Mikrobiální kontaminace bylinných čajů

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ Agronomická fakulta Ústav technologie potravin

Mikrobiální kontaminace bylinných čajů Diplomová práce

Vedoucí diplomové práce: Vypracovala: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D.

Mgr. Barbora Kleinová

BRNO 2014

Čestné prohlášení

Prohlašuji, že jsem práci:…………………………………………………………… …….………………………………………………………………………………… …………... vypracoval/a samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb.,o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona.

Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše.

V Brně dne:………………………..

…………………………………………………….. podpis

Tímto děkuji Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za vedení, pomoc a cenné rady při psaní diplomové práce.

ABSTRAKT Název práce: Mikrobiální kontaminace bylinných čajů Diplomová práce se zabývá problematikou mikrobiální kontaminace bylinných čajů. Teoretická část se věnuje léčivým rostlinám, jejich správnému pěstování a zpracování na bylinné čaje. Tato část také shromažďuje legislativní požadavky na bylinné čaje a charakterizuje mikroorganizmy, které se mohou v bylinných čajích nejčastěji vyskytovat. Dále popisuje postupy, kterými lze mikrobiální kontaminaci snižovat. Experimentální část shrnuje výsledky laboratorní práce zaměřené na mikrobiální kontaminaci bylinných čajů. Popisuje vliv horké vody na počty mikroorganizmu v bylinném čaji a bylinných nálevech. Zkoumá také změny počtu mikroorganizmů v bylinných nálevech v závislosti na čase.

KLÍČOVÁ SLOVA Bylinné čaje, léčivé rostliny, výroba bylinného čaje, bakterie, plísně, ekologické zemědělství

ABSTRACT Title: Microbial contamination of herbal teas

This thesis deals with microbial contamination of herbal teas. The theoretical part is focused on medicinal plants, their growing, harvesting and herbal tea production. This part also includes legislative requirements for herbal teas and characterize microorganisms that could be in herbal infusions found. It also describes the processes that can reduce microbial contamination. Experimental part summarizes the results from laboratory work, which was focused on microbial contamination of herbal teas. It shows the effect of boiling water on the number of microorganisms in herb teas and herbal infusions. Due to the time were examined the changes in the number of microorganisms in herbal infusions.

KEY WORDS Herbal teas, medicinal plants, herbal tea production, bacteria, mould, ecological farming

OBSAH 1

Úvod .......................................................................................................................... 8

2

Literární přehled ..................................................................................................... 9 2.1

Léčivé, aromatické a kořeninové rostliny (LAKR)............................................ 9

2.1.1

Vybrané skupiny LAKR dle využití ........................................................... 9

2.1.2

Základní pojmy ......................................................................................... 10

2.2

Bylinné čaje z léčivých rostlin ......................................................................... 11

2.2.1 2.3

Legislativa ČR .......................................................................................... 11

Výroba bylinného čaje ..................................................................................... 13

2.3.1

Technologické požadavky ........................................................................ 13

2.3.2

Suroviny – léčivé rostliny k výrobě bylinných čajů ................................. 13

2.3.3

Technologické zpracování bylinných čajů ............................................... 18

2.4

Jakost léčivých rostlin pro výrobu bylinných čajů ........................................... 22

2.4.1 2.5

Kontrola jakosti......................................................................................... 22

Mikrobiální kontaminace ................................................................................. 26

2.5.1

Mikrobiální kontaminace léčivých bylin a bylinných čajů ....................... 26

2.5.2

Význam vybraných indikátorových mikroorganizmů .............................. 45

2.6

Ovlivnění počtu mikroorganizmů u bylinných čajů......................................... 48

2.6.1

Vodní aktivita aw a mikroorganizmy ........................................................ 48

2.6.2

Snižování mikrobiologické kontaminace čajů .......................................... 48

3

Cíle práce ................................................................................................................ 51

4

Materiál a metodika .............................................................................................. 52 4.1

Charakteristika materiálu ................................................................................. 52

4.2

Metodika mikrobiologického rozboru.............................................................. 56

4.2.1

Příprava laboratorních pomůcek ............................................................... 56

4.2.2

Zpracování vzorku .................................................................................... 56

4.2.3

Použité kultivační půdy ............................................................................ 58

4.2.4

Stanovované skupiny mikroorganizmů .................................................... 59

4.3 5

Vyhodnocení výsledků ..................................................................................... 60

Výsledky ................................................................................................................. 61 5.1

Celkové výsledky mikrobiologické analýzy bylinných čajů ........................... 61

5.2

Celkový počet mikroorganizmů ....................................................................... 65

5.2.1

Vývoj počtu CPM v KTJ.g-1 v čase .......................................................... 65

5.2.2

Srovnání vývoje počtu CPM v KTJ.g-1 v čase .......................................... 67

5.3

Počty koliformních bakterií.............................................................................. 71

5.4

Počty plísní ....................................................................................................... 72

5.5

Počty kvasinek ................................................................................................. 74

5.6

Počty termorezistentních mikroorganizmů ...................................................... 75

6

Diskuze.................................................................................................................... 77

7

Závěr ....................................................................................................................... 80

8

Použitá literatura ................................................................................................... 82

9

SEZNAM OBRÁZKŮ ........................................................................................... 90

10

SEZNAM TABULEK ........................................................................................ 91

11

SEZNAM ZKRATEK ....................................................................................... 92

12

PŘÍLOHY ........................................................................................................... 93

1

ÚVOD Lidé v minulosti využívali léčivé rostliny k léčbě většiny nemocí. V posledních

letech se opět začínají k léčivým rostlinám vracet, protože je považují za přirozenější způsob léčby lidského organizmu. Na trhu je k dispozici nepřeberné množství bylinných čajů a to jak jednodruhových, tak bylinných směsí. Bylinné čaje se připravují z kořenů, listů, kůry, květů, plodů, semen či z celých rostlin. Za účelem vylepšení chuti se do bylinných směsí přidávají například kousky sušeného ovoce nebo různé koření. Bylinné čaje jsou určené převážně ke zmírňování nachlazení či projevů mírnějších onemocnění. Nejsou tedy vhodné k léčbě závažných a akutních onemocnění, ale často jsou v těchto případech využívané. Jelikož jsou bylinné čaje využívány napříč celou populací, je nezbytné, aby byly zdravotně nezávadné. A to obzvláště pro děti, starší osoby a osoby s oslabenou imunitou. Tato diplomová práce se proto zabývá mikrobiální kontaminací bylinných čajů, které jsou dostupné v tržní síti ČR. Zaměřuje se na bylinné čaje z léčivých rostlin, jakožto skupinu pro potravinářské účely. Taktéž zkoumá rozdíly mezi bylinnými čaji z ekologického a konvenčního zemědělství.

8

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Léčivé, aromatické a kořeninové rostliny (LAKR) Zkratkou LAKR jsou označovány rostliny léčivé, aromatické a kořeninové. Celosvětově se uvádí okolo 40 000 druhů, ale v našich podmínkách se jich vyskytuje zhruba 120 druhů (30 druhů se dá pěstovat v kultuře). Jsou skupinou tvořenou rostlinami z mnoha botanických čeledí a jejich pojítkem je způsob využití. LAKR jsou využívány v oborech jako je lékařství, farmacie, potravinářství, kosmetika a parfumerie. Tato skupina zahrnuje nejen rostliny planě rostoucí, ale i vyšlechtěné odrůdy pěstované v kultuře. Jednotlivé části rostlin v suchém stavu jsou nazývány „drogy“ (41). Skupinu LAKR můžeme rozdělit na vícero skupin. Např. na rostliny určené pouze k terapeutickému užití (např. durman obecný), na skupinu rostlin se širším uplatněním (terapie, potravinářství aj.) např. heřmánek lékařský, bez černý aj. Jiné skupiny mají charakter zeleniny (např. česnek) či jsou i okrasnými rostlinami (např. třapatka) (56). Avšak přednostní jsou dvě skupiny rostlin: pro farmaceutické účely a pro potravinářství.

2.1.1 Vybrané skupiny LAKR dle využití 2.1.1.1 LAKR pro produkci léčivých čajů Velká část LAKR je spotřebována na produkci léčivých čajů (jeden z možných farmaceutických účelů), kdy se výroba řídí Zákonem o léčivech č. 79/1997 a Českým lékopisem. Produkce léčivých čajů je více administrativně náročná, než produkce bylinných čajů z léčivých rostlin. Léčivé rostliny pro farmaceutické účely jsou podrobovány zkouškám účinnosti, zkouškám na čistotu (30).

2.1.1.2 LAKR pro produkci bylinných čajů z léčivých rostlin Skupina pro potravinářské účely je upravována Zákonem o potravinách č. 110/1997, je rozmanitější a věnuje se jí více podnikatelských subjektů. Výrobky spadající do této skupiny mají určité charakteristické rysy. Výrobky nemají omezeny názvy (většinou pro spotřebitele poutavé názvy), na výrobcích a k nim patřících informačních materiálech je zakázáno uvádět jakákoli terapeutické tvrzení o účincích na lidský organizmus (41).

9

2.1.2 Základní pojmy

Léčivá rostlina – celá rostlina nebo její část, které jsou užívány pro léčebné účely. Rostlinná droga – čerstvá nebo sušená léčivá rostlina nebo její části (58).

Rostlinné drogy určené k přípravě čajů – jsou to buď jednotlivé druhy rostlinných drog či jejich směsi, které jsou určené k přípravě perorálních vodných přípravků jakovou odvary, nálevy nebo maceráty. Tyto vodní přípravky se připravují až v čase potřeby.

Léčivé čaje – tvořeny jednou nebo více druhy rostlinných drog (30, 58). Čajové směsi – směsi drog, které jsou rozdrobené nebo nerozdrobené na předepsanou velikost částic. Někdy jsou přidávány i další přísady léčivých látek, určené nejčastěji k přípravě vodných nálevů nebo odvarů (30, 58). Čaje se připravují vždy bezprostředně před použitím a jsou určeny k přípravě odvarů, nálevů, či macerátů.

Nálev Vodný výluh rostlinné drogy získaný za tepla. Droga se přelije vroucí vodou, překryje se a cca po 15 minutách se scedí. Využívá se zpravidla u květů, listů a natí.

Macerát Vodný výluh rostlinné drogy za studena. Droga se přelije studenou či vlažnou vodou a nechá se luhovat po dobu 1/2-12 hodin (většinou 6-8 hodin). Poté se výluh scedí. Tento způsob přípravy se používá zejména u slizových drog (podběl léčivý, plicník lékařský, divizna velkokvětá aj.).

Odvar Vodný výluh rostlinné drogy získaný varem např. čtvrthodinové povaření. Droga se 10 až 15 minut vaří ve vodě, poté se nechá 15 minut odstát a následně se scedí. Užívá se zejména u kořenů, plodů a kůr drog, jejichž obsahové látky se teplem nemění (66).

10

2.2 Bylinné čaje z léčivých rostlin Označení bylinné čaje není zcela nejvhodnější. Jelikož tyto čaje nejsou vyrobeny z lístků čajovníků čínského (lat. Camelia sinensis), měly by být nazývány spíše jako bylinné výluhy či nálevy. Bylinné čaje se skládají ze sušených, aromatických části rostlin (kořeny, výhonky, listy, květy, kůra, plody, semena). Po zalití vroucí vodou jsou vhodné ke konzumaci jako nápoj. Suroviny jsou pěstovány v mnoha zemích světa. Například heřmánek se pěstuje převážně v Itálii a Latinské Americe, ibišek v Maroku, máta v mnoha evropských zemích. Za účelem zlepšení chutí bylinného čaje se do směsí přidávají např. sušené kousky ovoce, sušené slupky pomerančů, citronů, skořice, anýz, zázvor, lékořicové dřevo aj. Bylinné čaje se vyrábějí buď jednodruhové nebo jako směsi. Na trhu jsou dostupné bylinné čaje porcované, sypané či v rozpustné formě (23).

2.2.1 Legislativa ČR Zákon č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů •

Vyhláška ministerstva zemědělství č. 330/1997 Sb., kterou se provádí § 18 písm. a), d), j) a k) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, pro čaj, kávu a kávoviny (31.12.1997) (69).

•

Změněny a doplňky předpisu provedené: Vyhláškou č. 91/2000 Sb. (účinnost 1.9.2000) a vyhláškou č. 78/2003 Sb.(účinnost 1.7.2003) (69).

2.2.1.1 Definice Dle vyhlášky se čajem rozumí výrobek rostlinného původu sloužící k přípravě nápoje určeného k přímé spotřebě nebo nápoj připravený z tohoto výrobku. Bylinným čajem je čaj z částí bylin nebo jejich směsí uvedených v příloze č. 2 nebo bylin s pravým čajem nebo jejich směsí s ovocem, přičemž obsah bylin musí činit minimálně 50 % hmotnosti. 11

2.2.1.2 Členění na druhy a skupiny Tab. 1 Členění čaje na druhy a skupiny (69) Druh

Skupina zelený čaj

čaj pravý

polofermentovaný čaj černý čaj

ochucený čaj bylinný čaj ovocný čaj čajový extrakt

výrobky z čaje

instantní čaj

Rozpustná forma bylinného čaje, tedy i instantní čaj je výluh získaný extrakcí suroviny horkou vodou, který se suší speciálními technologiemi. K odstranění vody (sušení) se využívají sušící věže s rozprašovačemi nebo se suší tzv. sublimačním sušením (lyofilizací). Takto je získán instantní bylinný čaj. Do rostlinného výluhu je možné před či po sušení přidávat různé přísady (cukr, kyselinu citronovou, extrakty ovoce, aromata, potravinářská barviva, vitaminové preparáty aj.) (23).

2.2.1.3 Označovaní, hmotnostní odchylky Kromě údajů uvedených v zákoně a ve zvláštním právním předpise se u bylinných čajů a výrobků z něj uvede upozornění na obsah kofeinu, pokud jej obsahuje. Při použití třezalky, pohanky, nebo římského kmínu se uvede upozornění ve znění „u citlivých osob možnost fotosenzibilizace“ (69).

Tab. 2 Přípustné záporné hmotnostní odchylky balení čaje (69) Druh bylinný čaj výrobky z čaje ochucený čaj

Hmotnost balení do 50 g do 100 g do 250 g nad 250

12

Odchylka hmotnosti -5% -3% -2% -1%

2.3 Výroba bylinného čaje 2.3.1 Technologické požadavky K výrobě bylinných a ovocných čajů lze použít: a) části rostlin uvedené v příloze č. 2 části A bez omezení, b) části rostlin uvedené v příloze č. 2 části B do výše 30 % hmotnosti, c) části rostlin uvedené v příloze č. 2 části C do výše 5 % hmotnosti (69).

V kategorii A je 27 položek, v kategorii B 38 a v kategorii C je zařazeno 105 položek. Procentuální omezení v užití rostlin jsou důvodu obsahu přírodních toxických látek, jež jsou v některých bylinách obsažena ve větších množstvích. Existovala by tedy možnost ohrožení lidského zdraví (69). Podrobnosti viz přílohy.

2.3.2 Suroviny – léčivé rostliny k výrobě bylinných čajů 2.3.2.1 Specifika léčivých rostlin v ekologickém a konvenčním zemědělství Pěstování léčivých rostlin v ekologickém zemědělství se výrazně neliší od pěstování v konvenčním zemědělství. Důvodem je, že používání průmyslových hnojiv většinou nepřináší významné zvyšování výnosů. Neexistují ani skoro žádné schválené herbicidy, které by v konvenčním zemědělství byly schváleny právě pro tyto rostlinné kultury. Jsou také ušetřeny genetickým modifikacím. Základní obecné zásady je nutné dodržovat jak v ekologickém, tak konvenčním zemědělství (ochrana před skladištními škůdci při sušení, posklizňové zpracování a skladování). Největší zájem o léčivé byliny pocházející z ekologického zemědělství je ze strany výrobců potravin zejm. ze strany výrobců bylinných čajů. Je tedy kladen důraz na senzorickou kvalitu a pak až na obsahové látky. Farmaceutický průmysl je pravý opak – nejprve obsahové látky, potom až senzorická kvalita.

Skladištní škůdci jsou v ekologickém zemědělství (dále EZ) ničeni např. fyzikálními metodami asanace (nízkou teplotou (- 25 °C po dobu 72 hodin), vysokou teplotou – přesušením (teplota 55 °C po dobu několika hodin). V zahraničí jsou využívána zařízení, která pracují na principu mírně zvýšené teploty za současného sníženého tlaku (asanace mikrobiálního znečištění). Nejvhodnější 13

metodou je samozřejmě prevence. V EZ se využívá také biotechnologická metoda – pomocí parazitické vosičky. Často v EZ funguje model, kdy je smluvně zajištěn a spolupráce mezi pěstitelem a odběratelem. Odběratelem je zajištěna technologie pěstování a posklizňového zpracování, dále dodávání osiv a sadby, obalového materiálu, zajištění logistiky vykupované biomasy a stanovení pevných výkupních cen. Úkole biopěstitele je zajistit nadstandardní kvalitu a smluvní množství biomasy (40). Pěstováním a zpracováním léčivých rostlin pro výrobu čajů se v ČR zabývají například firmy Botanicus, Leros, Sonnentor aj. (48).

2.3.2.2 Pěstování a sklizeň léčivých rostlin Rostlinné druhy poskytující drogy se i v dnešní době z části získávají sběrem ve volné přírodě. Ovšem více jak 50 % zpracovávaného množství má původ z pěstovaných ploch. Ve volné přírodě je množství druhů omezováno soustavným sběrem, zejména pokud nejsou dodržována základní pravidla sběru. Záměrným pěstováním se snižuje nebezpečí záměny a falšování. Mnohem lépe se také kontroluje kontaminace či vliv chemikálií z prostředí. Pěstováním je zaručena spolehlivá úroveň sběru a sušení (11, 40, 41). Léčivé rostliny se podle potřeby pěstují velkoplošně u nás, ale zejména v zahraničí, odkud pocházejí (plantáže r. Lavandula, r. Mentha aj.). U nás jsou léčivé rostliny pěstovány ve specializovaných zemědělských závodech a pro některé obtížně pěstovatelné druhy jsou vypracovány speciální pěstitelské agrotechniky (11, 40, 41). Sekundární metabolity léčivých rostlin jsou tvořeny a lokalizovány v určitých orgánech a sekrečních buňkách dané rostliny (mléčnice, siličné trichomy, siličné kanálky aj.). Sklízí se tedy ty části rostlin, které jsou na obsahové látky nejbohatší. Dále se omezuje sběr nevhodných částí (např. květ heřmánku bez delších stopek, zbytku listí apod.). Správnou sklizní a posklizňovou úpravou se zajišťuje požadovaný vzhled a kvalita účinných látek. Sklizeň se provádí postupně, dle navazující sklizňové zralosti jednotlivých druhů rostlin. Provádí se v době, kdy léčivé rostliny obsahují nejvíce účinných látek, kdy vyhovují hektarové výnosy a když je volná kapacita sušení (11, 40, 41).

14

Sklizeň: a) ručně (např. sklizeň květů a listů) – u malo-produkčních ploch b) pomocí nástrojů určených ke sklizni (např. srpy, kosy, hřebeny) c) částečně mechanizovaná a mechanizovaná d) speciálními stroji (pro sklizeň měsíčku zahradního, levandulových květů aj.)

Sklizený (čerstvý) materiál se nesmí kupit ve vysokých vrstvách, jelikož má tendenci se zahřívat. Naruší se a rychle dochází k nežádoucím změnám (hnědnutí, ztráta obsahových látek).

2.3.2.2.1 Pěstování v ČR Údaj z roku 2011 udává, že léčivé rostliny byly pěstovány na 4 063 ha. V roce 2012 vzrostla pěstební plocha na 4 177 ha. V letech 2006 – 2008 byl zaznamenán mírný pokles rozlohy pěstebních ploch, ale v posledních letech lze pozorovat mírný nárůst. Na cca 100 – 200 ha je pěstován koriandr a fenykl. V západních a středních Čechách se na 100 – 200 ha pěstuje heřmánek, ale jeho produkce nepokryje poptávku (63).

