Aminokyseliny, Peptidy, Proteiny

Aminokyseliny, Peptidy, Proteiny

Proteiny jsou nejrozšířenější biologické makromolekuly Proteiny jsou tvořeny kombinací 20 α-aminokyselin Aminokyseliny sdílejí společné základní strukturní vlastnosti

α-uhlík váže amino a karboxylovou skupinu

Aminokyseliny mohou být rozděleny do několika skupin podle charakteru jejich vedlejšího řetězce • Nepolární alifatické

• Nepolární • Polární

• Nabité

• Aromatické • Polární, nenabité • Pozitivně nabité • Negativně nabité

Cystin je aminokyselina tvořená dvěma cysteiny

*

Fyzikální vlastnosti aminokyselin

Aminokyseliny jejich názvosloví a zkratky

Alanine

Ala

A

Arginine

Arg

R

Asparagine

Asn

N

Aspartic acid

Asp

D

Cysteine

Cys

C

Glutamic acid

Glu

E

Glutamine

Gln

Q

Glycine

Gly

G

Histidine

His

H

Isoleucine

Ile

I

Leucine

Leu

L

Lysine

Lys

K

Methionine

Met

M

Phenylalanine

Phe

F

Proline

Pro

P

Serine

Ser

S

Threonine

Thr

T

Tryptophan

Trp

W

Tyrosine

Tyr

Y

Valine

Val

V

Aminokyseliny jsou dipolární ionty Za fyziologického pH je amino skupina protonovaná a karboxylová skupina deprotonovaná

Iontové formy leucinu • Za nízkého pH, karboxyl je protonovaný a amino skupina je kladně nabitá

• Za neutrálnío pH, karboxyl je deprotonovaný a amono skupina je protonovaná. Výsledný náboj je nulový • Za vysokého pH, karboxylová skupina je záporně nabitá a amino skupina je neutrální (–NH2)

Titrační křivka leucinu

Iontové formy glutamové kysleiny • Ionizace některých skupin vedlejšího řetězce

• Titrační křivka je mnohem komlexnější

Aminokyseliny jsou chirální molekuly

• Asymetrický uhlík – α-uhlík

• Biosyntetické procesy produkují čisté stereoizomery • Aminokyseliny v proteinech mají L konfiguraci • D-aminokyseliny se nacházejí v některých krátkých bakteriálních peptidech

Biologicky aktivní deriváty aminokyselin

Polypeptidy - Proteiny lineární řetězce aminokyselin spojených peptidovou vazbou

• Variabilita v délce řetězce a sekvenci aminokyselin – klíčový faktor přispívající k diverzitě tvaru a biologické funkce proteinů • Vedlejší řetězce aminokyselin určují vlastnosti proteinů – slabé nekovalentní interakce

Peptidová vazba Polymerace aminokyselin a vznik peptidové vazby - dipetidy, tripeptidy, ..., oligopeptidy, ..., polypeptidy -

Velikost některých proteinů

Funkce peptidů • Hormony a feromony • Neuropeptidy • Antibiotika • Ochrana, např. toxiny

Proteiny jsou tvořeny • Polypeptidy (polymery -aminolyselin) + další: • kofaktory • koenzymy • prostetické skupiny • další modifikace • Kofaktor je obecný termín pro funkční neaminokyselinovou součást – Ionty nebo organické molekuly

• Koenzym je označení pro organický kofaktor – NADH

• Prostetická skupina je kovalentně vázaný kofaktor – Hem v hemoglobinu

Modifikace proteinů Post-translační modifikace proteinů • Štěpení proteinů • Kovalntní vazba různých molekul a kofaktorů (konjugované proteiny) • Chemická modifikace vedlejších řetězců amoinokyselin

Příklady konjugovaných proteinů

Modifikace vedlejších řetězců aminokyselin

• Nezvyklé aminokyseliny nejsou inkorporovány při syntéze na ribozomech • Vznikají při post-translační modifikaci proteinů • Reversibilní nebo ireverzibilní modifikace, např. fosforylace při signalizaci, hydroxylace prolinu v kolagenu

Modifikace vedlejších řetězců aminokyselin

Modifikace vedlejších řetězců aminokyselin

Separace směsí proteinů • Separace závisí na rozdílných fyzikálně – chemických vlastnostech – – – – – –

Náboj Velikost Afinota k ligandům Rozpustnost Hydrofobicita Tepelná stabilita

Chromatografie - iontová - gelová filtrace - affinitní

Elektroforéza -nativní -isoelektrická fokusace - SDS

Centrifugace - preparativní - analytická

Sekvenace proteinů

Sekvenace proteinů • N-terminální sekvenace

• Pouze omezeně dlouhé řetězce • Delší proteiny musí být napřed naštípány na kratší oligopeptidy

• Sekvence jsou pak rekonstruovány z překrývajících se částí • Identifikace proteinů podle N-terminálních sekvencí • Databanka sekvencí

