3 TECHNICKÁ MIKROBIOLOGIE

3 TECHNICKÁ MIKROBIOLOGIE V této kapitole se seznámíme s řešením praktických úkolů technické mikrobiologie, tzn. využití mikroorganismů buď jako producentů některých, z průmyslového hlediska využitelných metabolitů (produkce etanolu, enzymů apod.) nebo přípravu mikrobiální biomasy samotné.

Obsah kapitoly: 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 3.3.6 3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.4

Základní pojmy Růstová křivka mikroorganizmů Matematický popis růstové křivky Specifická růstová rychlost Typy kultivací Modelování mikrobiologických procesů Růst mikroorganizmů Odumírání mikroorganizmů Spotřeba substrátu a tvorba produktu Sterilace teplem Modelování spotřeby kyslíku Modelování tvorby bioplynu Úlohy Výroba krmných bílkovin kultivací na metanolu Vsádková sterilace zápary Sterilace uzenin Interakce mikroorganizmů ve směsných kulturách

3.1 Základní pojmy Než přistoupíme k řešení konkrétních příkladů je třeba si zopakovat některé zásady kinetiky růstu mikroorganismů, které jsou pro to nezbytné. Jedná se o popis růstové křivky, možnosti matematického vyjádření jejího průběhu a specifickou růstovou rychlost. Výklad je stručný, podrobnější informace lze nalézt v literatuře.

3.1.1 Růstová křivka mikroorganismů Pro analýzu růstu mikrobiální populace je základní modelovou situací růst čisté kultury v uzavřeném, uměle připraveném homogenním prostředí, které obsahuje nadbytek živin. Růst mikroorganismů lze vyjádřit růstovou křivkou (na obrázku vpravo). Charakter této křivky je ovlivněn řadou faktorů, které budou definovány dále. Jestliže se buňky dostanou do kontaktu se substrátem, kterého mohou využívat pro svůj růst, začnou se rozmnožovat svým typickým způsobem: bakterie dělením, kvasinky pučením. Znamená to, že z jedné buňky vzniknou dvě, z těchto dvou buněk následujícím dělením čtyři atd. Takto proces dělení

pokračuje dále pokud trvají přiznivé podmínky (koncentrace živin, přítomnost kyslíku, pH, teplota apod.). Rychlost dělení na těchto podmínkách závisí a pro některé skupiny bakterií to znamená, že za příznivých podmínek dochází k takovému dělení každých 20 minut.Jednoduchou matematickou úvahou zjistíme, že při takové rychlosti dělení jedna buňka za běžnou pracovní dobu 8 hodin růstu dá vznik více než 16 milionů buněk. Takovýto růst označujeme jako exponenciální nebo logaritmický (log). Takto rychlý růst mikroorganismů však nenastává okamžitě po přenosu buněk do prostředí bohatého na živiny. Bezprostředně po přenosu do čerstvého média se buňky nedělí, ale pouze se adaptují na nové podmínky a postupně přijímají živiny z prostředí. Tato fáze růstu se nazývá lag fáze. Je charakterizována tím, že počet buněk během ní nestoupá, ale zůstává stejný. Délka lag fáze je proměnlivá a je ovlivněna řadou faktorů jako jsou podmínky, ve kterých buňky žily před tím, množství biomasy, která byla přenesena, teplota, typ substrátu apod. Po ukončení lag fáze se mikroorganizmy začínají dělit a nastupuje již zmíněná exponenciální (logaritmická) fáze růstu. V této fázi je závislost logaritmu množství mikroorganizmů (počtu buněk) v jednotkovém objemu na čase lineární.(obrázek vpravo).Znamená to, že každá buňka v populaci se dělí stejnou rychlostí a všechny nově vzniklé buňky mají stejnou velikost. Růstová rychlost je stálá a počet buněk stoupá. Po určité době takového růstu dochází ke změnám v prostředí. Ubývá živin, hromadí se reakční zplodiny, které mohou inhibovat růst mikroorganismů, a stoupá počet buněk na jednotku objemu. Všechny tyto změny mají za následek snížení růstové rychlosti, přičemž množství buněk vzniklých za jednotku času klesá. Populace buněk se dostává do další fáze růstu – stacionární fáze. Během této fáze je počet živých buněk ve sledované populaci stálý. Délka stacionární fáze u mikroorganismů je různá a závisí na jejich citlivosti k hladovění. Během této fáze dochází u sporotvorných rodů bakterií ke tvorbě endospor. Teprve, když začne docházet k úbytku počtu živých buněk, nastupuje fáze odumírání. Z předcházejícího textu jasně vyplývá, že při růstu mikroorganismů rozeznáváme 4 hlavní fáze: • lag fázi, • log fázi, • stacionární fázi, • fázi odumírání. Jejich délka je závislá na řadě faktorů, jako jsou koncentrace živin, přítomnost kyslíku, pH, teplota apod.

3.1.2 Matematický popis růstové křivky Jak bylo řečeno výše, růstová křivka má čtyři fáze (lag-fáze, exponenciální fáze, stacionární fáze a fáze odumírání). Matematické modely růstových křivek jsou obvykle formulovány jen pro fázi exponenciální a přechod do fáze stacionární (pro časový interval kdy růst není nulový). Doby trvání lag fáze a stacionární fáze, kdy je růst nulový, a stejně tak i fáze odumírání nebývají

v modelech zahrnuty. Matematický model růstu a množení mikroorganismů může být deterministický nebo stochastický. Deterministické matematické modely jsou jednodušší a používají se častěji. Deterministický model Deterministický model vychází ze spojitosti růstové křivky a používá analytický způsob vyjádření funkčních závislostí, diferenciálních rovnic a reakční kinetiky. Pro biotechnologie je nejdůležitější část křivky odpovídající exponenciálnímu růstu, protože je to oblast nejvyšší produktivity mikroorganizmů. Dynamiku jejich růstu tu obvykle modelujeme rovnicí pro kinetiku chemické reakce 1.řádu, kde jako rychlostní konstanta vystupuje specifická růstová rychlost. Podrobněji bude problematika probrána v kapitole 3.3 Modelování mikrobiologických procesů. Stochastický model Stochastický model odvozuje chování populace z chování jedince. Zahrnuje v sobě veličiny náhodné, charakterizované na základě pravděpodobnosti. Je to posloupnost za sebou jdoucích výsledků, z nichž každý je odvozen z předcházejícího.Rozdíly mezi oběma přístupy prakticky mizí v tak četné populaci jako je mikrobiální, tj. zhruba 106 – 109 buněk/ml. Formálně matematicky přechází stochastický model v model deterministický pro limitní situaci, tj. pro nekonečně velký počet jedinců a pro pravděpodobnost růstu a dělení P=1. Souhrnně lze říci, že matematický model celé růstové křivky nelze formulovat. Neexistují žádné definovatelné vztahy mezi parametry sousedních fází. Nelze ani zahrnout do matematického popisu přechody mezi jednotlivými fázemi. Nejužší vztah existuje mezi fází exponenciální a stacionární. Při popisu růstové křivky se vychází z geometrické řady (z 1 buňky vznikají 2, ze dvou 4 atp.), dále pak z faktu, že doba potřebná ke zdvojení mikrobiální populace T je konstantní a nezávisí na počtu buněk. Tyto skutečnosti vedou k základnímu obecnému závěru: v čase t = nT je počet mikroorganizmů X = X0 2n

(n je počet generací)

Počet mikroorganizmů v rostoucí kultuře je tedy exponenciální funkcí času. Čas T se nazývá generační doba.

3.1.3 Specifická růstová rychlost Základním parametrem při sledování kinetiky mikroorganizmů je specifická růstová rychlost. Pro exponenciální růst lze její střední hodnotu za dobu t definovat vztahem

Lze říci, že specifická růstová rychlost µ je pro každý mikroorganizmus, typ výživného média a způsob kultivace odlišná. Její hodnota je dána vnitřními faktory, tj. vlastními růstovými schopnostmi mikroorganismu, vnitřními limity jeho růstu, které jsou určené genetickým vybavením buňky. Vedle vnitřních faktorů je specifická růstová rychlost limitována i faktory vnějšími, t.j. prostředím, ve kterém se mikroorganizmy množí. Jejich vymezení je značně široké, neboť zahrnuje jak základní zdroje výživy (uhlík, dusík, fosfor, síra), tak i další potřebné prvky (Mg, Mn, Zn, K), ale také aciditu prostředí (pH), osmotické podmínky a množství kyslíku rozpuštěného v médiu. Z toho vyplývá, že specifická růstová rychlost není v průběhu celého růstu konstantní. S klesající koncentrací živin klesá. Ovšem pokles prakticky konstantní

maximální hodnoty µmax k hodnotě nulové je velmi rychlý. Proběhne během několika minut, takže je těžko podrobně sledovatelný. Díky tomu předchází růstová křivka (přímka) z exponenciální fáze do stacionární ostře během několika minut, ale nicméně plynule. Růst a množení bakteriální populace v tekuté kultuře lze sledovat pomocí dvou základních parametrů: •

koncentrace biomasy (nebo některé její komponenty),

•

koncentrace buněk.

