Mikrobiologie ve vinařství Diplomová práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin

Mikrobiologie ve vinařství Diplomová práce

Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D,

Vypracoval: Bc. Tomáš Marvánek

Brno 2014

ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE

Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci: Mikrobiologie ve vinařství vypracoval/a samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb.,o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše.

V Brně dne: 30.4.2014

…………………………………………………….. podpis

PODĚKOVÁNÍ Tímto způsobem bych rád poděkoval vedoucímu mé diplomové práce panu Ing. Liborovi Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení, literaturu k tématu, poskytnuté konzultace a cenné připomínky, díky kterým jsem diplomovou práci dokončil. Díky patří i mým rodičům, kteří mi poskytli zázemí pro studium na Mendelově univerzitě.

ABSTRAKT Diplomová práce se zabývá sledováním počtu vybraných skupin mikroorganismů, které se vyskytují na bobulích hroznů a v technologii výroby vína. V teoretické části jsou popsány jednotlivé kroky výroby vína a významné skupiny mikroorganismů uplatňující se během celé vinifikace. Dále pojednává o vadách vína způsobených činností nežádoucí mikroflόry a prevenci. Praktická část se věnuje vyhodnocení výsledků získaných během analýz tří odrůd - Pálava, Veltlínské zelené a Rulandské modré. Stanovován byl celkový počet mikroorganismů, bakterie mléčného kvašení, kvasinky a plísně. KLÍČOVÁ SLOVA Víno, výroba vína, mikroflóra vína, alkoholové kvašení

ABSTRACT The goal of this master thesis is to track the number of selected microorganism groups which tend to appear in grape berries and along the whole process of winemaking. In the theoretical part, specific phases of winemaking are described as well as some significant groups of microorganisms that take part in the vinification proces. This part also deals with the wine defects caused by undesirable microflora activity and further it explains how to avoid this situation, using an adequate sanitation in the wine cellars. The practical part is dedicated to the evaluation of the results obtained during the analysis of three wine varieties - Pálava, Veltlínské zelené and Rulandské modré. The analysis determine the total number of microorganisms, lactic acid bacteria, yeasts and molds. KEYWORDS Wine, winemaking, microflora of wine, alcoholic fermentation

OBSAH 1

ÚVOD .................................................................................................... 9

2

CÍL PRÁCE .......................................................................................... 10

3

TEORETICKÁ ČÁST.......................................................................... 11 3.1

Technologie výroby vína.................................................................................. 11

3.1.1

Sklizeň hroznů .......................................................................................... 11

3.1.2

Mlýnkování a odzrňování hroznů ............................................................ 11

3.1.3

Nakvášení rmutu ....................................................................................... 12

3.1.4

Lisování .................................................................................................... 12

3.1.5

Odkalování moštu ..................................................................................... 13

3.1.6

Docukření moštu ....................................................................................... 14

3.1.7

Odkyselování moštu ................................................................................. 14

3.1.8

Zasíření moštu........................................................................................... 14

3.1.9

Alkoholové kvašení moštu........................................................................ 15

3.1.9.1

Spontánní kvašení .............................................................................. 16

3.1.9.2

Kvašení za použití čistých kulturních kvasinek ................................ 16

3.1.10

Jablečno - mléčná fermentace ................................................................... 17

3.1.11

Stáčení vína ............................................................................................... 18

3.1.12

Čiření ........................................................................................................ 18

3.1.13

Filtrace ...................................................................................................... 19

3.1.14

Zrání a scelování vín ................................................................................. 20

3.1.15

Lahvování ................................................................................................. 21

3.1.16

Hygiena a čistota ve vinařské praxi .......................................................... 21

3.2

Mikroflόra vína ................................................................................................ 22

3.2.1

Bakterie ..................................................................................................... 22

3.2.1.1

Bakterie octového kvašení ................................................................. 22

3.2.1.2

Bakterie mléčného kvašení ................................................................ 22

3.2.2

Kvasinky ................................................................................................... 27

3.2.2.1 3.2.3

Plísně ......................................................................................................... 30

3.2.3.1 3.3

4

Významné rody kvasinek .................................................................. 28

Významné rody plísní........................................................................ 30

Mikrobiologické vady vína .............................................................................. 32

3.3.1

Křísovatění vína ........................................................................................ 32

3.3.2

Vláčkovatění vína ..................................................................................... 32

3.3.3

Octovatění vína ......................................................................................... 32

3.3.4

Mléčné a manitové kvašení....................................................................... 33

3.3.5

Zvrhnutí vína............................................................................................. 33

3.3.6

Pach po myšině ......................................................................................... 33

3.3.7

Pachuť po plísni ........................................................................................ 34

3.3.8

Pelargoniová vůně..................................................................................... 34

3.3.9

Pach po koňském potu .............................................................................. 34

MATERIÁL A METODIKA ............................................................... 35 4.1

Charakteristika analyzovaných odrůd .............................................................. 35

4.1.1

Pálava ........................................................................................................ 35

4.1.2

Veltlínské zelené ....................................................................................... 35

4.1.3

Rulandské modré (rosé) ............................................................................ 36

4.2

Technologie výroby vín ................................................................................... 36

4.2.1

Pálava ........................................................................................................ 36

4.2.2

Veltlínské zelené ....................................................................................... 37

4.2.3

Rulandské modré (rosé) ............................................................................ 38

4.3

Použité druhy kvasinek (ASVK) ...................................................................... 38

4.4

Odběr vzorků .................................................................................................... 39

4.5

Zpracování vzorků ........................................................................................... 40

4.5.1

Kultivace ................................................................................................... 40

4.5.2

Použité živné půdy .................................................................................... 41

4.5.3

Mikroflόra bobulí ...................................................................................... 42

4.5.4

Očkování moštu a vína ............................................................................. 42

4.5.5

Vyhodnocení výsledků ............................................................................. 43

5

VÝSLEDKY A DISKUZE .................................................................. 44

6

ZÁVĚR ................................................................................................. 51

7

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY.................................................. 52

8

SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ ................................................. 57 8.1

Seznam tabulek ................................................................................................ 57

8.2

Seznam obrázků ............................................................................................... 57

1 ÚVOD O výrobě vína by se dalo říci, že je stará jak lidstvo samo. Původ tohoto oblíbeného moku bychom hledali v Mezopotámii, starém Egyptě, Řecku a Římě. Jako důkazy o zpracování hroznů slouží nálezy pozůstatků lisů a starověké amfory, které již tehdy byly vysířovány před plněním vínem. Díky římským výbojům se réva vinná rozšiřovala po celé Evropě, a tak se dostala i na jižní Moravu do oblasti Velkých Pavlovic. Největšího rozmachu však zaznamenalo vinohradnictví až za vlády Karla IV., který z Francie nechal dovést Rulandské modré, aby rozšířil výběr pěstovaných odrůd v Čechách. Abychom vyrobili kvalitní víno, musíme mít zdravé a vyzrálé hrozny. Mnozí vinaři přikládají dokonce větší význam kvalitě a zralosti hroznů než samotné technologii jejich zpracování. Na procesu utváření vína se nejvíce podílejí kvasinky. Mezi nejtypičtějšího a nejznámějšího zástupce můžeme zařadit kvasinku druhu Saccharomyces cerevisiae. Tato kvasinka metabolizuje cukr hroznů na etanol a oxid uhličitý. Kromě těchto hlavních

produktů

vytváří

i

senzoricky

zajímavější

látky

udělující

vínům

charakteristickou odrůdovost. Po prokvašení se musí víno pročistit, stabilizovat, a pokud je to žádoucí, tak nechat zrát, aby se ve víně dotvořily jedinečné aromatické látky podílející se na chuti a vůni. Konzumace vína dnes už není prosté oslavování úspěšného tažení jako za dob římských legií, ale stává se mόdním trendem ve společenských „rituálech“ moderní komplexní společnosti.

9

2 CÍL PRÁCE a) Zpracovat literární rešerši, v niž budou shrnuty poznatky o výrobě a mikrobiologii vína. b) Zaměřit se na mikroorganismy, které mohou kontaminovat víno. c) Charakterizovat mikroorganismy negativně ovlivňující kvalitu vína. d) Charakterizovat opatření v boji proti nežádoucím mikroorganismům při výrobě vína. e) Ve vybraných vzorcích vína stanovit mikrobiální kontaminaci. f) Získaná data zpracovat, vyhodnotit, porovnat s údaji v literatuře a výsledky shrnout v závěru práce.

10

3 TEORETICKÁ ČÁST 3.1 Technologie výroby vína 3.1.1

Sklizeň hroznů

Rozhodnutí, pomineme-li rozmary počasí, kdy a jak sklízet hrozny, se zdá být pohledem laika jednoduché, ale opak je pravdou. Než začne vinař se sklizní, musí se rozhodnout, jaké víno chce vyrobit a jakou technologii při dané výrobě uplatní. Klíčovou podmínkou sklizně je zralost. V tradičních vinařských oblastech se vinohradníci spíše obávají nedostatečné vyzrálosti než přezrálosti hroznů. Příliš brzký sběr může vést ke kyselým bílým vínům a hubeným, tříslovitým červeným. Dnes se hrozny sklízejí ve zralejším stádiu, ale někdy nejde docílit ideálního okamžiku vlivem nepříznivého počasí či začínající hniloby. Hrozny se sklízejí převážně ručně a jen zřídka strojově. Metoda využití strojní techniky je charakteristická pro Austrálii a to hlavně během noci. Mechanizovaná sklizeň je dokonce zakázaná v oblasti Champagne. (Simon, 2002) 3.1.2

Mlýnkování a odzrňování hroznů

Přivezené hrozny z vinohradu by měly být zpracovány týž den, nejpozději do 24 hodin. Hrozny z mechanizovaného sběru zpracováváme ihned po převzetí, nejpozději do 12 hodin po sklizni. Před lisováním, pro snadnější uvolňování šťávy z bobulí, je třeba hrozny rozemlít tak, aby byly odděleny třapiny od bobulí a ty narušeny, čímž vzniká rmut. Nesmějí být při tom porušena semena a rozmačkány třapiny, z nichž by do rmutu přešla nežádoucí šťáva obsahující chlorofyl a třísloviny. Obě složky zhoršují kvalitu budoucího vína, které by výslednému moku daly drsnou a dřevitotravnatou chuť. Pro tuto manipulaci se používá celá řada mlýnků a odzrňovačů mnoha typů a výkonů. Některé stroje mají i čerpadla na dopravu rmutu do scezovacích a kvasných nádrží a lisů. Rmut je nutno zasířit disiřičitanem draselným 10-20 g.hl-1. (Hubáček, 1997) Po odzrňování mohou být do vzniklého rmutu přidávány různé pektolytické enzymy (pektinasy), které usnadňují lisování, zvyšují výtěžnost rmutu, lépe uvolňují barviva ze

11

slupek a zlepšují filtrovatelnost vína. Tyto enzymy jsou získávány z různých druhů ušlechtilých plísní (Aspergillus, Rhizopus a Trichoderma). (Ribéreau-gayon et al., 2003) 3.1.3

Nakvášení rmutu

Nakvášení rmutu se provádí převážně u výroby červených a růžových vín. Pro bílá vína není typické a provádí se u aromatických, muškátových a kořeněných odrůd. Určit přesnou délku nakvášení není lehkou záležitostí, následkem dlouhého nakvášení mohou vznikat příliš tmavé tóny vína nebo vyluhování velkého množství tříslovin, které zapříčiňují neharmoničnost vína. Při teplém počasí nakvašujeme 6 hodin, při chladném 15-20 hodin a při velmi chladném i déle, aby se uvolnilo co nejvíce barevných a aromatických látek ze slupek a peciček hroznů. Efekt vyluhování těchto látek se zvyšuje tvořícím se etanolem. Nakvášení rmutu s nízkým obsahem kyselin může vést k fádním vínům. (Kraus et al., 2004) Vyluhování červených barviv se podporuje pravidelným ponořováním matolinového klobouku do moštu. Klobouk bychom měli ponořovat každé 4 hodiny a tím zabráníme nejen oxidaci, ale i nežádoucímu pomnožení octových bakterií. Dnes se upouští od ručního ponořování a využívá se různých roto - tanků, vinifikátorů a kvasných tanků s míchadly. (Hubáček, 1997) 3.1.4

Lisování

Na základě principu lisování můžeme rozlišit lisy na mechanické, hydraulické a pneumatické a dále také na vertikální (hlavně u malovinařů) a horizontální. (Pavloušek, 2010) Lisováním rmutu se odděluje šťáva od výlisků. Stupeň vylisování závisí na charakteru lisovaného rmutu a lisovacího tlaku. Rychlost lisování závisí od stupně rozdrcení hroznů a typu lisovacího zařízení. (Malík, 1996) Podstata lisování spočívá v tom, že se pracuje pomalu a především s nízkým tlakem, aby měl mošt dostatek času odtéci ze rmutu. Tlak se zvyšuje až na závěr lisování, což má ale za následek vyšší emisi kalů a tříslovin, které jsou nežádoucí převážně u bílých vín. Nízkého podílu tříslovin a kalů dosáhneme lisovacím tlakem pod 0,8 MPa/8 atm, minimálním předcházejícím drcením a krátkou dobou lisování.

