LAPORAN AKHIR PENELITIA.J.�
Pengembangan �apid Test dengan Metode RT-LAMP untuk Demam Berdarah Dengue
Nama Penyusun Laporan:
1. Penny Humaidah H, drh., M. Biotech 2. Anis Widyasari, dr 3. Purwati, dr., Sp. PD
Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Jl. Farmako, Sekip Utara, Yogyakarta, 55281
2012
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Pengembangan Rapid Test dengan Metode RT-LAMP untuk Demam Berdarah Dengue
t; an Kesehata!l ) U na Pengem t Badan renciit.ian d;'l.n ·
PERPUSTAKAAN
Tanr,r,al No. ln!3uk {.' • No. "'ass -L
: ..
sbe> ---·��·
.
I
---J __
.. ------- �--- -··
---
-
i\
-- -·---··--·
----
Nama Penyusun Laporan:
•
1. Penny Humaidah H, drh., M. Biotech 2. Anis Widyasari, dr 3. Purwati, dr., Sp. PD
Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada
Jl. Farmako, Sekip Utara, Yogyakarta, 55281 2012
KATA PENGANTAR Puji dan syukur kami panjatkan kepada Allah SWT atas segala curahan 'fabmat dan karunia-Nya, sehingga penelitian yang berjudul "Pengembangan Rapid Test dengan Metode RT-LAMP untuk Demam Berdarah Dengue" berhasil diselesaikan. Tidak lupa sholawat serta salamkami panjatkan kehadirat Nabi Muhammad SAW. Kami menyadari bahwa penelitian ini tidak lepas dari bimbingan dan bantuan dari berbagai pihak, untuk itu kami menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian Kesehatan Republik Indonesia selaku pemberi dana penelitian. 2.
Prof. Dr. drh. Asmarani Kusumawati, M.P., Prof. Dr. dr. Subarto, M.Sc., MPdK., DTM&H., Sp.PD-KPTI, FINASIM., dr. Tri Wibawa, Ph.D. selaku konsultan penelitian kami.
3.
Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
4.
Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
5.
Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
6. Bagian Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. 7.
Divisi Tropik Infeksi Departemen Penyakit Dalam RSU Dr. Soetomo Surabaya.
8.
Komite Etik RSU Dr. Soetomo Surabaya.
Kami menyadari dalam penelitian ini masih terdapat banyak kekurangan dan keterbatasannya, untuk itu kami sangat mengharapkan masukan berupa kritik dan saran yang bersifat membangun. Akhirnya kami berharap semoga tugas akhir
ini dapat memberikan manfaat bagi kami, bagi
perkembangan ilmu pengetahuan serta kemajuan dalam pelayanan kesehatan di Indonesia, Arnin. •
Surabaya, Desember 20 I I
Tim Peneliti
1
DAFTAR ISI
DAFTAR lSI
...................................................................................................................................
DAFTAR GAMBAR DAFTAR TABEL
......................................................................................................................
3
................................ ...........................................................................................
4
RINGKASAN HASIL PENELITIAN BAB I PENDAffiJLUAN
............................................................................................
5
...............................................................................................................
6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
.....................................................................................................
BAB III MATERI DAN METODE
..............................................................................................
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN BAB VI DAFT AR PUSTAKA
9
14
................................................ ......................................
18
........................................................................................
30
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
LAMPIRAN
2
.....................................................................................................
............................................... ........................ ...... ..... ... ....... . .. ...................................
31 32
2
DAFTAR GAMBAR
;1e_
dd-ofrttM
Gambar 1 Kultur Virus Dengue pada C6/ 36._ftril#Jeptiet1S'"yang diinfeksi dengan Gambar 2 Hasil amplifikasi multiplex-one step RT-PCR Gambar 3 Hasil sekuensing amplikon Gambar 4 Hasil reaksi RT-LAMP Gambar 5 Visualisasi basil multiplex one step RT-PCR dan RT-LAMP Gambar 6 Visualisasi hasil amplifikasi menggunakan Sybr green 1 Gambar 7 Profil digesti enzym Gambar 8 Hasil RT -PCR dan RT-LAMP pasien suspect DEN
.........
..................... ........................................
............................ ..............................................................
..............H................................................................................
.....................................
............................................
. ....................... .............................................................................
....................................................
18 19
20
21
22 23
23
24
..
3
DAFTAR TABEL
Tabel 1 Profil laboratoris dan derajad DBD Tabel 2 Diagnosis Dengue dengan pemeriksaan Tabel 3 Tingkat sensitivitas masing-masing metode diagnostik
. ................................................................................
.........................................................................
.....................................•.............
25
26 27
..
4
RINGKASAN HASIL PENELITIAN
Pengembangan Rapid Test dengan Metode RT -LAMP
hl�)�-f--::1 {\.. � ;k �tJ-f'-7L t't �.s>J lL-�tH,k,\ Pf;t Demam berdarah D �� ue adalah penyakit infeksi yang disebabkan oleh v§us Dengue (DENV) I, II, Ill, dan I� yang disebarkan oleh nyamuk Aedes aegypt)i dan Aedes albopictu$1-Lebih dari s�� rtiga populasi.,dunia yang tinggal di daerah yang me_plUikj risiko trcfnsmisi DengueM)ndonesia, wabah DBD terakhir te�adi pada tahun \2004) ,..... -� () ,
untuk Demam Berdarah Den ue
•
I
.
\/"'
dengan angka kejadian � luar biasa tinggi dilaporkan dari 293 kota dan kabupaten di 1 17 provinsi. Saat terjadi infeksi, pengenalan dini dan perawatan suportif yang memadai dapat menurunkan risiko berkembangnya penyakit menjadl lebih berat sehingga deteksi dini penting dilakukan pada kasus-kasus DO dan DBD. Penelitian ini menggunakan metode diagnosa yang dirancang cepat, sederhana, ./ yaitl(cissay LAMP (Loop Med a i ted Isothermal Amplifci ation) untuk amplifikasi asam nuk-(eat berdasarkan prinsip reaksi strand displacement dan pembentukan struktur loop dalam mengamplifikasi target. Efisiensi amplifikasi dalam RT-LAMP disebabkan karena tingginya amplifikasi yang bersifat terus -menerus menghasilkan banyak target (amplikon) DNA serta magnesium pyrofosfat yang menghasilkan tingkat kekeruhan pada tube reaksi. Primer yang digunakan dalam penelitian ini bisa diaplikasikan untuk : isolat virus yang berasal dari RSUD Dr. Soetomo, Surabaya; serotyping dapat dilakukan dengan RT LAMP dan pemeriksaan pada sampel yang suspect DB sejumlah 3Q�ampel yang � sudah dikoleksi. Hasil positif dapat divisualisasikan dengan baik pada reaksi one-step RT dan LAMP selama 60 menit. Analisis statistik menunjukkan bahwa metode RT LAMP memiliki tingkat sensitivitas sebesar 100% dengan RT -PCR sebagai gold standard.