Obě tyto veličiny jsou v podstatě samostatné a nezávislé a obecně nelze odvodit z jedné druhou. Koncentrace biomasy, kterou lze např. vyjádřit sušinou nebo obsahem bílkovin, vystihuje především růst buněk a mění se spojitě s časem. Koncentrace buněk je především odrazem dělení a množení buněk a v principu se mění s časem nespojitě, protože může nabývat jen celočíselných hodnot. Při měření růstu a množení bakteriální populace najednou oběma parametry dostáváme dvě křivky, které jsou na vodorovné ose časově posunuty, protože buňka nejdříve roste a potom se dělí. Množství vytvořené biomasy je přímo úměrné množství spotřebované živiny, konstanta úměrnosti Y je tzv. růstový výtěžek. Rychlost spotřeby živin je přímo úměrná koncentraci biomasy, konstanta úměrnosti q je tzv. specifická metabolická rychlost. Aktuální hodnoty Y a q jsou za různých okolností různé. Informují o změnách vyvolaných ve fyziologii bakteriální buňky změnami podmínek růstu. Běžně používané vztahy pro rychlost růstu mikroorganizmů, specifickou růstovou rychlost, spotřebu živin, tvorbu produktu apod. jsou uvedeny v kap. 3.3.

3.2 Typy kultivací V zásadě rozeznáváme tři základní typy kultivací: •

•

•

vsádkovou kultivaci, kdy se během kultivace do systému nepřidávají žádné živiny a sama kultivace probíhá až do jejich vyčerpání, přítokovou kultivaci ("fed-batch"), kdy se na začátku naplní fermentor určitým množstvím kultivačního média a zbytek substrátu pak přitéká do systému postupně nebo konstantní rychlostí, průtokovou neboli kontinuální kultivaci, která spočívá v nepřetržitém pomalém přítoku živin do systému za současného nepřetržitého odebírání kultivačního media, čímž je zajištěn dostatek živin po celou dobu kultivace a současně se naředí i eventuální nepříznivé metabolity inhibující růst mikroorganismů.

Z technologického hlediska je nejvýhodnější co nejvíce prodloužit logaritmickou fázi růstu mikroorganismů, což se děje právě při kontinuální kultivaci. Hlavním parametrem charakterizujícím kontinuální kultivaci je tzv. zřeďovací rychlost D, která je definována vztahem (3.2.-1) kde F je objemový přítok živin a V objem kultury ve fermentoru. Zřeďovací rychlost má rozměr čas-1 a její převrácená hodnota se nazývá dobou zdržení. Udává dobu, za kterou se vymění celý objem kultury.

Při konstantním objemu kultury ve fermentoru odtéká část buněk a média stejným průtokem, jako přitékají živiny. Jestliže provedeme jednoduchou bilanci množství biomasy za jednotku času, tak dostanene, že změna obsahu biomasy v kultuře je dána vztahem (3.2.-2) Znamená to, že při příliš velké zřeďovací rychlosti bude obsah biomasy ve fermentoru klesat (fermentor se vyplavuje), při příliš malé zřeďovací rychlosti zase nebude v kultuře dostatek živin a růst se bude zpomalovat. Ideální stav je tehdy, když X bude nulové, tedy  = D. Tohoto rovnovážného stavu lze dosáhnout dvojím způsobem vedení kontinuální kultivace: •

•

v režimu turbidistat dodáváme nadbytek živin a kultura roste maximální rychlostí; zřeďovací rychlost mírně kolísá kolem hodnoty maximální specifické růstové rychlosti, v režimu chemostat je rychlost růstu limitována koncentrací jedné živiny; zřeďovací rychlost je menší než maximální specifická růstová rychlost.

Turbidistat je náročný na řízení, protože se musí průběžně sledovat počet buněk a podle jejich koncentrace zvyšovat či snižovat zřeďovací rychlost. Protože se používá vysokých zřeďovacích rychlostí, hrozí nebezpečí vyplavení fermentoru. V chemostatu se po určité době ustaví rovnovážný stav a v prostředí je určitá koncentrace buněk. Při selekci buněk s vyšší specifickou růstovou rychlostí  počet buněk stoupne a současně klesne koncentrace limitující živiny v systému, v důsledku toho klesne  a opět se utvoří rovnováha, ovšem při jiné koncentraci buněk a limitující živiny. Tento princip je podstatou tzv. samoregulační schopnosti kontinuální kultury. V průmyslových podmínkách se většinou za limitující živinu volí zdroj uhlíku. Limitace však může být prováděna množstvím dusíku, fosforu nebo kyslíku. Buňky stejného mikroorganismu se stejnou  limitované různou živinou jsou v odlišném fysiologickém stavu. Uspořádání kontinuální kultivace může být různé: • homokontinuální kultivace kultura má díky intenzivnímu míchání stejné složení v celém systému; lze ji dále dělit podle uspořádání na jednostupňovou nebo vícestupňovou, • heterokontinuální kultivace kultura je prostorově různorodá (např. u turbuálního uspořádání). V potravinářských technologiích se kontinuálních kultivací s výhodou využívá pro produkci droždí, lihu a piva, protože značně urychlují celý proces výroby.

3.3 Modelování mikrobiologických procesů Mikrobiologické procesy se velmi obtížně exaktně matematicky popisují, protože se jedná o živou hmotu a není možné postihnout všechny vlivy, které na proces působí. Modely, se kterými budeme pracovat, jsou proto značně zjednodušené. V praxi obvykle stačí, když model vystihuje podstatné vlastnosti a podstatné rysy chování procesu a takový model je pro analýzu, studium vlivu parametrů a predikci průběhu procesu velmi užitečný. V této kapitole jsou popsány základní přístupy k modelování • růstu mikroorganizmů, • přirozeného odumírání mikroorganizmů, • spotřeby substrátu a tvorby produktu,

procesu sterilace teplem. Jsou uváděny vztahy, které jsou víceméně obecně platné, ale pro řadu procesů byly formulovány empirické vztahy, které dobře vystihují jejich podstatu a průběh. Proto je vhodné se v konkrétním případě vždy informovat v literatuře. •

3.3.1 Modelování růstu mikroorganismů I když je růst mikroorganizmů složitý proces závisející na celé řadě vlivů, lze jej dobře popsat poměrně jednoduchými modely. Nejčastěji se opět vychází z analogie s chemickou reakcí, konkrétně z kinetiky 1.řádu (3.3.-1) kde X je koncentrace mikroorganizmů (biomasy) a  je specifická růstová rychlost. Specifická růstová rychlost je konstantní pouze při tzv. nelimitovaném růstu, jinak se obvykle během procesu mění v závislosti na koncentraci substrátu, produktu, inhibitorů apod., ale také na podmínkách kultivace. Pro její vyjádření existuje celá řada vztahů. Většina z nich vychází z tzv. Monodovy rovnice: (3.3.-2) kde  max je maximální specifická růstová rychlost pro daný mikroorganizmus, S je koncentrace živin (substrátu) a KS je tzv. saturační konstanta, jejíž hodnota odpovídá koncentraci substrátu, při které je specifická růstová rychlost  právě rovna polovině své maximální hodnoty  max. Saturační konstanta je mírou afinity mokroorganizmu k živině – čím je KS menší, tím je afinita větší. Monodova rovnice popisuje růst v tzv. exponenciální fázi a nezahrnuje inhibici. Jestliže je třeba inhibici brát v úvahu, platí pro specifickou růstovou rychlost modifikovaná Monodova rovnice, a to:

•

pro inhibici substrátem (jeho vysokou koncentrací):

(3.3.-3)

• •

kde KI je inhibiční konstanta, pro inhibici produktem (jeho vysokou koncentrací): (3.3.-4)

kde P je koncentrace produktu. Modifikované Monodovy rovnice se rovněž používá pro vyjádření specifické růstové rychlosti ve složitějších mechanizmech fermentace: • vliv dvou různých substrátů:

(3.3.-5) •

vliv diauxie, tj. kdy druhý substrát je využíván až po vyčerpání prvého substrátu (např. glukosa – laktosa), což je matematicky vyjádřeno inhibicí zpracování substrátu 2 vysokou koncentrací substrátu 1):

(3.3.-6)

•

vliv počáteční koncentrace substrátu S0: (3.3.-7)

•

vliv difuze v systémech využívajících flokulující nebo imobilizované buňky, či enzymy (tzv. Contoisova rovnice): (3.3.-8)

Specifická růstová rychlost se někdy vyjadřuje i jinak než modifikovanou Monodovou rovnicí: •

Teisserova rovnice: (3.3.-9)

•

logistická rovnice: (3.3.-10)

kde a, b jsou konstanty. Umožňuje popis fáze exponenciálního růstu a při dosažení určité koncentrace biomasy udržování její koncentrace na konstantní hladině, což je vhodné pro systémy se zádrží biomasy, např. membránový bioreaktor.

3.3.2 Modelování přirozeného odumírání mikroorganismů Kromě růstu mikroorganizmů dochází při kultivaci i k jejich přirozenému odumírání, a to jak stářím, tak v důsledku nedostatečného přísunu živin či přítomnosti toxických látek. Tento proces se opět nejčastěji modeluje kinetikou 1.řádu, takže pro rychlost odumírání mikroorganizmů rd lze použít vztahu (3.3.-11) kde kd je koeficient odumírání, obvykle konstanta. Při fermentacích s vysokou koncentrací biomasy dochází ke zvýšenému odumírání mikroorganizmů právě v důsledku jejich vysoké koncentrace. Pro tento případ se pro koeficient odumírání může použít vztahu (3.3.-12) kde Xmax je mezní koncentrace mikroorganizmů. Tento vztah zajistí, že pro X  Xmax se rychlost růstu a odumírání vyrovnávají.

