Pokroky v analytice HDL cholesterolu (èást 2.)

Pokroky v analytice HDL cholesterolu (èást 2.) Ing. Petr Horák, CSc., OKB Masarykova nemocnice Ústí nad Labem Pokraèování èlánku z minulého èísla se pøedevším zabývá homogenními metodami stanovení HDL cholesterolu a rùznými faktory ovlivòujícími výsledky mìøení. 9) Homogenní metody Jsou oznaèovány též jako tzv. pøímé metody. Umožnují uskuteènit enzymatické reakce HDL-C v systému, kde jsou non-HDL LP selektivnì inhibovány. 9a) blokaèní metody (maskování non-HDL) 9a1) Polyethylen glykol modified enzymes (PEGME) / α-cyklodextrinsulfát / dextransulfát / Mg2+ Kyowa,Tokyo, Japonsko - Sugiuchi H.et.al. -1995 (29) Diagnostické soupravy HDL-C Plus assay (Roche), Sentinel, Dialab. Sulfatovaný α-cyklodextrin a dextransulfát (R1) tvoøí s LDL, VLDL a CHM pøi neutrálním pH za pøítomnosti MgCl2 ve vodì rozpustné komplexy, které nejsou schopny reagovat s PEG-modifikovanými enzymy (R2). Jelikož HDL-C není komplexován, podléhá v nìm obsažený cholesterol enzymatickým reakcím. E-Chol obsažené v HDL jsou modifikovanou cholesterolesterázou (CHES) štìpeny na volné mastné kyseliny (FFA) a F-Chol, který je v reakci katalyzované cholesteroloxidázou (CHOD) oxidován za souèasného vzniku peroxidu vodíku. Ten v reakci katalyzované peroxidázou (POD) uvolòuje kyslík, který pøevádí chromogenní substrát na chinoniminové barvivo s absorbèním maximem okolo 600nm. α-cyklodextrin je cyklický oligosacharid tvoøený ze šesti D-glukos spojených α-1,4-glykosidickými vazbami. Modifikace glukosových jednotek sulfátovými skupinami zvyšuje poèet negativních nábojù a α-cyklo9

dextrinsulfát je tak polyaniontem schopným vytváøet za spoluúèasti Mg2+ prostøednictvím nekovalentních vazeb ve vodì rozpustné komplexy s LDL, VLDL a CHM, zatímco s HDL neinteraguje. Prùmìrná Mr α-cyklodextrinsulfátu je zhruba 100x nižší než Mr polyaniontù bìžnì užívaných v precipitaèních metodách. Takto modifikované oligosacharidy proto mají daleko vìtší povrchovou hustotu negativního náboje a afinitu srovnatelnou s heparinem, aniž by pøitom docházelo k tvorbì precipitujících agregátù. Sulfatované α-cyklodextriny tak slouží k potlaèení reaktivity cholesterolu v CHM a VLDL. Reaktivita cholesterolu lipoproteinù vázaných v komplexech s α-cyklodextrinsulfátem je v reakcích využívajících polyethylenglykolem 6000 modifikovaných enzymù CHES a CHOD ve srovnání s HDLC snížena. PEGem 6000 modifikované enzymy si uchovávají vlastnosti nativních enzymù, ale vykazují selektivní katalytickou aktivitu v rùzných tøídách LP se zvyšující se reaktivitou v poøadí LDL < VLDL = CHM < HDL (30). Nejvìtší selektivity bylo dosaženo pøi modifikaci 40% aminoskupin apoenzymù. 9a2) Polyanion polymer / detergent (PPD) Daiichi Pure Chemicals Company, Tokyo, Japonsko -1997 Genzyme Corporation (Cambridge, VB) Na tomto principu je též koncipována diagnostická souprava firmy DOT diagnostics. Syntetické polymery a polyanion-

