KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM Tibouchina langsdorffiana Baill
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana Baill adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Juli 2009
Yasinta Ratna Esti Wulandari NIM G351040131
ABSTRACT YASINTA RATNA ESTI WULANDARI. Construction of Genomic Libraries of Tibouchina langsdorffiana Baill. Under direction of SUHARSONO and UTUT WIDYASTUTI. Tibouchina langsdorffiana Baill is tolerant plant to low pH and high aluminum (Al). Due its tolerance, this plant may be used as source of Al tolerant genes and model for tolerant plant to Al. Therefore genetic material of this plant must be kept in genomic library. Genomic library plays a crucial role in maintaining all genetic information belonging to an organism. This research aim to construct the genomic library of Tibouchina langsdorffiana using BlueSTAR1 phage as a vector. The big fragments of plant DNA were obtained by partial digestion of total DNA using 0.01 unit Sau3AI per g DNA at 37ºC for 30 minutes. By using 0.5 g insert DNA and the molarity ratio between insert DNA : vector = 2.9 : 1, the titer of 1.7 x 105 plaque forming unit (pfu) per ml was obtained. Analysis of the recombinant rate by blue-white screening showed that T. langsdorffiana genomic library contains 8% phage recombinant. To determine the size of insert DNA, pBlueSTAR-1 recombinant plasmid was digested by EcoRI. This digestion resulted two DNA fragment, one is 2.1 kb fragment corresponding to pBlueSTAR-1 plasmid, and the other is 10 kb fragment corresponding to insert DNA. Since the genom size of T. langsdorffiana is unknown, Dissotis canescens was used as reference, because both species belong to Melastomataceae family. By using formula N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = number of phage recombinant, f = insert DNA length ratio against genom length, so the probability (P) of all T. langsdorffiana genom found in genomic library is 17%. Keywords: Tibouchina langsdorffiana, DNA, libraries, genomic, phage
RINGKASAN YASINTA RATNA ESTI WULANDARI. Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana Baill. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT WIDYASTUTI. T. langsdorffiana adalah tumbuhan yang toleran terhadap pH rendah dan aluminium (Al) tinggi. Oleh sebab itu tumbuhan ini dapat digunakan sebagai sumber gen dan tumbuhan model toleransi terhadap pH rendah dan Al tinggi. Untuk memanfaatkan toleransi T. langsdorffiana terhadap pH rendah dan Al tinggi dan kemampuannya dalam mengakumulasi Al, maka bahan genetik tumbuhan ini harus disimpan di dalam pustaka genom. Pustaka genom sangat penting untuk menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh suatu spesies. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan konstruksi pustaka genom T. langsdorffiana. Konstruksi pustaka genom dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu: isolasi DNA total tanaman, pemotongan parsial DNA tanaman, penyisipan DNA T. langsdorffiana ke dalam fage , pengemasan DNA rekombinan, transveksi fage rekombinan ke E. coli dan analisis pustaka genom. Analisis pustaka genom meliputi eksisi dari fage menjadi plasmid, isolasi DNA plasmid, transformasi genetik dan pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi. Ukuran 7-20 kb DNA T. langsdorffiana didapat dari pemotongan 1 g DNA dengan 0.01 unit Sau3AI (Takara) pada 37ºC selama 30 menit. Pengemasan hasil ligasi 0.5 g DNA T. langsdorffiana dengan BlueSTAR-1 dengan rasio molaritas 2.9 : 1 menghasilkan titer sebesar 1.7 x 105 plaque forming unit (pfu) tiap ml. Hasil seleksi biru-putih menunjukkan bahwa pustaka genom T. langsdorffiana yang dikonstruksi mengandung rata-rata 8% fage rekombinan. Untuk mengetahui ukuran sisipan, plasmid pBlueSTAR-1 rekombinan dipotong dengan enzim restriksi EcoRI yang menghasilkan dua fragmen DNA yaitu vektor plasmid pBlueSTAR-1 yang berukuran 2.1 kb dan DNA T. langsdorffiana yang tersisip yang berukuran 10 kb. Untuk mengetahui derajat kelengkapan suatu pustaka genom, maka informasi ukuran genom dari suatu organisme harus diketahui. Karena ukuran genom T. langsdorffiana belum diketahui, maka ukuran genom Dissotis canescens digunakan sebagai dasar perhitungan karena kedua spesies tersebut termasuk dalam famili Melastomataceae. Pada penelitian ini, volume fage yang disintesis adalah 500 µl, sedangkan titer fage rekombinannya adalah 8% sehingga jumlah total fage rekombinan adalah 6.8 x 10 3 pfu. Dengan menggunakan rumus N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = jumlah fage rekombinan, f = rasio ukuran DNA sisipan terhadap ukuran genom, maka peluang (P) seluruh genom T. langsdorffiana terdapat dalam pustaka genom adalah 17%. Hal ini berarti bahwa peluang untuk mendapatkan sembarang potongan DNA di dalam pustaka genom adalah 17%. Kata kunci: Tibouchina langsdorffiana, DNA, pustaka, genom, fage
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM Tibouchina langsdorffiana Baill
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI
Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Judul Tesis Nama NIM
: Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana Baill : Yasinta Ratna Esti Wulandari : G351040131
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Suharsono, DEA. Ketua
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si. Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA.