2.3.2.2.2 Sběr v ČR Sběr se jeví jako možnost v případech, kdy daný druh léčivé rostliny nelze z ekologických či ekonomických důvodů pěstovat v monokultuře, jelikož rostliny mají své specifické nároky. Celkový objem nakoupených sběrových drog je určován výškou výkupních cen českých nákupců, a také zájmem sběračů. V posledních letech sběr zaznamenává stagnaci a aktivně uchován je hlavně v místech tradice. U některých druhů rostlin je sběr jediným způsobem získávání. Sběrači musí mít dobrou znalost sbíraných rostlin, problémem však je kvalita usušené drogy. Je důležité, aby byla zachována udržitelnost výskytu sbíraného rostlinného druhu v přírodě (ponechání silných jedinců apod.). Tyto skutečnosti jsou dokladovány prohlášením majitele či uživatele daných území, obsahují zakreslení sběrových lokalit do mapy a slouží pro certifikaci sběru (40). V ČR se sbírá přibližně 70 druhů nakupovaných léčivých rostlin. Nejvíce je sbírán šípek, list břízy bělokoré, nať třezalky tečkované a kopřivy dvoudomé, květ lípy srdčité 15

a černého bezu, nať řepíku lékařského a přesličky rolní, list maliníku a ostružiníku a další (63). Rostliny z volného sběru je možné certifikovat jako bio (dle předpisů ekologického zemědělství), pokud je doloženo, že pocházejí z čistého a nechemizovaného prostředí. Certifikovaný sběr volně rostoucích léčivých rostlin a jejich částí je považován za způsob ekologické produkce, pokud pochází z oblastí, které nebyly v průběhu nejméně tří let ošetřeny jinými produkty než produkty schválenými pro použití v ekologickém zemědělství (23, 40).

2.3.2.3 Posklizňová úprava léčivých rostlin Jedná se zpravidla o oddělení požadovaných částí jednotlivých léčivých rostlin od stonků a příměsí (41). Většinou není třeba sklizené léčivé rostliny nějak náročně upravovat. Výjimkou je vytřídění cizích organických a minerálních příměsí, také nepatřičných částí matečné rostliny, nekrotizovaných částí a částí nesprávně zabarvených (např. kořeny je nutné po sklizni důkladně očistit a oprat).

2.3.2.4 Sušení Sušení se podílí na kvalitě drogy. Podstatou sušení je „konzervace“ čerstvého materiálu. Je nutné, aby sušený materiál byl v dobrém stavu. Zbytky a odumřelé části rostlin jsou zdrojem mikrobiální kontaminace a to zejména při pomalém sušení. Sušení musí být stejnoměrné a nesmí se v surovině tvořit „hnízda“ syrového a navlhlého materiálu. Pokud je sušení přerušeno nebo už usušená surovina opětovně zvlhne či je „předušena“, tak se zvyšuje riziko pomnožení hub či bakterií.

16

Sušení dle zdrojů tepla: a) přirozeným zdrojem (sušení přirozeným odparem) – na vzduchu, ve stínu při pokojové teplotě b) umělým zdrojem – teplo pochází z tepleného zařízení, při výměně vzduchu v sušícím prostoru. Existuje několik možností: sušení teplým vzduchem, infračervenými paprsky, ve vakuu, za snížených teplot, za pomoci sušících gelů.

U sušení přirozeným odparem existuje mnoho rizik: nejistota usušení v případě srážek či chladného počasí a velká pravděpodobnost napadení skladištními škůdci (41). Teplota sušení (resp. teplota vstupujícího vzduchu do sušárny) by neměla přesáhnout cca 50 – 55 °C.

2.3.2.5 Uchovávání drog Usušený materiál je vhodné co nejdříve transportovat do sběren či k výrobci. Není doporučováno delší a neodborné skladování, které by mohlo snížit kvalitu drog. Mikroorganizmy mohou v droze nahromadit toxiny - je tedy vhodné drogy uchovávat ve stinných a suchých prostorách při teplotě nepřekračující 20 °C (optimum 10 – 15 °C). Není doporučováno skladování v plastových pytlích, jelikož droga ztrácí barevnost a je zde zvýšené riziko plísňových pochodů, protože změny okolní teploty způsobují kondenzaci par uvnitř pytle (41).

2.3.2.6 Balení a zasílání drog Drogy jsou baleny do nepoužitých, čistých obalů. Každý druh drogy je balen zvlášť a odděleně jsou baleny i rozdílné jakosti. Za vhodné obaly jsou považovány husté tkaniny (jutové žoky), několikavrstvý papír (papírové pytle), obaly umělohmotné, voskované kartony a plechové/dřevěné krabice (11).

17

2.3.3 Technologické zpracování bylinných čajů Vzhledem k typu využívání LAKR je nutné stále kontrolovat jakost jednotlivých procesů za účelem zabránění znehodnocení a kontaminaci konečných produktů (11).

18

Výkup a příjem suroviny Vrácení dodavateli/sterilizace/pozastavení

Vstupní kontrola vizuální Detekce kovů

Vrácení dodavateli/sterilizace/pozastavení

Odběr vzorků a analýza

Skladování u výrobce

Předání ke zpracování

Řezání

Míchání

Prosévání

Skladování

Balení strojní/ruční

Filtrační papír a další obalový materiál

Balení do krabiček

Skladování hotových výrobků

Expedice

Obr. 1 Proudový diagram výroby bylinných čajů (27, 62) 19

Krabičky a další obalový materiál

2.3.3.1 Příjem, analýza a skladování suroviny Příjem vstupní suroviny je velmi důležitou součástí výrobního procesu bylinných čajů. Léčivé rostliny mohou být vykupovány přímo od pěstitelů (systém direct trade obchodu) nebo dováženy, případně přijímány z certifikovaného volného sběru (27). Po přijetí suroviny se provede vstupní vizuální kontrola (vzhled, vůně, kvalita usušení, nepřítomnost škůdců, plísní a jiných nečistot). Přijatá surovina je označena šarží, mateřským označením společnosti a třídou kvality. Třída kvality je určována kvalitou vysušení a ovlivňuje způsob využití přijaté suroviny (např. pro sypané či porcované čaje). Jsou také odebrány vzorky pro provedení potřebných analýz (11). Odebrané vzorky jsou nejpodrobněji analyzovány pro výrobu léčivých čajů, což se řídí speciálními předpisy. Při výrobě bylinných čajů z léčivých rostlin jsou vzorky analyzovány z hlediska kvality vysušení, mikrobiologické kontaminace, zbytků reziduí. Kontrola zbytků reziduí je důležitá hlavně u surovin vykupovaných z volného sběru, kdy léčivé rostliny mohou např. sušeny na nevhodných místech a být kontaminovány. Výrobce si potřebné analýzy může zpracovávat ve vlastních laboratořích, ale častěji jsou využívány služby samostatných akreditovaných laboratoří. V laboratořích si výrobci nechávají nejčastěji stanovovat CPM, Escherichia coli, koiformní bakterie, kvasinky, plísně, Salmonella spp, Staphylococcus aureus. Léčivé rostliny jsou uskladněny ve skladech s řízenými podmínkami (klimatizace) či v takových, kde jsou jinými přirozenými způsoby zajištěné požadované skladovací podmínky u výrobce (optimální teplota 5 – 25°C, relativní vlhkost max. 75%, stín) (11).

2.3.3.2 Výroba čajové směsi Drogy jsou těsně před následujícím zpracováním nařezány na řezačkách nebo šrotovnících. Požadované velikosti nařezání drog závisí na určeném konečném produktu. Pro výrobu sypaného čaje je požadováno hrubší nařezání léčivých rostlin než u čaje určeného do nálevových sáčků. Také do pyramidálních sáčků je nutné léčivé rostliny nařezat na větší kousky. Nařezaná surovina je dále tříděna na síťových či vzduchových třídičích. Tímto postupem je získán produkt požadovaných rozměrů a je odstraněn přebytečný prach. 20

Dle receptury se v homogenizátorech (např. bubnová míchačka) mísí jednotlivé komponenty čajové směsi (léčivé rostliny, kousky sušeného ovoce). Je nutné dosáhnout celkové homogenity směsi. Homogenizovaná směs pak může být pomocí šnekového dopravníku dopravena do balícího stroje nebo znovu zabalena a expedována do balírny.

2.3.3.2.1 Balení bylinného čaje Čajové směsi či jednodruhové bylinné čaje je možné balit do velkých sáčků (čaj sypaný) nebo strojně do malých sáčků nálevových (čaj porcovaný). Balící stroj z filtračního papíru či jiného materiálu vytvoří sáček (jednokomorový, dvoukomorový, pyramidální), sáček naplní, uzavře a přidá šňůrku. Takto vyrobené nálevové sáčky pak mohou být strojem zabaleny do přebalu. Přebal není nutností, ale má aromaprotektivní funkci. Sáčky jsou poté baleny skupinově po určitých počtech do krabiček (strojově nebo ručně). Hotová balení jsou ukládána do lepenkových krabic a expedována (27).

2.3.3.2.1.1 Nálevové sáčky Čajový sáček byl pravděpodobně poprvé použit v roce 1903 v Americe, kdy měl zajistit čistotu připravovaného nápoje (patent čajového sáčku – Robert C. Lawson a Mary Molaren, Wisconsin) (29). Hedvábná látka, z které byl sáček vyroben, udržela nejen lístky čaje, ale i obsažené nečistoty. Postupem času přestaly být nálevové sáčky využívány kvůli jejich filtračním schopnostem, ale spíše pro jejich snadnost použití. Hedvábí nahradil filtrační papír a v současnosti i různé druhy plastů např. PET a PLA (Polyactic acid, sáčky z materiálu na bázi kukuřičného škrobu biologicky plně odbouratelný). Nálevové sáčky jsou většinou jednokomorové či dvoukomorové (čajové směsi více rozemlety). Rozmachu se dočkaly i sáčky pyramidové, které zajišťují lepší průtok vody, tím pádem i lepší vylouhování čaje. Pyramidové sáčky se mohou díky své prostornosti a průhlednosti plnit méně nařezanými čajovými směsi, což zvyšuje kvalitu porcovaného čaje (59).

21

2.4 Jakost léčivých rostlin pro výrobu bylinných čajů 2.4.1 Kontrola jakosti Kvalitu léčivých rostlin pro farmaceutické účely vymezují příslušné články Českého a Evropského lékopisu a Českého farmakologického kodexu. Každý podnik zpracovávající léčivé rostliny pro farmaceutický průmysl si může na základě evropských předpisů utvořit vlastní podnikovou normu. Kvalita u zpracovatelů, jejichž výrobky jsou registrovány jako léčiva, kontroluje Státní úřad pro kontrolu léčiv (SÚKL). Kvalitu u zpracovatelů, jež zpracovávají LAKR pro potravinářské účely, kontroluje státní zemědělská a potravinářská inspekce (SZPI) a požadavky vymezuje potravinářská legislativa (63).

2.4.1.1 Optická kvalita produktu Nejzákladnějším parametrem je optická kvalita produktu. Natě a listy by měly mít odpovídající zelenou barvu (bez černých fleků, změn barevnosti). Barevnost květů by měla být také pro každý druh odpovídající. Vizuálně se kontroluje také kvalita vysušení, napadení hmyzem, zaplísnění (11).

2.4.1.2 Charakteristická vůně Skladované LAKR mají schopnost jímat cizí pachy, proto je nutné při zpracování a skladování zajistit oddělení jednotlivých druhů s vysokým obsahem vonných látek (41). Léčivé rostliny si při správném sušení udrží svou typickou vůni.

2.4.1.3 Vlhkost Optimální vlhkost se pohybuje v rozpětí 8 – 10 %.

22

2.4.1.4 Požadavky na jakost bylinného čaje 2.4.1.4.1 Smyslové, fyzikální a chemické požadavky na jakost Dle přílohy č. 3 vyhlášky ministerstva zemědělství č. 330/1997 Sb., kterou se provádí § 18 písm. a), d), j) a k) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, pro čaj, kávu a kávoviny.

Tab. 3 Smyslové, fyzikální a chemické požadavky na jakost (69) Bylinné čaje

Vzhled

Barva

Vůně a chuť

Před přípravou

jsou tvořeny z různých

Části rostlin barevně

Typická po použité

částí rostlin

odlišné, typické

surovině, čistá,

pro použité suroviny

bez cizích zápachů

a způsob zpracování Po přípravě

Nálev, odvar nebo

Charakteristické

macerát čirý s mírnou

po použitých

opalescencí až mírným

surovinách bez cizích

zákalem v závislosti

pachů a příchutí

na použité surovině a způsobu přípravy

Čajové

Viskozní tekutina, čirá

Typická po použité

Čistá, aromatická,

extrakty

až opalizující nebo

surovině

typická pro použitou

zakalená se sedimentem

surovinu

2.4.1.4.2 Mikrobiologické požadavky na jakost Obecně platí, že potravina nesmí být uvedena na trh, není – li bezpečná nebo hrozí – li nebezpečí ohrožení zdraví spotřebitele. Bezpečnost potravin je zajišťována nejlépe preventivním přístupem (např. správnou hygienickou praxí, postupy založenými na HACCP atd.). Pro hygienickou kontrolu je možné použít mikrobiologická 23

kritéria - kritéria jak pro zhodnocení přijatelnosti postupů, tak stanovující limit pro bezpečnost potravin.

Na mezinárodní úrovni existují principy pro stanovení a aplikaci mikrobiologických kriterií přijaty Komisí Codex Alimentarius. Mikrobiologické požadavky stanovené legislativou jsou obsaženy v nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 ze dne 15. Listopadu o mikrobiologických kriteriích pro potraviny a v nařízení Komise (ES) č. 1441/2007 ze dne 5. prosince 2007, kterým se nahrazuje příloha I nařízení Komise (ES) č. 2073/2005, jejichž dodržování je pro provozovatele potravinářských podniků závazné. Tato nařízení však kategorii bylinných čajů nespecifikují. Mnoho výrobců tedy stále vychází z dříve platné vyhlášky č. 132/2004 Sb., o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení (27).

Dle přílohy č. 2 Vyhlášky č. 132/2004 – přípustné hodnoty pro jednotlivé druhy, skupiny nebo podskupiny potravin

Tab. 4 Přípustné hodnoty pro bylinné čaje (67) Bylinné čaje

PH

Escherichia coli

103

Koagulázopozitivní stafylokoky

103

Clostridium perfringens

103

Salmonella spp.

0/10 (nepřítomnost v 10 g nebo v 10 ml vzorku)

Potenciálně toxinogenní plísně 5.103 (Aspergilus

flavus,

A. parasiticus, A. nomius) PH – přípustné hodnoty Pozn. Při překročení povolené hodnoty je pro posouzení rozhodující zjištěný obsah aflatoxinů (viz vyhláška č. 53/2002 Sb. ve znění vyhlášky 233/2002 Sb.

24

Dle přílohy č. 3 Vyhlášky 132/2004 – přípustné hodnoty pro potraviny určené pro kojeneckou a dětskou výživu

Tab. 5 Přípustné hodnoty pro bylinné čaje určené pro kojence a malé děti (67) Nápoje (v prášku) a bylinné PH čaje pro kojence a malé děti Escherichia coli

102

Koagulázopozitivní stafylokoky

102

Clostridium perfringens

102

Salmonella spp.

0/10 (nepřítomnost v 10 g nebo v 10 ml vzorku)

Potenciálně toxinogenní plísně 5.102 (Aspergilus

flavus,

A. parasiticus, A. nomius) PH – přípustné hodnoty Pozn. Při překročení povolené hodnoty je pro posouzení rozhodující zjištěný obsah aflatoxinů (viz zvláštní předpis) (67)

V současné době platí norma ČSN 56 9609, která stanovuje mikrobiologická kritéria pro potraviny. Limity pro bylinné čaje jsou uvedeny v tabulce.

Tab. 6 Přípustná množství jednotlivých skupin mikroorganizmů pro bylinné čaje (ČSN 56 9609, B.5.2.15) (9) n

c

m

M

Escherichia coli

5

2

102

103

Salmonella spp.

5

0

0/10

-

5

2

103

5 . 103

Potenciálně toxinogenní plísně Aspergillus flavus

Vysvětlivky: n

počet vzorků, který je určen k vyšetření, jehož účelem je rozhodnout zda

posuzovaná šarže výrobku nebo její část bude posouzena jako vyhovující nebo nevyhovující stanoveným mikrobiologickým požadavkům

25

m množství mikroorganizmů, které se připouští u všech vzorků výběru n M množství mikroorganizmů, které se ještě připouští u počtu vzorků, který je nižší nebo se rovná c c

rozhodnuté číslo, čímž se rozumí počet vzorků z výběru n, u nichž se připouští

hodnota M

Pokud se u všech vzorků z výběru n připouští pouze hodnota m (M se nepřipouští), je hodnota c vyjádřená nulou a hodnota M je proškrtnuta (9).

2.5 Mikrobiální kontaminace 2.5.1 Mikrobiální kontaminace léčivých bylin a bylinných čajů Léčivé byliny jsou zemědělskými produkty, které jsou pěstovány a sklízeny stejně jako jiné zemědělské produkty. Mohou být kontaminovány mikroorganizmy, které se běžně vyskytují v životním prostředí. Navíc mohou být kontaminovány z dalších zdrojů – hmyzem, výkaly, hlodavci, ptáky, prachem, vodou atd. Také nevhodné zavlažování může být zdrojem kontaminace. Léčivé byliny jsou často pěstovány v místech, která podporují růst mikroorganizmů (např. tropické, subtropické oblasti). Ke kontaminaci může také dojít při sklizni bylin, při manipulaci s nimi a při jejich transportu (37, 18).

Mikrobiologické studie léčivých bylin, které byly provedené v mnoha zemích světa, prokázaly

přítomnost

významných,

v potravinách

se

vyskytujících,

bakterií

a toxinogenních plísní. Nejčastěji byla nalezena Salmonella spp., Escherichia coli, sporotvorné bakterie (Clostridium perfringens, Bacillus cereus). Sporotvorné bakterie jsou u rostlin nalézány často, ale v nízkých množstvích (18). Další nalézané skupiny bakterií zahrnovaly fekální streptokoky (bakterie rodu Enterococcus), pseudomonády (rod Pseudomonas), čeleď Enterobacteriaceae (52). Bakterie čeledi Enetrobakteriaceae jsou nejčastěji analyzovány jako ukazatel hygienické kvality zpracování než jako ukazatele fekální kontaminace. Spíše tedy vypovídají o mikrobiologické kvalitě suroviny než o možných zdravotních rizicích (31). Je málo informací o vlivu zpracování (hlavně sušení) na mikrobiologii surovin bylinných čajů. Avšak je zřejmé, že potáčení mikrobiální kontaminace surovin

26

je vysoká a druhové zastoupení mikroorganizmů, na jakémkoliv surovém rostlinném materiálu, bude velmi variabilní. Pro sušení se používají mírné podmínky, aby bylo zabráněno nežádoucím změnám – ztrátě chuti, barvy, éterických olejů. Tyto mírné podmínky nemají však výrazný efekt na mikrobiální flóru (31). Plísně jsou spíše symbionty rostlin, kteří přežívají sušení a skladování. Dominantními

plísněmi

byl

rod

Aspergillus,

následně

Penicillium.

Většina

identifikovaných plísní byla schopna produkovat mykotoxiny (14). Studie prováděné ve světě se dále soustřeďovaly na zkoumání výskytu bakterie Acinetobacter baumanii, Cronobacter sakazakii.

2.5.1.1 Bakterie 2.5.1.1.1 Čeleď Enterobacteriaceae Čeleď Enterobacteriaceae zahrnuje gramnegativní, nesporulující, fakultativně anaerobní tyčinky. Zkvašují laktózu na plyny, kyseliny a aldehydy. Redukují dusičnan na dusitan. Mohou být pohyblivé či nepohyblivé. Dělí se skupiny, rody, druhy a sérovary. Řada příslušníku této čeledi se přirozeně nachází v půdě, ve vodě a na rostlinách (Erwinia, Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Yersinia. Mezi podmíněně patogenní lze zařadit některé členy rodu Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Yersinia aj.