12

Výlisnost závisí na odrůdě, ročníku, vyzrálosti a způsobu lisování. V průměru se počítá se 75-80 litry šťávy ze 100 kg hroznů. Při běžném lisování rmutu vznikají tři frakce:  Scezený mošt (40-60 %): odtéká volně z lisu a říká se mu samotok. Obsahuje vyšší podíl kyselin a cukrů, je světlejší a má nižší extrakt oproti ostatním frakcím. Vyrábějí se z něho bílá vína nejvyšší kvality, lehká a šumivá vína.  Lisovaný mošt (40-60 %): získává se užitím tlaku a mísí se se scezeným moštem.  Dolisek (10 %): vyšším tlakem se porušuje slupka bobulí, eventuálně pecičky. Díky tomu obsahuje mošt vyšší podíl tříslovin, barviv a minerálních látek. Obsah kyselin a cukrů je nižší, při získávání kvalitních druhů vín by měla být tato frakce zpracovávána samostatně. (Steidl, Schödl, 2002) 3.1.5

Odkalování moštu

Odkalování je dnes běžným technologickým krokem, kdy se snažíme odstranit mechanické nečistoty (zbytky slupek, třapiny, pecičky i půdní částice) a rezidua různých chemických přípravků používaných při ochraně révy vinné proti chorobám a škůdcům. Tyto rezidua by mohla mít negativní vliv na průběh kvašení, a proto je potřeba tyto látky odstranit. Jednou z možností, jak odkalit mošt, je za využití disiřičitanu draselného, který se přidává do předem vysířených nádob v množství 15-20 g/hl moštu. Další možností odkalení je použití odstředivek, ale to hlavně u velkovýrobců. Odkalení je rychlé, účinné a brání tvorbě nežádoucích vedlejších produktů kvašení. U moštů, kde předpokládáme vysoký výskyt reziduí chemických přípravků (víno z vinohradů silně ošetřených proti plísni), aplikujeme před kvašením bentonit o dávce 100-200 g na 1 hl moštu. (Kraus et al., 2004) Pokud se neprovede odkalení, může dojít v moštu k rychlému prokvašení, ztrátě aroma a vhodným podmínkám ke vzniku sirky (H2S). Ve víně se projeví nečistou chutí, vyšším obsahem tříslovin, vyšší barvou, rychlým stárnutím a horší filtrovatelností. (Steidl, Schödl, 2002)

13

3.1.6

Docukření moštu

Mošty s nízkým obsahem cukru dávají vína alkoholicky slabá, neharmonická, snadno podléhající křísovatění, naoctění a jiným nemocem. V nepříznivých ročnících je proto nutno mošty před kvašením docukřit. Mošt docukřujeme pomocí rafinovaného řepného cukru rozpuštěného v podílu moštu určeného k docukření a nebo zahuštěním moštu (vakuová destilace, reverzní osmóza, vymrazování vody). (Dohnal et al., 1975) Dle zákonu č. 321/2004 Sb., o vinohradnictví a vinařství a o změně některých souvisejících zákonů (zákon o vinohradnictví a vinařství) lze docukřovat jen víno zemské a jakostní. U jakostních vín s přívlastkem je slazení zakázáno. 3.1.7

Odkyselování moštu

Příliš vysoký, ale i příliš nízký obsah kyselin vyvolává ve víně neharmoničnost. Mošt z hroznů, které dozrávaly za nepříznivých meteorologických podmínek, obsahuje zpravidla vyšší obsah kyselin. Nejdůležitější kyseliny v moštu jsou kyselina vinná a jablečná.

Kyselina

jablečná

je

po

prokvašení

odbourávána

v

procesu

jablečno - mléčného kvašení, ale i přesto se může stát, že ve víně zůstane vysoký obsah těchto kyselin. Někteří odborníci zastávají názor, že je výhodnější odkyselit mošt, jíní se domnívají, že je lepší odstranit kyseliny až z hotového vína po skončení biologického odbourávání kyselin. Množství kyselin tedy můžeme snížit pomocí: uhličitanu vápenatého, acidexu, anexů a scelováním vín. (Farkaš, 1980) 3.1.8

Zasíření moštu

Ve vinařství má použití síry značný význam, protože působí jako:  Antiseptické

činidlo

–

potlačuje

nebo

zcela

likviduje

činnost

mikroorganismů v průběhu celého procesu výroby vína. Antiseptický účinek je mnohem silnější vůči bakteriím a divokým kvasinkám, a tím zabráníme jejich nežádoucímu rozvoji. Ušlechtilé kvasinky jsou eliminovány až při vyšších koncentracích oxidu siřičitého.  Antioxidační činidlo – zabraňuje oxidaci vyvázáním kyslíku.  Antienzymatické činidlo – aplikací oxidu siřičitého zabraňuje nebo tlumí činnost některých negativně působících enzymů. (Pavloušek, 2010) Mošt můžeme zasířit pomocí sirných knotů a disiřičitanu draselného, a to v podobě prášku nebo tablet. Zdravé mošty síříme dávkou 3-5 g na hl. Mošty z poškozených, 14

nahnilých nebo namrzlých hroznů síříme většími dávkami, 15-20 g na hl. Oxid siřičitý se ve víně vyskytuje jen v malé míře jako volná síra a spíše se navazuje na různé složky vína.

Během

kvašení

se

váže

na

acetaldehyd,

kyselinu

pyrohroznovou

a 2-oxoglutarovou. Dále také na cukry, barevné a aromatické látky. (Kraus et al., 2004) Maximální celkový obsah SO2 pro vína s přívlastkem:  300 mg/l pro pozdní sběr,  350 mg/l pro výběr z hroznů,  400 mg/l pro výběr z bobulí, z cibéb, ledové víno a slámové víno. (Otáhal, 2010) 3.1.9

Alkoholové kvašení moštu

Jedná se o základní a nejdůležitější biochemický proces při výrobě vína. Hlavní reakcí během kvašení je přeměna cukru na etanol a oxid uhličitý. 1 mol glukosy

→

2 moly etanolu

+

100 g

→

51,11 g

+

2 moly oxidu uhličitého 48,89 g

Kromě těchto dvou hlavních produktů vznikají i četné vedlejší podílející se na konečném buketu. Jedná se o různé glyceriny, estery, aldehydy, kyseliny, aceton, diacetyl, vyšší alkoholy a aromatické látky. Pro zahájení kvasného procesu je potřeba asi 10 milionů buněk v 1 mililitru moštu. (Steidl, Schödl, 2002) Hlavním a zásadním kritériem kvašení je teplota. Čím teplejší bude kvašení, tím více aroma a alkoholu se ztratí, ale tím spolehlivěji kvasinky mošt zcela prokvasí. Optimální teplota pro kvašení je 30 °C. Při překročení této teploty (asi 35-37 °C) může dojít k tzv. „uvaření“ kvasinek - zastavení kvašení. Nízké teploty (pod 15 °C) naopak mohou vést ke špatnému startu kvašení. Mezi další kritéria kvašení můžeme zařadit: koncentraci cukrů, alkoholu, kyseliny siřičité, kyslíku, dusíku, nežádoucích látek (kovy a rezidua aplikovaných postřiků) a obsah kalových částic. (Steidl, Renner, 2004) Samotné kvašení probíhá ve 3 fázích: počátek kvašení, „bouřlivé“ kvašení a dokvášení.

15

Tab. č. 1: Nejčastější druhy kvasinek podílejících se na kvašení. (Steidl, Schödl, 2002) Počátek kvašení

Hlavní kvašení

Závěrečné dokvášení

Kloeckera apiculata

Saccharomyces cerevisiae ssp. cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae ssp. cerevisiae

Metschnikowia pulcherrima

Saccharomyces cerevisiae ssp. uvarum

Saccharomyces cerevisiae ssp. bayanus

Candida stellata

Saccharomyces cerevisiae ssp. bayanus

Kloeckera corticis

Saccharomyces chevalieri

Candida krusei

Torulaspora delbrueckii

Candida vini

Zygosaccharomyces florentinus

Hansenula anomala

Zygosaccharomyces rouxii

Hansenula subpelliculosa

Kluyveromyces thermotolerans

Pichia mermentans Pichia membranaefaciens

3.1.9.1

Spontánní kvašení

Při spontánním kvašení se do moštu nijak nezasahuje. Mělo by probíhat jen v moštech ze zdravých hroznů. Důležité je, aby v moštu bylo dostatečné množství kulturních kvasinek, pokud se hrozny sbíraly v dešti nebo po dešti, je poté spontánní kvašení velmi pomalé a obtížné. Celé kvašení je delší, protože musíme čekat, než se samy kvasinky namnoží na potřebný počet. Podle celkových podmínek (oxid siřičitý, teplota, výchozí počet zárodků, rezidua pesticidů) se může prosadit vždy jiný druh kvasinek, a tím je výsledek ponechán náhodě. Spontánní kvasný proces zahajují vždy apikulátní kvasinky (Kloeckera apiculata). Na začátku je jejich množství až 90 %. Prokvašují mošt až do 5 obj. % alkoholu, poté odumírají. Při koncentraci 3 obj. % etanolu je začínají potlačovat kvasinky rodu Saccharomyces. Divoké kvasinky jsou nejaktivnější na začátku kvašení, kdy tvoří mnoho glycerolu, vyšších alkoholů a těkavých kyselin. Jsou málo tolerantní k alkoholu a pro mnohé z nich je horní hranice koncentrace 4 obj. %. (Farkaš, 1980) 3.1.9.2

Kvašení za použití čistých kulturních kvasinek

Přídavkem sušené čisté kultury kvasinek (ASVK) se od počátku zajistí dostatečný počet buněk, a tím se značně omezí závady v procesu kvašení. Mošt začíná kvasit takřka okamžitě a máme záruku úplného prokvašení. Přídavek čistých kulturních 16

kvasinek se doporučuje při vysoce cukernatých přívlastkových moštech, moštech z nahnilých hroznů a velmi nízkých teplotách kvašení. (Steidl, Renner, 2004) Čisté kulturní kvasinky se aktivují tak, že se ponechají 15-20 minut nabobtnávat ve vlažné směsi moštu a vína v poměru 1:1 o desetinásobném objemu. Poté, co je zřetelně patrné tvoření pěny, nalije se směs s kvasinkami do moštu. Pro lepší růst kvasinek můžeme přidat živiny jako např. amonné soli, přípravky s buněčnými stěnami kvasinek a vitamíny (thiamin). Tyto růstové faktory se přidávají hlavně při výrobě bílých vín z důvodu, že po odzrňování je rmut hned lisován, a proto nedochází k samovolnému vyluhování potřebných živin z výlisků, jako je tomu při výrobě červených vín vlivem macerace. (Hutkins, 2006) Kvasný proces může probíhat v nádobách či nádržích z různých materiálů. U malovinařů se nejčastěji potkáváme s dřevěnými sudy, plastovými nádobami nebo skleněnými demižony. U velkovýrobců jsou to nejčastěji nerezové tanky. (Pavloušek, 2010) 3.1.10

Jablečno - mléčná fermentace

Při jablečno - mléčném kvašení, neboli biologickém odbourávání kyselin (BOK), dochází pomocí bakterií mléčného kvašení k rozkladu kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou a oxid uhličitý. Přednosti (BOK):  Snížení kyseliny jablečné (víno s touto kyselinou chutná jako z nevyzrálých hroznů.  Vytvořením kyseliny mléčné je víno plnější.  Nižší potřeba SO2 (10 až 15 mg/l) v důsledku redukce vedlejších produktů kvašení.  Mikrobiologická stabilita. Nedostatky (BOK):  U tenkých a nevyzrálých vín s vysokým podílem kyseliny jablečné vznikají produkty, které se senzoricky projevují negativně (tón po kyselém zelí).  U málo vybarvených červených vín dochází ke ztrátě barvy. Předpokladem k zahájení BOK je hodnota pH přes 3,1, teplota vína minimálně 18 °C, žádný volný SO2 (maximálně 50 mg/l), zbytkový cukr pod 20 g a živiny uvolněné činností kvasinek. (Steidl, Renner, 2003) 17

Známe asi 25 různých druhů bakterií, které odbourávají kyselinu jablečnou, ale jen dva druhy, které nevytvářejí vedlejší nežádoucí produkty. Prvním z nich je Oenococcus oeni (dříve Leuconostoc oenos), který dobře zvládá alkohol. Druhým je Lactobacillus plantarum, který nesnáší alkohol a musí se aplikovat před kvašením. Pro zabránění BOK je vhodné víno stočit z kvasnic a zasířit. (Steidl, Leindl, 2003) 3.1.11

