PEPTIDY A BÍLKOVINY Obsah kapitoly • • • • • •
Separace peptidů a bílkovin : kapalinová chromatografie Možnosti detekce peptidů a bílkovin Separace peptidů a bílkovin: elektromigrační metody Hmotnostní spektrometrie peptidů Analýza peptidů v potravinách Analytická proteomika
Kapalinová chromatografie peptidů a bílkovin • gelová permeační chromatografie – GPC, SEC size exclusion chromatography • iontoměničová chromatografie – IEC ion – exchange chromatography • chromatografie v systému obrácených fází – RPC reversed phase chromatography • chromatografie s hydrofobní interakcí – HIC hydrophobic interaction chromatography • afinitní chromatografie – AC
1
Detekce peptidů a bílkovin v HPLC a kapilární elektroforéze • UV λ = 280 nm, λ < 230 nm • derivatizace a UV/VIS detekce ninhydrin → A570 dabsylchlorid → A430
DTNB – selektivní detekce thiolových skupin → absorpční maxima při 412 a 357 nm S
S
SSR
+ O2N
NO2 COOH
COOH
SH
+
RSH O2 N
O2 N COOH
COOH
Detekce peptidů a bílkovin v HPLC a kapilární elektroforéze • FLD – vlastní fluorescence bílkovin (Trp) • derivatizace a FLD reakce s o-ftalaldehydem a merkaptoethanolem reakce s dansylchloridem…
• MS
2
SEC resp. GPC peptidů a bílkovin Gely modifikované dextrany (Sephadex, Superdex), agarosové gely… Rozměry kolon 4,6 × 250 mm, 10 × 300 mm, 16 × 600 mm… Mobilní fáze konc. roztoky močoviny (6M), guanidinu vodný roztok elektrolytu (0,2-0,5 M) + pufr (např. fosfátový 0,02M) nebo samotný pufr (Tris-HCl) někdy přídavek org. rozpouštědla (10-30 %, MeOH nebo ACN) Separační mechanismy Malá separační účinnost
IEC bílkovin Stacionární fáze: katexy -SO3-, -COOanexy -CH2CH2-N+Et3, -CH2CH2-NH+Et2 Gradientová eluce: kyselý pufr (katexy) nebo alk. pufr (anexy) + rostoucí konc. elektrolytu Separace podle náboje
IEC dělení bílkovin na silně kyselém katexu (1): chymotrypsin (2): cytochrom c (3): lysozym
3
RPC peptidů a bílkovin • dělení podle hydrofobních vlastností předpokládaný retenční čas peptidu lze vypočítat jako sumu retenčních příspěvků aminokyselin s korekcí na uspořádání molekuly • stacionární fáze: – SiC18, SiC8, SiC4, SiPh… – porézní grafitický uhlík
• mobilní fáze 1. voda (vodný tlumivý roztok) + ACN nebo MeOH (někdy THF) 2. (1) + iontově párové činidlo (0,1 % TFA tj. CF3COOH, případně HFBA)
• zpravidla gradientová eluce (↑ ACN nebo MeOH) (s konstantní konc. TFA)
Příklad RPC separace peptidů a aromatických karboxylových kyselin
Hypercarb PGC 4,6 × 100 mm × 5 µm A: voda + 0,1 % TFA B: ACN + 0,1 % TFA
4
HIC peptidů a bílkovin • hydrofobní stacionární fáze • mobilní fáze: vodný roztok elektrolytu o vysoké koncentraci (několik mol/l) • gradient: pokles koncentrace elektrolytu → hydrofobní interakce slábne • výhodné pro separaci proteinů v nativním stavu
RPC a HIC separace peptidů
RPC: A: 0,1 % TFA ve vodě, B: 0,1 % TFA v 50 % ACN
HIC: A: 2M (NH4)2SO4 + 0,025 M K2HPO4 (pH 6,5) B: 0,025 M K2HPO4 (pH 6,5)
5
Elektromigrační metody dělení peptidů a bílkovin • gelová elektroforéza ve sloupcích (trubičkách) nebo v plošném uspořádání – agarosové gely – polyakrylamidové gely (PAGE)…
• kapilární elektroforéza (CE) – kapilární zónová elektroforéza (CZE) – micelární elektrokinetická (kapilární) chromatografie (MEKC, MECC) – kapilární isoelektrická fokusace (CIEF) – kapilání gelová elektroforéza (CGE)
• (kapilární) isotachoforéza (CITP, ITP)