Kata kunci: RT -LAMP, RT-PCR, Virus Dengue, Deteks i Dini
5
BAB I PENDAHULUAN
Latar Belakang Penelitian Demam berdarah Dengue adalah penyakit infeksi yang disebabkan oleh virus . Dengue (DENV) I, II, Ill, dan IV yang d1sebarkan oleh nyamuk Aedes aegyp r dan L-"' Aedes albopictus (Soegijanto, 2006; NIAID, 2009).Lebih dari sepertiga populas1� -1-� ?gtlnggal di daerah yang memiliki risiko transmisi Dengue.Dengue bersifat endemik sedikitnya pada 100 negara di daerah tropis dan subtropis meliputi Afrika, Asia Tenggara, India, Timur Tengah, Amerika Selatan dan Ausralia. emperkirakan bahwa sekitar 50 sampai 100 kasus infeksi Dengue terjadi di setiap tahun di seluruh dunia, termasuk 500.000 kasus Demam berdarah Dengue (DBD) dan 22.000 diantaranya meninggal, yang terbanyak adalah anak-anak (CDC, 201 0; NIAID, 2009). Selama akhir .,dari abad ke-20, banyak daerah tropis mengalami peningkatan jumlah kasus Dengue.Secara epidemis, kasus Dengue terjadi lebih sering dan dengan gejala.,._ kJinis ya� lebih be �t pula (NIAID, 2009). �ovu - ��0) 1 } 7 @Ck ��· �� �done�iaJ wabah DBD terakhir terjadi pada tahun Kementerian _ Kesehatan mencatat sejumlah 58.301 kasus dema engue (DO) dan DBD dan 658 kematian mulai 1 Januari - 30 April 2004. Meskipun mencakup 30 provinsi, wabah dengan angka kejadian yang luar biasa tinggi dilaporkan dari 293 kola dan kabupaten di 17 provinsi. Pada akhir April keadaan kembali normal, semua provinsi melaporkan penurunan angka kejadian pada tingkatan yang rendah (WHO, 2010).Belum tersedia vaksin untuk mencegah infeksi virus Dengue dan perlindungan yang paling efektif adalah menghindari gigitan nyamuk.Saat terjadi infeksi, pengenalan dini dan perawatan suportif yang memadai dapat menurunkan risiko berkembangnya penyakit menjadi lebih berat (CDC, 2010).Hal inilah yang menjadi alasan pentingnya dilakukan deteksi dini pada kasus-kasus DO dan DBD. Metode yang rutin digunakan di laboratorium adalah isolasi dan karakterisasi virus, deteksi antibodi spesifik virus Dengue dan deteksi sekuen genomik dengan teknik \.. ampifikasi asam nukleat (Morita et a/., 1991; Kuno et a/., 1998; Shu et a/. , 2003). lsolasi virus melalui cell line nyamuk dari serum saat fase akut atau sampel plasma masih A.
�
�
,.
)t
"f
�� @
6
•
merupakan gold standard, meskipun metoda tersebut membutuhkan waktu hingga 7 hari untuk melakukan proses dan metoda hingga selesai. �mumnya isolasi virus Dengue pada kultur sel dari sampel klinis tidak sukses karena rendahnya virus yang bersirkulasi di darah saat terjadi viremia karena sifat patogenesis penyakit. Secara serologis infeksi virus Dengue dapat dideteksi dengan level lgM dan lgG dengan metoda ELISA (Innis eta/., 1989). Typing dan konfirmasi jenis virus berdasarkan pada keberadaan titer antibody penetral menggunakan plaque reduction neutraliz ation (PNRT) belum bisa digunakan sebagai standar karena adanya reaksi silang dengan beberapa Flavivirus yang lain dengan kekerabatan yang dekat. lsolasi virus dan PNRT memiliki ting�at kesulitan yang tinggi dan membutuhkan waktu yang banyak hingga selesai ls6fa� virus dan deteksi antibodi memiliki efek yang rendah bagi efektivitas penanganan dan kontroi.Sehingga diperlukan deteksi cepat untuk mendeteksi infeksi virus pada fase akut untuk mendapatkan kepastian diagnosa dan mempercepat tindakan penanganan yang tepat bagi pasien demam berdarah. Teknik molekuler berdasarkan pada deteksi sekuen genom menggunakan reverse transcription (RT)-PCR, nested PCR, Nucleic Acid Sequence Based Amplific ation (NA SBA ) dan real timJPCR telah banyak digunakan L,/ I untuk diagnosa cepat dan diasumsikan sebagai standar baru dalam deteksi definitif Dengue. Diantara metoda tersebut nested-PCR merupakan metoda yang paling banyak digunakan, selanjutnya dimodifikasi dengan multiplex serotype spesifik primer untuk ¥Ping virus Dengue. Namun, metode RT-PCR yang digunakan kurang sensitif dan membutuhkan waktu, serta lebih kompleks karena melibatkan kompleks amplifikasi cONA -PCR-nested PCR sehingga membutuhkan alat (thermal cycler) yang berkualitas. l?erkembangan selanjutnya adalah real-time PCR yang memiliki lebih banyak keunggulan seperti kecepatan, kuantifikasi, kontaminasi yang rendah, spesifitas yang ggi serta kemudahan melakukan standardisasi (Morita et a/., 1991; Kuno et a/., 1 998; Shu et a/. , 2003). Namun metoda tersebut membutuhkan alat dengan kualitas yang !:nggi sehingga tidak bisa diterapkan untuk laboratorium dengan peralatan yang .:erbatas. Penelitian ini direncanakan menggunakan metoda diagnosa yang dirancang ......._ .cepat, sederhana, memiliki efektifitas biaya yang tinggi untuk deteksi cepat dan
(
7
...
'
'1
diferensiasi serotype virus Dengue yang beredar di Indonesia. Assay LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplfi ci at o i n) merupakan pendekatan baru untuk amplifikasi asam . nukleat berdasarkan prinsip reaksi strand displacement dan pembentukan struktur loop dalam mengamplifikasi target. Metode LAMP memiliki tingkat selektifitas dan spesifitas yang tinggi serta hanya ?menggunakan satu suhu sehingga tidak memerlukan thermal cycler dan sudah diterapkan untuk deteksi SARS coronavirus dan West Nile virus (Nagamine et a/., 2002; Parida et at., 2004; Hong et a/., 2004). Dalam penelitian ini akan digunakan RT (Reverse-Transcriptase) LAMP karena materi genetik virus adalah RNA. Efisiensi amplifikasi dalam RT -LAMP disebabkan karena tingginya amplifikasi yang bersifat terus-menerus menghasilkan banyak target (amplikon) DNA serta magnes u i m pyrofosfat yang menghasilkan tingkat kekeruhan pada tube reaksi. Pengamatan reaksi positif tidak harus menggunakan elektroforesis gel agarose tetapi dapat menggunakan mata telanjang dibawah lampu UV dengan menambahkan penggunaan SYBR green. Reaksi akan selesai dalam waktu kurang dari 1 jam (30 menit) dibandingkan dengan PCR yang memerlukan waktu 2-3 jam per reaksi (Notomi et at., 2000)
Kemudahan dan keakuratan dalam melakukan metode deteksi dini serta emudahan dalam peralatan dan analisis hasil yang dapat diamati tanpa instrumen JcrnQ rumit menjadi latar belakang yang kuat untuk memilih pengembangan metode !ersebut dalam deteksi dini Dengue di Indonesia. lB.
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk : 1. Mendesain primer metode LAMP untuk deteksi virus Dengue pada penderita suspect terinfeksi Dengue yang beredar di Indonesia. 2. Serotyping virus Dengue di Indonesia menggunakan metode LAMP. 3. Aplikasi metode LAMP untuk mendukung strategi pengendalian persebaran Dengue dan upaya ketepatan penanganan di berbagai daerah di Indonesia.
