Pokroky v analytice HDL cholesterolu (èást 2.) Ing. Petr Horák, CSc., OKB Masarykova nemocnice Ústí nad Labem Pokraèování èlánku z minulého èísla se pøedevím zabývá homogenními metodami stanovení HDL cholesterolu a rùznými faktory ovlivòujícími výsledky mìøení. 9) Homogenní metody Jsou oznaèovány té jako tzv. pøímé metody. Umonují uskuteènit enzymatické reakce HDL-C v systému, kde jsou non-HDL LP selektivnì inhibovány. 9a) blokaèní metody (maskování non-HDL) 9a1) Polyethylen glykol modified enzymes (PEGME) / α-cyklodextrinsulfát / dextransulfát / Mg2+ Kyowa,Tokyo, Japonsko - Sugiuchi H.et.al. -1995 (29) Diagnostické soupravy HDL-C Plus assay (Roche), Sentinel, Dialab. Sulfatovaný α-cyklodextrin a dextransulfát (R1) tvoøí s LDL, VLDL a CHM pøi neutrálním pH za pøítomnosti MgCl2 ve vodì rozpustné komplexy, které nejsou schopny reagovat s PEG-modifikovanými enzymy (R2). Jeliko HDL-C není komplexován, podléhá v nìm obsaený cholesterol enzymatickým reakcím. E-Chol obsaené v HDL jsou modifikovanou cholesterolesterázou (CHES) tìpeny na volné mastné kyseliny (FFA) a F-Chol, který je v reakci katalyzované cholesteroloxidázou (CHOD) oxidován za souèasného vzniku peroxidu vodíku. Ten v reakci katalyzované peroxidázou (POD) uvolòuje kyslík, který pøevádí chromogenní substrát na chinoniminové barvivo s absorbèním maximem okolo 600nm. α-cyklodextrin je cyklický oligosacharid tvoøený ze esti D-glukos spojených α-1,4-glykosidickými vazbami. Modifikace glukosových jednotek sulfátovými skupinami zvyuje poèet negativních nábojù a α-cyklo9
dextrinsulfát je tak polyaniontem schopným vytváøet za spoluúèasti Mg2+ prostøednictvím nekovalentních vazeb ve vodì rozpustné komplexy s LDL, VLDL a CHM, zatímco s HDL neinteraguje. Prùmìrná Mr α-cyklodextrinsulfátu je zhruba 100x nií ne Mr polyaniontù bìnì uívaných v precipitaèních metodách. Takto modifikované oligosacharidy proto mají daleko vìtí povrchovou hustotu negativního náboje a afinitu srovnatelnou s heparinem, ani by pøitom docházelo k tvorbì precipitujících agregátù. Sulfatované α-cyklodextriny tak slouí k potlaèení reaktivity cholesterolu v CHM a VLDL. Reaktivita cholesterolu lipoproteinù vázaných v komplexech s α-cyklodextrinsulfátem je v reakcích vyuívajících polyethylenglykolem 6000 modifikovaných enzymù CHES a CHOD ve srovnání s HDLC sníena. PEGem 6000 modifikované enzymy si uchovávají vlastnosti nativních enzymù, ale vykazují selektivní katalytickou aktivitu v rùzných tøídách LP se zvyující se reaktivitou v poøadí LDL < VLDL = CHM < HDL (30). Nejvìtí selektivity bylo dosaeno pøi modifikaci 40% aminoskupin apoenzymù. 9a2) Polyanion polymer / detergent (PPD) Daiichi Pure Chemicals Company, Tokyo, Japonsko -1997 Genzyme Corporation (Cambridge, VB) Na tomto principu je té koncipována diagnostická souprava firmy DOT diagnostics. Syntetické polymery a polyanion-