ty (R1) se adsorbují na povrch LDL, VLDL a CHM a konvertují tyto LP na rozpustné komplexy resistentní k denaturaci.V druhém kroku po pøídavku R2 (enzymy CHES, CHOD, POD, 4-aminoantipyrin a chromogenní substrát ve flalátovém pufru pH 5,7) detergent selektivnì rozruší strukturu HDL a solubilizuje HDLC, který je pak enzymaticky stanoven (31). PPD bylo zpoèátku ménì specifické pro HDL-C vzhledem k nekompletnímu vychytávání non-HDL, což vedlo k falešnì vysokým koncentracím HDL-C u vzorkù s vysokým pomìrem LDL-C/HDL-C a výtìžnost pøi pøídavku HDL-C byla pouze 70%. Teprve pøechod na kapalné reagencie s úpravou jejich složení pøinesl podstatné zlepšení specifity. Triacylglyceroly u této metody interferují až od koncentrací nad 20 mmol/l (29). 9b) Imunoinhibièní metody 9b1)PEG / anti-apo B , anti-apo C III (32) International Reagent Corporation (Kobe, Japonsko) - IRC Tato ètyøstupòová metoda je jednou z prvních v praxi aplikovaných imunochemických homogenních metod stanovení HDL-C. První reagencie (R1) obsahuje PEG 4000 ke komplexování non-HDL LP . V R2 jsou dávkovány protilátky proti apo B a apo C-III, které agregují non-HDL LP na rozpustné komplexy nereagující s CHES a CHOD. V R3 je pipetována smìs enzymù (CHES, CHOD, POD) pro stanovení cholesterolu. Enzymatická reakce je zastavena stop èinidlem (R4) obsahujícím guanidin hydrochlorid. Nevýhodou je dávkování ètyøech reagencií, které znemož-

òuje uplatnìní tohoto postupu na bìžných automatických biochemických analyzátorech. 9b2) Imunoseparaèní metoda (IS) Wako Pure Chemical Industry (Osaka, Japonsko) (33, 34, 35) K pøímé inhibici reakcí s LDL, VLDL a CHM jsou využívány protilátky proti lidským β-lipoproteinùm. Vzniklé rozpustné komplexy nereagují s enzymy obsaženými v R2, takže enzymatické reakce probìhnou pouze s cholesterolem obsaženým v HDL. Sterické blokování enzymatických reakcí non-HDL tvorbou imunokomplexu s anti-βLP využívá také diagnostická souprava HDL-C Direct Liquid firmy PLIVA-Lachema. Imunoinhibièní princip je uplatnìn také u homogenní sekvenèní enzymatické metody stanovení HDL-C, T-CHOL a TG tzv. TLS testu (Triple Lipid Screening test) (36). Nejprve jsou po pøídavku anti-apo B (R1) blokovány non-HDL a je enzymaticky stanoven HDL-C. Souèástí R2 je deoxycholát, který jako detergent solubilizuje nezreagovaný cholesterol v non-HDL a umožní jeho enzymatické stanovení. Po napipetování R3 probìhne enzymatické stanovení TG. Stanovení tøí analytù v jedné kyvetì znamená snížení nákladù na reagencie. Autoøi doporuèují tuto metodu pro

úèely screeningu dyslipoproteinemií. 9c) Eliminaèní metoda (37) Denka Seiken Co. (Niigata, Japonsko), Randox Laboratories Limited (Crumlin, VB) Diagnostické soupravy Randox a BioVendor. Pufr o specifické iontové síle (R1) rozruší v prvním kroku CHM, VLDL a LDL vèetnì dalších abnormálních LP a cholesterol v nich obsažený je enzymaticky transformován pùsobením CHES a CHOD za tvorby peroxidu vodíku. Ten je rozložen pùsobením katalázy. Druhá reagencie (R2) obsahuje inhibitor katalázy (azid sodný) a detergent, který solubilizuje HDL-C, který je následnì enzymaticky stanoven. Pøedností eliminaèní metody je omezení diskrepantních výsledkù v pøítomnosti abnormálních lipoproteinù pøi závažných patologických stavech organismu napø. pøi tìžkých jaterních onemocnìních (napø. cirhoze). Výhody homogenních metod: - vyšší pøesnost a správnost stanovení - pøímé použití séra (plazmy) bez srážení - snadná adaptace na automatické analyzátory - možnost využít pipetování z primárních zkumavek oznaèených èarovým kodem - kratší doba analýzy

