Ing. Petr ák, CSc., Roche s.r.o., Diagnostics Division
Nové monosti v sekvenování - sekvenátor GS-FLX Pøedstavte si, e zajdete k lékaøi tøeba s migrénou a u druhý den víte, jestli za bolest hlavy mùe vae DNA. Nebo jetì lépe pøedstavte si, e víte, e vae DNA obsahuje sekvence podmiòující bolest jetì pøed tím, ne se projeví. Podobný scénáø se jistì neodehraje v nejbliích pìti èi deseti letech, ale jestli se sen vývojových pracovníkù biotechnologické firmy 454 Life Sciences splní, budou lékaøi v budoucnosti schopni rychle a levnì odhalit tajemství genù a genomù pacientù, odhalit indikátory náchylnosti k nìkterým onemocnìním a urèit potenciální úèinnost rùzných lékových reimù. Díky pokrokùm v sekvenaèních technologiích se tato vize postupnì mùe stát realitou, co by zcela jistì pøineslo revoluci nejenom pøi návtìvì u lékaøe, ale také v náhledu spoleènosti na lidské zdraví a onemocnìní. V genetice a biochemii se sekvenováním rozumí urèení primární struktury (nebo primární sekvence) nerozvìtveného biopolymeru. Výsledkem sekvenování je tedy lineární symbolický popis struktury sekvenované molekuly. Sekvenovat mùeme obecnì nukleové kyseliny (DNA, RNA), proteiny a pøípadnì i polysacharidy (i kdy zde se vìtinou nemluví o sekvenování právì proto, e jsou èasto rozvìtvené). Nejèastìji se termín sekvenování pouívá v souvislosti s urèením primární struktury DNA, tedy urèením posloupnosti nukleotidù daného DNA fragmentu. Sekvence DNA obsahuje pro ivé organismy nezbytné informace pro pøeití a reprodukci. Vzhledem ke klíèové úloze DNA pro ivé organismy mùe být znalost DNA sekvence uiteèná prakticky pøi jakémkoliv biologickém výzkumu. Urèení sekven-
ce je tedy uiteèné pro základní výzkum (jak organismy ijí a fungují), ale také pro aplikaèní oblasti a pochopitelnì pak i v medicínské oblasti. Pokud má nìjaká choroba genetický základ, pak je její konkrétní pøíèinou zmìna normální (zdravé) formy genu v nesprávnou nebo chorobnou formu. Základem této zmìny je právì konkrétní zmìna sekvence DNA. Podaøí-li se takovou zmìnu po srovnání sekvencí zdravých a nemocných jedincù identifikovat, mùe poslouit k vývoji diagnostického postupu. Znalost zmìny sekvence, která je pøíèinou choroby, také otevírá cestu k budoucí cílené léèbì genovou terapií (tj. náhradou funkce chorobné alely zdravou alelou). První sekvenaèní technologie pouitelná pro rozsáhlejí sekvenování byla technika vyvinutá Frederickem Sangerem v roce 1977. V roce 1980 byla tato práce ohodnocená Nobelovu cenou za chemii (spolu s Walterem Gilbertem a Paulem Bergem). Tato metoda pouívá modifikované nukleotidy (dideoxynukleotid trifosfáty) pro sekvenènì specifickou terminaci DNA polymeraèní reakce. Metoda byla postupnì zdokonalovaná a zejména tøi vylepení pùvodního postupu pøispìly k jejímu velkému rozíøení - pouití fluorescenèních znaèek místo pùvodních radioaktivních znaèek pro detekci syntetizovaných úsekù DNA, pouití kapilární elektroforézy místo plochých gelù a nakonec tzv. paired-end sekvenování umoòující uspoøádat poskládané úseky do vzájemnì orientovaných celkù. Rùzné varianty Sangerovy metody tak pøispìly do roku 2005 k osekvenování prakticky vech do té doby sekvenovaných genù a genomù. Sangerova technika má ale nìkterá omezení. Zejména projekty