Stáčení vína

Stáčením rozumíme stažení mladého vína z kvasničných kalů. Kvasinky po prokvašení začínají odumírat a jejich rozkladem vznikají látky s nepříjemnou vůní a chutí. Dochází také ke snižování obsahu kyselin, což by následně mohlo vést k vadám vína díky rozvoji nežádoucích bakterií. (Farkaš, 1980) Na to, kdy poprvé víno stáčet, neexistuje žádný návod a je to zcela individuální dle vývoje vína. Obecně lze říci, že lehká, méně alkoholická a méně kyselá vína stáčíme v polovině října až listopadu (30 až 60 dnů po hlavním kvašení). Na kvasnicích nenecháváme ani dlouho vína s výrazným odrůdovým charakterem, aby nedošlo k jeho překrytí kvasničným aroma. Plná, extraktivní vína s vyšším obsahem kyselin stáčíme až v prosinci. V lednu a únoru stáčíme vína s vysokým obsahem kyselin a vyšším zbytkovým cukrem, které v chladnějších sklepích pozvolna dokvašují. Víno stačíme buďto za přístupu vzduchu (vína málo prokvašená, vláčkovitá a mající sirku) nebo bez přístupu vzduchu (vína náchylná na hnědnutí a aromatická odrůdová vína). Druhé stáčení provádíme o 6-10 týdnů později po prvním stáčení. Mezi oběma stáčeními dochází již ke zrání vína. Intenzivně v něm probíhají oxidačně - redukční reakce, tvoří se buket a víno se čistí. Období mezi stáčeními je vhodné pro různé technologické zásahy do vína (scelování, síření, čiření, stabilizaci a filtraci vína). Tyto kaly spíše než kvasničnou biomasu obsahují vysrážený vinný kámen, minerální látky a vypadnuté bílkoviny. Druhé stáčení probíhá vždy za nepřístupu vzduchu a co nejšetrněji, aby se nepoškodil buket. (Malík, 1996) 3.1.12

Čiření

Jedná se o proces, kdy mladé víno zbavujeme kalových částeček a nestabilních látek. Princip čiření spočívá v opačných elektrických nábojích mezi čiřidlem a čiřenou látkou. (Kraus et al., 1999)

18

Mezi nejčastěji používané čiřící látky můžeme zahrnout: vaječný bílek, tanin, želatinu, bentonit, vyzí klih, kasein, mléko a polyvinylpolypyrrolidon. Jednotlivé čiřicí preparáty mají speciální užití. Např. kladně nabitý vaječný bílek vyčiří záporně nabité látky (třísloviny a antokyany), zatímco záporně nabitý bentonit vyčiří kladně nabité částice (proteinový kal a ostatní organické látky). (Stevenson, 2005) 3.1.13

Filtrace

Filtrací rozumíme odstranění veškerých pevných částí, včetně mikroorganismů z vína pomocí filtrů. Konzumenti dnes požadují čistá a jiskrná vína, proto je v současné době filtrace klasickým technologickým procesem pro stabilizaci vína. Po stáčení a čiření může víno ještě obsahovat dostatek kalových částic. Tyto kaly mají různou velikost. Použitím tedy na první filtraci hned jemných filtrů by vedlo k jejich ucpání, proto se často filtruje nadvakrát nebo víckrát. První filtrací odstraníme hrubější částice a následnou filtrací na jemném filtru víno dočistíme. Materiály na výrobu filtrů jsou estery celulosy, polykarbonáty, polypropyleny, nylony, křemeliny, perlity nebo skleněná vlákna. Jednotlivé materiály se liší velikostí pórů, kde nejmenší průměry začínají na 0,22 µm. (Delfini, Formica, 2001) V dnešní době existuje spousta filtrů pracujících na různém principu:  Síťový princip.  Hloubkový účinek. - Mechanický hloubkový účinek. - Adsorpční hloubkový účinek. Filtrace:  křemelinová,  vložková,  membránová,  kalový filtr,  vakuový rotační filtr. (Steidl, Schödl, 2002) Účinnost filtrace můžeme změřit pomocí turbidimetru, který nám určí hodnotu zakalenosti vína. (Pavloušek, 2010)

19

Tab. č. 2: Vzájemný vztah mezi absolutní čirostí a hodnotami turbidity. (Pavloušek, 2010) Absolutní čistota

Zakalené víno

Bílá vína

méně než 1,1

více než 4,4

Růžová vína

méně než 1,4

více než 5,8

Červená vína

méně než 2,0

více než 8,0

3.1.14

Zrání a scelování vín

Samotný proces zrání začíná již po kvašení. Délka zrání je velice individuální a některá vína se vůbec nehodí, aby zrála. Obecně lze říci, že ke zrání se ukládají vína prémiové kvality nebo vína vyrobená ze samotoku. Během zrání dochází ve víně k mnoha enzymatickým, chemickým a mikrobiologickým reakcím. Vzniká přibližně 400-600 různých těkavých sloučenin jako např. aldehydy, ketony, alkoholy, vyšší mastné kyseliny, estery, laktony, thioly a další. Víno také interaguje se dřevem sudu, ve kterém je skladováno, jeho složkami, se vzdušným kyslíkem a dokonce i korkem, proto je nutné si uvědomit, že během zrání může v určitém okamžiku dojít i ke zhoršení kvality vína. Víno se nejčastěji skladuje a nechává zrát v nerezových tancích, dřevěných sudech, skleněných demižonech, plastových nádobách nebo lahvích. Pro jedinečné aroma se nechávají vína zrát v dřevěných sudech typu barrique. Tyto sudy jsou vyráběny z dubu a jejich vnitřek může být vypálen (toasting). To dodává vínu ještě silnější chuť a vůni. Do vína se uvolňuje celá řada fenolů, laktonů, taninů a lignin. Víno pak má nádech po vanilce a kokosu. Jelikož barrique sudy jsou dosti drahé a ne věčné, používají se dnes pro získání typického aroma dubové hobliny („chipsy“), desky a piliny. (Hutkins, 2006) Ponechání vína zrát v těchto sudech je charakteristické pro aromatické odrůdy, jejichž vína jsou tělnatější a nepřevažuje v nich ovocnost. Mimořádně vhodné jsou modré i bílé odrůdy z rodiny Pinot (Rulandské, Svatovařinecké, Chardonnay) a také Cabernet Sauvignon. (Steidl, Leidl, 2003) Vína scelujeme převážně na základě senzorického posouzení. Scelením vín v určitém poměru odstraňujeme nedostatky v jakosti, vyrovnáváme chuťové vlastnosti a zvyšujeme nebo snižujeme obsah některých látek, abychom dosáhli harmoničnosti vína. Vhodným scelením je také možno odstranit přesířené nebo přečiřené víno. (Hubáček, 1997) 20

3.1.15

Lahvování

Po dosažení sudové zralosti se vína stáčejí do lahví, kde následně dochází k tzv. lahvové zralosti, tj. k vrcholu jejich kvality. Víno pro lahvování by mělo být plné, výrazné a lahodné v chuti. Včasným stočením zachováme jeho svěžest a buketní látky. Víno stáčíme do lahví o objemu 0,5, 0,7, 0,75 nebo 1 litr. Jsou buď čiré, tmavozelené nebo hnědé barvy. Lahve před plněním by měly být dokonale čisté. Jako uzávěry se nejčastěji používají korkové špunty. U vín, která nejsou určena k archivnímu skladování, se setkáváme s PVC špunty. (Kraus et al., 2004) Při samotném lahvování bychom se měli vyvarovat toho, aby došlo ke zbytečnému styku vína se vzdušným kyslíkem. Tím zabráníme jeho oxidaci, která by měla negativní vliv na jeho kvalitu. Pro odstranění vzduchu, můžeme do lahve vstříknout inertní plyn nebo odsát vzduch a tím vytvořit v lahvi vakuum. (Hofmann, Trioli, 2009) 3.1.16

Hygiena a čistota ve vinařské praxi

Pro získání kvalitního jakostního vína nestačí mít jen dobré nenahnilé hrozny a dobrou technologii výroby, ale i správně nastaven sanitační řád. Po vinobraní je potřeba použité přepravky a výrobní zařízení důkladně umýt horkou vodou nebo lépe přehřátou párou. Tím se zabrání rozvoji nežádoucí mikroflόry, která by mohla mít negativní vliv na finální víno. Lze použít i dezinfekčních prostředků, ale po jejich aplikaci musí následovat dostatečný oplach čistou vodou. (Richter, 2011) Dezinfekce dřevěných sudů můžeme dosáhnout tradičním spalováním sirných knotů, pastilek nebo organických náplní umístěných dovnitř prázdné nádoby. Oxid siřičitý je možné také aplikovat přímo v plynné formě z průmyslově zkapalněného plynu. Na mikroorganismy působí oxid siřičitý smrtelně v důsledku okyselení mezibuněčných prostor. Pokud předpokládáme, že sudy budou delší dobu prázdné (půl roku a více), je vhodnější mokrá konzervace. Sudy se naplní 0,05 % vodným roztokem oxidu siřičitého a zůstanou tak až do příštího použití. (Michlovský, 2012) Když dosáhne víno lahvové zralosti, plní se do čistých lahví, které jsou předem dezinfikovány 1,5 % roztokem disiřičitanu draselného. (Kraus et al., 2004)

21

3.2 Mikroflόra vína 3.2.1

Bakterie

Různé druhy bakterií

jsou

součástí mikroflόry hroznu, moštu a vína.

Z technologického hlediska je můžeme rozdělit na užitečné, pomocí kterých dochází ke zlepšování kvality vína prostřednictvím jablečno - mléčné fermentace, a škodlivé, vlivem kterých vznikají ve vínech nežádoucí mikrobiologické změny. (Farkaš, 1983) 3.2.1.1

Bakterie octového kvašení

Jedná se o gram - negativní aerobní tyčinky, které patří do čeledi Acetobacteraceae. Ve vinařské praxi jsou tyto bakterie považovány za znehodnocující mikroorganismy. V procesu oxidace přeměňují etanol na kyselinu octovou, která se podílí na tvorbě nepříjemné chuti a vůni. (Fugelsang, Edwards, 2007) Rod Acetobacter částečně degraduje kyselinu jablečnou a citronovou. Na hroznech, které jsou připraveny k lisování, se vyskytují divoké kvasinky, které po vylisování mohou částečně nakvášet mošt. Vznikající malé množství etanolu je okamžitě metabolizováno bakteriemi octového kvašení, a proto některé mošty mohou mít relativně vysoký obsah těkavých kyselin před alkoholovou fermentací. (Ribéreau-Gayon et al., 2003) Lafon – Lafourcade a Joyeux (1981) prokázali, že rod Gluconobacter a Acetobacter produkuje inhibiční látky vůči některým rodům kvasinek. Nicméně tento účinek je velmi omezený, protože život bakterií octového kvašení v moštu je krátký. Zastaví se téměř ve stejnou dobu, kdy začíná alkoholové kvašení. Du Toit a Lambrechts (2002) izolovali z povrchu hroznů a vína tyto bakterie octového kvašení: Gluconobacter oxydans, Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus, Gluconacetobacter liquefaciens a Gluconacetobacter hansenii. 3.2.1.2

Bakterie mléčného kvašení

V minulosti byl odpovědný organismus za jablečno - mléčnou fermentaci nazýván jednotně Bacterium gracile. Později bylo zjištěno, že se jedná o rody Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus a Oenococcus. Z povrchu bobulí, stonků, listů, půdy a vinařského zařízení vstupuje do moštu a vína velké množství různých bakterií mléčného kvašení (BMK). Nicméně vzhledem k vysoce selektivnímu prostředí, které se

22

v moštu a víně nachází, je schopno v něm prosperovat jen několik typů BMK. Pro všechny BMK, které se vyskytují ve víně, je charakteristické, že:  Jsou gram - pozitivní.  Nejsou pohyblivé a netvoří spory.  Jsou fakultativně anaerobní.  Mají

chemoorganotrofní

mechanismus

-

vyžadují

bohatý

substrát

a zkvasitelné cukry.  Optimální teplota růstu je 20-30 °C. BMK lze rozdělit dle tvaru na tyčinky a koky. Rozhodujícím faktorem pro jejich klasifikaci je však, jaký mají metabolismus cukrů, a to heterofermentativní a nebo homofermentativní. Homofermentativní typy bakterií produkují z glukosy nebo fruktosy pouze kyselinu mléčnou. Heterofermentativní bakterie produkují ze stejných cukrů oxid uhličitý, etanol, kyselinu octovou a kyselinu mléčnou. Lactobacilly mohou mít oba tyto typy metabolismů a jsou rozděleny do tří skupin:  Striktně homofermentativní – tato skupina nebyla nikdy zjištěna ve víně.  Fakultativně heterofermentativní – jedna molekula glukosy se rozdělí na dvě molekuly kyseliny mléčné. Pentosy jsou fermentovány na jednu molekulu kyseliny mléčné a jednu molekulu kyseliny octové.  Striktně heterofermentativní – fermentují glukosu na kyselinu mléčnou a octovou, etanol a oxid uhličitý. Pentosy jsou fermentovány na kyselinu mléčnou a octovou (Bou et al., 2005)

23

Tab. č. 3: Metabolismus cukrů BMK. (Ribéreau-gayon et al., 2003) Skupina

Druh fermentace

BMK

Fakultativně heterofermentativní

Lactobacillus casei Lactobacillus plantarum

Lactobacilli Striktně heterofermentativní

Lactobacillus brevis Lactobacillus hilgardii

Pediococcus damnosus Homofermentativní Pediococcus pentosaceus

Cocci

Leuconostoc oenos (Oenococcus oeni)