Protein Data Bank .pdb file format http://www.rcsb.org/

Sekvence proteinů odhalují evoluční příbuznost

Fylogenetické stromečky a evoluční historie

Změna proteinů během evoluce

Struktura proteinů

Primární, Sekundární, Terciální, Kvartérní struktura proteinů

Primární struktura proteinů • Sekvence aminokyselin v polypeptidovém řetězci

• Struktura proteinů je částečně dána vlastnostmi peptidové vazby

Struktura peptidové vazby peptidová vazba je planární • díky rezonanci má peptidová vazba částečný (~ 40%) charakter dvojné vazby a proto nedochází k její rotaci peptidová vazba je resonanční hybrid dvou kanonických struktur

Struktura peptidové vazby • Rezonance způsobuje, že je peptidová vazba: – méně reaktivní ve srovnání s např. estery – více rigidní a téměř planární – vykazuje velký dipólový moment

Rigidní peptidová vazba a částečné rotace kolem ní • Peptidová vazba nepodléhá rotaci • Rotovat mohou vazby kolem alfa uhlíku aminokyseliny

Rigidní peptidová vazba a částečné rotace kolem ní • Φ (fí): dihedrální úhel mezi uhlíkem a dusíkem (C-Cα-NC)

• y (psí): dihedrální úhel mezi -uhlíkem a karbonylem (N-CCα-N) • plně roztažený řetězec má oba úhly y a f 180°

Distribuce f a y dihedrálních úhlů • Některé kombinace f a y úhlů jsou díky stérickým podmínkám vedlejších řetězců aminokyselin velmi problematické • Jiné kombinace f a y úhlů jsou preferované i třeba díky tvorbě vodíkových vazeb • Ramachandranův plot znázorňuje distribuci možných f a y dihedrálních úhlů v proteinech • ukazuje základní sekundární struktury • odhaluje oblasti s neobvyklou strukturou

Ramachandranův plot

Ramachandranův plot

Sekundární struktura proteinů • Sekundární struktura představuje opakující se speciální místní uspořádání peptidového řetězce • Základní a nejběžnější sekundární struktury stabilizované vodíkovými vazbami: –  helix (šroubovice)

–  sheet (skládaný list) –  turn (ohyb) • Náhodné uspořádání polypeptidového řetězce se nazývá random coil (náhodné klubko)

 helix

 helix •

Pravotočivá šroubovice se 3,6 jednotkami na otočku a se stoupáním 5,4 Å

• Šroubovice je držena vodíkovými vazbami mezi sousedními páteřními aminokyselinami • Vedlejší řetězce směřují ven od osy šroubovice a jsou k ní přibližně kolmé

 helix • Vnitřní rozměr šroubovice je přibližně 4 – 5 Å (příliš malý na to, aby se tam cokoli vešlo) • Vnější rozměr šroubovice (s vedlejšími řetězci) je 10 – 12 Å (vejde se do velkého žlábku dvoušroubovice DNA)

Sekvence a tvorba  helixu • Ne všechny sekvence mohou nabývat tvaru šroubovice • Malá hydrofobní rezidua jako je Ala nebo Leu silně podporují tvorbu šroubovic • Pro ruší helikální struktury díky zamezení rotace kolem vazby N-Ca • Gly ruší helikální struktury díky absenci vedlejšího řetězce, což dovoluje více možných konformací

 Sheet

 Sheet • Planarita peptidové vazby a geomerie uhlíku vytváří strukturu podobnou skládanému listu • Listová struktura je fixována vodíkovými vazbami mezi jednotlivými vlákny řetězců • Vedlejšé řetězce směřují ven kolmo na rovinu listu vždy střídavě nahoru a dolu

Paralelní a antiparalelní  Sheet • U paralelních struktur směřují sousední řetězce spojené vodíkovými vazbami vždy stejným směrem

Paralelní a antiparalelní  Sheet • U antiparalelních struktur směřují sousední řetězce spojené vodíkovými vazbami vždy opačným smětem

 Turn • Ohyb -turn se hojně vyskytuje ve spojení se strukturami skládaného listu v místech, kde se musí řetězec otočit např. do protisměru • Ohyb o 180° je zabezpečen čtyřmi aminokyselinami • Ohyb je stabilizován vodíkovými vazbami karbonylového kyslíku k protonu amidu aminokyseliny o tři pozice dále v sekvenci • Prolin v pozici 2 nebo glycin v pozici 3 jsou charakteristickými znaky struktur -turn

Structury β-turn

Terciální struktura proteinů • Molekuly proteinů získávají ve vodném prostředí specifickou 3D konformaci • Přesně definovaná struktura je nezbytná pro specifickou biologickou funkci • Funkční struktura se nazývá native fold • Specifická struktura je zajištěna řadou různých druhů interakcí v rámci samotného proteinu • Během sbalování proteinu dochází k poklesu entropie

Interakce v proteinech • Hydrofobní efekt • Vodíkové vazby

• Elektrostatické interakce • Dipól-dipólové interakce • Londonovy dispersní síly

