OPTIMALISASI HASIL EKSTRAKSI DNA DARI DARAH SEGAR SAPI MENGGUNAKAN HIGH SALT METHOD DENGAN PERBANDINGAN DARAH DAN LISIS BUFFER PADA KECEPATAN SENTRIFUGASI BERBEDA
SKRIPSI AYU WULANDHARI
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2009
RINGKASAN AYU WULANDHARI. D14050916. 2009. Optimalisasi Hasil Ekstraksi DNA dari Darah Segar Sapi Menggunakan High Salt Method dengan Perbandingan Darah dan Lisis Buffer pada Kecepatan Sentrifugasi Berbeda. Skripsi. Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Pembimbing Utama Pembimbing Anggota
: Prof. Dr. Ir. Ronny Rachman Noor, MRurSc. : Dr. Ir. Endang Tri Margawati, MAgrSc.
Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan material genetik yang diturunkan dari generasi ke generasi berikutnya. DNA dapat diekstraksi dari berbagai bagian tubuh ternak. Darah merupakan sumber DNA yang paling banyak digunakan karena kemudahan memperoleh sampel. Ada berbagai metode ekstraksi DNA, salah satunya adalah high salt method yang digunakan pada penelitian ini. Tujuan penelitian ini adalah mengoptimalkan produk DNA yang dihasilkan dengan mengkombinasikan perbandingan darah dan lisis buffer dengan menggunakan kecepatan sentrifugasi yang berbeda pada proses ekstraksi DNA. Materi penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah darah segar sapi peranakan Friesian Holstein (FH) yang diperoleh dengan cara penyedotan dengan jarum suntik 18G dari pembuluh darah ekor sapi yang dialirkan ke dalam tabung vakum mengandung 15% EDTA, sebanyak ± 9 ml. Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap dengan pola faktorial 3x2. Faktor pertama adalah perbandingan darah dan lisis buffer, yaitu 1:2, 1:1, dan 2:1. Faktor kedua adalah kecepatan sentrifugasi yaitu 2.500 rpm dan 3.500 rpm. Data yang dikoleksi adalah data konsentrasi dan kemurnian DNA yang diukur menggunakan Genequant DNA calculator pada panjang gelombang 260 Å dan 280 Å. Kualitas DNA dilihat dengan mengelektroforesis DNA pada gel agarosa 0,8 % yang dialiri listrik 100 volt selama 1 jam. Data konsentrasi dan kemurnian DNA dianalisis dengan sidik ragam pada = 0,05 (P<0,05). Perbedaan antara perlakuan diuji dengan Tukey test pada taraf = 0,05. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perbandingan darah dan lisis buffer tidak berpengaruh tetapi kecepatan sentrifugasi yang berbeda berpengaruh terhadap konsentrasi DNA (P<0,05). Kombinasi perbandingan darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi tidak berpengaruh terhadap kemurnian DNA. Tingkat kemurnian DNA berkisar 1,009-1,214, mengindikasikan bahwa DNA yang dihasilkan masih terkontaminasi protein. Hasil elektroforesis menunjukkan DNA berkualitas baik karena menunjukkan pita tunggal. Kata-kata kunci : darah, DNA, lisis buffer, kecepatan sentrifugasi, high salt method, sapi
ABSTRACT OPTIMIZING DNA YIELDS FROM WHOLE BLOOD COW USING HIGH SALT METHOD AT COMBINATION OF BLOOD AND LYSIS BUFFER WITH DIFFERENT CENTRIFUGATION SPEED Wulandhari, A., R. R. Noor and E. T. Margawati Deoxyribonucleic acid is genetic materials that inherited from one generation to next generation. DNA can be obtained from all body parts of animal, such as tissue and blood. Blood is one of DNA sources that is usually used because of its simple collection. There are several methods to extract DNA, one of which is a high salt method that used in this experiment. The aim of this experiment was to determine the optimal combination of whole blood and buffer lysis ratio at different centrifugation speed (rpm) to obtain optimal DNA products with high quality. Fresh whole blood of Friesian Holstein (FH) dairy cattle was collected by using a vacuum tube containing 15% EDTA with a 18G needle to suck the blood from tail vena with amount of ± 9 ml per head. The whole blood was collected from four FH cows. A 3x2 factorial completely random design was used in this experiment. The first factor was three combinations of whole blood and buffer lysis volume (ml), which was 1:2, 1:1, and 2:1. The second factor was centrifugation speed, i.e. 2,500 rpm and 3,500 rpm. Therefore, there were six combination treatments with four replications of each combination treatment. Data of DNA concentration and purity was observed from Genequant DNA calculator at 260 Å and 280 Å wave length. The quality of DNA was obtained from running DNA through electrophorosis of 0.8% gel agarose and electricity flow of 100 voltages for an hour. The DNA concentration and purity were analyzed by ANOVA. The differences among treatments were tested by Tukey test at = 0.05. The result showed that there was no significant effect of whole blood and buffer lysis combination on DNA concentration and purity. Centrifugation speed had a significant effect on DNA concentration (P<0.05) but did not affect their purity. DNA quality was good because it had a single band. Keywords: blood, DNA, centrifugation speed, lysis buffer, high salt method, cow
OPTIMALISASI HASIL EKSTRAKSI DNA DARI DARAH SEGAR SAPI MENGGUNAKAN HIGH SALT METHOD DENGAN PERBANDINGAN DARAH DAN LISIS BUFFER PADA KECEPATAN SENTRIFUGASI BERBEDA
AYU WULANDHARI D14050916
Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2009
OPTIMALISASI HASIL EKSTRAKSI DNA DARI DARAH SEGAR SAPI MENGGUNAKAN HIGH SALT METHOD DENGAN PERBANDINGAN DARAH DAN LISIS BUFFER PADA KECEPATAN SENTRIFUGASI BERBEDA
Oleh AYU WULANDHARI D14050916
Skripsi ini telah disetujui dan disidangkan di hadapan Komisi Ujian Lisan pada tanggal 18 Agustus 2009
Pembimbing Utama
Pembimbing Anggota
Prof. Dr. Ir. Ronny R. Noor, MRurSc.
Dr. Ir. Endang T. Margawati, MAgrSc.
Dekan Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor
Ketua Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Luki Abdullah, MScAgr.
Prof. Dr. Ir. Cece Sumantri, MAgrSc.
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 22 Nopember 1987 di Jakarta. Penulis merupakan anak kedua dari tiga bersaudara dari pasangan bapak Sularto dan ibu Nurhasanah. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar pada tahun 1999 di SDN Pesanggrahan 02 Pagi, Jakarta. Pendidikan lanjutan tingkat pertama diselesaikan pada tahun 2002 di SLTP Negeri 177 Jakarta dan pendidikan menengah atas diselesaikan pada tahun 2005 di SMA Negeri 47 Jakarta. Penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB USMI pada tahun 2005. Penulis diterima sebagai mahasiswa Mayor Teknologi Produksi Ternak di Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor pada tahun 2006. Selama mengikuti pendidikan, Penulis aktif di Ikatan Alumni SMA Se-Pesanggrahan, Kebayoran, dan Sekitarnya IAS3 , Himpunan Mahasiswa Produksi Ternak Himaproter , dan Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Peternakan BEM-D . Penulis pernah menjadi asisten praktikum pada mata kuliah Metodologi Penelitian dan Rancangan Percobaan. Penulis merupakan salah satu penerima beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik (PPA) pada tahun 2007, Beasiswa Bank Indonesia pada tahun 2008, dan beasiswa Bantuan Belajar Mahasiswa (BBM) pada tahun 2009.
KATA PENGANTAR Bismillahirrahmanirrahim. Alhamdulillah. Puji dan syukur Penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat, karunia, rizki, dan nikmat iman dan Islam yang telah diberikan sehingga Penulis memperoleh kemudahan dalam menyusun dan menyelesaikan skripsi ini yang berjudul Optimalisasi Hasil Ekstraksi DNA dari Darah Segar Sapi Menggunakan High Salt Method dengan Perbandingan Darah dan Lisis Buffer pada Kecepatan Sentrifugasi Berbeda . Shalawat dan salam semoga selalu kita curahkan kepada Nabi Muhammad SAW. Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan di Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penulisan skripsi ini juga bertujuan untuk memberikan satu sumbangan untuk kemajuan di dunia peternakan, khususnya bioteknologi molekuler hewan. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler Hewan, Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Cibinong pada bulan Maret-April 2009. Sampel darah diambil sapi FH dengan 18G pada pembuluh halus kemudian diekstraksi dengan metode high salt method dengan mengkombinasikan komposisi darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi yang berbeda. Penelitian ini diharapkan dapat memperoleh dan mengetahui kombinasi optimal antara volume darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi dalam mengoptimalkan produk DNA yang dihasilkan. Penulis menyadari bahwa skripsi ini belum sempurna. Penulis mengharapkan semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan menjadi salah satu sumber ilmu pengetahuan. Bogor,
Agustus 2009
Penulis
DAFTAR ISI Halaman RINGKASAN ................................................................................................
i
ABSTRACT ...................................................................................................
ii
RIWAYAT HIDUP .......................................................................................
v
KATA PENGANTAR...................................................................................
vi
DAFTAR ISI..................................................................................................
vii
DAFTAR TABEL .........................................................................................
ix
DAFTAR GAMBAR.....................................................................................
x
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................
xi
PENDAHULUAN..........................................................................................