velkého rozsahu, jako napøíklad sekvenování celých genomù jednotlivých organismù, vyadují velmi pracnou pøípravu knihovny genomových fragmentù v bakteriálních plasmidech, které jsou potom sekvenovány a skládány do vìtích úsekù. Sangerova metoda se pøesto pouila i pøi tak rozsáhlých projektech, jako bylo sekvenování lidského genomu (Human Genome Project, HGP). Byla zlatým standardem po desetiletí. Po celou tuto dobu kralování Sangerovy metody se zvýení sekvenaèní kapacity dosahovalo v zásadì jenom zvìtováním poètu sekvenaèních reakcí, pouíváním stále vìtího poètu kapilár v jednom pøístroji. Drahá a na práci nároèná pøíprava vzorku pro Sangerovo sekvenování èiní tento postup ménì vhodný i pro rutinní klinické úèely, kde se vyaduje levné, rychlé a pøesné sekvenování. Zkouela se øada nových pøístupù sekvenování hybridizací, pøímé zobrazení DNA sekvence pomocí speciální mikroskopie (atomic force microscopy), hmotnostní spektrometrie, aplikace mikrofluidních èipù atd. ádná metoda se neukázala jako prakticky pouitelná a tak se øada spoleèností a výzkumných týmù snaila najít nìco nového. V roce 1998 Mostafa Ronaghi na univerzitì ve Standordu pøiel na novou technologii, nazvanou pyrosekvenování. Tuto metodu nakonec adaptovala pro své úèely firma 454 Life Sciences. Spoleènost 454 Life Sciences byla zaloena v roce 2000 právì s cílem pøevést do reality sekvenování genomù jednotlivcù a od okamiku svého zaloení je stále na èele pelotonu v závodì o personalizovanou medicínu. Zakladatel 454 Life Sciences, Dr. Jonathan Rothberg, se musel vypoøádat s onemocnìním v rodinì. Jeho novì narozený syn byl nemocný Labor Aktuell 03/09
27
a nakonec na sekvence DNA. V roce 2005 publikoval 454 Life Sciences genom Mycoplasma genitalium, prvního organismu sekvenovaného touto technologií.
Sekvenaèní reakce v pøístroji Genome Sequencer System FLX
a kdy Dr. Rothberg èekal na nové zprávy od lékaøù, uvaoval o monosti pøesnì urèit synùv stav pøeètením jeho genomu. Tak zaèalo jeho taení, jeho cílem bylo poskytnout rychlé a dostupné sekvenování genomu. Roche Diagnostics zaèal velmi záhy s firmou 454 Life Sciences úzce spolupracovat a v bøeznu 2007 po dohodì firmu 454 Life Sciences koupil. Pyrosekvenováním se oznaèuje série enzymatických reakcí, bìhem kterých se zaznamenává zaèlenìní DNA báze do syntetizovaného øetìzce díky uvolnìnému viditelnému záøení. Struènì - DNA templát je inkubován s nìkolika enzymy, vèetnì DNA polymerázy a ATP sulfurylázy. Inkorporace kteréhokoliv ze ètyø deoxynukleotid trifosfátù (dNTP) do komplementárního øetìzce k templátové (sekvenované) DNA vede k uvolnìní pyrofosfátu, slouèeniny, která je dále pøevedená na ATP pomocí ATP sulfurylázy. ATP pak slouí v reakci spøaené s enzymem luciferázou k uvolnìní protonu a ke vzniku svìtelného signálu. Svìtlo uvolnìné pøi zabudování nového nukleotidu se zaznamenává (zpravidla CCD èipem) a tento cyklus se pøi prodluování øetìzce komplementárního k sekvenované jednoøetìzcové DNA opakuje. 454 sekvenování posouvá technologii pyrosekvenování díky masivní paralelizaci tìchto reakcí (soubìnì probíhají stovky tisíc a více ne milión sekvenaèních reakcí) o krok dále a umoòuje sekvenování 28
Labor Aktuell 03/09
tøeba i celých genomù. Jak tedy celý proces 454 sekvenování vypadá? Genomová DNA je nejdøíve mechanicky fragmentovaná na kratí úseky. K tìm jsou potom pøipojeny specifické adaptorové molekuly, které se pouívají jako templát pro primery v bìné polymerázové øetìzové reakci (PCR) a pro sekvenaèní primery. PCR reakce probíhá na syntetických kulièkách v olejové emulzi - jedna molekula sekvenované jednoøetìzcové DNA, která je typicky pøihybridizovaná ke kulièce, je tzv. emulzní PCR reakcí namnoena, take na konci PCR reakce je k DNA kulièce pøichyceno v prùmìru 10 miliónù identických kopií pùvodní jednoøetìzcové DNA. Dále jsou tyto kulièky vpraveny