KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA GENOM KEDELAI (Glycine max (L.) Merr.) UNTUK SEKUENSING GENOM TOTAL
ANDI KOSASIH
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
ABSTRAK ANDI KOSASIH. Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Kedelai (Glycine max (L.) Merr.) untuk Sekuensing Genom Total. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan I MADE TASMA. Kedelai merupakan salah satu dari komoditas pertanian terpenting dalam penyediaan bahan pangan di Indonesia. Kendala dalam budidaya kedelai di Indonesia yaitu rendahnya produktivitas kedelai nasional. Usaha untuk meningkatkan produktivitas kedelai nasional dapat dilakukan dengan perbaikan genetik tanaman. Sekuensing genom total dan analisis genom kedelai merupakan salah satu cara untuk mempercepat peningkatan pemuliaan kedelai serta untuk lebih meningkatkan pemahaman mengenai informasi genetik dan genomik kedelai. Tujuan penelitian ini adalah mengkonstruksi pustaka genom dari tiga genotipe kedelai di Indonesia (Tambora, B3293 dan Grobogan) dan menganalisis kualitas pustaka genom hasil sekuensing genom total. Konstruksi pustaka genom dilakukan secara in vitro dengan menempelkan adapter pada ujung fragmen DNA. Pustaka genom selanjutnya diklasterisasi dan disekuensing dengan menggunakan cBOT claster generation dan Next Generation Sequencing HiSeq2000. Pustaka genom yang berhasil dikonstruksi berukuran 400 bp dengan konsentrasi 23.20 ng/µL (Tambora), 64.50 ng/µL (B3293), dan 21.20 ng/µL (Grobogan). Ukuran dan konsentrasi pustaka genom yang dikonstruksi telah memenuhi persyaratan untuk sekuensing genom total. Jumlah basa yang dihasilkan dari proses sekuensing yaitu sebanyak 50.1 x 109 bp. Klaster pustaka genom dengan nilai Q scores di atas 30 yang dihasilkan sebesar 88.6%. Tingkat kesalahan pembacaan basa selama proses sekuensing sebesar 0.97%. Nilai densitas klaster, persen klaster PF, intensitas basa, persen phasing, dan persen prephasing yang dihasilkan dari penelitian ini menunjukkan bahwa kualitas klaster pustaka genom termasuk kategori ideal. Kata kunci : Kedelai, Pustaka Genom, Sekuensing Genom Total, Next Generation Sequencing
ABSTRACT ANDI KOSASIH. Construction and Quality Analysis of Soybean (Glycine max (L.) Merr.) Genomic Library for Whole Genome Sequencing. Under the direction of I MADE ARTIKA and I MADE TASMA. Soybean is one of the most important agricultural commodities in the supply of food in Indonesia. However, the low of the national soybean productivity is a constraint in soybean cultivation in Indonesia. National soybean productivity can be increased by genetic improvement of plants. Whole genome sequencing and genomic analysis of soybean is one way to accelerate soybean breeding progress and improve understanding of genetic and genomic information of soybean. Purposes of this research were to construct genomic library of three Indonesian soybean genotypes (Tambora, B3293 and Grobogan) and analyze the quality of the genomic library on whole genome sequencing result. Construction of genomic libraries was carried out in vitro by attaching an adapter to the end of DNA fragments. Clasterization and sequencing of genomic library in this research were conducted by using cBOT claster generation dan Next Generation Sequencing HiSeq2000. Genomic libraries were constructed successfully sized 400 bp with a concentration of 23.20 ng/µL (Tambora), 64.50 ng/µL (B3293), and 21.20 ng/µL (Grobogan). Size and concentration of the constructed genomic libraries were suitable for whole genome sequencing. The total yield of bases generated from the sequencing was 50.1 x 109 bp. Cluster library produced during the process of genome sequencing was Q scores value above 30 was 88.6%. Error rate of base reading during the sequencing was 0.97%. Values of the cluster density, percent cluster PF, the intensity of the base, phasing percent, and prephasing percent generated from this research showed that the cluster quality of genomic libraries was of ideal category. Keyword : Soybean, Genomic Library, Whole Genome Sequencing, Next Generation Sequencing
KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA GENOM KEDELAI (Glycine max (L.) Merr.) UNTUK SEKUENSING GENOM TOTAL
ANDI KOSASIH G84080043
Skripsi sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Judul skripsi Nama NIM
: Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Kedelai (Glycine max (L.) Merr.) untuk Sekuensing Genom Total : Andi Kosasih : G84080043
Disetujui, Komisi Pembimbing
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Ketua
Dr. Ir. I Made Tasma, M.Sc Anggota
Diketahui,
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc. Ketua Departemen Biokimia
Tanggal lulus :
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya. Shalawat dan salam semoga selalu tercurah kepada Nabi Muhammad SAW beserta seluruh keluarga, sahabat dan kepada para pengikutnya sampai akhir zaman sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini sebagai salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Tema yang dipilih pada penelitian ini adalah biologi molekuler, dengan judul “Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Kedelai (Glycine max (L.) Merr.) untuk Sekuensing Genom Total”. Penelitian ini dilaksanakan selama lima bulan sejak bulan Februari sampai Juni 2012, bertempat di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB Biogen), Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc dan Dr. Ir. I Made Tasma, M.Sc atas semua ilmu, bimbingan dan dukungan yang diberikan kepada penulis selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak Dani Setyawan, M.Si yang telah banyak membantu dalam teknis pelaksanaan penelitian, kepada kedua orang tua dan seluruh keluarga atas segala doa, dukungan, dan kasih sayangnya yang selalu memberi inspirasi kepada penulis untuk selalu berjuang keras dan menjadi lebih baik. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Esti Sahifah, Riris, Nanda, Wulan, rekan-rekan Biokimia 45 dan seluruh penghuni Wisma Badenten atas dukungan, kritik dan bantuannya selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat untuk perkembangan ilmu pengetahuan dan mampu memberikan informasi bagi yang memerlukan.
Bogor, November 2012
Andi Kosasih
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Ciamis pada tanggal 6 Mei 1990 dari ayah Drs. Kartono Kosasih dan ibu Yeyet Nurhayati. Penulis merupakan putra kedua dari dua bersaudara. Pendidikan penulis dimulai dari SD Negeri Cibodas dan melanjutkan pendidikan ke SMP Negeri 1 Banjar. Penulis lulus tahun 2008 dari SMA Negeri 1 Banjar dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih mayor Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan minor Pengolahan Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Biokimia Umum untuk mahasiswa S1 Biologi tahun ajaran 2011/2012 dan asisten praktikum Struktur dan Fungsi Biomolekul untuk mahasiswa S1 Biokimia tahun ajaran 2011/2012. Penulis juga aktif dalam kegiatan kemahasiswaan di IPB dan organisasi mahasiswa daerah, di antaranya penulis pernah aktif sebagai anggota Unit Kegiatan Mahasiswa Koperasi Mahasiswa IPB pada tahun 2008/2009, staf Divisi Human Resource Development Himpunan Profesi Community of Research and Education in Biochemistry (CREBs) periode 2009/2010, staf divisi Budaya, Olahraga dan Seni Paguyuban Mahasiswa Galuh Ciamis periode 2009/2010, Anggota Forum Silaturahmi Ketua Lembaga Kemahasiswaan FMIPA IPB periode 2010/2011 dan Ketua Himpunan Profesi Biokimia Community of Research and Education in Biochemistry (CREBs) periode 2010/2011. Penulis juga pernah aktif dalam berbagai kepanitian, di antaranya sebagai Ketua Divisi Penanggung Jawab Kelompok dalam Masa Perkenalan Departemen Biokimia tahun 2010, Ketua Pelaksana Lomba Karya Ilmiah Populer Pesta Sains Nasional tahun 2010 dan Ketua Divisi Humas Kegiatan Fieldtrip Biokimia Angkatan 45. Penulis juga aktif sebagai Steering Commitee beberapa kegiatan kemahasiswaan seperti Seminar Kesehatan 2011, Lomba Karya Ilmiah Populer Pesta Sains Nasional 2011, Seminar dan Workshop Kesehatan, Keselamatan Kerja di Laboratorium 2011 dan Masa Perkenalan Departemen Biokimia 2011. Penulis pernah melakukan Praktik Lapangan (PL) di Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI) Jalan Taman Kencana No.1, Bogor selama periode Juli hingga Agustus 2011 dengan judul Analisis Kadar Hara Daun (N,P), Tanah (C,N,P dan pH) Kelapa Sawit (Elaeis guineensis) dan Mucuna bracteata pada Uji Efektifitas Penggunaan Pupuk Hayati Berbasis Rhizobium sp. Dalam bidang karya ilmiah, penulis pernah mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa untuk kategori bidang penelitian (PKM P) dan mendapatkan dana hibah bersaing dari DIKTI pada tahun 2011 dengan judul Pemanfaatan Limbah Kayu Suren (Toona sinensis) sebagai Obat Diabetes pada Tikus Sprague Dawley yang Diinduksi Aloksan dan Aktivitas Anti Tirosinase pada Aloe Vera sebagai Pemutih Alami Kulit.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR .....................................................................................
ix
DAFTAR TABEL ..........................................................................................
ix
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................
x
PENDAHULUAN .........................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA Kedelai ................................................................................................... Pustaka Genom ..................................................................................... Sekuensing DNA.................................................................................... Next Generation Sequencing .................................................................. Klasterisasi Pustaka Genom ...................................................................
1 3 4 5 6
BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan ...................................................................................... Metode ...................................................................................................
6 7
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Isolasi DNA Genom Kedelai ........................................................ Hasil Fragmentasi DNA Genom Kedelai ............................................... Hasil Konstruksi Pustaka Genom Kedelai ............................................. Analisis Kualitas Pustaka Genom Hasil Sekeunsing Genom Total .........
11 12 13 17
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ............................................................................................... 20 Saran ......................................................................................................... 20 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 20 LAMPIRAN ................................................................................................ 24
DAFTAR TABEL Halaman 1
Kualitas dan kemurnian DNA genom total kedelai ................................... 12
2
Kuantitas dan kemurnian DNA genom kedelai hasil fragmentasi .............. 13
3
Kuantitas dan kemurnian DNA cetakan untuk preparasi konstruksi pustaka genom setelah dilarutkan dalam resuspension buffer ................................. 14
4
Kuantitas dan kemurnian fragmen DNA setelah tahapan modifikasi ujung fragmen DNA pada preparasi pustaka genom kedelai ............................... 15
5
Kuantitas dan kemurnian DNA cetakan setelah tahapan ligasi adapter....... 15
6
Kuantitas dan kemurnian DNA hasil ekstraksi gel .................................... 16
7
Kuantitas dan rasio kemurnian pustaka genom kedelai .............................. 17
8
Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom hasil sekuensing ............. 17
9
Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing .............................. 18
10 Tingkat kesalahan (error rate), nilai penyejajaran (aligned), dan intensitas basa hasil sekuensing ................................................................................ 20
DAFTAR GAMBAR Halaman 1
Tanaman kedelai (Glycine max (L.) Merr.) ...............................................
2
2
Next Generation Sequencing HiSeq 2000 ..................................................
