Apllkosl Isotopdon Radlasl.1996
PEMET AAN GEN "GAMETOPHYTE" (ga-l, ga-3) PADA "RFLP LINKAGE MAP" TANAMAN PADI Sobrizal Puat Aplikasi lsotop dan Radiasi, BAT AN
ABSTRAK PEMETAAN GEN"GAMETOPHYTE" (ga-l, ga-J) PADA "RFLP LINKAGE ~rfAP" TANAMAN PADI, Pemelaangen "gametophyte" (ga-l, ga-J) pada "RFLP (Restriction FraRment!&.!!i!b Polvmomhi!!!!) ~ In!P.'' tanaman padi telah dilakukan dengan bantuan gen marka dl, I_okusgaol dilacak denganmenganalisis"Jal)()nika Near IsogenicLine" (NIL) untukga-l' daDdl secaraRFLP, di managa-l' berasaldari VarietasIndika. Hong Shi Zu, Sedangkanuntuk pelacakan lokus ga-3 daD pemelaangen dl pads RFLP linkage map, analisis RFLP dilakukan pads 24~! tanamanF2 dari silangan "Japonika dl marker line" (FL85) dengan VarietasIndika. Dakanalo,Jarak antara dl dengan gaol, daDantara dl denganga3 ditentukan dengan menghitung"recombination~" antara dl denganga-2 daDantara dl dengan ga-3, Hasil yang diperoleh dikonversikan ke dalam cM dengan menggunakan"Kosambi function", Hasil analisis menunjukkan bahwa gen ga-2 terletak di sekitarXNpbl56 daDXNpb55, berjarak 10,7 :!: 3,3 cM dari dl, sedangkanga-3 terletak di sekitar XNpbJ44, berjarak 25,5 :!: 0,0 cM dari dl,
ABSTRACT MAPPING OF GAMETOPHYTE (g/l-2, 6/1-3) GENES ON RFLP LINKAGE MAP OF RICE. Mapping of ga-2 and gaol geneson RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) linkage map of rice was carried out with aid of dl marker gene. Locus of ga-2 was estimated by analyzing JaponicaNear lsogenicLine (NIL) for ga-2' and dl. In this NIL thega-2' gene was originated from Indica variety, Hong Shi Zu. To estimatethe gaol locus and to map the dl gene on RFLP linkage map, RFLP analysis was conductedon 242 F2 plantsderived from cross betweenJaponicadl marker line (FL85) and Indica variety, Dakanalo. The distances betweendl and ga-2 and betweendl and ga-l were estimatedby calculating recombination values betweendl and ga-2 and betweendl and ga-l. The valuesobtained were convertedto cM by Kosambi function. The results indicated that the ga-2 was located around XNpb 256 to XNpb 55. The distance betweenga-2 and dl was 10,7,j; 3,3 cM. The ga-l was located around XNpb144, and the distance betweengaol and dl was 10,7,j; 3,3 cM.
PENDAHULUAN Penyimpangansegregasigen marka pada persilangan Padi Indika-Japonika sudah banyak dilaporkan. Diantaranya adalah penyimpangan segregasigen yang mengontrol sifat berdaun terkulai (drooRing ~dl), di manapadapopulasiF2 daTipersilanganantaragalurmarka berdaunterkulai (FL85) denganbanyak Varietas Indika, ditemukanfrekuensitanamanberdaunterkulai lebih tinggi atau lebih rendahbila dibandingkandenganfrekuensi menurntperhitunganhokumMENDEL 25% (I, 2). Selanjutnya, NAKAGAHRA (I) menjelaskanbahwapenyimpangansegregasiini disebabkanoleh linkage pada kromosom 3 antara gen d/ dengan gen ga-2 untuk frekuensi tanaman berdaun terkulai lebih rendah daTi 25% atau dengangenga-3 untuk frekuensitanamanberdaunterkulai lebih tinggi dari 25%, yang menyangkutperbedaankemampuanfertilisasi antara garnetjantan ga-2 d/ dengan ga-2+d/+ataugarnetjantan ga-3+d/dengan ga-3d/+. RekombinasibebasdaTikarakterakanberkurangdenganadanya gen "gametophyte"ini. Oleh karena itu, gen "gametophyte" mempakansalah satufaktor pentingdalarn mempelajari evolusi daD diferensiasi tanaman padi. Dalam penangananpopulasi silangan pada program pemuliaan
tanaman,gen ini juga perlu dipertimbangkankarenamempengaruhikemampuanfertilisasi gametjantan. Banyak pendekatanyang telah dilakukan untuk mempelajarimekanismeterjadinya penyimpangansegregasi, tetapi belumada satu makalahpunyang dapatmemberikan keterangansecarajelas. Denganberkembangnya teknik biologi molekulerakhir-akhir ini, diharapkanpendekatan secara molekuler dapat membantu pemecahan masalahini. Untuk itu perlu diketahui secaratepat letak gen"gametophyte"tersebutpadapetakhromosom.Percobaan ini bertujuanuntuk memetakanga-2 daftga-3 pada "RFLP linkage ~" deng:anbantuangen marka dl.