2.5.1.1.1.1 Rod Escherichia Bakterie tohoto rodu svými vlastnostmi odpovídají obecné charakteristice čeledi Enterobacteriaceae. Escherichia coli je přirozeným obyvatelem jak zvířecího, tak i lidského trávicího traktu. V potravinářství se bere jako indikátorový organizmus sanitace a zachovávání hygienických a technických požadavků při získávání, zpracovávání, skladování, distribuci a spotřebě potravin. U osob s oslabeným imunitním systémem a např. u malých dětí a starších osob můžou některé sérotypy způsobovat zdravotní problémy (průjmy). Patogenní kmeny byly uspořádány do 4 skupin: Enterpatogenní (EPEC), Enteroinvazivní (EIEC), Enterotoxigenní (ETEC), Enterohemoragické (EHEC). U ETEC a EHEC je patogenita vztahována k produkci toxinů. U EHEC byl zjištěn 27

sérotyp O157:H7, který byl roku 1982 identifikován. Tento sérotyp je hlavním alemintárním patogen, za vhodných podmínek produkuje velmi aktivní toxin, který způsobuje specifické onemocnění tzv. hemoragickou enterokolitidu. Těžký průběh mívá u dětí a starších osob. V posledních letech budí pozornost zástupce skupiny EPEC, který produkuje tzv. verotoxin a jím způsobuje u lidí průjmy (14).

2.5.1.1.1.2 Rod Salmonella Salmonely jsou pohyblivé gramnegativní tyčinky. Bakterie rodu Salmonella se vyskytují ve střevním traktu teplo i studenokrevných živočichů, některé druhy se vyskytují ubikvitárně. Jsou schopné přežít dlouho dobu ve vodě a za příznivé teploty, vlhkosti a pH až roky přežívat v půdě (14).

Optimální teplota pro růst je 37 °C, pro

některé kmeny jsou příznivé i nižší teploty. V kyselém prostředí postupně hynou. Taktéž nízká aktivita vody tomuto rodu bakterií nevyhovuje. U sušených potravin sehrává významnou roli křížová kontaminace (65). V suchých potravinách jsou schopny přežít dlouhou dobu. Teplotami nad 70°C jsou rychle devitalizovány (6).

Salmonely jsou děleny do tří skupin: Skupiny tyfus a parafytus: S. typhi, S. paratyphi aj.; způsobují u člověka onemocnění provázené bakteriémii; přenáší se z bacilonosičů přímým kontaktem, ale nejčastěji kontaminovanou vodou a potravinami.

Skupiny enteritis: S. typhimurium, S. enteritidis aj.; prostřednictvím svých endotoxinů způsobují akutní gastroenteritidy, alimentární intoxikace, MID (minimální infekční dávka) se v potravinách pohybuje mezi 102 - 105 KTJ (14).

2.5.1.1.1.3 Rod Proteus Gramnegativní pohyblivé tyčinky, růstové optimum je 37 °C, v potravinách roste i při pokojové teplotě. Nachází se v půdě, ve vodě a střevním traktu živočichů. Vyskytuje se i jako tzv. nemocniční mikrob způsobující nozokomiální nákazy (14).

28

2.5.1.1.1.4 Rod Enterobacter, Erwinia, Hafnia Rod Enterobacter

se vyskytuje ve střevním traktu, ale nachází se primárně

na rostlinách. Je stálou součástí „koliformních bakterií“. Rod Erwinia se taktéž vyskytuje u rostlin, je rostlinným patogenem (blokuje vodní systém rostliny). Bakterie rodu Hafnia se vyskytují ve střevním traktu, půdě a vodě (14).

2.5.1.1.2 Čeleď Bacillaceae 2.5.1.1.2.1 Rod Bacillus Tento rod patří mezi grampozitivní aerobní nebo fakultativně anaerobní sporulující (tvoří endospory) tyčinky. Spory jsou tvořeny za účelem přečkání nepříznivých podmínek okolního prostředí. Spory, které tvoří Bacillus cereus, jsou velmi termorezistentní a přežívají tepelné opracování potravin, jsou oválného tvaru. Jednotlivé druhy tohoto rodu mají značně rozdílné optimální a maximální teploty, dobře rostou v rozmezí pH 5,5 až 8,5, jen některé rostou i při pH 5,0 a nižším (14). Bakterie tohoto rodu jsou rozšířeny hlavně v půdě, ve vodě, v potravinách. Spory se z půdy a rostlin dostávají dále do ovzduší a kontaminují rostlinné i živočišné potraviny. B. cereus

produkuje dva typy toxinů, které způsobují alimentární

onemocnění. Emetický toxin (způsobuje zvracení, nevolnost, průjmy) je termostabilní. Druhým je diarhoický toxin (způsobuje průjmy, poškozuje sliznici střev), který je termolabilní a inaktivuje se už záhřevem nad 60 °C (14).

2.5.1.1.3 Čeleď Clostridiaceace 2.5.1.1.3.1 Rod Clostridium Grampozitivní, anaerobní až aerotolerantní sporulující tyčinky. Za přítomnosti kyslíku roste např. Clostridium perfringens. Optimum růstu je nejčastěji 30-37 °C. Bakterie tohoto rodu se vyskytují ubikvitárně. Hlavně v půdě, v bahně, sekundárně v siláži, mléku a sýrech. Clostridium perfringens původním stanovištěm je tlusté střevo, ale vyskytuje se i v půdě. Produkuje několik typů toxinů (A až E). Některé termorezistentní kmeny přežívají až 60 minut záhřev na 100 °C. Teplotní šok může dokonce urychlit klíčení spor. Po vstupu vegetativních buněk s jídlem do střevního 29

traktu konzumenta se začne bakterie pomnožovat a tvořit spory. Enterotoxin se tvoří při sporulaci buněk a uvolňuje se do organizmu. Následkem jsou u konzumenta průjmy, bolesti břicha a nevolnost. Clostridium perfringens je hodnoceno z hlediska hygieny a mikrobiologie potravin, jelikož je všeobecně rozšířeno (půda, prach, prachem znečištěné předměty) (14).

2.5.1.1.4 Čeleď Pseudomonadaceae 2.5.1.1.4.1 Rod Pseudomonas Bakterie rodu Pseudomonas jsou gramnegativní, pohyblivé, striktně aerobní tyčinky. Netvoří spóry. Řada druhů tvoří pigmenty (modrozelený, zelený, žlutý fluoreskující aj.). Jsou velmi přizpůsobivé. Nerostou při nižším pH než 4,5. Rostou při teplotách 5 – 42 °C (6). Pseudomonády jsou v prostředí velmi rozšířené. Vyskytují se v půdě, na rostlinách, ve vodě atd. P. aeruginosa je patogenem a pomnožená v potravině může způsobit alimentární onemocnění. Může vyvolat akutní gastroenteritidu nebo enterokolitidu zejména u kojenců a u osob s oslabeným imunitním systémem. Z prostředí se těžko eliminuje (odolává i některým dekontaminačním prostředkům). P. aeruginosa se stanovuje při mikrobiologické kontrole léčivých rostlin, protože hrozí přítomnost kontaminovaných rostlin. Obecně nesmí být v čajích přítomna.

2.5.1.1.5 Čeleď Staphylococcaceae 2.5.1.1.5.1 Rod Staphylococcus Do rodu Staphylococcus patří druhy Staphylococcus aureus, S. epidermidis aj. Jsou to grampozitivní kokovité nepohyblivé bakterie většinou uspořádané do hroznovitých útvarů. Staphylococcus aureus je podmíněně patogenní, roste při teplotě 10 až 45 °C (6). V potravimách produkuje řadu enterotoxinů, které snášejí půlhodinový var a způsobují stafylokokové enterotoxikózy (alimentární onemocnění). Nejvhodnějšími podmínkami pro produkci enterotoxinů je teplota nad 15 °C, pH = 4 v aerobním prostředí a při pH 5,3 v anaerobním prostředí, enterotoxiny jsou termostabilní. Obecně Staphylococcus aureus způsobuje anginu, hnisavé onemocnění kůže a ran.

30

Stafylokoky se nacházejí v prachu, ve vodě a jsou součástí tělesné mikroflóry (6). Do potravin se může dostávat z infekčního personálu potravinářského podniku (hnisající rány, kašel, kýchání) (60). Staphylococcus aureus se běžně stanovuje v rámci mikrobiologické kontroly sušených léčivých rostlin. V bylinných čajích nesmí být přítomen (11).

Primárně se na rostlinách vyskytují bakterie rodu Pediococcus, bakterie rodu Arthrobacter a Flavobacterium.

2.5.1.1.6 Studie zaměřené na analýzu bakteriální kontaminace u bylinných čajů Proběhly studie věnující se přítomnosti spor bakterie Clostridium botulinum v heřmánku ve vztahu k výskytu kojeneckého botulismu. Spory byly nalezeny v 7,5 % vzorků (15/200) (12). V argentinské studii bylo detekováno 0,30 – 0,40 spor na gram heřmánku ve dvou vzorcích. Minimální infekční dávka spor bakterie C. botulinum u dětí není. Nicméně ze studií analyzujících spory v medu je možné soudit, že infekční dávka se může pohybovat mezi 10 až 100 spor (2). Tato hodnota je vyšší, než je zatížení sporami u heřmánkového čaje, který se připraví jen z pár gramů. Na druhou stranu se dětem čaje podávají častěji, takže minimální infekční dávka pro vznik kojeneckého botulizmu by se mohla během doby naakumulovat. Nejčastějšími původci kojeneckého botulizmu jsou C. botulinum typu A a B. Ke snížení vzniku onemocnění se doporučuje heřmánkový čaj podávat dětem až od 12-ti měsíců věku (3). Ve studii věnující se mikrobiologické kontaminaci bylinných čajů všechny vzorky bylin byly přijatelné mikrobiologické kvality. Salmonella spp.

a E. coli nebyly

detekovány v nezpracovaném a ani ve zpracovaném rostlinném materiálu. Samotné zpracování bylin (řezání, mletí, prosévání apod.) výrazně nezvýšilo celkové počty aerobních a mezofilních bakterií. Lze tedy říci, že dominantním zdrojem aerobních bakterií, plísní a kvasinek je právě samotná surovina (8).

31

Zkoumáním vlivu vysokého tlaku a teploty na bylinné čaje (roztoky) ukázalo, že hodnota TPC (total plate counts – aerobní, mezofilní mikroorganizmy), počty kvasinek, plísní a koliformních bakterií byly v bylinných nálevech sníženy (20). Německá studie se zabývala bylinnými čaji ve vztahu k nozokomiálním infekcím. Jelikož na německé neurologické jednotce došlo k několika infekcím, u kterých se předpokládal jako zdroj infekce nedostatečně tepelně připravený bylinný čaj, který byl používán k ústní hygieně (17). Byla se

tedy

zahájena

mikrobiologické

experimentální

kontaminaci

a

mikrobiologická

rizikovosti

bylinných

studie čajů

ve

věnující vztahu

k nozokomiálním infekcím (dále jen NI). Studie zahrnovala 3 typy testů (různé teploty při přípravě, postupy, vychladnutí nálevu). Ve

všech

třech

testech

byly

detekovány

aerobní

sporulující

bakterie,

nefermentativní (jen nepatogenní) mikroorganizmy a různé druhy aspergilů. Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa nebyli detekování. V testu, kdy byly analyzovány surové studené vzorky nálevů, byly zjištěny velmi vysoké bakteriální počty u všech čajů (fenyklový, heřmánkový, mátový a ovocný) a to hlavně v mátovém. Také plísně byly v nejvyšším počtu identifikovány u mátového čaje (17).

Tab. 7 Mátový čaj surový studený nálev (17)

Mátový čaj

KTJ/g průměr

KTJ/g rozsah

Plísně průměr

1,6 x 108

6,3 x 107 – 2,4 x 108

1,3 x 104

32

Tab. 8 Počty mikroorganizmů (KTJ/100 ml čaje), ve vzorcích zalitých kohoutkovou vodou o teplotě 67 °C a v dalším testu zalitých vodou o teplotě 90 °C (vše KTJ/100 ml čaje) (17) fenyklový čaj Teplota CPM Nefermen tativní

heřmánkový čaj

mátový čaj

67 °C

90 °C

67 °C

90 °C

67 °C

90 °C

1,3 x 104

1,4 x 104

1,6 x 106

3,9 x 105

3,7 x 105

4,7 x 105

1,1 x 104

2,0 x 103

1,0 x 103

2,6 x 103

5,8 x 103

3,4 x 103

1,2 x 103

1,2 x 104

1,6 x 106

2,9 x 105

3,7 x 105

4,7 x 105

4,0 x 102

<10

<10

<10

2,0 x 102

<10

Aerobní sporotvorn é bakterie plísně

V další studii byl heřmánkový čaj vysoce kontaminován bakterií Bacillus ceresu a E. coli (39).

Obr. 2 Růstová křivka bakterií v heřmánkopvém čaji během 24 hodin (log KTJ/ml) (39)

33

Italská studie analyzovala mikrobiální kontaminaci u 18 ti vzorků bylinných čajů. Plísně byly detekované ve většině vzorcích, jejich hodnoty byly nízké (<10 KTJ/g), s výjimkou čaje heřmánkové a mátového (103 až 104 KTJ/g). Ve většině vzorcích byl identifikovaný Bacillus genus, spory clostridií byly detekovány u heřmánkového čaje (6,4 spor/g) a u mátového čaje (160 spor/g). Enterokoky byly identifikovány v minimálních množstvích (10 KTJ/g), vyjma heřmánkového čaje (103 KTJ/g). Výsledky studie tedy potvrzují, že bylinné čaje jsou kontaminovány mikroorganizmy a ukazuje se, že nejvíce heřmánkový a mátový čaj (54).

Tab. 9 Vybrané výsledky italské studie (54) aerobní

koliformní

mezofilní

bakterie

plísně

enterokoky

aerobní sporotvorné

mikroorg.

bakterie

máta

9x103

1 x103

3x103

1x101

2x103

sléz

2x103

2x102

3

<1

4x102

heřmánek

3x106

2x104

2 x104

3x103

5x104

Enterobacter sakazakii je uváděný často jako Cronobacter sakazakii. Cronobacter sakazakii je gramnegativní bakterie netvořící spory, která patří do čeledi Enterobacteriaceae. Přímo původ bakterie není znám, ale byla izolována z vody, sedimentu a půdy. V rozsáhle studii 500 vzorků potravin, bylo ze vzorků bylin a koření 25 % pozitivních na přítomnost Cronobacter sakazakii (21). C. sakazakii měl podíl na případeh dětské meningitidy, sepse a nekrotizující kolitidy (74, 72, 13, 64). Ohroženy jsou zejména děti narozené předčasně, narozené s nízkou porodní hmotností, novorozenci, děti se sníženou imunitou, děti HIV pozitivních matek apod. Z dospělých jsou ohroženi převážně ti s jinými onemocněními (rakovina, chronické choroby) (28). Závažné následky infekcí jsou v některých případech způsobené produkcí enteroxinů této bakterie (ne všechny kmeny jsou ale patogenní) (45, 46). Studie zkoumající 150 vzorků čajů (např. různé dětské čaje, šalvějový, mátový, čajové směsi atd.) nakoupených v Bělehradě zjistila u 48 vzorků přítomnost této 34

bakterie. Všechny pozitivní vzorky byly poté připraveny dle návodu výrobce a u 46 vzorků čajů byl zaznamenán růst této bakterie po 2, 12 a 24 hodinách uchovávání. Negativní byly vzorky s meduňkou. Z 11 dětských čajů bylo 5 pozitivních (45 %) (57). Mnozí spotřebitelé si neuvědomují, že bylinné čaje mohou představovat potenciální riziko pro spotřebitele, zvláště kdy jsou připravovány se studenou či vlažnou vodou a jsou ponechávány při pokojové teplotě. Otázkou tedy je zda a kdy používat bylinné čaje u kojenců, malých dětí a imunokompromitovaných osob, kteří trpí nějakým chronickým onemocněním. Neexistují žádná mikrobiologická kritéria pro tuto patogenní bakterii. Lepší dohled založený na spolehlivých detekčních metodách by umožnil lepší kontrolu výskytu Cronobacter sakazakii (57). Studie potvrdila přítomnost Cronobacter sakazakii v dětských bylinných čajích komerčně dostupných. Cronobacter sakazakii byl schopen růst v nálevech s použitou vodou o teplotě 21 °C až 37 °C. Ukázalo se, že zalití čaje vodou o teplotě ≤ 60 °C snižuje potenciální riziko infekce. Kromě toho bylo zkoumáno použití hovězího laktoferinu (antimikrobiální účinky) u bylinných čajů za účelem účinné kontroly rizika spojeného s touto bakterií (1).

2.5.1.2 Plísně Plísně patří mezi mikroskopické houby – mikromycety. Mikroskopické houby zahrnují

vláknité

mikroskopické

houby

(plísně),

kvasinky

a

kvasinkovité

mikroorganizmy (44). Plísně řadíme mezi houby (Fungi). Botanicky jsou mezi plísně řazeny jen houby s nepřehrádkovaným myceliem (třída Zygomycetes a vybrané vodní plísně). Vláknité houby náleží mezi Ascomycotina a Deuteromycotina. Technologové přiřazují k plísním příslušníky všech tří skupin, jelikož jejich vlastnosti a nárůsty na napadeném materiálu jsou si hodně podobné (60). Plísně jsou ubikvitární, mohou se tedy nacházet v ovzduší, v půdě, vodě, na jakýchkoliv plochách, potravinách atd. (33, 47). Stélka plísní (lat. thalus) je tvořena vlákny (lat. hyfy), která jsou jednobuněčná (bez přepážek) nebo vícebuněčná (s přepážkami). Spleť hyf se nazývá mycelium. Hyfy

35

mohou tvořit sklerocium, což je polokulovitý tvrdý útvar. Buňky hyf se mohou změnit na chlamydospory (kulovité útvary obalené tlustou stěnou). Plísně se rozmnožují rozrůstáním hyf a sporami. Spory mohou vznikat vegetativně (vegetativní spory) nebo po spájení (pohlavní spory). Vegetativní spory jsou tvořeny na hyfách či na tzv. fruktifikačních orgánech. Spory, které jsou umístěné vně orgánů jsou nazývány exosporami neboli konidiemi. Ty, které se nacházejí uvnitř orgánů jsou endospory. Pokud je hyfa nesoucí konidie diferencována od zbylých hyf, tak se jedná o konidiofor. Tyto konidiofory mohou být jednoduché či větvené nebo zduřelé ve vezikulu (60).

Vlastnosti plísní: Jsou aerobní a porůstají povrchy napadnutých potravin. Jednotlivé druhy plísní se liší v potřebě kyslíku pro svůj růst. Plísně jsou odolné a snáší dobře nižší pH prostředí, nižší teploty a nízký obsah využitelné vody (aw). Pokud se podrobněji analyzuje výskyt plísní na poživatinách, je dobré, aby se v určitých případech stanovoval i rod, případně druh plísní. Dle získaných informací by se dalo usuzovat o zdroji kontaminace a možnostech její eliminace (53, 22, 14). Rostliny mohou být plísněmi napadeny už na polích nebo až po sklizni, kdy je s rostlinami nevhodně nakládáno (sklizeň, posklizňové období). Během období po sklizni má na rozvoj plísní největší vliv právě vysoká vlhkost vzduchu a vyšší teplota okolí. Obecně je pro výrobce nemožné zabránit kontaktu bylin s výtrusy plísní. Plísně rodu Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Mucor se vyskytují všude v okolí. Je uváděno, že každá rostlina je náchylnější k určitým druhům plísní. Výrobci bylinných čajů tedy čelí širokému spektru plísní, ale jen menší část z těchto plísní je schopna produkovat mykotoxiny, které jsou spojeny s bezpečností potravin. Mykotoxiny jsou prakticky nezničitelné, takže jedinou cestou je prevence (14).

Jaké tedy mohou u čajů nastat problémy s plísněmi: První problém je vizuální, kdy plísně rostou přímo na čajové směsi, nebo se k sobě rostliny nepřirozeně lepí. Tento stav svědčí o tom, že rostliny nebyly při zpracování dostatečně vysušeny a během balení a skladování nebyly v dobrém stavu.