Terciální struktura proteinů • Terciální struktura představuje celkové prostorové uspořádání atomů (funkčních skupin, aminokyslein) v proteinu • Existují dvě základní skupiny proteinů: – vláknité proteiny ¤ typicky nerozpustné, tvořené většinou jednou sekundární strukturou

– globulární proteiny ¤ ve vodě rozpustné proteiny ¤ membránové protein ¤ mohou být tvořeny více sekundárními strukturami

Struktura kolagenu vláknitý protein

Struktura velrybího myoglobinu globulární protein

ABC transportér E. coli globulární membránový protein

Motif a fold ve struktuře proteinů • motif - propojení více sekundárních struktur • fold - uspořádání sekundárních struktur do vyšších strukturních motivů

Kolik je strukturních foldů?

• Počet unikátních foldů je v přírodě omezen a poměrně nízký (pravděpodobě několik tisíc) • 90% nových proteinových struktur v PDB databázi za posledních deset let má podebné strukturní foldy, za poslední tři roky se prakticky neobjevují nové foldy

Kvartérní struktura •

Kvartérní struktura popisuje seskupení jednotlivých proteinových podjednotek tvořících větší funkční strukturní celek

Dimer homodimer, heterodimer Cro protein z bacteriofága lambda

Tetramer lidský hemoglobin

Primární – Sekundární – Terciální – Kvartérní struktura Shrnutí

(a) Lineární sekvence aminokyselin (b) Specifické lokální uspořádání peptidového řetězce stabilizované vodíkovými vazbami mezi aminokyselinami tvořícími řetězce

(c) Finální 3D struktura jednoho polypeptidového řetězce stabilizovaná nevazebnými interakcemi mezi aminokyselinami peptidového řetězce

(d) Specifické prostorové uspořádání více polypeptidových podjednotek tvořící jeden funkční celek proteinového komplexu

Sbalování a stabilita proteinů

Sbalování a stabilita proteinů • Funkce proteinů závisí na jejich 3D struktuře • Ztráta struktury je spojena se ztrátou aktivity denaturace • Proteiny mohou být denaturovány • teplo nebo chlad • pH extrémy • organická rozpouštědla • chaotropní látky: močovina, guanidinium hydrochlorid, litium perchlorát

• redukce disulfidických vazeb merkaptoethanolem

Renaturace rozbaleného a denaturovaného proteinu ribonukleázy

Refolding ribonukleázy • Ribonukleáza je malý protein s 8 cysteiny, které tvoří 4 disulfidické vazby • Močovina v přítomnosti 2-merkaptoethanolu plně denaturuje ribonukleázu • Pokud je močovina a 2-merkaptoethanol odstraněn, protein spontánně refolduje do původní nativní struktury

• Nativní konformace je determinována samotnou sekvencí • Jednoduchý eperiment, Nobelova cena za chemii z roku 1972 pro Chrise Anfinsena

Jak se protein sbalí tak rychle? • Proteiny se sbalují do energeticky nejnižšího stavu během mikrosekund až sekund. Jak může být tento proces tak rychlý? • Je matematicky nemožné, aby se protein sbalil do své nativní formy náhodným zkoušením všech možných konformací než doputuje do energeticky nejnižšího stavu (Levinthalův paradox)

Levinthalův paradox: U typického proteinu (~125 AK) existuje přibližně 1050 možných konformací. I kdyby trvalo jen 10-13 vteřiny vyzkoušení každé konformace trvalo by to 1030 let vyzkoušet většinu z nich. je tedy zřejmé sbalování neprobíhá náhodně sbalování nativní struktury je určováno termodinamicky výhodnou cestou

Termodynamika sbalování preteinů energetická nálevka

Chaperoniny • Speciální proteiny, které pomáhají sbalovat nově syntetizované proteiny • Přibližně 10 až 15% proteinů v E. coli vyžadují chaperoniny ke sbalení • Potřeba ATP

Další příklady asistovanných molekulárních procesů při sbalování proteinů a posttranslační modifikaci • Disulfidické vazby napříč proteinem – disulfid izomeráza • cis – trans izomerizace prolinu – prolyl cis-trans izomeráza • Hydroxylace prolinu v kolagenu – prolyl 4hydroxyláza (vyžaduje askorbát)

Co musím znát • Struktura 20 základních aminokyselin • Vlastnosti a důležitost vedlejších řetězců aminokyselin

• Optická aktivita (chiralita) aminokyselin • Aminokyseliny v proteinech mají L konfiguraci • Peptidová vazba – základní vlastnosti • Vedlejší řetězce aminokyselin mohou být v proteinech modifikovány • Některé aminokyseliny a jejich deriváty jsou biologicky aktivní • Metody na separaci a identifikaci proteinů • Sekvenační data odhalují evoluční historii proteinů • Primární, sekundární, terciální a kvartérní struktura proteinů • Sbalování proteinů, Chaperoniny a asistované sbalování