( 8
�
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
pada lnfeksi Virus Dengue Virus Dengue masuk ke dalam tubuh manusia lewat gigitan nyamuk Aedes aegypti atau Aedes a/bopi rgan sasaran dari virus adalah organ RES (reticulo endothelial system) meliputi sel kupffer hepar, endotel pembuluh darah, limfe nodi, sumsum tulang serta paru-paru.Data dari berbagai penelitian menunjukkan bahwa selsel monosit dan makrofag mempunyai peranan besar pada infeksi ini. Dalam peredaran darah, virus tersebut akan difagosit oleh sel monosit primer (Soegijanto, 2006). Virus DEN mampu bertahan hidup dan mengadakan multiplikasi di dalam sel tersebut ftnfeksi j 'Virus dengue dimulai dengan menempelnya v�nompya masuk ke dalam sel dengan bantuan organel-organel sel, genom virus membentuk komponenomponennya, baik komponen perantara maupun komponen struktural virus setelah v omponen struktural dirakit, virus dilepaskan dari dalam sel. Proses pe� �kan---:={+itt� 7 ·rus DEN terjadi di sitoplasma sel (Vorvick, 2008). Semua flavivirus memiliki kelompok epitop pada selubung protein yang :nenimbulkan "cross reaction" atau reaksi silang pada uji serologis, hal ini menyebabkan diagnosis pasti dengan uji serologis sulit ditegakkan. lnfeksi oleh satu serotipe virus :lEN menimbulkan imunitas protektif terhadap serotipe virus tersebut, tetapi tidak ada •aoss protective" terhadap serotipe virus yang lain (Khana eta/., 1990). lmunopatogenesis DBD dan sindrom syok dengue (SSD) masih merupakan -:taSalah yang kontroversial.'pua teori yang digunakan untuk menjelaskan perubahan :Jatogenesis pada DBD dan SSD yaitu hipotesis infeksi sekunder (teori secondary ""'eterologous infection) dan hipotesis antibody dependent enhancement (ADE). Teori -:feksi sekunder menyebutkan bahwa apabila seseorang mendapatkan infeksi primer �ngan satu jenis virus, akan terjadi proses kekebalan terhadap infeksi jenis virus :ersebut untuk jangka waktu yang lama. Pengertian ini akan lebih jelas bila emukakan sebagai berikut: seseorang yang pernah mendapat infeksi primer virus .langue, akan mempunyai antibodi yang dapat menetralisasie�mg ;a�homologous). _ -etapi jika orang tersebut mendapatkan infeksi sekunder denga jenis serotipe virus A. Patogenesis dan Patofisiologi
ctu�p
(
'
I
r
1-A}P--7 I
I
9
I
yang lain, maka te�adi infeksi yang berat. Pada infeksi selanj.utnya, antib.odi heterologous yang telah terbentuk dari infeksi primer akan membentuk kompleks •
dengan virus dengue baru dari serotipe berbeda; namun tidak dapat dinetralisasi, virus baru bahkan membentuk kompleks yang infeksius (Soegijanto, 2006; WHO, 2007) Pada teori kedua (ADE), menyebutkan tiga hal yaitu antibodies enhance infection, T-cell enhance infection serta limfosit-T dan monosit akan melepaskan sitokin :rang berkontribusi terhadap terjadinya DBD dan SSD. Singkatnya secara umum ADE dijelaskan sebagai berikut, bahwa jika terdapat antibodi spesifik terhadap jenis virus tertentu, maka antibodi tersebut dapat mencegah penyakit, tetapi sebaliknya apabila an1ibodi yang terdapat dalam tubuh merupakan antibodi yang tidak dapat menetralisasi .
'
�. justru dapat menimbulkan penyakit yang berat (Soegijanto, 2006).Walaupun DD dan DBD disebabkan oleh virus yang sama, tetapi mekanisme patofisiologinya berbeda
.�.
. ��. �V
3ehingga menyebabkan adanya perbedaan klinis. Perbedaan yang utama adalah pada .......--- ---... :Jeristiwa renjatan yang khas pada DBD. Renjatan itu disebabkan karena kebocoran
..,. sma yang diduga karen a proses imunologi. Pada DD �rikushartana et al, 2002).
i
tidak te�adi
']eftJICk-
Manifestasi klinis DD timbul akibat reaksi tubuh terhadap masuknya virus. Virus -
berkembang di dalam peredaran darah dan aka
nr
itangkap oleh makrofag. Segera
qadi viremia selama dua hari sebelum timbul gejala dan berakhir setelah lima hari a · Ja panas mulai. Makrofag akan segera bereaksi dengan menangkap virus dan �rosesnya sehingga makrofag menjadi APC (antigen precenting cell). Antigen }ang menempel di makrofag ini akan mengaktivasi sel T-helper dan menarik makrofag ,.
Jain
untuk memfagosit lebih banyak virus. T-helper akan mengaktivasi sel T-sititoksik
)'ailg akan melisiskan makrofag yang sudah memfagosit virus, juga mengaktifkan sel
8
�g akan melepaskan antibodi. Ada tiga jenis antibodi yang telah dikenali yaitu antibodi netralisasi, antibodi hemaglutinasi, dan antibodi fiksasi komplemen. Proses :ersebut menyebabkan terlepasnya mediator-mediator yang merangsang te�adinya aejala sistemik seperti demam, nyeri sendi, otot, malaise, dan gejala lainnya. Dapat ;afjadi manifestasi perdarahan karena terjadi agregasi trombosit yang menyebabkan ombositopenia, tetapi trombositopenia ini bersifat ringan (Harikushartana et al, 2002; Soegijanto, 2006). 10
J
Terdapat dua perubahan patofisiologi yang utama terjadi pada DBD/SSD, yang pertama ialah peningkatan permiabilitas vaskuler yang menjngkatkan kehilangan plasma dari kompartemen vaskuler. Hal ini mengakibatkan hemokonsentrasi, tekanan nadi yang rendah dan tanda-tanda syok yang lain. Perubahan yang kedua adalah gangguan
hemostasis yang meliputi
perubahan vaskuler, trombositopenia dan
oagulopati. Hampir semua penderita DBD mengalami peningkatan fragilitas vaskuler dan trombositopenia, dan banyak diantara penderita menunjukkan koagulogram yang abnormal (WHO, 1 997;Soegijanto, 2006). B. Gejala Klinis lnfeksi virus dengue bisa bersifat asimtomatis atau menyebabkan demam berdarah (DO) atau demam berdarah dengue (DBD) dengan kebocoran plasma yang bisa
mengakibatkan syok hipovolumik (sindrom syok dengue, SSD) (WHO, 1997).
Demam Dengue Gambaran klinis dari DO sering tergantung pada usia pasien. Bayi dan anak anak mungkin tidak bisa dibedakan dengan kejang demam, sering dengan ruam makulopapuler.Anak yang lebih besar dan dewasa bisa muncul gejala demam tinggi, kadang-kadang dengan dua puncak (saddle-backed), nyeri kepala berat, nyeri periorbita, nyeri otot dan sendi, mual dan muntah, dan ruam.Perdarahan kulit (ptekie) tidak biasa.Leukopeni dan trombositopeni biasa muncul. Pada beberapa kejadian epidemis, DO bisa disertai dengan komplikasi perdarahan, seperti epistaksis, perdarahan gusi, perdarahan saluran cerna, hematuria, dan menorrhagia.Perdarahan berat yang jarang terjadi menyebabkan kematian pada beberapa kasus.Penting untuk membedakan kasus DO dengan perdarahan yang tidak biasa dari kasus DBD dengan peningkatan permiabilitas vaskuler, bahwa DBD khas ditandai dengan hemokonsentrasi. Pada daerah endemis, DO harus dibedakan dengan demam chikungunya, penyakit virus yang disebarkan oleh vektor dan memiliki distribusi yang sama di banyak wilayah di Asia dan Pasifik (WHO, 1 997).
11
Demam Berdarah Dengue 080 ditandai dengan empat manifestasi klinis yang utam�: demam tinggi, tanda perdarahan, dan sering hepatomegali dan kegagalan sirkulasi. Perubahan patofisiologi utama yang menandai beratnya 080 - dan membedakannya dari DO - adalah kebocoran plasma, dengan manifestasi peningkatan hematokrit, efusi serosa atau hipoproteinemia.Tanda perdarahan yang paling umum terjadi adalah tes tornikuet yang
(
oositif, mudah memar dan perdarahan pada tempat pungsi vena Epistaksis dan I
perdaraha gusi jarang terjadi; perdarahan ringan saluran cerna dapat dtobservasi selama periode demam (WHO, 1997). Hepar biasanya teraba pada fase demam dan ukurannya bervariasi dari "sebatas :eraba" samapai 2
-
4 em di bawah batas kosta. Meskipun ukuran hepar tidak
oerhubungan dengan berat ringannya penyakit, hepar yang membesar lebih sering c:temukan
pada
kasus
dengan
syok
dibandingkan
pada
kasus
tanpa
syok.Splenomegali jarang ditemukan pada bayi; tetapi jelas terlihat pada foto i0fltgen.8eratnya penyakit dapat dicegeah dengan diagnosis dini dan penggantian ::ehilangan plasma. Trombositopeni dan hemokonsentrasi biasanya terdeteksi sebelum onset
dari syok (WHO, 1997; NIAID, 2009)
•r
Sindrome Syok Dengue Kondisi pasien yang berkembang ke arah syok mengalami pemburukan secara
::oa-tiba setelah demam selama 2 - 7 hari/Pemburukan ini terjadi pada saat, segera .setelah turunnya temperatur - antara hari ketiga dan ketujuh.DSS biasanya ditandai =engan denyut nadi yang cepat dan lemah dengan penyempitan tekanan nadi (<20
,
Hg) atau hipotensi dengan kulit yang lembab dan dingin.Pasien dalam syok bisa !ahJh dalam kondisi bahaya jika penanganannya tidak tepat. Durasi dari syok pendek: =msanya pasien meniggal dalam waktu 12 - 24 jam, atau membaik dengan cepat setelah pemberian terapi cairan yang cukup. Efusi pleura dan asites mungkin ::!emukan pada pemeriksaan fisik atau radiografi. Syok yang tidak terkoreksi bisa -enimbulkan komplikasi , seperti asidosis metabolik, perdarahan berat pada saluran cemadan organ lain, serta prognosis yang buruk (Soegijanto 1997; WHO, 1997).