Celkový vztah pro růst i odumírání vznikne spojením rovnic (3.3.-1) a (3.3.-11):

3.3.3 Modelování spotřeby substrátu a tvorby produktu Spotřeba substrátu a tvorba produktu při fermentaci jsou dány stechiometrií procesu a jejich rychlost souvisí s rychlostí růstu mikroorganizmů. Pro vyjádření stechiometrických vztahů se používá tzv. výtěžnostních koeficientů. Výtěžnostní koeficient biomasy ze substrátu YX/S (množství biomasy vyrostlé z jednotkového množství substrátu) a výtěžnostní koeficient produktu ze substrátu YP/S (množství produktu vzniklé fermentací z jednotkového množství substrátu) jsou definovány vztahy (3.3.-14) (3.3.-15) Vztah mezi rychlostí růstu biomasy a rychlostí spotřeby substrátu pak bude (3.3.-16) a vztah mezi rychlostí spotřeby substrátu a rychlostí tvorby produktu bude (3.3.-17) Při přesnějších modelech je třeba brát v úvahu i tu skutečnost, že mikroorganizmy potřebují určité množství substrátu k zachování životaschopnosti i tehdy, když nerostou (“maintenance” proces). Tato spotřeba se vyjadřuje pomocí tzv. maintenance faktoru m a rovnice (3.3.-16) doplněná o spotřebu substrátu na udržení života bude pak mít tvar (3.3.-18) Pro modelování tvorby produktu se také často využívá tzv. Luedeking-Piretovy rovnice, která je univerzální a vystihuje i situaci, kdy mikroorganizmy vytvářejí produkt i když nerostou (3.3.-19) První člen v závorce vyjadřuje tvorbu produktu při růstu a druhý tehdy, když mikroorganizmy nerostou, rP je rychlost tvorby produktu, YX/P je výtěžnostní koeficient vyjadřující stechiometrický vztah mezi růstem biomasy a tvorbou produktu a b je koeficient vyjadřující tvorbu produktu biomasou za nerůstových podmínek. V obecném případě YX/P a b nejsou konstanty, ale jsou funkcemi koncentrace substrátu nebo produktu. Někdy (např. když nedokážeme parametry rovnice (2.3.-19) stanovit jednotlivě) se obsah závorky shrnuje do jednoho koeficientu qP, takže rychlost tvorby produktu je vyjádřena vztahem (3.3.-20)

kde hodnota qP závisí na stavu kultury a koncentraci produktu a substrátu.

3.3.4. Modelování procesu sterilace Sterilací rozumíme inaktivaci mikroorganizmů teplem, zářením nebo chemickými látkami. Nejčastějším způsobem je sterilace teplem. Rychlost procesu se modeluje pomocí kinetiky 1.řádu, takže je-li N počet mikroorganizmů resp. X jejich koncentrace, pak je průběh sterilace dán vztahy (3.3.-21) (3.3.-22) Specifické koeficienty inaktivace kSN resp. kSX jsou obecně funkcemi teploty popřípadě jiných sterilaci ovlivňujících faktorů.

3.3.5. Modelování spotřeby kyslíku Modelování spotřeby kyslíku u aerobních fermentací vychází z hmotnostní bilance rozpuštěného kyslíku. Výsledná rovnice popisující rychlost změny koncentrace rozpuštěného kyslíku v dostatečně provzdušňovaném médiu v důsledku jeho spotřeby mikroorganizmy je (3.3.-23) kde jsou c ... koncentrace rozpuštěného kyslíku c* ... koncentrace rozpuštěného kyslíku při saturaci za daných podmínek Kla...koeficient přestupu rozpuštěného kyslíku (zahrnuje v sobě i plochu výměny kyslíku, protože ta se nedá stanovit) R ... rychlost spotřeby rozpuštěného kyslíku daným mikroorganismem (biomasou) X ... koncentrace mikroorganismu (biomasy) Jestliže přestaneme médium provzdušňovat, spotřebovávají mikroorganizmy zbylý kyslík až do jeho vyčerpání. V rovnici pro rychlost spotřeby odpadne druhý člen, takže bude mít tvar (3.3.-24)

3.3.6 Modelování tvorby bioplynu Při některých fermentačních procesech dochází k vytváření plynných produktů. Typickým případem je tvorba metanu při anaerobním odbourávání organických látek (hnití). Rychlost tvorby plynu souvisí přímo úměrně s rychlostí biodegradace organických substrátů, tedy

(3.3.-25) kde jsou B ... množství vytvořeného bioplynu,

S ... množství substrátu, YB/S...výtěžnostní koeficient bioplynu ze substrátu, kB ... konstanta úměrnosti.

Substrátem bývá obvykle nějaký organický polutant, který je pro mikroorganizmy zdrojem uhlíku. Množství degradovaného polutantu je závislé na množství mikroorganizmů. Matematicky je popisujeme pomocí kinetiky 1. řádu, přičemž specifická rychlost odbourávání polutantu rS je úměrná jeho koncentraci (3.3.-26) kde je kS ... rychlostní konstanta odbourávání (má rozměr koncentrace-1.čas-1).

3.4. Úlohy ke kapitole TECHNICKÁ MIKROBIOLOGIE

Seznam úloh: 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.4

Výroba krmných bílkovin kultivací na metanolu - chemostat Vsádková sterilace zápary Sterilace uzenin Interakce mikroorganizmů ve směsných kulturách

Úloha 3.4.1 Výroba krmných bílkovin kultivací na metanolu - chemostat Příprava krmných bílkovin z kvasničné biomasy kultivované na metanolu jako zdroji uhlíku byla v 70-tých letech jedním z nejatraktivnijších biotechnologických procesů vzhledem k vysoké rentabilitě dané cenou metanolu. Výtěžnost (YX/S) byla pro kvasinky Candida boidinii co do hmotnosti získané sušiny biomasy z jednotky hmotnosti metanolu 40 % (M.Reuss a spol. Chem.Ing.Technik 46,669,1974). Jeffris R.P. a spol. publikovali (AFCET Meeting, 12.-13.5.1975, Paříž), že pro specifickou růstovou rychlost je třeba uvažovat inhibici substrátem, kde parametry mají tyto číselné hodnoty: max = 0.2 h-1 , KS = 0.55 g/l , KI =16.4 g/l (rozměr  v rychlostním vztahu je [h-1] a S [g/l]). Vytvořte matematický model chemostatu, ve kterém probíhá výše popsaná fermentace. Počáteční koncentrace substrátu ve fermentoru je S0 =10 g/l a biomasy X0 =0.1 g/l. Chemostat startuje jako vsádková kultivace a při dosažení určité mezní koncentrace biomasy (XM = 3 g/l) se začne dávkovat roztok substrátu o koncentraci Sp = 25 g/l určenou zřeďovací rychlostí D = 0.08 h-1. Zároveň se stejným průtokem odvádí z fermentoru médium obsahující biomasu a nevyužitý substrát. Sledujte časovou závislost koncentrace biomasy X a substrátu S ve fermentoru a v odtékajícím roztoku. Sledujte také časový průběh růstové rychlosti  v průběhu kultivace. Úkoly:

1. Sestavte tabulku hodnot koncentrace biomasy a zbytkového substrátu v ustálených stavech chemostatu v závislosti na zřeďovací rychlosti D (0.025, 0.05, 0.075, ...). Zjistěte, při jaké zřeďovací rychlosti dojde k tzv. vyplavení chemostatu. 2. Sledujte chování chemostatu vzhledem k začátku dávkování substrátu. Volte počátek přítoku při různé mezní koncentraci biomasy XM (2, 3 a 4 g/l). 3. Simulujte vliv různé koncentrace substrátu v médiu (v rozmezí 5 - 50 g/l ) na průběh kontinuální kultivace. 4. Určete minimální dobu, za kterou mikrobiální kultura v chemostatu dospěje do ustáleného stavu (max. velikost odchylky parametrů S, X,  od ustálených hodnot v čase t by neměla být větší než 5%). Ukázka výsledků

S ... koncentrace substrátu, X ... koncentrace biomasy, D ... zřeďovací rychlost, mi ... růstová rychlost, čas v hodinách