BAHAN DAN METODE Lokus ga-2 pada IORFLPlinkage ~ dilacak denganmenganalisisOJaponikaNearlsogenicLine (NIL) untukga-2+ daDdl secaraRFLP (3). Genga-2+yang diintroduksikanpada NIL berasaldari VarietasIndika, Hong Shi Zu. Untuk melacaklokus ga-3 daDpemetaangen d/ padaRFLPlinkage~, analisisRFLPdilakukanpada242 tanamanF2 dari silangan antaraFL85 dengan Varietas
Aplikasi [sotopdon Radiasi.[996
lndika, Dakanalo. DNA diekstraksi daTi daun setiap tanaman F2 dan daun tanaman induknya dengan menggunakan metode CT AB (cetyltrimethyl amonium bromide) seperti yang dikemukakan oleh ROGERS daD BENDICH (4). DNA yang diperoleh dipotong-potong dengan 4 macam enzim restriksi (BamHI, Bg/II, Dral, EcoRV), dielektroforesis pada 0,8% agarose gel, dan diblot pada nilon membran dengan menggunakan metode SOUTHERN (5). Frob DNA diisolasi daTi plasmid daD diradio label dengan P2P]dCfP secarametode random hexamer (6). Prob yang sudah dilabel, secara individu dihibridisasi dengan "survey filter" untuk mendeteksi polymorphism daD seterusnya dengan "eksperimental filter" untuk mendeteksi segregasi antara alii Japonika dan alii lndika. Setelah dihibridisasi, membran dicuci dengan larutan 6xSSC.0,2% SDS selama 30 menit (dua kali), daD 2xSSC.0,2% SDS selama satu jam, selanjutnya dibeberkan pada x-ray film. Segregasi "banding patterns" lndika daDJaponika dari marka RFLP akan terdeteksi pada autoradiogram populasi F2. Penyimpangan segregasi daTi perhitungan menurut hukum MENDEL diuji dengan uji "Chi square". Bagian khromosom yang diperkirakan mengandung gen ga-3 ditentukan daTi tingkat penyimpangan segregasi marka RFLP. Dengan menggunakan data segregasi marka RFLP dan data segregasi tanaman berdaun terkulai, gen dl dipetakan pada RFLP linkage !rum. Marka RFLP yang digunakan pada penelitian ini adalah PUCl2 Pst I genomic library daTiPadi Japonika (7). Pada makalah ini bila ditulis Npb #maksudnya menerangkan klon RFLP, daD bila ditulis XNpb # menerangkan lokus RFLP.
Recombination~ antara gen d/ denganga-2 dan antara gen d/ denganga-3 dihitung menurut rumus yangdikemukakanoleh NAKAGAHRA dkk. (I), sedangkan recombination ~ antara RFLP loci dihitung denganmaximumlikelihood eQuationyang dikemukakan oleh ALLARD (8). Recombination ~ yang didapat dikonversikan pada genetic !!!@ distance (cM) dengan menggunakan"Kosambi function" (9).