5
3
Elektroforegram DNA genom total kedelai ............................................... 11
4
Elektroforegram DNA genom kedelai hasil fragmentasi ........................... 13
5
Elektroforegram tahapan purifikasi DNA hasil ligasi................................. 15
6
Elektroforegram pustaka genom tiga genotipe kedelai ............................... 16
7
Histogram jumlah klaster berdasarkan kualitas sekuens yang dihasilkan.... 19
8
Grafik intensitas basa-basa nitrogen selama proses sekuensing .................. 20
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1
Strategi Penelitian ..................................................................................... 25
2
Flow cell Illumina HiSeq2000 ................................................................... 26
3
Prinsip sequencing by synthesis next generation sequencing Illumina HiSeq 2000 .......................................................................................................... 27
4
Tahapan klasterisasi pustaka genom .......................................................... 28
5
Tabung nebulisasi ..................................................................................... 29
6
Ilustrasi phasing dan prephasing yang dapat terjadi saat proses sekuensing ................................................................................................ 30
7
Gambar intensitas basa adenin pada siklus 1 proses sekuensing ................ 31
8
Grafik jumlah densitas klaster setiap lajur dalam flow cell ......................... 32
9
Grafik nilai Qscores pada setiap siklus selama proses sekuensing ............ 33
1
PENDAHULUAN Kedelai (Glycine max (L.) Merr.) merupakan komoditas pertanian terpenting ketiga setelah padi dan jagung dalam penyediaan bahan pangan di Indonesia. Kedelai berperan sebagai sumber protein nabati yang sangat penting dalam rangka peningkatan gizi masyarakat karena harganya yang terjangkau dan aman bagi kesehatan (Kementerian Pertanian 2007). Shanmugasundaram dan Sumarno (1993) melaporkan bahwa dalam 100 g kedelai mengandung 10 g air, 35 g protein, 18 g lemak dan 32 g karbohidrat. Kebutuhan kedelai meningkat seiring dengan pertumbuhan jumlah penduduk di Indonesia. Hal tersebut terlihat dari meningkatnya nilai konsumsi kedelai per kapita pada tahun 2004 sebesar 8.97 kg meningkat menjadi 10.10 kg pada tahun 2011 (Kementerian Pertanian 2007, Sari 2011). Direktorat Jenderal Tanaman Pangan Republik Indonesia (2010) memperkirakan konsumsi kedelai per kapita di Indonesia akan semakin meningkat dan dapat mencapai 10.20 kg pada tahun 2012 dengan tingkat pertumbuhan konsumsi sebesar 0.24%. Namun, meningkatnya tingkat konsumsi berbanding terbalik dengan produksi kedelai nasional. Tahun 2011, produksi kedelai nasional hanya sebesar 843 838 ton dengan luas panen 620 928 ha dan produktivitas 1.36 ton/ha. Nilai produksi tersebut sangat menurun dibandingkan produksi kedelai nasional tahun 1992 yang mencapai 1.8 juta ton dengan luas panen 1.6 juta ha dan produktivitas 1.12 ton/ha. Rendahnya produktivitas kedelai nasional menyebabkan kebutuhan kedelai dalam negeri tidak tercukupi. Produksi kedelai nasional hanya memenuhi 48% dari total kebutuhan kedelai dalam negeri yang mencapai 2 juta ton (Dirjen Tanaman Pangan RI 2010, BPS 2011, Sari 2011). Usaha untuk meningkatkan produktivitas kedelai nasional dapat dilakukan melalui perbaikan genetik tanaman. Salah satu faktor yang penting dalam perbaikan genetik tanaman adalah tahapan isolasi dan karakterisasi gen. Tahapan tersebut dapat dilakukan dengan memanfaatkan informasi genomik dan genetik kedelai yang diperoleh melalui sekuensing genom total kedelai. Sekuensing genom total (whole genome sequensing) adalah proses penentuan urutan genom suatu organisme yang dilakukan dalam satu waktu. Argout et al (2010) menyatakan
bahwa sekuensing genom total penting dilakukan terutama untuk mengetahui informasi genomik dan genetik suatu organisme secara menyeluruh. Sekuensing genom total dapat dilakukan dengan teknologi sekuensing yang disebut next generation sequensing (NGS). Panjang untai DNA yang disekuens menggunakan metode NGS yaitu 25-500 bp namun dapat dibaca ratusan bahkan ribuan kali. Jika dibandingkan dengan menggunakan metode sekuensing genom total yang lainnya seperti metode shotgun sequencing, metode NGS menghasilkan data yang lebih banyak dengan waktu yang lebih singkat (Voelkerding et al. 2009, Metzker 2010). Instrumen NGS yang digunakan pada penelitian ini adalah Illumina HiSeq2000. Keunggulannya yaitu dapat membaca untai DNA sekitar 2x100 bp dan menghasilkan data sekitar 200 Gbp dalam satu kali sekuens dengan akurasi data yang dihasilkan dapat mencapai 99.5% (Zhang et al. 2011). Tahapan sekuensing genom total diawali dengan mengkonstruksi pustaka genom. Konstruksi pustaka genom untuk sekuensing genom total menggunakan NGS Illumina HiSeq2000 membutuhkan waktu yang relatif singkat dan efisien. Hal tersebut terjadi karena dalam tahapan konstruksi pustaka genom tidak membutuhkan vektor untuk menyisipkan fragmen DNA dan tidak memerlukan sebuah ruang penyimpanan khusus untuk menyimpan vektor yang mengandung fragmen DNA. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi pustaka genom kedelai dan menganalisis kualitas pustaka genom hasil sekuensing genom total. Hipotesis penelitian ini adalah pustaka genom tiga genotipe kedelai Indonesia dapat dikonstruksi untuk sekuensing genom total. Penelitian ini diharapkan dapat membantu meningkatkan informasi genomik dan genetik kedelai yang pada tahapan selanjutnya dapat digunakan untuk membantu pemuliaan kedelai
TINJAUAN PUSTAKA Kedelai Kedelai (Glycine max (L.) Merr) merupakan tanaman semusim berupa semak rendah, tumbuh tegak dan berdaun lebat, serta memiliki beragam morfologi (Hidajat 1985). Kedelai bukan merupakan tanaman asli Indonesia namun sejak abad ke 16 tanaman ini mulai dibudidayakan di pulau Jawa yang dibawa oleh imigran Cina sebagai bahan
2
makanan. Kedelai berasal dari daerah Manshukuo (Cina Utara) dan merupakan salah satu tanaman yang penting dalam kehidupan masyarakat di daratan Cina dan telah dibudidayakan sejak tahun 2500 SM. Tanaman ini kemudian tersebar luas sampai ke Cina bagian selatan, Korea, Jepang dan negara-negara di Asia Tenggara termasuk Indonesia. Di samping itu, kedelai juga tersebar hingga ke luar benua Asia seperti Amerika dan Eropa (Poehlman dan Sleper 1995, Purwono dan Purnamawati 2008). Pertumbuhan kedelai ditentukan oleh ketinggian tempat. Kedelai tumbuh pada daerah yang memiliki ketinggian 0-900 m di atas permukaan laut (dpl) dan akan tumbuh baik pada ketinggian dibawah 500 m dpl. Kondisi curah hujan yang ideal bagi pertumbuhan kedelai adalah lebih dari 1500 mm/tahun dengan curah hujan optimal antara 100-200 mm/bulan. Pertumbuhan terbaik juga diperoleh pada kisaran suhu 20-30 0C dengan suhu optimal 25-27 0C dan kelembaban udara rata-rata sebesar 50%. Intensitas cahaya matahari penuh selama 12 jam sehari merupakan intensitas yang dikehendaki bagi pertumbuhan kedelai (Suprapto 2002, Pitojo 2007). Pitojo (2007) mengklasifikasikan kedelai (Gambar 1) ke dalam Divisi Spermatophyta, Subdivisi Angiospermae, Kelas Dicotyledoneae, Ordo Polypetales, Famili Leguminosae, Subfamili Papilionoideae, Genus Glycine, Spesies Glycine max. Kedelai yang dibudidayakan saat ini termasuk dalam spesies Glycine max (L.) Merr. yang berasal dari kedelai liar yang disebut Glycine usuriensis (Sumarno dan Harnoto 1983). Secara morfologi, kedelai memiliki akar tunggang yang dapat mencapai kedalaman 150 cm pada tanah yang gembur (Suprapto 2002). Perakaran kedelai dapat membentuk hubungan simbiosis mutualisme dengan bakteri pengikat nitrogen bebas dari udara dengan membentuk bintil akar. Bintil akar tersebut terbentuk setelah tanaman kedelai muda memiliki akar rambut pada akar utama atau cabang (Hidajat 1985). Hidajat (1985) menyatakan bahwa kedelai memiliki empat tipe daun yang berbeda dalam masa hidupnya. Empat tipe daun tersebut yaitu kotiledon, daun primer sederhana, daun trifoliate dan profilia. Daun primer sederhana berbentuk oval, berupa daun tunggal (unfoliate) serta memiliki tangkai sepanjang 1-2 cm dan terletak bersebrangan pada buku pertama di atas kotiledon. Daun trifoliate adalah daun-daun yang terbentuk pada batang
Gambar 1 Pohon kedelai (Glycine max (L.) Merr.) (Zamroni 2012) utama dan cabang. Bentuk anak daun dapat berbentuk oval hingga lancip. Bunga kedelai termasuk bunga sempurna dan memiliki sifat penyerbukan sendiri. Kedelai mulai berbunga pada umur 30-50 hari setelah ditanam dan sekitar 60% bunga rontok sebelum membentuk polong. Buah kedelai berbentuk polong dengan 1-4 biji di dalamnya. Jumlah polong per tanaman bervariasi tergantung varietas, kesuburan tanah dan jarak tanam. Setiap tanaman mampu menghasilkan 100-250 polong, namun pada jarak tanam yang rapat, kedelai hanya mampu menghasilkan 30 polong. Waktu yang dibutuhkan polong sampai masak bervariasi tergantung varietas dan berkisar antara 75-100 hari setelah ditanam (Rukmana dan Yunarsih 1996, Suprapto 2002) Tanaman kedelai berbatang pendek (30100 cm), memiliki 3-6 percabangan dan berbentuk tanaman perdu. Batang tanaman kedelai berasal dari poros embrio yang terdapat pada biji masak (Pitojo 2007, Adie dan Krisnawati 2007). Pola pertumbuhan kedelai berdasarkan batang dan bunga dibedakan menjadi determinate dan indeterminate. Pola pertumbuhan determinate dicirikan dengan fase vegetatif terhenti setelah fase berbunga, sedangkan fase indeterminate dicirikan dengan pertumbuhan vegetatif berlanjut setelah berbunga. Di samping kedua pola pertumbuhan tersebut dikenal juga pola pertumbuhan semideterminate yang memiliki pola pertumbuhan diantara kedua tipe tersebut. Kedelai di Indonesia pada umumnya memiliki pola pertumbuhan determinate (Adie dan Krisnawati 2007). Contoh genotipe kedelai Indonesia yang memiliki pola pertumbuhan determinate yaitu genotipe Tambora dan grobogan. Genotipe kedelai yang digunakan pada penelitian ini adalah genotipe Tambora, grobogan dan B3293. Genotipe Tambora merupakan kedelai yang dihasilkan melalui