Úloha 3.4.2 Vsádková sterilace zápary Při zkouškách nové technologie kontinuálního kvašení melasové zápary s recyklem buněk je nutno mít k dispozici dostatek sterilního média (jeho spotřeba bude 100 l/h). Po naředění melasy vodou z kondenzátu na koncentraci cukru 150-200 g/l (hustota 1100 kg/m3) se mikrobiologickým rozborem zjistilo, že zápara obsahuje cca 105 živých buněk kontaminujících mikroorganismů v 1 ml. Pro zajištění dlouhodobého provozu bioreaktoru je nezbytné, aby množství nežádoucích mikroorganismu v zápaře bylo pod hodnotou 10 živých buněk / ml. Pro sterilizaci máme k dispozici míchaný nerezový tank s aseptickými armaturami a expanzním ventilem. Pracovní objem tanku je 2 m3 a jeho vlastní hmotnost je 950 kg. Tank je vybaven chladicím duplikátorem a možností neregulovaného přímého ohřevu vsádky ostrou parou s maximálním příkonem 600 kg páry/h. Teplota zápary nesmí překročit 92 °C, aby nebyly denaturovány organické látky nezbytné pro růst kvasinek. Teplota melasové zápary po

naředění kondenzátem před sterilizací je 20 °C, po ukončení sterilace se před zaočkováním musí ochladit na 35 °C. Vstupní teplota chladicí vody je 15 °C a její průtok při plně otevřeném kohoutu je 100 l/min. Výparné teplo páry je 2370 kJ/kg, měrné teplo zápary a chladicí vody je pro náš případ možno považovat za konstantní a rovné 4.2 kJ.kg-1.K-1. Měrné teplo konstrukční oceli sterilačního tanku je 0.5 kJ.kg-1.K-1. Konstanta charakterizující rychlost denaturace buněk kontaminujících mikroorganismů má pro teplotu 65 °C hodnotu 0, pro 80 °C hodnotu 0.2 min-1 a pro 95 °C hodnotu 0.5 min-1. Závislost hodnoty této konstanty na teplotě lze v uvedených intervalech interpolovat lineárně. Úkoly: 1. Odvoďte matematický model procesu sterilace a simulujte její pruběh. 2. Navrhněte vhodný časový režim ohřevu a chlazení. 3. Upravte časový režim pomocí optimalizace tak, aby bylo v co nejkratším čase dosaženo žádaného stupni sterility a ochlazení zápary na fermentační teplotu. 4. Simulujte pruběh sterilace při maximální sterilační teplotě 85 °C. 5. Vyzkoušejte vliv teploty chladicí vody na dobu sterilace (v letních měsících může dosahovat až 22 °C). Návod k řešení: a. Odumírání buněk při sterilaci modelujte jako chemickou reakci 1.řádu pro počet buněk. b. Při entalpické bilanci zanedbejte ztráty tepla do okolí. c. Pro řízení ohřevu a chlazení použijte logických operací, které zajistí, že: -- teplota sterilace nepřekročí stanovenou hodnotu, -- chlazení bude zapnuto ve stanovenou dobu tchl od začátku procesu, -- chlazení nebude zapnuto současně s ohřevem. d. Jako kritéria pro optimalizaci použijte doby potřebné k dosažení stavu kdy teplota T<35°C a zároveň počet živých mikroorganizmů N<10 buněk v 1 ml ; odhad doby tchl v níž má být spuštěno chlazení určete opakováním simulace s různou dobou počátku chlazení. Ukázka výsledků

N ... počet živých buněk, T ... teplota, k ... rychlostní konstanta denaturace, konec ... indikace dosažení koncových podmínek sterilace, čas v minutách

Úloha 3.4.3 Modelování sterilace uzenin Vytvořte matematický model sterilace boloňských párků při použití elektrického teplovzdušného sterilizátoru a teplotně rezistentních mikroorganismů Enteroccocus faecium. Konec sterilace nastane v okamžiku, kdy množství živých mikroorganismů na jednotku objemu poklesne pod stanovenou hodnotu. Návod k řešení: Tepelnou bilancí lze získat rovnici pro teplotu v závislosti na čase a na souřadnici, kterou je vzdálenost od středu párku (za předpokladu, že produkt má tvar nekonečného válce). Uvažujte následující rovnici, která je převzata z B.Zanoni, C.Peri, C.Garzaroli, S.Pierucci: A Dynamic Mathematical Model of the Thermal Inactivation of Enterococcus faecium during Bologna Sausage Cooking, Lebensmittel-Wissenschaft-und-Technologie, vol.30 (1997), No.7, p.727-734. Předpokládá se, že produkt je co do hodnot fyzikálních parametrů homogenní a co do geometrického tvaru osově symetrický.

kde x je vzdálenost od středu párku, význam ostatních symbolů je zřejmý z tabulky. Rovnice inaktivace mikroorganismů je dána kinetikou 1. řádu, kde specifický koeficient inaktivace k je závislý na teplotě podle Arrheniova vztahu:

Teplota v jednotlivých bodech materiálu tak určuje intenzitu sterilace prostřednictvím této teplotní závislosti koeficientu k. Model řešte metodou přímek. Počet uzlů sítě volte dle možností simulačního programu. Úkoly: 1) Doplňte uvedené rovnice o příslušné počáteční a okrajové podmínky, přičemž vycházejte z toho, že teplota ve všech bodech párku je na počátku stejná, okrajová podmínka pro osu válce (párku) v důsledku symetrie teplotního pole vyjadřuje, že je teplota v tomto bodě minimální. U povrchu předpokládejte nejjednodušší situaci, tj. že koeficient přestupu tepla je nekonečně velký, takže teplota povrchu párku se v libovolném čase rovná teplotě okolí. 2) Uvažujte variantu, kdy se teplotní režim mění s časem následovně: první hodinu probíhá sterilace při teplotě 55°C, druhou hodinu při teplotě 65°C a na závěr při teplotě 75°C až do konce procesu. Hodnoty konstant: teplotní vodivost hustota tepelná kapacita poloměr válce (párku) počáteční teplota teplota sterilace konstanta Arrheniovy rovnice aktivační energie univerzální plynová konstanta počáteční počet mikroorganismů

  cp r Tpoc Tokoli k0 E R N0

1,3 990 3349 0,05 10,5 65 2,37.1044 302 8,314 107

Ukázka výsledků: Simulace sterilace boloňských párků teplem (při teplotě 65°C)

W.m-1.K-1 kg.m-3 J.kg-1 m °C °C s-1 kJ.mol-1 J.mol-1.K-1 1

Ni ... počty živých mikroorganizmů (N0 u povrchu, N5 ve středu); čas v sekundách

Úloha 3.4.4 Interakce mikroorganizmů ve směsných kulturách (model "lovec - kořist", "Prey - Predator") V chemostatu je kultivována směsná populace dvou mikroorganismů, jejichž vzájemný vztah lze formulovat jako vztah lovce a kořisti. Do ideálně míchaného bioreaktoru o pracovním objemu 500 l je kontinuálně přiváděn substrát S, který je utilizován mikroorganismem 1. Mikroorganizmus 1 je pak substrátem (kořistí) pro mikroorganismus 2. Hodnoty parametrů: koncentrace substrátu v přítoku zřeďovací rychlost výtěžnostní koeficient biomasy mikroorg. 1 ze substrátu výtěžnostní koeficient biomasy mikroorg. 2 z mikroorg. 1 maximální specif. růstová rychlost mikroorg. 1 maximální specif. růstová rychlost mikroorg. 2 saturační konstanta pro mikroorg. 1 saturační konstanta pro mikroorg. 2

So D

100 kg m-3 0,04 h-1

Y1

0,14

Y2

0,50

1max 2max

0,35 h-1 0,40 h-1

K1 K2

10 kg m-3 10 kg m-3

Úkoly: 1. Sestavte reakční schéma systému, látkové bilance a k vyjádření kinetiky použijte Monodův vztah.

2. Studujte chování systému v závislosti na zřeďovací rychlosti (D = 0,05 – 1,0 h-1) a koncentraci vstupujícího substrátu (So = 50 – 300 kg m-3), výsledky uveďte přehledně do tabulky a znázorněte graficky 3. Najděte podmínky, ve kterých bude systém v ustáleném stavu. 4. Najděte podmínky, ve kterých bude systém vykazovat pravidelné oscilace. 5. Určete při jaké zřeďovací rychlosti dojde k vyplavení kultury 1 a 2 z bioreaktoru. 6. Zjistěte, jak závisí chování systému na poměru 1max /2max v rozsahu mezi 0,1 – 10. 7. Zjistěte, jaký vliv má na chování systému změna saturační konstanty K1 a K2. Ukázka výsledků: Simulace kultivace typu "lovec - kořist" v chemostatu (D = 0,1)

v horním okně jsou průběhy koncentrací substrátu (S), mikroorg. 1 (X1) a mikroorg. 2 (X2), v dolním okně průběhy specifické rychlostí růstu pro oba mikroorganizmy, čas v hodinách

4 BIOTECHNOLOGIE Biotechnologické procesy zaznamenaly v posledních dvaceti třiceti letech prudký rozvoj. Kromě tradičních kvasných technologií, ke kterým se řadí výroba klasických fermentačních produktů jako etanolu, piva, vína, destilátů, pekařského droždí a krmné biomasy, dosáhly nebývalého uplatnění tzv. moderní biotechnologie. Spektrum a počet produktů získávaných biotechnologickou cestou se neustále zvyšuje. Rozšířila se především výroba antibiotik, enzymů, organických kyselin, aminokyselin, vitaminů, růstových faktorů, steroidních hormonů apod. Biotechnologické procesy jsou dnes kromě potravinářství široce využívány i v mnoha dalších odvětvích průmyslu, farmacie, zemědělství a ekologie. Na základě rozvoje poznání v oblastech molekulární biologie, genetického a proteinového inženýrství, fermentačních technik, bioinženýrství, separačních a purifikačních technik atd. nezůstávají stranou modernizace ani “klasické” technologie kvasného průmyslu. Hlavní trendy rozvoje a modernizace biotechnologií jsou spojovány s využitím netradičních surovin, perspektivami produkce nových tzv. obnovitelných zdrojů energie, přípravou produkčních kmenů mikroorganismů požadovaných vlastností tzv. “na míru”, technologiemi s nízkými energetickými nároky, bezodpadovými technologiemi, ochranou životního prostředí atd.