BASIL DAN PEMBAHASAN Untuk mendeteksi segmen khromosom Hong Shi Zu yang terintroduksi pada khromosom 3tanaman NIL, beberapa marka RFLP yang terletak pada khromosom 3 daD memperlihatkan polymorphism antara induk lndika daD Japonika dihibridisasi pada eksperimental filter yang mengandung DNA tanaman NIL. Berdasarkan banding R!!t: ~ yang terlihat, dibikin graphical genowe daTi setiap tanaman yang dianalisis seperti yang terlihat pada Gambar I. Dari 10 tanaman yang dianalisis hanya tanaman yang mengandung segmen introgresi terpendek yang diperlihatkan pada Gambar ini. Untuk menyelidiki apakah ga-2+ terikut bersama segmen yang terintroduksi itu, maka tanaman NIL yang dianalisis disilangkan dengan Varietas Japonika, Taichung65, dan segregasi tanaman berdaun terkulai diamati pada populasi F2 nya (Tabel I). Seperti terlihat pada Gambar I, aliI indika homozigot ditemukan padaXNpb256,XNpb373 dariXNpb55:
Hal ini menunjukkan bahwa segmen khromosom homozigot yang berasal dari induk indika, Hong Shi Zu terintroduksi pada NIL. Juga dapat dipastikan bahwa ga-2+ terbawa bersama segmen ini dengan terlihatnya frekuensi tanaman berdaun terkulai lebih tinggi dengan nyata mOandingkan dengan frekuensi menurut perhitungan hukum MENDEL pada 14 populasi F2 dari silangan tanaman NIL ini dengan Taichung65 (Tabel I). Dari data ini dapat disimpulkan bahwa lokus ga-2 terletak pada bagian sekitar XNpb256 daD XNpb55. Untuk mengetahui jarak antara lokus ga-2 dengan lokus dl maka dihitunglah recombination ~ antara ga-2 dengan dl dengan mengamati pola segregasi tanaman berdaun terkulai pada galur F3 dari silanganHong Shi Zu dengan FL85 (Tabel 2). Pada Tabel 2 ini terlihat bahwajarak antaraga-2 daD dl adalah 10,7:1: 3,3 cM. Untuk melacak lokus ga-3 dan pemetaan gen d/ pada RFLP linkage map, analisis RFLP dilakukan pada 242 tanaman F2 dari silangan FL85 dengan Dakanalo. Dari 15 marka RFLP yang diamati, 14 memperlihatkan "polymorphism" antara FL85 dengan Dakanalo. Ke-14 marka RFLP tersebut dihibridisasi pada e~erimental ~ yang mengandung DNA tanaman F2 dan induknya. Segregasidari aliI Indika-Japonika pada 14 loci RFLP tersebut dapat dilihat pada Tabel 3. Pada populasi F2 ini segregasi tanaman berdaun terkulai juga diamati dengan perbandingan 167 tanaman normal daD 75 tanaman berdaun terkulai. Dari data segregasi ini disusunlah hubungan linkage antara dl dengan loci RFLP dan antara sesamalokus RFLP (Gambar 2). Urutan marka pada RFLP linkage !!mR ini sarna dengan urutan marka pada "RFLP map" yang disusun oleh SAITO ill. (7), tetapi jarak antara satu lokus dengan lokus yang lainnya sedikit berbeda. Hal ini kemungkinan disebabkan karena material yang digunakan untuk menyusun "map" tersebutberbeda. Pada ~ ~ ~ ~ ini dl gen terletak antaraXNpb348 danXNpb/84. Hal ini berbeda sekali dengan yang dilaporan oleh SAlTO ill. (10) bahwa gen dl linkage dekat sekali (0%) dengan XNpb5/. Selanjutnya, dengan menggunakan ~ distance yang disusun ini, penyimpangan segregasipada setiap lokus RFLP dapat diilustrasikan seperti yang terlihat pada Gambar 3. Pada gambar ini terlihat pada XNpb48, XNpbJ45, daDXN pb J 73 frekuensi daTi kedua aliI persis berbanding 1:2:1, tetapi pada loci yang lain, mulai dariXNpb249 sampai XNpbJ84, frekuensi aliI Japonika secara nyata lebih tinggi. Puncak penyimpangan ini terjadi pada XNpbJ44. Hal ini memberikan indikasi yang kuat bahwa ga-3 terle'tak disekitar XNpb J44. Recombination ~ antara dl daD ga-3 dihitung dengan mengamati pola segregasi dari tanaman berdaun terkulai pada galur F3 daTi silangan antara FL85 daD Dakanalo. Hasilnya menunjukkan bahwa recombination ~ antara ga-3 dan dl adalah 23,5 :f: 0,1%, daD bila dikonversikan pada genetic ~ distance menjadi 25,5 :f: 0,0 cM (Table 2). Hasil analisis NIL untuk ga-2 daD dl menunjukkan bahwa ga-2 terletak di sekitar antara XNpb 256 dan XNpb55, daD basil analisis populasi F2 daTi silangan FL85 dengan Dakanalo menunjukkan bahwa ga-3 terletak di
Ap/ikasi Isotopdon Radiasi,1996
sekitarXNpb144. Dari data segregasitanaman berdaun terkulai dan segregasialii Indika daDJaponikapada 14loci RFLP telah ditentukan Ictak dari dl gen. Jarak antara ga-2 dengandldanjarak antaraga-3 dengandl pun sudah diketahui. Dengandemikian ga-2 dan ga-3 dapatdipetakan seperti terlihat pada Gambar2.
KESIMPULAN Dengan bantuan gen marka dl, gen ga-2 daD ga-3 telah dapatdipetakanpadaRFLP linkage~. Jarak antaragenga-2 dengandl adalah 10,7%3,3 cM danjarak antaragenga-3 dengandl adalah25,5 %0,0 cM. Urutan letak markaRFLP,ga-2. ga-3 daD dl sepertiterlihat pada Gambar2.