Heterofermentativní

BMK hrají velkou roli při odbourávání kyseliny jablečné, což je žádoucí děj pro získání harmoničtějšího vína s jemnější kyselinou. Dochází k rozkladu jablečné kyseliny na kyselinu mléčnou a oxid uhličitý. (Hornsey, 2007) BMK produkují i spoustu vonných látek podílejících se na aroma vína. Mezi nejdůležitější bychom mohli zařadit 2,3-butandion , neboli diacetyl. Pro tuto látku je charakteristická máslová, oříšková až pečená vůně. Je produkována během metabolismu cukrů, ale i při odbourávání kyseliny citronové. (Fugelsang, Edwards, 2007) Diacetyl ve víně o vyšší koncentraci než 7 mg/l je nežádoucí pro svou výraznou máslovitou vůni, což je charakteristické pro nahnilé hrozny. Dalšími vonnými látkami produkovanými BMK jsou acetaldehyd, kyselina octová, aceton, 2-butanol, diethylsukcinát, ethylacetát, laktát a 1-hexanol. (Jackson, 2008) Ve víně vlivem BMK mohou vznikat i nežádoucí biogenní aminy. Tyto dusíkaté sloučeniny mají nežádoucí fyziologický účinek na lidské tělo, který se projevuje bolestí hlavy, zarudnutím kůže, gastrointestinálními a respiračními potížemi. (Lahtinen et al., 2012). Bartowsky a Stockley (2011) zjistili, že červená vína zpravidla vykazují větší koncentrace biogenních aminů než bílá vína. Tuto skutečnost autoři připisují tomu, že pro červená vína je typičtější malolaktická fermentace než pro bílá, při které tyto sloučeniny vznikají. Hlavními biogenními aminy nalezenými ve víně jsou histamin, tyramin, putrescin, kadaverin, fenylethylamin, spermidin, spermin, agmatin a tryptamin. (Moreno-Arribas, Polo, 2008) 24

Hlavní faktory, které ovlivňují růst BMK ve víně, jsou alkohol, obsah volného oxidu siřičitého, teplota a pH. (Jackson, 2008) Bakterie začínají být inhibovány přibližně při obsahu alkoholu 10 %. (Ribéreau-Gayon et al., 2003) Koncentrací volné síry nad 30 mg/l, při současně vyšší aciditě (pH = 3) se činnost bakterií silně inhibuje. (Minárik, Švejcar, 1981) Optimální teplota pro růst BMK a malolaktickou fermentaci je 20 °C. Snížením teploty na 10 °C, zastavíme množení bakterií, ale nezabráníme pomalému prokvášení. (Ribéreau-Gayon et al., 2003) V některých zemích je do mladého vína přidáván lysozym, aby zabránil nebo zpomalil působení BMK. Dobré využití má u vín, kde je vyšší pH. Nebylo pozorováno, že by měl nějaký negativní vliv na chuť nebo aroma vína. Pokud je přidáván do vína, tak bychom se měli vyhnout bílkovinnému čiření, protože by došlo k jeho vyvázání. (Jackson, 2008) Ribéreau-Gayon et al. (2003) potvrdili, že krystalický lysozym v dávce 4 mg/l stačil na zničení téměř všech BMK za 24 hodin. 3.2.1.2.1 Významné rody BMK  Lactobacillus – představuje velmi rozmanitou skupinu gram - pozitivních, mikroaerofilních bakterií, které pod mikroskopem můžeme vidět jako krátké tyčinky

nebo

dokonce

jako

koky.

Mohou

mít

jak

hetero,

tak

i homofermentativní metabolismus hexos. Z hroznů i vína byly izolovány tyto druhy: L. brevis, L. buchneri, L. casei, L. cellobiosus, L. curvatus, L. delbrueckii, L. diolivorans, L. fructivorans, L. heterohiochii, L. hilgardii, L. jensenii, L. kunkeei, L. leichmanni, L. nagelli, L. paracasei, L. plantarum, L. trichodes, L. vermiforme a L. yamanashiensis. (Fugelsang, Edwards, 2007) Lactobacillus plantarum rozkládá v červených vínech kyselinu vinnou, vinný kámen a glycerol na kyselinu octovou, mléčnou a oxid uhličitý. Tento nežádoucí děj bývá označován jako zvrhnutí vína. Protože se rozkládá glycerol a kyselina vinná, dojde ke snížení extraktivních látek a tím se stává víno prázdnější. Dojde rovněž k rozrušení červeného barviva, což se projeví nahnědlým odstínem vína. (Minárik, Švejcar, 1981) Lactobacillus fructivorans vyvolává někdy odbourávání kyseliny jablečné. V našich ekologických podmínkách tvoří asi 10 % ze všech heterofermentativních bakterií. Obvykle bývá kvašení slabší a málo aktivní. Odbourávání kyselin nastává při pH 3 až 3,8. Lactobacillus brevis zkvašuje arabinosu a xylosu. 25

Jedná se o nežádoucí mikroorganismus, protože se podílí na mnoha chorobných změnách vína. Tím, že je schopný využívat arabinosu a je odolný vůči alkoholu a nižšímu pH, může se vyvíjet i v suchých vínech, které hexosy neobsahují. (Minárik, Navara, 1986)  Oenococcus – tyto bakterie byly dříve klasifikovány jako Leuconostoc gracile,

Leuconostoc

citrovorum

a

Leuconostoc

oenos.

Pozdější

fylogenetické studie zjistily, že Leuconostoc oenos představuje odlišný druh oddělený od ostatních Leuconostoc ssp. Následně byla tato bakterie přeřazena do nového rodu Oenococcus. Bakterie patřící do tohoto rodu můžeme popsat jako gram - pozitivní, nepohyblivé, fakultativně anaerobní elipsoidní až kulovité buňky, které se obvykle vyskytují v párech nebo řetízcích. Jsou heterofermentativní a přeměňují glukosu na ekvimolární množství kyseliny D-mléčné, CO2 a etanol nebo kyselinu octovou. Oenococcus oeni je schopen metabolizovat kyselinu jablečnou na kyselinu mléčnou pomocí tzv. malolaktické fermentace, proto se využívá i jako komerční starter pro tento druh fermentace. Během malolaktické fermentace produkuje i vonné látky podílející se na aroma. Ve víně byly vnímány tόny lískového ořechu, čerstvého chleba a sušeného ovoce. (Fugelsang, Edwards, 2007)  Pediococcus – z vína byly izolovány čtyři druhy: Pediococcus damnosus, Pediococcus parvulus, Pediococcus inopinatus a Pediococcus pentosaceus. Pediokoky jsou charakterizovány jako gram - pozitivní, nepohyblivé, aerobní až mikroaerofilní bakterie s homofermentativním metabolismem. Vyskytují se jako diplokoky, tetrády nebo velké shluky sférických buněk. Pěstované kultury mají obvykle schopnost tvořit L-laktát z L-jablečné kyseliny. Při omezeném přísunu glukosy, je schopen Pediococcus pentosaceus degradovat glycerol na pyruvát, ten je dále metabolizován na acetát nebo diacetyl, který se podílí na aroma (viz výše). (Fugelsang, Edwards, 2007)

26

3.2.2

Kvasinky

Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotní mikroorganismy, náležející mezi houby (Fungi). Český název dostaly pro schopnost většiny druhů zkvašovat monosacharidy a některé disacharidy, případně trisacharidy na etanol a oxid uhličitý. Taxonomicky rozdělujeme kvasinky podle způsobu sexuálního rozmnožování do tří skupin:  Rody tvořící askospory – Ascomycotina  Rody tvořící bazidiospory nebo sporidie a heterokaryotní mycelium s přepážkami – Basidiomycotina  Rody, u nichž není známa tvorba pohlavních spor – Deuteromycotina, dříve nazývány „nepravé kvasinky“ nebo „kvasinkovité mikroorganismy“ (Šilhánková, 2002) Rozmanitost a zastoupení různých druhů kvasinek v moštu, může záviset na mnoha faktorech, jako je zeměpisná poloha, klimatické podmínky, půdní fond, odrůda révy vinné, napadení hroznů plísněmi, sanitaci vinařského zařízení a zpracování hroznů. K spontánnímu kvašení hroznové šťávy dochází postupným rozvojem různých druhů kvasinek, které pochází z hroznů a vinařského zařízení. Počáteční populace kvasinek z čerstvě vylisované šťávy je 103 až 106 KTJ/ml. Hanseniaspora ssp. patří mezi nejvíce rozšířené druhy kvasinek na bobulích, což představuje 50-75 % z celkového počtu kvasinek. Méně zastoupeny jsou rody Candida, Brettanomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Metschnikowia, Pichia, Hansenula a Rhodotorula. Množství hlavní vinné kvasinky Saccharomyces cerevisiae je v moštu odhadováno na 101-102 KTJ/ml. Zhruba v polovině kvašení je však její počet navýšen již na 107 až 108 KTJ/ml, a to hlavně díky potlačení ostatních rodů kvasinek vlivem vysokého obsahu alkoholu (5-7 % alkoholu). (Fleet, Querol, 2006) Nevýhodou spontánního kvašení je jeho nepředvídatelné chování, proto dnes většina vinařů mošt síří a zbaví se tak problémů s divokými kvasinkami. Mošt je pak zakvášen kulturními kvasinkami konkrétního kmene rodu Saccharomyces podle potřeb vinaře. (Jacobson, 2006) Během anaerobní fermentace cukrů se kromě hlavních složek (etanol, CO2) vytváří i různé vonné sloučeniny, které se podílejí na senzorickém profilu vína. Mezi tyto sloučeniny můžeme zařadit mastné kyseliny, vyšší alkoholy, estery, fenoly, karbonylové sloučeniny a těkavé sloučeniny síry. Vznikající množství těchto sloučenin závisí na 27

kmenu kvasinek, složení moštu (chemické, fyzikální a nutriční) a podmínkách fermentace. Další vonné látky vznikají až následkem působení kvasinkových enzymů z netěkavých prekurzorů. Sem patří monoterpeny (geraniol, nerol, linalol, citronelol, α-terpineol) a C13-norisoprenoidy, které se uvolňují z glykosidických prekurzorů a polyfunkčních thiolů s dlouhým řetězcem odvozených od S-cysteinyl konjugátů. (Moreno-Arribas, Polo, 2008) 3.2.2.1

Významné rody kvasinek

 Saccharomyces – mnoho druhů kvasinek se může účastnit alkoholového kvašení, ale rod Saccharomyces je pro svou dobrou přizpůsobivost tvrdým podmínkám panujícím v moštu a víně (vysoká kyselost, vysoký obsah cukru a etanolu, dobrá odolnost vůči SO2 atd.) nejcharakterističtější. (Fröhlich et al.,2008) Kvasinky tohoto rodu jsou nejvíce rozšířené v moštech a vínech, méně již v půdě a na orgánech révy vinné. Buňky mají kulatý nebo oválný, někdy i protáhlý tvar. (Minárik, Švejcar, 1981) Taxonomie saccharomycetních vinných kvasinek prošla několika změnami. Zprvu do tohoto rodu byly řazeny jen čtyři druhy: S. cerevisiae, S. bayanus, S. paradoxus a S. pastorianus, ale později byly přidány další tři: S. kudriavzevii, S. mikatae a S. cariocanus. Nejvyužívanějším druhem kvasinek ve vinařství je S. cerevisiae. Nicméně druh S. bayanus je s oblibou využíván všude tam, kde dochází ke kvašení při nízké teplotě a kde vzniká vysoký obsah alkoholu. Kmeny S. paradoxus byly izolovány z vinic, ale jejich potenciální přínos pro kvašení není znám. (Fröhlich et al., 2008)  Candida – představuje širokou skupinu mikroorganismů s řadou druhů nalezených ve víně. Někteří zástupci např. Candida pulcherrima se zásadně vyskytují na hroznech a jsou zodpovědní za zahájení alkoholového kvašení. Jiní jako Candida vini, Candida zeylanoides, jsou zase velmi častou složkou mikroflόry mladých vín. (Minárik, Švejcar, 1981)  Brettanomyces/Dekkera – mnozí vinaři považují kvasinky rodu Brettanomyces a její sporulující formu Dekkera za kvalitu zhoršující mikroorganismy. Za aerobních podmínek produkují z cukrů značné množství kyselin a v některých 28

případech způsobují zákaly vína. Tyto kvasinky jsou typické pro mladá červená vína, kterým dodávají starší charakter v chuti. Tvar buněk připomíná loďku nebo gotické oblouky, závisí to na stáří buněk. Všechny druhy kvasí glukosu, galaktosu, sacharosu a maltosu. Brettanomyces anomalus a Brettanomyces bruxellensis kvasí i laktosu.  Hanseniaspora – buňky tvoří vejčitý, kulovitý až citronovitý tvar. Nejběžnějším druhem je H. uvarum, který fermentuje výhradně glukosu. (Fugelsang, Edwards, 2007)  Rhodotorula – jedná se o kvasinky vyznačující se oválným až protáhlým tvarem. Jsou stálou mikroflόrou výrobních zařízení a největší výskyt je na stěnách sklepu, kde tvoří růžové až hnědorůžové povlaky. Rod Rhodotorula bývá nejčastěji zastoupen druhy Rh. glutinis a Rh. rubra. Vzhledem k malé odolnosti vůči alkoholu se tyto kvasinky ve vínech nevyskytují a nemají tudíž žádný technologický význam. (Minárik, Švejcar, 1981)  Pichia – pod mikroskopem tyto kvasinky můžeme vidět jako vejčité, eliptické nebo válcové buňky. Tvoří bílé nebo krémové kolonie. Druhy P. anomala a P. membranifaciens byly identifikovány ve víně. Naproti tomu druh P. guilliermondii byl izolován na výrobním zařízení a v moštu. V závislosti na druhu kvasinky jsou fermentovány různé cukry. P. anomala fermentuje glukosu a je schopna produkovat 0,2 až 4,5 % alkoholu spolu s velkým množstvím kyseliny octové, ethylacetátu a isoamylacetátu. (Fugelsang, Edwards, 2007)  Schizosaccharomyces – jsou to sporogenní válcovité kvasinky, aktivně zkvašující cukry. Dokáží také zkvašovat kyselinu jablečnou na alkohol a oxid uhličitý. S. pombe dobře vytváří etanol a to až do obsahu 15 %, avšak pomaleji než kvasinky rodu Saccharomyces. Charakteristickým rysem tohoto druhu je vysoká odolnost vůči oxidu siřičitému. S. malidevorans dokáže 100 % rozkládat kyselinu jablečnou a během kvašení vytváří značné množství sulfanu, což může vést ke vzniku sirky. (Minárik, Švejcar, 1981)  Saccharomycodes – tento rod je zastoupen pouze jedním druhem, S. ludwigii. Buňky mají citronovitý tvar a vyskytují se jednotlivě nebo v párech. Zkvašují a asimilují glukosu, sacharosu a rafinosu. Vyskytují se sporadicky a jen do prvního stáčení vína. (Minárik, Navara, 1986) 29