Obsah kapitoly: 4.1 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.4 4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.4.4 4.5 4.5.1 4.5.2 4.5.3 4.6 4.6.1 4.6.2 4.6.3 4.6.4 4.6.5 4.6.6 4.6.7 4.6.8 4.6.9 4.6.10

Obecné rysy biotechnologických procesů Technologie výroby kvasného lihu Suroviny a pomocné látky při výrobě lihu Základy lihovarské mikrobiologie a biochemie Výroba lihu z melasy v průmyslových lihovarech Technologie výroby piva Výroba mladiny Kvašení mladiny a dokvášení piva Závěrečné úpravy a stáčení zralého piva Matematické modelování pivovarské technologie Technologie výroby pekařského droždí Produkční mikroorganizmy a suroviny Technologie výroby Kvalitativní znaky droždí Odpady z výroby droždí Modelování biotechnologických procesů Rovnice Michaelis-Mentenové pro reakční rychlost Jiné vztahy pro reakční rychlost Deaktivace enzymů Úlohy Identifikace modelu fermentace Kontinuální fermentace s vysokou koncentrací biomasy Výroba pekařského droždí Kvašení piva v CKT Filtrace piva na deskovém filtru Destilace prokvašené melasové zápary Výroba kyseliny mléčné Jednoduchý model výroby penicilinu Regulace teploty v bioreaktoru Studie bezpečnosti skladu lihovin

4.1 Obecné rysy biotechnologických procesů Obecně jsou biotechnologické procesy založeny na reakcích biologického činitele, nejčastěji mikroorganismů, tkáňových kultur rostlinných a živočišných buněk, které musejí mít pro svou činnost zajištěn dostatečný přívod živin a energie. Kromě zdroje uhlíku musí mít buňky k dispozici zdroje dusíku, fosforu a dalších biogenních prvků a specifické růstové faktory jako jsou např. některé vitaminy, aminokyseliny, minerální látky apod., které si nemohou samy syntetizovat. Mikroorganismy přijímají (utilizují) z prostředí živiny a využívají je pro svůj růst a obnovu buňky (“maintenance” účely). Pro syntetické pochody (anabolismus) získává mikroorganismus energii a některé důležité látky štěpením energeticky bohatých látek a živin (katabolismus). Energetika a látková výměna spolu těsně spřaženy. Z průmyslového hlediska je možné mikrobiální procesy rozdělit na 1. procesy, kde hlavním produktem je biomasa (pro lidskou výživu a krmivářské účely a pro izolaci intracelulárních komponent); příklad: pekařské droždí, 2. procesy, kde hlavním produktem je extracelulární produkt, tj. metabolit. Podle toho, ve které fázi růstové křivky buněčné populace dochází k tvorbě metabolitu, rozeznáváme primární a sekundární metabolity. Primární metabolit vzniká simultánně s růstem buněk, kdežto sekundární metabolit se vytváří zejména v průběhu stacionární fázi růstu; příklad: etanol. Každý biotechnologický proces je možné rozdělit na základní jednotkové operace směřující od substrátu k produktu: 1. Upstream processing  médium, aerační plyny, živiny  sterilace 2. Biologický proces - účast biologického činitele  inokulum  fermentace, kultivace, biokonverze 3. Downstream processing  separace buněk, příp. buněčného materiálu  izolace a purifikace produktu

Upstream processing je prvou fází probíhající před vlastním bioprocesem. Zahrnuje přípravu média, potřebných živin a dalších složek vstupujících do bioprocesu. Ve většině případů je nutné jednotlivé vstupy sterilovat. Sterilace se obvykle provádí tepelně nebo u termolabilních látek a u plynů (vzduchu) pomocí mikrofiltrace. Bioproces je druhou fází, “duší” celé biotechnologie. Začíná propagací inokula. Cílem propagace je připravit potřebné množství kvalitní násady (inokula) pro zákvas provozního stupně a zároveň postupně adaptovat kulturu na provozní podmínky (např. na méně výhodné složení media).

Při realizaci bioprocesů v průmyslovém měřítku se nejčastěji setkáváme se submerzními procesy. Ty probíhají v bioreaktorech v kapalné fázi (popř. i s pevnou fází), do které může být vháněn aerační plyn (vzduch, …). Vyžaduje-li proces kyslík (vzduch), pak se jedná o aerobní procesy, v opačném případě, kdy kyslík není přiváděn (a dokonce není žádoucí), jde o procesy anaerobní. Kromě submerzních kultivací existují ještě kultivace povrchové, při kterých vláknité mikroorganismy (obvykle plísně) rostou na povrchu pevného či kapalného media (např. plíseň Aspergillus niger produkující citronovou kyselinu). Submersní kultivace dále dělíme na diskontinuální a kontinuální. Diskontinuální procesy mohou probíhat při konstantním objemu media (vsádkové, jednorázové, "batch") nebo při proměnlivém objemu (přítokové způsoby, "fed-batch"). Kontinuální mikrobní procesy jsou z hlediska udržení aseptických podmínek obtížnější než diskontinuální a jejich uplatnění v průmyslu vyžaduje vysokou technickou úroveň provozu. Kontinuální kultivace se používají při výrobě mikrobní biomasy z různých surovin (syntetický etanol, metanol, sulfitové výluhy, hydrolyzáty dřeva), uplatnily se i při výrobě fermentačního etanolu a šumivých vín. Výhodou kontinuálních procesů je hlavně vysoká produktivita systému, která se především uplatňuje při kultivaci mikroorganismů a tvorbě primárních metabolitů. Jako bioreaktory jsou používány nádoby různého objemu (od objemů kolem 0,5 l až do objemů kolem 100000 m3 a více), ve kterých probíhá bioproces. Jsou obvykle vybaveny: • vnitřním nebo vnějším chlazením a ohřevem, • míchacím zařízením, • přívodem vzduchu, • odvodem výdechových plynů, • mechanickým nebo chemickým odpěňováním, • zařízením na odběr vzorků, • měřením a regulací teploty, • měřením a regulací pH, • měřením a regulací koncentrace rozpuštěného kyslíku, • měřením obsahu oxidu uhličitého, • měřením redox-potenciálu, • měřením koncentrace O2 a CO2 v odcházejícím plynu, • měřením koncentrace biomasy, • měřením koncentrace substrátu, • aj. Bioreaktory jsou zhotoveny z materiálu, který nepodléhá korozi. U diskontinuálních procesů slouží též jako sterilátory fermentačního media. Bioreaktory pro anaerobní procesy jsou konstrukčně jednodušší než pro aerobní procesy. Pro aerobní procesy musí být zajištěn neustálý přívod kyslíku (nejčastěji se používá vzduch). Mikroorganismy využívají především kyslík, který je rozpuštěn v kapalině. Rozpustnost kyslíku v kapalině je nízká a závisí na teplotě a parciálním tlaku kyslíku (rozpustnost O2 ve vodě při 30°C je 7,7 mg/l), proto je třeba zajistit co největší součinitel přestupu kyslíku. Tento parametr závisí na konstrukci a umístění míchadel, na konstrukci fermentoru a jeho vestaveb, na frekvenci otáčení míchadla, na fyzikálněchemických vlastnostech kapaliny, na tvaru distributoru vzduchu atd. Downstream processing je třetí fáze biotechnologického procesu. Je charakterizována izolací a purifikací produktu. Jednou z prvních operací je oddělení mikrobní biomasy od fermentační kapaliny, většinou usazováním, filtrací, odstřeďováním, flotací apod. Mikrobní biomasa je často cenným produktem biotechnologické výroby, protože se vyznačuje vysokým obsahem stravitelných bílkovin. Některé procesy jsou zaměřeny v první řadě na její produkci (krmivářská a potravinářská biomasa, pekařské droždí). Pro získání komerčního

produktu následují další operace, jako např. zahušťování a sušení. Odstředěná biomasa může být též využita po určité úpravě k inokulaci dalších provozních stupňů. Mikrobní biomasa je rovněž zdrojem cenných produktů, jako jsou např. RNA, bílkoviny, lipidy, fosfolipidy, polysacharidy, vitaminy, enzymy aj. Při jejím zpracování je třeba většinou šetrně narušit buněčnou stěnu mikroorganismů a buněčný obsah dále zpracovat některou izolační metodou. K narušení buněčné stěny se používá mnoha metod fyzikálních (např. drcení s brusnými materiály), fyzikálně-chemických (např. pomocí ultrazvuku), chemických (např. kyselá hydrolýza) a biologických (např. využití některých enzymů). Pro potravinářský průmysl se vyrábí např. z pekařského droždí autolyzát, extrakt nebo hydrolyzát obsahující lyzovanou, či jinak narušenou buňku. Stravitelnost tohoto materiálu je větší, používá se např. jako přídavek do polévkového koření. Extracelulární produkty se izolují z média po fermentaci. Volba vhodné separační techniky popřípadě sekvence operací závisí na chemických a fyzikálně-chemických vlastnostech produktu a balastních látek, na jejich koncentraci, stabilitě a v neposlední řadě i požadavcích na čistotu produktu. K základním metodám patří např. adsorpce nebo absorpce, extrakce, destilace, srážení, membránové techniky, preparativní chromatografické a elektromigrační metody aj. U klasických fermentačních výrob, jako je pivovarství, vinařství a octářství, je hlavním produktem právě tato fermentační kapalina zbavená mikroorganismů a dále stabilizovaná, při výrobě farmaceutických preparátů (vakcín apod.) jsou to látky ve vysokém stupni čistoty, zbavené balastních látek, zejména tzv. pyrogenních složek. Při mikrobních výrobách vznikají často odpady, které ještě obsahují řadu organických a anorganických látek a které by se znovu mohly použít při kultivaci. Vzhledem k tomu, že tyto látky jsou jednak cenné a jednak by mohly znečišťovat prostředí nebo zbytečně zatěžovat čistírnu, uplatňuje se často metoda jejich recirkulace. Přitom se však mohou hromadit inhibitory, které postupně zpomalují fermentaci, takže recirkulace má své meze. Některých odpadů fermentačního průmyslu lze využít pro přípravu krmiv (lihovarské výpalky, mláto, odpadní kvasnice aj.), jiné se používají pro přípravu hnojiv, ke kompostování nebo k výrobě bioplynu.