UCAPANTERIMA KASm Penulis mengucapkanterima kasih kepadaProf. Dr. Nobuo Iwata, Kepala LaboratoriumPemuliaanTanaman, Fakultas Pertanian Universitas Kyushu, Fukuoka, Jepang,alas pengarahandan izin yang diberikankepada penulis untuk melakukan penelitian ini di laboratorium yang dipimpinnya.
3. SOBRIZAL, Evaluasi segmen khromosom introgresi pada khromosom 3 dari dua near-isogenic untuk ga2 tanaman padi dengan menggunakan teknik RFLP , Zuriat.4 (1993) 50. 4. ROGERS, S. 0., and BENDICH, A., J., Extraction of DNA from plant tissues, Plant Molecular Biology Manual M. (1988) I. 5. SOUlHERN, E. M., Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis, J. Mol. BioI. ~ (1975) 503. 6. FEINBERG, A. P., and VOGEL STEIN, B., A technique for radiolabeling DNA restriction endonucleasefragments to high specific activity, Anal. Biochem. n (1983) 6. 7. SAITO, A., YANO, M., KISHIMOTO, N., NAKAGAHRA, M., YOSHIMURA, A., SAITO, K., KUHARA, S., UKAI, Y., KAWASE, M., NAGAMINE, T., YOSHIMURA, S., IDETA, 0., OHSAWA, R., HAYANO, Y., IWATA, N., and SUGIURA, M., Linkage map of restriction fragment length polymorphism loci in rice, Jpn. J. Breed. !l (1991) 665 8. ALLARD, R. W., Formulas and tables to facilitate the calculation of recombination values in heredity, Hilgardia M (1956) 23:5. 9. KOSAMBI, D. D., The estimation of map distances from recombination values, Ann. Eugen.ll (1944) 177
DAFTARPUSTAKA 1. NAKAGAHRA, M., Geneticmechanismon the distorted segregationof marker genesbelonging to the eleventhlinkage geroup in cultivated rice. Jpn. J. Breed. II (1972) 232.
10. SAITO, A., SHIMOSAKA, E., HAYANO, Y., SAITO, K., MATSUURA, S., and Y ANO, M., Molecularmapping on chromosome3 of rice, Jpn. J. Breed.!l Supl. 1 (1991) 158.
2. NAKAGAHRA, M., OMURA, T., and IWATA, N., Gametophytegenesand their loci on the eleventh linkage group of cultivated rice. Jpn. J. Breed. II (1972) 305.
Tabe\
Tipe segregasi tanaman berdaun terkulai pada populasi F2 dari silangan tanaman NIL dengan Taichung
65. Kombinasi silang
Tabel 2. "Recombination value" antara d/ dengan ga-2 pads silangan FL85 dengan H0639 dan antara d/ dengan ga3 pads silangan FL85 dengan HO1203, berdasarkan pols segregasitanaman berdaun terkulai pads galur F3.
Jumlah populasi F2 yang bertipe segresi Recombination value
Jumlah galur F3 yang
Increase&) NIUfaichung65
14
Normalb) 0
Total 14
a) Frekuensi tanarnan berdaun terkulai dengan nyata lebih tinggi
bertipe segresi
Varietas Indika
Decrease') Normalb)
H0639 HO1203
Increasec) Total
37
3
3
43
1
44
53
98
(%)
(cM)
IO,5:!;3,3 IO,?:!;3,3 23,5:!;O,1 25,5:!;O,O
dari 25%. b) Frekuwensi tanarnan berdaun terkulai sarna atau rnendekati
25%.
a) Frekuwensi
tanaman
rendah dari 25%. b) Frekuwensi tanaman 25°0. c) Frekuwensi gi dari 25%.
berdaun berdaun
terkulai terkulai
dengan
nytata
lebih
sarna atau mendekati
tanaman berdaun terkulai dengan nytata lebih ting-
Aplikasi Isotop dan Radiasi, J 996
Tabel 3. SegregasialiI Indika dan Japonikapada loci RFLP pada populasiF2 dari silanganFL85 denganHO1203. AliI X;2untuk 1:2:1
XNpb Ind/Ind
48 249
332 144 51 23 182
256 373 55 348 184 145 173
48 37 50 38 31 41 43 45 46 45 46 48 55 61
Ind/Jap
Jap/Jap
124
69
125
80 91
101
106 120 119 121 122 123 121 120 118 123 127
Total
241 242 242 242 241 242 241 241 242 241 242 242 241 242
98 90
82 77 74 73
75 76 76 63 54
3,86 15,55*** 20,50*** 33,47*** 28,89*** 13,96*** 9,60** 7,02* 609* , 7,47* 746* , 6,63* 0,64 1,00
*, ** daD*** adalah nyatapada level 5%, 1%dan 0,1% berturut-turut. Ind/Ind = homozigotuntuk alii Indika. Ind/Jap = heterozigotuntuk alii Indika daDJaponika. lap/lap = homozigotuntuk alii Japonika.