- nižší pracnost - nižší objem vzorku ze 100 µl na cca 4 µl - snížení interference vyšších koncentrací TG Kolébkou diagnostických souprav pro homogenní stanovení HDL-C je jednoznaènì Japonsko. Principielnì shodné metody nabízí v rùzných modifikacích od poloviny 90tých let celá øada evropských a amerických výrobcù. Od roku 1998 jsou uvádìny na trh dvoureagenèní kapalné soupravy „ready to use“ pro homogenní stanovení HDL-C, což pøineslo opìt urèité úpravy složení reagencií v zájmu dosažení jejich vysoké stability. 10) Modifikovaná CDC referenèní metoda (38) (Centers for Disease, Control and Prevention ) Probíhá ve tøech krocích: a) Na TG bohaté LP (frakce pod 1,006 g/l), tedy VLDL a CHM jsou odstranìny ultracentrifugací (18 hod, 10°C, 40 000 r.p.m) b) Zbylé apo B obsahujících LP IDL, LDL a Lp(a) jsou precipitovány èinidlem obsahujícím heparin + MnCl2 (46 mmol/l) c) HDL-C je kvantifikován mìøením cholesterolu v supernatantu s využitím referenèní modifikované Abell-Kendallovy metody (39)

10

11) CDC DCM (Designated Comparison Method) (40) Jako DCM metoda pro HDL-C byl vybrán CRMNL (Cholesterol Reference Method Laboratory Network) v roce 1994 postup užívající dextransulfát s Mg2+ jako precipitaèní èinidlo následované mìøením cholesterolu v supernatantu Abell-Kendallovou metodou. Schematický pøehled metod užívaných pro kvantitativní stanovení HDL-C a subtypizaci HDL je uveden na obr. 3. Interference Triacylglyceroly Precipitaèní metody následkem neúplné precipitace non-HDL LP a z toho plynoucí turbidity supernatantu, vykazují u chylozních sér pozitivní systematickou odchylku od CDC referenèní metody. Homogenní metody jsou naproti tomu podstatnì ménì ovlivòovány vyššími koncentracemi TG a u žádné z nich nelze oèekávat výraznìjší negativní bias do 10,1 mmol/l TG. U nìkterých homogenních metod je udávána interference TG teprve u silnì chylozních sér - u eliminaèní metody pøi TG nad 19,2 mmol/l , PPD dokonce nad 21,4 mmol/l TG. Není ovšem lhostejné, zda se jedná o TG obsažené v CHM, VLDL èi jiných na TG bohatých lipoproteinech. Volné mastné kyseliny (FFA) Tato interference se uplatòuje hlavnì u pacientù s intravenozní heparinovou terapií. Pøi koncentracích FFA nad 2 mmol/l se totiž významnou mìrou uplatòuje jejich vazba k LP, což zpùsobuje zvýšení elektroforetické mobility LP a mìní jejich interakci s precipitaèními èinidly. Pro zlepšení separaèní úèinnosti pøi elektroforéze LP je proto doporuèováno vyvázání FFA pøídavkem albuminu (41). Metody IS a PPD jsou citlivé k interferenci FFA, zatímco PEG a MB nikoli. Koncentrace FFA nad 11

2 mmol/l mohou vést u metod IS a PPD k namìøení falešnì vysokých koncentrací HDL-C. LDL-C Homogenní metody jsou do znaèné míry specifické pro HDL-C, takže pozitivní interference LDL-C s odchylkami nad 5% jsou udávány až od znaènì vysokých hladin LDLC nad 15,5 mmol/l (PEGME), 18,1 mmol/l (PPD), 23,2 mmol/l (IS). Hemoglobin Hemoglobin má malý vliv na pøímé stanovení HDL-C a zpùsobuje negativní interference teprve pøi koncentracích nad 5g/l u eliminaèní metody, nad 6g/l u PPD a od 10g/l u metody PEGME (33). Naproti tomu pozitivní interference se projevuje u precipitaèních metod (PTA). Bilirubin Zpùsobuje negativní interference nad 10% u homogenních metod teprve pøi koncentracích nad 427 µmol/l (PEGME a eliminaèní metoda) od hodnoty 513 µmol/l u PPD a u IS až nad 855 µmol/l. β-VLDL u dysbetalipoproteinemie (hyperlipoproteinemie typu III) Pacienti s dysbetalipoproteinemií mají v dùsledku narušeného katabolismu remnantních LP vyšší koncentraci tzv. beta-VLDL cholesterolu v séru, který pøi stanovení HDL-C interferuje a vede u homogenních metod k výraznì pozitivnímu biasu (42). Jsou však také publikovány pøípady naopak falešnì nízkých koncentrací HDL-C (43) Odbìr krve Pacienti by mìli nejménì dva týdny pøed odbìrem dodržovat obvyklou dietu. K stanovení HDL-C by se mìlo pøikroèit nejdøíve 8 týdnù po traumatu, akutní bakteriální èi virové infekci. Doporuèuje se odbìr krve