12
C. Temuan Laboratorium
:)8'JL� :. \";1
� '?
Trombositopeni dan hemokonsentrasi selalu ditemukan !?"''a kasus DB£f.�; . trombosit yang rendah hingga dibawah 200.000/mmk biasanya ditemukan anta� t'iari ke-3 dan ke-8, sering sebelum atau bersamaan dengan perubahan hematokritfPeningkatan hematokrit yang mengindikasikan kebocoran plasma, selalu ada, meskipun pada kasus tanpa syok.H emokonsantrasi dengan peningkatan 1 hematokrit 20% atau lebih menunjukkan adanya peningkatan permiabilitas vaskuler dan kebocoran plasma (NIAID, 2009). I Pada DBD, � (;� leukosit bisa bervariasi pada saat onset penyakit, mulai !eukopenia sampai leukositosis ringan, tetapi �_, leukosit yang rendah disebabkan karena penurunan angka neutrofil yang biasanya ditemukan pada akhir fase demam. limfositosis relatif, dengan atipikal limfosit, biasa ditemukan sebelum terjadi syo�buminuria ringan yang sementara bisa ditemukan, dan perdarahan tersembunyi :!lisa dijumpai pada fesesfPada sebagian besar kasus te�adi penurunan faktor fibrinolitik 'dan koagulasi yaitu fibri hogen, prothrombin, faktor VII, faktor XII, dan antithrombin Ill. Temuan lain adalah hipoproteinemia, hiponatemia, dan peningkatan aspartat aminotransferase serum. Asidosis metabolik sering teijadi pada syok yang .:erkepanjangan. Peningkatan blood urea nitrogen terjadi pada fase terminal dari syok (WHO 1997; Soegijanto, 2006).
"
13
·
BAB III MATERI DAN METODE
A.
lsolat Referen lsolat referen dari 4 serotype virus Dengue yang digunakan sebagai kontrol dalam penelitian ini berasal dari Bagian Parasitologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada. Virus sebelumnya telah dikultur dalam se line C6/ 36�ticus , dan disimpan dalam -80°C.
Jt/ ft)� ·-,
Ae.
.at'kJfcfv_r
·
B. Ekstraksi RNA Ekstraksi menggunakan konsep pengikatan poliA-tai/ pada mRNA virus yang dideteksi
(Sambrook
et
a/.,
2000)
menggunakan
produk
Vira/RNA
extractionkitQiaamp Viral RNA Minikit dari Qiagen®. Metode isolasi dilakukan sesuai protokol kit sebagai berikut :lsolat virus dari supernatant dan sel line kultur dithawing dalam es. Volume sampel sebanyak 140 ul dimasukkan dalam microtube dan dicampur dengan 560 ul buffer AVL yang sudah
f
diberi carrier RNA dan divortex. elanjutnya diinkubasi selama 1 0 menit pada suhu
\L
ruang dan ditambah 560 ul ethanol absolut arutan divortex hingga homogen. Campuran dipindah ke spin kolom kit dan disentrifus 8000 rpm selama 1 menit. Filtrat pada collection tube dibuang kemudian ditambahkan buffer AW1 pada kolom� Sentrifus 8000 rpm selama 1 menit .Selanjutnya ditambahkan buffer AW2 dan
f
sentrifus 14000 rpm selama 3 meni "
filtrate dibuang. Collection tube diganti
kemudian lysat pada kolom dielusi menggunakan buffer AVE sebanyak 60 ul, �� disentrifus 8000 rpm selama 1 menit dan disimpan di -80°C sampai digunakan. Semua proses dilakukan dengan kondisi RNAse free maksimum sehingga RNA yang diperoleh diusahakan tetap intact.
14
•
RT-PCR
RT-PCR secara one step-multiplex dilakukan untuk pengece�an kembali serotype isolat referen
sesuai metode Harris et a/., 1998 dengan modifikasi sesuai
opti masitherma/ cycler dan kit yang kami gunakan. Urutan primer (dari 5'-73')yang digunakan adalah : FDEN Universal
TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA ACC G
OEN 1 Reverse
CGT CTC AGT GAT CCG GGG G
DEN2 Reverse
CGC CAC AAG GGC CAT GAA CAG
OEN3 Reverse
TAA CAT CAT CAT GAG ACA GAG C
OEN4 Reverse
TGT TGT CTI AAA CAA GAG AGG TC
RT-PCR dilakukan dengan kit One-Step RT-PCR Invitrogen dengan volume ::otal reaksi sebanyak 25 ul. Komposisi reaksi sebagai berikut : RT-Mix 12,5 ul; RT -aq
enzyme 0,5 ul; MgS04 1 ul; dH20 1 ul; template RNA 5 ul; primer forward DEN
ul;
primer reverse DEN masing-masing 1 ul. Program yang digunakan adalah satu s"
extension68 °C selama 10 menit. Elektroforesis menggunakan gel agarose 1 ,5 % dengan panjang target c Sekuensing
::lengue,
.
.
.
untuk Mappln
')
f
an
"Gold Standard" Pengecekan
Serotype
Sekuensing dilakukan untuk mengetahui urutan basa nukleotida spesifik dari genom ·
s yang beredar di Indonesia. Selain itu hasil sekuensing dapat dijadikan sebagai
•gold stand arda kebenaran isolat yang terdeteksi adalah isolat Dengue. Sekuensing oJakukan secara single pass menggunakan primer forward DEN Universal. Sekuensing menggunakan metode Sanger akan dikerjakan di
1st
Base,
Singapura menggunakan_ Anal isis hasil sekuensing menggunakan query hasil ...._,_ sekuensing dengan�LASTN.\ � .' v -vv""' ,_ e. ct., t9; � "' , .l. t. --tJ
tvDt�.-t' .t .rlG'V·t L
\,_.;
��
tji�_ 0C
15
o��I
E. Rancangan Primer RT-LAMP
Primer oligonukleotida serotype spesifik didesain menggun !ikan beberapa daerah yang berbeda dari masing-masing serotype. Gen tersebut memiliki homologi yang tinggi antara isolat Dengue yang terdaftar dalam genbank. Dasar template penyusunan primer adalah isolat Indonesia yang terdaftar dalam
genbankJHal tersebut penting karena spesifisitas reaksi sangat penting dalam
deteksi �ini suatu penyakit. Kandidat isolat sebagai template dalam penelitian ini adalah : DEN
I
:env gene �936-2420 bp genbank ace no. EU 848545
DEN II
: NS1 gene � 2422-3476 genbank ace no. JF 327392
DEN Ill
: NS5 gene �7575-10271 bp genbank ace no. AY 858047
DEN IV
: NS2 A gene �3477-4130 bp genbank ace no. GQ 868594
F. Reaksi RT-LAMP
Reaksi RT-LAMP dilakukan secara one-step menggunakan 2 enzym sekaligus yaitu
AMV reverse transcriptase Fermentas untuk sintesis eDNA dan BSt polymerase untuk aktivitas strand displacement LAMP. Komposisi reaksi dalam 25 ul volume adalah: Bst polymerase 1 ul; Bst buffer 2,5 ul; Betaine monohydrate(1 M) 3 ul; dNTPs (100mM) masing-masing 0,5 ul; primer mix (6) masing-masing 1 ul, enzyme AMV-RT 1 ul; MgCI 3 ul; template 2 ul; buffer i Taq 4,5 ul. Reaksi dilakukan menggunakan satu suhu heat lock 60°C dan penelitian menggunakan setting waktu selama maksimal 60 menit untuk menyelesaikan satu reaksi
lengkap
RT-
LAMP.