do jamek speciální optické destièky, tzv. pikotitraèní destièky (PTP), spoleènì s dalími kulièkami, na které jsou pøichycené enzymy nezbytné pro pyrosekvenaèní reakci. Pikotitraèní destièka obsahuje na ploe 6x6 cm a 3 200 000 jamek. Vechny tyto kroky nahrazují pracné klonování jednotlivých DNA molekul nezbytné pøi klasickém sekvenování. Výhodou je i to, e se eliminují moné chyby vzniklé klonováním, kdy se v baktériích nìkteré fragmenty replikují výraznì lépe ne jiné. Naplnìná pikotitraèní destièka se potom vloí do pøístroje, který øídí prùtoky deoxynukleotidù nad jejím povrchem. Pøitom dochází v kadé jamce k prodluování øetìzce komplementárního k templátové DNA, k tvorbì ATP a následnì k produkci svìtla. Øídící poèítaè zaznamenává tyto svìtelné signály kadé jamky a zpracovává tento primární signál na tzv. flowgramy
V souèasné dobì pøístroj Genome Sequencer FLX dokáe v jednom sekvenaèním bìhu za 10 hodin získat sekvence cca 400 - 600 miliónù bází. Délka jednotlivých sekvenovaných úsekù je cca 500 bází (modální hodnota). Délkou ètení DNA sekvence pomocí Genome Sequencer (GS-FLX) se zcela zásadnì odliuje od ostatních tzv. next-generation sequencing pøístrojù, kde délka ètení nepøekraèuje reálnì 50 - 75 bází. Pøedpokládá se, e v prùbìhu pøítího roku se délka sekvenovaných úsekù zvýí a na 1000 bází, èím se pøekoná i prùmìrná délka ètení pøi klasickém Sangerovì sekvenování. Jeden sekvenaèní bìh pak osekvenuje asi 1 miliardu bází. Délka ètených úsekù je velmi dùleitá, protoe zcela zásadnì ovlivòuje praktickou pouitelnost sekvenaèních pøístrojù pro øadu sekvenaèních aplikací. Kombinace dlouhých sekvenovaných úsekù a obrovského poètu osekvenovaných bazí v jednom bìhu dovoluje uivatelùm pøístroje GS-FLX sekvenovat dnes u jakékoliv vzorky, take umoòuje napøíklad: l celogenomové de novo sekvenování a BAC sekvenování: Pøi de novo sekvenování se doposud neznámý genom (není k dispozici referenèní sekvence) nebo èást genomu sekvenuje a skládá do vìtích souvislých oblastí. V urèitých pøípadech se de novo pøístup pouívá i tehdy, kdy k dispozici referenèní sekvence je, protoe se tak dají získat lepí výsledky. Pøi tradièním Sangerovì sekvenování se vìtina sekvenaèních projektù nemohla uskuteènit díky finanèní a technické nároènosti tìchto projektù. Pouze velká sekvenaèní centra provádìla sekvenování vybraných (zpravidla modelových) organismù. S pøístrojem Genome Sequencer FLX mùou i malé laboratoøe sekvenovat v podstatì jakékoliv organismy. GS-FLX umoòuje sekvenování genomù nejrùznìjích organismù, napøíklad baktérií, kvasinek, hub a virù a dále tøeba umìlých bakteriálních chromozómù (BAC) a fosmidù apod. De novo sekvenování genomu E. coli o velikosti 4,6 Mb se mùe
Jeden fragment - jedna DNA kulièka - jedno ètení
Pøíprava vzorku Vzorky jako genomová DNA nebo BAC knihovny jsou fragmentovány na mení fragmenty o délce cca 500 - 800 bp. Pøi sekvenování kratích vzorkù, jako napø. malých nekódujících RNA nebo PCR produktù (amplifikovaných pomocí tzv. fùzních primerù) není fragmentace nutná - mùou se pouít pro imobilizaci na DNA kulièky pøímo, jak je vidìt na obrázku jeden fragment - jedna kulièka.
Pøíprava knihovny S vyuitím bìných molekulárnì biologických technik se ke kadému fragmentu DNA pøidají krátké adaptory (A a B) specifické jak pro 3' tak pro 5' konec. Tyto adaptory se vyuívají v dalím postupu pøi purifikaèních a amplifikaèních krocích a pøi vlastní sekvenaci. Knihovnou (se kterou se pracuje dále) se rozumí jednoøetìzcové fragmenty sekvenované DNA s A a B adaptory na obou koncích.