3
tetua yang berasal dari IRRI Philipina dan dimuliakan oleh Sumarno, Rodiah, Ono Sutrisno dan Cheppy Syukur. Ciri-ciri genotipe ini yaitu hipokotil berwarna unggu, bunga berwarna ungu, kulit polong tua berwarna coklat tua, dan biji berwarna kuning mengkilat. Rataan hasil kedelai tambora yaitu sekitar 1.5 ton/ha. Genotipe ini memiliki keunggulan toleran terhadap penyakit karat. Sedangkan, genotipe Grobogan merupakan kedelai yang berasal dari pemurnian populasi lokal Malabar Grobogan dan dimuliakan oleh Suhartina dan M. Muclisch Adie. Potensi hasil yang dapat diperoleh dari varietas ini yaitu sebanyak 3.4 ton/ha dengan keunggulan umur panen lebih pendek, polong lebih besar dan tingkat kematangan polong dan daun bersamaan (Pusat Penelitian dan pengembangan Tanaman Pangan 2012). Genotipe B3293 merupakan kedelai yang berasal dari Kediri, termasuk kedelai yang bersifat genjah dan sensitif terhadap toksisitas aluminium. Genotipe ini digunakan sebagai tetua dalam persilangan untuk pemuliaan kedelai yang toleran terhadap toksisitas aluminium (BB-Biogen 2004, Tasma et al. 2008). Pustaka Genom Pustaka genom diartikan sebagai kumpulan sekuens (urutan) DNA dari suatu organisme (Wulandari 2009). Suharsono (2002) menyatakan bahwa pustaka genom mengandung semua gen yang dipunyai oleh suatu organisme, termasuk daerah penyandi sehingga sangat penting untuk menyimpan seluruh informasi genetika yang dipunyai oleh suatu organisme. Pustaka genom sangat bermanfaat dalam usaha isolasi dan karakterisasi suatu gen dan dapat digunakan untuk pemetaan gen secara fisik. Peta genetik ini sangat penting di dalam program pemuliaan tanaman secara konvensional maupun secara molekuler. Oleh karena itu, pustaka genom merupakan bagian yang sangat penting dalam program perbaikan genetika tanaman secara molekuler maupun melalui pemuliaan konvensional. Berdasarkan sumber DNA yang digunakan, pustaka gen dapat dibedakan menjadi dua jenis yaitu pustaka genom dan pustaka cDNA. Pustaka genom menggunakan DNA genomik/kromosom sebagai sumber DNA yang digunakannya. Sementara itu, pustaka cDNA menggunakan DNA hasil transkripsi balik dari suatu populasi mRNA. Hal yang perlu diperhatikan dalam melakukan konstruksi pustaka genom yaitu bahwa
pustaka yang dibuat harus merepresentasikan semua gen yang ada di dalam sumber DNA asalnya. Suatu pustaka dikatakan representatif jika mengandung semua sekuens aslinya. Di samping itu, jika suatu pustaka tidak mengandung klon dalam jumlah yang mencukupi maka sangat dimungkinkan hilangnya beberapa gen tertentu. Pustaka genom yang representatif diperoleh dengan memurnikan DNA genom yang kemudian dipotong-potong secara acak menjadi fragmen-fragmen dengan ukuran yang diperlukan. Fragmentasi DNA dapat dilakukan dengan dua cara yaitu secara fisik contohnya dengan sonikasi atau nebulisasi dan fragmentasi secara enzimatik dengan menggunakan enzim restriksi (Wahyudi 2001). Pustaka genom dapat dikonstruksi dengan menggunakan vektor yang disisipkan pada sel inang. Vektor yang diperlukan dalam pembuatan pustaka genom dapat berupa bakteriofage, P1 artificial chromosome (PAC), yeast artificial chromosome (YAC), bacterial artificial chromosome (BAC) atau kosmid. Pemilihan vektor-vektor tersebut tergantung pada ukuran panjang fragmen DNA (Wahyudi 2001). Menurut Woo et al. (1994), pustaka DNA sebagian besar dikonstruksi melalui vektor bakteriofage, kosmid dan YAC. Ukuran panjang fragmen DNA yang dapat disisipkan dalam vektorvektor tersebut yaitu maksimal 17 kb untuk bakteriofage, 46 kb untuk kosmid, 100 kb untuk PAC dan 2000 kb untuk YAC. Penggunaan vektor dalam konstruksi pustaka genom memiliki beberapa kendala. Ukuran fragmen DNA yang dapat disisipi hanya dapat dilakukan untuk fragmen berukuran kecil. Walaupun, yeast artificial chromosome (YAC) dapat disisipkan ukuran fragmen yang cukup besar berkisar 2000 kb namun dalam aplikasinya mengalami beberapa kendala seperti banyaknya DNA khimera yang tidak diinginkan dan sulitnya mengisolasi DNA yang telah disisipkan dalam YAC (Woo et al. 1994). Konstruksi pustaka genom untuk sekuensing genom total menggunakan Next Generation Sequencing (NGS) memiliki metode yang berbeda. Metode konstruksi pustaka genom yang digunakan memiliki prinsip yang sama dengan konstruksi genom dengan menggunakan metode shotgun sequencing yaitu fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan DNA genom tidak disisipkan dalam suatu vektor pada sel inang. Namun, tahapan selanjutnya setelah
4
fragmentasi DNA berbeda antara NGS dengan shotgun sequencing. Pada metode shotgun sequencing, DNA yang telah difragmentasi tidak dilakukan ligasi adapter tetapi langsung dilakukan sekuensing. Hal tersebut berbeda dengan konstruksi pustaka genom menggunakan NGS, fragmen DNA yang dihasilkan sebelum disekuens dipreparasi dengan menempelkan adapter pada ujung fragmen DNA. Adapter tersebut pada tahapan selanjutnya (klasterisasi pustaka genom) akan menempel pada sebuah flow cell (Lampiran 2) untuk amplifikasi fragmen DNA melalui metode bridge amplification (Mardis 2008, Metzker 2010, Commins et al. 2011). Sekuensing DNA Sekuensing DNA atau pengurutan basa DNA merupakan teknik kunci untuk berbagai perkembangan ilmu pengetahuan di antaranya arkeologi, antropologi, ilmu genetika, bioteknologi, biologi molekular dan ilmu forensik (Franca et al. 2002). Sekuensing DNA digunakan untuk menentukan urutan basa nitrogen (adenin, guanin, sitosin dan timin) dalam suatu DNA. Salah satu contoh aplikasi sekuensing DNA yaitu dalam pengurutan genom manusia melalui proyek genom manusia atau Human Genome Project. Contoh lain yaitu dalam ilmu pengobatan, sekuensing DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan pengobatan penyakit genetik. Awal tahun 1970 merupakan perkembangan awal dari sekuensing DNA dengan metode yang digunakan yaitu metode kromatografi. Perkembangan selanjutnya mulai diperkenalkan metode sekuensing DNA dengan menggunakan metode dye based sequencing (Olsvik 1993). Metode sekuensing DNA yang dikenal sekarang adalah metode enzimatik yang diperkenalkan oleh Sanger dan metode kimiawi yang diperkenalkan Maxam-Gilbert. Sebelum dikenal metode enzimatik atau metode terminasi rantai, Sanger dan Coulson (1975) terlebih dahulu memperkenalkan sekuensing DNA yang disebut metode plusminus. Metode ini menggunakan DNA polimerase I yang berasal dari Escherichia coli dan DNA polimerase dari bakteriofage T4 (Englund 1971,1972). Kedua DNA polimerase tersebut mempunyai perbedaan dalam urutan nukleosida trifosfat. Produk yang dihasilkan dari tahapan polimerase kemudian diselesaikan dengan menggunakan elektroforesis dalam gel akrilamid. Dua tahun setelah memperkenalkan metode plus-minus,
Sanger kemudian memperkenalkan metode sekuensing yang lain dengan menggunakan polimerisasi enzimatik atau dikenal juga dengan nama metode terminasi rantai (Sanger dan Coulson 1975). Perpanjangan atau ekstensi rantai DNA pada metode enzimatik Sanger, dimulai dari situs spesifik pada DNA cetakan dengan menggunakan sebuah primer atau oligonukleotida pendek yang komplementer terhadap DNA pada daerah situs tersebut. Primer tersebut diperpanjang menggunakan DNA polimerase (enzim yang mereplikasi DNA). Di samping itu, dalam metode enzimatik juga ditambahkan empat jenis basa deoksinukleotida dan nukleotida pemutus atau penghenti rantai (terminator rantai) yang biasanya dalam bentuk di-deoksinukleotida. Pengikatan nukleotida pemutus rantai dengan rantai DNA yang dibantu oleh DNA polimerase menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang berhenti memanjang hanya pada posisi DNA tempat nukleotida tersebut berikatan. Fragmen-fragmen DNA tersebut dideteksi dengan menandai (labelling) primer yang digunakan dengan fosfor radioaktif sebelum reaksi sekuensing dimulai. Keempat hasil reaksi tersebut kemudian dielektroforesis pada empat lajur yang berdekatan pada gel akrilamid. Perkembangan selanjutnya dari sekuensing DNA metode sanger adalah penggunaan flourescent dye sebagai penanda ujung primer. Hal ini memiliki kelebihan karena tidak menggunakan bahan radioaktif serta menambah keamanan dan kecepatan karena keempat hasil reaksi dapat dicampur dan dielektroforesis pada satu lajur pada gel. Metode ini dikenal juga sebagai metode dye primer sequencing (Franca et al. 2002). Pada waktu yang hampir bersamaan dengan dikenalkannya metode sekuensing Sanger, Allan Maxam dan Walter Gilbert tepatnya pada tahun 1976-1977 mengembangkan metode sekuensing DNA yang didasarkan pada modifikasi kimiawi DNA yang dilanjutkan dengan pemotongan DNA (Pettersson et al. 2009). Metode ini awalnya cukup populer karena dapat langsung menggunakan DNA hasil pemurnian. Sedangkan, metode Sanger pada waktu itu memerlukan kloning untuk membentuk DNA untai tunggal. Seiring dengan dikembangkannya metode terminasi rantai, metode sekuensing Maxam-Gilbert menjadi tidak populer karena kerumitan teknisnya, penggunaan bahan kimia berbahaya, dan kesulitan dalam sekuensing skala besar (Pesole dan Saccone 2003).