Tanggal Ujian: 27 Juli 2009
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.
Tanggal Lulus:
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA
“Allah turut bekerja dalam segala sesuatu untuk mendatangkan kebaikan bagi mereka yang mengasihi Dia” Roma 8:28
Setitik usaha dan upaya kupersembahkan kepada........... Suamiku Herdamon Budianto dengan segenap pengorbanan waktu dan kesabarannya, Buah hatiku Dimas dan Michelle dengan segala keluguan dan kepolosannya, Papa dan Mama serta Dek’ Aris yang tidak lelah mendampingi dan memberiku semangat. Segala jerih payahku takkan pernah terwujud tanpa andil karya Maha Agung Allah Bapa. Puji dan syukur ke Hadirat-Mu..........Amin.
PRAKATA Puji dan syukur penulis haturkan kepada „Bapa‟ oleh karena kasih dan anugerah-Nya maka penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2006 sampai Desember 2008 adalah Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana Baill. Penelitian ini bertempat di Laboratorium Pusat Kerjasama Bioteknologi Indonesia-Belanda (BIORIN) dan Laboratorium Genetika Molekuler dan Seluler Tanaman, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB, Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku ketua komisi pembimbing dan Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si. selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah, serta Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA selaku penguji yang telah banyak memberikan masukan yang berguna dalam penyelesaian penulisan karya ilmiah ini. Terima kasih atas dana penelitian Proyek DIPA BIOTROP Tahun 2005 dengan judul “Construction of genomic Library and Isolation of Gene Involved in the Plant Tolerant to Low pH and High Solubility of Aluminium from Melastoma” dengan contract agreement No. 13.1/PSRP/SP-PEN/IV/2005 atas nama Dr. Ir. Suharsono, DEA. Terima kasih pula kepada rekan satu tim penulis yaitu Bapak Ir. Hadisunarso yang telah bersama-sama melakukan penelitian dari awal hingga berakhirnya penelitian ini. Terima kasih kepada Laboratorium BIORIN dan Laboratorium PPSHB IPB yang telah menyediakan tempat dan fasilitas dalam pelaksanaan penelitian. Terima kasih penulis sampaikan juga kepada Bapak Abdul Mulya dan Mbak Pepi Elvavina, serta Bapak Adi atas kerjasama dan bantuannya di laboratorium dan di rumah kaca. Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang mendalam kepada suami tercinta Herdamon Budianto atas pengertian dan kesabarannya memperhatikan anak-anak saat penulis berada di laboratorium dan atas bantuannya dalam membantu mengedit tulisan karya ilmiah ini, Papa & Mama, Enpa & Enma atas dukungan semangat dan doanya, dek Aris yang telah memudahkan transportasi penulis pada masa-masa penulisan, serta seluruh keluarga dan kerabat atas doa, semangat dan kasih sayangnya, juga buat rekanrekan yang berjuang bersama di Laboratorium BIORIN yaitu Ibu Sri Listyowati, Bu Ratna Yuniati, Pak Ulung, Pak Muzuni, Mbak Hanum, Bu Yohana, Niken, Pak Azis, Pak Neo, Rizky, Mbak Emma, Goto, dan Lulu. Semoga Allah Bapa membalas kebaikan mereka dan semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Juli 2009
Yasinta Ratna Esti Wulandari
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jayapura pada tanggal 2 Januari 1981 dari ayah Drs. F.X. Soewarto Citrotaruno, M.S. dan ibu M.G. Soewarti Pujirahayu, S.E., M.M. Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara. Pada tahun 2005, penulis menikah dengan Hugo Herdamon Budianto, SP. dan saat ini telah dikaruniai dua orang buah hati yaitu Alexander Dimas Raditya dan Brigita Michelle Radisti. Tahun 1999 penulis lulus dari SMU Stella Duce I Yogyakarta dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur undangan seleksi masuk IPB (USMI). Penulis memilih Program Studi Biologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama menjadi mahasiswa IPB, penulis pernah menjadi panitia Biologi Interaktif dalam rangka Dies Natalis IPB ke-36, dan menjadi pengurus Organisasi Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) periode 2001/2002 dan 2002/2003. Penulis juga menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar pada semester ganjil tahun ajaran 2002/2003 dan semester genap tahun ajaran 2002/2003, mata kuliah Taksonomi Tumbuhan Berpembuluh pada semester ganjil tahun ajaran 2002/2003, serta mata kuliah Fisiologi Tumbuhan pada semester genap tahun ajaran 2002/2003. Pada bulan Juni hingga Juli 2002, penulis melaksanakan praktik lapangan di Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB-BIOGEN) Cimanggu, Bogor. Makalah penulis yang merupakan bagian dari skripsi yang berjudul Growth and Development of Plant Studies in Mango using Paclobutrazol and KNO3 Application menjadi Supporting Paper pada Seminar Nasional X PERSADA di Jakarta pada bulan Juli 2003. Pada tahun 2004, penulis melanjutkan pendidikan strata-2 pada Program Studi Biologi, Sub Program Studi Fisiologi, Genetika dan Biologi Molekuler Tanaman, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Selama menjadi mahasiswa pascasarjana, penulis juga aktif mengikuti simposium-simposium dan seminar-seminar yang berkaitan dengan bioteknologi.