Jeden fragment - jedna DNA kulièka Jednoøetìzcová DNA knihovna se hybridizací pøichytí ke speciálnì navrené DNA kulièce. Hybridizaèní podmínky se nastaví tak, aby se podpoøilo navázání jednoho jednoøetìzcového fragmentu na jednu DNA kulièku.
emPCR (emulzní PCR) Kadý jednotlivý fragment knihovny pøichycený na DNA kulièku je amplifikován v oddìleném mikroreaktoru, vytvoøeném v olejové emulzi. Mikroreaktory obsahují nezbytné sloky pro normální PCR reakci. Po skonèení emPCR reakce je ke kulièce pøihybridizováno v prùmìru 10 miliónù identických kopií pùvodní jednoøetìzcové DNA, které zùstanou pøichycené k DNA kulièce i po jejím uvolnìní z olejové emulze.
Jedna DNA kulièka - jedno ètení DNA kulièky jsou pak vpraveny do jamek speciální optické destièky, tzv. pikotitraèní destièky (PTP). Do jedné jamky PTP se vejde vdy jen jedna DNA kulièka. Pouívají se i dalí kulièky, na které jsou pøichycené enzymy nezbytné pro pyrosekvenaèní reakci. Pøi vlastním sekvenování proudí nad otevøenou stranou PTP jamek jednotlivé nukleotidy v pevném poøadí. Pøidání nukleotidu (nukleotidù) komplementárního sekvenovanému fragmentu dá vzniknout chemiluminiscenènímu signálu, který zaznamenává CCD kamera pøístroje.
Analýza dat Kombinace intenzity signálu a pozice na PTP destièce umoní softwaru urèit paralelnì sekvenci více ne 1 000 000 individuálních fragmentù (ètení) bìhem asi 10ti hodinového bìhu.
Labor Aktuell 03/09
29
provést v jednom sekvenaèním bìhu pøístroje (a to a ètyøi rùzné vzorky, napøíklad kmeny v jednom bìhu) a jeden èlovìk zvládne ve za nìkolik dní. S pouitím externích softwarových nástrojù pro analýzu dat je pak moné de novo sekvenovat i sloitìjí organismy (rostliny, ivoèichy). Jako poslední byl pouze pøístrojem GSFLX (tedy bez pomoci klasického Sangerova sekvenování) napøíklad sekvenován genom olejové palmy. De novo sekvenování vyuívá dvou základních metod - shot gun sekvenování, tedy sekvenování náhodnì fragmentovaných úsekù genomové DNA a tzv. paired-end (párového) sekvenování, tedy ètení úsekù pùvodnì od sebe vzdálených 3 kb, 8 kb nebo 20 kb (nebo jejich kombinací) - viz vloená informace. Resekvenování: Pøi resekvenování je èást genomu nebo kompletní genom porovnán s existující obdobnou ji známou sekvencí. Cílem je zjistit rozdíly nové sekvence oproti referenèní sekvenci. Resekvenují se stejné organismy jako pøi de novo sekvenování, tedy rostliny, ivoèichové, baktérie, kvasinky, houby, viry atd. Pøístrojem byl resekvenován napø. kompletní genom dr. Jamese Watsona. Pomocí resekvenování (pøípadnì tzv. ultra hlubokého resekvenování PCR amplikonù) se dají zkoumat a detekovat genomické pøestavby, oblasti spojené s výskytem nìkterých chorob (detekce SNP, delecí a inzercí), detekovat nové SNP, detekovat øídce se vyskytující somatické mutace, tedy zmìny, které mohou hrát klíèovou roli v onkologických onemocnìních.