5
Metode lain yang dapat digunakan dalam sekuensing DNA adalah metode pyrosequencing yakni teknik pemetaan DNA yang berdasarkan deteksi terhadap pirofosfat (PPi) yang dilepaskan selama sintesis DNA. Teknik ini memanfaatkan reaksi enzimatik yang dikatalisis oleh ATP sulfurilase dan luciferase untuk pirofosfat anorganik yang dilepaskan selama penambahan nukleotida (Poirel et al. 2006). Sekuens DNA skala besar dibutuhkan dalam sekuensing genom. Berbagai strategi telah dikembangkan untuk sekuensing DNA skala besar, termasuk strategi primer walking dan shotgun sequencing. Kedua strategi tersebut melibatkan pembacaan banyak bagian DNA dengan metode Sanger dan selanjutnya menyusun hasil pembacaan tersebut menjadi sekuens yang runut. Masing-masing strategi memiliki kelemahan sendiri dalam hal kecepatan dan ketepatan, contohnya metode shotgun sequencing merupakan metode yang paling praktis untuk sekuensing genom ukuran besar, namun proses penyusunannya rumit dan rentan kesalahan. Perkembangan sekuencing skala besar selanjutnya disebut sebagai Next Generation Sequencing (Mardis 2008). Next Generation Sequencing Next Generation Sequencing (NGS) merupakan istilah yang digunakan untuk menyebutkan perkembangan metode sekuensing DNA setelah metode yang diperkenalkan oleh Sanger dan MaxamGilbert pada tahun 1977. Metode yang diperkenalkan dalam NGS memungkinkan sekuensing dapat dilakukan dalam skala besar dengan waktu yang relatif singkat dan tingkat kesalahan yang lebih kecil daripada metode sekuensing sebelumnya (Schuster 2008). Metzker (2010) menyatakan bahwa metode sekuensing Sanger disebut juga sebagai generasi sekuensing yang pertama. Instrumentasi NGS mulai diperkenalkan tahun 1990-an melalui Massive Parallel Signature Sequencing (MPSS) yang dikembangkan oleh Lynx Therapeutics, sebuah perusahaan yang didirikan oleh Sydney Brenner dan Sam Eletr. Perusahaan tersebut pada tahun 2004 bergabung dengan Solexa dan berganti nama menjadi Illumina. Metode MPSS adalah metode bead-based yang menggunakan pendekatan kompleks penempelan adaptor yang selanjutnya akan dibaca melalui adaptor decoding (Brenner et al. 2000). Instrumen NGS yang lain yaitu
Polony Sequencing, sebuah instrumen yang diperkenalkan pada tahun 2005 oleh Laboratory of George Chruch, Harvard. Metode NGS dengan Polony Sequencing merupakan NGS pertama yang dapat mengurutkan genom pertama kali melalui kombinasi in vitro paired-tag library dengan emulsi PCR dan ligasi yang berdasarkan pada sekuensing kimiawi. Genom yang berhasil disekuens adalah genom yang berasal dari Escherichia coli. Apabila dibandingkan dengan metode sekuensing yang dilakukan dengan menggunakan metode Sanger, sekuensing genom total menggunakan NGS memiliki tingkat akurasi yang tinggi yaitu 99,99%. Biaya yang dibutuhkan juga lebih murah yaitu satu per sepuluh dari biaya yang dibutuhkan untuk mengurutkan genom melalui metode sanger (Schuster 2008). Instrumen NGS yang lain yaitu pyrosequencing (454 Life Sciences), SOLiD sequencing ( Applied Biosystem) , ion semicunductor sequencing (Ion Torrent System Inc.), DNA nanoball sequencing, dan helioscope single molecule sequencing, (Margulies et al 2005, Valouev et al 2008, Rusk 2011). Selain yang disebutkan sebelumnya, instrumen NGS yang lain yaitu HiSeq2000 (Gambar 2) yang dikembangkan oleh Illumina. HiSeq2000 mempunyai kemampuan untuk mengurutkan lebih dari lima genom manusia dalam 30 kali cakupan secara bersamaan, serta mengurutkan lebih dari 192 ekspresi gen. Instrumen ini menghasilkan 540-600 Gb dengan panjang fragmen 2 x 100 bp selama 11 hari. Secara umum, terdapat empat tahapan yang dilakukan dalam sekuensing DNA menggunakan HiSeq2000 yaitu preparasi sampel pustaka genom, klasterisasi pustaka genom, sekuensing dan analisis data sekuens (Illumina 2010a).
Gambar 2 Next Generation Sequencing HiSeq2000 (Illumina 2010a)
6
Prinsip sekuensing menggunakan NGS HiSeq2000 adalah Sequencing by Synthesis (SBS) (Lampiran 3). Selama proses sekuensing keempat basa nitrogen penyusun DNA (adenin, timin, guanin dan sitosin) dialirkan secara simultan ke dalam flow cell dan akan berikatan dengan fragmen DNA pada klaster dengan dibantu oleh DNA polimerase. Secara spesifik, keempat basa tersebut membawa penanda berupa flourescen yang akan berpendar ketika basa-basa tersebut berikatan membentuk utas DNA. Utas DNA yang terbentuk merupakan utas DNA yang komplemen dengan fragmen DNA pada klaster. Gugus 3’OH pada basa-basa tersebut telah mengalami modifikasi sehingga tidak dapat berikatan dengan basa penyusun yang lain sebelum satu siklus sintesis telah selesai dilakukan. Satu siklus telah selesai jika pendaran flourescen yang dihasilkan dari basa yang telah disintesis dideteksi oleh sebuah kamera CCD yang terdapat pada NGS HiSeq2000. Kamera CCD tersebut akan menangkap pendaran flourescen hasil reaksi pembentukan utas DNA dan akan mencitrakan hasilnya melalui tampilan Real Time Analysis pada monitor NGS HiSeq2000. Di samping itu, berakhirnya satu siklus sintesis juga ditandai dengan putusnya ikatan kimia penanda flourescen dan gugus 3’OH termodifikasi yang selama sintesis berikatan dengan fragmen DNA dalam klaster (Mardis 2008, Ansorge 2009, Metzker 2010). Klasterisasi Pustaka Genom Klasterisasi pustaka genom merupakan tahapan yang harus dilakukan sebelum sekuensing menggunakan Next Generation Sequencing Hiseq2000. Klasterisasi pustaka genom dilakukan melalui lima tahapan yaitu denaturasi, immobilisasi dan perpanjangan DNA, amplifikasi, linearisasi dan hibridisasi (Lampiran 3). Klasterisasi bertujuan untuk menghasilkan klaster atau kelompok salinan dari pustaka genom yang akan disekuen (Mardis 2008). Tahap awal klasterisasi pustaka genom yaitu denaturasi utas ganda DNA menjadi utas tunggal dengan menambahkan NaOH pada larutan pustaka genom yang akan disiapkan untuk proses klasterisasi. Utas tunggal yang telah terbentuk akan mengalami immobilisasi dengan cara menempel pada oligonukleotida di permukaan flow cell. Setelah terimmobilisasi, utas tunggal akan membentuk salinan pustaka genom dengan oligonukleotida yang menempel pada permukaan flow cell berperan sebagai primer dalam proses penyalinan tersebut. Setelah
salinan terbentuk, utas tunggal yang berperan sebagai cetakan akan terdenaturasi kembali dan menyisakan utas salinan pustaka genom yang berikatan dengan oligonukleotida pada flow cell. Tahapan selanjutnya yaitu amplifikasi pustaka genom dengan metode bridge amplification. Dalam metode amplifikasi tersebut, adapter pada pustaka genom akan menempel pada olinukleotida yang lain di permukaan flow cell sehingga membentuk lengkungan seperti jembatan (Lampiran 4). Setelah proses bridge amplification selesai, salinan pustaka genom akan kembali ke bentuk awal dan tidak membentuk lengkungan kembali. Hasil akhirnya akan terbentuk klaster salinan dari pustaka genom yang akan disekuen. Namun, beberapa salinan pustaka genom dalam klaster akan mengalami denaturasi secara acak sehingga menyebabkan oligonukleotida pada flow cell terblokir dan tidak dapat digunakan kembali. Hal tersebut bertujuan untuk mencegah gangguan dan mengurangi tingkat kesalahan pada proses sekuensing (Illumina 2010b).
BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan meliputi mortar, alu, tabung 15 mL, tabung 2 mL, tabung 1.5 mL, penangas air, inkubator thermostat, sentrifus 5810X effendorf, thermolyne vortex mixer maxi II, mikropipet, tip pipet, spektrofotometer nanodrop thermoscientific 2000c, tabung nebulisasi invitrogen, selang nebulisasi, tabung gas nitrogen, microwave sanyo, mikrosentrifus VWR minifuge galaxy minister C1413, kotak es, sarung tangan karet, termos, neraca analitik, cetakan gel, sisir, alat pengering, thermal cycler biometra T1, sudip, gelas piala, parafilm, power supply, perangkat elektroforesis, kolom elusi gel minElute Spin, UV Transilluminator DigiDoc-lt Imaging System, magnetic stand, mesin pendingin tropicalized Sansio, Illumina cBot Cluster Generation, Illumina Hiseq 2000. Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah daun kedelai, es batu, etanol, nitrogen cair, bufer ekstraksi CTAB (Cetil Trimetil Amonium Bromida), NaOAc (natrium asetat), chisam (kloroform : isoamil alkohol) dengan perbandingan 24 : 1, isopropanol, bufer TE, etanol absolut dan etanol 70%, 0.2% beta merkaptoetanol, dan 2% polivinilpirolidon. Bahan-bahan yang digunakan untuk nebulisasi DNA adalah
7
gliserol 50%, 1 x TAE, akuades, isolat DNA, resuspension buffer, etanol absolut, etanol 70%, NaOAc, serbuk agarosa. Bahan-bahan yang digunakan untuk modifikasi ujung fragmen DNA adalah end repair control, end repair mix, AMPure XP Beads, etanol 80%, dan resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk adenilasi ujung 3’OH DNA adalah A-tailing control dan A-tailing mix. Bahan-bahan yang digunakan untuk ligasi adapter adalah ligase control, DNA ligase mix, DNA adapter index, stop ligase mix, AMPure XP Beads, etanol 80%, dan resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk purifikasi DNA hasil ligasi adalah serbuk agarosa, 1 x TAE, SyBr Gold, loading dye, DNA ladder, bufer QG, bufer PE, dan bufer EB. Bahan-bahan yang digunakan untuk amplifikasi DNA adalah PCR Primer Cocktail, PCR Master Mix, AMPure XP Beads, etanol 80%, dan Resuspension Buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk klasterisasi dan sekuensing genom kedelai adalah 2 N NaOH, bufer hibridisasi, Tris-Cl, buffer library, TruSeq SR Cluster Kit v3-cBotHS, Truseq SBS Kit-HS (200 cycle). Metode Isolasi DNA Genom Kedelai (Modifikasi Michiels et al.. 2002) Sampel daun muda ditimbang sebanyak 300 mg dan digerus sampai halus menggunakan mortar yang sebelumnya telah dibasuh dengan nitrogen cair. Bufer ekstraksi yang telah dipanaskan sebelumnya pada suhu 600C ditambahkan sebanyak 5 mL pada daun yang telah halus dan dicampurkan secara perlahan dalam tabung 15 mL. Sampel diinkubasikan pada suhu 600C selama 60 menit dan secara berkala dilakukan pencampuran untuk menghindari penggumpalan. Sebanyak 5 mL kloroform :isoamilalkohol (24 :1) ditambahkan ke dalam sampel dan dicampurkan dengan cara dibolakbalik secara perlahan selama 5 menit. Campuran tersebut kemudian disentrifus selama 5 menit pada 2500 g (suhu 200C). Kemudian lapisan atas hasil sentrifus dipindahkan ke dalam tabung baru. Langkah penambahan kloroform:isoamilalkohol diulangi kembali dan tabung yang berisi sampel dicampur dengan cara dibolak-balik secara perlahan selama 5 menit sebelum disentrifus sebanyak 2 kali untuk menjernihkan supernatan. Sebanyak 3.5 mL isopropanol ditambahkan ke dalam tabung yang berisi supernatan. Sampel diinkubasi