36

Druhým problém je zatuchlost čajů napadených plísněmi. Čaje při otevření neuvolní svou charakteristickou vůni a při přípravě se plísně vyluhují. Navíc přítomnost mykotoxinů, i v nepatrném množství, je pro spotřebitele nevhodná. Studie prokázaly jak u léčivých, tak u bylinných čajů nejčastější přítomnost plísně z rodu

Aspergillus,

Penicillium,

Mucor,

Rhizopus,

Alternaria,

Cladosporium

a Trichoderma. Alternaria, Cladosporium jsou obecně považovány za polní patogeny, Trichoderma je plíseň záměrně využívaná v pěstitelství pro omezení rostlinných škůdců. Další čtyři uvedené rody jsou nejběžněji plísněmi posklizňovými. Zvláště Aspergillus flavus je producentem obávaného aflatoxinu, který čaj nesmí obsahovat. Právě Aspergillus flavus byl přítomen u 18 % vzorků léčivých čajů a u 9 % čajů bylinných. Ochratoxin byl nalezen u 15 % analyzovaných vzorků. V turecké studii byly v bylinných čajích nalezeny i fumonisiny (FB1 a FB2) (75). Lze tedy říci, že rostlinný materiál, pokud je skladován a zpracováván nevhodně, tak je náchylný k plísním. Podle studií jsou růstem plísní a kontaminací mykotoxiny ohroženy i kořeny užívané v bylinných čajích (zázvor, lékořice, lopuch, smetanka lékařská) (32).

37

2.5.1.2.1 Plísně vyskytující se v bylinných čajích 2.5.1.2.1.1 Rod Aspergillus Rod Aspergillus, řád Eurotiales, oddělení Ascomycota. Do tohoto rodu je řazeno cca 200 druhů. Asi 20 druhů je považováno za lidské patogeny (14). Mycelium je plsťovitě-vatovitého vzhledu, neprůhledné, někdy bezbarvé a někdy velmi nápadně zbarvené. Staré kolonie jsou pokryté bílou, žlutou, zelenou, hnědou nebo černou vrstvou spór. Tento rod se vyskytuje ubikvitárně. Často způsobuje kažení poživatin a krmiv, ovoce a ovocných produktů, zeleniny, tuků, jedlých olejů a na tuk bohatých potravin. Vyskytuje se na obilí a mlýnských produktech. A. flavus a A. parasiticus se nacházejí v půdě, prachu, na rostlinách a jejich plodech. Plísně tohoto rodu jsou významnými producenty mykotoxinů. A. flavus, A. parasiticus a A. nomius jsou producenty aflatoxinu, A. carbonarius s A. ochraceus jsou producenty ochratoxinu A. Mohou být původci infekcí u člověka (systémové a povrchové mykózy) nejčastěji A. fumigatus, A. favus a A. niger. Plísně tohoto rodu bývají původci tzv. aspergilózy (invazivní, alergická bronchopulmonární, chronická nekrotizující plicní, aspergilom), která u imunokompromitovaných osob může být fatální. Nejčastějším původcem aspergilóz je A. fumigatus (14).

2.5.1.2.1.2 Rod Penicillium Do tohoto rodu je zahrnováno cca 220 druhů plísní. Jedná se o ploché vlnovité zrnité kolonie, mycelium je vzdušné a bezbarvé, substrátové mycelium je dle druhu odlišně zbarvené. Často je přítomen výpotek. Plísně tohoto rodu se vyskytují ubikvitárně a jsou častými kontaminanty potravin a okolního prostředí. Některé jsou choroboplodné a způsobují mykózy a jiné tvoří mykotoxiny (P. viridicatum). Konidie tohoto rodu jsou schopné působit obtíže alergikům a astmatikům, pokud se dostanou do dýchacích cest (61). Průmyslně se využívají k výrobě antibiotika penicilinu, jsou využívány pro zrání plísňových sýru apod. (14).

38

2.5.1.2.1.3 Rod Mucor Tento druh zahrnuje víc jako 50 druhů plísní. Vzdušné mycelium je vatovité, zpočátku bílé a v průběhu tmavne. Velmi rychle se rozrůstá. Hyfy jsou málo větvené a bez sept. V tekutých produktech tvoří některé druhy kvasinkovité shluky buněk tzv. kulovité mycelium. Z mycelia vyrůstají sporangiofory a nesou sporangia (bílá, později tmavá), která obsahují nepohlavní sporu. Jednotlivé druhy rodu Mucor se vyskytují na rostlinách, ovoci a na některých potravinách (mlýnské a pekárenské produkty). Některé druhy jsou patogenní a způsobují tzv. hloubkové mukorové mykózy (14).

2.5.1.2.1.4 Rod Rhizopus Do rodu Rhizopus patří 10 druhů plísní. Kolonie jsou vzhledem podobné koloniím rodu Mucor. Řadí se mezi saprofytické a parazitární houby. Běžně se nachází na zelenině, ovoci, pekařských výrobcích (14), dále v želé a sirupech, oříšcích a tabáku (33). Mycelium tohoto rodu je šedé. Některé druhy (R. oryzae) jsou patogenní a způsobují hloubkové mykózy vyskytující se u teplokrevných živočichů. Průmyslově se rod Rhizopus využívá k výrobě např. amylázy, kyseliny fumarové (R. stolonifer) a japonského alkoholického nápoje arak (R. oryzae) (14).

2.6.1.3.1.6 Rod Cladosporium Plísně rodu Cladosporium mají tmavé, ploché, matné kolonie. Do tohoto rodu patří cca 50 druhů, které jsou saprofytické nebo fakultativně rostlinoparazitické. Vyskytují se na obilí (polní flóra), na ovoci, zelenině, mase, textiliích a mnoha dalších organických předmětech. Cladosporium fagi tvoří toxin, kyselinu epikladosporinovou (14).

2.6.1.3.1.7 Rod Fusarium Kolonie rostou velmi rychle a dle druhu jsou bledé nebo jasně zbarvené. Barva stélky může být bíla, žlutá, hnědá, růžová, načervenalá či fialová. Mycelium tvoří dva typy konidií (makro - a mikrokonidie). Některé druhy navíc ještě vytvářejí

39

chlamydospory, což jsou zduřelé buňky se silnou stěnou umístěné uprostřed nebo na konci hyf a v makrokonidiích (47, 60). Výskyt fusarií je ubikvitární. Jsou součástí půdního ekosystému, působí závažné škody na rostlinách a ve skladech s rostlinnými produkty (kukuřice, ovoce, brambory aj.). Některé plísně tohoto rodu produkují mykotoxiny v obilí, čímž můžou negativně působit na zdraví lidí a zvířat (14).

2.5.1.2.2 Mykotoxiny tvořené plísněmi Mykotoxiny vznikají při růstu některých mikroskopických vláknitých hub na poživatinách a krmivech. Přesněji jsou sekundárními metabolity plísní nebílkovinné povahy a jsou toxické pro živočichy (61). Některé toxinogenní plísně produkují více než jeden druh mykotoxinů. Nejvýznamnějšími toxinogenními plísněmi jsou rody Aspergillus, Penicillium a Fusarium. Dle těchto producentů můžeme mykotoxiny rozdělit na mykotoxiny fuzáriové, aspergilové a penicilinové. Mykotoxiny působí toxicky na lidský organizmus (14).

2.5.1.2.2.1 Aflatoxiny Plísně A. flavus a A. parasiticus produkují aflatoxiny. Existuje 6 hlavních typů aflatoxinů: B1, B2, G1, G2, M1 a M2. Aflatoxiny jsou termorezistentní. Akutní otravy aflatoxiny nejsou známé, významnější je pro člověka jejich chronická toxicita. Také jejich teratogenní a karcinogenní účinek není zanedbatelný. U člověka mohou způsobovat Reyerův syndrom, zánět jater, primární hepatom, kwashiorkor a stavy spojené se snížením imunity. Nebezpečnost klesá v řadě aflatoxin B1,> M1> G1> M2> B2> G2. V italské studii byl nulový výskyt u 48 vzorků bylinek zakoupených na italském tržišti (51). V německé studii z roku 1995 bylo zkoumáno několik vzorků bylin na výskyt aflatoxinů 78 % obsahovalo A B1, 90 % A B2, 88 % A G1, 58 % A G2. U Kozlíku lékařského 79 % vzorků obsahovalo A B1, 71 % A B2, 88 % A G1, 68 % A G2 u fenyklu, 66 % A B1, 71 % A B2, 78 % A G1, 59 % A G2 u koriandru (49).

40

Ve 27 z 56 druhů bylin byly nalezeny plísně A.flavus, A.parasiticus a A.sojae. z nichž 50 % produkovala aflatoxiny v rozmezí 10 – 2000 µg/kg. (máta, koriandr, passiflora, kozlík, meduňka) (50).

2.5.1.2.2.2 Ochratoxin A Ochratoxin A (OTA) tvoří různé druhy plísní z rodů Aspergillus a Penicillium. Ochratoxin A se může vyskytovat v obilovinách, v podzemnici olejné, sušeném ovoci, kávě, kakau, koření, mase. U potravin živočišného původu se jedná o kontaminaci sekundární. Ochratoxin A byl v měnších množstvích nalezen v bylinných čajích a sušených bylinách (15). Ochratoxin A snižuje imunitu a je neurotoxický (61).

2.5.1.2.2.3 Patulin Patulin produkují plísně rodu Penicillium (P. expansum, P. urticae, P. patulum), Aspergillus, a také rodu Byssochlamys. Patulin má účinky karcinogenní, teratogenní a neblahé účinky na plíce, játra a ledviny. Na rozdíl od jiných mykotoxinů není termostabilní. Patulinem je kontaminováno hlavně ovoce (nejčastěji jablka), je tedy důležité dbát při zpracování ovoce na vytřídění shnilých a zaplísněných plodů. Patulin se v bylinných čajích může vyskytovat, pokud by čajová směs obsahovala kontaminované ovoce (61, 14).

2.5.1.2.2.4 Fusáriové mykotoxiny Plísně rodu Fusarium produkují mykotoxiny ze třídy trichothecenů (např. deoxynivalenol, nivalenol) a další toxiny jako jsou např. zearalenon a fumonisiny. Některé druhy fusárií mohou produkovat dva i více toxinů. Hlavními producenty fumonisinů v potravinách jsou F.verticillioides a F.proliferatum. Je známo asi 15 analogů (A1, A2, B1, B2, B3, B4), z nichž převládajícím toxinem v potravinách je B1. Způsobuje leukoencephalomalacii u koní, hydrothorax a plicní edém u prasat, je neurotoxický, hepatotoxický a napadá imunitu. B1 a B2 jsou statisticky spojeny s výskytem rakovin jícnu a primární rakoviny jater. Biochemickou podstatou jeho toxických účinků je interference s metabolismem sfingolipidů a tím patrně narušení membránových struktur (38, 14). 41

Ačkoliv se do potravinového řetězce člověka dostávají hlavně kontaminovanými zrny kukuřice, bylo provedeno několik studií zkoumající výskyt fumonisinů v bylinkových a léčivých čajích (50, 4, 35, 34, 71). Ze 115 analyzovaných vzorků se B1 vyskytoval v 86 vzorcích a B2 ve 102 vzorcích (43).V Polsku byla provedena studie na 79 vzorcích sušeného koření a bylin. Výskyt fumonisinů byl zjištěn u 31 % vzorků a výskyt ochratoxinu A u 49% (70). Ve studii z Jižní Afriky bylo kontaminováno typem B1 4/30 vzorků (55). Další studie z Jižní Afriky zjistila kontaminaci u 13 ze 16 vzorků v rozmezí 14 – 139 ng/kg (24). Kontaminace heřmánku byla 20 -70 ng/kg (36). V poslední studii týkajících se bylin byl nalezen obsah B1 v rozmezí 20 – 22 000 ng/kg a B2 5 – 3000 ng/kg. Z celkového počtu 152 vzorků jich bylo 16% kontaminováno plísní rodem Fusarium spp. (34).

42

2.5.1.2.2.5 Toxicita mykotoxinů Tab. 10 Přehled hlavních toxinů (25) Název toxinu Producent Aflatoxin B1, B2, Asperfillus flavus Aspergillus parasiticus G1, G2, M1 a M2

Ochratoxin

Aspergillus ochraceus Penicillium verrucosum

Zearalenon Trichoteceny (nivalenol, deoxynivalenol)

Fusarium spp. Fusarium spp.

Fumonisiny

Fusarium moniliforme Fusarium proliferatum

Patulin

Penicillium expansum

Hlavní toxické účinky • hepatotoxický (nádory jater u zvířat) • gastritidy • enteritidy • neurotoxický (nádory močového ústrojí, zjištěno u zvířat) • teratogenní (zjištěno u zvířat) • estrogenní účinky • záněty trávicího traktu • poškozování krvetvorby • anémie • aborty a imunosuprese (zjištěno u zvířat) • hepatotoxický • nádory jater • nádroy jícnu • plicní edem (u prasat) • neurotoxický • inhibice syntézy bílkovin • intestinální hyperémie • gastroenteritidy • dermální iritace • imunotoxicita • genotoxicita (u zvířat)

Toxicita těchto mykotoxinů se snižuje v pořadí aflatoxiny, ochratoxin > zearalenon, trichotheceny, patulin > fumonisiny (34, 14).

2.5.1.2.2.6 Limity mykotoxinů Nejvyšší přípustná množství (NPM) mykotoxinů a jiných dalších kontaminantů v potravinách jsou stanovena Nařízením (ES) Komise č. 1881/2006 ve znění Nařízení (ES) č. 1126/2007, č. 629/2008, č. 165/2010. Hodnoty týkající se přímo bylinných čajů či bylin nejsou (až na pár výjimek např. lékořice specifikovány) (10, 42). Potraviny, které by přesahovaly daný maximální limit kontaminujících látek, se nesmí uvést na trh (10, 42). 43

Pokud se alespoň obecně srovnají hodnoty NPM a ADI (Acceptable Daily Intake) s hodnotami skutečného příjmu, vycházejícího z monitoringu, dá se usuzovat, že alimentární riziko plynoucí z konzumace potravin je přiměřené. O případech kdy by potravina obsahovala nadlimitní množství mykotoxinů to ovšem tvrdit nelze. Je tedy důležité nepodceňovat preventivní opatření (25).

Tab. 11 Srovnání obecných hodnot NPM (legislativní limity) s příjmem (ADI) ve vztahu k hodnotám výskytu a příjmu (25) Toxin aflatoxiny, ochratoxin

Výskyt [µg/kg] NPM skutečnost jednotky jednotky až desítky

zearalenon, trichotheceny, desítky až stovky patulin fumoniziny

103

Příjem [µg/kg] ADI skutečnost setiny desetiny až desetiny

desítky až stovky

desítky

jednotky

104 až 105

desítky

jednotky

2.5.1.2.2.7 Prevence výskytu mykotoxinů Základem prevence je nesklízet vlhké, nevyzrálé suroviny a skladovat je v suchých a větraných prostorách. Ovoce je dobré sklízet ručně a třídit jej již před sušením. Suroviny k výrobě by měly být nepoškozené, nezaplísněné a chráněny před opětovným zvlhnutím či zapařením. U dovážených surovin by měl být pravidelně prováděný monitoring výskytu mykotoxinů.

2.5.1.3 Kvasinky Suroviny pro výrobu bylinných čajů jsou rostlinného původu. Kontaminovány kvasinkami mohou být již z přírody. Jelikož je bylinným čajem i čaj s příměsí ovoce (obsah bylin musí činit minimálně 50 % hmotnosti), dá se přítomnost kvasinek v bylinném čaji předpokládat. Kvasinky patří mezi heterotrofní eukaryotní mikroorganizmy řazené mezi houby (Fungi). Nejčastěji jsou tvaru elipsoidního, vejčitého až kulovitého. Rostou za aerobních podmínek, ale za podmínek anaerobních jsou schopny změnit svůj metabolizmus na fermentační a produkovat etanol a CO2 (14, 60). 44

Výskyt kvasinek je omezen jejich nižší tepelnou odolností. Jsou většinou usmrceny už po 2 – 5minutovém zahřívání na 56 °C. Spory kvasinek jsou nepatrně teplotně odolnější. Oproti bakteriím se kvasinky rozmnožují pomaleji. S bakteriemi mohou tedy soutěžit jen za podmínek, které znesnadňují bakteriální růst (nízké pH, nízký oxidoredukční potenciál). Kvasinky a kvasinkovité organizmy jsou v prostředí velmi rozšířené. Nacházejí se nejčastěji na materiálech, které obsahují cukry (ovoce - především peckové a bobulové, cukernaté potraviny). Dále je můžeme najít v květních nektarech, výronech stromů, půdě, ve vzduchu, a také ve střevním traktu lidí, zvířat a hmyzu (zejm. včel). Do okolí jsou kvasinky roznášeny např. hmyzem a větrem. V květních nektarech se vyskytují kvasinky rodu Cryptococcus, Rhodotorula, Sporobolomyces a vyjímečně rodu Candida. Na ovoci se vyskytují hlavně kvasné typy rodu Saccharomyces, Saccharomycodes, Kloeckera. Ve vzduchu se nejčastěji vyskytují kvasinky rodu Rhodotorula (14, 60). Patogenní kvasinky (např. Candida albicans, Cryptococcus neoformans) způsobují onemocnění u jedinců oslabených nebo u jedinců s poškozeným imunitním systémem. K fytopatogenním druhům kvasinek patří například kvasinky rodu Nematospora, Ashbya a jsou přenášeny hmyzem (14, 60).

2.5.2 Význam vybraných indikátorových mikroorganizmů Indikátorové bakterie a jejich počty podávají informaci o primární či sekundární kontaminaci surovin a poživatin, ploch přicházejících do styku s poživatinami, o dodržování zásad správné výrobní praxe, o správných parametrech technologických postupů při výrobě potravin. Indexové bakterie informují o možném výskytu choroboplodných bakterií v poživatinách a pitné vodě (14).

2.5.2.1 Význam hodnocení celkového počtu mikroorganizmů Pojmem „celkový počet mikroorganizmů“ se rozumí počet kolonií (KTJ kolonie tvořící jednotky, angl. CFU – colony forming units) stanovených v 1 ml nebo v 1 g vzorku zřeďovací kultivační metodou. Stanovený počet KTJ je jen určité procento z reálného množství bakterií v nebo na vyšetřovaném materiále. Pomocí stanovení CPM lze zjistit, zda výrobě určitého produktu byla věnovaná dostatečná pozornost. Vyšší 45

hodnota CPM upozorňuje, na vysokou primární kontaminaci (kontaminované vstupní suroviny, kontaminované nářadí a zařízení) nebo na sekundární kontaminaci (např. nežádoucí množení bakterií v době skladování) (14).

2.5.2.2 Význam hodnocení termorezistentních bakterií Termorezistentní bakterie jsou schopné přežívat vyšší teploty, než jsou jejich optimální (maximální teplota neteremorezistentních = optimální teplota + 10 °C). Do této skupiny se z praktických příčin můžou zahrnovat i sporotvorné bakterie (termorezistentní jsou jejich endospory). Jako termorezistentní jsou určovány ty bakterie, které přežívají termizační a pasterační teploty a časy (60 °C po dobu 30 min a 71,5 °C až 85 °C po dobu 40 až 5 s) a nerozmnožují se při nich. K termorezistentním bakteriím se řadí některé bakterie z rodu Micrococcus, Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus,

Bacillus,

Clostridium

a

některé

gramnegativní

bakterie.

Termorezistentními bakteriemi jsou kontaminovány poživatiny půdou, prachem, nečistým nářadím (při získávání, opracování a zpracování) (14).

2.5.2.3 Význam hodnocení počtu plísní a kvasinek Plísně mohou produkovat mykotoxiny, mohou být původci kažení potravin a mohou být indikátorem mikrobiologické jakosti potravin. Kvasinky a plísně rostou i při nízké aktivitě vody a i jejich optimální tepoty růstu jsou nižší. Ve významné míře se zúčastňují kažení potravin a mohou být původci alimentárních onemocnění (14).

2.5.2.4 Význam hodnocení počtu koliformních bakterií Mezi indikátorové a indexové koliformní bakterie patří všechny bakterie čeledi Enterobacteriaceae. V této čeledi jsou zastoupeny nepatogenní, podmíněně patogenní i patogenní druhy a i stejný příslušníci stejného druhu mohou mít z hlediska patogenity odlišné vlastnosti (14).