Optimasi
dilakukan
dengan
penambahan
dan
pengurangan beberapa komponen konsolven seperti betaine dan MgCI serta dNTPs. G"' Analisis Reaksi LAMP
Hasil reaksi LAMP dianalisis menggunakan beberapa metode : Metode yang pertama adalah penggunaan elektoforesis gel agarose 3% dengan penambahan SYBR green. Visualisasi dilakukan dibawah UV dengan diindikasikan adanya pola migrasi band-band DNA target. 16
Metode yang kedua adalah pengamatan dengan mata langsung dengan penambahan 1 : 1000 SYBRgreen pada tube hasil reaksi. .Hasil yang diharapkan adalah visualisasi yang lebih sederhana tanpa menggunakan alat elektroforesis untuk
mengetahui
kuningkehijauan
hasil
positif.
Reaksi
positif
akan
menghasilkan
karena interkalasi DNA dengan SYBRgreerlsedangkan
warna
reaksi
negatif menghasilkan warna yang tetap orange. H. Analisis Spesifisitas Reaksi LAMP Spesifisitas reaksi menggunakan enzim restriksi yang memotong salah satu sisi dari target sekuen dari 4 serotype yang kemungkinan ditemukan. Profit pemotongan dari enzim Ban// dan Alu1 overnight digunakan sebagai dasar identifikasi serotype dan analisis untuk mengetahui adanya reaksi silang dengan virus lain dari famili
Flavivirus yang kemungkinan mengkontaminasi. Sampel Serum Pasien Penderita
Tahun I bertujuan untuk mengetahui sensitifitas dan spesifisitas metode yang diterapkan (LAMP) untuk diagnosa DB/DBD dibandingkan dengan diagnosis menggunakan metode berdasarkan genom yang lain (RT-PCR). Sampel dari pasien yang benar-benar sudah terdiagnosa
08/DBD sesuai
standar WHO 2009
(pertimbangan kriteria inklusi dan eksklusi WHO 2009) dengan pembimbing klinis Prof. Dr. Suharto, dr., M.Sc., MPdK., DTM&H., Sp.PD., K-PTI. Sampel serum yang akan digunakan dalam penelitian ini berasal dari pasien yang dirawat di bagian tropik-infeksi RSU Dr. Soetomo Surabaya. Jumlah sampel ..
yang akan diambil adalah sebanyak 30 dari pasien yang terdiagnosis DB/DBD yang
rl
dirawat di ruang perawata Penyakit Tropik lnfeksi RSU Dr. Soetomo. ! Sampel darah dimasukkan ke dalam vacutainer lithium-heparin (gehnier-bio one®) yang telah diberi RNA Later® dari Ambion 1 : 1 dan disimpan di 4°C sampai digunakan
.rampel darah minimal adalah 1 ml, untuk uji hematologi dan isolasi RNA
virus. Kontrol negatif akan diambil dari penduduk (volunteer) dengan pemeriksaan hematologi rutin.
17
\_..../'
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
•
l
A.
lsolat Referen Virus yang digunakan sebagai kontrol diperoleh dari Laboratorium Parasitologi,
J
Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada solat tersebut sudah digunakan sebagai standar secara serologis dengan uji imu nositokimia menggunakan antibody
\
monoc/o�al (Umniyat bt a/., 2008). Serotype DEN I-IV diperoleh dari biakan kultur C6/ 36, A� albep#et:J&.yang diinfeksi dengan virus dan disimpan dalam -80 °C . Dari hasil biakan bisa dilihat bahwa semua menunjukan pembentukan giant eel dan
cytopatic effect khas sifat kultivasi virus dengue pada sel C6/ 36 namun tidak spesifik secara morfologis untuk membedakan DEN I - IV.
DEN I
DEN II
D::.N Ill
DEN
Gambar 1 Kultur Virus
IV �
Dengue pada C6/36, ...A.-.al/3optiotf8"Yang diinfeksi dengan
Virus Dengue, terlihat cythopatic effect baik pada DEN 1, 2, 3 dan 4.
18 r
B. Ampliflkasi multiplex-one step RT -PCR
Ekstraksi sampel menggunakan kit dari Qiaamp Viral RN� Minikit dari Qiagen®
yang memisahkan RNA virus dengan pengikatan pada poliA-tail dari genom virus. lsolasi tersebut menghasilkan RNA genom viral yang digunakan sebagai cetakan (template) bagi reaksi RT-PCR yang akan dilakukan. Amplifikasi ini dilakukan untuk memberikan kepastian standar yang digunakan secara genomic (molekuler) untuk dijadikan sebagai kontrol. Reaksi menggunakan desain primer Harris et a/, 1998, yang merupakan modifikasi dari primer Lanciotti et a/., 1992,dan dapat digunakan sebagai salahsatu alat penegakan diagnosa sesuai protokol WHO 2009. M
1
2
3
4
500bp 400bp
300 bp
200 bp
100 bp
M :100 bp ladder; 1: DEN 1; 2: DEN 2; 3: DEN 3; 4: DEN 4
Gambar 2 H asil amplifikasi multiplex-one step RT-PCR pada isolat referen virus DEN.
Optimasi dari program RT-PCR menghasilkan suhu yang tepat bagi annealn i g primer sehingga pada analisis elektroforesis gel agarose 1 ,5% dapat muncul pita pita DNA dengan panjang base pairsesuai panjang target DEN 1 : 482 bp; DEN 2: 119 bp; DEN 3 : 290 bp; DEN 4 : 389 bp yang jelas dari hasil amplifikasi RT-PCR yang dilakukan. Munculnya pita DNA yang jelas baik pada kontrol dan pasien menunjukkan RT-PCR dapat digunakan sebagai metode pendukung yang lebih 19 j
mudah dengan tingkat kemudahan dalam menyimpulkan diagnosis penyakit lebih tinggi. C. Sekuensing untuk
mapping dan 11gold standard" pengecekan serotype Dengue
Hasil sekuensing amplikon RT-PCR ditunjukkan pada Gambar 3. DEN 1
2
DEN 3
DEN 4
..-
:
,;
-··
.
·=·
.
.:;e
,.
-
'" ..
..
. -
J£ ;(
.
'�-
Gambar 3 Hasil sekuensing amplikon multiplex-one step RT-PCR pada isolat referen
Hasil •
sekuensing
diatas
cukup
baik
ditunjukkan
dengan
profit
pada
chromatogram yang memiliki puncak terpisah antar nukleotida (Log Book).Hasil BLASTN dari data sekuensing amplikon RT-PCR pada Gambar 3.menunjukkan bahwa sekuen gen yang diamplifikasi memiliki homologi yang tinggi dengan virus Dengue yang terdaftar dalam genbank (Lampiran 2). Dari data-data tersebut maka dapat disimpulkan bahwa isolat tersebut memenuhi syarat untuk digunakan sebagai kontrol dalam reaksi RT-LAMP
20
D. Reaksi RT-LAMP pada kontrol virus
RT-LAMP dilakukan dengan menggunakan 4 mikrotube untuk masing-masing serotype.Aktifitas reverse-transcriptase dan strand displacement untuk membentuk amplikon dilakukan secara one-step pada suhu 60°C (dengan optimasi).Pada suhu tersebut enzyme RT dan BSt bisa bekerja bersama dan dan keduanya tetap aktif hingga amplifikasi dihentikan.Reaksi positip terlihat pada hasil elektroforesis gel agarose 1 ,5 % yang membentuk pola seperti marker dikarenakan terjadinya pembentukan loop yang menerus pada amplikon (Gambar 4.).