1
Latar Belakang.................................................................................... Tujuan .................................................................................................
1 2
TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................
3
Sapi Friesian Holstein ........................................................................ Perkembangan Teknologi DNA ......................................................... Deoxyribonucleic Acid (DNA) ........................................................... Struktur DNA ......................................................................... Ekstraksi DNA.................................................................................... High Salt Method ................................................................... Pengukuran Konsentrasi DNA ........................................................... Kemurnian DNA................................................................................. Elektroforesis DNA ............................................................................
3 3 4 4 6 6 7 8 8
METODE .......................................................................................................
11
Lokasi dan Waktu ............................................................................... Materi.................................................................................................. Sampel Darah Sapi................................................................. Bahan Kimia........................................................................... Alat Penelitian........................................................................ Rancangan .......................................................................................... Analisis Data .......................................................................... Prosedur .............................................................................................. Pengkoleksian Sampel Darah Sapi......................................... Ekstraksi DNA ....................................................................... Penentuan Konsentrasi ........................................................... Penentuan Kemurnian ............................................................ Penentuan Kualitas DNA .......................................................
11 11 11 11 11 11 12 12 12 13 15 15 15
HASIL DAN PEMBAHASAN .....................................................................
17
Konsentrasi DNA ............................................................................... Kemurnian DNA.................................................................................
17 18
Kualitas DNA .....................................................................................
20
KESIMPULAN DAN SARAN .....................................................................
23
Kesimpulan ......................................................................................... Saran ...................................................................................................
23 23
UCAPAN TERIMA KASIH ........................................................................
24
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................
25
LAMPIRAN...................................................................................................
27
viii
DAFTAR TABEL Nomor
Halaman
1. Karakteristik Pemisahan untuk Gel Agarosa dan Poliakrilamid......
9
2. Rata-rata Konsentrasi DNA (ng/µl) pada Perbandingan Darah dan Lisis Buffer dengan Kecepatan yang Berbeda .................................
17
3. Rata-rata Kemurnian DNA (OD260/OD280) pada Perbandingan Darah dan Lisis Buffer dengan Kecepatan yang Berbeda................
19
DAFTAR GAMBAR Nomor
Halaman
1.
Struktur Serangkaian Molekul DNA Heliks Ganda.......................
5
2.
Struktur Kimia Nukleotida Pembawa Basa Nitrogen Adenin, Guanin, Thymin, dan Cytosin.........................................................
6
3.
Bagan Alir Ekstraksi DNA Menggunakan High Salt Method .......
14
4.
Hasil Elektroforesis DNA dalam Gel 0,8% Agarosa .....................
21
DAFTAR LAMPIRAN Nomor
Halaman
1. Larutan-Larutan yang Digunakan untuk Ekstraksi DNA Menggunakan High Salt Method .........................................................
28
2. Data Konsentrasi dan Kemurnian DNA (OD260/OD280)......................
30
3. Sidik Ragam Pengaruh Kecepatan Sentrifugasi dan Rasio Lisis Buffer dengan Darah terhadap Konsentrasi DNA ...............................
31
4. Uji Tukey Pengaruh Kecepatan yang Berbeda terhadap Konsentrasi DNA.....................................................................................................
31
5. Sidik Ragam Pengaruh Kecepatan Sentrifugasi dan Rasio Lisis Buffer dengan Darah terhadap Kemurnian DNA.................................
31
PENDAHULUAN Latar Belakang Peternakan sapi perah merupakan salah satu komponen subsektor peternakan yang mampu membuka lahan pekerjaan dan memberikan perbaikan gizi melalui protein hewani. Usaha peternakan sapi perah di Indonesia memiliki masalah produksi susu yang rendah sehingga belum dapat memenuhi kebutuhan susu di dalam negeri. Produksi susu merupakan hasil interaksi antara faktor genetik dan lingkungan. Beberapa usaha telah dilakukan pemerintah untuk meningkatkan produktivitas sapi perah. Peningkatan produktivitas sapi perah melalui peningkatan mutu genetik biasa dilakukan dengan cara konvensional yaitu seleksi dan kawin silang. Cara konvensional membutuhkan waktu yang lama untuk meningkatkan produktivitas sapi perah karena memerlukan pencatatan produksi dan reproduksi yang akurat. Oleh karena itu, teknologi baru diperlukan untuk membantu mempercepat proses peningkatan mutu genetik, salah satunya melalui aplikasi teknologi DNA. Deoxyribonucleic Acid (DNA) merupakan material genetik yang diturunkan dari generasi ke generasi berikutnya (Russel, 1990). DNA bersama-sama protein dan molekul Ribonucleic Acid (RNA) terdapat dalam inti sel. Ketiganya saling terkait membentuk kromosom yang merupakan komponen penting pada semua makhluk hidup (Muladno, 2002). DNA menjadi pusat perhatian dalam berbagai penelitian bioteknologi, misalnya rekayasa DNA atau riset bioteknologi yang lain. Teknik untuk mengidentifikasi keragaman genetik dalam struktur DNA antar individu telah dilakukan untuk mengidentifikasi ciri-ciri genetik yang dihubungkan dengan gen yang mengkodekan sifat yang bernilai ekonomis pada suatu ternak (Montgomery dan Sise, 1990). DNA dapat diisolasi dari berbagai bagian tubuh individual ternak, misalnya jaringan atau darah. Darah merupakan sumber DNA yang sering digunakan karena kemudahan dalam koleksi sampel. Produksi DNA yang baik dari sampel darah penting dilakukan untuk keperluan penelitian selanjutnya. Ada berbagai prosedur ekstraksi DNA dimana proses satu dan lainnya berbeda dalam komposisi bahan kimianya (Sambrook et al., 1989; Montgomery dan Sise, 1990). Perbedaan prosedur
tersebut sudah pasti akan menghasilkan produk DNA dan kualitas serta kemudahan pengerjaan yang berbeda. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengoptimalkan produk DNA yang dihasilkan dengan mengkombinasikan perbandingan volume darah sapi dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi yang berbeda pada proses ekstraksi DNA menggunakan high salt method.