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR...............................................................................................xi PENDAHULUAN Latar Belakang................................................................................................. 1 Tujuan........................................................................................................... 2 KAJIAN PUSTAKA Karakter Tibouchina...................................................................................... Pustaka Genom............................................................................................. Bakteriofage Lambda..................................................................................... Vektor Pengklonan Bakteriofage Lambda ................................................... Pengemasan DNA Lambda...........................................................................
3 6 7 9 11
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian...................................................................... 123 Bahan Penelitian........................................................................................... 123 Metode Penelitian............................................................................................13 Isolasi DNA total tanaman..................................................................... 143 Pemotongan parsial DNA...................................................................... 154 Penyisipan nukleotida pada ujung fragmen DNA.................................. 15 4 Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor............................................ 154 12 Pengemasan fage rekombinan............................................................. 16 Transveksi fage ke dalam E. coli…………......................................... 16 12 Eksisi plasmid dari fage ...................................................................... 16 Isolasi DNA plasmid rekombinan…...................................................... 17 12 Transformasi bakteri.............................................................................. 174 Pemotongan plasmid dengan enzim restriksi EcoRI............................. 18 HASIL DAN PEMBAHASAN Pemotongan Parsial dan Penyisipan Nukleotida pada Ujung Fragmen DNA............................................................................................................ 19 Konstruksi Fage Rekombinan...................................................................... 20 Ukuran DNA Sisipan................................................................................... 23 Ukuran Pustaka Genom............................................................................... 25 SIMPULAN DAN SARAN..............................................................................
27
DAFTAR PUSTAKA......................................................................................... 28
x
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Morfologi tanaman T. langsdorffiana……..................................................... 5 2 Peta genetik bakteriofage ............................................................................. 8 3 Penyusunan virus bakteriofage λ.................................................................... 10 4 Vektor pengklonan fage 5
BlueSTAR-1......................................................... 12
BlueSTAR-1 (Novagen) yang dipotong dengan XhoI dan mengalami pengisian dengan dCTP dan dTTP pada situs pengklonan…………...........
12
6 Tahapan konstruksi pustaka genom..............................................................
13
7 Fragmen DNA T. langsdorffiana hasil pemotongan parsial dengan Sau3AI........................................................................................................... 19 8 Seleksi biru-putih terhadap plak.................................................................... 21 9 DNA T. langsdorffiana menggantikan daerah lacZ, lambda, EMC, lambda, EMC dari vektor fage .................................................................................. 23 10 Plasmid rekombinan yang dipotong dengan EcoRI...................................... 24
xi
