Kvantitativní hodnocení krevních cév biopsie peritonea

5. sympozium o peritoneální dialýze Regionální centrum, Olomouc, 29. 3. 2007

Kvantitativní hodnocení krevních cév biopsie peritonea Z. Tonar1, S. Opatrná2, L Nedorost1, M. Kultscherová1, K. Witter3 1

Ústav histologie a embryologie LF UK v Plzni 2 I. Interní klinika FN Plzeň 3 Institut für Histologie und Embryologie, VU Wien

•First •Prev •Next •Last •Go Back •Full Screen •Close •Quit

Obsah sdělení I Histologické změny peritonea při peritoneální dialýze (PD) I Cíle práce I Materiál a metody – Přehled odhadů objemů, povrchů a počtu objektů – Sampling I Výsledky – Odhady parametrů – Analýza variability ∗ parametrů v sérii řezů ∗ výsledků mezi různými pozorovateli I Diskuse – Srovnání s literaturou: 2-D a 3-D měření – Význam poměrů primárních parametrů – Perspektivy I Závěr •First •Prev •Next •Last •Go Back •Full Screen •Close •Quit

Změny peritonea při PD I Epitel (Di Paolo 2000) – – – – – –

deskvamace přeměna plochého na kubický ztráta mikroklků vakuolizace, hromadění inkluzí otevření mezibuněčných spojů polyploidie

I Submezotelové vazivo (Di Paolo 2000): – fragmentace BM, po čase opět zesílení BM mezotelu i BM kapilár (multiplikace vrstev BM kapilár) – submezotelový edém – zvýšená buněčnost – aktivace fibroblastů profibrotickými cytokiny z mezotelu ⇒ zesílení kolagenního vaziva nad 50 µm (simple sclerosis), resp nad 150 µm (Williams, 2002) – α-SM-aktin pozitivní myofibroblasty jsou častou známkou fibrózy (Del Peso 2005) •First •Prev •Next •Last •Go Back •Full Screen •Close •Quit

Změny peritonea při PD I Cévy submezotelu: – mikroangiopatie (zejména u DM), obliterace a hyalinizace cév, – v.s. pokles počtu lymfatických cév (⇑ transportní role zmnožených krevních cév?) – vyšší exprese PAI-1 mezotelem (Pollock 2005) – zvýšená vaskularizace na úrovni pre/kapilár (korelace s rychlostí peritoneálního transportu roztoku (Numata 2003)) – peritoneální neoangioneze přes VEGF z mezotelu (Aquilera 2005) Problémy při hodnocení: • omezená použitelnost ELMI (artefakty) • nedostatečný popis a standardizace techniky biopsie i histologického hodnocení v publikacích • omezená velikost vzorku • některé ze změn jsou i u urémie bez PD •First •Prev •Next •Last •Go Back •Full Screen •Close •Quit

Cíle práce 1. navrhnout soubor parametrů pro kvantifikaci krevních cév peritonea a síly submezotelového vaziva 2. porovnat rozdíly při hodnocení těchto parametrů různými pracovníky


Materiál a metody • 72 sériových řezů (síla 5 µ) bločkem biopsie parietálního peritonea • zelený trichrom s Verhoeffovým železitým hematoxylinem • 5 řezů zpracováno kombinací lektinové histochemie (Wheat Germ Agglutinin) a imunohistochemie (vWF) • 5 řezů IHC α-SM-aktin • moduly PointGrid, LineSystem a CountingFrame SW Ellipse3D (ViDiTo, Košice, SR) • výběr 9 řezů ze série ⇒ z každého řezu ještě 4 zorná pole při ⇑ zvětšení ⇒ hodnoceno pozorovateli A, B, C s identickým nastavením parametrů software • Intraclass correlation coefficient (Shrout 1979) (Statistica 7.1, Statsoft CZ)


Odhady ploch/objemů testovacími mřížkami

Obr. 1: Superpozice bodové testovací mřížky na mikrofotografii.