Systém GS-FLX umoòuje také stanovení sekvence obou protilehlých koncù fragmentù DNA (tzv. párové ètení) vzdálených od sebe ve zkoumaném genomu pùvodnì cca 3000 bází, 8000 bází nebo 20 000 bází, pøièem prùmìrná délka kadého èteného fragmentu je asi 150 bází. Tato metoda nevyaduje ádné klonování a celková doba pro získání výsledkù je pøitom kratí ne 4 dny. Metoda je vyuitelná nejenom pro orientaci a zjitìní relativní pozice tzv. kontigù získaných pøi de novo shot gun sekvenování, ale také pro identifikaci strukturálních variací a jim pøísluejících zlomù. Strukturálními variacemi genomu zde rozumíme velké delece, duplikace, inzerce, inverze a komplexní kombinace pøestaveb, které jsou hojné v napø. v lidském genomu a o kterých se pøedpokládá, e jsou zodpovìdné za znaèné mnoství fenotypových variací.
l
Analýza transkriptomù: S pøístrojem GS-FLX je moná komplexní sekvenaèní analýza transkriptomù. Velká délka sekvenovaných úsekù umoòuje pouití øady metod, zejména pak analýzu cDNA plné délky, dùleitou napøíklad pro detekci zatím neznámých sestøihových variant.
l
Analýza regulace genù: Pøístroj se hojnì vyuívá napøíklad k identifikaci nekódujících malých RNA (snc RNA), identifikaci vazebných míst pro transkripèní faktory (CHIP-Sequencing) atp.
l
Analýza epigenetických zmìn: analýza zmìn DNA metylací, analýza modifikací nukleozómù atp.
l
30
Labor Aktuell 03/09
Metagenomika a bakteriální diverzita: velmi se roziøující oblast, kde se s úspìchem pouívá právì pøístroj GS-FLX, který umoòuje díky dlouhé délce ètených úsekù jednoznaènì pøiøadit sekvenované fragmenty DNA jednotlivým (mikro) organizmùm. Cílem metagenomických studií je vìtinou analýza mikrobiálních genomù z rùzných vzorkù pro zjitìní mikrobiální pestrosti, mnoství a rozíøení mikroorganismù.
l
Paleogenomika: sekvenování DNA z vymøelých organismù. Úspìnì byl sekvenován genom mamuta, neandrtálce a dalích organizmù.
l
K dnenímu datu (srpen 2009) byl pøístroj GS-FLX vyuit pøi pøípravì asi 500 tzv. peer review prací v renomovaných èasopisech. To svìdèí asi nejlépe o tom, e jde o vyzrálý a spolehlivý systém, který poskytuje kvalitní výsledky.
Pøíkladù pouití je mnoho, staèí si v pøísluných databázích (nebo na firemních webových stránkách) zadat do vyhledavaèe napøíklad heslo 454. Uveïme alespoò jeden zajímavý pøíklad metagenomické studie, která byla publikována v èasopise Nature. Autoøi v ní zjiovali vzájemný vztah mezi støevní mikroflórou a obezitou (An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Turnbaugh1, P. J., et al., Nature, 2006 Dec 21; 444(7122):1027-31). Lidský metagenom se skládá z genù Homo sapiens a genù triliónù mikrobù, které osídlily nae tìla. Pøedpokládá se, e mikrobiální geny pøevyují ty lidské co do poètu o nìkolik øádù. Ná mikrobiální genom (mikrobiom) má zakódované metabolické schopnosti, které jsme si sami nevyvinuli, napøíklad rozklad jinak nestravitelných èástí naí potravy. Obdobná situace je i u myí.
Porovnáním støevní mikroflory obézních myí a jejich tíhlých protìjkù (a také lidských dobrovolníkù) se zjistilo, e obezitu doprovází zmìna relativní èetnosti dvou dominantních kmenù, Bacterioides a Firmicutes. Mikrobiom obézních myí má zvýenou schopnost vyuít energii z potravy. Zajímavé je i to, e tato vlastnost je pøenositelná - pøi osídlení bezmikrobních myí obézním mikrobiomem dolo k výraznému nárùstu celkového tìlního tuku ne pøi osídlení pùvodnì bezmikrobních myí mikrobiomem tíhlých myí. První pøeètení (tedy osekvenování) úplné genetické informace èlovìka stálo øádovì stovky milionù dolarù. Pøedpokládá se, e kdy cena za sekvenaci jednoho lidského genomu klesne pod 1000 dolarù, zaène se sekvenování postupnì rutinnì pouívat pro medicínské úèely. Pokrok v metodách masivního paralelního sekvenování ji dnes pøibliuje mylenku osekvenování lidského