46

Tab. 12 Přehled nedůležitějších rodů čeledě Enterobacteriaceae (14) Rody

Vlastnosti

Escherichia

koliformní, podmíněně patogenní

Shigella

patogenní

Salmonella

patogenní

Citrobacter

koliformní, podmíněně patogenní

Klebsiella

koliformní, podmíněně patogenní

Enterobacter

koliformní

Erwinia

-

Serratia

-

Hafnia

-

Edwardsiella

podmíněně patogenní

Proetus

podmíněně patogenní

Providencia

podmíněně patogenní

Morganella

podmíněně patogenní

Yersinia

patogenní

Nepatogenní a podmíněně patogenní druhy jsou pravidelnou součástí střevní mikroflóry. Patogenní rody zejm. Salmonella, Shigella, Yersinia a patogenní kmeny Escherichia coli jsou jen příležitostnou součástí střevní mikroflóry (infekční jedinec, zdravý bacilonosič). Nález

nepatogenních

či

podmíněně

patogenních

rodů

a

druhů

čeledi

Enterobacteriaceae vypovídat o tom, že byly poživatiny, předměty a pitná voda přímo znečištěné fekáliemi. Tento výskyt je vhodné chápat v souvislostech s charakterem vyšetřovaného materiálu, s technologií jeho získávání, opracování a zpracování. Pro svou termolabilnost jsou v potravinách indikátorem spolehlivosti pasterizace a termizace. Jsou indikátorem primární a sekundární kontaminace potravin. Pro svou chemolabilnost jsou indikátorem sanitace (čistění a dekontaminace) u technologického nářadí a zařízení. V pitné vodě jsou indikátorem a indexem jakosti pitné vody (14).

47

2.6 Ovlivnění počtu mikroorganizmů u bylinných čajů 2.6.1 Vodní aktivita aw a mikroorganizmy Aktivitou vody se rozumí poměr tlaku vodních par potraviny k tlaku par destilované vody při určité teplotě. Hodnoty aktivity vody se pohybují v rozmezí 0.00 (úplně suchá látka) do 1,0 (destilovaná voda) (60). Mikroorganizmy potřebují pro svou látkovou přeměnu vodu. Jejím snižováním zpomalují svůj růst až se v nich látková přeměna může naprosto zastavit. Citlivé mikroorganizmy za takovýchto podmínek odumírají. Optimální hodnota aw je pro většinu mikroorganizmů aw > 0,98. Při snižování hodnoty aw - odnímáním vody (např. sušením) se částečně snižuje až inhibuje růst mikroorganizmů. Odolnost vůči nízké hodnotě vodní aktivity se snižuje v řadě plísně > kvasinky > bakterie grampozitivní > bakterie gramnegativní. Mikroorganizmy, které jsou obzvláště přizpůsobivé nízkým hodnotám, jsou označovány jako organizmy xerotolerantní (14). Minimální hodnota aw pro kvasinky je 0,87 – 0,94 a pro plísně 0,70 – 0,80.

2.6.1.1 Sušení léčivých bylin V sušených potravinách se mikroorganizmy nemnoží, ale přežívají. Sušení má mikrobiostatický účinek. U sušených potravin se dá říci, že čím je potravina sušší, tím má nižší hodnotu aw. Pro sušení se používají mírné podmínky, aby bylo zabráněno nežádoucím změnám – ztrátě chuti, barvy, éterických olejů. Tyto mírné podmínky nemají však výrazný efekt na mikrobiální flóru (31). I přes přežívání mikroorganizmů při sušení se sušení jeví jako vhodný způsob uchovávání bylin, který lze z hygienického hlediska doporučit (19).

2.6.2 Snižování mikrobiologické kontaminace čajů Vzhledem k charakteristice vstupních surovin (léčivé rostliny) pro výrobu čajů je nutné podotknout, že není možné dosáhnout přirozeně sterilní suroviny.

48

Existuje více možností ošetření rostlinných drog. •

Sterilizace teplem (fyzikální metoda) není příliš vhodná pro drogy z léčivých rostlin.

•

Užití tlakových komor není vhodné pro drogy s těkavými látkami.

•

Snížení kontaminace využívající chemických prostředků už není často v praxi využíváno, jelikož je problematické. Zbytky etylenoxidu (etylenchlorhydrin a etylenglykol) reagují s obsahovými látkami drogy. Etylenoxid ničí bakterie, viry, bakteriofágy, kvasinky i houby. Pouze spory jsou částečně rezistentní. V této době se využívá už jen ke sterilizaci např. kontejnerů, které by sloužily pro transport léčivých rostlin.

•

Propařování suchou kritickou párou – metoda založená na účinku vodní páry nebo suché kritické páry. Při této metodě ošetření dochází u léčivých rostlin k mírnému snížení obsahu silic (26).

•

Biosterilizace – metoda sterilace za použití vysokého tlaku, při které bohužel dochází i ke změně textury suroviny (26).

2.6.2.1 Ozařování V České republice je ozařování potravin regulováno Vyhláškou č. 133/2004 Sb., o podmínkách ozařování potravin a surovin, o nejvyšší přípustné dávce záření a o způsobu označení ozáření na obalu. Ionizujícím zářením se rozumí záření tvořené částicemi nabitými, nenabitými nebo obojími, schopnými přímo nebo nepřímo ionizovat. Lze použít gama záření radionuklidů

60

Co nebo

137

Cs, rentgenové záření

o energii nepřevyšující 5 MeV, nebo urychlené elektrony o energii nepřevyšující 10 MeV (68). Dle vyhlášky lze sušené byliny ozářit ionizujícím zářením o nejvyšší přípustné celkové průměrné absorbované dávce 10,0 kGY. Stanovená hodnota platí pro maximální celkovou průměrnou, jednorázovou i kumulovanou absorbovanou dávku. Sušené byliny lze ošetřit ionizujícím zářením, jen pokud pro to existuje dostatečná technologická nutnost, nevznikne zdravotní riziko pro spotřebitele, je to příznivé pro spotřebitele a hlavně pokud není ozáření použito jako náhrada hygienických a 49

zdravotních opatření nebo správné výrobní a zemědělské praxe. Informace o ozáření musí být uvedeny na obale dle vyhlášky č. 133/2004 Sb (68).

2.6.2.2 Předcházení mikrobiální kontaminaci - preventivní opatření Vzhledem k typu využívání LAKR je nutná stálá kontrola všech výrobních procesů, aby bylo zabráněno mikrobiální kontaminaci. Obecným a stěžejním opatřením je vstupní mikrobiologická kontrola všech surovin pro výrobu bylinných čajů. V rámci vstupní kontroly se provádí stanovení jednotlivých skupin mikroorganizmů. V laboratořích si výrobci nechávají nejčastěji stanovovat CPM, Escherichia coli, koiformní bakterie, kvasinky, plísně, Salmonella spp, a dle potřeby Staphylococcus aureus. (27, 48). Je důležité využívat kvalitní a nekontaminovaný obalový materiál. V praxi se také často objevuje pravidelné vysvěcování výrobních prostor UV zářením. Řízení se legislativou, funkční systém HACCP, řízení se pravidly správné výrobní a hygienické praxe je předpokladem pro výrobu zdravotně nezávadných a kvalitních výrobků (27, 48, 19).

50

3 CÍLE PRÁCE Cílem práce bylo zjistit úroveň mikrobiálního znečistění u vybraných druhů porcovaného bylinného čaje nejen z konvenčního, ale i ekologického zemědělství. Práce proběhla v mikrobiologické laboratoři, kdy byly opakovány mikrobiologické rozbory s využitím plotnové metody. U bylinných čajů se stanovoval celkový počet mikroorganizmů, počet kvasinek, plísní, koliformních a termorezistentních bakterií.

51

4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Charakteristika materiálu Všechny vzorky byly získány či nakoupeny v období listopad – únor 2014 v běžné prodejní síti v Brně. 6 výrobků je čistě bylinných, 2 jsou s příměsí ovoce, všechny jsou bylinné směsi na nachlazení a některé z nich jsou určeny dětem.

I.

Čaj A – bio bylinný čaj, pro děti a dospělé na nachlazení

Bylinný čaj porcovaný, v nálevových sáčcích. Složení

Příprava

máta kadeřavá, heřmánek, černý bez květ, lípa květ, šalvěj list, tymián (vše bio) Čajový sáček na 1 šálek, přelejte vroucí vodou a nechte 5 – 10 minut luhovat. Skladovat v suchu a chladu.

Hmotnost 20 g Minimální trvanlivost do konce: 10.2015 Skladovat v suchu a chladu.

II.

Čaj B – bio bylinný čaj s ovocem

Bylinný čaj porcovaný, v nálevových sáčcích. Složení

Příprava

šípek, jablka, citronová tráva, máta kadeřavá, ibišek, jahody kousky, sedmikráska, chrpa, měsíček (vše bio) Čajový sáček na 1 šálek, přelejte vroucí vodou a nechte 10 minut luhovat. Skladovat v suchu a chladu.

Hmotnost 45 g Minimální trvanlivost do konce: 06.2015 Skladovat v suchu a chladu.

52

III.

Čaj C – bio bylinný čaj s ovocem

Bylinný čaj porcovaný, v nálevových sáčcích. Složení

Příprava

brusinky 30%, šípek, ibišek květ, jablka kousky, pomerančová kůra (vše bio) Čajový sáček na 1 šálek, přelejte vroucí vodou a nechte 10 minut luhovat. Skladovat v suchu a chladu

Hmotnost 50,4 g Minimální trvanlivost do konce: 07.2015 Skladovat v suchu a chladu.

IV.

Čaj D – konvenční čaj

Doplněk stravy. Bylinný čaj porcovaný, v nálevových sáčcích. Složení

lípa malolistá květ 30 g, tužebník jilmový – nať 20 g, černý bez květ 17 g,

ve 100 g

heřmánek pravý květ 13 g, jitrocel kopinatý list 13 g, maliník obecný list

Příprava

Čajový sáček na 1 šálek, přelejte vroucí vodou a nechte 10 minut luhovat. Skladovat v suchu a chladu

Hmotnost 30 g (20 nálevových sáčků po 1,5 g) Minimální trvanlivost do konce: 10.2015 Ukládejte mimo dosah dětí. Skladujte v suchu při teplotě do 25 °C. Poznámka výrobce: Doporučené dávkování 2 až 3 šálky za den. Není určeno pro děti do 3 let. Nepřekračujte doporučené dávkování. Není určeno jako náhrada pestré stravy.

53

IV.

Čaj E – konvenční čaj

Bylinný čaj porcovaný, v nálevových sáčcích. Složení ve 100 g Příprava

heřmánkový květ Nálevový sáček přelijeme ¼ l vařící vody a necháme 5 – 10 minut vyluhovat. Používá se vlažný. Připravuje se vždy čerstvý.

Hmotnost 30 g (20 nálevových sáčků po 1,5 g) Minimální trvanlivost do: 04.09.2015 Uchovávejte na suchém místě do 25 °C, chráněn před světlem a cizími pachy.

IV.

Čaj F – konvenční čaj

Bylinný čaj porcovaný, v nálevových sáčcích. Složení

mateřídouška 44 %, anýz 18 %, fenykl 18 %, květ heřmánku 5 %, třapatka

ve 100 g

nachová (Echinacea) 5 %, tymián 5 %, květ měsíčku

Příprava

Čajový sáček na 1 šálek, přelejte vroucí vodou (200 ml) a nechte 6 - 8 minut luhovat.

Hmotnost 40 g. Minimální trvanlivost do: 11.2014 Skladujte v suchu a temnu.

54

IV.

Čaj G – konvenční čaj pro děti

Bylinný čaj porcovaný, v nálevových sáčcích. Složení

heřmánek květ, fenykl plod, šípek, jahodník list, maliník list, ostružiník list,

ve 100 g

sedmikráska květ, lípa květ, černý rybíz list

Příprava

Jeden sáček zalijeme ¼ litrem právě vroucí vody a necháme 10 – 15 minut louhovat.

Hmotnost 30 g (20 x 1,50 g). Minimální trvanlivost do: 24.12.2014 Uchovejte v suchu a teplotě do 25 °C.

IV.

Čaj H – konvenční čaj pro děti

Bylinný čaj porcovaný, v nálevových sáčcích. Složení (ve

100

g)

šípky (40 %), nať mateřídoušky (20 %), anýz, lipový květ, květ černého bezu (10 %), diviznový květ (5 %) 1 nálevový sáček přelijeme šálkem (¼ l) vařící vody a po 5 – 10 minutách

Příprava

vyluhování v přikryté nádobě sáček vyjmeme. Čaj se nesmí vařit. Připravuje se vždy čerstvý.

Hmotnost 30 g (20 x 1,50 g) Minimální trvanlivost do: 20.11.2015 Uchovávejte na suchém místě do 25 °C, chráněn před světlem a cizími pachy.

Poznámka výrobce: Děti od 6 měsíců do 3 let: 1-2 šálky denně, po lžičkách nebo z dětské láhve. Děti od 3 let: 3-4 šálky denně. Dospělí: 4-6 šálků denně. Nepřekračujte uvedené dávkování.

55

4.2 Metodika mikrobiologického rozboru Při zpracování vzorků byla použita plotnová metoda. Nejmenovanou firmou (XY) byly poskytnuty 3 druhy bio bylinkových čajů, dalších 5 vzorků bylo zakoupeno od různých firem konvenčního zemědělství. Rozbory byly pro jednotlivé výrobky dle potřeby dva až třikrát opakovány.

4.2.1 Příprava laboratorních pomůcek Laboratorní sklo bylo sterilizováno v horkovzdušném sterilizátoru při 160 °C po dobu 60 minut. Další přístroje a pomůcky byly minimálně 15 minut sterilizovány v parním sterilizátoru při teplotě 121 °C. Veškeré sterilní pomůcky a nástroje byly do upotřebení uchovávány tak, aby byla zachována jejich sterilita. K laboratorní práci byly použity jednorázové sterilní násadky na automatické pipety a jednorázové sterilní Petriho misky.

4.2.2 Zpracování vzorku 4.2.2.1 Studený nálev 4.2.2.1.1 Stanovení koliformních bakterií, CPM, kvasinek a plísní Nálevový sáček daného vzorku bylinného čaje (tzn. vzorek č. 1 až 8) byl zalit 100 ml sterilního fyziologického roztoku a homogenizován v homogenizátoru typu STOMACHER po dobu 1 minuty. Poté bylo provedeno desetinné ředění. 1 ml potřebného ředění byl očkován do sterilních, řádně označených Petriho misek. Inokulum bylo zalito živnou půdou (plotnová metoda), která byla zchlazená na 45 °C. Inokulum s živnou půdou bylo v misce řádně promícháno krouživými pohyby a směs se nechala ztuhnout. Od každého ředění byly naočkovány dvě misky. Plotny se po zatuhnutí inkubovaly v termostatu dnem vzhůru. Po inkubaci se provedl odečet narostlých kolonií.

4.2.2.1.2 Stanovení termorezistentních bakterií Do sterilních zkumavek se napipetovalo 10 ml z připravených ředění daného vzorku. Zkumavky byly následně pasterovány ve vodní lázni při 85 °C po dobu 10 56

minut. Poté byl 1 ml potřebného ředění očkován do sterilních, řádně označených Petriho misek. Inokulum bylo zalito živnou půdou, vše opět krouživými pohyby promícháno a necháno zatuhnout. Plotny byly inkubovány v termostatu dnem vzhůru a po inkubaci byl proveden odečet narostlých kolonií.

4.2.2.2 Horký nálev Nálevový sáček daného vzorku bylinného čaje (tzn. vzorek č. 1 až 8) byl zalit 200 ml vroucí vody ve skleněné sterilní láhvi s uzávěrem. 100 ml nálevu bylo přelito do další sterilní skleněné láhve s uzávěrem. Do druhé láhve bylo přidáno 5 g laboratorní sacharozy (pro spotřebitele toto množství odpovídá 1 kostce cukru). 1 ml potřebného ředění byl očkován do sterilních, řádně označených Petriho misek v čase t0. Inokulum bylo zalito živnou půdou, která byla zchlazená na 45 °C. Inokulum s živnou půdou bylo v misce řádně promícháno krouživými pohyby a směs se nechala ztuhnout. Byly naočkovány dvě misky (koliformní bakterie) nebo 3 misky (CPM, kvasinky, plísně). Plotny se po zatuhnutí inkubovaly v termostatu dnem vzhůru. Po inkubaci se provedl odečet narostlých kolonií. Po čtyřech hodinách (čas t4) byly vzorky řádně promíchány a bylo provedeno další očkování vzorků dle postupu výše. Po 24 hodinách od zalití nálevových sáčků vroucí vodou byly vzorky pečlivě promíchány. Bylo provedeno desetinné ředění. 1 ml potřebného ředění byl očkován do sterilních, řádně označených Petriho misek. Inokulum bylo zalito živnou půdou, která byla zchlazená na 45 °C. Inokulum s živnou půdou bylo v misce řádně promícháno krouživými pohyby a směs se nechala ztuhnout. Od každého ředění byly naočkovány dvě misky. Plotny se po zatuhnutí inkubovaly v termostatu dnem vzhůru. Po inkubaci se provedl odečet narostlých kolonií.

57

4.2.3 Použité kultivační půdy 4.2.3.1 PCA – Plate Count Agar Trypton

5,0 g/l

Kvasničný extrakt

2,5 g/l

Glukóza

1,0 g/l

Agar

12,0 g/l

Příprava: 20,5 g dehydrované půdy se rozpustí v 1000 ml destilované vody. Upraví se pH na předepsanou hodnotu 7 ± 0,2 při 25 °C a takto připravená živná půda se sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 minut.

Výrobce: Biokar Diagnostic, Francie.

4.2.3.2 CGA – Chloramphenicol Glucose Agar Agar s kvasničným extraktem, glukózou a chloramfenikolem Kvasničný extrakt

5,0 g/l

Glukóza

20 g/l

Chloramfenikol

0,1 g/l

Agar

15,0 g/l

Příprava: 40,1 g dehydrované půdy se rozpustí v 1000 ml destilované vody. Upraví se pH na předepsanou hodnotu 6,6 ± 0,2 při 25 °C a takto připravená živná půda se sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 minut.

Výrobce: Biokar Diagnostic, Francie.

58

4.2.3.3 VRBL – Violet Red Bile agar Agar krystalovou violetí, neutrální červení, žlučí a laktózou Pepton

7,0 g/l

Kvasničný extrakt

3,0 g/l

Laktóza

0,1 g/l

Chlorid sodný

5,0 g/l

Žlučové soli

1,5 g/l

Neutrální červeň

0,03 g/l

Krystalová violeť

0,002 g/l

Agar

12,0 g/l

Příprava: 38,5 g dehydrované půdy rozpustíme v 1000 ml destilované vody. Upraví se pH na předepsanou hodnotu 7,4 ± 0,2 při 25 °C a poté se půda povaří.

Výrobce: Biokar Diagnostic, Francie.

4.2.4 Stanovované skupiny mikroorganizmů •

Stanovení celkového počtu mikroorganizmů (CPM) na živné půdě PCA (Plate Count Agar). Plotny byly inkubovány v termostatu při 30 °C po dobu 72 hodin.

•

Stanovení koliformních bakterií na selektivní živné půdě VRBL. Plotny byly inkubovány v termostatu při 37 °C po dobu 24 hodin.

•

Stanovení plísní a kvasinek na půdě s chloramfenikolem. Plotny byly inkubovány při 25 °C po dobu cca 120 hodin.

•

Stanovení termorezistentních bakterií na živné půdě PCA. Plotny byly inkubovány v termostatu při 30 °C po dobu 48 hodin.

59

4.3 Vyhodnocení výsledků Po ukončení kultivace pro určitou skupinu mikroorganizmů byly spočítány kolonie (KTJ) na jednotlivých Petriho miskách. Zjištěné množství KTJ bylo přepočteno na gram výrobku pomocí vzorce:

=

∑ + ,

Kde: N

je počet kolonií tvořících jednotky (KTJ) na 1 g vzorku

ΣC je součet kolonií vyrostlých na Petriho miskách při dvou po sobě jdoucích ředěních V

je objem inokula v ml, které je očkováno na jednotlivou plotnu

n1

je počet ploten používaných pro výpočet z prvního ředění

n2

je počet ploten používaných pro výpočet z druhého ředění

d

je faktor prvního, pro výpočet použitého, ředění

Výsledky mikrobiologické analýzy byly vyjádřeny jako aritmetický průměr. Konečný výsledek počtu mikroorganizmů je vyjádřen v KTJ v 1 g bylinného čaje a také je přepočítán na počet KTJ v jednom nálevovém sáčku.

60

5 VÝSLEDKY Zjištěná data byla zpracována do tabulek a grafů pomocí softwaru Microsot Office Excel 2007. Ke statistické analýze dat byl použit program Statistica vision 12.