2
TINJAUAN PUSTAKA Sapi Friesian Holstein Sapi perah di Indonesia merupakan hasil persilangan grading up antara sapi Ongole dan Peranakan Ongole dengan Fries Holland (FH) (Diwyanto et al., 2000). Sapi FH berasal dari Provinsi Belanda Utara dan Provinsi Friesland Barat. Di Amerika Serikat, sapi ini disebut Friesian Holstein. Sapi FH adalah sapi perah yang produksi susunya tertinggi dibandingkan dengan sapi perah lainnya dan juga kadar lemaknya terendah. Produksi susu sapi FH di Amerika Serikat rata-rata 7.245 kg per laktasi dengan kadar lemak 3,65%, sedangkan di Indonesia produksi rata-rata 10 liter/hari atau sekitar 3.050 kg per laktasi (Sudono et al., 2003). Produktivitas sapi FH merupakan akumulasi kompleks dari aspek genetik dan lingkungan. Beberapa faktor aspek pemuliaan masih menyebabkan produktivitas sapi perah rendah. Interaksi genotip dan lingkungan mengakibatkan keturunan pejantan impor tidak mampu mengekspresikan keunggulan genetik produksi susu dengan baik (Diwyanto et al., 2000). Sapi FH betina yang memiliki kemampuan produksi tinggi belum dimanfaatkan secara optimal sebagai sapi bibit sehingga belum memberikan kontribusi secara signifikan dalam perbaikan produktivitas sapi perah domestik (Anggraeni et al., 2000). Perkembangan Teknologi DNA Perkembangan biologi molekuler yang secara umum mencakup teknologi dan manipulasi DNA secara luas telah merambah ke berbagai bidang kehidupan sejak ditemukan struktur DNA oleh Watson dan Crick pada tahun 1953. Di dalam dunia peternakan, puluhan gen penyandi berbagai protein telah berhasil diintegrasikan ke dalam genom ternak babi, sapi, kelinci, domba, dan kambing. Upaya pemetaan genetik berbagai ternak domestik membuka peluang semakin lebar dalam penemuan gen-gen penting atau penciri DNA yang dapat membantu proses seleksi ternak unggul untuk meningkatkan produktivitas (Muladno, 2002). Teknologi DNA rekombinan tidak terlepas dari penemuan yang mendahului seperti penemuan enzim restriksi yang dapat memotong molekul DNA, enzim ligase yang dapat menyambung potongan-potongan DNA menjadi satu dan berbagai proses biokimia yang lain. Penemuan-penemuan tersebut memungkinkan pengisolasian individual gen untuk dimanipulasi serta dipindahkan dari satu organisme ke
organisme lain. Penemuan Polymerase Chain Reaction (PCR) menyebabkan perkembangan biologi molekuler menjadi semakin cepat dan hingga saat ini berbagai teknologi yang memanfaatkan PCR telah diciptakan. Teknik PCR menyederhanakan proses sequencing DNA dan semakin dipercepat dengan adanya teknologi informasi (Muladno, 2002). Deoxyribonucleic Acid (DNA) Gen disusun oleh suatu substansi yang disebut dengan deoxyribonucleic acid atau disingkat DNA (Russel, 1990). DNA terdiri atas dua untaian panjang terpilin yang membentuk double helix. Setiap dua untaian DNA disusun oleh ribuan unit nukleotida. Setiap nukleotida disusun oleh basa nitrogen, gula deoksiribosa dan asam fosfat. Ikatan kimia antara gula dan fosfat menghubungkan antarnukleotida. Kedua untaian DNA dihubungkan oleh ikatan lemah hidrogen (Noor, 2008). DNA adalah dasar kimiawi hereditas dan penyusun gen yang menjadi unit fundamental informasi genetik. Informasi genetik yang disimpan dalam nukleotida berfungsi untuk memenuhi dua tujuan, yaitu sumber informasi bagi sintesis semua molekul protein pada sel serta organisme dan memberikan informasi yang diwariskan kepada anak atau generasi berikutnya (Granner, 1995). Jumlah DNA dalam satu sel bervariasi berkisar dari 4x106 pasang basa pada E. coli sampai 109 pasang basa pada manusia. Tidak semua DNA ini memiliki fungsi genetik dan banyak dari DNA organisme tingkat tinggi yang memiliki DNA nongenetik lebih banyak dari pada organisme tingkat rendah (Maclean, 1987). DNA sebagai unit keturunan terkecil, terdapat pada semua makhluk hidup mulai dari mikroorganisme sampai organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tanaman. DNA yang terdapat di dalam sel dapat berupa DNA mitokondria, DNA kloroplas atau DNA penyusun kromosom, sedangkan DNA yang terdapat dalam inti sel disebut juga sebagai DNA inti. DNA dapat diperoleh atau diekstrak dari berbagai macam organ seperti daging, darah, sperma, ginjal, jantung, hati dan limfa karena sel terdapat di semua organ tersebut (Muladno, 2002). Darah merupakan sumber DNA yang paling sering digunakan karena kemudahan dalam pengoleksian sampel. Struktur DNA DNA
tersusun
oleh
tiga
komponen,
yaitu
molekul
gula
pentosa
(deoxyribose), gugus fosfat dan basa nitrogen. Gula pentosa dan gugus fosfat bersifat
4
identik sedangkan basa nitrogen mempunyai susunan dan bentuk yang berbeda di dalam satu nukleotida dengan nukleotida lain. Hanya terdapat empat macam basa nitrogen yaitu Adenin, Guanin, Thymin dan Cytosin. Basa adenin dan guanin digolongkan sebagai basa purin, sedangkan basa timin dan sitosin sebagai basa pirimidin (Muladno, 2002.)
Gambar 1. Struktur Serangkaian Molekul DNA Heliks Ganda. (Sumber: www.wiwapia.com)
Basa nitrogen menempel pada posisi karbon 1 dari pentosa, sedangkan gugus fosfat pada posisi karbon 3 atau karbon 5 dari pentosa. Satu nukleotida dan nukleotida lainnya dapat dibedakan pada basa nitrogennya. Serangkaian nukleotida dapat terbentuk dengan mengikatkan gugus hidroksi pada karbon 3 dari satu pentosa dan gugus fosfat pada gugus 5 dari pentosa sebelahnya. Struktur molekul DNA terdiri atas dua rangkaian nukleotida yang tersusun secara linier. Kedua rangkaian yang saling berikatan itu terbentuk seperti tali terpilin sehingga molekul DNA dikatakan double helix (heliks ganda) (Alberts et al., 1994).
5
Gambar 2. Struktur Kimia Nukleotida Pembawa Basa Nitrogen Adenin, Guanin, Thymin, dan Cytosin. (Sumber: www.sciencebiotech.net)
Ekstraksi DNA Setiap penelitian manipulasi gen memerlukan sumber asam nukleat, dalam bentuk DNA atau RNA. Pengisolasian komponen tersebut dari sel penting dilakukan dengan menggunakan metode yang tersedia (Nicholl, 1996). Ekstraksi DNA merupakan suatu langkah awal pengisolasian molekul DNA. Molekul DNA ini harus diekstraksi dari tempat asalnya (Murray, 1995). Biomolekul seperti DNA bersifat labil dan mudah kehilangan aktifitas biologisnya sehingga ekstraksi harus dilakukan dalam kondisi ringan yaitu dengan menggunakan suatu larutan encer dan menghindari pH dan tekanan osmotik yang ekstrim dan suhu tinggi (Murray, 1995). DNA sel hewan biasanya diekstraksi dengan merusak sel menggunakan Proteinase-K, EDTA (etilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat) yang diikuti dengan menggunakan fenol (Sambrook et al., 1989). Metode yang biasa digunakan untuk mengekstraksi DNA dari darah utuh melibatkan tahap ekstraksi menggunakan fenol (Sambrook, 1990; Khosravinia, 2009). Fenol bersifat korosif dan beracun, tahap ekstraksi memerlukan waktu yang panjang dan sampel yang dapat digunakan terbatas. Dua metode ekstraksi lain yang dapat digunakan yaitu guanidine hydrocloride dan high salt method (Montgomery dan Sise, 1990). High Salt Method High salt method merupakan metode yang simpel, cepat, dan dapat diterapkan secara luas untuk mengekstraksi DNA genom. Metode ini tidak
6
memerlukan larutan yang mahal, tidak membahayakan peneliti maupun lingkungan. High salt method dapat dilakukan dengan menggunakan peralatan laboratorium dengan teknologi rendah (Aljanabi dan Martinez, 1997). High salt method sedikit lebih rumit untuk dilakukan dibandingkan metode PCI (phenol chloroform isoamilalkohol) karena memerlukan waktu dua hari pengerjaan sedangkan PCI hanya membutuhkan waktu satu hari (Komalasari, 2009). High salt method didasarkan pada prinsip melisis sel darah merah (eritrosit) dari darah segar dengan menggunakan red blood cell lysis buffer (RBCL). Hasil pelisisan eritrosit dan kotoran lain dihilangkan dengan teknik sentrifugasi sehingga yang tertinggal hanya pelet sel darah putih (leukosit). Tris buffered saline ditambahkan ke dalam pelet leukosit untuk mencuci zat warna merah eritrosit. DNA diekstraksi dari leukosit dengan merusak sel menggunakan Proteinase-K, EDTA dan SDS (Montgomery dan Sise, 1990). EDTA berfungsi untuk merusak sel dengan cara mengikat ion magnesium. SDS untuk merusak membran sel (Muladno, 2002). NaCl jenuh ditambahkan untuk memekatkan DNA dan mengikat protein. Larutan-larutan yang digunakan memiliki pH 7,2
8. DNA bersifat labil dan mudah kehilangan
aktifitas biologisnya sehingga larutan yang digunakan adalah larutan yang memiliki pH tidak ekstrim (Montgomery dan Sise, 1990). High salt method dapat dijadikan alternatif metode ekstraksi DNA. Metode tersebut aman dan tidak membahayakan karena tidak menggunakan bahan beracun fenol yang bersifat korosif dan toksik. High salt method efisien karena dapat mengektraksi DNA dengan jumlah banyak dalam sekali pengerjaan. Namun demikian, kontaminasi protein yang lebih tinggi terdapat pada DNA yang diekstrak dengan menggunakan high salt method daripada DNA yang diekstrak dengan fenol (Prasetyo, 2005). Metode ekstraksi DNA harus disesuaikan dengan tujuan penelitian lanjut. Beberapa penelitian memerlukan DNA dalam jumlah banyak namun beberapa penelitian memerlukan DNA dalam jumlah sedikit. Penelitian yang memerlukan banyak DNA dengan tingkat kemurnian rendah dapat menggunakan high salt method sebagai metode ekstrasi DNA (Montgomery dan Sise, 1990). Pengukuran Konsentrasi DNA Jumlah dan kualitas DNA dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer atau dengan melihat intensitas molekul DNA dalam gel.