Pravděpodobnost výskytu průsečíku s ROI je úměrná plošnému podílu ROI. •First •Prev •Next •Last •Go Back •Full Screen •Close •Quit

• odhad plochy ROI v rovině řezu pomocí bodové testovací sondy (mřížky), rovnice 1, estA = a · P

(1)

• Delesseho princip – plošný podíl dává odhad objemového podílu téže složky: AA = VV . (2) • výpočet odhadu celkového objemu ROI – Cavalieriho metoda mezi vybranými řezy je konstantní známá vzdálenost T (např. 40 µm), plochy jednotlivých řezů a součet těchto ploch A indexovaných i (v počtu m = 8) se poté vynásobí vzdáleností T podle rovnice 3. estV = T · (A1 + A2 + . . . + Am)

(3)


Odhady povrchové hustoty • systém lineárních sond SV (Y, ref ) =

S(Y ) V (ref )

[m−1],

(4)

kde SV (Y, ref ) je povrchová hustota plochy povrchu S(Y ) v referenčním objemu V (ref ). SV = 2IL,

(5)

Pn 2 · i=1 Ii Pn SV (Y, ref ) = , l/p · i=1 Pi

(6)

kde IL je počet průsečíků plochy s lineárními testovacími sondami, l/p je délka testovací linieku počtu bodů pomocné mřížky. • předpokladem je náhodnost orientace řezů (u objemů ne) ⇒ testovací linie prokládané vzorkem musí být izotropní ⇒ IUR či VUR řezy •First •Prev •Next •Last •Go Back •Full Screen •Close •Quit

Vertikální uniformní náhodné řezy • VUR řezy nejsou izotropní ve 3-D • izotropii zajistíme jen v arbitrárně zvolené horizontální rovině rotací o úhel φ • vzorek pak krájíme systematicky náhodně kolmo na horizontální rovinu • potřebujeme systém křivek, jejichž délková hustota je úměrná sin θ

Obr. 2: Abitrární orientace horizontální roviny a rotace φ kolem vertikální osy.


Odhady plochy povrchů • cykloidy s kratší osou k s vertikálou mají délkovou hustotu úměrnou sin θ • kombinace roviny generované VUR protokolem a sítí cykloid je ekvivalentní izotropním řezům (IUR) ve 3-D ⇒ cykloidy lze použít k odkadu povrchové hustoty na VUR řezech

Obr. 3: Síť cykloid.


Vzorkování Na každé úrovni odběru/vzorkování odebrané tkáně či histologických řezů by měl proběhnout systematický nestranný náhodný výběr.

Obr. 4: Systematický nestranný náhodný výběr.

1. 2. 3. 4.

Pozice prvního vzorku v sérii je určena náhodným číslem. Pozice dalších vzorků jsou ekvidistantní vzhledem k prvnímu. Hustota vzorkování se řídí požadovaným koeficientem chyby. Rozptyl metody je vždy minimálně stejný jako u prostého náhodného výběru, většinou je však význačně nižší. •First •Prev •Next •Last •Go Back •Full Screen •Close •Quit

Hodnocení koeficientu chyby CE je užitečnou mírou variability, která je pro základní soubor definována: SD (7) x¯ Posouzení variability výběru Cavalieriho řezů prostorově korelovanými objekty – hodnocení variability způsobené výběrem (sampling error) odhadem CE (rovnice 8, 9) dle Gundersena a Jensenové (1987): r 3A + C − 4B 1 estCEn = P · (8) ai 12 CE =

A=

n X i=1

ai · ai , B =

n−1 X i=1

ai · ai+1, C =

n−2 X

ai · ai+2

(9)

i=1


estV1: objem celého vzorku na řezu = 4 · 109 µm3 ICC: 0,894 (0,716–0,970)

Obr. 5: Odhad estV1. •First •Prev •Next •Last •Go Back •Full Screen •Close •Quit

estV2: objem submezotelového kolagenního vaziva = 2, 17 · 108 µm3 ICC: 0,862 (0,629–0,961)

Obr. 6: Odhad estV2.


estV3: objem všech cév rozlišitelných při daném zvětšení v subserózním vazivu = 1, 94 · 108 µm3 ICC: 0,912 (0,769–0,975)


estV4: objem drobných cév v kolagenním submezotelovém vazivu (celkem ze 4 zorných polí z každého z 9 řezů) = 1, 18 · 105 µm3 ICC: 0,990 (0,984–0,994)


estV5: objem submezotelového kolagenního vaziva (při velkém zvětšení) = referenční objem pro estV4 (celkem ze 4 zorných polí z každého z 9 řezů) = 9, 75 · 106 µm3 ICC: 0,992 (0,987–0,995)


estS1: plocha peritoneálního povrchu vzorku = 1, 25 · 106 µm2 ICC: 0,745 (0,440–0,921)

Obr. 10: Odhad estS1.


estS2: vnitřní povrch všech cév rozlišitelných při daném zvětšení v tukovém subserózním vazivu = 4, 94 · 106 µm2 ICC: 0,892 (0,721–0,969)