teprve po pøedchozím 9-12ti hodinovém laènìní (24). Pokud je tato doba kratší než 9 hodin, lze oèekávat mírné podhodnocení HDL-C o 1-4%. Pokud nebyl odbìr krve proveden nalaèno, mohou být výsledky až o 5-10% nižší. Pacient by mìl minimálnì 5 minut pøed odbìrem v klidu sedìt a krev by mìla být odebírána s minimálním zaškrcením paže. Stanovení HDL-C lze provádìt nejen v séru, ale též v plazmì. Sérum èi plazma by mìla být oddìlena od krevních elementù do tøí hodin po venepunkci. Pokud je zvolena jako antikoagulans EDTA, lze oèekávat výsledky asi o 3-6 % nižší než v séru vlivem naøedìní plazmy v dùsledku osmozou podmínìného transportu vody z erytrocytù do plazmy (44). Toto se neprojevuje pøi použití Li-heparinátu (45). Stabilita vzorku Je optimální provádìt vyšetøení HDL-C pokud možno v den odbìru krve. Pøi skladování séra v chladnièce mùže nadále docházet k redistribuci lipidù mezi LP. Zaznamenaný pokles HDL-C o 4% za 10 dnù pøi 4°C (46), mùže být zpùsoben transferem E-Chol a fosfolipidù z HDL do VLDL a LDL výmìnou za TG zprostøedkovanou CETP. Esterifikace HDL-C katalyzovaná LCAT vede k postupnému poklesu volného cholesterolu. Pøi sledování zmìn koncentrace HDL-C vlivem sedmiletého pøechovávání séra pøi teplotì -70°C byl zjištìn statisticky nevýznamný pokles o 1,3% HDLC za rok (47). Sérum resp.plazmu tedy lze uchovávat bez výrazného poklesu koncentrace HDL-C 7 dní pøi 2-8°C, 1 mìsíc pøi -20°C a až 2 roky pøi -70°C. Referenèní hodnoty Podle NCEP Adult Treatment Panel II (NCEP ATP II) Guidelines (48) jsou žádoucí koncentrace HDL-C nad 0,91 mmol/l a optimální koncentraèní hladiny s antiaterogenními protektivními úèinky nad 1,56 mmol/l. Za rizikové

byly považovány koncentrace HDL-C pod 0,90 mmol/l. V roce 2001 byla NCEP ATP III pøehodnocena hranice zvýšeného rizika ICHS na hodnoty HDL-C pod 1,03 mmol/l (49) . Biologický rozptyl Z dùvodu vyššího intraindividuálního biologického rozptylu hladin HDL-C v prùmìru okolo 7,5%, není možné dìlat závìry z analýzy jednoho vzorku. Jsou proto doporuèena opakovaná stanovení nejlépe ze tøí odbìrù v intervalu, který by nemìl být kratší než 1 týden a ne delší než 8 týdnù. Po tuto dobu by nemìl být mìnìn obvyklý zpùsob stravování. Požadavky na pøesnost a správnost V rámci NCEP ATP II byla stanovena cílová kriteria (viz obr.4) dosáhnout v roce 1998 u rutinnì užívaných metodik stanovení HDL-C maximální celkové chyby 13% a maximální celkové analytické nepøesnosti 4% na hladinách HDL-C nad 1,09 mmol/l. Pøi koncentraci HDLC pod 1,09 mmol/l by nemìla být pøekroèena SD 0,044 mmol/l (24). U homogenních metod obecnì bylo dosaženo podstatného zlepšení pøesnosti s relativní smìrodatnou odchylkou okolo 1% pøi mìøení v sérii a 2-3% v mìøení mezi série-