7
Pengukuran DNA melalui spektrofotometer didasarkan pada prinsip iradiasi ultra violet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. Penyerapan iradiasi sinar UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada panjang gelombang 280 nm. Apabila kepadatan optik (optical density) atau disebut OD260 sama dengan satu maka konsentrasi molekul DNA setara 50 µg/ml (untuk DNA heliks ganda) atau setara 40 µg/ml (untuk RNA atau DNA untai tunggal) atau setara 20 µg/ml (untuk oligonukleotida untai tunggal) (Muladno, 2002). Apabila jumlah DNA yang diperoleh terlalu sedikit sehingga konsentrasi tidak dapat diukur dengan alat spektrofotometer atau DNA yang diperoleh tidak murni, konsentrasi DNA dapat diestimasi dengan melihat intensitas flourosen yang dipancarkan etidium bromida. Intensitas DNA standar yang telah diketahui jumlahnya kemudian dibandingkan dengan intensitas DNA sampel dengan asumsi jenis DNA standar dan sampel harus sama (Muladno, 2002). Sambrook et al. (1989) menyatakan bahwa teknik flourosen etidium bromida digunakan bila sampel yang tersedia tidak mencukupi untuk dianalisis dengan menggunakan spektofotometer atau sampel terkontaminasi cukup parah. Kemurnian DNA Tingkat kemurnian DNA berkorelasi dengan kualitas DNA. Kualitas DNA dapat ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai OD260 dan nilai OD280 pada sampel DNA yang diukur melalui spektrofotometer. DNA dinyatakan murni jika memiliki nilai rasio OD260/OD280 (optical density) berkisar antara 1,8-2,0 (Muladno, 2002). Sambrook et al. (1989) menjelaskan bahwa rasio OD akan lebih besar atau lebih kecil dari nilai 1,8-2,0 jika ditemukan kontaminasi dari protein atau fenol. DNA dikatakan terkontaminasi RNA jika memiliki rasio OD260/OD280 lebih dari dua (Khosravinia et al., 2007). Elektroforesis DNA Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekular selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik pada makromolekul (Triwibowo, 2008). Teknik gel elektroforesis penting dilakukan dalam genetic engineer untuk merepresentasikan
8
fragmen asam nukleat secara langsung. Elektroforesis dilakukan dengan cara meletakkan sampel asam nukleat pada gel dan mengalirkan arus listrik yang berbeda potensial (Nicholl, 1996). Cara yang paling populer digunakan adalah melalui elektroforesis gel agarosa. Agarosa mudah dipakai untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang berukuran beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa. Poliakrilamida digunakan untuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil (Old dan Primrose, 1989). Agarosa adalah gel tiruan, berupa polisakarida yang merupakan hasil ekstraksi rumput laut dan bersifat edible. Suspensi agarosa dalam larutan penyangga dipanaskan sampai mendidih dan larutan yang panas dituangkan pada cetakan plastik dengan ketinggian beberapa milimeter (Soffer, 1991). DNA dapat bermigrasi di dalam gel dalam bentuk padat yang diletakkan dalam larutan buffer yang dialiri arus listrik (Muladno, 2002). DNA yang bermuatan negatif disebabkan oleh gugus fosfat. DNA berpindah secara garis lurus menuju kutub positif (Soffer, 1991). Old dan Primrose (1989) menyatakan bahwa DNA bergerak melalui gel pada kecepatan yang berbeda tergantung pada ukurannya (Tabel 1). Fragmen DNA yang lebih kecil (dengan berat molekul lebih ringan) relatif lebih mudah berpindah dan bermigrasi secara cepat, sementara potongan (fragmen) yang lebih besar pindah lebih lambat (Becker et al., 2006). Muladno (2002) menyatakan bahwa kecepatan migrasi DNA ditentukan oleh beberapa faktor diantaranya ukuran molekul DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, voltase yang digunakan, etidium bromida di dalam gel dan komposisi larutan buffer. Tabel 1. Karakteristik Pemisahan untuk Gel Agarosa dan Poliakrilamid Tipe Gel
Kisaran pemisahan (bp)
0,3% agarosa
50.000-1.000
0,7% agarosa
20.000-300
1,4% agarosa
6.000-300
4,0% akrilamid
1000-100
10,0% akrilamid
500-25
20,0% akrilamid
50-1
Sumber: Nicholl (1996)
9
Fragmen DNA dalam gel dapat divisualisasikan dengan cara melakukan staining atau memberikan label pada DNA dengan bahan radioaktif. Pewarnaan yang biasa digunakan melibatkan perendaman gel dalam etidium bromida, yang berikatan dengan DNA dan berflourosen ketika terekspos sinar ultraviolet (Becker et al., 2006). Penggunaan etidium bromida dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena etidium bromida akan memendarkan sinar ultra violet. Gel yang disinari ultraviolet dari bawah akan menampakkan citra berupa pita-pita. Pita-pita tersebut adalah molekul-molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah proses running dilakukan (Triwibowo, 2008).
10
METODE Lokasi dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler Hewan, Pusat Penelitian Bioteknologi-Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong. Penelitian ini dilaksanakan selama dua bulan dari bulan Maret 2009 sampai April 2009. Materi Sampel Darah Sapi Sampel yang digunakan adalah darah segar sapi Friesian Holstein (FH) dari empat ekor sapi yang berasal dari Laboratorium Hewan Pusat Bioteknologi-LIPI, Cibinong. Bahan Kimia Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah red blood cell lysis (RBCL) (NH4Cl, KHCO3, 0,5 M EDTA, H2O, pH 7,2), tris buffered saline (TBS) (NaCl, KCl, Tris, H2O, pH 7,4), NaCl jenuh, Proteinase K, tris etilendiamin tetraasetat buffer (TE buffer) (1 M Tris, 0,5 M EDTA, H2O, pH 8,0), alkohol 70%, etanol 96%, gel 0,8% agarosa, marker ladder 1 kb, tris borat etilendiamin tetraasetat (TBE) 1x, etidium bromida, film polaroid, H2O, dan loading dye. Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan adalah venoject vacutainer yang mengandung 15 % EDTA, cap holder, jarum 18G, tabung sentrifugasi, alat sentrifugasi, shaker bertemperatur, vortex, pipet Pasteur modifikasi, pembakar Bunsen, tabung mikro 1,5 ml, pipet mikro P1000, pipet mikro P100, tisu Kimwipe, tisu handuk, pinset, pipet Pasteur modifikasi, tabung gelas steril, tips P1000+P100 steril, parafilm, Genequant DNA calculator, dan alat elektroforesis. Rancangan Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap dengan pola faktorial 3x2. Dua faktor (perlakuan) yang diujikan yaitu perbandingan darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi yang berbeda. Perbandingan darah dan lisis buffer (ml) yaitu 1:2, 1:1, dan 2:1. Kecepatan sentrifugasi yaitu 2.500 rpm dan 3.500 rpm. Dengan demikian, penelitian ini melibatkan enam kombinasi perlakuan (3x2).
Keenam kombinasi perlakuan tersebut yaitu T1 = 1:2, 2.500 rpm; T2 = 1:1, 2.500 rpm; T3 = 2:1, 2.500 rpm; T4 = 1:2, 3.500 rpm; T5 = 1:1, 3.500 rpm; dan T6 = 2:1, 3.500 rpm. Tiap kombinasi perlakuan diulang sebanyak empat kali. Model matematika rancangan tersebut menurut Gaspersz (1991) adalah Yijk = µ + Bi + Ki + BKij +
ijk
Keterangan: Yijk : variabel respon akibat pengaruh taraf perbandingan darah dan lisis buffer ke-i dan taraf kecepatan sentrifugasi ke-j pada ulangan ke-k µ
: nilai tengah umum
Bi
: pengaruh taraf perbandingan darah dan lisis buffer level ke-i
Kj
: pengaruh taraf kecepatan sentrifugasi level ke-j
BKij : pengaruh interaksi antara perbandingan darah dan lisis buffer ke-i dengan kecepatan sentrifugasi ke-j ijk
: pengaruh galat percobaan pada unit percobaan ke-k dalam kombinasi perlakuan ke-ij
Analisis Data Data konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh dari tiap perlakuan dianalisis dengan Sidik Ragam. Data tersebut diuji asumsi (kenormalan, kebebasan, keaditifan, dan kehomogenan galat) terlebih dahulu. Data yang memenuhi keempat uji asumsi tersebut langsung disidik ragam, tetapi data yang tidak memenuhi salah satu uji asumsi tersebut ditranformasi terlebih dahulu. Perbedaan antar kombinasi perlakuan diuji menggunakan Uji Tukey pada
= 5% (P<0,05).