 Zygosaccharomyces – kvasinky tohoto rodu mají kulovitý, elipsoidní až podlouhlý tvar. Z moštu a vína byly izolovány druhy: Z. bailii, Z. bisporous, Z. rouxii a Z. florentinus. Jsou velmi odolné vůči vysokému obsahu glukosy, konzervačních látek běžně užívaných ve vinařství a alkoholu. (Fugelsang, Edwards, 2007) V poslední době jsou častým a obávaným kontaminantem ve vinařství (tvorba křísu v lahvovém víně). (Šilhánková, 2002) Plísně

3.2.3

Jako plísně označujeme mikroskopické vláknité eukaryotní mikroorganismy, které spolu s kvasinkami a bakteriemi tvoří mikroflóru vinné révy. Najdeme je i na stěnách vinných sklepů, sudech a vinařských zařízeních. (Farkaš, 1980) Podle přítomnosti a typu pohlavního rozmnožování můžeme technologicky významné plísně rozdělit do těchto taxonomických jednotek:  Do třídy Zygomycetes, jež patří mezi Zygomycotina.  Do podkmene Ascomycotina.  Do podkmene Deuteromycotina (Fungi imperfecti, tj. houby nedokonalé). (Šilhánková, 2002) Běžně se vyskytujícími rody plísní na hroznech révy vinné jsou: Aspergillus, Botrytis,

Penicillium

a

v menší

míře

Phythophthora,

Moniliella,

Alternaria

a Cladosporium. Na povrchu vinného sklepa a vinařského zařízení se můžeme setkat s rody: Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Geosmithia, Penicillium a Verticillium. (Fugelsang, Edwards, 2007) 3.2.3.1

Významné rody plísní

 Rhizopus – tento rod je charakteristický pro sušší vinařské oblasti, kde nejvíce napadá hrozny během přepravy a skladování. (Fröhlich et al., 2008) Na bobulích a v půdě se vyskytuje nejčastěji R. stolonifer a R. nigricans, který je velice náchylný na obsah alkoholu, a proto nehrozí jeho kontaminace v kvasícím moštu nebo finálním víně. (Farkaš, 1980)  Mucor – napadá hlavně hrozny, co spadly na zem. Významným druhem je Mucor racemosus, který je schopen zkvašovat sacharosu do 4 – 5 % alkoholu, při čemž vznikají i vedlejší produkty kvašení jako glycerol, acetaldehyd,

30

organické kyseliny. Vyskytuje se prakticky v každém moštu, ale je potlačován kvasinkami. (Minárik, Švejcar, 1981) 

Aspergillus – na vinné révě se vyskytuje převážně v teplých měsících, kdy dochází k dozrávání hroznů. Povrch napadnutých bobulí je pokryt černou plísní a bobule uhnívají. (Fugelsang, Edwards, 2007) Aspergillus produkuje mykotoxin - ochratoxin, který má nefrotoxický, imunotoxický, mutagenní, karcinogenní a teratogenní účinek na lidský organismus. (Vlková et al., 2009) Proto by hrozny s touto plísní měly být vyřazeny ze zpracování. Nejčastějšími druhy jsou: A. niger, A. alliaceus, A. carbonarius a A. ochraceus.

 Penicillium – způsobuje sekundární onemocnění na poraněných zralých bobulích. Vyskytuje se převážně v teplých a vlhkých létech, kdy bobule předčasně dozrávají. Infikované bobule dodávají vínu chuť po plísni, a proto bychom měli věnovat velkou pozornost tomu, aby se takovéto hrozny nedostaly do zpracovny. Rod Penicillium produkuje mykotoxiny a to např. patulin, který je však degradován během fermentace a zasíření. Nejběžnějším druhem je Penicillium expansum.  Cladosporium – se vyskytuje v mírných oblastech a hlavně na tlejícím organickém materiálu. Pozdě sklizené hrozny mohou být velmi často napadeny touto hnilobou, a pokud jsou zpracovávány do moštu, tak udělují vínu plesnivý charakter. Neprodukují žádné významné mykotoxiny. Na vinné révě se setkáváme s C. herbarum. (Fröhlich et al., 2008)  Botrytis cinerea – když napadne ve vlhkém podzimu nedozrálé bobule hroznů, stává se původcem jejich hnití. V tomto případě ji označujeme jako plíseň zhoubnou. Napadne-li však vyzrálé bobule v pozdním suchém podzimu, působí příznivě na jejich vysychání, a tím i na kvalitu moštu. Označujeme ji pak jako plíseň ušlechtilou. Tato plíseň vytváří na povrchu bobulí povlak, z něhož proniká konidiemi do dužniny a rozkládá zde kyseliny a v menší míře i cukry. Vzniklé póry ve slupce bobulí usnadňují výpar vody a tím urychlují koncentraci jejich obsahu, včetně obsahu cukru. Bobule sesychají a cibébovatí. Vlivem specifických oxidačních enzymů dochází k produkci látek, udělující vínu chlebnaté tóny ve vůni i chuti. Mění se původní odrůdový charakter vína. (Kuttelvašer, 2003) 31

3.3 Mikrobiologické vady vína Tyto nemoci vína jsou způsobeny rozvojem nežádoucích mikroorganismů, které rozkládají některé složky vína a vytvářejí složky nové, poškozující jakost vína. Změny způsobené mikroorganismy se obvykle neustále prohlubují a víno se nakonec stává nepoživatelným. Riziko vzniku nemocí ve víně můžeme snížit: zpracováváním jen zdravých a vyzrálých hroznů, dobrou sanitací výrobního zařízení, čistotou sklepa a dodržováním správných zásad ošetřování vína. (Dohnal, Kraus, 1972) 3.3.1

Křísovatění vína

Jde o nejznámější a nejrozšířenější vadu vína. Vyskytuje se převážně u vín s nižším obsahem alkoholu (do 12,5 %). Na hladině v nádobách se tvoří charakteristický bílý nebo šedobílý povlak nazývaný křís, lidově šum nebo květ. (Pátek, 2000) Hlavním původcem jsou kvasinky rodu Candida, Pichia a Hansenula, které oxidují etanol na vodu a CO2 a tvoří těkavé kyseliny spolu s aldehydy. Dochází rovněž ke snížení tříslovin a ke ztrátě aromatických látek. Jestli se neprovede včasná náprava, ztratí víno svůj charakter. Nejvýznamnějším opatřením je držet nádoby s vínem zcela plné, popřípadě prázdný prostor zasířit, a zabránit tak styku hladiny se vzduchem. (Hrabě, Rop, 2009) 3.3.2

Vláčkovatění vína

Vyskytuje se hlavně u bílých vín. Projevuje se olejovitou konzistencí. V rané fázi se barva ani vůně nemění, ale později dochází k zakalení, změně chuti a víno se stává mdlým. Vláčkovitost způsobují především bakterie, které produkují sliz jako např. Pediococcus cerevisiae, P. damnosus, Leuconostoc mesenteroides a L. dextranicum. Nejedná se o nebezpečnou nemoc a slabé vláčkovatění se ztratí samo. V případě, že ve víně zůstává, je možné jej odstranit překvašením vína nebo jeho silným provzdušněním, prošleháním a zasířením. Slizové látky se pak usadí na dno a jsou odstraněny při stáčení vína. (Pátek, 2002) 3.3.3

Octovatění vína

Dochází k němu činností bakterií octového kvašení, konkrétně druhy Acetobacter ascendent, A. mesooxydans, A. suboxydans atd., mléčného kvašení a kvasinek rodu Hanseniaspora, Kloeckera a Brettanomyces. Kromě kyseliny octové vznikají i jiné 32

těkavé kyseliny (kyselina mravenčí, propionová a máselná) a jejich estery. Ve víně se pak objevuje zápach a chuť po salátovém octu. Octovatění můžeme předejít, pokud se budeme držet těchto zásad: zpracovávat zdravé hrozny, čištění a dezinfekce výrobního zařízení, dostatečné zasíření moštu, rychlé nakvášení za použití kulturních kvasinek a stále plné nádoby, ve kterých máme víno. Odstranění octovatění lze jen v lehkých případech scelováním. (Eder, 2006) 3.3.4

Mléčné a manitové kvašení

Podléhají mu vína s vysokým obsahem kyselin, tříslovin a zbytkového cukru. Za původce tohoto onemocnění můžeme označit bakterie mléčného kvašení. V našich vínech se setkáváme s Bacterium gracile a B. mannitopoeum. Nemocná vína mají drsnou chuť i vůni připomínající kvašené zelí. Fermentací vzniká kyselina mléčná, octová a CO2 v doprovodu těkavých kyselin a případně manitu. Od octovatění se tato nemoc liší v tom, že probíhá i za anaerobních podmínek. Preventivní ochranou je oddělování nahnilých a poškozených hroznů při jejich zpracování, dostatečné zasíření a nízká kvasná teplota. (Pátek, 2000) 3.3.5

Zvrhnutí vína

Nejčastěji se vyskytuje u červených vín s nízkým obsahem kyselin a tříslovin. Napadené víno ztrácí barvu, na vzduchu hnědne a kalí se. Má mdlou chuť. Tuto chorobu zapříčiňuje Bacterium tartarophtorum, které rozkládá kyselinu vinnou, vinný kámen a glycerol na kyselinu octovou, mléčnou a CO2. Slabě napadené víno je možné silně zasířit a scelit s vínem zdravým, silně napadené pak zpracovat na vinný ocet nebo jakostní destilát. (Gavorník, 1964) 3.3.6

Pach po myšině

Jedná se o významnou změnu v chuti a vůni vína. Objevuje se u zdlouhavě kvašených vín, která jsou docukřována. (Vlková et al., 2009) Původci myšiny jsou jednak bakterie (Lactobacillus brevis a L. cellobiosus) a jednak kvasinky rodu Brettanomyces. Zabránit této nemoci můžeme silným zasířením, čiřením, aktivním uhlím a sterilní filtrací. (Eder, 2006)

33

3.3.7

Pachuť po plísni

Toto onemocnění vína je výhradně zapříčiněno nedostatečnou hygienou sudů a hadic používaných k transportu vína. Nejdůležitějšími rody plísní způsobující tuto pachuť jsou Penicillium a Aspergillus. Prevencí je nezpracovávat nahnilé hrozny, dostatečná sanitace hadic a zasíření sudů. (Eder, 2006) Mírnou pachuť lze odstranit čiřením zdravými kvasinkami, silnější jen čiřením aktivním uhlím. (Hrabě, Rop, 2009) 3.3.8

Pelargoniová vůně

Může se vyskytovat u vín se zbytkem cukru, která byla konzervována kyselinou sorbovou nebo jejími deriváty. Vzniká odbouráváním tohoto konzervačního prostředku bakteriemi mléčného kvašení a prozrazuje se ve víně vůní typickou pro květy pelargonií. (Kopeček, Kraus, 2002) Odstranění závady prakticky není možné a můžeme jí předejít jen dobrou hygienou sklepa. (Eder, 2006) 3.3.9

Pach po koňském potu

Za příčinu jsou zpravidla odpovědné produkty látkové výměny (těkavé fenoly) kvasinek rodu Brettanomyces. V malém množství pozitivně ovlivňují aroma vína (vůně po kosatcích, hřebíčku, dýmová vůně), při vyšší koncentraci však způsobují vadu vína. Nejčastěji se tato choroba vyskytuje u červených vín zrajících v sudech barrique. Významným předpokladem k potlačení této vady je dobrá hygiena a dostatečné zasíření. Kvasinky Brettanomyces nesnášejí oxid siřičitý. Od 40 mg/l volného oxidu siřičitého dochází k výraznému zastavení jejich vývoje. (Michlovský, 2012)

34

4 MATERIÁL A METODIKA Praktická část diplomové práce spočívala v provedení mikrobiologické analýzy třech druhů vín v jednotlivých krocích jejich technologie výroby. U moštů a následně vín se stanovoval celkový počet mikroorganismů, bakterie mléčného kvašení, kvasinky a plísně. Pro tyto analýzy byla využita plotnová metoda. Hrozny pro výrobu vín pocházely z vinohradu Zbyňka Žišky, který spadá do:  Vinařské oblasti: Morava,  Podoblasti: znojemské,  Viniční obce: Jaroslavice,  Viniční trati: Na zámku. Tato viniční trať je nejstarší v městečku Jaroslavice. Rozkládá se na jižním svahu nad silnicí směrem do Znojma a patří k ní i rovina před zámeckou alejí. Trať je dnes zázemím drobných jaroslavických vinařů s 12 registrovanými pěstiteli na 13 ha vinic. Najdeme tu díky vlastnické struktuře mnoho odrůd, ale převládá výsadba Veltlínského zeleného, Ryzlinku vlašského a Müller Thurgau. (Markelwinery, 2008) Zpracování hroznů a výroba vín probíhaly ve sklepě malovinaře Zbyňka Žišky, který řídil i samotnou technologii.

