Biochemie I
Aminokyseliny a peptidy
Aminokyseliny a peptidy (vlastnosti, stanovení a reakce)
AMINOKYSELINY Když se řekne AK ( -COOH, -NH2 nebo -NH-) prostorový vztah aminoskupiny a karboxylové skupiny: - (=2-), -(=3-)..... -(= poslední) -alanin: +H3N-CH2-CH2-COO-aminobutyrát (GABA): +H3N-CH2-CH2-CH2-COO-
AMINOKYSELINY -aminokyseliny: konfigurace (podle Fischera) COOD:
H
C R
NH3+
COOL:
NH3+
C
H
R
Kódované aminokyseliny (20): -aminokyseliny (kromě prolinu – NH2 skupina zabudována do cyklu)). Alfa = aminoskupina na uhlíku, který nese karboxylovou skupinu.
AMINOKYSELINY
L- -aminokyseliny: kódované (= proteinogenní, viz dále) nekódované: - odvozené od kódovaných aminokyselin -Tyr katecholaminy (dopamin, adrenalin, tyroxin...) -vzniklé modifikacemi bílkovin (posttranslační modifikace) - metabolické meziprodukty (ornithin, citrulin)
Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Glycin Gly
Vzorec
Polarita
Esenciální
COO H C H
N
N
N
N
+
NH3
Alanin Ala
COO H C CH3 +
NH3
Valin Val Leucin Leu
COO - CH 3 H C HC + CH3 NH3 COOH C CH2 HC +
NH3
CH3 CH3
N
E
N
E
Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka
Vzorec COO-
Isoleucin Ile
Polarita
CH2 CH3
H C HC
N
E
N
N
N
E
P
N
N
E
CH3
+
NH3
COOCH2 H C
Prolin Pro
Esenciální
CH2
+
H2N
CH2
COO-
Fenylalanin Phe Tyrosin Tyr Tryptofan Trp
C
H
CH2 +
NH3
COOH C CH2
OH
+
NH3 COOH C
CH2 +
NH3
N H
Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Histidin His
Vzorec COO-
NH
H C CH2 C +
NH3
Serin Ser
Polarita
Esenciální
CH +
NH
Z
N
P
N
P
E
P
N
N
E
CH COO -
H C CH2 OH +
NH3
Threonin Thr
COO -
+
NH3
Cystein Cys
CH3
H C CH OH
COOH C CH2 SH +
NH3
Methionin Met
COOH C CH2 CH2 S CH3 +
NH3
Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka
Vzorec
Esenciální
COO-
Lysin Lys Arginin Arg
Polarita +
H C CH2 CH2 CH2 CH2 NH3 +
NH3 COO-
Z
E
Z
N
K
N
K
N
P
N
P
N
+
NH2
H C CH2 CH2 CH2 HN C + NH2 NH 3
Asparagová kyselina Asp Glutamová kyselina Glu
COO H C CH2 COO +
NH3 COOH C CH2 CH2 COO+
NH3 COO-
Asparagin Asn Glutamin Gln
H C CH2 CONH2 +
COO -
NH3
H C CH2 CH2 CONH2 +
NH3
Naučit se AK včetně označení hmotnosti v Tab jsou uváděny o 18 nižší, tedy takové jaké jsou v bílkovinném řetězci
Rozdělení podle chemické povahy postranních řetězců Funkční skupiny:
Alifatické Aromatické Hydroxylové Sulfhydrylové Kyselé Basické Polární Nepolární
Hydrofobní aminokyseliny
Polární aminokyseliny
Kyselé aminokyseliny
Bazické aminokyseliny
Větvené aminokyseliny • • • •
leucin, valin, izoleucin energetické substráty nezbytné v těžkých stavech (sepse, polytraumata) součástí specializovaných roztoků aminokyselin
Kódované aminokyseliny: Jednopísmenkové zkratky Proč jsou v tabulce vzorce s náboji?
obojetné ionty = amfionty
COO H
C
H +
NH 3
celkový náboj amfiontu: součet všech nábojů (pro Gly v pH 7 = 2) volný náboj amfiontu: algebraický součet nábojů (pro Gly v pH 7 = 0)
Úvod do teorie elektrolytické disociace: kyselina: např.