M
01
02
03
04
M:
Marker; D1 spn : DEN 1; D2 sel : DEN 2;D3 spn: DEN 3; D 4 MK: DEN
4
Gambar 4 Hasil reaksi RT-LAMP pada 4 serotype virus DEN, load tiap sumuran
3
ul
Ketebalan band sangat tergantung pada kualitas template dan lamanya reaksi dilakukan. Semakin lama maka akan semakin tebal. Kami melakukan optimasi reaksi dan menemukan reaksi yang cukup baik dalam waktu 60 menit.Pada suhu tersebut.enzyme AMV-RT belum inaktif dan
akan terus
membentuk eDNA 21
bersamaan aktifrtas strand displacement dan loop formation yang sedang berjalan. perbandingan molaritas primer sangat enting karena kecepat�n pembentukan initial
strand tergantung perbandingan outer dan inner primer RT-LAMP. Kami juga melakukan reaksi silang antar serotype dan tidak terlihat adanya reaksi silang antar serotype. Sehingga kami menarik kesimpulan bahwa primer tersebut spesifik dan bisa bekerja untuk identifikasi virus DEN dengan cepat tanpa kemungkinan cross reaksi antar serotype. Selain itu kami membandingkan reaksi yang dibentuk oleh multiplex one step RT -PCR yang dilakukan selama 3, 5 jam dengan RT-LAMP yang dilakukan selama 60 menit. Terlihat amplikon terbentuk lebih cepat walaupun dengan template yang lebih rendah (Gambar 5).
..
M: Marker; 1 :DEN 1; 2: DEN 2; 3: DEN 3; 4: DEN 4; C :control·
Gambar 5 Visua lisasi hasil multiplex one step RT-PCR
dan RT-LAMP
Visualisasi reaksi positip dapat dilakukan dengan beberapa cara selain elektroforesis gel agarose. Diantaranya adalah dengan visualisasi langsung dengan penambahan Sybr green 1 dengan perbandingan 1 : 1000 seperti ditunjukkan pada Gambar 6. 22
uv
VIS
Gambar 6 Visualisasi hasil amplifikasi menggunakan Sybr green 1
Profil pemotongan dari
enzim Ban// dan Alu 1 overnight digunakan
sebagai dasar identifikasi serotype dan analisis untuk mengetahui adanya reaksi silang
dengan
virus
lain
dari
famili
F/avivirus
yang
kemungkinan
mengkontaminasi ditunjukkan pada Gambar 7.
200 100
"
Gambar 7 Profit digesti enzym. Lane 1 : 1 00 bp ladder; lane 2: DEN I (150 bp); lane 3: DEN II (170 bp); lane 4 : DEN Ill (150 bp); lane 5: DEN IV (190 bp). -
Aplikasi pada sampel darah
Sebelum aplikasi ke sampel darah manusia tim kamitelah mendapatkan surat elaikan etik(Lampiran 4). Kami mendapatkan 28sampel dari RSU Dr. Soetomo dengan data pemeriksaan hematologi terlampir (Lampiran 5).Sampel darah diambil dan dicampur RNA Later™dari Ambion® dengan perbandingan 1 : 1 , untuk menjaga 23
agar RNA dalam darah tetap intact. Hal ini penting dilakukan karena sifat RNA yang sangat
mudah
terdegradasi
oleh
RNAse
yang
jum�ahnya
melimpah
di
lingkungan.Selain itu kami menggunakan alat yang telah di DEPC sebelumnya untuk meminimalkan jumlah RNAse aktif.Pada penelitian ini kami menggunakan whole
blood dengan antikoagulan heparin untuk sampel isolasi RNA dan disimpan dalam 80° C hingga digunakan.
-
Gambar 8 Hasil RT-PCR dan RT-LAMP pasien suspect DEN
24
F. Analisis statistik
f
Kami mendapatkan 30sampel dari RSU Dr. Soetomo dengan .data hasil pemeriksaan �
hematologi terlampir (Lampiran 7). Tabel 1 Profil laboratoris dan derajad DBD. t+
INtO.
SAMPEJL
'llERAmT
1.
I
'2. ;:;
II
4
11
5
II
5
r
7
11
s
II
9
11
::.o
11
•< --
II
!.2
II
IPLT'"l
H H
[+)
r+�
f +}
H
{ -) (-}
H H {+, [+)
(+)
(-)
(+)
::.s
r
17
II
H H {-) [+) [+) H [+. [ +� l+: {+! H
2.2. 25 24 2.5
II II II
I
2.5
II
21
II
J:B
�
{-)
(-)
{-j
'2.!:1
II
H H H
Stl
I
H
H
[+)
[-)
r-> [-}
[-) H [-) H H H H H H
H [ ·} H H [ +) H H H H
11
(-!
H
{-)
2.1.
rl -
{-)
r
II
[-)
{+) [+) [+ ) H
!5
JJ
H
H H l+) f+ )
(-)
f-)
::.9
(-)
( +; [+t
II
II
[-l H
H (+, I+!
!4
!'B
NS1
I +� (+)
( +�
i3
[+)
IELIS.A
H
f+)
II
ZD
..
II
HCT'•I
H
H H [+� I+)
(+)
.
[+)
H H [+t H
[+}
(-� (+�
[-)
{-) H
{-) {-)
H [-) { +) H
H {-)
[+t
H
[+)
f+l
{-) {-)
(- ) H
D
25
Untuk deteksi dengan metode RT-PCR dan RT-LAMP, hasilnya sebagai berikut: Tabel 2• Diagnosis Dengue dengan pemeriksaan RT-PCR dan RT-LAMP. RT-PCR
No.
5ampel
DEN l
1 2 3
DEN Z
DEN 3
(+) (+) (+) (+)
4
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
(+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)
19
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Jumlah
DEN 4
(+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) 2
9
(+) 13
6
RT-LAMP
(+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) 30
26
Dari label 2.di atas, dapat dilihat bahwa pemeriksaan dengan metode RT-PCR dan RT-LAMP memberikan hasil positif untuk semua sampel. f?engan RT-PCR bisa kita ketahui bahwa dari 30 sampel yang diperiksa, infeksi sebagian besar oleh DEN 3 (13 sampel) kemudian disusul DEN 2 (9 sampel).
J
Pengukuran sensitivitas dari setiap metode diagnosti dengan pembanding I RT-PCR sebagai gold standard, diperoleh hasil sebagai berikut: Tabel 3 Tingkat sensitivitas masing-masing metode diagnostik. Metode Pemeriksaan ELISA NS1 RT-PCR (gold standard) RT-LAMP
Hasll (+)
Hasil (-)
Sensitivitas
15 0 30 30
15 30 0 0
50% 0% 100%
RT-LAMP memiliki tingkat sensitivitas paling tinggi dibandingkan dengan metode diagnostik yang Jain. Tingkat spesifisitas untuk masing-masing metode tidak bisa diukur karena tidak didapatkannya hasil negatif dari pemeriksaan dengan gold
standard. lsolasi virus adalah metode dengan pendekatan paling definitif, tetapi teknik ini
rSelain
memerlukan keahlian tinggi dan peralatan dengan standard yang tinggi pula
itu membutuhka nwaktu yang cukup lama (7 hari) (Kuno et a/., 1998; Morita et a/.,
J
1 99 1 ; Shu et a/., 2003) Secara serologis infeksi virus Dengue dapat dideteksi dengan level lgM dan lgG dengan metode ELISA. Metode ini cukup sederhana dan bisa diJakukan dalam waktu cepat, tetapi reaksi silang antar antibodi dengue dan dengan �ivirus yang lain akan memberikan hasil false positive (positif palsu) (Innis et a/.,
989). Rasio lgM/IgG bisa digunakan untuk membedakan infeksi virus dengue primer :ian sekunder. Perkembangan baru ELISA dan dot blot assay pada antigen envelop/membrane (E/M) dan protein non-struktural 1 (NS1) menunjukkan bahwa wnsentrasi antigen yang tinggi dalam bentuk kompleks imun dapat dideteksi baik ':lada infeksi dengue primer maupun sekunder hingga 9 hari setelah onset penyakit. Sfikoprotein NS1 dihasilkan oleh semua flavivirus dan disekresi dari sel mamalia.NS1 27
V L/
menghasilkan respon humoral yang sangat kuat. � '
NS1
merupakan glikoprotein yang
highly conserved, yang tampaknya .