mi. Precipitaèní metody jsou naproti tomu zatíženy zhruba dvojnásobnou CV (%) v rozsahu 2-6% (50). Systematická diference mìøení od výsledkù získaných CDC referenèní metodou (bias) by nemìla pøekroèit 5%. K vyššímu biasu pøispívá pøedevším neúplná separace frakce HDL a použití nevhodného kalibrátoru (48). Ten by mìl mít návaznost na CDC referenèní metodu a kontrolní materiály na dvou hladinách koncentrací. Kalibrátory a kontrolní séra by mìly být z dùvodu nežádoucích matricových efektù jednoznaènì lidského pùvodu. Zvyšování hladin analytù v kontrolních materiálech pøídavkem zvíøecích lipoproteinových koncentrátù mùže vést u nìkterých metod k diskrepantním výsledkùm. V roce 1989 byla CDC ustanovena široká mezinárodní sí referenèních laboratoøí pro stanovení cholesterolu (Cholesterol Reference Method Laboratory Network -CRMNL), která zaèala provádìt testování komerèních diagnostických souprav a umožnila tak jejich výrobcùm dosáhnout návaznosti na National Reference System for Cholesterol (NRS/CHOL). Testování spoèívá v analýze 40-50ti èerstvých sér testovanou diagnostickou soupravou a referenèní metodou. Výrobce, pokud v testování obstojí, obdrží certifikát o návaznosti (Certificate od Traceability). Pro celkový cholesterol probíhal tento program certifikace již od roku 1990.

Obr. 4:

Od roku 1994 byl rozšíøen také o HDL cholesterol a v roce 1997 též o LDL cholesterol. Analýza HDL-C v ÈR O míøe uplatnìní moderních metod homogenního stanovení HDL-C a LDL-C ve srovnání s klasickými precipitaèními technikami v rutinních klinicko-biochemických laboratoøích v Èeské republice vypovídá úèast laboratoøí v lipidových cyklech SEKK. Poèet laboratoøí analyzujících HDL-C homogenními metodami za uplynulých 5 let výraznì vzrostl a trend je stále stoupající. Zatímco v roce 1996 (cyklus 24/96) stanovovalo 98 % laboratoøí HDL-C precipitaèními metodami a pouze 2% homogenními metodami, v roce 2001 (cyklus LIP 1/01) již tøi ètvrtiny laboratoøí pracují s homogenními metodami a pouze 21% stále používá srážecí postupy (viz obr. 5). V pøípadì LDL-C je tento nárùst pøímého stanovení ménì výrazný, zøejmì v dùsledku vyšší ceny reagencií. Vìtšina laboratoøí stále urèuje LDL-C výpoètem dle Friedewalda (61% v cyklu LIP 1/01) a pouze menší èást 33% používá pøímých metod (viz obr. 6). Literatura: 29) Sugiuchi, H., Uji, Y., Okabe, H., Irie, T., Uekama, K., Kayahara, N.: Direct measurement of HDL cholesterol in serum with PEG modified enzymes and sulfated alfa-cyklodextrin. lin Chem 41: 717-23, 1995. 30)Nauck, M., Marz, W., Haas, B., Wieland, H: Homogenous assay for direct determination of HDL cholesterol evaluated. Clin Chem 42: 424-9, 1996. 31) Harris, N., Galpchian, V., Thomas, J., Iannoti, E., Law, T., Rifai, N.: Three generation of HDL cholesterol assays compared with ultracentrifugation/dextran sulfate Mg2+ method. Clin Chem 43: 816-23, 1997. 32) Kakuyama, T., Kimura, S., Hashigushi, Y.: Fully automated determination of HDL-cholestetrol form human serum with Hitachi 911.Clin Chem 1994;40:1104.