4.1 Charakteristika analyzovaných odrůd 4.1.1

Pálava

Jedná se o křížence Tramínu červeného a Müller Thurgau. Dužnina bobulek je šťavnatá a aromatická, s plnou muškátovou vůní a kořenitou příchutí. Tyto vlastnosti se projevují v hotovém víně. Víno je poněkud štíhlejší než Tramín červený a může dobře posloužit do směsí, které jakostně zvýrazní. Pálava dobře dozrává a často mívá vysokou cukernatost a nízkou kyselinu. Nezkvašený zbytkový cukr pak dodává vínu lahodnou a harmonickou chuť. (Ludvíková, 2004) 4.1.2

Veltlínské zelené

Tato odrůda je velmi stará a typická pro znojemskou podoblast. Hojně se dříve podávala u císařského dvora ve Vídni a Schönbrunnu v dobách slávy vídeňských valčíků. Vyznačuje se pikantní a mírně medovou vůní. Hodí se ke scelování s Ryzlinkem vlašským a k výrobě dobrých známkových vín. V některých případech 35

dosahuje výborné lahvové zralosti a je uváděno na trh jako víno archivní za podstatně vyšší cenu. (Pátek, 2000) Rulandské modré (rosé)

4.1.3

Poskytuje jednoduchá, čitelná vína s nižším obsahem kyselin a tříslovin. V aroma je možné objevit především jahody a černé třešně, ale může přecházet až v intenzivní tropické ovocné tόny, a to především v případě, že se v technologii použijí kvasinky podporující tento typ aroma. Barevně jsou tato vína světlejší. Vína této odrůdy nestárnou tak rychle a jsou v našich oblastech jemná a komplexní. (Stávek, 2013)

4.2 Technologie výroby vín Pálava

4.2.1

 Sklizeno 225 kg hroznů, cukernatost 22,5 °NM.  Do rmutu přidáno: -

20 g VINPROTECT (směs disiřičitanu draselného + vit. C + taninu), aby se zabránilo rozvoji nežádoucí mikroflόry a oxidaci.

-

6 g Rapidase Expression (pektolytické enzymy).

-

Macerace 4 hodiny.

 Vylisováno 150 l moštu. Lisováno pomocí mechanického šroubovacího lisu. Doba lisování 3 hodiny. Výlisnost 67 %.  Do šťávy přidáno: -

Vzorek č. 1: 75 l šťávy zakvašeno 18 g OENOFERM TERRA F3 ASVK + 75 g MajorBentonit + 35 g VITAMON COMBI (výživa pro kvasinky).

-

Vzorek č. 2: 75 l šťávy zakvašeno 23 g OENOFERM BOUQUET ASVK + 75 g MajorBentonit + 35 g VITAMON COMBI (výživa pro kvasinky).

 Kvašení zastaveno pomocí disiřičitanu draselného, přidáno v množství 70 mg SO2/l.  1. stáčení z kalů.  Čiření: -

Vzorek č. 1: 12 g Bentogran + 12 g CombiGel + 12 g Klar-Sol Super.

-

Vzorek č. 2: 1: 12 g Bentogran + 12 g CombiGel + 12 g Klar-Sol Super.

 2. Stáčení. 36

 1. filtrace (pόrovitost 10 µm), deskový filtr.  2. filtrace (pόrovitost 0,2 µm), mikrosvíčka.  Zrání vína. Veltlínské zelené

4.2.2

 Sklizeno 200 kg hroznů, cukernatost 22,5 °NM.  Do rmutu přidáno: -

20 g VINPROTECT (směs disiřičitanu draselného + vit. C + taninu), aby se zabránilo rozvoji nežádoucí mikroflόry a oxidaci.

-

4 g Rapidase Expression (pektolytické enzymy).

-

Macerace 5 hodin.

 Vylisováno 130 l moštu. Lisováno pomocí mechanického šroubovacího lisu. Doba lisování 3 hodiny. Výlisnost 65 %.  Do šťávy přidáno: -

Vzorek č. 3: 65 l šťávy zakvašeno 15 g OENOFERM VELTLINER F3 ASVK + 65 g MajorBentonit + 32 g VITAMON COMBI (výživa pro kvasinky).

-

Vzorek č. 4: 65 l šťávy zakvašeno 5 g OENOFERM VELTLINER F3 ASVK a 10 g OENOFERM F3 + 65 g MajorBentonit + 32 g VITAMON COMBI (výživa pro kvasinky).

 Kvašení zastaveno pomocí disiřičitanu draselného, přidáno v množství 70 mg SO2/l.  1. stáčení z kalů.  Čiření: -

Vzorek č. 3: 10 g Bentogran + 10 g CombiGel + 10 g Klar-Sol Super.

-

Vzorek č. 4: 10 g Bentogran + 10 g CombiGel + 10 g Klar-Sol Super.

 2. Stáčení.  1. filtrace (pόrovitost 10 µm), deskový filtr.  2. filtrace (pόrovitost 0,2 µm), mikrosvíčka.  Zrání vína.

37

Rulandské modré (rosé)

4.2.3

 Sklizeno 170 kg hroznů. Cukernatost 22,5 °NM.  Do rmutu přidáno: -

15 g VINPROTECT (směs disiřičitanu draselného + vit. C + taninu), aby se zabránilo rozvoji nežádoucí mikroflόry a oxidaci.

-

2 g Rapidase Expression (pektolytické enzymy).

-

Macerace 4 hodin.

 Vylisováno 100 l moštu. Lisováno pomocí mechanického šroubovacího lisu. Doba lisování 2 hodiny. Výlisnost 59 %.  Do šťávy přidáno: -

Vzorek č. 5: 100 l zakvašeno 30 g OENOFERM ROSE ASVK + 100 g MajorBentonit + 50 g VITAMON COMBI.

 Kvašení zastaveno pomocí disiřičitanu draselného, přidáno v množství 70 mg SO2/l.  1. stáčení z kalů.  Čiření: -

Vzorek č. 5: 17 g Bentogran + 17 g CombiGel + 17 g Klar-Sol Super.

 2. Stáčení.  1. filtrace (pόrovitost 10 µm), deskový filtr.  2. filtrace (pόrovitost 0,2 µm), mikrosvíčka.  Zrání vína.

4.3 Použité druhy kvasinek (ASVK) Výrobce: Erbslöh, Německo  Oenoferm Terra F3 – směs těchto kvasinek vznikla selekcí divokých kvasinek běžně se vyskytujících na vinici. Je určena jak pro bílá, tak i červená vína. Podporují rozvoj terroir charakteru vín. Nehrozí zvrhnutí kvašení a tvorba nežádoucích látek, jak by tomu mohlo být u divokých kmenů kvasinek. Nástup kvašení je rychlý a mošt prokváší dobře až do konce. Fermentační teplota pro bílá vína: 17-22 °C, červená vína: 22-28 °C. Tolerance alkoholu do 14 % obj.

38

 Oenoferm Bouquet F3 – převládající kvasinkou v tomto preparátu je Saccharomyces cerevisiae ssp. bayanus. Ta produkuje vysoký podíl esterů, které udělují vínům ovocné, květinové až sladké aroma s dobrou tělnatostí. Proto se tyto vína často používají ke scelování. Fermentační teplota: 16-20 °C. Tolerance alkoholu do 15 % obj.  Oenoferm Veltliner F3 – tyto kvasinky produkují svěží ovocné aromatické látky, přičemž jsou zvýrazněny především pepřovitě kořenité tόny. Soubor vznikajících látek pak udává Veltlínskému zelenému typickou ovocnou chuť. Kvasinky i zvýrazňují tvorbu charakteristických aromatických látek pro terroir. Fermentační teplota: 14-17 °C. Tolerance alkoholu do 15 % obj.  Oenoferm F3 – používají se při výrobě vín, u kterých chceme docílit čistého a typického odrůdového aroma. Vína mají svěží chuť, ve které můžeme nalézt vyzrálé zelené jablko či broskev. Fermentační teplota: 16-22 °C. Tolerance alkoholu do 14 % obj.  Oenoferm Rose F3 – pro tyto kvasinky je charakteristická vysoká aktivita a rychlost prokvášení moštu. Díky těmto svým vlastnostem zabraňují rozvoji nežádoucí mikroflόry, která by mohla negativně ovlivnit finální víno. Oenoferm Rose F3 je ideální preparát pro výrobu lehkých, svěžích a ovocných vín. Ve vůni převládá sladké aroma květů třešní, ovoce a medu.

4.4 Odběr vzorků Hrozny byly sklizeny ručně během dopoledne, a to do přepravek o obsahu 50 kg. Ihned po přivezení hroznů do sklepa byl proveden odběr pro analýzu mikroflόry bobulí. Od každé odrůdy byly odebrány tři trsy hroznů. První z povrchu přepravky, druhý ze středu přepravky a třetí ze dna přepravky. Trsy byly uloženy do mikrotenových sáčků a chladicího boxu, ve kterém byly přepravovány. Vzorky byly analyzovány následující den. Do té doby byly v chladničce při teplotě 6-8 °C. Vzorky pro analýzu moštu byly odebírány ze samotoku, a to po scezení první třetiny rmutu. Mošt byl odebírán do 150 ml sterilních vzorkovnic. Ty byly uloženy do chladicího boxu a následně do chladničky o teplotě 6-8 °C. Druhý den byl mošt analyzován.

39

Následující odběry proběhly po jednotlivých krocích technologie výroby vín:  5 dní po zasíření (70 mg SO2/l),  1 hodinu po stáčení z hrubých kalů,  týden po 1. stáčení,  týden po 2. stáčení (z jemných kalů) + čiření + scelování,  týden po 1. filtraci (10 µm),  bezprostředně po 2. filtraci (0,2 µm). Vzorky se odebíraly přímo z nádob, ve kterých bylo víno uchováváno, pomocí sterilní hadičky na stáčení kapalin (PVC). Hadička byla před každým odběrem několikrát prolita vroucí vodou a při samotném odběru byla vždy ponořena doprostřed nádoby. První litr vína se nechal odtéci. Pak byla naplněna 150 ml sterilní vzorkovnice, která se pečlivě uzavřela. Během přepravy bylo víno v chladicím boxu a do druhého dne v chladničce o teplotě 6-8 °C. Druhý den proběhla analýza. Pro kontrolu mikrobiologie výroby byly zanalyzovány i tytéž odrůdy z ročníku 2011. Vína zrála v tomtéž sklepě, ve kterém probíhala výroba, v půllitrových tmavě zelených lahvích při teplotě 12 °C.

4.5 Zpracování vzorků Pro mikrobiologickou analýzu je důležitá sterilita, proto veškeré laboratorní sklo, živné půdy, špičky pipet, zkumavky s fyziologickým roztokem atd. byly sterilizovány v parním sterilizátoru při 121 °C 20 minut. 4.5.1

Kultivace

 Celkový počet mikroorganismů (CPM) – použitý agar byl PCA „Plate Count Agar“. Kultivace při teplotě 30 °C po dobu 72 hodin.  Bakterie mléčného kvašení (BMK) – použitý agar byl MRS. Kultivace při teplotě 30 °C po dobu 72 hodin.  Kvasinky a plísně (Kva/Pl) – použitý agar CHL „Chloramphenicol glucose agar“. Kultivace při teplotě 25 °C po dobu 72-120 hodin.

40

4.5.2

Použité živné půdy

 Plate Count Agar (PCA) Výrobce: Biokar Diagnostics, Francie Složení na 1 litr média: Trypton

5g

Kvasničný extrakt

2,5 g

Glukosa

1g

Bakteriologický agar

12 g

Příprava: Naváží se 20,5 g dehydratovaného agaru, který se nasype do 1 litru destilované nebo deionizované vody. Suspenze se pomalu za stálého míchání přivede k varu a počká se, dokud není agar zcela rozpuštěn. Agar se sterilizuje při teplotě 121 °C po dobu 15 minut. Hodnota pH se upraví na 7,0 ± 0,2.  MRS agar Výrobce: Biokar Diagnostic, Francie Složení na 1 litr média: Polypepton

10 g

Masový extrakt

10 g

Kvasničný extrakt

5g

Glukosa

20 g

Tween 80

1,08 g

Hydrogenfosforečnan draselný

2g

Octan sodný

5g

Citran amonný

2g

Síran hořečnatý

0,2 g

Síran manganatý

0,05 g

Bakteriologický agar

15 g

Příprava: Naváží se 70,3 g dehydratovaného agaru, který se nasype do 1 litru destilované nebo deionizované vody. Suspenze se pomalu za stálého míchání přivede k varu a počká se, dokud není agar zcela rozpuštěn. Agar se sterilizuje při teplotě 121 °C po dobu 15 minut. Hodnota pH se upraví na 5,7 ± 0,2.