merupakan regio penting dalam viabilitas virus namun tidak memiliki aktivitas biologis. Tidak seperti glikoprotein virus yang lain, NS1 diproduksi baik dalam bentuk yang berhubungan dengan membran maupun dalam bentuk yang disekresikan (Dussart, 2006). Antigen NS1 terdapat baik pada infeksi primer maupun sekunder. Antigen NS1 dapat dideteksi dalam 9 hari pertama demam, yang terdapat baik pada serotipe DEN-1 (terbanyak), DEN-2, DEN-3 dan DEN-4 (Alcon, 2002). Kumarasamy, 2007, meneliti sensitivitas dan spesifisitas NS1 pada 554 donor sehat dan 297 pasien terinfeksi virus dengue dimana 157 pasien PCRnya positif dan pasien diperiksa juga lgM dan lgG antidengue. Beliau mendapatkan spesifisitas 100% dan sensitivitas 9 1 , 0 % dari 157 sampel yang positif PCR nya dengan perbedaan yang tidak signifikan untuk ke empat serotipe, sedangkan Blacksell, 2008 meneliti NS1 dan beliau mendapatkan sensitivitas NS 1 63% dan spesifisitas 100% dengan memperhatikan adanya perbedaan sekresi yang bervariasi antar serotipe. Pada penelitian kami ....
r
disebabkan sifat
patogenitas virus bukan pada NS1 melainkan pada protein E. al ini terbukti dengan adanya pasase pada sel kultur menjadi lemah ketika sifat protein E berubah yang ditandai adanya perubahan asam amino yang sangat memungkinkan terjadi asosiasi dengan sifat virulensi virus (Laytmeyer et al. 1 999). Teknik molekuler berdasarkan pada deteksi sekuen genom menggunakan
reverse transcription (RT)-PCR, nested PCR, Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) dan real timePCR telah banyak digunakan untuk diagnosa cepat dan diasumsikan sebagai standar baru dalam deteksi definitif Dengue. �iantara metode tersebut nested-PCR merupakan metode yang paling banyak argunakan, selanjutnya dimodifikasi dengan multiplex serotype spesifik primer untuk
typing virus Dengue. Namun, metode RT-PCR yang digunakan kurang sensitif dan 28
V
membutuhkan waktu, serta lebih kompleks karena melibatkan kompleks amplifikasi
cDNA-PCR-nested berkualitas.
PCR
sehingga
membutuhkan
alat
(t�ermal
cycler) yang
Perkembangan selanjutnya adalah real-time PCR yang memiliki lebih
banyak keunggulan seperti kecepatan, kuantifikasi, kontaminasi yang rendah, spesifitas yang tinggi serta kemudahan melakukan standardisasi (Kuno et a/., 1 998;
tNamun metode tersebut membutuhkan alat
Morita et a/., 1991; Shu et a/., 2003)
dengan kualitas yang tinggi sehingga tidak bisa diterapkan untuk laboratorium dengan peralatan yang terbatas. Metode LAMP memiliki tingkat selektifitas dan spesifitas yang tinggi serta hanya nmenggunakan satu suhu sehingga tidak memerlukan thermal cycler dan sudah diterapkan untuk deteksi SARS coronavirus dan West Nile virus (Nagamine et
a/., 2002; Parida et a/., 2004; Hong et a/., 2004). Dalam penelitian ini akan digunakan RT (Reverse-Transcriptase) LAMP karena materi genetik virus adalah RNA Reaksi 1 RT-LAMP sangat sederhana, reaksi positip bisa diamati secara langsungdibawah lampu UV dengan menambahkan penggunaan SYBR green, ditunjukka�'tiengan .
adanya kekeruhan dan perubahan warna pada tube reaksi.Hal tersebut sangat berbeda dengan reaksi amplifikasi yang sebelumnya menggunakan Taqman RT PCR dan NASBA yang memerlukan primer fluorogenic dan probe dengan harga lebih mahal untuk suatu sistem deteksi berbasis amplifikasi asam nukleat. Efisiensi amplifikasi dalam RT-LAMP disebabkan karena tingginya amplifikasi yang bersifat terus-menerus menghasilkan banyak target (amplikon) DNA serta magnesium
pyrofosfat yang menghasilkan tingkat kekeruhan pada tube reaksi. Reaksi akan selesai dalam waktu kurang dari 1 jam (30 menit) dibandingkan dengan PCR yang memerlukan waktu 2-3 jam per reaksi (Notomi et a/., 2000). RT-LAMP yang diaplikasikan pada penelitian ini dapat diterapkan pada berbagi kondisi laboratorium di daerah yang belum memiliki thermal cycler yang presisi untuk deteksi berbasis amplifikasi genomik.
29
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
A. Primer yang digunakan dalam penelitian ini bisa diaplikasikan untuk : a. lsolat virus yang berasal dari RSUD Dr. Soetomo, Surabaya b. Serotyping dapat dilakukan dengan RT-LAMP c. Pemeriksaan pada sampel yang suspect DB sampai dengan 30 sampel yang sudah dikoleksi , B. Hasil positif dapat divisualisasikan dengan baik pada reaksi one-step RT dan
l·
LAMP selama 60 menit
·'
C. Deteksi dini dengue penting dilakukan karena vaksin dan penanganan terhadap dengue belum optimal dikembangkan, sehingga diperlukan surveillance yang �
terus menerus untuk persiapan dini adanya outbreak dengue di suatu wilayah sehingga perangkat kesehatan, rumah sakit dan lain lain mempersiapkan diri ' .41 .... 1 L ,.)f R seoptimal mung kin saat �e�adi - L �rw.'t.._'' ;... vc ( ;. '"-'2 I·1)' ���� .:;\)'"1}7, tPtc -., 1 L II�r 1 ,.a A' " . -. ' - <-J} r::..,'-( <1{!:!.� '? \P tt a> -pcV a ,... �, . (_/r'YI UCAPAN TERIMAKASIH
'!"erimakasih
kami
sampaikan
J
(Lf p&-'f bk
yang
P�(t.'\1"-> ....-tt...�
)
•
•
·
sebesar-besamya
kepada
Badan
Penelitian
dan
P'engembangan Kesehatan Kementerian Kesehatan Republik Indonesia selaku pemberi dana _?ellelitian. Prof. Dr. drh. Asmarani Kusumawati, M.P., Prof. Dr. dr. Suharto, M.Sc., MPdK., DTM&H., Sp.PD-KPTI, FINASIM., dr. Tri Wibawa, Ph.D. selaku konsultan penelitian kami. Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, Dekan Fakultas -edokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Hewan ..:niversitas Gadjah Mada Yogyakarta, Bagian Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Jadjah Mada Yogyakarta, Divisi Tropik Infeksi Departemen Penyakit Dalam RSU Dr. Soetomo S:rrabaya dan Komite Etik RSU Dr. Soetomo Surabaya serta berbagai pihak yang telah mbantu terlakasananya penelitian ini yang tidak bisa kami sebutkan satu per satu..
30
BAB VI DAFTAR PUSTAKA
..