Data kualitas DNA yang diperoleh dari sampel yang dipilih secara acak dari setiap perlakuan, dibandingkan antar perlakuan dengan melihat penampakan pita tunggal. Prosedur Pengkoleksian Sampel Darah Sapi Sampel darah sapi diambil dengan menggunakan jarum 18G pada pembuluh darah kecil (vena coxigea) dari ekor sapi. Darah tersebut dikoleksi langsung ke dalam tabung 14 ml yang mengandung 15% EDTA sebagai antikoagulasi.
12
Ekstraksi DNA Metode ekstraksi DNA yang digunakan adalah high salt method (Montgomery dan Sise, 1990) yang telah dimodifikasi. Runutan proses sebagai berikut: Penyiapan Sel Darah Putih. Sel darah putih diperoleh dengan cara melisis darah segar dengan menggunakan red blood cell lysis buffer (RBCL) dan pengendapan dengan sentrifugasi (2.500 dan 3.500 rpm). RBCL yang digunakan adalah sesuai perlakuan yang digunakan dengan perbandingan darah segar dengan RBCL yaitu 1:2, 1:1, dan 2:1, dengan total volume keduanya adalah tiga ml. Darah segar yang ditambahkan RBCL dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Larutan tersebut kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Larutan disentrifugasi sesuai perlakuan (2.500 atau 3.500 rpm) selama 10 menit pada suhu 10 oC. Pelet yang diperoleh adalah sel darah putih yang kemudian ditambahkan RBCL lagi, dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Larutan tersebut kemudian diinkubasi selama 10 menit dalam suhu ruang. Larutan disentrifugasi selama 10 menit pada suhu 10 oC. Pelet sel darah putih yang diperoleh ditambahkan ½ volume RBCL (0,5; 0,75; atau 1 ml) lalu dihomogenkan menggunakan vortex. Larutan tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan dibuang. Pelet yang dikoleksi ditambahkan TBS dengan jumlah yang sama seperti RBCL (0,5; 0,75; atau 1 ml) kemudian dihomogenkan dan disentrifugasi selama 10 menit pada suhu 10 oC. Pelet ditambahkan TBS (sebagai pencuci) lalu disentrifugasi selama 10 menit pada suhu 10 oC. Pencucian dengan TBS dilakukan hingga pelet tidak berwarna merah (kurang lebih tiga kali). TE buffer sebanyak 1 ml ditambahkan ke dalam pelet sel darah putih, lalu dihomogenkan dengan vortex sampai pelet hancur. Penghilangan Protein (Protein Removal). Larutan Proteinase K sebanyak 1 ml ditambahkan ke dalam tabung berisi sel darah putih. Tutup tabung dilapisi parafilm. Tabung diinkubasi di dalam shaker bersuhu 37 oC pada kecepatan 150 rpm selama satu malam.
13
Darah + RBCL (sesuai perlakuan ) dihomogenkan, diinkubasi selama 10 menit Darah + RBCL disentrifugasi (kecepatan sesuai perlakuan) selama 10 menit, 10 oC
Pelet + RBCL dihomogenkan, diinkubasi selama 10 menit Pelet + RBCL disentrifugasi selama 10 menit, 10 oC
Pelet + ½ volume RBCL dihomogenkan, diinkubasi 10 menit TBS ditambahkan, lalu disentrifugasi selama 10 menit, 10 oC Pelet + TBS disentrifugasi selama 10 menit, 10 oC (dilakukan ± 3 kali hingga pellet tidak berwarna merah)
Pelet + 1 ml TE buffer dihomogenkan sampai pellet hancur
Pelet + 1 ml Proteinase-K ditambahkan ke dalam pelet Pelet diinkubasi pada suhu 37 oC pada kecepatan 150 rpm selama 1 malam
Pelet + 1 ml NaCl jenuh dikocok membentuk angka 8 lalu disentrifugasi selama 10 menit, 10 oC
Supernatan berisi DNA ditransfer ke tabung berisi 1 ml 96% etanol dingin DNA dikoleksi menggunakan pipet kaca lalu dicuci di dalam alkohol 70%
DNA dikeringkan di atas tisu Kimwipe
DNA direndam dalam TE buffer, dihomogenkan di atas shaker pada suhu ruang sampai terlarut
DNA disimpan pada suhu -20 oC
Gambar 3. Bagan Alir Ekstraksi DNA Menggunakan High Salt Method
14
Koleksi DNA. NaCl jenuh sebanyak satu ml ditambahkan ke dalam sel darah putih. Tabung kemudian dikocok kuat membentuk angka delapan dan disentrifugasi selama 10 menit pada suhu 10 oC. Supernatan yang mengandung DNA ditransfer ke tabung gelas yang steril yang berisi etanol 96% dingin. Tabung gelas tersebut kemudian ditutup dengan parafilm. Untaian benang putih terlihat naik ke atas (ini adalah DNA). DNA dikoleksi dengan pipet kaca yang berbentuk kait di ujungnya. DNA yang diperoleh dicuci dalam alkohol 70%. DNA dikeringkan di atas tisu Kimwipe. DNA direndam dalam TE buffer sampai DNA terlepas dan dihomogenkan di atas shaker pada suhu ruang sampai larut. DNA disimpan pada suhu -20oC. Penentuan Konsentrasi Konsenstrasi DNA diukur secara spektofotometer dengan menggunakan GeneQuant DNA calculator. Penentuan konsentrasi DNA berdasarkan pembacaan optical density (OD) pada gelombang 260 Å dan 280 Å (Sambrook et al., 1989). DNA yang terlalu pekat diencerkan terlebih dahulu dengan menambahkan volume TE buffer. Hasil penentuan konsentrasi DNA oleh GeneQuant DNA calculator dikalikan dengan faktor pengenceran yang dilakukan. Penentuan Kemurnian Kualitas DNA diukur secara spektofotometrik dengan menggunakan GeneQuant DNA calculator. Kualitas DNA ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai OD260 dan nilai OD280 pada sampel DNA yang diukur. Penentuan Kualitas DNA Bubuk gel agarosa sebanyak 1,6 g dilarutkan dalam TBE 1x sebanyak 200 ml kemudian dididihkan sampai larut sempurna dan bening untuk mendapatkan gel agarosa 0,8%. Gel lalu dibiarkan beberapa menit hingga suhu turun menjadi 50-60 o
C. Cetakan gel dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70%, lalu gel dituangkan
ke dalam cetakan. Sisir elektroforesis dipasang di salah satu ujung cetakan gel agarosa. Gel agarosa dibiarkan kira-kira satu jam hingga mengeras. Gel agarosa yang telah mengeras lalu dikeluarkan dari cetakan dan dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi TBE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TBE).
15
Sampel DNA sebanyak 5 µl untuk masing-masing sampel dicampurkan dengan 2 µl loading dye. Marker DNA yang digunakan sebanyak 1.5 µl kemudian dicampurkan dengan 2 µl loading dye. Marker DNA yang digunakan adalah 1 kb Biolabs DNA Ladder N32325. Marker tersebut hanya sebagai kontrol ukuran berat molekul. Selanjutnya, masing-masing sampel yang telah dicampur dengan loading dye dimasukkan ke dalam sumur dengan menggunakan mikropipet. Alat elektroforesis dialiri arus listrik 100 V, selama 60 menit. Setelah itu, gel direndam dalam larutan mengandung etidium bromida (EtBr) selama 30 menit. Gel yang telah direndam EtBr kemudian dibilas dengan menggunakan air yang mengalir. Gel kemudian diperiksa di atas UV illuminator. Hasil visualisasi difoto dengan film polaroid. Hasil elektroforesis dikonfirmasikan antara pita yang dihasilkan dengan konsentrasi DNA.