ty (R1) se adsorbují na povrch LDL, VLDL a CHM a konvertují tyto LP na rozpustné komplexy resistentní k denaturaci.V druhém kroku po pøídavku R2 (enzymy CHES, CHOD, POD, 4-aminoantipyrin a chromogenní substrát ve flalátovém pufru pH 5,7) detergent selektivnì rozruí strukturu HDL a solubilizuje HDLC, který je pak enzymaticky stanoven (31). PPD bylo zpoèátku ménì specifické pro HDL-C vzhledem k nekompletnímu vychytávání non-HDL, co vedlo k falenì vysokým koncentracím HDL-C u vzorkù s vysokým pomìrem LDL-C/HDL-C a výtìnost pøi pøídavku HDL-C byla pouze 70%. Teprve pøechod na kapalné reagencie s úpravou jejich sloení pøinesl podstatné zlepení specifity. Triacylglyceroly u této metody interferují a od koncentrací nad 20 mmol/l (29). 9b) Imunoinhibièní metody 9b1)PEG / anti-apo B , anti-apo C III (32) International Reagent Corporation (Kobe, Japonsko) - IRC Tato ètyøstupòová metoda je jednou z prvních v praxi aplikovaných imunochemických homogenních metod stanovení HDL-C. První reagencie (R1) obsahuje PEG 4000 ke komplexování non-HDL LP . V R2 jsou dávkovány protilátky proti apo B a apo C-III, které agregují non-HDL LP na rozpustné komplexy nereagující s CHES a CHOD. V R3 je pipetována smìs enzymù (CHES, CHOD, POD) pro stanovení cholesterolu. Enzymatická reakce je zastavena stop èinidlem (R4) obsahujícím guanidin hydrochlorid. Nevýhodou je dávkování ètyøech reagencií, které znemo-
òuje uplatnìní tohoto postupu na bìných automatických biochemických analyzátorech. 9b2) Imunoseparaèní metoda (IS) Wako Pure Chemical Industry (Osaka, Japonsko) (33, 34, 35) K pøímé inhibici reakcí s LDL, VLDL a CHM jsou vyuívány protilátky proti lidským β-lipoproteinùm. Vzniklé rozpustné komplexy nereagují s enzymy obsaenými v R2, take enzymatické reakce probìhnou pouze s cholesterolem obsaeným v HDL. Sterické blokování enzymatických reakcí non-HDL tvorbou imunokomplexu s anti-βLP vyuívá také diagnostická souprava HDL-C Direct Liquid firmy PLIVA-Lachema. Imunoinhibièní princip je uplatnìn také u homogenní sekvenèní enzymatické metody stanovení HDL-C, T-CHOL a TG tzv. TLS testu (Triple Lipid Screening test) (36). Nejprve jsou po pøídavku anti-apo B (R1) blokovány non-HDL a je enzymaticky stanoven HDL-C. Souèástí R2 je deoxycholát, který jako detergent solubilizuje nezreagovaný cholesterol v non-HDL a umoní jeho enzymatické stanovení. Po napipetování R3 probìhne enzymatické stanovení TG. Stanovení tøí analytù v jedné kyvetì znamená sníení nákladù na reagencie. Autoøi doporuèují tuto metodu pro
úèely screeningu dyslipoproteinemií. 9c) Eliminaèní metoda (37) Denka Seiken Co. (Niigata, Japonsko), Randox Laboratories Limited (Crumlin, VB) Diagnostické soupravy Randox a BioVendor. Pufr o specifické iontové síle (R1) rozruí v prvním kroku CHM, VLDL a LDL vèetnì dalích abnormálních LP a cholesterol v nich obsaený je enzymaticky transformován pùsobením CHES a CHOD za tvorby peroxidu vodíku. Ten je rozloen pùsobením katalázy. Druhá reagencie (R2) obsahuje inhibitor katalázy (azid sodný) a detergent, který solubilizuje HDL-C, který je následnì enzymaticky stanoven. Pøedností eliminaèní metody je omezení diskrepantních výsledkù v pøítomnosti abnormálních lipoproteinù pøi závaných patologických stavech organismu napø. pøi tìkých jaterních onemocnìních (napø. cirhoze). Výhody homogenních metod: - vyí pøesnost a správnost stanovení - pøímé pouití séra (plazmy) bez sráení - snadná adaptace na automatické analyzátory - monost vyuít pipetování z primárních zkumavek oznaèených èarovým kodem - kratí doba analýzy