pada suhu 250C selama satu malam untuk mengendapkan DNA. Kemudian, sampel disentrifus selama 10 menit pada 5000g dengan suhu 200C. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ditambahkan 5 mL larutan pencuci ke dalam tabung yang berisi pelet. Sampel diinkubasikan selama 15 menit pada suhu ruang. Setelah 15 menit, sampel disentrifus kembali pada 2500 g selama 6 menit dengan suhu 200C dan tahapan pencucian diulangi satu kali lagi. Supernatan hasil sentrifus dan pencucian kemudian dibuang dan pelet yang dihasilkan dikeringkan pada udara terbuka sebelum ditambahkan 300 µL bufer TE. Uji Kualitatif DNA Genom Kedelai Uji kualitatif DNA dilakukan untuk mengetahui kualitas DNA genom kedelai yang telah berhasil diisolasi. Uji kualitatif DNA menggunakan elektroforesis gel agarosa 1%. Gel agarosa dibuat dengan menambahkan agarosa sebanyak 0.55 g dalam 55 mL larutan TAE 1X. Kemudian dipanaskan hingga larut dan didinginkan pada suhu kamar hingga hangat. Selanjutnya ditambahkan 5.5 µL SyBr Gold dan dituang ke dalam cetakan gel elektroforesis yang telah dipasangi sisir (cetakan sumur) hingga gel memadat. Gel yang sudah padat dipindahkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi TAE 1X. Sampel yang akan dielektroforesis dicampur dengan loading buffer dengan perbandingan 1:10 pada parafilm. Setelah tercampur maka campuran sampel diinjeksi ke dalam sumur gel agarosa. Marker yang digunakan adalah 100 bp plus DNA ladder sebanyak 6 µL. Setelah semua sampel selesai diinjeksi maka alat elektroforesis dihubungkan pada power supply yang dialiri tegangan listrik 100 volt selama 30 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan bantuan lampu UV dalam trasnsilluminator. Uji Kuantitatif DNA Genom Kedelai Uji kuantitatif dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific, USA. Blanko yang digunakan adalah larutan TE. Sebelum digunakan lubang optik dibersihkan terlebih dahulu. Larutan TE dimasukkan ke dalam lubang optik sebanyak 2 µL. Nanodrop thermoscientific ditutup kemudian dipilih menu measure blank pada komputer. Kemudian, lubang optik dibersihkan kembali dan sampel DNA sebanyak 2 µL dimasukkan ke dalam lubang optik. Setelah itu, hasil pengukuran akan muncul dalam konsentrasi ng/µL dan kemurnian DNA dapat dilihat
8
langsung dalam A280 dan A260. Uji kuantitas DNA dilakukan untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA dengan perbandingan A260/280 yang baik sekitar 1.8 hingga 2.0. Fragmentasi DNA (Invitrogen 2004) Fragmentasi DNA dilakukan dengan menggunakan metode nebulisasi DNA. Sebanyak 700 µL bufer nebulisasi ditambahkan ke dalam tabung yang berisi 25 µg DNA dan dicampurkan sampai homogen. Semua campuran sampel yang telah homogen dipindahkan ke dalam tabung nebulisasi yang disimpan dalam es dan diberikan gas dengan tekanan 40 psi selama 6 menit. Kemudian, disentrifus pada 450 rpm selama 2 menit dengan suhu 250C. Sampel sebanyak 360 µL dipindahkan ke dalam tabung yang baru dan disimpan dalam es. Sebanyak 40 µL natrium asetat dan 1000 µL etanol absolut ditambahkan ke dalam setiap tabung dan dicampurkan sampai homogen sebelum diinkubasi dalam es selama 30 menit. Kemudian, sampel disentrifus pada 12000 rpm selama 10 menit dengan suhu 150C. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan 500 µL etanol 70% ditambahkan ke dalam tabung yang berisi pelet. Sampel disentrifus kembali pada 12000 rpm selama 10 menit dengan suhu 150C. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan. Resuspension Buffer ditambahkan sebanyak 50 µL dan dicampurkan sampai homogen. Sampel DNA diambil sebanyak 5 µL untuk mengetahui kualitas fragmen DNA yang dihasilkan dengan elektroforesis gel agarosa. Untuk mengetahui kuantitas DNA yang dihasilkan, sebanyak 2 µL diambil dan dianalisis dengan menggunakan nanodrop thermoscientific. Konstruksi Pustaka Genom (TruSeq DNA low throughput protocol 2010c) Preparasi Fragmen DNA cetakan. Sebanyak 1 µg DNA hasil fragmentasi DNA dilarutkan dalam 52.5 µL Resuspension Buffer. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Untuk mengetahui kuantitas fragmen DNA cetakan, sebanyak 2 µL diambil dan dianalisis dengan menggunakan nanodrop thermoscientific. Modifikasi Ujung Fragmen DNA. Modifikasi ujung fragmen DNA diawali dengan pembuatan Insert Modification Plate (IMP). Sebanyak 10 µL End repair control dan 40 µL End Repair Mix ditambahkan dalam tabung yang mengandung 50 µL fragmen DNA cetakan. Sampel dicampurkan
menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam thermal cycler selama 30 menit pada suhu 300C. Langkah selanjutnya yaitu purifikasi IMP yang diawali dengan penambahan 160 µL AMPure XP Beads ke dalam sampel. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Campuran sampel dan AMPure XP Beads diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan dalam magnetic stand pada suhu ruang selama 15 menit. Sebanyak 127.5 µL supernatan dibuang dengan hati-hati dan jangan sampai mengenai pelet yang terletak pada dinding tabung. Tahapan sebelumnya diulangi untuk menghilangkan supernatan yang masih tersisa. Untuk pencucian pelet, sebanyak 200 µL etanol 80% ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik. Selanjutnya, etanol 80% yang telah ditambahkan dibuang dan tahapan penambahan etanol 80% diulangi kembali satu kali. Pelet kemudian dikeringkan selama 15 menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari magnetic stand. Resuspension buffer sebanyak 17.5 µL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi pelet. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Selanjutnya, sampel diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan dalam magnetic stand pada suhu ruang selama 5 menit untuk memisahkan supernatan dengan pelet. Sebanyak 15 µL supernatan dipindahkan ke dalam tabung yang baru dan disimpan dalam mesin pendingin. Adenilasi Ujung 3’ DNA. A-tailing control 2.5 µL dan A-tailing mix 12.5 µL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel hasil tahapan sebelumnya. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam thermal cycler selama 30 menit pada suhu 370C. Ligasi Adapter. Ligase control 2.5 µL, DNA Ligase Mix 2.5 µL dan DNA Adapter Index 2.5 µL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel hasil adenilasi. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam thermal cycler selama 10 menit pada suhu 300C. Sebanyak 5 µL Stop Ligase Mix ditambahkan ke dalam tabung
9
yang berisi sampel. Kemudian, sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Langkah selanjutnya yaitu pemurnian sampel yang diawali dengan penambahan 160 µL AMPure XP Beads ke dalam sampel. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Campuran sampel dan AMPure XP Beads diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan dalam magnetic stand pada suhu ruang selama 2 menit. Sebanyak 127,5 µL supernatan dibuang dengan hati-hati agar tidak sampai mengenai pelet yang terletak pada dinding tabung. Tahapan sebelumnya diulangi untuk menghilangkan supernatan yang masih tersisa. Untuk pencucian pelet, sebanyak 200 µL etanol 80% ditambahkan dan campuran diinkubasi selama 30 detik. Selanjutnya, etanol 80% yang telah ditambahkan dibuang dan tahapan penambahan etanol 80% diulangi kembali satu kali. Pelet kemudian dikeringkan selama 15 menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari magnetic stand. Resuspension buffer sebanyak 22.5 µL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi pelet. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Selanjutnya, sampel diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan dalam magnetic stand pada suhu ruang selama 2 menit untuk memisahkan supernatan dengan pelet. Sebanyak 20 µL supernatan dipindahkan ke dalam tabung yang baru dan disimpan dalam mesin pendingin. Purifikasi DNA Hasil Ligasi. Purifikasi hasil ligasi terdiri dari dua tahap yaitu pemisahan ukuran fragmen DNA melalui elektroforesis dan pemisahan fragmen DNA yang telah dielektroforesis melalui proses ekstraksi gel DNA. Pemisahan ukuran fragmen DNA diawali dengan pembuatan gel agarosa 2%. Sebanyak 1.1 gram bubuk agarosa ditimbang dan ditambahkan larutan TAE 1x sebanyak 55 mL. Larutan kemudian dipanaskan dalam microwave sampai semua agarosa larut. Setelah suhu larutan hangat, kemudian tambahkan 5,5 uL pewarna SyBr Gold dan dicampurkan hingga homogen. Kemudian dituang larutan ke dalam cetakan yang telah disiapkan. Elektroforesis diawali dengan disiapkannya seperangkat bak elektroforesis, kemudian larutan TAE 1x dituangkan ke dalam bak hingga gel terendam penuh. Selanjutnya, ditempat terpisah diteteskan 1 µL
larutan loading dye pada microfilm. Sebanyak 5 µL sampel DNA dicampurkan dengan loading dye. Untuk penanda disiapkan 6 µL DNA ladder. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel yang tersedia. Sampel tersebut kemudian di elektroforesis pada kuat arus 120 volt selama 120 menit. Hasil elektroforesis dilihat di atas lampu UV transiluminator dan didokumentasikan. Ukuran fragmen DNA antara rentang 200-500 bp yang memiliki intensitas yang lebih tinggi diiris dari gel agarosa dan disimpan dalam tabung untuk digunakan pada tahapan selanjutnya. Tahapan ekstraksi gel hasil elektroforesis diawali dengan penimbangan irisan gel. Tiga volume Bufer QG ditambahkan untuk satu volume gel (100 mg = 100 µL). Tabung yang berisi campuran gel dan bufer QG diinkubasi pada suhu 50 0C atau sampai gel agarosa mencair seluruhnya. Setelah gel larut, warna campuran dicek untuk menyamakan dengan warna bufer QG yang berwarna kuning. Jika campuran berwarna jingga atau violet, sebanyak 10 µL natrium asetat 3 M, pH 5 ditambahkan ke dalam campuran sampel. Selanjutnya, isopropanol sebanyak 1 volume gel ditambahkan ke dalam sampel dan dicampurkan sampai homogen. Sampel dipindahkan dalam MinElute Spin Colomn dan disentrifus selama 1 menit pada 13000 rpm. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam MinElute Spin Colomn ditambahkan 500 µL bufer QG. Sampel kemudian disentrifus kembali selama 1 menit pada 13000 rpm. Supernatan yang dihasilkan dibuang. Untuk pencucian, sebanyak 750 µL bufer PE ditambahkan ke dalam MinElute Spin Colomn. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan MinElute Spin Colomn disentrifus kembali selama 1 menit pada 13000 rpm. Selanjutnya, MinElute Spin Colomn disimpan dalam tabung mikrosentrifus 1.5 mL. Untuk mengelusi DNA, sebanyak 25 µL bufer EB (10 mM TrisHCl, pH 8.5) ditambahkan ke dalam MinElute Spin Colomn dan disimpan dalam suhu ruang selama 1 menit. Selanjutnya, MinElute Spin Colomn disentrifus selama 1 menit pada 13000 rpm. Sebanyak 20 µL dipindahkan ke dalam tabung dan disimpan dalam mesin pendingin untuk tahapan selanjutnya. Amplifikasi fragmen DNA. Amplifikasi fragmen DNA diawali dengan penambahan 5 µL PCR Primer Cocktail dan 25 µL PCR Master Mix ke dalam tabung yang berisi sampel. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan
10
sebanyak 10 kali. Tabung kemudian disimpan dalam mesin PCR. Proses amplifikasi terdiri dari 16 siklus selama 1 jam dengan rincian reaksi predenaturasi pada suhu 98°C selama 30 detik, denaturasi pada suhu 98°C selama 10 detik, annealing pada suhu 60°C selama 30 detik, extension pada suhu 72°C selama 30 detik, dan pasca pemanjangan primer pada suhu 72°C selama 5 menit. Tahapan selanjutnya yaitu pemurnian hasil PCR yang diawali dengan penambahan 50 µL AMPure XP Beads ke dalam sampel. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Campuran sampel dan AMPure XP Beads diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan dalam magnetic stand pada suhu ruang selama 2 menit. Sebanyak 95 µL supernatan dibuang dengan hati-hati jangan sampai mengenai pelet yang terletak pada dinding tabung. Ulangi tahapan sebelumnya untuk menghilangkan supernatan yang masih tersisa. Untuk pencucian pelet, sebanyak 200 µL etanol 80% ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik. Selanjutnya, etanol 80% yang telah ditambahkan dibuang dan tahapan penambahan etanol 80% diulangi kembali satu kali. Pelet kemudian dikeringkan selama 15 menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari magnetic stand. Resuspension buffer sebanyak 32.5 µL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi pelet. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Selanjutnya, sampel diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan dalam magnetic stand pada suhu ruang selama 2 menit untuk memisahkan supernatan dengan pelet. Sebanyak 30 µL supernatan dipindahkan ke dalam tabung yang baru dan disimpan dalam mesin pendingin. Validasi pustaka genom. Validasi pustaka genom dilakukan melalui uji kualitatif dan kuantitatif untuk mengetahui ukuran dan konsentrasi dari pustaka genom sebelum disekuens menggunakan next generation sequencing HiSeq2000. Pustaka genom yang akan disekuens harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu memiliki panjang fragmen sekitar 300-500 bp dengan konsentrasi 10 nM. Uji kualitatif dilakukan dengan metode elektroforesis gel agarosa. Sampel DNA diambil sebanyak 5 µL dan dielektroforesis pada gel agarosa dengan konsentrasi 1% selama 40 menit pada kuat arus 120 volt. Untuk mengetahui kuantitas pustaka genom yang dihasilkan, sebanyak 2 µL sampel
diambil dan dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific. Klasterisasi Pustaka Genom Kedelai (cBot cluster generation protocol 2010b) Klasterisasi DNA diawali dari preparasi sampel yang terdiri dari dua tahapan, yaitu denaturasi dengan menggunakan 2 N NaOH dan pelarutan DNA dalam bufer hibridisasi. Denaturasi diawali dengan penambahan 17 µL Tris-Cl 10 mM, pH 8.5 dan 1 µL 2 N NaOH ke dalam 2 µL sampel DNA sehingga diperoleh konsentrasi DNA sebesar 1 nM. Campuran tersebut kemudian dicampurkan sampai homogen dengan menggunakan vortek. Sampel diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang untuk mendenaturasi utas ganda DNA menjadi utas tunggal. DNA yang telah didenaturasi disimpan dalam mesin pendingin sampai proses pelarutan DNA akan dilakukan. Tahapan preparasi sampel selanjutnya yaitu pelarutan DNA dalam bufer hibridisasi. Tahapan ini diawali dengan pengenceran 1 nM DNA hasil denaturasi menjadi DNA yang memiliki konsentrasi 7 pM dan 13 pM. Konsentrasi tersebut didapat dari pengenceran 7 µL sampel DNA dalam 993 µL bufer hibridisasi (7 pM) dan 13 µL sampel DNA dalam 987 µL bufer hibridisasi (13 pM). Sebanyak 120 µL control library disiapkan dalam tabung pertama dalam suatu lajur yang memiliki 8 tabung untuk digunakan sebagai kontrol dalam flow cell. Sampel DNA yang telah diencerkan sebelumnya kemudian dipindahkan dalam tabung yang lain dalam lajur tersebut. Posisi sampel dicatat dan tabung disimpan dalam mesin pendingin sampai sampel akan dimasukkan ke dalam cBot Cluster Generation. Sekuensing Pustaka Genom Kedelai (HiSeq2000 protocol 2011) Sekuensing pustaka genom menggunakan Illumina HiSeq2000 terdiri dari beberapa tahap yaitu persiapan reagen, pemilihan parameter untuk sekuensing, pemasangan flow cell, sekuensing, dan post-run sequencing (maintenance wash). Reagen yang digunakan selama sekuensing di antaranya SBS reagent (TruSeq SBS kit), multiplexing reagent dan paired end reagent. Reagen-reagen tersebut dimasukkan ke dalam rak dan disimpan dalam ruang reagen compartment yang terdapat dalam Illumina Hiseq2000. Pemilihan parameter untuk sekuensing dilakukan melalui Hiseq control software interface. Parameter yang tersedia di antaranya flow cell ID,
11
experiment, user name, flow cell type, control lane, output folder,confirm first base, keep intensity files, existing recipe, save image dan align lanes. Tahapan selanjutnya yaitu pemasangan flow cell yang telah diklasterisasi melalui cBot cluster generation pada flow cell stage. Sekuensing dilakukan selama sekitar 11 hari dengan panjang pembacaan DNA 2 x 101 siklus. Tahapan terakhir setelah proses sekuensing selesai dilakukan yaitu dengan dipindahkannya flow cell dari flow cell stage dan dilakukannya post-run sequencing yaitu maintenance wash. Tahapan maintenance wash terdiri dari pembilasan dengan menggunakan air dan NaOH.
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Isolasi DNA Genom Kedelai DNA genom ketiga genotipe kedelai diisolasi menggunakan metode Michiels et al. (2003). Metode tersebut merupakan modifikasi dari metode Doyle&Doyle (1990). Metode Michiels et al. (2003) dan Metode Doyle & Doyle (1990) pada prinsipnya menggunakan cetil trimetil amonium bromida (CTAB) yang berfungsi untuk mendegradasi senyawa-senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam tanaman. CTAB akan membentuk kompleks tak larut dengan asam nukleat sehingga dapat memisahkan kontaminan polisakarida dan polifenol dari asam nukleat. Namun, perbedaan kedua metode tersebut di antaranya terletak pada penambahan polivinil pirolidon (PVP) saat proses ekstraksi yang berfungsi sebagai antioksidan untuk mencegah terbentuknya warna coklat polifenol pada DNA. PVP pada metode Michiels et al. (2003) ditambahkan langsung ke dalam bufer ekstraksi yang telah mengandung CTAB. Hal tersebut, berbeda dengan metode isolasi Doyle&Doyle (1990) yang menambahkan PVP pada saat penggerusan sampel DNA yang akan diisolasi. Perbedaan lainnya yaitu terletak pada suhu yang digunakan saat presipitasi isopropanol selama satu malam. Metode Michiels et al. (2003) menggunakan suhu 250C saat presipitasi isopropanol sedangkan suhu yang digunakan pada metode Doyle&Doyle (1990) adalah suhu 40C. Melalui kedua modifikasi tersebut, Michiels et al. (2003) melaporkan bahwa hasil isolasi DNA genom yang diperoleh memiliki kualitas yang lebih baik dibandingkan metode Doyle&Doyle (1990).
DNA genom tiga genotipe kedelai berhasil diisolasi dengan ditandai terbentuknya pita DNA pada elektroforegram hasil isolasi DNA (Gambar 3). Elektroforegram tersebut merupakan hasil uji kualitatif terhadap DNA yang telah berhasil diisolasi. Uji kualitatif bertujuan untuk mengetahui kualitas dan kemurnian DNA hasil isolasi. Uji kualitatif dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1%. Elektroforegram hasil isolasi DNA genom total dari tiga genotipe kedelai menunjukkan hasil yang baik, terlihat dari intensitas pita DNA yang tampak jelas (Gambar 3). Hasil elektroforesis juga menunjukkan bahwa ketiga pita DNA yang dihasilkan merupakan DNA genom. Hal tersebut terlihat dari ukuran pita DNA yang cukup besar (lebih dari 1200 bp) dan posisi pita DNA yang dekat dengan sumur gel. Brown (2007) menyatakan bahwa elektroforesis gel akan memisahkan molekul DNA sesuai dengan ukurannya dan semakin besar molekul DNA maka pita DNA yang dihasilkan akan semakin dekat dengan sumur gel. Selain diuji secara kualitatif, DNA hasil isolasi juga diuji secara kuantitatif. Uji kuantitatif bertujuan untuk mengetahui konsentrasi DNA dan tingkat kemurnian DNA dari kontaminan polisakarida dan protein. Uji kuantitatif dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific pada panjang gelombang 230, 260 dan 280 nm. Panjang gelombang 230 nm merupakan serapan maksimum untuk polisakarida. Sedangkan, panjang gelombang 260 nm merupakan serapan maksimum untuk asam nukleat dan panjang gelombang 280 nm
1200 bp
a Gambar 3
b
c
d
Elektroforegram DNA genom total kedelai. DNA marker (a), Tambora (b), B3293 (c), dan Grobogan (d).
12
merupakan serapan maksimum untuk protein. Kemurnian DNA ditentukan melalui perbandingan nilai absorbansi 260 nm dengan 280 nm dan perbandingan nilai absorbansi 260 nm dengan 230 nm. Rasio A260/A280 menunjukkan kemurnian terhadap protein dan rasio A260/A230 menunjukan kemurnian terhadap polisakarida. Hasil uji kuantitatif menunjukkan bahwa DNA genom total kedelai yang dihasilkan memiliki konsentrasi pada kisaran 902.4 – 1485.7 ng/µL dengan rasio A260/A280 dan A260/A230 berkisar 2.03 – 2.06 dan 1.90 - 2.03 (Tabel 1). Hasil tersebut menunjukkan bahwa DNA genom total yang diisolasi memiliki tingkat kemurnian yang baik. Walker & Wilson (2000) menyatakan bahwa nilai kemurnian yang lebih dari 2.0 menunjukan bahwa sampel mengandung kontaminasi RNA. Sedangkan, nilai kemurnian yang kurang dari 1.8 menunjukkan bahwa sampel mengandung kontaminasi protein dan polisakarida (Yuwono 2005). Berdasarkan uji kuantitatif dan kualitatif, DNA genom kedelai yang berhasil diisolasi telah memenuhi persyaratan untuk digunakan sebagai bahan konstruksi pustaka genom. Michiels et al. (2003) menyatakan bahwa DNA genom yang dibutuhkan untuk konstruksi pustaka genom harus memiliki kualitas dan kuantitas yang baik. DNA genom yang digunakan harus utuh, sedikit mengandung fragmen DNA yang berukuran kecil serta memiliki konsentrasi yang tinggi. Tabel 1 Kuantitas dan kemurnian DNA genom total kedelai Sampel
A260
[DNA] ng/µL
A260/ A280
A260/ A230
Tambora
18.05
902.40
2.05
1.93
B3293
29.71
1485.70
2.06
2.09
Grobogan
28.03
1401.50
2.03
1.90
Hasil Fragmentasi DNA Genom Kedelai Tahapan yang harus dilakukan sebelum konstruksi pustaka genom adalah fragmentasi DNA genom. Pada tahapan ini, DNA genom tiga genotipe kedelai yang telah diisolasi pada tahapan sebelumnya difragmentasi menjadi fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil ukurannya. Fragmen DNA yang dibutuhkan untuk konstruksi pustaka genom yaitu berukuran kurang dari 800 bp. Ukuran tersebut dipilih untuk memudahkan dalam mendapatkan ukuran pustaka genom yang optimum untuk sekuensing genom total menggunakan Next Generation Sequencing HiSeq2000.