16
HASIL DAN PEMBAHASAN Konsentrasi DNA Konsentrasi DNA dapat dihitung secara akurat melalui penyerapan spektofotometrik sinar ultraviolet. Jumlah radiasi yang diserap DNA berbanding lurus dengan jumlah DNA dalam sampel (Brown, 1995). Hasil sidik ragam menunjukkan bahwa perbandingan volume darah dengan lisis buffer tidak berpengaruh terhadap konsentrasi DNA yang dihasilkan, sedangkan kecepatan sentrifugasi berpengaruh terhadap konsentrasi DNA yang dihasilkan (P<0,05). Rataan konsentrasi semakin meningkat dengan peningkatan kecepatan sentrifugasi. Rataan konsentrasi DNA yang dihasilkan diperlihatkan pada Tabel 2. Tabel 2. Rata-rata Konsentrasi DNA (ng/µl) pada Perbandingan Darah dan Lisis Buffer dengan Kecepatan yang Berbeda. Kecepatan sentrifugasi 2.500 rpm 3.500 rpm Rata-rata ± SE
1:2
Darah:lisis buffer 1:1 2:1
Rata-rata ± SE
170,60±53,32 220,10±71,92 226,78±52,06 205,82b±32,13 862,50±272,37 496,45±190,33 199,05±56,39 519,33a±130,46 516,55a±183,31 358,27a±107,70 212,91a±35,91 Keterangan: Huruf superskrip berbeda pada kolom yang sama, berbeda (P<0,05); SE = Standard error for mean
Tabel 2 menunjukkan bahwa konsentrasi DNA pada kecepatan sentrifugasi 2.500 rpm (205,82 ng/µl) lebih sedikit daripada kecepatan 3.500 rpm (519,33 ng/µl) (P<0,05). Perbandingan lisis buffer dan darah tidak berpengaruh terhadap konsentrasi DNA yang dihasilkan. Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan menggunakan sampel darah dalam jumlah yang sedikit jika ditemukan kesulitan dalam memperoleh sampel darah dalam volume besar. Konsentrasi yang diperoleh pada ketiga taraf perlakuan perbandingan darah dan lisis buffer adalah sama. Namun pada perbandingan darah dan lisis buffer 1:2 lebih optimal dalam melisis eritrosit. Hal ini diperkirakan bahwa darah yang digunakan lebih sedikit dibandingkan 1:1 dan 2:1, tetapi dapat memanen leukosit dengan jumlah yang tidak berbeda. Jumlah leukosit yang dipanen berbanding lurus dengan konsentrasi DNA yang dihasilkan karena DNA ada di dalam inti sel yang hanya dimiliki oleh leukosit. Dellman dan Brown (1989) menyatakan bahwa eritrosit mamalia dewasa tidak berinti, sedangkan leukosit memiliki nukleus (inti sel). DNA bersama-sama protein dan molekul RNA terdapat dalam inti sel (Muladno, 2002).
Hasil sidik ragam yang tidak nyata pada pengaruh perbandingan darah dan lisis buffer juga disebabkan standard error pada kombinasi perlakuan 1:2, 3.500 rpm (272,37 ng/µl) dan 1:1, 3.500 rpm (190,33 ng/µl) lebih besar dari standard error pada kombinasi perlakuan yang lain. Standard error yang besar pada kedua kombinasi perlakuan mungkin disebabkan oleh pengaruh pengenceran yang dilakukan pada tahap penghitungan konsentrasi. Pengenceran dilakukan karena QeneQuant DNA calculator tidak dapat membaca pada konsentrasi DNA awal yang pekat. Hasil pembacaan konsentrasi oleh GeneQuant DNA calculator dikalikan dengan faktor pengenceran yang dilakukan. Hal tersebut membuat selang data konsentrasi pada kedua kombinasi perlakuan tersebut menjadi besar sehingga mengakibatkan standard error juga berbeda. Konsentrasi DNA yang diperoleh dengan kecepatan yang berbeda adalah tidak sama. Peningkatan konsentrasi DNA terjadi dengan pertambahan kecepatan dari 2.500 rpm menjadi 3.500 rpm. Rata-rata konsentrasi DNA pada kecepatan 2.500 rpm adalah 205,82 ng/µ, sedangkan pada kecepatan 3.500 rpm adalah 519,33 ng/µl. Peningkatan konsentrasi pada kecepatan sentrifugasi 3.500 rpm diduga disebabkan oleh lebih banyak sel darah putih yang mengendap daripada kecepatan 2.500 rpm. Prinsip sentrifugasi berdasarkan fenomena bahwa partikel yang tersuspensi di dalam suatu wadah
akan mengendap ke dasar wadah karena pengaruh gravitasi
(Triwibowo, 2008). Kemurnian DNA Tingkat kemurnian DNA berhubungan dengan kualitas DNA. DNA dinyatakan murni jika memiliki nilai rasio OD260/OD280 (optical density) berkisar antara 1,8-2,0 (Sambrook et al., 1989). Tingkat kemurnian tersebut diukur secara spektofotometrik dengan menggunakan Genequant DNA calculator. Sidik ragam menunjukkan bahwa perbandingan darah dengan lisis buffer tidak berpengaruh terhadap kemurnian DNA. Rataan rasio OD260/OD280 dari DNA yang dihasilkan disajikan secara lengkap pada Tabel 3.
18
Tabel 3. Rata-rata Kemurnian DNA (OD260/OD280) pada Perbandingan Darah dan Lisis Buffer dengan Kecepatan yang Berbeda. Kecepatan sentrifugasi 1:2 1,155±0,103 2.500 rpm 1,148±0,111 3.500 rpm Rata-rata ± SE 1,151±0,070
Darah:lisis buffer 1:1 2:1 1,214±0,057 1,161±0,065 1,187±0,041
1,009±0,018 1,131±0,054 1,070±0,034
Rata-rata ± SE 1,12±0,044 1,146±0,042
Keterangan : SE = Standard error for mean
Tabel 3 menunjukkan bahwa kecepatan sentrifugasi juga tidak berpengaruh terhadap kemurnian DNA yang dihasilkan pada penelitian ini (P>0,05). Rataan kemurnian DNA pada keenam kombinasi perlakuan berkisar 1,009 sampai 1,214. Rasio tertinggi relatif dimiliki oleh perbandingan darah dan lisis buffer 1:1 pada kecepatan 2.500 rpm (1,214±0,057). Rasio relatif terendah ada pada perbandingan darah dan lisis buffer 2:1 pada kecepatan 2.500 rpm (1,009±0,018). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa DNA yang dihasilkan tidak terlalu murni. Kemurnian yang rendah ini diduga disebabkan protein yang tercampur pada DNA yang dihasilkan. Sambrook et al. (1989) menjelaskan bahwa rasio OD akan lebih besar atau lebih kecil dari nilai 1,8-2,0 jika ditemukan kontaminasi dari protein atau fenol. Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah high salt method yang hanya menggunakan NaCl jenuh sehingga materi pengotor berupa protein masih tinggi ditemukan pada perolehan DNA. Prasetyo (2005) menyatakan bahwa kandungan materi pengotor (protein, RNA, fenol, heparin, haemoglobin) lebih tinggi pada DNA yang diekstraksi menggunakan metode pengendapan garam. Penggunaan NaCl jenuh juga diduga sebagai sumber kontaminasi DNA. Perbandingan volume darah dan lisis buffer maupun kecepatan sentrifugasi tidak berpengaruh terhadap kemurnian DNA yang dihasilkan karena kedua faktor tersebut hanya menentukan banyaknya sel darah putih yang diperoleh. Setelah pengkoleksian sel darah putih baru dilakukan protein removal dengan menambahkan Proteinase-K yang terdiri atas 10 % SDS, 0,5 M EDTA, dan Proteinase-K dalam jumlah yang sama pada masing-masing perlakuan. EDTA berfungsi untuk merusak sel dengan cara mengikat ion magnesium. SDS untuk merusak membran sel. Proteinase-K berfungsi untuk menghilangkan protein yang berikatan dengan DNA di dalam inti sel darah putih (Sigma, 2008). Protein tersebut tidak hilang, tetapi hanya dipisahkan dari DNA. DNA yang ada lalu dipekatkan dengan menggunakan NaCl
19
jenuh. Proses penuangan supernatan yang berisi DNA memungkinkan protein yang ada ikut tertuang sehingga menyebabkan DNA yang diperoleh terkontaminasi oleh protein. Selain itu, kemurnian yang rendah juga dapat terjadi karena volume Proteinase-K yang digunakan terlalu sedikit dan masih terdapat NaCl pada DNA. Konsentrasi DNA yang dihasilkan pada penelitian ini cukup besar dengan tingkat kemurnian yang rendah. Hal ini disebabkan penghitungan dengan GeneQuant DNA calculator didasarkan pada penghitungan optical density (OD). Dengan demikian, yang dihitung termasuk kontaminan (protein). Tingkat kemurnian DNA yang rendah tidak menutup kemungkinan DNA tersebut untuk digunakan pada penelitian yang berbasis teknologi DNA. Penelitian teknologi DNA yang memerlukan DNA dalam jumlah banyak dan tidak menuntut tingkat kemurnian yang tinggi, diantaranya pemetaan genetik, teknologi marker, dan sequencing DNA. Setiap prosedur ekstraksi DNA memiliki kelebihan dan kekurangan, begitu juga dengan high salt method. DNA yang diperoleh dengan menggunakan metode high salt method yang dilakukan pada penelitian ini, memiliki tingkat kemurnian yang rendah. Meskipun demikian, metode ini mempunyai kelebihan yaitu tidak menggunakan bahan-bahan yang bersifat toksik dan korosif seperti fenol dan kloroform. Dengan demikian high salt method bersifat aman terhadap peneliti yang menggunakannya. Selain itu, isu lingkungan menuntut untuk menggunakan bahanbahan yang ramah lingkungan. High salt method dapat dijadikan alternatif metode ekstraksi DNA yang bersifat ramah lingkungan. Kualitas DNA Hasil elektroforesis dari DNA ditampilkan pada Gambar 4. Masing-masing kombinasi perlakuan diwakili oleh satu ulangan yang didapat melalui pemilihan secara acak.