H+ + A-
HA
H+ + CH3-COO-
CH3-COOH
a termodynamická disociační konstanta
zdánlivá
přičemž
H + AKA
Ka
HA
KA
H
. HA
A
Ka
H
.a
a HA
A
Úvod do teorie elektrolytické disociace: báze:
B + H2O
např:
CH3-NH2 + H2O
BH+ + OHCH3-NH3+ + OH-
bazická zdánlivá disociační konstanta: ale:
Kw = [H+] . [OH-] a tedy:
po spojení: K
BH + OH -
KB
[ OH ]
B .[ H 2 O]
Kw [H ]
BH + Kw B
B .[ H ].[ H 2 O]
[H2O] zahrnu do konstanty a vypočtu 1/KB:
1
B][ H + KB
BH
.[ Kw ]
Kyselá disociační konstanta KA ionisované formy báze B (např. CH3-NH3+) KW je tedy rovna:
KA
KB
KYSELÉ DISOCIAČNÍ KONSTANTY pKA SKUPIN VYSKYTUJÍCÍCH SE V BÍLKOVINÁCH
-COOH 2,5
, -COOH imidazolium 4,0
6,0
-SH
-NH3+
8,3
9,5
fenol 10,1
-NH3+ guanidinium 10,5
12,5
Hodnoty pKA disociovatelných skupin v aminokyselinách a bílkovinách (25 oC) Funkční skupina -karboxylová , karboxylová imidazolová -aminová
Aminokyselin a C-koncová Asp, Glu His N-koncová
Hodnoty pKA nalezené ve volných aminokyselinách 1,7 - 2,6
Hodnoty pKA nalezené v bílkovinách 1,8 - 3,6
3,86; 4,25
3,0 - 4,7
6,0
5,6 - 7,0
8,8 - 10,7
7,9 - 10,6
-aminová
Lys
10,53
9,4 - 11,0
sulfhydrylová
Cys
8,33
8,3 - 8,6
fenolová
Tyr
10,07
9,8 - 10,8
guanidylová
Arg
12,48
11,6 - 12,6
TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN
Mám roztok slabé kyseliny. Jak se bude měnit pH, když budu přidávat NaOH? H + AKA
HA
Na začátku: jen HA, množství A- odpovídá množství přidaného louhu. H
+
KA
HA A-
převedeme na pH: (Hendersonova - Hasselbalchova rovnice) pH
pK A
log
A HA
TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN
Titrační křivka glycinu
COOH C CH2 CH2 COO+
NH3
COO+
H C CH2 CH2 CH2 CH2 NH3 +
NH3
COO-
NH
H C CH2 C +
NH3
CH +
NH CH
Cystin = cystinylcystein
Titrační křivka cystindihydrochloridu
12 10
pH
8 6 4 2 0 0
1
2
3
[NaOH]/[cystin.2HCl]
4
ISOELEKTRICKÝ BOD
DEFINICE: pH, při němž se amfiont nepohybuje ve stejnosměrném elektrickém poli (interakce s dalšími ionty, závisí na prostředí - pufr); označujeme pI
Isoionický bod: pH, při němž je v destilované vodě volný náboj iontu nulový.
ISOELEKTRICKÝ BOD př.: Gly (titruji Gly.HCl) COOH
KA1
H C H
COO +
NH3
log
[Gly ] Gly
2 pH
pK A1
NH2
NH3
Z = +1 (Gly1+)
pK A1
COOH C H
H C H
+
pH
KA2
-1 (Gly-1)
0 (Gly )
pH
pK A 2
pK A2
log
log
[Gly ] Gly
[Gly ] Gly
Ale v pH = pI platí: [Gly1+] = [Gly-1] takže:
pI
( pK A1
pK A2 ) / 2
Více disociovatelných skupin: rozhodují ty, které "sousedí" s pI (nutno načrtnout titrační křivku) Pro polyionty (např. bílkoviny) tuto rovnici nelze použít (příliš mnoho pKA v okolí pI) Isoelektrické body kódovaných aminokyselin AK
pI
AK
pI
AK
pI
AK
pI
Gly
6,0
Ser
5,7
Phe
5,5
His
7,6
Ala
6,0
Thr
5,6
Tyr
5,7
Lys
9,6
Val
6,0
Cys
5,0
Trp
5,9
Arg
10,8
Leu
6,0
Met
5,7
Asn
5,4
Asp
3,0
Ile
6,0
Pro
6,4
Gln
5,6
Glu
3,2
OPTICKÉ VLASTNOSTI Absorpce UV záření: aromatické (především Tyr a Trp) u 280 nm Absorpční spektra 1: hovězího sérového albuminu (1 mg/ml), 2: lidského imunoglobulinu (1 mg/ml) a 3: DNA (0,1 mg/ml), optická délka kyvety 1 cm. Optická aktivita: konfigurace (nesouvisí přímo se smyslem rotace) 1,6
3
2
1,4
absorbance
1,2 1 0,8 0,6
1
0,4 0,2 0 210
230
250
270
290
vlnová délka [nm]
310
330
Chemické reakce AK Stanovení AK (reakce aminoskupin): ninhydrin, Sangerovo činidlo, dansylchlorid
Chemické reakce AK Reakce postranních řetězců: modifikační reakce - různá specifita např. R2
R2
CO
CO
H C CH2
OH
+ I2
H C CH 2
NH
NH
R1
R1
OH I
značení bílkovin radioaktivním jodem R2
R2
CO
CO
H C H 2C SH + ICH2-CONH2
H C H 2C S CH2-CONH2 + HI
NH
NH
R1
R1
blokování SH skupin (proti oxidaci a vzniku disulfidových můstků)
Chemické reakce AK
Nejdůležitější reakce (hypothetická): vznik peptidové vazby +
H3N
CH R1
COO-
+
+
H3N
CH R2
COO-
+
H3N
CH
C
NH CH
R1
O
R2
COO-
Chemické reakce AK
Chemické reakce AK
Nomenklatura peptidů N- konec (začátek), C-konec (konec) acylaminokyseliny, např. Gly.Ala.His = glycylalanylhistidin Pozor: Ala.Tyr
Tyr.Ala
O +
H3N
O
CH C NH CH CH3
H2C
OH
COO-
+
H3N
CH C NH CH
H2C
OH
CH3
COO-
PŘIROZENÉ PEPTIDY
Zvláštnosti struktury: ·
nekódované aminokyseliny (ornithin, -alanin ...)