Isoelektrická fokusace (IEF) • v gelu s gradientem pH se jednotlivé částice pohybují z místa startu do místa, kde ztratí náboj (pI) • gradient pH se v gelu vytvoří předchozím vložením napětí a je stabilizován přítomností nízkomolekulárních amfolytů (oligoaminooligokarboxylových kyselin) pH klesá od katody k anodě • dělení podle pI: lze rozlišit látky s rozdílem pI > 0,001
6
SDS-PAGE elektroforéza • dělení v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS) • asociáty SDS s jednotlivými bílkovinami získávají prakticky stejný náboj vazba cca 1,4 g SDS na 1 g bílkoviny • v gelu se jednotlivé částice dělí podle velikosti molekuly
Detekce bílkovin v gelu • vazba organického barviva amidočerň, methylenová modř, Comassie blue vypírání z gelu roztokem kys. octové • reakce s fluoreskaminem (reagují všechny prim. aminy) O O
O
O
→ fluoreskující derivát • redukce Ag+ na kovové stříbro (velmi citlivé) • specifická detekce – reakce s protilátkou • blotting
7
Dvourozměrná gelová elektroforéza 2D GE nejčastěji IEF × SDS-PAGE 2D GE gluteninů pšeničných odrůd Okapi a Avalon 1. IEF v ultratenké vrstvě (0,25 mm) 2. SDS-PAGE
Kapilární elektroforéza, CE
Dávkování vzorku
Elektroosmotický tok
hydrostatická metoda hydrodynamická metoda elektrokinetická metoda
vnitřní povrch křemenné kapiláry je nabit záporně vznik elektrické dvojvrstvy ⇒ EOF
8
CZE peptidů a bílkovin Dělení částic podle jejich náboje závisí na IEB a pH pufru
Význam složení pufru • interakce molekul proteinů s povrchem kapiláry ⇒ rozšiřování zón, prodlužování analýzy • potlačení interakce: ↑ iontové síly, přídavek aminu (putrescin)
• příliš alkalický pufr ⇒ záporný náboj proteinu i stěny ⇒ ↑ EOF, ↓ migrace částic analytu • příliš kyselý pufr ⇒ záporný náboj stěny mizí, kladný náboj proteinu ⇒ EOF slábne (mizí při pH < 3)
MEKC peptidů a bílkovin • přídavek surfaktantu do pufru aniontové surfaktanty: SDS, alkansulfonové kyseliny kationtové surfaktanty: dodecyltrimethylamonium bromid, cetyltrimethylamonium bromid, tetradecyltrimethylamonium chlorid • při separaci se uplatňuje selektivní tvorba micel surfaktant-analyt • neionogenní surfaktant nebo aniontový surfaktant – zůstává záporný povrch kapiláry • kationtový surfaktant – povrch kapiláry získává kladný náboj ⇒ směr EOF se obrací
9
MEKC analogů angiotensinu
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
Pufr 10 mM Tris + 10 mM Na2HPO4 + 50 mM DTAB, pH 7,05 (1): [Ile7]-Ang III, (2): [Val4]-Ang III, (3): Ang III, (4): [Val5]-Ang II, (5): Ang II, (6): Des-Asp1-Ang I, (7): Ang I
Postup při vývoji CE metody dělení bílkovin • výběr detekčních podmínek např. absorbance při 200, 214, 280 nm • výběr separačního módu, pufru, jeho pH nejprve 100 mM boritan, pH 8,3-8,6 nebo 50 mM fosfát pH 7,5 • optimalizace teploty kapiláry t ↑ ⇒ zkrácení migračních časů • optimalizace napětí • zlepšení rozlišení dělených látek použití aditiv pufru (MeOH nebo ACN, diaminy…) • optimalizace nastřikovaného objemu vzorku nástřik tlakem, závislost rozlišení na objemu
10
Vícerozměrné separace • postupná analýza frakcí z předchozí separace SEC → RPC SEC → IEC → RPC SEC → CE • LC × LC comprehensive two-dimensional liquid chromatography • LC × LC × CE
Příklad postupné analýzy chromatografických frakcí při izolaci a charakterizaci metalothioneinů
11
Možné uspořádání při LC × LC