CDC. Epidemiology of Dengue Fever and Dengue Hemorrhagic Fever. http://www. cdc.gov/dengue/epidemiology/index. html. Download 28 J uli 201 0 Nagamine, K., T. Hase, and T. Notomi.2002. Accelerated reaction by loop mediated Isothermal amplification using loop primers. Mol. Cell. Probes16: 223-229 http://www. nih. in/iaf/to5/i2/print.html. NIAID. 2009. Dengue Fever : Overview. Download 28 Juli 2010 Notomi, T., H. Okayama, H. Masubuchi, T. Yonekawa, K. Watanabe, N. Amino, and T. Hase.2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28:e63 (i-vii). Parida, M. M., P. Guillermo, S. Inoue, F. Hasebe, and K. Morita. 2004 . Real-time reverse transcription loop mediated isothermal amplification for rapid detection of West Nile virus. J. Clin. Mic robio/.42:257-263. Hong, T. C. T., Q. L. Mai, D. V. Cuong, M. M. Parida, M. Harumi, M. Tsugunori, F. Hasebe, and K. Morita. 2004. Development and evaluation of a novel loop mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus. J. Clin. Microbio/.42: 1956-1961. Innis, B. L, A Nisalak, S. Nimmannitya, S. Kusalerdchariya, V. Chongswasdi, S. Suntayakorn, P. Puttisri, and C. H. Hoke. 1989. An enzyme-linked immunosorbent assay to characterize Dengue infections where Dengue and Japanese encephalitis co-circulate. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40:41 8-427. Kuno, G. 1998. Universal diagnostic RT-PCR protocol for arboviruses.J. Virol. Methods72:27-41 Morita, K., M. Tanaka, and A. lgarashi.1991. Rapid identification of Dengue virus serotypes by using polymerase chain reaction. J. Clin. Microbio/.29:21 07-2 1 1 0. Shu, P. Y., S. F. Chang, Y. C. Kuo, Y. Y. Yueh, L. J. Chein, C. L. Sue, T. H . Lin, and J. H. Huang. 2003. Development of group and serotype specific one-step SYBR Green based real-time reverse transcription PCR assay for Dengue virus. J. Clin. Microbio/.41 :2408-2416. Soegijanto, S. 2006. Demam Berdarah Dengue edisi 2.Surabaya : Airlangga University Press �""? ) 'mniyati, S.R., Sutaryo, Wahyono, D., Artama, W.T., Mardihusodo, S.J., Soeyoko, .. Mulyaningsih, B., Utoro, T. 2008. Application of monoclonal antibody DSSC7 for detecting dengue infection in Aedes aegypti based on immunocytochemical streptavidin biotin peroxidase complex assay (ISBPC).Dengue bulletin vo/ 3. \VHO, 2009.DENGUE GUIDELINES FOR TREATM ENT, PREVENTION AND CONTROL !'HO. 2010. Dengue Fever in Indonesia. http://www.who.int/csr/d o n/2004.05. 1 1 a/en/index.html . Download 28 Juli 2010
� I
31
LAMPI RAN
32
Lampiran 1 Data Personil Peneliti
33
1.
Peneliti Utama Nama
Penny Humaidah Hamid
Gelar
: drh., M. Botech .
Tempat lahir
Trenggalek
Jabatan
Dosen
Bagian!Divisi
Anatomi, Biomolekuler
Institusi asal
Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada
Telepon
0274 560862
Alarnat
n. Fauna No 2 Karangmalang Yogyakarta 55281
Tanggal Lahir : 17 Juli 1984
Kelamin
: Wanita
GoIongan
: li1 B
Fax
: 0274 560861
korespondensi pos Alarnat E-mail
Qennx:
Telepon Rumah
-
hamid@x:ahoo.com Telepon
: 081 328886207
Genggam
(HP) Kualifikasi akademik
,.
Tabun
Institusi
Gelar
2006
Universitas Gadjah Mada
Srujana Kedokteran Hewan (SKH)
2007
Universitas Gadjah Mada
Dokter Hewan (drh)
2009
Universitas Gadjah Mada
Master of Biotechnology (M. Biotech)
34
2. Peneliti 1 �·
Gelar
: dr
Kelamin
: Wanita
Nama
Anis Widyasari
Tempat lahir
Klaten
Jabatan
Dokter umum
Bagian/Divisi
Ginekoonkologi
Institusi asal
Jln. Mayjen Prof. Dr. Moestopo No. 6 - 8 Surabaya
Telepon
(031) 5501000
AJamat
. .
1
Tanggal Lahir : 9 Januari 1985
GoIongan
Fax
: (031) 5028735
Keputih IIC/ 13, RT 02 RW 03, Sukolilo, Surabaya 60111
korespondensi pos AJamat E-mail
[email protected]
Telepon Rumah
-
Telepon
085643393466
Genggam
(HP) Kualifikasi akademik Tabuo
Institusi
Gelar
2006
Universitas Gadjah Mada
Sarjana Kedokteran (S.Ked)
2008
Universitas Gadjah Mada
Dokter (dr)
35
3.
Peneliti 2
Nama
Purwati
Tempat lahir
Jombang
Tanggal Lahir : 25 Februari
Gelar
: dr, Sp.PD
Kelamin
: Wanita
GoIongan
: nm
1972
Jabatan Bagian/Divisi
Dokter umum .
Penyakit Dalam/ Tropik Infeksi
lnstitusi asal
Jln. Mayjen Prof. Dr. Moestopo No. 6 - 8 Surabaya
Telepon
031-5035975
Alamat
Rungkut Harapan Blok E No. 10, Surabaya
Fax
: 031-5035975
korespondensi pos
[email protected]
Alamat E-mail
1Telepon Rumah
.
Telepon
031-8700566
.
081332075261
Genggarn (HP)
Kualifikasi akademik Taboo
Institusi
Gelar
1998
Universitas Airlangga
Dokter (dr)
2008
Universitas Airlangga
Spesialis Penyakit Dalarn (Sp.PD)
36
4.
Kesekretariatanl Administrasi
Nama
H. SumiJo
Gelar
Jabatan
Tenaga Administrasi
Golongan
Bagian!Divisi
Anatomi
Telepon
0274 560862
Alamat
Jl. Fauna No 2 Karangmalang Yogyakarta 55281
.
Fax
-
: III A
: 0274 560861
korespondensi pos Alamat E-mail
-
Telepon Rumah
-
Telepon
: 081 328593063
Genggam .
(HP)
37
5.
Konsultanl Supervisor Nama
Asmarani Kusumawati
Gelar
: drh., M.P., Dr
Tempat lahir
Kupang
Kelamin
: Wanita
Golongan
: IV A
Jabatan
.
J
Tanggal Lahir : 27 April l961
Lektor Kepala
Bagian/Divisi
Imunokimia
Institusi asal
Fakultas Kedokteran Hewan UGM, PS. Bioteknologi UGM
Telepon
0274. 560861
Alamat
Fak. Kedokteran Hewan UGM, Jl. Fauna No. 2 Karang Malang Yogyakarta
korespondensi
55281
Fax
: 0274. 560863
pos Alamat E-mail
kartapati 2008@ yahoo.com
Telepon Rumah
0274 888880
_
Telepon
081 32886
Genggam
7709
(HP)
Kualifikasi akademik Tahun
Institusi
Gelar
1 987
Univ. Gadjah Mada
Drh
1995
Univ. Gadjah Mada
M.P
2000
Universitas Montpellier II,
Dr
Montpellier Prancis
38
6.
Koosultanl Supervisor Nama
Suharto
Gelar .
: Prof., Dr., dr., M.Sc.,MPdK,D TM&H., Sp.PD-
Tempat Jahir
.
Madiun
1
KPTI,FINASIM Tanggal lahir : 12 Agustus 1947
Kelamin
: Laki-laki
Golongan
: IVC
Jabatan
Guru Besar di Bidang Ilmu Penyakit Dalam
Bagian/Divisi
Ilmu Penyakit Dalam/ Divisi Penyakit Tropik- Infeksi
Institusi asal
.
FK Unair- RSU. Dr Soetomo Surabaya
Telepon
(031) 5035975
Alamat
Jl. Sukomanunggal 35, Surabaya - 60188
Fax
: (03 1)
5035975 korespondensi
pos Alamat E-mail
[email protected]
Telepon
(031) 7313812 - 7341208
Telepon Genggam
Rumah
081230432666
(HP)
Kualifikasi akademik Taboo
Iostitusi
Gelar
1973
FK Unair, Surabaya
Dokter
1979
FK Unair, Surabaya
Sp.PD
BangkokSchool ofTropical Medicine, MahidolUniversity,
DTM&H
1988
Bangkok, Thailand
•
1989
BangkokSchool of Tropical Medicine, MahidoiUniversity,
M.Sc.
Bangkok, Thailand 1999
Program Pascasarjana Unair, Surabaya
Doktor
1999
PETRI Jakarta
KPTI
2005
FK Unair, Surabaya
Guru Besar
2008
FK Universitas Indonesia, Jakarta
MPdK
39
7.
Konsultanl Supervisor Nama
Tri Wibawa
Bagian/Divisi
Mikrobiologil Medical Practitioner
Institusi asal
Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada
Telepon
0274 560300
Alamat
.
Gelar
Fax
: dr., PhD
: 0274 560 1 16
Jl. Farmako, Sekip Utara, Yogyakarta, 55281
korespondensi pos Alarnat E-mail
[email protected]
Telepon
-
Telepon
: 08122963 1 86
Genggam
Rumah
(HP)
Kualifikasi akademik Tahun
Institusi
Gelar
1997
Univ. Gadjah Mada
dr
2000
Kobe University
Ph.D
"
40