·
často i D-aminokyseliny
·
někdy i tzv. -peptidové vazby (Glu)
·
cyklické struktury (laktamy, disulfidové vazby)
·
větvené struktury
blokování konců (pyroglutamát, glycinamid)
Biosynthesa
•
meziprodukty odbourávání bílkovinných prekursorů
•
synthesa pomocí speciálních enzymových reakcí (ne na ribosomech cestou protheosynthesy)
Skupiny přirozených peptidů
·
di a tripeptidy (glutathation, umělý aspartám...)
·
peptidové hormony (oxytocin, vasopresin....přechod k proteohormonům)
·
neuromodulátory: enkefaliny (pentapeptidy), endorfiny (15 - 32 AK)
·
peptidová antibiotika (mnoho nekódovaných AK)
·
peptidové zoo- a fytotoxiny (hadi, štíři, apamin, falloidiny a amanitiny: phalloides)
·
protaminy (malé bazické lineární peptidy, mlíčí ryb) polyaminokyseliny (buněčné stěny bakterií: poly- -L-Glu, poly- -D-Glu)
Amanita
Skupiny přirozených
peptidů
URČOVÁNÍ CELKOVÉHO AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ
AK1-AK2-AK3 ....AKn
kyselá nebo bazická hydrolysa
AK1 + AK2 + AK3 +....+ AKn
(určit kvalitativní i kvantitativní jednotlivé aminokyseliny chromatografické dělení)
URČOVÁNÍ SEKVENCE AMINOKYSELIN V ŘETĚZCI
Edmanovo odbourávání
URČOVÁNÍ N-KONCOVÉ AMINOKYSELINY
Sangerova reakce
URČOVÁNÍ N-KONCOVÉ AMINOKYSELINY
Edmanovo odbourávání
SYNTHESA PEPTIDŮ in vitro a) aktivace (aktivní estery, anhydridy, azidy, karbodiimidová synthesa) b) blokování skupin, které nemají reagovat c) synthesa peptidové vazby d) odblokování Q HN
O CH "
CO-X
R1 R10
+
+
H3N
CH "
COO-
R2 R10
+
H3N
CH "
C
R1 R10
NH CH "
COO-
R2 R10
+ HX
Chromatografické metody pro separaci proteinů • Gelová chromatografie • Ionexová chromatografie • Chromatografie s hydrofóbní interakcí • Afinitní chromatografie
Ionexová chromatografie • Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj • Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje • V případě proteinů hraje zásadní roli pH ! • Celulosové a dextranové ionexy
Ionexy • Katexy – záporný náboj vazba kationtů silné – sulfo (S), sulfopropyl(SP) OSO3slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO• Anexy – kladný náboj vazba aniontů slabé – diethylaminoethyl (DEAE) silné – triethylaminoethyl (TEAE)
Ionexová chromatografie proteinů • Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny • pH < pI bílkovina nese kladný náboj separace na katexu
• pH > pI bílkovina nese záporný náboj separace na anexu • pH = pI celkový náboj bílkoviny je nulový nelze provést ionexovou chromatografii
Ionexová chromatografie • Nanášení vzorku – nízká iontová síla • Eluce – gradientová • Zvyšováním iontové síly • Změnou pH Použití – purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru
Typická ionexová chromatografie Loading ends, Low salt wash begins
1M
Salt gradient
0
Protein absorbance
II III Loading starts
Peak of unbound protein
Salt gradient begins
Salt gradient ends
I Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II) and tightly bound (III) proteins
Příklad 1 Roztok obsahující kyselinu asparagovou (pI = 2,98), glycin (pI = 5,97), threonin (pI = 6,53) a lysin (pI = 9,74) v citrátovém pufru pH 3,0 byl nanesen na sloupec Dowex-50 (katex). V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly? COO -
COO -
H C CH2 COO -
H C H
+
+
NH3
COO -
NH3
CH3
H C CH +
NH3
COO+
H C CH2 CH2 CH2 CH2 NH3
OH
+
NH3
Příklad 2 Na sloupec DEAE-celulosy (anex) byl nanesen vzorek obsahující sérový albumin, ureasu a chymotrypsinogen (isoelektrické body pI jsou 4,9; 5,4 a 9,5) v pufru pH 7,0. V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly?