Obr. 11: Odhad estS2. •First •Prev •Next •Last •Go Back •Full Screen •Close •Quit

estS3: vnitřní povrch malých cév v submezotelovém kolagenním vazivu při velkém zvětšení = 6, 44 · 104 µm2 ICC: 0,961 (0,937–0,977)


estS4: povrch hranice mezotel/kolagen u snímků při velkém zvětšení = 1, 02 · 105µm2 ICC: 0,868 (0,752–0,928)


Analýza CE

Obr. 14: Pro CE ≈ 0, 05 je nutno hodnotit min. 9 řezů ze série 72. •First •Prev •Next •Last •Go Back •Full Screen •Close •Quit

von Willebrandův faktor (endotel)

Obr. 15: Počítání profilů vWF-pozitivních shluků (kapilár). •First •Prev •Next •Last •Go Back •Full Screen •Close •Quit


Obr. 16: Hodnocení referenční plochy submezotelového vaziva. •First •Prev •Next •Last •Go Back •Full Screen •Close •Quit





α-SM aktin

Obr. 19: Aktin-pozitivní buňky mohou být významné v submezotelovém vazivu.


α-SM aktin

Obr. 20: Aktin-pozitivní buňky mohou být významné v submezotelovém vazivu.


Diskuse • poměr estV 2/estS1 udává střední sílu submezotelového kolagenního vaziva = 173 µm; kontrolní měření kalibrovanou úsečkou (n=45) = 144 µm • poměr estS2/estV 1 ukazuje povrchovou hustotu velkých cév v tukovém subserózním vazivu • poměr a estS3/estV 5 ukazuje povrchovou hustotu malých cév v submezotelu • poměr QA = V P 2/estV 5 je analogický „relative microvessel numberÿ a poměr estV 4/estV 5 je obdobný parametru „relative microvessel areaÿ (Numata 2003)


Diskuse • většina publikací (Zareie 2005, van Westhenen 2005, Numata 2003) používá parametry založené na hodnocení počtu/plochy profilů cév • profily cév jsou 2-D struktury (průměty do roviny řezu) a jejich počet/plocha ∼ úhlu mezi osou cévy a rovinou řezu a délce cévy • hodnocení povrchů cév má v.s. větší biologický význam • hodnocení QA „relative microvessel number, density of microvessel profilesÿ je jednoduché, použitelné i u vzorků variabilního vzhledu, efektivní a může vypovídat o ev. angiogenezi • má smysl hodnotit větší cévy v subserózním vazivu? • použití IHC? × αSM-actin+ myofibroblasty u fibrózy;


Perspektivy 1. porovnání vzorků peritonea: • za normy (bez urémie) • během PD • po HD (příjemci Tx ledviny) 2. Existuje korelace parametrů mikroskopických a klinických? 3. další testování variability na větším počtu vzorků


Závěr 1. Představili jsme novou metodiku nestranné stereologické analýzy cév a vaziva peritonea na mikroskopické úrovni. 2. Její validita a korelace s klinickými parametry bude předmětem dalších studií.


Literatura [1] Di Paolo N., Sacchi G.: Atlas of peritoneal histology in normal conditions and dutiny peritoneal dialysis. Perit. Dial. Int. 2000, Vol. 20, Suppl.3. [2] Gundersen H.J.G., Jensen E.B.: The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J. Microsc. 1987, 147:229–263. [3] Numata M., Nakayama M., Nimura S. et al.: Association between an increased surface area of peritoneal microvessels and a high peritoneal solute transport rate. Perit. Dial. Int. 2003, 23:116– 122. [4] Opatrná S., Opatrný K.: Peritoneální dialýza – aktuální trendy. Postgraduální medicína 2003, 5:560–564. [5] Shrout P.E., Fleiss J.L.: Intraclass Correlations: Uses in Assessing Rater Reliability. Psychological Bulletin 1979, 2:420–8. [6] van Westrhenen R., Aten J., Aberra M. et al.: Effects of inhibition of the polyol pathway during chronic peritoneal exposure to a dialysis solution. Perit. Dial. Int. 2005, Suppl 3:S18–S21. [7] Zareie M., van Lambalgen A.A., ter Wee P.M. et al.: Better preservation of the peritoneum in rats exposed to amino acid-based peritoneal dialysis fluid. Perit. Dial. Int. 2005, 25:58–67.


Děkuji Vám za pozornost.

Práce byla podpořena výzkumným záměrem LF UK v Plzni MSM0021620819 „Náhrada a podpora funkce některých životně důležitých orgánůÿ.


Kvantitativní hodnocení krevních cév biopsie peritonea

Recommend Documents