41

 Chloramphenicol glucose agar (CHL) Výrobce: Biokar Diagnostic, Francie Složení na 1 litr média: Kvasničný extrakt

5g

Glukosa

20 g

Chloramfenikol

0,1 g

Bakteriologický agar

15 g

Příprava: Naváží se 40,1 g dehydratovaného agaru, který se nasype do 1 litru destilované nebo deionizované vody. Suspenze se pomalu za stálého míchání přivede k varu a počká se, dokud není agar zcela rozpuštěn. Agar se sterilizuje při teplotě 121 °C po dobu 15 minut. Hodnota pH se upraví na 6,6 ± 0,2. 4.5.3

Mikroflόra bobulí

Během analýzy byly použity gumové rukavice, které byly potřeny dezinfekčním prostředkem. Nůžky byly vysterilizovány směsí lihu + benzínu a vyžíhány plamenem. Z hroznů byly odstřihnuty bobule, z kterých se navážilo 10 g. Následně byly nasypány do 100 ml fyziologického roztoku. Ten byl ponechán po dobu 10 minut na třepačce. Bobule byly kombinovaně nastříhány z trsu pocházejícího z povrchu, prostředku a dna přepravky. Ze vzniklého oplachu bylo připraveno desítkové ředění. 1 ml původního vzorku nebo jeho desetinného ředění byl zalit příslušnou živnou půdou (10 ml) zchlazenou na cca 40-45 °C. Po zatuhnutí byla Petriho miska umístěna do termostatu a inkubována daný čas při příslušné teplotě. Ředění pro:  CPM bylo 10-2, 10-3,  BMK bylo 10-1, 10-2,  Kva/Pl bylo: 10-2, 10-3. 4.5.4

Očkování moštu a vína

Z původních vzorků moštu/vína bylo připraveno desítkové ředění. 1 ml původního vzorku nebo jeho desetinného ředění byl zalit příslušnou živnou půdou (10 ml) zchlazenou na cca 40-45 °C. Po zatuhnutí byla Petriho miska umístěna do termostatu a inkubována daný čas při příslušné teplotě.

42

Ředění pro mošt:  CPM bylo 10-2, 10-3,  BMK bylo 100, 10-1,  Kva/Pl bylo: 10-1, 10-2. Ředění pro víno:  CPM bylo 100, 10-1, 10-2,  BMK bylo 100, 10-1, 10-2,  Kva/Pl bylo: 100, 10-1, 10-2. 4.5.5

Vyhodnocení výsledků

Po ukončení kultivace byly spočítány narostlé kolonie mikroorganismů na Petriho miskách. Výsledky byly dosazeny do vzorce na přepočet jednotlivých kolonií (KTJ) obsažených v 1 ml moštu/vína nebo na 1 g bobulí. Pro výpočet se použily misky obsahující ne více než 300 kolonií ve dvou po sobě jdoucích ředění a ne méně než 15 kolonií ve dvou po sobě jdoucích ředění.

N=

c V .(n1  0,1n2 ).d

Ʃc

součet kolonií dvou paralelních misek ze dvou po sobě jdoucích ředění

V

objem očkovaného vzorku v ml

n1

počet misek použitých pro výpočet z prvního ředění

n2

počet misek použitých pro výpočet z druhého ředění

d

faktor prvního pro výpočet použitého ředění

43

5 VÝSLEDKY A DISKUZE Pro mikrobiologickou analýzu byly použity tři odrůdy - Pálava, Veltlínské zelené a Rulandské modré, u kterých se stanovoval: celkový počet mikroorganismů (CPM), bakterie mléčného kvašení (BMK), kvasinky (Kv) a plísně (Pl). Mikroorganismy byly stanovovány v jednotlivých krocích technologie výroby vína.  Analýza oplachu z bobulí Obrázek č. 1 zobrazuje počty mikroorganismů v oplachu z bobulí jednotlivých odrůd. Z obrázku je patrné, že nejvíce se vyskytovaly v oplachu kvasinky. Podobných hodnot kvasinek dosáhli ve svém výzkumu i Fleet et al. (2002), kteří stanovili počet buněk na 104 až 106 vztažených na 1 cm2 slupky bobule. Za nejrozšířenější kvasinku na povrchu bobulí můžeme označit Kloeckera apiculata, která představuje až 50 % všech kvasinek. Dalšími významně vyskytujícími rody jsou Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Hansenula, Issatchenkia, Kluyveromyces, Metschnikowia, Pichia a Rhodotorula. (Fugelsang, Edwards, 2007) Počet bakterií mléčného kvašení se řádově pohyboval okolo 102 KTJ/g, což se shoduje s tím, co uvedli ve své studii Lafon-Lafourcade et al. (1983), kteří prováděli oplach ze 100 g bobulí. Při sklizni se na hroznech Rulandského šedého nechávala ušlechtilá plíseň Botrytis cinerea, aby do vína přenesla charakteristické tόny. Proto je u této odrůdy zaznamenán vyšší počet plísní než u ostatních.

44

Obr. č. 1: Počty mikroorganismů v oplachu z bobulí jednotlivých odrůd Legenda: CPM = Celkový počet mikroorganismů, BMK = Bakterie mléčného kvašení, Kv = Kvasinky, Pl = Plísně

 Analýza moštu (samotok) Jelikož rmut je „živý“ materiál, dochází při jeho scezení a lisování k pomnožení mikroorganismů. To je vidět na obrázku č. 2. Kvasinky vyskytující se na hroznech se začínají množit a fermentovat cukry - začátek alkoholového kvašení. V raných fázích kvašení dochází k rozvoji nesaccharomycetních kvasinek a obsah nejtypičtější kvasinky pro fermentaci Saccharomyces cerevisiae je nižší než 102 KTJ/ml. (Fleet, 1993) Obsah kvasinek se pohyboval v rozmezí 105 až 106, což koreluje s výsledky, které zaznamenali Fleet a Querol (2006).

45

Obr. č. 2: Mikrobiální kvalita moštů jednotlivých odrůd Z hodnot odečtených z obrázku č. 2 je patrné, že již během lisování docházelo ke snížení množství bakterií mléčného kvašení. Obsah bakterií mléčného kvašení v moštu je obvykle 104 KTJ/ml. S nárůstem rozvoje kvasinek dochází ke snížení jejich výskytu až na 102 KTJ/ml. Pokles je zapříčiněn produkcí inhibičních látek kvasinkami (alkohol, SO2, mastné kyseliny se středně dlouhými řetězci, antibakteriální proteiny/peptidy) a rychlejším vyčerpáním živin potřebných k růstu bakterií mléčného kvašení. (Moreno-Arribas, Polo, 2008)  Analýza mladého vína po prokvašení - zasíření Pro dosáhnutí harmonických vín s příjemným aroma a dobrou tělnatostí se zakvášely mošty Pálavy a Veltlínského zeleného každý dvěma druhy kvasinek na podporu těchto dvou atributů. U Rulandského modrého se použila jedna komerční směs kvasinek. Začátek a konec kvašení - zasíření u jednotlivých odrůd je znázorněn v tabulce č. 4. Odběr vzorků pro analýzu mladých vín byl proveden v jeden den - 31.10.2013.

46

Tab. č. 4: Kvašení moštů Začátek kvašení

Konec kvašení - zasíření

Pá - Terra

5.10.2013

19.10.2013

Pá - Bouquet

5.10.2013

26.10.2013

VZ - Veltliner

12.10.2013

31.10.2013

VZ - F3

12.10.2013

26.10.2013

RM - Rosé

12.10.2013

26.10.2013

Legenda: Pá - Terra = Pálava - Terra, Pá - Bouquet = Pálava - Bouquet, VZ -Veltliner = Veltlínské zelené - Veltliner, VZ - F3 = Veltlínské zelené - F3, RM - Rosé = Rulandské modré - Rosé

Nejvyšších

hodnot

všech

mikroorganismů

dosahoval

vzorek

Veltlínské

zelené - Veltliner, což můžeme vidět na obrázku č. 3. Toto mladé víno bylo na rozdíl od ostatních vín zasířeno až v den odběru vzorku (viz. Tab. č. 4), proto má vyšší koncentrace mikroorganismů. Nicméně je patrné, že kvasinky se nacházely ve fázi odumírání, tedy na konci fermentace.

Obr. č. 3: Mikrobiální kvalita mladých vín po prokvašení - zasíření Aby se zabránilo mikrobiologickým vadám při finalizaci vína, bylo víno zasířeno v dostatečném množství (70 mg SO2/l) proti patogenním mikroorganismům včetně 47

bakteriím mléčného kvašení. Tudíž se neprováděla malolaktická - fermentace, která není typická pro moravská bílá vína. Navíc ročník 2013 nebyl charakteristický na tvorbu vysokého obsahu jablečné kyseliny. Z obrázku č. 3 je patrné, že došlo k poklesu plísní u všech vzorků mladých vín. Odpovědnost za tento děj nese oxid siřičitý, který má fungicidní účinek. (Hornsey, 2007)  Stáčení z hrubých kalů (po 1 hodině) Vzorky byly odebrány 1 hodinu po stáčení mladých vín. Výsledky, na obrázku č. 4, jsou rozkolísané, to přisuzujeme zvíření kalů. I přesto je vidět, že počty jednotlivých mikroorganismů klesly a výskyt plísní ve vínech je takřka 0 KTJ/ml. Vzorek Rulandského modrého - Rosé měl nulové hodnoty mikroorganismů, kromě CPM. To bylo způsobeno nedostatečným vypláchnutím vzorkovnice, která byla před odběrem sterilizována pomocí NaOH.

Obr. č. 4: Mikrobiální kvalita mladých vín 1 hodinu po 1. Stáčení

48

 Stáčení z hrubých kalů (po týdnu) Po týdnu od prvního stáčení byla provedena mikrobiologická analýza jednotlivých vzorků mladých vín. Výsledky jsou shrnuty v tabulce č. 5. Tab č. 5: Počet mikroorganismů po 1. stáčení - po týdnu [KTJ/ml] CPM

BMK

Kv

Pl

Pá - Terra

1

1

0

0

Pá - Bouquet

1

1

1

0

VZ - Veltliner

1

2

1

0

VZ - F3

7

1

4

0

RM - Rosé

1

1

0

0

U všech vzorků vín došlo ke značnému snížení počtu mikroorganismů oproti předchozímu rozboru - po 1 hodině od 1. stáčení. Pokles byl zapříčiněn tím, že se usadily zvířené jemné kaly a docházelo k prohlubující se autolýze buněk. Plísně nebyly detekovány vůbec a nejvíce narostla mikroflόra na vzorku Veltlínské zelené - F3.  2. Stáčení, čiření, scelení Během druhého stáčení se mladé víno zároveň čiřilo a scelovalo. Odběry vzorků byly provedeny jeden týden po stáčení. Jak ukazuje tabulka č. 6, nastala u všech vín ještě vyšší mikrobiální čistota než v předešlém kroku. Tab. č. 6: 2. stáčení, čiření, scelení [KTJ/ml] CPM

BMK

Kv

Pl

Pá

1

0

1

0

VZ

1

0

1

0

RM

1

1

1

0

 1. filtrace Tato filtrace je často nazývána jako hloubková. Z vína jsou odstraněny jemné kaly, vysrážené koloidní látky a dochází i k částečné redukci zbývající mikroflόry. (Pavloušek, 2010) Pόrovitost používaných filtrů je vyšší než 0,45 µm, což neumožňuje sterilitu vzhledem k rozměrům bakterií a kvasinek vyskytujících se ve víně. (Steidl, Schödl, 2002) To potvrzuje i odečtení 1 KTJ/ml u celkového počtu mikroorganismů vzorků Pálavy a Rulandského modrého v tabulce č. 7. 49

Tab. č. 7: 1. filtrace [KTJ/ml] CPM

BMK

Kv

Pl

Pá

1

0

0

0

VZ

0

0

0

0

RM

1

0

0

0

 2. filtrace Pro získání sterilního vína, tabulka č. 8, byla použita membránová filtrace (mikrosvíčka) o pόrovitosti 0,2 µm. Fugelsang, Edwards (2007) publikovali, že pokud mají být z vína odstraněny i bakterie, musí mít použitý filtr menší pόrovitost než 0,45 µm. Obdobných výsledků dosáhli Delfini et Formica (2001), kteří prokázali průchod bakterie Oenococcus oeni přes filtr o pórovitosti 0,45 µm. Tab. č. 8: 2. filtrace [KTJ/ml] CPM

BMK

Kv

Pl

Pá

0

0

0

0

VZ

0

0

0

0

RM

0

0

0

0

 Ročníky 2011 Ve vínech byly stanoveny pouze plísně, tabulka č. 9. Tyto plísně se do vína dostaly pravděpodobně až během lahvování nebo z korku, který je častým nositelem jejich spor. (Hornsey, 2007) Jak uvádí Jackson (2009), nejběžnějšími plísněmi napadající korek a následně víno jsou rody Penicillium a Aspergillus, které produkují senzoricky aktivní látku quajakol odpovědnou za nepříjemný pach po plísni. Tab. č. 9: Ročníky 2011 [KTJ/ml] CPM