5.1 Celkové výsledky mikrobiologické analýzy bylinných čajů Tab. 13 CPM, plísně, kvasinky, koliformní a termorezistentní bakterie v KTJ.g-1 Koliformní

Termorezistentní

bakterie

bakterie

5,61.102

5,97.104

3,94.105

2,20.102

9,30.101

3,70.101

9,33.102

2,42.103

1,41.103

8,60.101

1,73.102

8,60.101

D

2,17.107

3,97.104

7,19.104

7,14.105

3,51.105

E

4,23.106

1,54.103

ND

1,58.105

1,63.106

F

1,69.106

3,04.102

ND

1,71.104

1,94.106

G

1,30.106

3,21.103

2,22.102

2,15.105

4,38.104

H

6,05.106

3,21.103

2,53.104

1,37.105

1,19.105

Průměr

4,46.106

6,19.103

1,23.104

1,62.105

5,59.105

Medián

1,50.106

1,49.103

1,58.102

9,83.104

2,35.105

7,26.106

1,36.104

2,56.104

2,37.105

7,74.105

2,57.106

4,80.103

9,07.103

8,36.104

2,74.105

Vzorek

CPM

Plísně

Kvasinky

A

7,45.105

1,71.103

B

7,64.103

C

Směrodatná odchylka SEM

Pozn. SEM = standardní chyba průměru: SEM = s / √n ND = nedetekováno

61

log KTJ.g-1 8 7 6 5 4 3 2 1 0 A

B

C

D

E

F

G

H

Název čaje

Obr. 3 Logaritmus celkového počtu mikroorganizmů v KTJ.g-1 výrobku log KTJ.g-1 5 4 3 2 1 0 A

B

C

D

E

Název čaje

Obr. 4 Logaritmus počtu plísní v KTJ.g-1 výrobku

62

F

G

H

log KTJ.g-1 5 4 3 2 1 0 A

B

C

D

E

F

G

F

G

H

Název čaje

Obr. 5 Logaritmus počtu kvasinek v KTJ.g-1 výrobku

log KTJ.g-1 6 5 4 3 2 1 0 A

B

C

D

E

Název čaje

Obr. 6 Logaritmus počtu koliformních bakterií v KTJ.g-1 výrobku

63

H

log KTJ.g-1 7 6 5 4 3 2 1 0 A

B

C

D

E

F

G

Název čaje

Obr. 7 Logaritmus počtu termorezistentních bakterií v KTJ.g-1 výrobku

64

H

5.2 Celkový počet mikroorganizmů 5.2.1 Vývoj počtu CPM v KTJ.g-1 v čase Tab. 14 Vývoj počtu CPM v KTJ.g-1 v čase u neslazeného nálevu Čas

Vzorek neslazený

0h

4h

24 h

A

4,95.104

5,12.104

6,29.106

B

1,50.104

1,33.104

1,68.104

C

6,90.101

6,90.101

2,30.101

D

1,36.105

1,78.105

2,07.104

E

2,08.105

2,01.105

3,81.107

F

2,76.105

2,29.105

3,07.107

G

9,35.104

7,15.104

1,66.105

H

2,20.105

2,09.105

1,11.107

log KTJ.g-1 8 7 6

A B

5

C D

4

E 3

F G

2

H

1 0 0

4

8

12

16

20

24

čas [h]

Obr. 8 Vývoj počtu CPM v KTJ.g-1 v čase u neslazeného nálevu

65

Tab. 15 Vývoj počtu CPM v KTJ.g-1 v čase u slazeného nálevu Čas

Vzorek slazený

0h

4h

24 h

A

1,29.105

6,63.104

3,37.106

B

1,50.104

1,42.104

1,28.104

C

9,20.101

4,60.101

3,40.101

D

1,16.105

9,50.104

2,05.105

E

1,90.105

2,25.105

4,14.107

F

2,48.105

2,63.105

3,76.107

G

7,49.104

6,76.104

1,97.104

H

2,25.103

2,06.105

2,72.107

log KTJ.g-1 8 7 A

6

B 5

C D

4

E 3

F G

2

H

1 0 0

4

8

12

16

20

24

čas [h]

Obr. 9 Vývoj počtu CPM v KTJ.g-1 v čase u slazeného nálevu

66

5.2.2 Srovnání vývoje počtu CPM v KTJ.g-1 v čase Tab. 16 Srovnání vývoje počtu CPM v KTJ.g-1 v čase u neslazeného a slazeného nálevu čas CPM

0h

4h

24 h

neslazené

9,69.104

1,20.105

1,37.10¨7

slazené

1,25.105

1,19.105

1,08.107

log KTJ.g-1 8 7 6

SLAZENÉ NESLAZENÉ

5 4 0

4

8

12

16

20

24

čas [h]

Obr. 10 Srovnání vývoje počtu CPM v KTJ.g-1 v čase u neslazeného a slazeného nálevu

67

V případě statistického testování pro hypotézy č. 1 – 7 byl na začátku vždy proveden test normality Shapiro-Wilkův, který je vhodný pro soubory o malém množství dat. Ve všech případech vyšla jeho p-hodnota nižší než 0,05, proto byl následně použit neparametrický

vícevýběrový

test

pro

nezávislé

vzorky

Kruskal-Wallis

nebo neparametrický dvouvýběrový Mann-Whitney test. Dle jejich získané výsledné p-hodnoty se potvrdila nebo vyvrátila daná hypotéza.

Hypotéza č. 1 H0: Celkový počet mikroorganizmů (KTJ.g-1) mezi jednotlivými čaji se neliší. HA: Mezi jednotlivými čaji je rozdíl v celkovém počtu mikroorganizmů. Testování normality – Shapiro-Wilkův test pro malé množství vzorků (P = 0,00210

p < 0,05

test ukazuje na nenormální

rozdělení, musíme použít neparametrické statistiky)

Histogram: KTJ/g Shapiro-Wilk W=,79138, p=,00210 Očekávané normální 10 9 8

Počet pozor.

7 6 5 4 3 2 1 0 -20000

0

20000

40000

60000

x <= hranice kategorie

Obr. 11 Histogram – testování normality

68

80000

1E5

1,2E5

Testování závislosti – Kruskall-Wallisův mnohonásobné porovnání.

test

pro

neparametrické statistiky

P=0,0686 Závěr: P-hodnota je větší než 0,05. Nulovou hypotézu na hladině významnosti α = 0,05 nelze zamítnout. Není statisticky významný rozdíl v celkovém počtu mikroorganizmů (KTJ.g-1) mezi jednotlivými čaji.

Obr. 12 Krabicový graf celkového počtu mikroorganizmů u všech vzorků bylinného čaje

Hypotéza č. 2 H0: Není rozdíl mezi kontaminací CPM Bio čajů a čajů z konvenčního zemědělství HA: Je rozdíl mezi bio čaji a čaji z konvenčního zemědělství Testování normality – Shapiro-Wilkův test pro malé množství vzorků P=0,00210

p<0,05

test ukazuje na nenormální rozdělení,

musíme použít neparametrické statistiky

69

Testování závislosti – Mann-Whitney test pro neparametrické statistiky dvouvýběrové testy

P = 0,002857

Závěr: P-hodnota je menší než 0,05. Nulovou hypotézu na hladině významnosti α = 0,05 zamítáme a potvrzujeme hypotézu alternativní. Je rozdíl mezi bio čaji a čaji z konvenčního zemědělství.

Obr. 13 Krabicový graf srovnání celkové počtu mikroorganizmů u čajů z ekologického a konvenčního zemědělství

70

5.3 Počty koliformních bakterií Hypotéza č. 3 H0: Není rozdíl mezi kontaminací koliformními bakteriemi bio čajů a čajů z konvenčního zemědělství HA: Je rozdíl mezi bio čaji a čaji z konvenčního zemědělství Testování normality – Shapiro-Wilkův test pro malé množství vzorků P=0,00011

p<0,05

test ukazuje na nenormální rozdělení,

musíme použít neparametrické statistiky

Testování závislosti – Mann-Whitney test pro neparametrické statistiky dvouvýběrové testy P = 0,010806 Závěr: P-hodnota je menší než 0,05. Nulovou hypotézu na hladině významnosti α = 0,05 zamítáme a potvrzujeme hypotézu alternativní. Je rozdíl v kontaminaci koliformními bakteriemi mezi čaji z různých zemědělství.

Obr. 14 Krabicový graf srovnání počtu koliformních bakterií u čajů z ekologického a konvenčního zemědělství 71

5.4 Počty plísní Hypotéza č. 4 H0: Kontaminace plísní se mezi jednotlivými čaji neliší. HA: Mezi čaji je rozdíl v kontaminaci plísněmi. Testování normality – Shapiro-Wilkův test pro malé množství vzorků P = 0,00003

p <0,05

test ukazuje na nenormální rozdělení,

musíme použít neparametrické statistiky

Testování závislosti – mnohonásobné porovnání

Kruskall-Wallisův

test

pro

neparametrické statistiky

P=0,3074 Závěr: P-hodnota je větší než 0,05. Nulovou hypotézu na hladině významnosti α = 0,05 nezamítáme, rozdíl není statisticky významný.

Krabicový graf dle skupin Proměnná: KTJ/G 800 700 600

KTJ/G

500 400 300 200 100 0 -100 A

B

C

D

E

Název čaje

F

G

H

Medián 25%-75% Min-Max

Obr. 15 Krabicový graf celkového počtu plísní u všech vzorků bylinného čaje

72

Hypotéza č. 5 H0: Není rozdíl mezi kontaminací plísněmi u bio čajů a čajů z konvenčního zemědělství HA:Je rozdíl mezi bio čaji a čaji z konvenčního zemědělství Testování normality – Shapiro-Wilkův test pro malé množství vzorků P = 0,00003

p <0,05

test ukazuje na nenormální rozdělení,

musíme použít neparametrické statistiky

Testování závislosti – Mann-Whitney test pro neparametrické statistiky dvouvýběrové testy P=0,704222 Závěr: P-hodnota je větší než 0,05. Nulovou hypotézu na hladině významnosti α = 0,05 nezamítáme, rozdíly nejsou statisticky významné.

Obr. 16 Krabicový graf srovnání kontaminace plísněmi u čajů z ekologického a konvenčního zemědělství

73

5.5 Počty kvasinek Hypotéza č. 6 H0: Není rozdíl mezi kontaminací kvasinek bio čajů a čajů z konvenčního zemědělství HA: Je rozdíl mezi bio čaji a čaji z konvenčního zemědělství Testování normality – Shapiro-Wilkův test pro malé množství vzorků P=0,0

p <0,05

test ukazuje na nenormální rozdělení,

musíme použít neparametrické statistiky

Testování závislosti – Mann-Whitney test pro neparametrické statistiky dvouvýběrové testy P=0,550802 Závěr: P-hodnota je větší než 0,05. Nulovou hypotézu na hladině významnosti α = 0,05 nezamítáme, rozdíly nejsou statisticky významné.

Obr. 17 Krabicový graf srovnání kontaminace kvasinkami u čajů z ekologického a konvenčního zemědělství

74

5.6 Počty termorezistentních mikroorganizmů Hypotéza č. 7 H0: Není rozdíl mezi kontaminací termorezistentními mikroorganismy u bio čajů a čajů z konvenčního zemědělství HA: Je rozdíl mezi bio čaji a čaji z konvenčního zemědělství Testování normality – Shapiro-Wilkův test pro malé množství vzorků P = 0,00629

p < 0,05

test ukazuje na nenormální rozdělení,

musíme použít neparametrické statistiky

Testování závislosti – Mann-Whitney test pro neparametrické statistiky dvouvýběrové testy P=0,034425

Závěr: P-hodnota je menší než 0,05. Nulovou hypotézu na hladině významnosti α = 0,05 zamítáme a potvrzujeme hypotézu alternativní. Je statisticky významný rozdíl mezi bio čaji a čaji z konvenčního zemědělství v kontaminaci termorezistentními mikroorganismy.

75

Obr. 18 Krabicový graf srovnání kontaminace termorezistentními mikroorganizmy u čajů z ekologického a konvenčního zemědělství

76

6 DISKUZE I když mají bylinné čaje nízkou vodní aktivitu je zřejmé, že počáteční mikrobiální kontaminace surovin je vysoká a druhové zastoupení mikroorganizmů je velmi variabilní. Prevence mikrobiální kontaminace spočívá v uplatňování správné hygienické praxe při pěstování, sklizni a zpracování. Uplatňuje se přístup „od farmy až na stůl“. Základem prevence je sklízet rostliny postupně, dle navazující sklizňové zralosti jednotlivých druhů. Rostliny by měly být při sklizni vyzrálé, nezaplísněné a ne extrémně poškozené. Nevhodné kusy by měly být pokud možno vytříděny již před sušením. Rostliny by měly být sušeny a skladovány za správných podmínek a měly by být chráněné před opětovným zvlhnutím. Léčivé rostliny jsou sušeny za mírných podmínek, aby nedocházelo k nežádoucím změnám (ztráta chuti, éterických olejů apod.). Avšak tyto mírné podmínky mají nepatrný vliv na mikrobiální flóru. Sušení je samo o sobě metodou, která má mikrobiostatické a částečně mikrobicidní účinky.

Avšak

v průběhu

celého

procesu

zpracování

je

podstatné

zamezit

také sekundární kontaminaci, růstu a šíření mikroorganizmů či jiných škůdců (při dopravě, balení apod.).

Při

mikrobiologickém

rozboru

bylinných

čajů

byly

stanovovány

počty

indikátorových mikroorganizmů, ze kterých lze odvodit míru primární a sekundární kontaminace potravin a informace o dodržování správné výrobní a hygienické praxe. Stanovován byl celkový počet mikroorganizmů a počet koliformních bakterií. Dále byly stanovovány počty plísní, kvasinek a počty termorezistentních mikroorganizmů. Veškeré hodnoty byly hodnoceny jak u studeného nálevu, tak i nálevů horkých a to i v závislosti na čase. Také se zkoumal vliv přídavku sacharozy na možné zvýšení růstu mikroorganizmů. Byla totiž brána v potaz skutečnost, že spotřebitelé někdy nevhodným způsobem připravují bylinné čaje (např. zalévání vlažnou vodou). Další chybou spotřebitelů bývá dlouhé uchovávání čajů již připravených, což napomáhá růstu přítomných mikroorganizmů. Při stanovování celkového počtu mikroorganizmů je zjišťována přítomnost aerobních bakterií, fakultativně anaerobních bakterií, kvasinek a také plísní. Celkový počet

mikroorganizmů

odpovídá

přibližně

absolutnímu

mikroorganizmů a poukazuje na míru mikrobiálního znečištění. 77

celkovému

počtu

Celkový počet mikroorganizmů v 1 gramu čaje u jednoho vzorku přesahoval 107 KTJ.g-1, u čtyř vzorků přesahoval 106 KTJ.g-1, nejnižší hodnoty přesahovaly 103 KTJ.g-1. Přípustné množství není však legislativně stanovené. Jedny z nejvyšších počtů patřily i vzorkům dětských čajů. Avšak rozdíl v celkovém počtu mikroorganizmů (KTJ.g-1) mezi jednotlivými čaji nebyl statisticky významný. Pokud ale srovnáme čaje bio s konvenčními, tak zjistíme, že rozdíl mezi nimi v celkovém počtu mikroorganizmů byl statisticky významný. Také celkový počet mikroorganizmů se v průběhu uchovávání připraveného čaje (při pokojové teplotě) zvyšoval. Oslazení nálevu mělo na tuto skutečnost minimální vliv. Zjištěné hodnoty u horkých nálevů bylo podobné hodnotám zjištěným v německé studii, kde se hodnoty pohybovaly 103 až 106 KTJ.g-1. Nejvyšší počty CPM byly u mátového a heřmánkového čaje (1,6.106 a 3,9.105 KTJ.g-1). Analyzovaný heřmánkový čaj byl mezi čaji s vyšší hodnotou CPM (4,23.106), což by se přibližně shodovalo i s uvedenou studií (73). Rozdíly v počtech CPM mezi jednotlivými vzorky můžou být způsobeny rozdílnou technologickou, hygienickou praxí a kvalitou vstupní suroviny. V minulých letech platná vyhláška č. 132/2004 Sb., o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení stanovovala u bylinných čajů pro potenciálně toxinogenní plísně přípustnou hodnotu 5.103 KTJ.g-1, pro bylinné čaje pro kojence a děti dokonce 5.102 KTJ.g-1. Aktuálně platná norma ČSN 56 9609 udává pro 5 vzorků v jedné šarži hodnotu 103 KTJ.g-1, pro menší počet vzorků 5.103 KTJ.g-1. Celkově byl plísněmi nejvíce kontaminován vzorek čaje D. Dětské čaje v celkovém počtu plísní přesahovaly hodnotu 103 KTJ.g-1. Plísně po zalití čaje horkou vodou nebyly v horkém nálevu detekovány, až na dvě výjimky, kdy mohlo jít o kontaminaci. Statistickým testováním nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl mezi kontaminací plísněmi u bio čajů a čajů z konvenčního zemědělství. V zahraničních

studiích

se

plísně

nejvíce

vyskytovaly

v mátovém

čaji

(1,3.104 KTJ.g-1). Stopy plísní byly nalezeny i po zalití čaje vodou o teplotě 60 až 80 °C, při použití teploty 90 °C plísně již zjištěny nebyly (73). Z hlediska kontaminace mykotoxinů jsou bylinné čaje v zahraniční zkoumány často. Nejčastěji byl zaznamenán výskyt aflatoxinů (49, 50, 51). V měnším množství ochratoxin A a hojně byly zaznamenány i fumonisiny (15).

78

Experimentálně byly stanovovány i počty koliformních bakterií. Jejich výskyt nemusí být přímo vypovídat o tom, že léčivé byliny, nástroje apod. byly znečištěné fekáliemi. Výskyt vypovídá spíše o správné hygienické a výrobní praxi. Také je vhodné chápat

jejich

výskyt

v souvislostech

vyšetřovaného

materiálu

apod.

Díky

své termolabilnosti jsou u potravin indikátorem spolehlivosti pasterizace a termizace (14, 7). Dříve platná vyhláška č. 132/2004 Sb. udává přípustnou hodnotu pouze pro E. coli 103 KTJ.g-1 pro bylinné čaje a pro bylinné čaje pro děti a kojence 102 KTJ.g-1. V platné normě je taktéž udávána pouze hodnota pro E. coli a to 102 KTJ.g-1. Z hlediska počtu koliformních bakterií nejlépe dopadly vzorky čajů B a C (101 a 102 KTJ.g-1). U ostatních čajů hodnoty přesahovaly 104 a 105 KTJ.g-1. Pasterizační účinek horké vody byl při experimentálním stanovování potvrzen. Termorezistentní bakterie jsou schopné přežívat vyšší teploty a do této skupiny se zahrnují i sporotvorné bakterie např. z rodu Bacillus, Clostridium atd. Termorezistentní bakterie se vyskytují všude- od půdy, přes rostliny až po potraviny. Při experimentálním stanovení byly počty těchto bakterií vyšší u čajů z konvenčního zemědělství (hodnoty v rozmezí 104 až 106 KTJ.g-1). Byl zjištěn statisticky významný rozdíl mezi bio čaji a čaji z konvenčního zemědělství v kontaminaci termorezistentními mikroorganismy. Zahraniční studie se věnovaly přítomnosti spor bakterie Clostridium botulinum (12). V další studii se počty aerobních sporogenních bakterií pohybovaly v řádech 102 až 106. Nejvyšší počty byly opět detekovány u heřmánkového (1,6.106 KTJ.g-1) a mátového čaje (3,7.105 KTJ.g-1) (73). V jiné studii byly ve většině vzorků identifikovány bakterie rodu B. cereus a C. perfringens. Ze 13 vzorků heřmánkového čaje všechny obsahovaly spory B. cereus. Z toho u 11 vzroků byl počet < 103 KTJ.g-1 a u 2 < 105 KTJ.g-1 (36). Kvasinky se vyskytovaly u všech vzorků v menších počtech, nejvyšší počet se vyskytl u vzorků D a H (104 KTJ.g-1). U zbylých čajů se hodnoty pohybovaly v rozmezí 101 a 102 KTJ.g1

. Ve studiích byly nejčastěji detekovány kvasinky rodu Sacharomyces a Candida (16).

V jiné studii také rod Rhodothorula glutinis u heřmánkového čaje (36). Avšak ve všech studiích byly jejich počty nízké.