20
DNA (>10 kb)
Gambar 4. Hasil Elektroforesis DNA dalam Gel 0,8% Agarosa (M= DNA Ladder 1 kb, T1 sampai dengan T6 = sampel DNA). Keenam sampel DNA dielektroforesis dalam gel Agarosa 0,8% pada tegangan 100 V selama 1 jam. Marker yang digunakan adalah DNA Ladder N32325 yang berukuran 1 kb. Ukuran sampel DNA diperkirakan dengan melihat letak DNA terhadap marker yang telah diketahui ukurannya. Pengukuran tersebut hanya bersifat perkiraan dan untuk memastikan DNA tersebut benar-benar ada. Keenam sampel DNA menunjukkan bahwa ukuran DNA lebih dari 10 kb karena pita DNA berada di atas marker yang digunakan. DNA tersebut merupakan DNA genom sapi FH yang ukurannya 3 giga basa (National Institutes of Health, 2009). Keenam sampel DNA tidak turun sempurna pada gel Agarosa. Masih banyak DNA yang berada di dalam sumur gel agarosa. Hal ini disebabkan oleh konsentrasi yang tinggi dari masing-masing sampel, T1 (108,8 ng/µl), T2 (329,7 ng/µl), T3 (230,4 ng/µl), T4 (433,8 ng/µl), T5 (252,4 ng/µl), dan T6 (222,8 ng/µl). Besarnya konsentrasi menyebabkan kecepatan pergerakan DNA dari kutub negatif ke kutub positif menjadi lambat sehingga banyak DNA yang tertinggal di sumur. Old dan Primrose (1985) menyatakan bahwa molekul-molekul DNA bermuatan negatif dan di dalam medan listrik molekul DNA bergerak melalui gel pada kecepatan yang berbeda tergantung ukurannya. Molekul DNA yang kecil dapat dengan mudah
21
melewati gel dan karenanya bergerak lebih cepat dibandingkan molekul yang lebih besar. Banyak faktor yang mempengaruhi kecepatan perpindahan DNA dari kutub negatif ke kutub positif. Faktor-faktor tersebut yaitu ukuran molekul DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, voltase yang digunakan, adanya etidium bromida di dalam gel, dan komposisi larutan buffer (Muladno, 2002). Faktor yang lain mempengaruhi permindahan DNA yang menyebabkan DNA masih tertinggal di dalam sumur selain besar molekul DNA, diduga adalah konsentrasi gel agarosa. Gel agarosa yang digunakan dalam penelitian ini adalah konsentrasi 0,8%. Konsentrasi gel tersebut kemungkinan terlalu tinggi jika sampel yang dianalisis berukuran 3 giga pasang basa. Muladno (2002) menyatakan bahwa migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul DNA yang sama pada gel berkonsentrasi tinggi. Nicholl (1996) menyatakan konsentrasi gel yang normal untuk elektroforesis yaitu antara 0,3%-2,0% dan untuk DNA yang berukuran 100050000 menggunakan gel agarosa yang berkonsentrasi 0,3%. Selain itu, NaCl diduga masih terdapat di dalam sampel DNA sehingga menampakkan pita DNA yang tidak tajam pada hasil elektroforesis. DNA yang berasal dari darah segar sapi berhasil diisolasi dengan baik, karena tidak ada pita-pita lainnya yang tampak pada gambar pada setiap sampel (single band). Elektroforesis DNA menghasilkan pita tunggal pada keenam sampel. Hal ini menunjukkan bahwa DNA yang diperoleh berkualitas baik. DNA yang dihasilkan murni tidak bercampur dengan RNA. High salt method efektif untuk menghilangkan RNA tanpa bantuan RNAse karena rasio OD260/OD280 tidak melebihi dua. DNA dikatakan terkontaminasi RNA jika memiliki rasio OD260/OD280 lebih dari dua (Khosravinia et al., 2007). Tidak perlunya penggunaan RNAse pada high salt method dapat meringankan biaya yang dikeluarkan untuk keperluan penelitian karena harga RNAse sangat mahal.
22
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Kecepatan sentrifugasi 3.500 rpm menghasilkan DNA lebih banyak dari 2.500 rpm. Perbandingan darah dan lisis buffer tidak berpengaruh terhadap konsentrasi DNA. Perbandingan darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi yang berbeda tidak mempengaruhi tingkat kemurnian DNA. DNA yang dihasilkan dengan metode high salt methode masih terdapat protein pengotor, tetapi efektif untuk menghilangkan RNA. DNA dapat digunakan untuk penelitian lanjut yang memerlukan DNA dalam jumlah banyak dan tingkat kemurnian rendah. Saran Perlu dicoba ekstraksi DNA dengan menggunakan kombinasi metode antara high salt method dan PCI (Phenol Choloform Isoamilalkohol) untuk meningkatkan tingkat kemurnian DNA yang dihasilkan. Perlu dilakukan pengujian kemurnian dengan menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan DNA yang diperoleh sebagai template. DNA genom perlu dicoba elektroforesis dengan menggunakan konsentrasi agarosa 0,3%.