4.2 Technologie výroby kvasného lihu Název líh nebo alkohol se v hovorovém jazyce vztahuje k nejčastěji se vyskytující sloučenině ze skupiny primárních alkoholů - k etanolu. Tato sloučenina se dá vyrobit čistě chemickým způsobem, např. hydratací etylenu, nebo běžnějším kvasným způsobem za pomoci mikroorganismů, zejména kvasinek. Na území dnešní České republiky vznikly první lihovary již v 16. století. Jak vypadal takový starší lihovar ukazuje obrázek. Líh se vyráběl především z obilí, zejména však ze žita (odtud název “režná”). Brambory se pro výrobu začaly ve větším měřítku používat až koncem 18.století. Výroba se proto začala přesouvat z měst na venkov, blíže k surovinovému zdroji. Byla to původně výroba značně primitivní, k jejímu rychlejšímu rozvoji přispělo zavádění destilačních aparátů vyhřívaných parou a zavedení paření brambor pod tlakem v pařácích (Henze, Hollefreund). Po první světové válce se využilo i nadprodukce cukrovky, při této výrobě byl však pařákový způsob nahrazován způsobem difúzním, protože řepné výpalky se těžko prodávaly, zatímco řízky šly dobře na odbyt. Po obilí a cukrovce

se objevuje melasa. Nejprve byla zpracovávána v cukrovarech, které si vybudovaly malé přidružené lihovary. Později se začala používat v zemědělských lihovarech jako přídavek do bramborové zápary. Důvodem k tomu byla špatná jakost melasových výpalků, které nebylo možno přímo zkrmovat.

První samostatný melasový lihovar vznikl v r. 1838 v Praze. Další průmyslové lihovary vznikaly postupně v Kolíně (1860), v Praze-Libni (1873), v Mladé Boleslavi, Mostě, Pardubicích, Smiřicích a jinde. Na Moravě vznikly ve 2.polovině 19. století průmyslové lihovary v Rájci nad Svitavou, Olomouci a Kojetíně. V roce 1874 bylo v Čechách 284 zemědělských lihovarů, 40 menších melasových lihovarů a 8 velkých průmyslových lihovarů. Tehdy tyto závody vyrobily kolem 420 000 hl etanolu. Řada závodů přežila hospodářské krize i války 20.století a tvoří část dnešního českého lihovarského průmyslu. Značně se změnila i tvář lihovarů, jak je vidět na druhém obrázku.V ČR se ve 2.polovině 90.let roční výroba kvasného rafinovaného lihu pohybuje okolo 650 000 hl, z toho je zhruba 90 % lihu vyráběno z melasy v šesti průmyslových lihovarech a na výrobě zbývajících asi 10 % lihu se podílejí zemědělské lihovary, jejichž počet i navzdory určitému oživení výroby zemědělského lihu po roce 1990 stále klesá díky odbytovým problémům se surovým lihem. Velké perspektivy lihovarnictví jsou spojovány s realizací programu výroby bioetanolu, který by byl přidáván do motorových paliv až do obsahu 5 %. V ČR je preferována varianta, která počítá s využitím kvasného etanolu ve formě ETBE (etylterciální butyl-éter) jako přídavku do benzinů a etylesterů mastných kyselin z řepkového oleje pro bionaftu. Tato koncepce uplatnění etanolu v palivech byla schválena vládou (usnesení č. 420 ze 17.6.1998) a pro první etapu realizace programu bioetanolu se počítá s potřebou cca 77 000 m3 bezvodého kvasného lihu vyrobeného ze zemědělských surovin vypěstovaných na území ČR.

4.2.1 Suroviny a pomocné látky při výrobě lihu Pro výrobu kvasného etanolu přicházejí v úvahu následující sacharidy: • • • •

monosacharidy (glukosa, fruktosa, mannosa, galaktosa), disacharidy (sacharosa, maltosa, laktosa, celobiosa), trisacharidy (rafinosa), polysacharidy (škrob, dextriny, inulin, celulosa, hemicelulosy).

Vyšší sacharidy nemohou být přímo zkvašovány běžnými lihovarskými kvasinkami, protože ty nemají k dispozici odpovídající enzymy pro štěpení těchto polymerních substrátů na jednoduché zkvasitelné cukry.

Suroviny obsahující sacharosu Nejdůležitější surovinou obsahující sacharosu je melasa. Melasa je hustá sirupovitá tekutina, která vzniká jako odpad v cukrovaru po vykrystalování hlavního podílu cukru. V naší republice se setkáme prakticky pouze s melasou řepnou. Melasa obsahuje zhruba 50 % sacharosy (cukr řepný). V současné době se uvažuje i o přímém zpracování lehké (nezahuštěné) nebo těžké (zahuštěné) šťávy z výroby cukru na etanol.

Škrobnaté suroviny Mezi tyto suroviny patří rostliny poskytující jak zrno, tak i hlízy. Z nich lze vyrobit kvalitní neutrální alkohol. První skupina (zejména obiloviny) se vyznačuje nižším obsahem vody a tím i lepšími vlastnostmi pro skladování. Hlavním představitelem druhé skupiny jsou brambory. Obiloviny jsou v řadě států hlavní lihovarskou surovinou. Nejvíce se zpracovává kukuřice, rýže a žito. V našich podmínkách připadá v úvahu žito, pšenice (nepotravinářské odrůdy), tritikale (kříženec žita a pšenice), méně ječmen, oves a další obiloviny.

Lignocelulózové materiály Lignocelolózové materiály ve formě zemědělských odpadů (kukuřičné oklasky, sláma, …) a dřevní hmoty jsou perspektivními surovinami pro výrobu etanolu. Pro fermentaci je možné využít pouze celulosu a hemicelulosy, ze kterých po hydrolýze (kyselé, alkalické nebo enzymové) vznikají jednoduché zkvasitelné cukry. Proces předúpravy (rozkladu) lignocelulózového materiálu je však technicky a ekonomicky mnohem náročnější než předúprava škrobnatých surovin. Tyto substráty jsou využívány především v severských zemích v Evropě a v Kanadě, kde jsou omezené možnosti pěstování obilovin. Používá se dřevní hmoty rychle rostoucích dřevin z tzv. “energetických” lesů.

4.2.2 Základy lihovarské mikrobiologie a biochemie

Alkoholové kvašení (fermentace) Průběh kvašení byl znám již i pradávným národům naší planety. O příčinách a původu kvašení a o přeměnách, ke kterým dochází v jeho průběhu neexistovaly až do 19. století jasné představy. Před zhruba 130 lety byl Louisem Pasteurem objeven původ kvašení a tím i jeho nositelé kvasinky. Základní stechiometrii lihového kvašení udává Gay-Lusacova rovnice: C6H12O6 glukosa 100 g

2 C2H5OH etanol 51 g

+

2 CO2 oxid uhličitý 49 g

Při lihovém kvašení dochází k postupnému rozkladu sacharidů enzymy mikroorganismů. Jde o proces, který probíhá převážně anaerobně, tj. bez přístupu vzduchu. Mírné provzdušnění kvasného média, hlavně na začátku fermentace, je příznivé pro potřebný nárůst počtu buněk a jejich fermentační aktivitu. Kvasinky obsahují celý soubor enzymů (dříve se nazývaly “zymasa”). Tento komplex glykolytických enzymů štěpí přítomný jednoduchý cukr (glukosu) především na etanol a oxid uhličitý. Vedle toho se tvoří ještě další látky. Jejich obsah určuje potom praktickou výtěžnost kvašení. V případě sacharosy jako substrátu dochází před jejím zkvašením k hydrolýze, která je

katalyzována enzymem invertasou (sacharasou, -fruktosidasou). Používají-li se škrobnaté suroviny, je třeba škrob převést na jednodušší zkvasitelné cukry (maltosa, glukosa). Toto se většinou děje přídavkem komplexu amylolytických enzymů (komerčně vyráběné enzymy nebo dříve slad).

Produkční mikroorganismy Lihovarské kvasinky Jsou to jednobuněčné organismy patřící do skupiny hub. Pravými kvasinkami označujeme takové, které se řadí do druhu Saccharomyces cerevisiae. Pro účely výroby lihu se používá výhradně kvasinek se vysokou schopností tvorby etanolu (vysoká rychlost tvorby a vysoká tolerance k etanolu, nízká produkce vedlejších metabolitů). Kvasinky se v kultivačních mediích množí vegetativně, většinou tzv. pučením. Ideální podmínky při lihovém kvašení jsou teplota mezi 27 a 32 °C a hodnota pH v rozmezí 4 - 6. Od určité koncentrace již alkohol začíná působit i na pravé kvasinky inhibičně. Obecně lze říci, že činnost kvasinek ustává při koncentraci etanolu mezi 14 až 15 % objemových. Bakterie produkující etanol V poslední době se testují k produkci etanolu i některé bakterie. Za zmínku stojí dobré výsledky některých termofilních klostridií a hlavně bakterie Zymomonas mobilis.