79

7 ZÁVĚR V práci bylo zkoumáno celkem 8 vzorků bylinných čajů. Z toho tři pocházely z ekologického zemědělství (vzorky A, B, C) a zbylých 5 z konvenčního zemědělství (vzorky D až H). Všechny čaje byly porcované v nálevových sáčcích. U všech vzorků byl stanoven CPM, počet plísní, kvasinek, koliformních a termorezistentních bakterií. První část experimentálního stanovení byla zaměřena na mikrobiální kontaminaci bylinných čajů, kdy byly vzorky zpracovávány se sterilním studeným fyziologickým roztokem. Hodnota CPM, byla u vzorků vysoká. Počty koliformních bakterií byly taktéž u většiny vzorků vysoké (vyjma vzorku B, C). Hlubší kontrole by bylo vhodné podrobit alespoň vzorky dětských čajů a vzorek D. Kontaminace plísní se pohybovala v rozmezí 2,20.102 KTJ.g-1 až 3,97.104 KTJ.g-1. Nejvíce kontaminovaný byl opět vzorek D a za ním opět 2 čaje dětské G a H. Kvasinky se objevovaly v malých počtech a u vzorů E a F nebyly detekovány vůbec. Nejvyšší hodnoty byly opět u vzorku D (7,19.104 KTJ.g-1). Počty termorezistentních bakterií byly nejnižší u vzorku B, C (101 a 102 KTJ.g-1), hodnoty u zbylých šesti vzorků převyšovaly 105 a 106 KTJ.g-1. Nejvyšší hodnoty byly zjištěny u vzorku F. Rozdíl mezi bio čaji a čaji z konvenčního zemědělství v kontaminaci termorezistentními mikroorganismy byl vyhodnocen jako statisticky významný. V současné době platí nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 ze dne 15. listopadu o mikrobiologických kriteriích pro potraviny a v nařízení Komise (ES) č. 1441/2007 ze dne 5. prosince 2007, kterým se nahrazuje příloha I nařízení Komise (ES) č. 2073/2005, jejichž dodržování je pro provozovatele potravinářských podniků závazné. Tato nařízení však kategorii bylinných čajů nespecifikují. Mnoho výrobců tedy vychází z dříve platné vyhlášky č. 132/2004 Sb., o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení. Aktuálně je platná norma ČSN 56 9609, která uvádí přípustná množství pro E. coli (102 u 5-ti vzorků), Salmonella spp. (nesmí být přítomna) a pro potenciálně toxinogenní plísně (103 u 5-ti vzorků). Není jisté, zda by všechny vzorky po hlubším prozkoumání vyhověly požadavkům. V druhé části experimentálního stanovení se zkoumal vliv teploty vody při přípravě na mikrobiální kontaminaci čajů. Byl potvrzen pasterační vliv horké vody. V horkém nálevu již nebyly detekovány koliformní bakterie, kvasinky, plísně. Celkový počet mikroorganizmů se mírně snížil a v průběhu uchovávání nálevu po dobu 24 hodin 80

se hodnota CPM zvyšovala. Pokusy s oslazením nálevu měly na tuto skutečnost minimální vliv. Bylinné čaje jsou mezi lidmi často využívány při zmírňování různých zdravotních problémů, při léčení různých i chronických chorob. Hojně jsou podávány i malým dětem, imunokompromitovaným osobám apod. Nelze tedy jejich mikrobiální kontaminaci úplně podceňovat. Zvláště pokud není dodržen správný postup při přípravě (zejména zalévání čaje horkou vodou) a ještě je bylinný čaj před konzumací delší dobu uchováván volně a při pokojové teplotě, tak se zvyšuje riziko vzniku možných zdravotních problémů u spotřebitele.

81

8 POUŽITÁ LITERATURA 1. ANAS, A., TAREQ, M., AMIN, N. et al., 2009: Survival of Cronobacter Species in Reconstituted Herbal Infant Teas and their Sensitivity to Bovine Lactoferrin. Journal of Food Science, 74(9): s. 497 – 484. 2. ARNON, S. S., 1998: Textbook of pediatric infectious disease - Infant botulism. Philadelphia: Saunders W. B., s. 1758 – 1766. 3. BIANCO, M. I., LÚQUEZ, C., FERNÁNDEZ, R. A. et al., 2008: Presence of Clostridium botulilnum spores in Matricaria chamomilla (chamomile) and its relationship with infant botulism. Internationaů Journal of Food Microbiology, 121: s. 357. 4. BINDER, E., 2007: Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology, 133: s. 149 – 166. 5. BUGNO, A., ALMODOVAR, AAB., PEREIRA, TC. et al., 2006: Occurrence of Toxigenic Fungi in Herbal Drugs. Brazilian Journal of Microbiology, s. 37: 47. 6. BURDYCHOVÁ, R., SLÁDKOVÁ, P., 2007: Mikrobiologická analýza potravin. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 208 s. 7. CARRASCO, E. et al., 2012: Cross – contamination and recontamination by Salmonella in foods – a review. Food research International, 45: s. 545 – 556. 8. CVETKOVIC, D., VIDOVIĆ, S., RAMIĆ, M. et al., 2013: Screening of changes in content of health benefit compounds,antioxidant activity and microbiological status of medicinal plantsduring the production of herbal filter tea. Industrial Crops and Products, 50: s. 338 – 345. 9. ČSN 56 9609, 2008: Pravidla správné hygienické a výrobní praxe – Mikrobiologická kritéria pro potraviny. Principy stanovení a aplikace. Praha: Český normalizační isntitut, 38 s. Třídící znak 569609. 10. EUROPA: Přehledy právních předpisů EU – maximální limity některých kontaminujících

látek.

[online] 82

[cit.

15.4.2014].

Dostupné

z:

http://europa.eu/legislation_summaries/food_safety/contamination_environment al_factors/l21290_cs.htm#Amendingact 11. FELKLOVÁ, M., 2003: Pěstování léčivých rostlin (pro farmaceuty). Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, s. 69 – 83. 12. FOX, C. K., KEET, C. A., STROBER, J. B., 2005: Recent advances in infant botulism. Pediatric Neurology, 32 (3): s. 149 – 154. 13. GALLAGHER, PG., 1990: Enterobacter bacteremia in pediatric patients. Reviews of Infectious Diseases, 12 (5): s. 808 – 812. 14. GÖRNER, F., VALÍK, L., 2004: Aplikovaná mikrobiológia poživatin. Bratislava: Malé centrum, 528 s. 15. HALT, M., 1998: Moulds and mykotoxins in herb tea and medicinal plants. European Journal of Epidemiology, 14 (3): s. 267 – 274. 16. HALT, M., KLAPEC, T., 2005: Microbial populations in medicinal and aromatic plants and herbal teas from Croatia. Italian Journal of Food Science, 17 (3): s. 349 – 354. 17. HAUER, T., JONAS, D., DETTENKOFER, M. et al., 1999: Tea as a source of Acinetobacter baumannii ventilator-associated pneumonia? Infection Control and Hospital Epidemiology, 20: 594 s. 18. HEREDIA, N., WESLEY. I., GARCÍA, S., 2009: Microbiologically safe foods. New Jersey: Wiley and Sons, s. 337 – 349. 19. HRUBÝ, S., 2000: Sušení jako šetrný způsob konzervace. Výživa a potraviny. 2: s. 23. 20. CHAIKHAM, P., WORAMETRACHANON, S., APICHARTSRANGKOON, A., 2014: Effects of high pressure and thermal processing on phytochemical, color and microbiological qualities of herbal-plant infusion. International Food Research Journal, 21 (1): s. 51 – 57.

83

21. IVERSEN, C., FORSYTHE. SJ:, 2004: Isolation of Enterobacter sakazakii and other Enterobacteriaceae from powdered infant formula milk and related products. Food Microbiology, 21 (6): s. 771 – 777. 22. JESENSKÁ. Z., 1987: Mikroskopické huby v poživatinách a v krmivách. Bratislava: Alfa, 319 s. 23. KADLEC, T., 2002:Technologie potravin II. Praha: VŠCHT, 226 – 227 s. ISBN: 978-80-7080-510-7 24. KATERERE, D. R., RHEEDER, J. P., SHEPHARD, G. S. et al., 2008: Preliminary survey of mycological and fumonisin and aflatoxin contamination of African traditional herbal medicines sold in South Africa. Human and Experimental Toxicology, 27 (11): s. 793 – 798. 25. KOMPRDA, T., 2004: Obecná hygiena potravin. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, s. 22 – 27. 26. KONEČNÁ, H., 2009: Mikrobiální kontaminace ovocných čajů. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, s. 70 – 71. 27. KUBÁČKOVÁ,

M.

Sonnentor

s.r.o.

[cit.

2.4.2014].

Dostupné

z:

[email protected] 28. LAI, KK., 2001: Enterobacter sakazakii infections among neonates, infants, children, and adults. Case reports and a review of the literature. Medicine, 80 (2): s. 113 – 122. 29. LAWSON, R., McLAREN, M., 1903: Tea-leaf holder. [online] [cit. 17.3.2014]. Dostupné z: http://www.google.com/patents/US723287#forward-citations 30. LÉKOPIS:

Český

lékopis.

[online]

[cit.

12.3.2014].

Dostupné

z:

http://www.lekopis.cz/ 31. LUND, B., TONY, C., WARWICK, G. et al., 2000: Microbiological Safety and Quality od Food. USA: Aspen Publishers, s. 964 – 967.

84

32. MABBETT, T., 2008: Mold and mykotoxin contamination of tea. Tea and Coffee

Trade

Journal.

[online]

[cit.

20.4.2014].

Dostupné

z:

http://www.thefreelibrary.com/Mold+and+mycotoxin+contamination+of+tea%3 A+contamination+of+processed...-a0183311855 33. MALÍŘ, F., OSTRÝ, V., 2003: Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka. Brno:Mikada, 349 s.

34. MARIN, S., RAMOS, AJ., SANCHIS, V., 2013: Mycotoxins: occurence, toxicology and exposure assessment. Food and Chemical Toxicology, s. 218 – 237. doi: 10.1016/j.fct.2013.07.047. 35. MARTINEZ-MAGANA, P., JODRAL – VILLAREJO, M., 1989: Mycoflora and Aspergillus flavus in pepperon sale in Spain. Microbiologie Aliments Nutrition, 7: s. 311 – 314. 36. MARTINS, H. M., MARTINS, M. L., DIAS, M. I. et al., 2001: Evaulation of microbiological quality of medicinal plants used in natural infusion. International Journal of Food Microbiology, 68 (1 – 2): s.149 – 153. 37. McKEE, LH., 1995: Microbial contamination of spices and herbs, a review. LWT-Food Science and Technology, 28 (1): s. 1-11. 38. MICHÁLEK, P., 2011: Termorezistentní mikroskopické houby v bylinách pro přípravu „čaje“, bakalářská práce. Brno: Lékařská fakulta. 39. MIMICA-DUKIC, N., PAVKOV, R., LUKIC, V. et al., 1993: Study of chemical composition and microbiological contamination of chamomile tea. Acta Hort (ISHS), 333: s. 137 – 142. 40. MITÁČEK, T., 2011: Léčivé rostliny v ekozemědělství. Zemědělec, 2011 (19), s.

25.

[online]

[cit.

15.3.2014].

Dostupné

z:

http://orgprints.org/24859/1/l%C3%A9%C4%8Div%C3%A9%20rostliny.pdf 41. MITÁČEK, T.: Produkce a zpracování léčivých rostlin z kontrolovaného EZ. EPOS - metodické listy č. 21.[online] [cit. 12.3.2014]. Dostupné z: http://www.eposcr.eu/wp-content/uploads/2011/04/ML21-Lecive-rostliny.pdf 85

42. NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujícíh látek v potravinách. [online] [cit. 15.4.2014]. Dostupné

http://eur-

z:

lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CONSLEG:2006R1881:2010070 1:CS:PDF 43. OMURTAG, GZ., YAZICIOGLU,D., 2004: Determination of fumonisins B1 and B2 in herbal tea and medicinal plants in Turkey by high performance liquid chromatography. Journal of Food Protection, 67 (8): s. 1782 – 1786. 44. OSTRÝ., V., 1998: Vláknité mikroskopické houby (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka. Praha: Státní zdravotní ústav, 20 s. 45. PAGOTTO, FJ., FARBER, JM., LENATI, RF., 2008: Pathogenicity of Enterobacter sakazakii. American society for Microbiology Press, s. 127 – 144. 46. PAGOTTO,

FJ.,

NAZAROWER-WHITE,

M.,

BIDAWID,

S.,

2003:

Enterobacter sakazakii: infectivity and enterotoxin production in vitro and in vivo. Journal of Food Protection, 2003, 66 (3): s. 370 – 375. 47. PRAŽÁKOVÁ, K., 2008: Termorezistentní plísně v prostředí, bakalářská práce. Brno: Lékařská fakulta.

48. PROŠKOVÁ, J., 2007: Analýza současného stavu pěstovaných léčivých, aromatických a kořeninových rostlin v ekologickém zemědělství ČR, příležitosti a konkurenceschopnost v tomto odvětví. Praha: Výzkumný ústav zemědělské ekonomiky,

17

s.

[online]

[cit.

15.3.2014].

Dostupné

z:

http://eagri.cz/public/web/mze/zemedelstvi/rostlinne-komodity/lecivearomaticke-a-koreninove-rostliny/pestovani-lakr-v-ekologickemzemedelstvi.html 49. REIF, K.. METZGER, W., 1995: Determination of aflatoxins in medicinal herbs and plant extracts. Journal of Chromatography, 692 (1 – 2): s. 131 – 136.

86

50. RIZZO, I., VEDOYA, G., MAURUTTO, S., 2004: Assessment of toxigenic fungi on Argentinean medicinal herbs. Microbiological Research, 159 (2): s. 113 – 120. 51. ROMAGNOLI, B., MENNA, V., GRUPPIONI, V. et al., 2007: Aflatoxins in spieces, aromatic herbs, herb teas and medicinal plants marketed in Italy. Food control, 18 (6): s. 697 – 701. 52. SAHOO,N., MANCHIKANTI, P., DEY, S., 2010: Herbal drugs – Standards and regulation. Fitoterapia, 81 (6): s. 462 – 471. 53. SAMSON, R. A., HOEKSTRA, E., et al., 1981: Introduction to food-borne fungi. Baarn/Delft: Centraalbureau voor Schimmelcultures. 247 s. 54. SCOLARI, G., ZACCONI, C., VESCOVO, M., 2001: Microbial contamination of tea and aromatic herb – tea products. Italian Journal of Food Science, 13 (4): s. 429 – 433. 55. SEWRAM, V., SHEPHARD, G.S., JACOBS, T. V. et al., 2006: Mycotoxin contamination of dietary and medicinal wild plants in the Eastern Cape Province of South Africa. Journal od Agricultural and Food Chemistry, 54 (15): s. 5688 – 5693. 56. SMEP: Léčivé, aromatické a kořeninové rostliny. [online] [cit. 15.2.2014]. Dostupné z: http://etext.czu.cz/php/skripta/skriptum.php?titul_key=57 57. STOJANOVIĆ, MM., et al., 2011: Icolation of Cronobacter sakazakii from different herbal teas. Vojnosanit Pregl, 68 (10): s. 837 – 841. 58. SÚKL: VYR-32 Seznam definic. [online] [cit. 12.3.2014]. Dostupné z: http://www.sukl.cz/leciva/vyr-32-seznam-definic 59. ŠETEK, J.: Sypaný versus sáčkový. [online] [cit. 17.3.2014]. Dostupné z: http://www.tastea.cz/sypany-versus-sackovy_id-537 60. ŠILHÁNKOVÁ, L., 2002: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Praha: Academia, 364 s.

87

61. ŠIMŮNEK, J., 2004: Plísně a mykotoxiny. Brno, [online] [cit. 22.4.2014]. Dostupné z: http://www.med.muni.cz/dokumenty/pdf/plisne_a_mykotoxiny.pdf 62. THE ORGANIC HERB TRADING CO.: HACCP Plan Control Document Dry Products.

[online]

[cit.

17.3.2014].

Dostupné

z:

http://organicherbtrading.com/admin/uploads/pdf/HACCP%20Revision%2030% 20June%202010.pdf 63. TOŠOVSKÁ, M., BUCHTOVÁ. I., 2012: Léčivé, aromatické a kořeninové rostliny- situační a výhledová zpráva. Praha: Ministerstvo zemědělství, 39 s. [online]

[cit.

15.3.2014].

Dostupné

z:

http://eagri.cz/public/web/file/188525/SVZ_2012_konecna_verze.pdf 64. VAN ACKER, J., DE SMET, F., BOUGAFET, A. et al., 2001: Outbreak of necrotizing enterocolitis associated with Enterobacter sakazakii in powdered milk formula. Journal of Clinical Microbiology, 39 (1): s. 293 – 297. 65. VEČEŘOVÁ. E., 2013: Mikrobiální kontaminace sušeného ovoce, diplomová práce. Brno: Mendelova univerzita v Brně. 66. VELKÝ LÉKAŘSKÝ SLOVNÍK: Odvar. [online] [cit. 12.3.2014]. Dostupné z: http://lekarske.slovniky.cz/pojem/odvar 67. VYHLÁŠKA č. 132/2004 Sb., o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení. [online] [cit. 15.3.2014]. Dostupné z: http://www.tabory.ymca.cz/dokumenty/2004-132.pdf 68. VYHLÁŠKA č. 133/2004 Sb., o podmínkách ozařování potravin a surovin, o nejvyšší dávce záření a o způsobu označení ozáření na obalu. [online] [cit. 15.4.2014].

Dostupné

z:

http://www.szpi.gov.cz/docDetail.aspx?docid=1006185&docType=ART&nid=1 1816 69. VYHLÁŠKA č. 330/1997 Sb., kterou se provádí § 18 písm. a), d), j) a k) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, pro čaj, kávu a kávoviny. [online] [cit. 15.3.2014].

Dostupné 88

z:

http://www.szpi.gov.cz/docDetail.aspx?docid=1007467&docType=ART&nid=1 1816 70. WAŚKIEWICZ, A., BESZTERDA, M., BOCIANOWSKI, J., 2013: Natural occurence of fumonisins and ochratoxin A in some herbs and spices commercialized in Poland anylzed by UPLC-MS/MS method.

Food

Microbiology, 36 (2): s. 426 – 431. 71. WASKIEWICZ, A., BESZTERDA, M., GOLINSKI, P., 2012. Review Occurrence of fumonisins in food – An interdisciplinary approach to the problem. Food and Control, 26 (2): s. 491 – 499. 72. WILLIS, J., ROBINSON, JE., 1988: Enterobacter sakazakii meningitis in neonates. The Pediatric Infectious Disease Jouornal, 7 (3): s. 196 – 199. 73. WILSON, CH., DETTENKOFER, M., JONAS, D. et al., 2004: Pathogen growth in herbal teas used in clinical settings: A possible source of nosocomial infection? American Journal of Infection Control, 32: s. 117 – 119. 74. WOLFF, MA., YOUNG, CL., RAMPHAL, R., 1993: Antibiotic therapy for enterobacter meningitis: a retrospective review of 13 episodes and review of the literature. Clinical Infectious Diseases, 16 (6): s. 772 – 777. 75. YAZICIOGLU, D., 2004: Determination of Fumonisins B and B2 in Herbal Tea and Medicinal Plants in Turkey by High – Performance Liquid Chromatography. Journal of Food Protection, 67 (8): s. 1782 – 1786.