UCAPAN TERIMA KASIH Puji syukur Alhamdulillah, Penulis sampaikan kehadirat Allah SWT yang selalu melimpahkan nikmat-Nya yang tak terhingga sehingga Penulis dapat menyelesaikan skripsi dan studi ini. Salawat dan salam semoga selalu kita curahkan untuk suri tauladan kita Nabi Muhammad SAW. Terima kasih untuk Ayahanda dan Ibunda yang tak pernah lelah berdoa, memberikan kasih sayang, nasihat, dan semangat kepada Penulis untuk kesuksesan dan keberhasilan Penulis. Terima kasih kepada Ka Insan dan De Anang atas kasih sayang dan keceriaan selama ini. Terima kasih kepada keluarga besar H. M. Syatiri dan Parto Wiryono yang telah memberikan banyak bantuan sehingga Penulis dapat menyelesaikan studi di IPB. Penulis menyampaikan terima kasih banyak kepada Prof. Dr. Ir. Ronny R. Noor, MRurSc. selaku pembimbing akademik dan pembimbing utama, atas bimbingannya yang berharga selama Penulis belajar di IPTP, melakukan penelitian dan menyusun skripsi. Dr. Ir. Endang T. Margawati, MAgrSc. selaku pembimbing anggota atas semua bimbingan, masukan dan arahannya selama Penulis melakukan penelitian dan penyusunan skripsi ini hingga tahap akhir. Terima kasih juga untuk Ir. Rini H. Mulyono, MSi dan Ir. Anita S. T., MRurSc. selaku penguji sidang yang telah memberikan banyak saran agar skripsi ini menjadi lebih baik. Tak lupa Penulis sampaikan terima kasih kepada staf Laboratorium Biologi Molekuler Hewan dan teman sepenelitian yaitu Kokom yang telah banyak membantu dalam melakukan penelitian ini. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Ninu, Lia, Pipit, Hida, Mala, dan Iyest atas persabahatannya serta kepada temanteman di Wisma Ceria atas persaudaraan yang telah terjalin selama ini. Semua kebaikan yang telah diberikan hanya Allah yang pantas membalasnya. Akhir kata, Penulis menyampaikan terima kasih banyak kepada civitas akademika Fakultas Peternakan, khususnya IPTP 42, serta kepada semua pihak yang telah membantu. Semoga skripsi ini bermanfaat bagi kemajuan dunia pendidikan dan peternakan. Amin. Bogor, Agustus 2009 Penulis
DAFTAR PUSTAKA Anggaraeni, A., K. Diwyanto, L. Praharani, A. Saleh, dan C. Talib. 2000. Evaluasi mutu genetik sapi perah induk sapi Fries Holland di daerah sentra produksi susu. Prosiding Hasil Penelitian Bagian Proyek Rekayasa Teknologi Peternakan/ARMP-II. Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan. Badan Penelitian dan Pengembangan Penelitian. Departemen Pertanian. Bogor. Alberts, B., D. Bray., J. Lewis., Raff., K. Robert and J. D. Watson. 1994. Biologi Molekuler Sel. Mengenal Sel. Edisi ke-2, Gramedia, Jakarta Aljanabi, M. and I. Martinez. 1997. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acid Research vol. 25 (22): 4692-4693. Becker, W. M., L. J. Kleinsmith, and J. Hardin. 2006. The World of The Cell. Pearson Benjamin Cummings, San Francisco. Brown, T. A. 1995. Gene Cloning an Introduction. Third edition. Chapman and Hall, New York. Dellman, H. D., and E. M. Brown. 1989. Buku Teks Histologi Veteriner I. Terjemahan : R. Hartono. Penerbit Universitas Indonesia, Jakarta. Diwyanto, K., A. Anggraeni, Sugiarti, Nurhasanah, H. Setyanto, dan L. Praharani. 2000. Pengkajian sistem budidaya sapi perah untuk meningkatkan produktivitas. Prosiding Hasil Penelitian Bagian Proyek Rekayasa Teknologi Peternakan/ARMP-II. Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan. Badan Penelitian dan Pengembangan Penelitian. Departemen Pertanian. Bogor. Gaspersz, V. 1991. Metode Perancangan Percobaan untuk Ilmu-ilmu Pertanian, Ilmu-ilmu Teknik, dan Biologi. CV ARMICO, Bandung. Granner, D. K. 1995. Biokimia Harper. Edisi ke-22. ECG Penerbit Buku Kedokteran, Jakarta. Khosravinia, H., H. N. Narasimha Murthy, D. T. Parasad, and N. Pirany. 2007. Optimizing factors influencing DNA extraction from fresh whole avian blood. African J. of Biotech. Vol. 6 (4): 481-486. Komalasari, K. 2009. Pengaruh perbandingan volume darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi terhadap kualitas produk DNA pada sapi Friesian Holstein (FH). Skripsi. Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Maclean, N. 1987. Macmillan Dictionary of Genetics and Cell Biology. Macmillan Press, London.
Montgomery, G. W. and J. A. Sise. 1990. Extraction DNA from sheep white blood cells. New Zealand Journal of Agricultural Research. Vol. 33 : 437-441. Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda, Bogor. Murray, R. K. 1995. Biokimia Harper. Edisi ke-22. ECG Penerbit Buku Kedokteran, Jakarta. National Institutes of Health. 2009. Bovine genome assembled: International Effort Makes Data Freely Available to Scientists Worldwide. http://www.genome.gov. [23 Agustus 2009]. Nicholl, D. S. T. 1996. An Introduction to Genetic Engineering. Cambridge University Press, Crambridge. Noor, R. R. 2008. Genetika Ternak. Penebar Swadaya, Jakarta. Old, R. W. and S. B. Primrose. 1989. Prinsip-prinsip Manipulasi Gen: Suatu Pengantar Rekayasa Genetik. Blackwell Scientific Publications, Oxford. Prasetyo, A. 2005. Metode ekstraksi DNA dan identifikasi gen kappa kasein (Kkasein) pada sapi Fries Holland (FH) di peternakan rakyat. Skripsi. Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Russel, P. J. 1990. Genetics. Scott, Foresman and Company, Ilinois. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Sigma Life Science. 2008. Products for life science research. SIGMA-ALDRICH LABWARE, Singapura. Soffer, W. H. 1991. An Introduction to Genetic Engineering. ButterworthHeinemann, Stoneham. Sudono, A., R. Rosdiana, dan B. S. Setiawan. 2003. Beternak Sapi Perah secara Intensif. Agromedia Pustaka, Jakarta. Triwobowo, Y. 2008. Biologi. Molekuler. Erlangga, Jakarta.
26
LAMPIRAN
Lampiran 1. Larutan-Larutan yang Digunakan untuk Ekstraksi DNA Menggunakan High Salt Method 1.
Red Blood Cell Lysis Buffer (RBCL) 500 ml pH 7,2 NH4Cl
4,01 g
KHCO3
0,5 g
0,5 M EDTA 100µl H2O
2.
500 ml
Tris Buffered Saline (TBS) 500 ml pH 7,4 NaCl
4g
KCl
0,19 g
Tris
1,5 g
H2O
500 ml
autoklaf
3.
TE buffer 250 ml, pH 8 1 M Tris
2,5 ml
0,5 M EDTA 50 ul H2O
250 ml
autoklaf
4.
5.
Proteinase K 1 ml/sample perlakuan 0,5 M EDTA
300 µl
10% SDS
210 µl
Proteinase-k
0,5 mg
milliQ-H2O
1 ml
TBE 1X 100 ml Tris
5,4 g
Boric Acid 2,75 g 0.5 M EDTA 2 ml H2O
100 ml
28
6.
Gel Agarosa 0,8 % Agarosa
2g
TBE 1X
200 ml
29
Lampiran 2. Data Konsentrasi dan Kemurnian DNA (OD260/OD280) No.
Perlakuan
Konsentrasi (ng/µl)
260 A
280 A
OD260/OD280
1
S1T1
230,1
0,767
0,763
1,005
2
S2T1
287,4
0,958
0,657
1,458
3
S3T1
56,1
0,561
0,52
1,079
4
S4T1
108,8
1,088
1,003
1,078
5
S1T2
81,2
0,406
0,37
1,097
6
S2T2
329,7
1,099
0,869
1,265
7
S3T2
357,9
1,193
1,041
1,146
8
S4T2
111,6
1,116
0,827
1,349
9
S1T3
112,8
1,128
1,144
0,986
10
S2T3
200
1
0,973
1,028
11
S3T3
230,4
0,576
0,566
1,018
12
S4T3
363,9
1,213
1,208
1,004
13
S1T4
1218
1,015
0,978
1,038
14
S2T4
433,8
1,446
0,977
1,48
15
S3T4
361,8
1,206
1,167
1,033
16
S4T4
1436,4
1,197
1,15
1,041
17
S1T5
981,6
1,227
1,013
1,204
18
S2T5
611,2
1,528
1,153
1,325
19
S3T5
252,4
1,262
1,201
1,051
20
S4T5
140,6
0,703
0,662
1,062
21
S1T6
106,3
1,063
0,839
1,267
22
S2T6
222,8
1,114
1,062
1,049
23
S3T6
348,9
1,163
1,118
1,04
24
S4T6
118,2
1,182
1,013
1,167
30
Lampiran 3. Sidik Ragam Pengaruh Kecepatan Sentrifugasi dan Rasio Lisis Buffer dengan Darah terhadap Konsentrasi DNA Sumber Keragaman
Kuadrat Tengah 0,616
F
Probability
Kecepatan Sentrifugasi
Derajat Jumlah Bebas Kuadrat 1 0,616
6,71
0,019*
Rasio Lisis Buffer dan
2
0,201
0,101
1,09
0,356
Kecepatan * Rasio
2
0,608
0,304
3,31
0,060
Galat
18
1,653
0,092
Total
23
3,079
Darah
* nyata Lampiran 4. Uji Tukey Pengaruh Kecepatan yang Berbeda terhadap Konsentrasi DNA Kecepatan Sentrifugasi
Rataan Konsentrasi
Grup Kehomogenan
(ng/µl) 3.500 rpm
519,33
b
2.500 rpm
205,83
a
Lampiran 5. Sidik Ragam Pengaruh Kecepatan Sentrifugasi dan Rasio Lisis Buffer dengan Darah terhadap Kemurnian DNA Sumber Keragaman
Kuadrat Tengah 0,0001
F
Probability
Kecepatan Sentrifugasi
Derajat Jumlah Bebas Kuadrat 1 0,0001
0,13
0,725
Rasio Lisis Buffer dan
2
0,0024
0,0012
1,39
0,274
Kecepatan * Rasio
2
0,0014
0,0007
0,83
0,458
Galat
18
0,0152
0,0008
Total
23
0,0190
Darah
31
This document was created with Win2PDF available at http://www.win2pdf.com. The unregistered version of Win2PDF is for evaluation or non-commercial use only. This page will not be added after purchasing Win2PDF.