Příklad chromatogramu IEC × SEC A – glukosa oxidasa B – ovalbumin C – β-laktoglobulin A D – trypsinogen E – α-chymotrypsinogen F – konalbumin G – ribonukleasa H – hemoglobin
Příklad uspořádání LC × LC × CE
12
Hmotnostní spektrometrie peptidů a bílkovin • FAB-MS fast atom bombardment • ESI-MS electrospray ionization • MALDI-MS matrix-assisted laser desorption/ionization – přístroje obvykle používají TOF analyzátor – v proteomice hlavní analytická metoda
MALDI-MS
Sloučeniny používané jako matrice 1 – α-kyano-4- hydroxyskořicová kys. (CCA) 2 – sinapová kys. (SA) 3 – 2,5-dihydroxybenzoová kys. (DHB)
13
MALDI-MS spektrum imunoglobulinu
ESI-MS bílkovin Klastry vícenásobně nabitých iontů (M + zH)z+ Výpočet M : m/z = q zvolený pík na začátku řady: q1 z1 = M + z1 mp další pík vzdálený od prvního o j-1 klastrů: q2 (z1 – j) = M + (z1 – j) mp ⇒ z1 = j (q2 – mp) / (q2 – q1) ESI-MS spektrum lysozymu λ
M = z1 (q1 - mp)
14
MS/MS peptidů a bílkovin nejčastěji ESI CID MS/MS fragmentace molekulových iontů peptidů
Příklad MS/MS peptidu
Spektra peptidu Tyr-Gly-Gly-Phe-Met (YGGFM)
15
ESI-MS spektra EC peptidů a – γ-Glu-Cys-Gly (GSH) b - γ-Glu-Cys- γ-Glu-Cys-Gly (PC2)
CID - MS/MS spektra EC peptidů a – γ-Glu-Cys-Gly, mateřský ion 308 b - γ-Glu-Cys- γ-Glu-Cys-Gly, mateřský ion 540
16
Analýza peptidů v potravinách Karnosin, anserin a balenin H N
H2N
COOH CH2
O
H N
H2N
H N
H2N
N
COOH CH2
O
CH2
O
NH N
COOH
CH3
N N
N H3C
• peptidy svalové tkáně • možnost rozlišení druhu masa podle poměru karnosin/anserin • markery přídavku živočišné bílkoviny
Stanovení karnosinu a anserinu • extrakce ze vzorku a deproteinace methanolem nebo roztokem HClO4 • stanovení IEC kolona Spherisorb SCX (4,6×250 mm) mobilní fáze A: 20 % ACN v 6 mM HCl B: A+ 0,8M NaCl • pokolonová derivatizace s OPA+ME fluorimetrická detekce λex = 340 nm, λem = 445 nm
Chromatogram vzorku krmiva křivky shora dolů: vzorek a přídavky 0,5, 1 a 5 ppm karnosinu a anserinu
17
Jiná metoda stanovení karnosinu a anserinu • předkolonová derivatizace peptidů dabsylchloridem • stanovení LC-MS
Analytická proteomika • Proteom – soubor všech proteinů určitého organismu • Proteomika – obor zabývající se studiem proteomu • Analytická proteomika – analýza kombinací separačních metod a hmotnostní spektrometrie s cílem identifikace jednotlivých bílkovin (určení Mr, sekvence aminokyselin a posttranslačních modifikací) Základní přístupy k analýze proteomu • Bottom-up proteomika (klasický postup): izolace bílkoviny, její enzymová hydrolýza a MS analýza peptidových štěpů • Top-down proteomika: izolace bílkoviny a MS analýza fragmentací molekuly • Shotgun proteomika: směs bílkovin je enzymově rozštěpena, vzniklé peptidy jsou separovány a sekvenovány tandemovou MS
18
Klasický postup proteomické analýzy 1. Oddělení proteinové frakce z biologického materiálu (srážení a denaturace) 2. Separace proteinů a jejich izolace − 2D gelová elektroforéza, vyříznutí částí gelu s jednotlivými bílkovinami − vícerozměrná chromatografie SEC, IEC, RPC, sběr frakcí
3. Enzymová hydrolýza jednotlivých čistých bílkovin (např. trypsin, pH 7-8, 4-12 h, 37 °C, štěpí vazby Arg-X a Lys-X zastavení reakce okyselením) 4. Hmotnostní spektrometrie (nejčastěji MALDI-MS) peptidových štěpů vzniklých hydrolýzou 5. Vyhledání struktur bílkovin v databázi sekvencí podle Mr peptidových štěpů
19