Metode fragmentasi DNA yang digunakan pada penelitian ini adalah metode fragmentasi secara fisik dengan cara nebulisasi. Pemilihan metode ini karena nebulisasi merupakan metode yang efektif untuk fragmentasi DNA genom. Surzcky (1990) menyatakan bahwa fragmentasi DNA dengan cara nebulisasi menghasilkan fragmen DNA yang lebih acak dengan ukuran yang lebih seragam sehingga cocok digunakan sebagai cetakan dalam pembuatan pustaka genom. Di samping itu, metode nebulisasi merupakan metode yang mudah dalam pengontrolan ukuran fragmen DNA yang diinginkan dan membutuhkan waktu yang lebih singkat jika dibandingkan dengan metode fragmentasi yang lain. Prinsip fragmentasi DNA dengan cara nebulisasi yaitu melalui pemutusan ikatan fosfodiester pada DNA. Hal tersebut terjadi karena pengaruh tekanan gas yang diberikan selama proses nebulisasi berlangsung. Tekanan gas yang ditambahkan ke dalam tabung nebulisasi menyebabkan larutan DNA masuk ke dalam saluran yang disebut sebagai saluran atomizer (Lampiran 5). Larutan DNA kemudian terpompa ke bagian atas saluran atomizer dengan pola aliran laminar dan keluar dengan melewati sejenis kerucut penghambat yang dapat mengakibatkan perubahan aliran larutan DNA. Perubahan aliran tersebut berdampak pada kecepatan aliran yang semakin cepat dan menghasilkan tegangan pada struktur DNA pada saat larutan DNA akan keluar dari saluran atomizer. Ketika tegangan pada DNA mencapai maksimal maka ikatan fosfodiester akan terputus dan menghasilkan fragmen-fragmen dengan ukuran yang lebih kecil (Sambrook & Russell 2001, Surzycki 2003, Illumina 2010c) DNA yang akan dinebulisasi dilarutkan terlebih dahulu ke dalam bufer nebulisasi. Bufer nebulisasi mengandung gliserol dan bufer TE. Bufer TE mengandung Tris-HCl dan EDTA yang berfungsi untuk menjaga kestabilan pH optimum pada larutan DNA dan berperan sebagai pengkelat ion magnesium untuk mencegah denaturasi (Horison et al. 2003, Barnum 2005). Gliserol dalam bufer tersebut berfungsi untuk meningkatkan viskositas larutan DNA yang akan dinebulisasi. Viskositas merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi ukuran fragmen DNA yang dihasilkan selama proses nebulisasi (Sambrook&Russell 2001). Selain dipengaruhi oleh viskositas, ukuran fragmen DNA juga dipengaruhi oleh besarnya tekanan yang diberikan selama proses nebulisasi.
13
Surzcky (2000) menyatakan bahwa semakin besar tekanan gas maka ukuran fragmen DNA yang dihasilkan selama proses nebulisasi akan semakin kecil. Fragmentasi DNA yang telah dilakukan menunjukkan bahwa DNA genom tiga genotipe kedelai berhasil difragmentasi menjadi fragmen DNA yang lebih kecil ukurannya. Hasil tersebut diketahui melalui uji kualitatif terhadap fragmen DNA yang dihasilkan. Sebelum uji kualitatif dilakukan, DNA genom ketiga genotipe kedelai yang telah difragmentasi dimurnikan terlebih dahulu untuk menghilangkan gliserol yang masih menempel pada fragmen DNA. Hasil uji kualitatif menunjukkan visualiasi DNA genom yang terlihat smear dengan ukuran fragmen DNA yang dihasilkan antara 100 800 bp (Gambar 4). Berdasarkan hasil tersebut, ukuran fragmen DNA yang dihasilkan telah sesuai dengan fragmen DNA yang dibutuhkan dalam konstruksi pustaka genom. Uji kuantitatif juga dilakukan pada DNA genom yang telah berhasil difragmentasi. Hal tersebut dilakukan untuk mengetahui konsentrasi dan tingkat kemurnian fragmen DNA ketiga genotipe kedelai. Uji kuantitatif yang dilakukan setelah fragmentasi DNA sama seperti uji kuantitatif pada tahap isolasi DNA genom yaitu dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific. Hasil uji kuantitatif menunjukkan bahwa DNA genom hasil fragmentasi memiliki rasio A260/A280 berkisar 2.07 – 2.09 (Tabel 2). Hasil tersebut menunjukkan bahwa DNA genom hasil fragmentasi memiliki tingkat kemurnian yang baik karena rasio A260/A280 yang dimiliki masih termasuk ke dalam kisaran 1.8 – 2.0 (Walker & Wilson 2000).
800 bp
100 bp
a
b
c
d
Gambar 4 Elektroforegram DNA genom kedelai hasil fragmentasi. DNA marker (a), Tambora (b), B3293 (c), dan Grobogan (d).
Tabel 2 Kuantitas dan kemurnian DNA genom kedelai hasil fragmentasi Sampel
A260
[DNA] ng/µL
A260/ A280
A260/ A230
Tambora
3.34
166.90
2.09
2.17
B3293
3.67
183.70
2.07
2.21
Grobogan
3.46
173.70
2.09
2.12
Hasil Konstruksi Pustaka Genom Kedelai Fragmen DNA genom ketiga genotipe kedelai telah berhasil dikonstruksi menjadi pustaka genom dengan ukuran 400 bp. Pustaka genom tersebut akan digunakan untuk sekuensing genom total dengan menggunakan Next Generation Sequencing (NGS) HiSeq2000. Pustaka genom diperoleh melalui beberapa tahapan konstruksi pustaka genom yaitu preparasi fragmen DNA cetakan, modifikasi ujung fragmen DNA, adenilasi ujung 3’OH, ligasi adapter, purifikasi DNA hasil ligasi dan amplifikasi fragmen DNA. Prinsip konstruksi pustaka genom untuk sekuensing genom total menggunakan NGS Illumina HiSeq2000 adalah menempelkan adapter pada kedua ujung fragmen DNA. Adapter tersebut berfungsi sebagai tempat penempelan primer pada tahap amplifikasi pustaka genom dengan menggunakan PCR (Polymerase Chain Reaction). Pada tahap klasterisasi pustaka genom, adapter juga berfungsi membantu pustaka genom untuk berikatan dengan oligonukleotida pada flow cell (Mardis 2008, Metzker 2011). Keberhasilan konstruksi pustaka genom dipengaruhi oleh ketepatan dalam penggunaan mikropipet dalam pencampuran fragmen DNA dengan pereaksi-pereaksi yang digunakan dalam setiap tahapannya. Selain itu, faktor yang mempengaruhi keberhasilan konstruksi pustaka genom adalah kualitas DNA yang digunakan sebagai bahan DNA cetakan dan keefektifan pemisahan fragmen DNA dengan pereaksi pada tahap purifikasi. Fragmen DNA Cetakan untuk Konstruksi Pustaka genom Preparasi fragmen DNA cetakan merupakan tahap awal dalam konstruksi pustaka genom. Tahapan ini bertujuan untuk mempersiapkan fragmen DNA yang akan menjadi cetakan dalam konstruksi pustaka genom. Hasil preparasi fragmen DNA cetakan memiliki konsentrasi pada kisaran 16.90 19.40 ng/µL dengan rasio A260/A280 dan A260/A230 berkisar antara 1.93 – 2.51 dan 2.16 – 2.56 (Tabel 3). Berdasarkan nilai rasio
14
yang diperoleh dapat diketahui bahwa fragmen DNA tersebut mengandung kontaminan RNA tetapi tidak mengandung kontaminan protein maupun polisakarida. Hasil tersebut tidak akan mempengaruhi tahapan preparasi konstruksi pustaka genom selanjutnya karena selama rasio A260/A280 dan A260/A230 lebih besar dari 1.8 atau terbebas dari kontaminan protein dan polisakarida maka kerja enzim selama proses preparasi tidak akan terganggu (Michiels et al. 2003). Tabel 3 Kuantitas dan kemurnian fragmen DNA cetakan untuk preparasi konstruksi pustaka genom setelah dilarutkan dalam resuspension buffer Sampel Tambora (1) Tambora (2) B3293 (1) B3293 (2) Grobogan (1) Grobogan (2)
A260
[DNA] ng/µL
A260/ A280
A260/ A230
0.36
18.30
2.35
2.56
0.33
16.90
2.27
2.51
0.38
19.40
2.18
2.22
0.38
19.10
2.13
2.16
0.38
19.10
1.93
2.21
0.34
17.10
2.51
2.97
Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Setelah preparasi fragmen DNA cetakan, tahap selanjutnya dalam konstruksi pustaka genom yaitu modifikasi ujung fragmen DNA atau end repair. Tujuan tahapan ini adalah mengubah ujung lengket pada fragmen DNA menjadi ujung tumpul (Illumina 2010a). Proses modifikasi fragmen DNA cetakan dibantu dengan menggunakan end repair mix. End repair mix mengandung enzim eksonuklease dan enzim polimerase. Kedua enzim tersebut memiliki aktivitas yang berbeda tergantung pada letak dari ujung lengket dari fragmen DNA. Jika ujung lengket terletak pada ujung 3’OH dari fragmen DNA maka aktivitas enzim eksonulease akan bekerja dengan cara memotong ujung lengket tersebut. Namun, jika ujung lengket terletak pada ujung 5’P dari fragmen DNA maka aktivitas enzim polimerase akan bekerja dengan cara membentuk utas DNA baru yang bersifat komplemen dengan utas DNA pada ujung lengket (Illumina 2010a). Sebelum ke tahapan preparasi konstruksi pustaka genom selanjutnya, fragmen DNA yang telah mengalami modifikasi dipurifikasi