89

9 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Proudový diagram výroby bylinných čajů (27, 62) Obr. 2 Růstová křivka bakterií v heřmánkopvém čaji během 24 hodin (log KTJ/ml) (39) Obr. 3 Logaritmus celkového počtu mikroorganizmů v KTJ.g-1 výrobku

Obr. 4 Logaritmus počtu plísní v KTJ.g-1 výrobku Obr. 5 Logaritmus počtu kvasinek v KTJ.g-1 výrobku Obr. 6 Logaritmus počtu koliformních bakterií v KTJ.g-1 výrobku Obr. 7 Logaritmus počtu termorezistentních bakterií v KTJ.g-1 výrobku Obr. 8 Vývoj počtu CPM v KTJ.g-1 v čase u neslazeného nálevu Obr. 9 Vývoj počtu CPM v KTJ.g-1 v čase u slazeného nálevu Obr. 10 Srovnání vývoje počtu CPM v KTJ.g-1 v čase u neslazeného a slazeného nálevu Obr. 11 Histogram – testování normality Obr. 12 Krabicový graf celkového počtu mikroorganizmů u všech vzorků bylinného čaje Obr. 13 Krabicový graf srovnání celkové počtu mikroorganizmů u čajů z ekologického a konvenčního zemědělství Obr. 14 Krabicový graf srovnání počtu koliformních bakterií čajů z ekologického a konvenčního zemědělství Obr. 15 Krabicový graf celkového počtu plísní u všech vzorků bylinného čaje Obr. 16 Krabicový graf srovnání kontaminace plísněmi u čajů z ekologického a konvenčního zemědělství Obr. 17 Krabicový graf srovnání kontaminace kvasinkami u čajů z ekologického a konvenčního zemědělství Obr. 18 Krabicový graf srovnání kontaminace termorezistentními mikroorganizmy u čajů z ekologického a konvenčního zemědělství

90

10 SEZNAM TABULEK Tab. 1 Členění čaje na druhy a skupiny Tab. 2 Přípustné záporné hmotnostní odchylky balení čaje Tab. 3 Smyslové, fyzikální a chemické požadavky na jakost Tab. 4 Přípustné hodnoty pro bylinné čaje Tab. 5 Přípustné hodnoty pro bylinné čaje určené pro kojence a malé děti Tab. 6 Přípustná množství jednotlivých skupin mikroorganizmů pro bylinné čaje Tab. 7 Mátový čaj surový studený nálev Tab. 8 Počty mikroorganizmů (KTJ/100 ml čaje), ve vzorcích zalitých kohoutkovou vodou o teplotě 67 °C a v dalším testu zalitých vodou o teplotě 90 °C (vše KTJ/100 ml čaje) Tab. 9 Vybrané výsledky italské studie Tab. 10 Přehled hlavních toxinů Tab. 11 Srovnání obecných hodnot NPM (legislativní limity) s příjmem (ADI) ve vztahu k hodnotám výskytu a příjmu Tab. 12 Přehled nedůležitějších rodů čeledě Enterobacteriaceae Tab. 13 CPM, plísně, kvasinky, koliformní a termorezistentní bakterie v KTJ.g-1 Tab. 14 Vývoj počtu CPM v KTJ.g-1 v čase u neslazeného nálevu Tab. 15 Vývoj počtu CPM v KTJ.g-1 v čase u slazeného nálevu Tab. 16 Srovnání vývoje počtu CPM v KTJ.g-1 v čase u neslazeného a slazeného nálevu

91

11 SEZNAM ZKRATEK ADI

přijatelná denní dávka (Acceptable Daily Intake)

CPM

celkový počet mikroorganizmů

EZ

ekologické zemědělství

Kolif. koliformní bakterie KV

kvasinky

NPM

nejvyšší přípustné množství

NSL

neslazené nálevy vzorků

PH

přípustné hodnoty

PL

plísně

92

12 PŘÍLOHY Příloha č. 1 A) Části rostlin, které lze použít bez omezení (69). 1. Artyčok 2. Borůvka 3. Čajovník

Cynara scolymus L. C. cardunculus L. Vaccinium myrtillus L. Camellia sinennsis L.

4. Čekanka 5. Dobromysl 6. Fenykl 7. Granátovník 8. Heřmánek 9. Heřmánek římský 10. Hluchavka 11. Ibišek 12. Jahoda 13. Jeřabina 14. Lípa

květní lůžko řapík plod list sušený nebo fermentovaný nať, kořen nať plod plod květ květ květ, nať květ list plod

Cichorium intybus L. Origanum vulgare L Foeniculum vulgare Mill. Punica granatum L. Matricaria chamomilla L. Anthemis nobilis L. Lamium album L. Hibiscus sabdariffa L. Fragaria vesca L. Sorbus aucuparia L. Tilia platyphyllos Scopoli, Tilia cordata Miller, Tillia euchlora Koch květ 15. Malina Rubus idaeus L. listy 16. Máta Mentha sp. list, nať 17. Maté Ilex paraguayensis St.-Hi. list 18. Mateřídouška Thymus serpyllum L. nať 19. Meduňka Melissa officinalis L. nať, list 20. Ostružina Rubus fructicosus L. list 21. Rakytník Hippophae rhamnoides L. plod 22. Rooibos Aspalathus linearit nať 23. Růže Rosa centifolia L. Rosa gallica L. korunní lístek 24. Šípek Rosa sp. L. plod 25. Rybíz Ribes nigrum L. list, plod 26. Svatojánský chléb Ceratonia siliqua L. plod 27. Ostatní nejmenované sušené ovoce a jádra skořápkového ovoce

Příloha č. 2 B) Části rostlin, které lze použít do výše 30 % hmotnosti (69). 1. Borůvka 2. Bříza 3. Celík (zlatobýl)

Vaccinium myrtillus L. Betula pendula Roth. B. pubescens Ehrh. Solidago virgaurea L., S. gigantea Ait., S. canadensis L. 93

list, nať list

nať

4. Chmel 5. Citron 6. Černý bez 7. Černucha 8. Fazolové lusky 9. Jasmín 10. Jestřabina 11. Klanopraška 12. Kmín římský 13. Kokoška 14. Konopice 15. Kontryhel 16. Kopřiva 17. Len 18. Lichořeřišnice 19. Lomikámen 20. Lžičník 21. Maceška

Humulus lupulus L šištice Citrus limon (L.) Burm oplodí Sambucus nigra L květ, plod Nigella sativa L. semeno Phaseolus vulgaris L. oplodí Jasminum grandiflorum L list, květ Galega officinalis L. nať Schizandra chinensis MICHX. plod, nať Cuminum cyminum L. plod Capsella bursa-pastoris L. nať Galeopsis sp. div. nať Alchemilla sp. div. nať Urtica dioica L. list, nať Linum usitatissimum L. semeno Tropaeolum majus L. nať, plod Saxifraga granulata L. nať Cochlearia officinalis L. nať Viola tricolor L., V. arvensis MURRAY květ, nať 22. Měsíček Calendula officinalis L. květ 23. Oves Avena sativa L. nať, plod 24. Pískavice Trigonella foenumgraecum L. semeno 25. Pomeranč Citrus aurantium L. ssp. aurantium Engler list, oplodí, květ 26. Popenec Glechoma hederacea L. nať 27. Proskurník Althaea officinalis L. kořen, list, květ 28. Sedmikráska Bellis perennis L. květ 29. Sezam Sezamum indicum L. semeno 30. Sléz Malva silvestris L., M. neglecta L., M. mauritiana L. květ, list 31. Smetánka Taraxacum officinale Web kořen, nať, list 32. Sporýš Verbena officinalis L. nať 33. Trnka Prunus spinosa L. květ, plod 34. Truskavec Polygonum aviculare L. nať 35. Voňatka Cymbopogon nardus (L.), W. Wats list 36. Vřes Calluna vulgaris (L.) Hill. nať, květ 37. Ženšen Panax ginseng C. A. Meyer kořen 38. Ostatní nejmenovaná sušená zelenina a nejmenované koření.

94

Příloha č. 3 C) Části rostlin, které lze použít do výše 5 % hmotnosti (69). 1.

Harphagophytum procumbens (BURCHELI) DC. 2. Andělika lékařská Archangelica officinalis HOFFM. 3. Badyáník pravý Illicium verum HOOK 4. Bazalka Ocimum basilicum L. 5. Bedrník větší Pimpinella major (L.) HUDS. 6. Benedikt lékařský Conicus benediktus L. 7. Blahovičník Eucalyptus sp. 8. Borovice Pinus sp. 9. Borovice kleč Pinus mugo ssp. Pumilio (HAENKE) FRANCO 10. Brusinka Vaccinium vitis idaea L. 11. Celer Apium graveolens L. 12. Cola Cola acuminata (Beauv.) Schott et End. a C. nitida (Vent.) Schott et E. 13. Čípek objímavý Ruscus aculeatus L. 14. Divizna sápovitá Verbascum phlomoides L. 15. Divizna velkokvětá Verbascum densiflorum BERTOL. 16. Dub letní Querrcus robur L. 17. Dub zimní Querrcus petraea (MATTUSCH.) LIEBL. 18. Galgán lékařský Alpinia officinarum HANCE 19. Hadí kořen větší Bistorta major S. F. GRAY 20. Hořec Gentiana sp. 21. Chaluha bublinatá Fuccus vesiculosus L. 22. Chrpa Centaurea cyanus (L.) MILLER 23. Jablečník obecný Marrubium vulgare L. 24. Jalovec obecný Juniperus communis L. 25. Jehlice Ononis sp. 26. Jetel červený Trifolium pratense L. 27. Jetel bílý Trifolium repens L. 28. Jitrocel indický Plantago ovata FORSK. 29. Jitrocel kopinatý Plantago repens L. 30. Jmelí Viscum sp. 31. Kardamon léčivý Eletaria cardamomum (L.) WHITE et MASON 32. Komonice lékařská Melilotus officinalis (L.) PALLAS 33. Kosatec Iris germanica L., I. pallida Lam. florentina L. 34. Kramerie Krameria triandra RUIZ et PAV trojmužná 35. Kuklík městský Geum urbanum L. 36. Kukuřice Zea mays L. 95

kořen kořen, plod plod nať kořen nať list jehlice, vrcholky, větve jehlice, vrcholky, větve list plod

semeno nať květ květ kůra kůra kořen kořen kořen stélka květ nať dřevo, plod kořen květ květ semeno list, nať nať plod, semeno nať kořen kořen kořen blizna

37. Kurkuma 38. Lékořice lysá 39. Levandule lékařská 40. Libeček lékařský 41. Líska obecná 42. Lopuch 43. Marsdenie kondurangová 44. Mořinka vonná 45. Mochna husí 46. Mochna nátržník 47. Mučenka 48. Muškátovník vonný 49. Mydlice lékařská 50. Myrtovník 51. Olivovník 52. Oman pravý 53. Ořešák 54. Ostropestřec mariánský 55. Ostrožka polní 56. Pelargonie 57. Pelyněk černobýl 58. Pelyněk pravý 59. Petržel 60. Petržel kadeřavá

Curcuma sp. Glycyrrhiza glabra L. Lavandula angustifolia MILLER Levisticum officinale KOCH Corylus avellana L. Arctium sp. Marschenia condurango REICHB. Galium odoratum (L.) SCOP Potentilla anserina L. Potentilla erecta(L.) RÄUSCHEL Passiflora sp. Myristica fragrans HOUT.

Saponaria officinalis L. Commiphora sp. Olea europaea L. Inula helenium L. Juglans regia L. Silybum mariannum(L.) GAERTN. Consolida regalis S. F. GRAY Pelargonium sp. Artemisia vulgaris L. Artemisia absinthium Petroselinum sativum Hoffm. Petroselinum crispum (MILL.) NYM ex A. W. HILL 61. Pivoňka Paeonia officinalis L. 62. Plicník lékařský Pulmonaria officinalis L. 63. Podběl obecný Tussilago farfara L. 64. Pohanka Fagopyrum aesculentum Moench., tatricum (L.) Gaertn. 65. Prha Arnica sp. 66. Průtržník Herniaria sp. 67. Prvosenka jarní Primula veris L. 68. Prvosenka vyšší Primula elatior (L.)Hill 69. Přeslička rolní Equisetum arvense L. 70. Pukléřka islandská Cetraria islandica (L.) ACH 71. Puškvorec obecný Acorus calamus L. 72. Pýr plazivý Elytrigia repens (L.) DESV. 73. Rdesno blešník Persicaria lapathifolia(L.) S. F. GRAY 74. Rdesno peprník Persicaria hydropiper(L.)SPACH 75. Rmenec sličný Camaemelum nobile(L.) ALL 76. Rosnatka Drosera sp. 77. Rozmarýna Rosmarinus officinalis L. 96

kořen kořen květ kořen list kořen kůra nať nať kořen nať plod, semeno, oplodí kořen klejopryskyřice list kořen list plod květ list nať nať plod kořen korunní lístek list, nať list nať, plod

květ, kořen nať kořen, květ kořen, květ nať stélka kořen kořen nať nať květ nať list

lékařská 78. Rozrazil lékařský 79. Řebříček obecný 80. Řecký horský čaj 81. Řepík 82. Řimbaba

Veronica officinalis L. Achillea millefolium L. Sideritis scardica Griseb. Agrimonia sp. Chrysanthemum parthenium(L.) BERNH. 83. Slunečnice Helianthus annuus L. 84. Smil písečný Helichrysum arenarium L. MOENCH 85. Smrk Picea sp. 86. Srdečník obecný Leonurus cardiac L. 87. Světlík Euphrasia sp. 88. Šalvěj lékařská Salvia officinalis L. 89. Topol Populus sp. 90. Topolovka růžová Alcea rosea L. cv. Nigra 91. Toten lékařský Sanguisorba officinalis L. 92. Trnovník bílý Robinia pseudo-arabica L. 93. Trubkovec Orthosiphon sp. 94. Třapatka nachová Echinacea angustifolia DC 95. Třezalka Hypericum sp. 96. Tužebník jilmový Filipoendula uimaria(L.)MAXIM 97. Tymián Thymus zygis L. 98. Vachta trojlistá Menyanthes trifoliata L. 99. Vilín viržinský Hamamelis virginiana L. 100. Violka Viola tricolor L. trojbarevná 101. Vítod senega Polygala senega L. 102. Vrba Salix sp. 103. Vrbovka Epilobium sp. 104. Yzop lékařský Hyssopus officinalis L. 105. Zeměžluč hořká Centarium erythraea RAFN

97

nať nať, květ nať nať nať jazykový květ květ jehlice, vrcholky, větve nať nať list, nať pupen květ květ květ list nať, kořen nať květ, nať nať list list nať kořen kůra nať nať nať

Příloha č. 4 Tabulka celkových hodnot mikrobiální kontaminace u všech vzorků – horké neslazené v čase 0 h NSL 0h

A KTJ/ sáček

B KTJ/ sáček

KTJ/g 4

4

C KTJ/ sáček

KTJ/g 4

4

KTJ/g 2

CPM PL

5,20.10 4,95.10 4,01.10 1,85.10 2,00.10 6,40.10 ND ND ND ND ND ND

KV kolif.

ND ND

NSL

E KTJ/ sáček

0h CPM

ND ND

ND ND

KTJ/g

F KTJ/ sáček

5

5

3

2,31.10 1,36.105 ND ND

6,60.101 ND ND ND

ND ND

KTJ/g

G KTJ/ sáček

H KTJ/ sáček

5

KTJ/g 5

2,36.10 2,08.10 6,16.10 2,76.10 1,62.10 9,35.10 ND ND ND

ND ND ND

4

ND ND ND

KTJ/g 5

ND ND

5

3,33.101 2,93.101 ND PL ND ND ND KV ND ND ND kolif. NSL – neslazené nálevy vzorků

D KTJ/ sáček

ND ND

KTJ/g 5

3,89.10 2,20.105 6,66.101 3,77.101 ND ND ND ND

PL - plísně KV – kvasinky Kolif. – koliformní bakterie

Příloha č. 5 Tabulka celkových hodnot mikrobiální kontaminace u všech vzorků – horké neslazené v čase 4 h NSL 4h CPM PL KV kolif.

A KTJ/ sáček 5,38.104 ND ND ND

KTJ/g 5,12.104 ND ND ND

B KTJ/ sáček 3,56.104 ND ND ND

KTJ/g 1,33.104 ND ND ND

98

C KTJ/ sáček 2,00.102 ND ND ND

KTJ/g 6,93.101 ND ND ND

D KTJ/ sáček 3,01.105 ND ND ND

KTJ/g 1,78.105 ND ND ND

NSL 4h CPM PL KV kolif.

E KTJ/ sáček 2,28.105 ND ND ND

KTJ/g 2,01.105 ND ND ND

F KTJ/ sáček 5,12.105 ND ND ND

KTJ/g 2,29.105 ND ND ND

G KTJ/ sáček 1,24.105 ND ND ND

KTJ/g 7,15.104 ND ND ND

H KTJ/ sáček 3,69.105 ND ND ND

KTJ/g 2,09.105 ND ND ND

Příloha č. 6 Tabulka celkových hodnot mikrobiální kontaminace u všech vzorků – horké neslazené v čase 24 h NSL 24 h CPM PL KV kolif.

NSL 24 h CPM PL KV kolif.

A KTJ/ sáček 6,60.106 ND ND ND

E KTJ/ sáček 4,33.107 ND ND ND

KTJ/g 3,37.106 ND ND ND

B KTJ/ sáček 4,49.104 ND ND ND

KTJ/g 3,81.107 ND ND ND

F KTJ/ sáček 6,87.107 ND ND ND

KTJ/g 1,68.104 ND ND ND

C KTJ/ sáček 6,67.101 ND ND ND

KTJ/g 3,07.107 ND ND ND

G KTJ/ sáček 2,89.105 ND ND ND

99

KTJ/g 2,31.101 ND ND ND

D KTJ/ sáček 3,51.104 ND ND ND

KTJ/g 2,07.104 ND ND ND

KTJ/g 1,66.105 ND ND ND

H KTJ/ sáček 1,97.107 9,00.101 ND ND

KTJ/g 1,11.107 5,09.101 ND ND

Příloha č. 7 Tabulka celkových hodnot mikrobiální kontaminace u všech vzorků – horké slazené v čase 0 h SL 0h CPM PL KV kolif.

A KTJ/ sáček 1,35.105 ND ND ND

B KTJ/ KTJ/g sáček 1,29.105 3,92.104 ND ND ND ND ND ND

SL

E KTJ/ 0h sáček KTJ/g 5 2,16.10 1,90.105 CPM ND ND PL ND ND KV ND ND kolif. SL –slazené nálevy vzorků

F KTJ/ sáček 5,53.105 ND ND ND

C KTJ/ KTJ/g sáček 1,46.104 2,66.102 ND ND ND ND ND ND

D KTJ/ KTJ/g sáček 9,21.101 1,97.105 ND ND ND 3,32.101 ND ND

KTJ/g 5,44.101 ND 1,96.101 ND

G KTJ/ KTJ/g sáček 3,38.106 1,30.105 ND ND ND ND ND ND

H KTJ/ KTJ/g sáček 7,49.104 3,98.105 ND ND ND ND ND ND

KTJ/g 2,25.105 ND ND ND

PL - plísně KV – kvasinky Kolif. – koliformní bakterie

Příloha č. 8 Tabulka celkových hodnot mikrobiální kontaminace u všech vzorků – horké slazené v čase 4 h SL 4h CPM PL KV kolif.

A KTJ/ sáček 6,96.104 ND ND ND

B KTJ/ KTJ/g sáček 6,63.104 3,80.104 ND ND ND ND ND ND

C KTJ/ KTJ/g sáček 1,42.104 1,33.102 ND ND ND ND ND ND

100

D KTJ/ KTJ/g sáček 4,61.101 1,61.105 ND ND ND ND ND ND

KTJ/g 9,50.104 ND ND ND

SL 4h CPM PL KV kolif.

E KTJ/ sáček 2,86.105 ND ND ND

F KTJ/ KTJ/g sáček 2,52.105 5,87.105 ND ND ND ND ND ND

G KTJ/ KTJ/g sáček 2,63.105 1,18.105 ND ND ND ND ND ND

H KTJ/ KTJ/g sáček 6,76.104 3,63.105 ND ND ND ND ND ND

KTJ/g 2,06.105 ND ND ND

Příloha č. 9 Tabulka celkových hodnot mikrobiální kontaminace u všech vzorků – horké slazené v čase 24 h SL 24 h CPM PL KV kolif.

SL 24 h CPM PL KV kolif.

A KTJ/ sáček 3,54.106 ND ND ND

E KTJ/ sáček 2,86.105 ND 5,00.101 ND

KTJ/g 3,37.106 ND ND ND

B KTJ/ sáček 3,42.104 ND ND ND

KTJ/g 2,52.105 ND 4,40.101 ND

F KTJ/ sáček 8,39.107 ND ND ND

KTJ/g 1,28.104 ND ND ND

C KTJ/ sáček 1,00.102 ND ND ND

KTJ/g 3,76.107 ND ND ND

G KTJ/ sáček 3,43.104 ND ND ND

101

KTJ/g 3,46.101 ND ND ND

D KTJ/ sáček 3,47.105 ND ND ND

KTJ/g 2,05.105 ND ND ND

KTJ/g 1,97.104 ND ND ND

H KTJ/ sáček 4,80.107 9,00.101 ND ND

KTJ/g 2,72.107 5,09.101 ND ND