- nií pracnost - nií objem vzorku ze 100 µl na cca 4 µl - sníení interference vyích koncentrací TG Kolébkou diagnostických souprav pro homogenní stanovení HDL-C je jednoznaènì Japonsko. Principielnì shodné metody nabízí v rùzných modifikacích od poloviny 90tých let celá øada evropských a amerických výrobcù. Od roku 1998 jsou uvádìny na trh dvoureagenèní kapalné soupravy ready to use pro homogenní stanovení HDL-C, co pøineslo opìt urèité úpravy sloení reagencií v zájmu dosaení jejich vysoké stability. 10) Modifikovaná CDC referenèní metoda (38) (Centers for Disease, Control and Prevention ) Probíhá ve tøech krocích: a) Na TG bohaté LP (frakce pod 1,006 g/l), tedy VLDL a CHM jsou odstranìny ultracentrifugací (18 hod, 10°C, 40 000 r.p.m) b) Zbylé apo B obsahujících LP IDL, LDL a Lp(a) jsou precipitovány èinidlem obsahujícím heparin + MnCl2 (46 mmol/l) c) HDL-C je kvantifikován mìøením cholesterolu v supernatantu s vyuitím referenèní modifikované Abell-Kendallovy metody (39)
10
11) CDC DCM (Designated Comparison Method) (40) Jako DCM metoda pro HDL-C byl vybrán CRMNL (Cholesterol Reference Method Laboratory Network) v roce 1994 postup uívající dextransulfát s Mg2+ jako precipitaèní èinidlo následované mìøením cholesterolu v supernatantu Abell-Kendallovou metodou. Schematický pøehled metod uívaných pro kvantitativní stanovení HDL-C a subtypizaci HDL je uveden na obr. 3. Interference Triacylglyceroly Precipitaèní metody následkem neúplné precipitace non-HDL LP a z toho plynoucí turbidity supernatantu, vykazují u chylozních sér pozitivní systematickou odchylku od CDC referenèní metody. Homogenní metody jsou naproti tomu podstatnì ménì ovlivòovány vyími koncentracemi TG a u ádné z nich nelze oèekávat výraznìjí negativní bias do 10,1 mmol/l TG. U nìkterých homogenních metod je udávána interference TG teprve u silnì chylozních sér - u eliminaèní metody pøi TG nad 19,2 mmol/l , PPD dokonce nad 21,4 mmol/l TG. Není ovem lhostejné, zda se jedná o TG obsaené v CHM, VLDL èi jiných na TG bohatých lipoproteinech. Volné mastné kyseliny (FFA) Tato interference se uplatòuje hlavnì u pacientù s intravenozní heparinovou terapií. Pøi koncentracích FFA nad 2 mmol/l se toti významnou mìrou uplatòuje jejich vazba k LP, co zpùsobuje zvýení elektroforetické mobility LP a mìní jejich interakci s precipitaèními èinidly. Pro zlepení separaèní úèinnosti pøi elektroforéze LP je proto doporuèováno vyvázání FFA pøídavkem albuminu (41). Metody IS a PPD jsou citlivé k interferenci FFA, zatímco PEG a MB nikoli. Koncentrace FFA nad 11
2 mmol/l mohou vést u metod IS a PPD k namìøení falenì vysokých koncentrací HDL-C. LDL-C Homogenní metody jsou do znaèné míry specifické pro HDL-C, take pozitivní interference LDL-C s odchylkami nad 5% jsou udávány a od znaènì vysokých hladin LDLC nad 15,5 mmol/l (PEGME), 18,1 mmol/l (PPD), 23,2 mmol/l (IS). Hemoglobin Hemoglobin má malý vliv na pøímé stanovení HDL-C a zpùsobuje negativní interference teprve pøi koncentracích nad 5g/l u eliminaèní metody, nad 6g/l u PPD a od 10g/l u metody PEGME (33). Naproti tomu pozitivní interference se projevuje u precipitaèních metod (PTA). Bilirubin Zpùsobuje negativní interference nad 10% u homogenních metod teprve pøi