BMK

Kv

Pl

Pá

0

0

0

0

VZ

0

0

0

1

RM

1

0

0

2

50

6 ZÁVĚR Náplní diplomové práce bylo stanovení celkového počtu mikroorganismů, bakterií mléčného kvašení, kvasinek a plísní v průběhu technologie výroby dvou bílých vín a jednoho růžového vína. Vzorky, ze kterých se vyráběla vína, pocházely z viniční obce Jaroslavice a jednalo se o odrůdy Pálava, Veltlínské zelené a Rulandské modré. Hrozny byly sklizeny v plné zralosti při cukernatosti 22,5° normovaného moštoměru. Pro kontrolu dobré hygieny lahvování a skladování vín byly provedeny tytéž rozbory u stejných odrůd z ročníku 2011. Ke stanovení počtu vybraných skupin mikroorganismů byla použita plotnová metoda. Zaočkované vzorky byly kultivovány v termostatu na příslušných živných půdách při odpovídající teplotě po daný čas. Na bobulích hroznů jednotlivých odrůd byl celkový počet mikroorganismů 104 KTJ/g. Již během odzrňování, macerace, scezení moštu a lisování dochází k intenzivnímu množení mikroorganismů a to hlavně kvasinek. Naopak snižuje se počet bakterií mléčného kvašení vlivem metabolitů produkovaných kvasinkami při fermentaci. Po prokvašení a zasíření mladých vín začal klesat celkový počet mikroorganismů u všech vzorků až na 0 KTJ/ml, kdy finální sterility bylo dosaženo filtrací přes filtr o pόrovitosti 0,2 µm. U ročníků 2011 byly ze vzorků odečteny pouze plísně a to pro odrůdu Rulandské modré. K této kontaminaci nejspíše došlo během lahvování nebo použitím korku obsahující spory plísní, které ve vhodných podmínkách vyklíčily. Jednotlivé vzorky, pro určitý technologický krok, se mezi sebou výrazně nelišily. To lze připisovat faktu, že všechny odrůdy pocházely z téhož vinohradu a byla na ně uplatněna stejná výrobní praxe. Z naměřených dat je zřejmé, že aplikovaná technologie výroby vede ke vzniku po mikrobiologické stránce bezproblémových vín. Rizikem pak může být sekundární kontaminace při lahvování vín.

51

7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY BARTOWSKY E. J., STOCKLEY C. S., 2011: Histamine in Australian wines–a survey between 1982 and 2009. Annals of mikrobiology. 61: 167-172 DOI: 10.1007/s13213010-0070-z. BOU M., BROWN N., COSTELLO P., DIETRICH W., GERTSEN-BRIAND S., KOLLAR S., KRIEGER S., KYNE A., LOUBSER P., MORENZONI R., PALACIOS A., POWELL CH., SPECHT K. S., SPECHT G., THEODORE D., VAN ZANDYCKE S., 2005: Malolactic fermentation in wine: understanding the science and the practice. Lallemand, Montréal, 170 s. ISBN 09-739-1470-X. DELFINI C., FORMICA J. V., 2001: Wine microbiology: science and technology. Marcel Dekker, New York, 490 s. ISBN 0-8247-0590-4. DOHNAL T., KRAUS V., PÁTEK J., 1975: Moderní vinař. Státní zemědělské nakladatelství, 1 vyd., Praha, 476 s. DOHNAL T., KRAUS V., 1972: Pěstování révy a zužitkování hroznů. Státní zemědělské nakladatelství, 2. vyd., Praha, 252 s. DU TOIT W. J., LAMBRECHTS M. G., 2002: The enumeration and identification of acetic acid bacteria from South African red wine fermentations. Int. J. Food Microbiol. 74: 57-64. EDER R., 2006: Vady vína. Národní vinařské centrum, 1. vyd., Valtice, 263 s. ISBN 80-903201-6-3. FARKAŠ J., 1983: Biotechnolόgia vína. Alfa, preprac. vyd., Bratislava, 978 s. FARKAŠ J., 1980: Technologie a biochemie vína. SNTL, Praha. FLEET G., 1993: Wine microbiology and biotechnology. Taylor and Francis, London, 510 s. ISBN 0-415-27850-3. FLEET G., QUEROL A., 2006: Yeasts in food and beverages. Springer, Berlín, 453 s. ISBN 3-540-28388-9. 52

FLEET G. H., BEH A. L., HEARD G. M., PRAKITCHAIWATTANA C., 2002: The yeast ecology of wine grapes. In: CIANI M., 2002: Biodiversity and biotechnology of wine yeasts. Trivandrum: Research Signpost, 123 s. ISBN 81-7736-120-1. FRÖHLICH J., KÖNIG H., UNDEN G., 2008: Biology of microorganisms on grapes, in must and wine. Springer, New York, 522 s. ISBN 978-3-540-85462-3. FUGELSANG K. C., EDWARDS CH. G., 2007: Wine microbiology.: practical applications and procedures. Springer, 2. vyd., New York, 393 s. ISBN 978-0-38733341-0. GAVORNÍK A., 1964: Spracovanie hrozna: učebný text pre stredné pol’nohospodárske technické školy odbor vinohradníctvo. Slovenské vydavatel’stvo pôdohospodárskej literatúry, Bratislava, 514 s. HOFMANN U., TRIOLI G., 2009: Kodex dobrého ekologického vinohradnictví. Svaz ekologické a integrované produkce vína Ekovín, Brno, 240 s. HORNSEY I. S., 2007: The chemistry and biology of winemaking. Royal Society of Chemistry, Cambridge, 457 s. ISBN 0-85404-2660. HRABĚ J., ROP O., 2009: Nealkoholické a alkoholické nápoje. Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, 1. vyd., Zlín, 129 s. ISBN 978-80-7318-748-4. HUBÁČEK V., 1997: Výroba révového vína. Institut výchovy a vzdělávání ministerstva zemědělství České republiky, 1. vyd., Praha, 40 s. ISBN 80-710-5140-3. HUTKINS R., 2006: Microbiology and technology of fermented foods. Blackwell, Oxford, 473 s. ISBN 0-8138-0018-8. JACKSON R.S., 2008: Wine science: principles and applications. Elsevier Acad. Press, 3. vyd., Burlington, 747 s. ISBN 978-0-12-373646-8. JACKSON R. S., 2009: Wine tasting: a professional handbook. Academic press, 2. vyd., Burlington, 487 s. ISBN 978-0-12-374181-3.

53

JACOBSON J. L., 2006: Introduction to wine laboratory practices and procedures. Springer, New York, 375 s. ISBN 978-0-387-24377-1. KOHOUT F., 1982: O víně. Merkur, 1. vyd., Praha, 218 s. KRAUS V., BALLÍK M., POSPÍŠILOVÁ L., VANEK G., 1999: Réva a víno v Čechách a na Moravě: Tradice a současnost. Radix, 1 vyd., Praha, 280 s. ISBN 8086031-23-3. KRAUS V., KOPEČEK J., 2002: Setkání s vínem. Radix, 1. vyd., Praha, 141 s. ISBN 80-86031-36-5. KRAUS V., ACKERMANN P., HUBÁČEK V., 2004: Rukověť vinaře. KVĚT, 1. vyd., Praha, 267 s. ISBN 80-209-0327-5. KUTTELVAŠER Z., 2003: Abeceda vína. Radix, 1. vyd., Praha, 279 s. ISBN 8086031-43-8. LAFON-LAFOURCADE S., JOYEUX A., 1981: Les Bactéries acétiques du vin. Bull. 608: 803-829. LAFON-LAFOURCADE S., CARRE E., RIBÉREAU-GAYON P., 1983: Occurrence of lactic acid bacteria during the different stages of vinification and conservation of wines. Applied and environmental microbiology, 46: 874-880. LAHTINEN S., OUWEHAND A. C., SALMINEN S., VON WRIGHT A., 2012: Lactic acid bacteria: microbiological and functional aspects. CRC Press, 4. vyd., Boca Raton, 779 s. ISBN 978-1-4398-3677-4. LUDVÍKOVÁ I., SEDLO J., ŠEVČÍK J., 2004: Přehled odrůd révy 2004. Svaz vinařů České republiky, Velké Pavlovice, 95 s. ISBN 80-903534-3-6. MALÍK F., 1996: Dobré víno. Polygrafia, 2. vyd., Bratislava, 341 s. ISBN 80-8878004-7. MARKELWINERY, 2008: Vinařství Markel. Databáze online [cit. 2014-4-3] Dostupná z: 54

http://www.markelwinery.cz/index.php?option=com_content&view=article&id=56&Ite mid=2 MICHLOVSKÝ M., 2012: Oxid siřičitý v enologii. Vinselekt Michlovský. 1. vyd., Rakvice, 151 s. ISBN 978-80-905319-0-1. MINÁRIK E., ŠVEJCAR V., 1981: Vinařství. Mikrobiologie hroznů a vína. Vysoká škola zemědělská, 2. vyd., Brno, 99 s. MINÁRIK E., NAVARA A., 1986: Chémia a mikrobiolόgia vína. Príroda, 1. vyd., Bratislava, 547 s. MORENO-ARRIBAS V. M., POLO C. M., 2008: Wine chemistry and biochemistry. Springer, 1. vyd., New York, 735 s. ISBN 978-0-387-74116-1. OTÁHAL K., 2010: Jak z hroznů víno dělat. Jonathan Livingston, Praha, 99 s. ISBN 978-80-86037-35-6. PÁTEK J., 2000: Zrození vína: všechno o zpracování hroznů, výrobě vína a jeho zrání. Jota, 2. vyd., Brno, 293 s. ISBN 80-7217-101-1. PÁTEK J. 2002: Víno je věčné. Jota, 1. vyd., Brno, 305 s. ISBN 80-7217-193-3. PAVLOUŠEK P., 2010: Výroba vína u malovinařů. Grada, 2. vyd., Praha, 120 s. ISBN 978-80-247-3487-3. RIBÉREAU-GAYON P., DUBOURDIEU D., DONÈCHE B., LONVAUD A., 2003: Handbook of enology. John Wiley & Sons, 2. vyd., Chichester, 404 s. ISBN 04-7001037-1 . RICHTER T., 2011: Hygienické standardy. Databáze online [cit. 2014-3-3] Dostupná z: http://www.ekovin.cz/sekce-ekologicke-produkce/hygienickestandardy?highlightWords=obecn%C3%A9+pojmy+hygieny SIMON J., 2002: O víně. Slovart, 1. vyd., Praha, 224 s. ISBN 80-720-9386-X.

55

STÁVEK J., 2013: Rosé: veselý i vážný vícebarevný svět vína. Radix, 1. vyd., Praha, 118 s. ISBN 978-80-87573-05-1. STEIDL R., LEINDL G., 2003: Zrání vína v sudech barrique. Národní salon vín, 1. vyd., Valtice, 71 s. ISBN 80-903201-1-2. STEIDL R., RENNER W., 2003: Moderní příprava červeného vína. Národní salon vín, 1. vyd., Valtice, 72 s. ISBN 80-903201-2-0. STEIDL R., RENNER W., 2004: Problémy kvašení vín. Národní salon vín, 1. vyd., Valtice, 74 s. ISBN 80-903201-3-9. STEIDL R., SCHÖDL H., 2002: Sklepní hospodářství. Národní salon vín, 1. vyd., Valtice, 307 s. ISBN 80-903201-0-4. STEVENSON T., 2005: The Sotheby’s wine encyclopedia. DK, 4. vyd., New York, 664 s. ISBN 07-566-1324-8. ŠILHÁNKOVÁ L., 2002: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Academia, 3. vyd., Praha, 363 s. ISBN 80-200-1024-6. VLKOVÁ E., KILLER J., RADA V., 2009: Potravinářská mikrobiologie. Česká zemědělská univerzita, 2. vyd., Praha, 168 s. ISBN 978-80-213-1988-2. ZÁKON č. 321/2004 Sb., o vinohradnictví a vinařství a o změně některých souvisejících zákonů (zákon o vinohradnictví a vinařství).

56

8 SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ 8.1 Seznam tabulek Tab. č. 1: Nejčastější druhy kvasinek podílejících se na kvašení Tab. č. 2: Vzájemný vztah mezi absolutní čirostí a hodnotami turbidity Tab č. 3: Metabolismus cukrů BMK Tab č. 4: Kvašení moštů Tab č. 5: Počet mikroorganismů po 1. stáčení - po týdnu [KTJ/ml] Tab. č. 6: 2. stáčení, čiření, scelení [KTJ/ml] Tab. č. 7: 1. filtrace [KTJ/ml] Tab. č. 8: 2. filtrace [KTJ/ml] Tab. č. 9: Ročníky 2011 [KTJ/ml]

8.2 Seznam obrázků Obr. č. 1: Počty mikroorganismů v oplachu z bobulí jednotlivých odrůd Obr. č. 2: Mikrobiální kvalita moštů jednotlivých odrůd Obr. č. 3: Mikrobiální kvalita mladých vín po prokvašení - zasíření Obr. č. 4: Mikrobiální kvalita mladých vín 1 hodinu po 1. Stáčení

57