Kontaminující mikroflóra Pokud není zajištěna potřebná kvalita suroviny, čistota celého kvasného prostředí, zejména kvasírny, a dostatečné množství zákvasu pravých kvasinek, mohou se při lihovém kvašení uplatnit i jiné mikroorganismy. Ty řadíme mezi kontaminující mikroflóru. Jsou to kvasinky (např. apikulátní a křísotvorné), bakterie či plísně. Kontaminující mikroorganismy snižují výtěžky etanolu, odbourávají produkty kvašení a v některých případech omezují činnost produkčního kmene. Mezi kontaminující kvasinky patří např. Hansenula, Pichia, Debaryomyces, Geotrichum (dříve název Oospora). U těchto kvasinek a kvasinkových mikroorganismů převládá oxidativní metabolismus a dochází obvykle na povrchu media (tj. v přítomnosti vzduchu) k masivnímu nárůstu, což se projeví např. jako křís nebo kožovitý útvar na povrchu kapaliny. Tyto kvasné procesy nejsou žádané a jejich vývoj se musí správným vedením kvašení potlačit (přídavek čisté kultury kvasinek, dobře uzavřená nádoba). Při těchto pochodech dochází nejen ke ztrátě cukru, ale i ke ztrátám alkoholu prodýcháním. Existují však i jiné kvasinky, které tvoří anaerobně etanol ve větším množství a lze jich použít pro výrobu lihových nápojů, příp. i k výrobě etanolu. Je to např. kvasinka Schizosaccharomyces pombe. Vážné problémy při lihovém kvašení mohou způsobit bakterie. Především jde o ty bakterie, které rostou za podobných podmínek jako kvasinky při lihovém kvašení. Tyto mikroorganismy přicházejí do kvasu hlavně ze surovin, a proto jejich úpravě musíme věnovat zvýšenou pozornost. Častými produkty jejich působení jsou těkavé a netěkavé organické kyseliny, jako kyselina mléčná a máselná, které i při nízkých koncentracích jsou pro kvasinky toxické. Ze surovin (havarované brambory, obilí) se mohou do zápary dostat i bakterie hnilobné. Produkty jejich metabolismu jsou obvykle pro kvasinky inhibiční až toxické. V melase se můžeme setkat s bakterií Leuconostoc mesenteroides, která vytváří sliz (polysacharid dextran) způsobující ucpání potrubí. Mezi redukujícími bakteriemi se mohou dobře uplatnit i bakterie redukující nitráty a způsobující tzv. nitrátové kvašení. Produktem při tom jsou jedovaté oxidy dusíku. Toto nebezpečí hrozí zejména u melas s vyšším obsahem dusičnanů. V obilí a bramborách se vyskytují bakterie máselného kvašení, které zkvašují škrob na kyselinu máselnou, octovou, vodík a oxid uhličitý. Za zvláštních podmínek může dojít i k tvorbě butanolu a acetonu. Tento proces je vyvolán rodem Clostridium.

Vedlejší produkty kvašení Vedlejšími produkty lihového kvašení jsou oxid uhličitý, glycerol, acetaldehyd, vyšší alkoholy, kyselina octová a další. Oxid uhličitý vzniká při kvašení ve velkém množství. V průběhu hlavního kvašení bouřlivě uniká z kvasící zápary, nad kterou vytváří ochrannou anaerobní atmosféru a tím zabraňuje rozvoji aerobní mikroflóry (octové bakterie, křísotvorné kvasinky). Glycerol vzniká jako vedlejší produkt glykolýzy. Jeho obsah se zvyšuje, když je do media přidán hydrogensiřičitan nebo při vyšší hodnotě pH. Glycerol je netěkavý a při destilaci nepřechází do surového lihu. Acetaldehyd je přirozený produkt kvašení; jeho obsah se zvyšuje při špatném kvašení. Je velice těkavý a proto při destilaci přechází do úkapu. Má pálivou a štiplavou chuť a tím negativně ovlivňuje sensorické vlastnosti lihu. Vyšší alkoholy (tzv. přiboudlina) jsou vyšší alifatické alkoholy o počtu uhlíků 3 –5 a o bodu varu mezi 80 až 160 °C, které se dají za vhodných podmínek při destilaci oddělit. Přiboudlina vzniká enzymovými pochody z přítomných aminokyselin. Má nepříjemný zápach a chuť a nepříjemně ovlivňuje sensorické vlastnosti lihu. Metanol není vedlejším produktem glykolýzy, ale vzniká v průběhu kvašení enzymovým rozkladem pektinu, kde dochází k hydrolýze metoxy-skupiny. Destilací za normálního tlaku ho není možné od etanolu uspokojivě oddělit.

4.2.3 Výroba lihu z melasy v průmyslových lihovarech Z hlediska zpracování je melasa jednodušší surovinou než obilí. Její předností je jednoduchá úprava (ředění vodou), nízká viskozita roztoku a skutečnost, že obsahuje přímo zkvasitelný cukr (sacharosu). Pokrok v jejím zpracování přineslo použití vyšší koncentrace kvasinek. To při stejné výsledné koncentraci etanolu značně zkrátilo dobu fermentace (až na 24 h). Dalším pokrokem bylo dopracování periodického přítokového způsobu na způsob plně kontinuální. Produktivita kontinuálních systémů se značně zvýšila (doba zdržení v reaktorech dosáhla hodnot až 14 - 16 hodin). V období těsně před 2.světovou válkou a v průběhu války se objevila v několika státech současně metoda využívající recirkulace kvasinek. Tomuto způsobu kvašení se dříve říkalo "způsob se zvratnou separací kvasnic". Myšlenka využití již jednou narostlých kvasinek byla skutečně pro další rozvoj lihovarského průmysl převratná, předpokládá však určitou technickou úroveň separace buněk využívající odstředivek nebo speciálních filtrů.

Příprava zápary Melasové lihovary se ve většině zemí značně liší od obilných velikostí. Svým charakterem se podobají již chemickým nebo petrochemickým závodům. Při denní produkci etanolu 100 m3 se musí zpracovat kolem 1000 m3 zápary (tj. přes 300 t melasy). Melasa se skladuje v tzv. melasnících. Nejprve se ředí na koncentraci sušiny kolem 60 % hmotnostních (60 °Bg), aby ji bylo možno dobře čerpat a rozvádět po lihovaru. Při zřeďování se současně provádí i úprava pH přídavkem kyseliny sírové. Pro kvasný proces se musí zředěná melasa sterilovat. Novější způsoby přípravy lihovarských zápar jsou kontinuální, a to zvlášť tehdy, když je i kvasný proces kontinualizován. Obvykle se pro kvašení připravují dva typy zápary: slabší pro zahájení fermentace (např. 10 - 20 % hm.) a silnější pro doplňování kádí během kvašení (30 - 40 % hm.). Optimální rozmezí pro kyselost zápary leží mezi pH 4,5 - 5,0. Pro výpočet optimálního složení živin je třeba provést bilanci složek. V případě řepné melasy není třeba přidávat dusíkaté živiny, ale je většinou nutné doplnit zdroj fosforu.

Příprava zákvasu Velké lihovary většinou vycházejí z vlastní kultury kvasinek, kterou postupně namnoží v laboratoři a potom dále v provozní propagační stanici. U závodů, které používají recirkulace

kvasinek, se kvasinky propagují jen občas (většinou jednou v lihovarské kampani). Laboratorní a provozní propagace se provádějí za sterilních podmínek a je nutné jim věnovat náležitou pozornost. Provozní kultura se připravuje ve vícečlenné propagační stanici. Koncentrace melasové zápary se pohybuje kolem 10 - 12 % hmotnostních. Laboratorním zákvasem (asi 10 litry) se zaočkuje první stupeň provozní propagace. Jakmile zápara prokvasí na polovinu původní koncentrace (5 - 6 % hmotnostních), převede se obsah nádoby do dalšího členu. Propagační poměr bývá 1 : 5. Mezi provozní propagací a kvasnou kádí často ještě bývá zařazena zákvasná káď. Zde se většinou již nepracuje se sterilní záparou. V zákvasné kádí se může větrat, protože nárůst kvasinek se tím zvýší a proces se zkrátí.