genomu za 1000 dolarù realitì. V souèasné dobì klinické sekvenování znamená sekvenování v malém rozsahu zamìøené na analýzu jednotlivých genù/ mutací. Next-generation sekvenování se pouívá v medicínì pøedevím pro výzkumné úèely - buï pro rychlé celogenomové sekvenování, nebo pro resekvenování urèitých zájmových oblastí. Zatím se neobjevují hlasy poadující celogenomové sekvenování pro diagnostické úèely. Výhledovì je ale jisté rozsáhlé sekvenování genù biochemických drah úèastnících se vzniku a vývoje onemocnìní (zejména u komplexních chorob). Je také moné pøedstavit si napøíklad rozsáhlé sekvenování stovek genù, majících vliv na metabolismus lékù, jako cestu k next
generation farmakogenetickému testování. Je moné spekulovat, e budeme pøed skuteènì celogenomovým sekvenováním sekvenovat stovky genù úèastnících se komplexních/multifaktoriálních onemocnìní, jako je hypertenze, ateroskleróza a dalí. V jetì vzdálenìjí budoucnosti je moné pøedpokládat, e lékaøské vyuití znalostí získaných celogenomovým sekvenováním pøeváí stávající cenu sekvenaèního procesu a e se tato metoda zaène rutinnì pouívat pro diagnostické úèely. V souèasné dobì ale schopnost interpretovat získaná data je daleko vìtí pøekákou klinickému vyuití next generation sekvenování, ne monost získat nìco pøes tøi miliardy bází lidského genomu. Malý pøíklad. Nìkolik velkých genù s nejrùznìjími mutacemi u jednotlivých pacientù bylo rozsáhle sekvenováno na úrovni genù. Nejvíce zøejmì geny BRCA1/BRCA2 a gen pro cystickou fibrózu. Tato úroveò sekvenování má opodstatnìní zejména u genù BRCA, protoe dìdièné onkologické onemocnìní prsu/ vajeèníkù je dominantnì dìdìné a kdy se nepodaøí detekovat by i jen jednu jedinou vzácnou mutaci u eny s rizikem vzniku choroby, mohla by se podcenit nezbytnost preventivních opatøení s pøíslunými vánými dopady. Zdá se ale, e se v genech BRCA1/BRCA2 vyskytuje témìø nekoneèná øada mutací, z nich nìkteré jsou tak vzácné, e se vyskytují jen v jedné rodinì. V jedné referenèní laboratoøi (konkrétnì Myriad Genetics) byly oba geny sekvenovány u více jak 150 000 jedincù. V souèasnosti je identifikováno více ne 10 000 jednak zhoubných mutací a dále nekodných mutací nebo mutací s nezná-
mým klinickým dopadem. Pøesto jsou stále kadý týden u 1 % a 2 % nyní testovaných pacientek nalézány nové (zpravidla nekodné) mutace, u kterých musí být ale peèlivì analyzován jejich klinický dopad. Tento malý pøíklad je dobré mít na pamìti pøed úvahami o klinickém sekvenování mnoha a mnoha genù nebo dokonce celého genomu. Mùeme oèekávat nalezení tisícù a tisícù, moná miliónù nových variant jak u nemocných pacientù, tak u zdravých lidí. To nutnì povede k urèité nejistotì pøi vyhodnocování výsledkù. V této souvislosti se dokonce vyskytl nový termín, analog genomu, transkriptomu. Je to výraz incidentalome, v této souvislosti pro oznaèení vech náhodných variací genomu. V souèasné dobì bìí nìkolik projektù, které se snaí rozíøit znalost o variabilitì mezi jednotlivci. Známý je napøíklad projekt 1000 genomù. Tyto projekty urèitì pøispìjí k pøedbìné identifikaci nekodných variant, ale dalí úsilí pro pøesnou identifikaci tìch, které jsou dùleité pro zdraví pacientù, bude nezbytné. Více podrobností o pøístroji, o principech a technologiích, které vyuívá, mùete najít na webových stránkách http://www.454.com. Zde také najdete seznam prací, které vznikly díky tomuto pøístroji vdy spoleènì s odkazy na databázi PubMed, kde lze v øadì pøípadù získat kopií dané publikace jako pdf soubor. Je moné pouít pro vyhledávání i klíèová slova, take si mùete snadno ovìøit, jestli tøeba ve vaem oboru u nìkdo pøístroj GS-FLX vyuil. V pøípadì, e budete chtít dalí informace - obrate se na nás, rádi vám je poskytneme. Pite, prosím, na e-mailovou adresu:
[email protected].
Labor Aktuell 03/09
31