koncentracích nad 427 µmol/l (PEGME a eliminaèní metoda) od hodnoty 513 µmol/l u PPD a u IS a nad 855 µmol/l. β-VLDL u dysbetalipoproteinemie (hyperlipoproteinemie typu III) Pacienti s dysbetalipoproteinemií mají v dùsledku narueného katabolismu remnantních LP vyí koncentraci tzv. beta-VLDL cholesterolu v séru, který pøi stanovení HDL-C interferuje a vede u homogenních metod k výraznì pozitivnímu biasu (42). Jsou vak také publikovány pøípady naopak falenì nízkých koncentrací HDL-C (43) Odbìr krve Pacienti by mìli nejménì dva týdny pøed odbìrem dodrovat obvyklou dietu. K stanovení HDL-C by se mìlo pøikroèit nejdøíve 8 týdnù po traumatu, akutní bakteriální èi virové infekci. Doporuèuje se odbìr krve
teprve po pøedchozím 9-12ti hodinovém laènìní (24). Pokud je tato doba kratí ne 9 hodin, lze oèekávat mírné podhodnocení HDL-C o 1-4%. Pokud nebyl odbìr krve proveden nalaèno, mohou být výsledky a o 5-10% nií. Pacient by mìl minimálnì 5 minut pøed odbìrem v klidu sedìt a krev by mìla být odebírána s minimálním zakrcením pae. Stanovení HDL-C lze provádìt nejen v séru, ale té v plazmì. Sérum èi plazma by mìla být oddìlena od krevních elementù do tøí hodin po venepunkci. Pokud je zvolena jako antikoagulans EDTA, lze oèekávat výsledky asi o 3-6 % nií ne v séru vlivem naøedìní plazmy v dùsledku osmozou podmínìného transportu vody z erytrocytù do plazmy (44). Toto se neprojevuje pøi pouití Li-heparinátu (45). Stabilita vzorku Je optimální provádìt vyetøení HDL-C pokud mono v den odbìru krve. Pøi skladování séra v chladnièce mùe nadále docházet k redistribuci lipidù mezi LP. Zaznamenaný pokles HDL-C o 4% za 10 dnù pøi 4°C (46), mùe být zpùsoben transferem E-Chol a fosfolipidù z HDL do VLDL a LDL výmìnou za TG zprostøedkovanou CETP. Esterifikace HDL-C katalyzovaná LCAT vede k postupnému poklesu volného cholesterolu. Pøi sledování zmìn koncentrace HDL-C vlivem sedmiletého pøechovávání séra pøi teplotì -70°C byl zjitìn statisticky nevýznamný pokles o 1,3% HDLC za rok (47). Sérum resp.plazmu tedy lze uchovávat bez výrazného poklesu koncentrace HDL-C 7 dní pøi 2-8°C, 1 mìsíc pøi -20°C a a 2 roky pøi -70°C. Referenèní hodnoty Podle NCEP Adult Treatment Panel II (NCEP ATP II) Guidelines (48) jsou ádoucí koncentrace HDL-C nad 0,91 mmol/l a optimální koncentraèní hladiny s antiaterogenními protektivními úèinky nad 1,56 mmol/l. Za rizikové
byly povaovány koncentrace HDL-C pod 0,90 mmol/l. V roce 2001 byla NCEP ATP III pøehodnocena hranice zvýeného rizika ICHS na hodnoty HDL-C pod 1,03 mmol/l (49) . Biologický rozptyl Z dùvodu vyího intraindividuálního biologického rozptylu hladin HDL-C v prùmìru okolo 7,5%, není moné dìlat závìry z analýzy jednoho vzorku. Jsou proto doporuèena opakovaná stanovení nejlépe ze tøí odbìrù v intervalu, který by nemìl být kratí ne 1 týden a ne delí ne 8 týdnù. Po tuto dobu by nemìl být mìnìn obvyklý zpùsob stravování. Poadavky na pøesnost a správnost V rámci NCEP ATP II byla stanovena cílová kriteria (viz obr.4) dosáhnout v roce 1998 u rutinnì uívaných metodik stanovení HDL-C maximální celkové chyby 13% a maximální celkové analytické nepøesnosti 4% na hladinách HDL-C nad 1,09 mmol/l. Pøi koncentraci HDLC pod 1,09 mmol/l by nemìla být pøekroèena SD 0,044 mmol/l (24). U homogenních metod obecnì bylo dosaeno podstatného zlepení pøesnosti s relativní smìrodatnou odchylkou okolo 1% pøi mìøení v sérii a 2-3% v mìøení mezi série-