Způsoby kvašení a jeho průběh Existuje velké množství různých způsobů kvašení. Fermentory nejsou konstrukčně nijak složité. Obvykle nejsou opatřeny vzdušněním. Dnes se používají již jen uzavřené fermentory vyrobené z nerezavějící oceli. Lihová fermentace je doprovázena vývojem tepla, proto se musí fermentor chladit. Z 1 tuny melasy (50% sacharosy) zpracované na etanol je třeba v chladicím systémem odvést kolem 260 MJ tepla. Klasická fermentace Klasický vsádkový (“batch”) proces je velmi jednoduchý, ale dosahuje se při něm jen nízké produktivity a doba kvašení je poměrně dlouhá. Charakteristické pro tento proces je, že probíhá od začátku do konce se stejným objemem zápary . Tento způsob se snadno převede na semikontinuální. Při něm se kvašení začíná s poměrně vysokou koncentrací buněk (kolem 30.106 buněk v 1 ml) na melasovém mediu o koncentraci sušiny 35 - 38 % hmotnostních. Další přítoky živin se realizují tak, aby zdánlivá koncentrace zápary nebyla vyšší než 12 - 13 % hmotnostních. Čím větší bude koncentrace kvasinek, tím kratší bude doba fermentace. Limitujícím faktorem je výsledná koncentrace etanolu, která se pohybuje od 10 do 12 % objemových. Při dobrém vedení procesu může být produktivita systému kolem 5 kg etanolu na 1 m3 za hodinu. Jedna šarže trvá 17 - 18 hodin. Způsob s recyklací kvasinek (se zvratnou separací buněk) Tento způsob patří v melasovém lihovarství mezi nejrozšířenější . U nás je znám pod jménem Melle - Boinot. Princip spočívá v tom, že kvasnice oddělené z prokvašené zápary se přenesou do nové zápary a tím se ušetří cukr potřebný k syntéze biomasy. Protože se může pracovat od začátku s vysokou koncentrací buněk a kvašení se celkově zrychlí. Začátek procesu je stejný jako při klasické fermentaci. K separaci kvasinek se obvykle používají drožďárenské odstředivky. Zápara se odstřeďuje na konci fermentace, ne však její celý objem, nýbrž jen část obsahující lepší kvasinky. Svrchní a spodní část zápary se neodstřeďuje a vede se na destilaci. Neseparuje se 5 10 % obsahu kádě. Kvasničné mléko se okyseluje kyselinou sírovou na pH od 2 do 4 (závisí na stupni kontaminace kvasničného mléka). Účinek preparační lázně se řídí dobou praní a hodnotou pH. Kromě dekontaminačního účinku se projeví u kvasinek i celkově čistící a aktivační účinek. K promíchávání kvasničného mléka se používá kvasný oxid uhličitý. Po skončení preparace se přidá k suspensi kvasinek tolik melasového roztoku, aby jeho koncentrace byla 12 - 14 % hmotnostních. Tak se kvasinky opět rozkvasí a rozkvašená kapalina se převede do kvasné kádě a zahájí se nová šarže. Celkem se může zkrátit doba kvašení i na 8 hodin - závisí to především na koncentraci kvasinek. Běžně se dosahuje koncentrace kolem 200.106 buněk/ml, po páté šarži lze dosáhnout koncentrace i 400.106 buněk/ml. Vzhledem k tomu, že se ušetří cukr na růst buněk, zvýší se výtěžky až o 2 %. Vlastní proces fermentace je veden přítokově. V poslední době se místo odstředivek začínají užívat mikrofiltrační jednotky. Obvykle jde o tubulární keramické systémy, které zadržují buňky, takže jejich koncentrace prudce vzrůstá a produktivita procesu se výrazně zvyšuje. Kromě toho se značně sníží nebezpečí kontaminace,

protože jde vlastně o uzavřenou smyčku. Tyto způsoby nejsou vhodné pro média obsahující pevné částice (pluchy, nerozluštěná zrna aj.). Kontinuální způsoby kvašení Hlavní charakteristikou kontinuálních způsobů je nepřetržitý přítok čerstvého a odtok prokvašeného média z fermentoru. Existuje mnoho variant uspořádání a také i konstrukce nádob. Nejstarší jsou systémy o jedné a více nádobách (kaskáda reaktorů), kde kapalina proudí z jedné nádoby do druhé bez jakékoliv zpětné cirkulace. Rychlost průtoku je u těchto jednoduchých systémů dána rychlostí růstu buněk. Ta je však v anaerobním prostředí malá a proto i průtok nemůže být velký, protože překročením určité mezní hodnoty průtoku by docházelo k vyplavování buněk z reaktoru. Aby se průtok mohl zvětšit byly postupně připojovány další stupně, takže kaskáda 10 i více reaktorů nebyla výjimkou. Společnou nevýhodou všech kontinuálních postupů je velké riziko kontaminace. Neustálou sterilací média, propařováním armatur apod. lze prodloužit funkčnost systému, ale je to energeticky náročná záležitost. Proto se ani u nás kontinuální proces neujal (byl zkoušen provozně v 50. a 60.letech). Nové způsoby kvašení melasových zápar V posledních 20 letech se objevila celá řada nových technologických řešení směřujících k rozvoji lihovarského průmyslu. Při inovaci a intenzifikaci procesu výroby kvasného etanolu se využívá: • • • • • • •

recyklace výpalků, kterými se ředí melasa; snižuje se tak spotřeba vody a současně se zvyšuje koncentrace sušiny výpalků, odpadního tepla, především u destilace a odparek, flokulujících kvasinek nebo kvasinek imobilizovaných na levných nosičích, aby nedocházelo při kontinuálních procesech k jejich vyplavování, etanol tolerantních kvasinek, aby se koncentrace etanolu ve zralé zápaře mohla zvýšit, vysoké koncentrace buněk v reaktorech (mikrofiltrační moduly), separace etanolu z kvasící zápary během fermentace (pervaporace, vakuová fermentace, pertrakce aj.), aby se snížil jeho inhibiční účinek a zvýšila se rychlost kvašení, počítačových systémů pro řízení a optimalizaci provozu.

Uvedené inovační směry jsou obsaženy v nabídkách některých firem (např. proces fy. Vogelbusch, systémy Biostil, Vakuferm, Alcon, Chemapec, Alltech). Produktivita těchto systémů je podstatně vyšší v porovnání s klasickou technologií, kontinuální systémy s recyklem buněk mohou dosáhnout produktivitu až 40 kg etanolu na 1 m3za hodinu.

Destilace a rektifikace Etanol je těkavá kapalina, která se ze zápary získává destilací. Při opakované destilaci dochází k zkoncentrování etanolu (rektifikace) na vysokoprocentní líh a jeho očištění od příměsí a doprovodných látek (rafinace). Etanol s vodou tvoří azeotropickou směs o složení 95,57 % hm. etanolu s bodem varu 78,15 °C za atmosférického tlaku. Takovou směs nelze rozdělit destilací za normálního tlaku. Závislost složení par na složení kapaliny se vyjadřuje y―x diagramem nebo tabulkou. Destilační přístroje Ke zkoncentrování etanolu (rektifikaci) se v průmyslových lihovarech používá opakovaná rovnovážná destilace v kontinuálně pracujících destilačních kolonových aparátech, naopak v pálenicích jde o jednoduchou nerovnovážnou (periodickou) destilaci. Patra kolon mají různou konstrukci, většinou jsou kloboučková, sítová, ventilová nebo i náplňová. Ohřev kolony může

být přímý nebo nepřímý. Na hlavě kolony bývá umístěn deflegmátor, kondenzátor a chladič. Fyzikálně-chemické rovnováhy na jednotlivých patrech a kvalitu odebíraného destilátu lze ovlivnit tzv. zpětným tokem (refluxem) kondenzátu. Výroba surového lihu K rektifikaci a rafinaci lihu se v praxi používají různé typy destilačních přístrojů s různým počtem kolon. Pro oddestilování etanolu ze zápary se často používá dvoukolonový destilační přístroj, který se skládá s kolony záparové a rektifikační. Výsledným produktem je etanol v kvalitě surového lihu. Výroba surového lihu je typická pro zemědělské lihovary, v průmyslových lihovarech se většinou používá přímý způsob výroby rafinovaného lihu ze zápary. Výroba rafinovaného lihu Pro výrobu rafinovaného lihu se používají složitější destilační přístroje, většinou 3 – 5 kolonové. Surový líh se před rafinací nařeďuje vodou na koncentraci kolem 20 - 35 % obj., aby se zvýšila účinnost dělení do frakcí: úkap, jádro a dokap. Rafinace probíhá dohromady s rektifikací. Pro správnou funkci rektifikační kolony má význam správné nastavení koeficientu zpětného toku. Starší destilační přístroje vycházejí velmi často z rafinačního přístroje Barbet. První kolona se nazývá úkapová (epyratér), druhá kolona je kolona rafinační s lutrovou, případně se často tato soustava doplňuje kolonou dokapovou. V hlavě rafinační kolony se hromadí aldehydy a rafinovaný líh se proto odebírá až na 5. - 8. patře od hlavy kolony. Přiboudlina se odděluje jako vrchní vrstva dvoufázového systému na patře, kde koncentrace alkoholu je již nízká. Spodní část rafinační kolony se nazývá lutrová kolona. Z horních pater všech kolon se odvádí po kondenzaci líh technický. Další starší přístroje jsou např. Guillaumův nebo Škoda-Gregor. Všechny se však vyznačují vysokou spotřebou páry - 4 až 6 kg na 1 l etanolu. Při rafinaci na těchto přístrojích se získá asi 85 % rafinovaného líhu a 11,5 % úkapu, 3 % dokapu a 0,5 % přiboudliny. Moderní rafinační přístroje jsou založeny na: využití tlakového spádu v kolonách, principu hydroselekce (přídavek vody z rektifikační kolony do hydroselekční kolony) a jsou zcela řízené počítačovými systémy. Přímou parou se vyhřívá jen hydroselekční a rektifikační kolona. Velké závody mají rafinační systémy, které vycházejí přímo ze zápary. Spotřeba páry se u těchto systémů snížila až na 1,5 - 2 kg páry (0,9 MPa) na 1 l etanolu.

Lihovarské výpalky a jejich zpracování Výpalky patří k jedněm z nejvýznamnějších odpadů lihovarského průmyslu, a to nejen vzhledem k jejich množství, ale i k dosti vysokému obsahu organických a anorganických látek. Na 1 m3 vyrobeného lihu je produkováno zhruba 10 – 14 m3 řídkých lihovarských výpalků o hodnotě CHSK vyšší než 30000. Výpalky se liší podle druhu použitých surovin a jejich složení je ovlivněno i technologickým postupem při výrobě lihu.