12

Obr. 5:

Obr. 6:

33) Nauck, M., März,W., Wieland, H.: New immunoseparation-based homogenous assay for HDL-cholesterol compared with three homogenous and two heterogenoua metods for HDL-cholesterol. Clin Chem 44/7: 1443-1451, 1998. 34) Sigma Diagnostics. Procedure no. 354. St.Louis: Sigma, 1997. 35) Okamoto, Y., Tanaka, S., Nakano, H.: Direct measurement of HDL cholesterol preferable to precipitation method. Clin Chem 41/12: 1784, 1995. 36)Sampson, M.L., Aubry, A., Csako, G., Remaley, A.T.: Triple lipid screening test: A homogenous sequential assay for HDL-C, total cholesterol and triglycerides.Clin Chem 47/3: 532-539, 2001. 37) Izawa, S., Okada, M., Matsui, H., Horita, Y.: A new direct method for measuring HDL-C which does not produce biased values. J Med Pharm Sci 37: 1385-1388 ,1997. 38) Myers, G.L., Cooper, G.R., Henderson, L.O., Hassemer, D.J., Kimber-

13

ly, M.M.: Standardization of lipid and lipoprotein measurement.Rifai N., Warnick, G.R., Dominiczak, M.H. eds. Handbook of lipoprotein testing AACC Press Washington, 717-747, 2000. 39) Abell, L.L., Levy, B.B., Brodie B.B., Kendall, F.E.: Simplified methods for the estimation of total cholesterol in serum and demonstration of specifity. J Biol Chem 195: 357-66, 1951. 40) Kimberly, M., Leary, E.T., Cole, T.G., Waymack, P. P.: Selection, validation, standardization and performance of a designated comparison method for HDL-C for use in the cholesterol reference method laboratory network. Clin Chem 45/10: 1803-1812, 1999. 41) Nauck, M. ,März,W.,Wieland,H.: Adding albumin normalizes electrophoretic mobility of lipoproteins in sera with high concentrations of free fatty acids. Clin Chem 42:1283-5, 1994. 42) Lackner, K.J.,,Schmitz,S.: betaVLDL of patients with Type III Hyper-

lipoproteinemia interferes with homogenous determination of HDL-C based on PEGME. Clin Chem 44/12: 2546-8, 1998. 43) Roberts, W.L., Leary, E.T., Lambert, T.L., Moulton, L., Goestch,. JL.: Falsely low direct HDL-C results in a patient with dysbetalipoproteinemia. Clin Chem 46/4: 560-562, 2000. 44) Peòa, M-L.A., Mata, J.T., Gil, J.M.: Comparison of two homogenous assays with a precipitation method and ultracentrifugatin method for the measurement of HDL-C. Clin Chem 44/ 12: 2499-2505, 1998. 45) Nauck, M., März,W., Jarausch, J., Cobbaert, C., Sägers, A., Bernard, D. et al.: Multicenter evaluation of homogenous assay for HDL cholesterol without sample pre-treatment. Clin Chem 43: 1622-9, 1997. 46) Evans, K., Mitcheson, J., Laker, M.F.: Effect of storage at 4°C and -20°C in lipid, lipoprotein, and apolipoprotein concentration. Clin Chem 41/3: 392396, 1995. 47) Shin, W.J., Bachorik, P.S., Haga, J.A., Myers, G.L., Stein, E.A.: Estimating the long-term effects of storage at 70°C on cholesterol, Triglyceride and HDL-C measurement in stored sera: Clin Chem 46/3: 351-364, 2000. 48) National Cholesterol Education Program. Second report of the expert panel on detection, evaluation and treatment of high blood cholesterol in adults (adult treatment panel II). Circulation 89: 1330-445, 1994. 49) The Expert Panel. Executive summary of the third report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) expert panel on detection, evaluation, and treatment of high blood cholesterol in adults (Adult Treatment Panel III). JAMA 285: 2486-2497, 2000. 50) Warnick, G.R., Nauck, M., Rifai, N.: Evolution of methods for measurement of HDL-Cholesterol: From ultracentrifugation to homogenous assays . Clin Chem 47/9: 1579-1596, 2001. 51) Johnson, W.J., Mahlberg, F.H., Rothblat, G.H., Phillips, M.C.: Biochimica et Biophysica Acta 1085: 273-298, 1991.