mi. Precipitaèní metody jsou naproti tomu zatíeny zhruba dvojnásobnou CV (%) v rozsahu 2-6% (50). Systematická diference mìøení od výsledkù získaných CDC referenèní metodou (bias) by nemìla pøekroèit 5%. K vyímu biasu pøispívá pøedevím neúplná separace frakce HDL a pouití nevhodného kalibrátoru (48). Ten by mìl mít návaznost na CDC referenèní metodu a kontrolní materiály na dvou hladinách koncentrací. Kalibrátory a kontrolní séra by mìly být z dùvodu neádoucích matricových efektù jednoznaènì lidského pùvodu. Zvyování hladin analytù v kontrolních materiálech pøídavkem zvíøecích lipoproteinových koncentrátù mùe vést u nìkterých metod k diskrepantním výsledkùm. V roce 1989 byla CDC ustanovena iroká mezinárodní sí referenèních laboratoøí pro stanovení cholesterolu (Cholesterol Reference Method Laboratory Network -CRMNL), která zaèala provádìt testování komerèních diagnostických souprav a umonila tak jejich výrobcùm dosáhnout návaznosti na National Reference System for Cholesterol (NRS/CHOL). Testování spoèívá v analýze 40-50ti èerstvých sér testovanou diagnostickou soupravou a referenèní metodou. Výrobce, pokud v testování obstojí, obdrí certifikát o návaznosti (Certificate od Traceability). Pro celkový cholesterol probíhal tento program certifikace ji od roku 1990.
Obr. 4:
Od roku 1994 byl rozíøen také o HDL cholesterol a v roce 1997 té o LDL cholesterol. Analýza HDL-C v ÈR O míøe uplatnìní moderních metod homogenního stanovení HDL-C a LDL-C ve srovnání s klasickými precipitaèními technikami v rutinních klinicko-biochemických laboratoøích v Èeské republice vypovídá úèast laboratoøí v lipidových cyklech SEKK. Poèet laboratoøí analyzujících HDL-C homogenními metodami za uplynulých 5 let výraznì vzrostl a trend je stále stoupající. Zatímco v roce 1996 (cyklus 24/96) stanovovalo 98 % laboratoøí HDL-C precipitaèními metodami a pouze 2% homogenními metodami, v roce 2001 (cyklus LIP 1/01) ji tøi ètvrtiny laboratoøí pracují s homogenními metodami a pouze 21% stále pouívá sráecí postupy (viz obr. 5). V pøípadì LDL-C je tento nárùst pøímého stanovení ménì výrazný, zøejmì v dùsledku vyí ceny reagencií. Vìtina laboratoøí stále urèuje LDL-C výpoètem dle Friedewalda (61% v cyklu LIP 1/01) a pouze mení èást 33% pouívá pøímých metod (viz obr. 6). Literatura: 29) Sugiuchi, H., Uji, Y., Okabe, H., Irie, T., Uekama, K., Kayahara, N.: Direct measurement of HDL cholesterol in serum with PEG modified enzymes and sulfated alfa-cyklodextrin. lin Chem 41: 717-23, 1995. 30)Nauck, M., Marz, W., Haas, B., Wieland, H: Homogenous assay for direct determination of HDL cholesterol evaluated. Clin Chem 42: 424-9, 1996. 31) Harris, N., Galpchian, V., Thomas, J., Iannoti, E., Law, T., Rifai, N.: Three generation of HDL cholesterol assays compared with ultracentrifugation/dextran sulfate Mg2+ method. Clin Chem 43: 816-23, 1997. 32) Kakuyama, T., Kimura, S., Hashigushi, Y.: Fully automated determination of HDL-cholestetrol form human serum with Hitachi 911.Clin Chem 1994;40:1104.