XNpb 249
144 51
15
62
3~85 238
234182 256 373 55
Gambar
i
0,0 (b,4 135,3 139,5 1:lJ,6
152;8 154,5 154,9
161,4161,8
1.621 167, 170,1 175,7
/84
186,9
145
200,2
173
213,0
."Graphical genotype"khromosom3 tanamanNIL untuk ga-2+ dan dl. Arsiran titik-titik terangpadaGambarmenyatakansegmenJaponika,arsiran hitarn menyatakantempatterjadinya"crossing over", arsiran titiktitik gelapmenyatakansegmenIndika, dan arsirangaris miring menyatakan segmenheterozigot.Angka disebelahkiri adalah loci RFLP (XNpb) dan angkadisebelahkananadalah"map distance"dalam cM dikutip dari SAITO ill.
(7).
145 XNpb 332
Aplikasi lsotop don Radiasi.1996
39,9 29,7
I
~
'78r3
--+-
r
1O.7..J-4,7~-+-S.3 J6,7 125.5 24.5.--+
I
I
ga-3
332
;,;
I
r- 3,6+ 3.0:--+-:- 21,1-1
4,7~-i-S,8+
2.5+-
27.3-j
~=!;~O,7~
-25$
I'"
48 ~-.::: 249
10,0
6,9+ 13,~10,2-J.3,4-t142.7t 3,s-t°'4f-l,9+-18.3-t-7,8~
..' I
19.6 -t-
122.7
~22.0+-39.5-+17.3+
I
144
I 1!i.!iM~!i;':!!i!itl;!;1 I I I
II
ga-2
51
23
182 256373
55 348 dl 184
Gambar 2. "Linkage map" ga-2, ga-3, dl daD loci'RFLP pada khromosom 3,
48
249
144
51 23
373~~ 348
55
184 145 17~
Frekuwensi aliI Japonika homozigot (%) Gambar3. Hubunganantara loci RFLP denganpenyimpangansegregasialii Japonikaberdasarkandata segregasipopulasiF2 dari silanganFL85 denganHO1203. Loci RFLP (XNpb) berurutan menurut sumbuvertikal dengan"map distance" nya menurutGambar2.
173
Aplikasi Isotop dan Radiasi. } 996
DISKUSI
SOERANTOHUMAN
SHOLEH A VIVI
Berdasarkanmetodepemetaangen-gen(ga-2dan ga-3), dapatkahterns dikembangkanpemetaangen-gen lainnya,misalnyagen-genyang mengontrolketahananterhadaphama daDpenyakit. Hambatanapa kiranya yang akan dihadapi dalam pengembangandan aplikasinya di bidang pemuliaantanamanpadi di Indonesia?
1. Untuk tujuan apakah daun tegak atau daun terku1ai dipi1ihpadapadi? 2. Selamaini gen untuk sifat daun tegak sudahdapatditransferpada tanamanpadi lain yang berdaunterku1ai? 3. Apakahgentegak tersebutbisa ditransferpada tanaman lain, misa1nyajagung, gandung,daDshorgum?
SOBRIZAL
SOBRIZAL
Pemetaan gen-gen lainnya seperti gen yang mengontrol harna dan penyakit tanaman sebagian sudah dilakukan daD ada juga yang sedang dilakukan di berbagai laboratorium, terutama di negara maju. Balai Penelitian Bioteknologi Bogor, bekerja sarna dengan IRRI daD Cornel University, sedang memetakan gen ketahanan penyakit bacterial bligh desease.Harnbatan di Indonesia sayarasa tidak ada kalau laboratorium daD 80M kita sudah siap mengaplikasikan dalam program pemuliaan tanaman, marka-marka yang sudah diidentifikasi daD sudah dipetakan.
I. Pada penelitian ini sifat daun terkulai (dl) dipakai sebagai gen marka (genpenanda). 2. Bisa saja kalau diperlukan setidaknya denganmenggunakanmetode~ ~. 3. Sepengetahuan sayauntuk saatini belurn bisa. rnungkin akanbisa kalauteknik rnolekulerbiologi sudahsemakin rnaju.
Ke Daftar Isi