12
Obr. 5:
Obr. 6:
33) Nauck, M., März,W., Wieland, H.: New immunoseparation-based homogenous assay for HDL-cholesterol compared with three homogenous and two heterogenoua metods for HDL-cholesterol. Clin Chem 44/7: 1443-1451, 1998. 34) Sigma Diagnostics. Procedure no. 354. St.Louis: Sigma, 1997. 35) Okamoto, Y., Tanaka, S., Nakano, H.: Direct measurement of HDL cholesterol preferable to precipitation method. Clin Chem 41/12: 1784, 1995. 36)Sampson, M.L., Aubry, A., Csako, G., Remaley, A.T.: Triple lipid screening test: A homogenous sequential assay for HDL-C, total cholesterol and triglycerides.Clin Chem 47/3: 532-539, 2001. 37) Izawa, S., Okada, M., Matsui, H., Horita, Y.: A new direct method for measuring HDL-C which does not produce biased values. J Med Pharm Sci 37: 1385-1388 ,1997. 38) Myers, G.L., Cooper, G.R., Henderson, L.O., Hassemer, D.J., Kimber-
13
ly, M.M.: Standardization of lipid and lipoprotein measurement.Rifai N., Warnick, G.R., Dominiczak, M.H. eds. Handbook of lipoprotein testing AACC Press Washington, 717-747, 2000. 39) Abell, L.L., Levy, B.B., Brodie B.B., Kendall, F.E.: Simplified methods for the estimation of total cholesterol in serum and demonstration of specifity. J Biol Chem 195: 357-66, 1951. 40) Kimberly, M., Leary, E.T., Cole, T.G., Waymack, P. P.: Selection, validation, standardization and performance of a designated comparison method for HDL-C for use in the cholesterol reference method laboratory network. Clin Chem 45/10: 1803-1812, 1999. 41) Nauck, M. ,März,W.,Wieland,H.: Adding albumin normalizes electrophoretic mobility of lipoproteins in sera with high concentrations of free fatty acids. Clin Chem 42:1283-5, 1994. 42) Lackner, K.J.,,Schmitz,S.: betaVLDL of patients with Type III Hyper-
lipoproteinemia interferes with homogenous determination of HDL-C based on PEGME. Clin Chem 44/12: 2546-8, 1998. 43) Roberts, W.L., Leary, E.T., Lambert, T.L., Moulton, L., Goestch,. JL.: Falsely low direct HDL-C results in a patient with dysbetalipoproteinemia. Clin Chem 46/4: 560-562, 2000. 44) Peòa, M-L.A., Mata, J.T., Gil, J.M.: Comparison of two homogenous assays with a precipitation method and ultracentrifugatin method for the measurement of HDL-C. Clin Chem 44/ 12: 2499-2505, 1998. 45) Nauck, M., März,W., Jarausch, J., Cobbaert, C., Sägers, A., Bernard, D. et al.: Multicenter evaluation of homogenous assay for HDL cholesterol without sample pre-treatment. Clin Chem 43: 1622-9, 1997. 46) Evans, K., Mitcheson, J., Laker, M.F.: Effect of storage at 4°C and -20°C in lipid, lipoprotein, and apolipoprotein concentration. Clin Chem 41/3: 392396, 1995. 47) Shin, W.J., Bachorik, P.S., Haga, J.A., Myers, G.L., Stein, E.A.: Estimating the long-term effects of storage at 70°C on cholesterol, Triglyceride and HDL-C measurement in stored sera: Clin Chem 46/3: 351-364, 2000. 48) National Cholesterol Education Program. Second report of the expert panel on detection, evaluation and treatment of high blood cholesterol in adults (adult treatment panel II). Circulation 89: 1330-445, 1994. 49) The Expert Panel. Executive summary of the third report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) expert panel on detection, evaluation, and treatment of high blood cholesterol in adults (Adult Treatment Panel III). JAMA 285: 2486-2497, 2000. 50) Warnick, G.R., Nauck, M., Rifai, N.: Evolution of methods for measurement of HDL-Cholesterol: From ultracentrifugation to homogenous assays . Clin Chem 47/9: 1579-1596, 2001. 51) Johnson, W.J., Mahlberg, F.H., Rothblat, G.H., Phillips, M.C.: Biochimica et Biophysica Acta 1085: 273-298, 1991.