terlebih dahulu. Purifikasi dilakukan dengan menggunakan AMPure XP beads. Selain digunakan untuk purifikasi setelah tahapan modifikasi ujung fragmen DNA, AMPure XP beads juga digunakan untuk purifikasi pada dua tahapan preparasi konstruksi pustaka genom lainnya yaitu purifikasi setelah tahapan ligasi adapter dan amplifikasi untuk fragmen DNA. AMPure XP beads dipilih untuk purifikasi fragmen DNA selama preparasi konstruksi pustaka genom karena AMPure XP beads efektif dalam mengikat DNA dan menghilangkan kelebihan pereaksi-pereaksi yang digunakan selama preparasi konstruksi pustaka genom. Di samping itu, purifikasi dengan menggunakan AMPure XP beads juga membutuhkan waktu yang relatif singkat jika dibandingkan dengan metode purifikasi yang lain seperti QIAquick, QuickStep, maupun ExoSAP-IT (Agencourt Bioscience Corp 2009). Purifikasi dengan AMPure XP beads memanfaatkan manik-manik paramagnetik yang akan mengikat fragmen DNA hasil preparasi pustaka genom dan memisahkannya dari kelebihan pereaksi-pereaksi yang digunakan. Dengan bantuan medan magnet, fragmen DNA yang telah berikatan dengan manik-manik paramagenetik akan menempel pada dinding tabung saat inkubasi dan memisahkannya dari pereaksi yang masih terlarut. Selama proses purifikasi, inkubasi dilakukan untuk mengoptimalkan penempelan fragmen DNA pada dinding tabung dengan ditandai semakin jernihnya larutan campuran fragmen DNA. Di samping itu, inkubasi juga bertujuan untuk memisahkan fragmen DNA dari manik-manik paramagnetik pada tahap akhir purifikasi. Pelarut yang digunakan pada purifikasi dengan menggunakan AMPure XP beads yaitu etanol 70% dan resuspension buffer. Etanol 70% digunakan untuk menghilangkan pereaksi-pereaksi yang masih tersisa setelah tahap inkubasi. Sedangkan, untuk melarutkan fragmen-fragmen DNA yang masih menempel pada dinding tabung digunakan resuspension buffer (Agencourt Bioscience Corp 2009). Hasil modifikasi ujung fragmen DNA yang telah dipurifikasi dilakukan uji kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific. Hal tersebut dilakukan untuk mengetahui konsentrasi dan rasio A260/A280. Konsentrasi DNA setelah tahapan modifikasi ujung fragmen DNA memiliki kisaran antara 39.9054.90 ng/µL (Tabel 4). Jika dibandingkan dengan konsentrasi DNA cetakan (Tabel 3),
15
konsentrasi DNA hasil modifikasi ujung fragmen DNA memiliki nilai yang lebih tinggi. Peningkatan nilai konsentrasi tersebut menandakan proses modifikasi ujung fragmen DNA telah berhasil dilakukan. Tabel 4 Kuantitas dan kemurnian fragmen DNA setelah tahapan modifikasi ujung fragmen DNA pada preparasi konstruksi pustaka genom kedelai Sampel Tambora (1) Tambora (2) B3293 (1) B3293 (2) Grobogan (1) Grobogan (2)
A260
[DNA] ng/µL
A260/ A280
A260/ A230
0.91
45.70
2.28
2.34
1.09
54.90
2.24
2.16
1.09
54.40
2.37
2.45
0.99
49.90
2.37
2.45
0.79
39.90
2.33
2.37
0.83
41.70
2.31
2.63
Fragmen DNA Hasil Adenilasi Ujung 3’OH dan Ligasi Adapter Tahap selanjutnya setelah modifikasi ujung fragmen DNA yaitu adenilasi ujung 3’OH dan tahapan ligasi adapter. Pemurnian dengan AMPure XP beads dan uji kuantitatif juga dilakukan setelah kedua tahapan ini. Pada tahap adenilasi ujung 3’OH dan ligasi adapter, kedua ujung 3’OH pada fragmen DNA berikatan dengan basa tunggal adenin. Tujuannya yaitu untuk mencegah ligasi antar fragmen DNA dan mempersiapkan fragmen DNA sebelum dilakukan ligasi adapter. Basa tunggal timin pada ujung adapter akan berikatan dengan basa adenin pada ujung fragmen DNA. Ligasi adapter pada preparasi konstruksi pustaka genom bertujuan untuk membantu pengikatan pustaka genom pada flow cell saat tahapan klasterisasi pustaka genom (Illumina 2010b). Konsentrasi DNA setelah tahapan ini memiliki kisaran antara 20.60 - 24.70 ng/µL (Tabel 5). Pada tahapan ini, kedua
fragmen DNA dari masing-masing genotipe digabungkan menjadi satu yang bertujuan untuk menaikkan konsentrasi DNA. Fragmen DNA Hasil Purifikasi DNA Setelah Tahap Ligasi Adapter Preparasi konstruksi pustaka genom dilanjutkan dengan purifikasi DNA hasil ligasi. Tahapan ini bertujuan untuk memilih ukuran fragmen DNA yang akan digunakan pada saat klasterisasi pustaka genom. Ukuran fragmen DNA tersebut didapatkan melalui dua tahap yaitu elektroforesis gel agarosa 2% dan ekstraksi gel. Ukuran fragmen DNA yang dipilih pada penelitian ini yaitu ukuran fragmen 400 bp (Gambar 5). Pemilihan ukuran tersebut dilakukan karena ukuran fragmen DNA 400 bp seperti yang ditunjukkan pada gambar 5 memiliki intensitas DNA yang lebih tinggi dibandingkan dengan intensitas pada ukuran fragmen DNA yang lain. Intensitas fragmen DNA yang tinggi pada hasil elektroforesis menunjukkan bahwa jumlah DNA yang terkandung dalam gel pada ukuran fragmen tersebut cukup banyak. Di samping itu, ukuran fragmen DNA 400 bp dipilih karena ukuran tersebut masih berada pada rentang ukuran fragmen DNA yang memenuhi persyaratan untuk klasterisasi pustaka genom. Illumina (2010a) menyatakan bahwa ukuran fragmen DNA yang memenuhi persyaratan untuk klasterisasi pustaka genom yaitu ukuran fragmen DNA 200-500 bp. Gel yang telah dipotong pada ukuran 400 bp diekstraksi dengan menggunakan metode MinElute Gel Extraction Kit. Selama proses ekstraksi gel ditambahkan beberapa pelarut
400 bp Area pemotongan fragmen DNA hasil ligasi
Tabel 5 Kuantitas dan kemurnian DNA cetakan setelah tahapan ligasi adapter Sampel
A260
[DNA] ng/µL
A260/280
A260/230
Tambora
0.42
21.00
2.75
1.47
B3293
0.49
24.70
2.79
1.41
Grobogan
0.41
20.60
3.19
1.38
a
b
c
d
Gambar 5 Elektroforegram tahapan purifikasi DNA hasil ligasi. DNA marker (a), tambora (b), B3293 (c), dan grobogan (d).
16
dengan fungsi yang berbeda-beda di antaranya bufer QG, isopropanol, bufer PE dan elution buffer (bufer EB). Bufer QG ditambahkan untuk melarutkan gel yang mengandung DNA. Sebelum disentrifugasi, Isopropanol ditambahkan untuk memekatkan DNA dan membantu mengendapkan DNA pada membran silika yang terdapat pada MinElute Spin Column. Bufer PE yang mengandung etanol juga ditambahkan pada saat proses ekstraksi. Hal tersebut bertujuan untuk menghilangkan kontaminan-kontaminan yang masih menempel pada DNA. Pelarut terakhir yang digunakan dalam proses ekstraksi gel yaitu bufer EB yang berfungsi untuk melarutkan DNA yang mengendap pada membran silika. DNA hasil ekstraksi gel diuji secara kuantitatif untuk mengetahui konsentrasi dan rasio A260/A280. Konsentrasi DNA hasil ekstraksi gel (Tabel 6) memiliki nilai yang lebih rendah dibandingkan dengan konsentrasi DNA pada tahapan sebelumnya (Tabel 5). Hal tersebut terjadi karena ekstraksi gel yang dilakukan bersifat parsial pada ukuran fragmen DNA tertentu. Rendahnya konsentrasi setelah ekstraksi gel juga dapat disebabkan karena terjadi kehilangan DNA akibat tidak menempel pada membran silika. Tabel 6 Kuantitas dan kemurnian DNA hasil ekstraksi gel Sampel
A260
[DNA] ng/µL
Tambora
0.21
10.80
A260/ A280 2.16
A260/ A230 0.03
B3293
0.12
6.30
2.51
0.02
Grobogan
0.31
15.70
1.94
0.03
Hasil Amplifikasi dan Validasi Pustaka Genom Kedelai Amplifikasi fragmen DNA merupakan tahap terakhir dalam preparasi konstruksi pustaka genom. Tahap ini menggunakan prinsip PCR (Polymerase Chain Reaction) yang bertujuan untuk memperbanyak fragmen DNA yang telah berikatan dengan adapter pada kedua ujungnya. Adapter pada tahap ini berfungsi sebagai tempat penempelan primer. Sama seperti tahap modifikasi ujung fragmen DNA dan ligasi adapter, fragmen DNA yang telah diamplifikasi juga dimurnikan dengan menggunakan AMPure XP beads. Setelah tahapan ini maka fragmen DNA tersebut telah berhasil dikonstruksi menjadi pustaka genom dan siap untuk disekuens menggunakan NGS HiSeq 2000. Namun,
sebelum pustaka genom tersebut disekuens harus dilakukan validasi pustaka genom terlebih dahulu untuk memastikan bahwa pustaka genom yang telah berhasil dikonstruksi memenuhi persyaratan untuk sekuensing. Validasi pustaka genom dilakukan melalui uji kualitatif dan kuantitatif untuk mengetahui ukuran dan konsentrasi dari pustaka genom yang telah dikonstruksi. Uji kualitatif dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1%. Elektroforegram hasil elektroforesis menunjukkan bahwa pustaka genom dari tiga genotipe kedelai telah berhasil dikonstruksi yang ditandai dengan munculnya pita DNA pada ukuran 400 bp (Gambar 6). Hasil tersebut sesuai dengan ukuran fragmen DNA yang dipilih pada saat tahap purifikasi fragmen DNA hasil ligasi saat preparasi konstruksi pustaka genom. Ukuran pustaka genom yang berhasil dikonstruksi juga telah memenuhi persyaratan untuk sekuensing menggunakan NGS HiSeq2000. Illumina (2010a) menyatakan bahwa pustaka genom yang akan disekuens harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu memiliki panjang fragmen sekitar 300-500 bp dengan konsentrasi minimal 2 ng/µL. Uji kuantitatif dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific. Hasil uji menunjukkan bahwa pustaka genom yang telah dikonstruksi memenuhi persyaratan untuk sekuensing dengan menggunakan NGS HiSeq 2000 karena memiliki konsentrasi lebih dari 2 ng/µL (Tabel 7).
400 bp
a
b
c
d
Gambar 6 Elektroforegram pustaka genom tiga genotipe kedelai. DNA marker (a), tambora (b), B3293 (c), dan grobogan (d).
17
Tabel 7 Kuantitas dan rasio kemurnian pustaka genom kedelai Sampel
A260
[DNA] ng/µL
A260/280
A260/230
Tambora
0.46 1.28 0.42
23.20 64.50 21.20
1.92 1.99 1.84
2.12 2.37 1.80
B3293 Grobogan
Analisis Kualitas Pustaka Genom Kedelai Hasil Sekuensing Genom Total Pustaka genom kedelai yang telah berhasil dikonstruksi dan divalidasi dapat digunakan untuk sekuensing genom total menggunakan NGS HiSeq2000. Namun sebelum disekuens, pustaka genom tersebut mengalami klasterisasi terlebih dahulu yang bertujuan untuk menghasilkan klaster atau kelompok salinan dari pustaka genom yang akan disekuen (Mardis 2008). Setelah diklasterisasi, klaster pustaka genom tersebut dimasukkan ke dalam NGS HiSeq2000 untuk disekuensing. Tahapan sekuensing selain bertujuan untuk mengurutkan basa penyusun genom kedelai yang berukuran 1,1 x 109 bp (1,1 Gbp) juga dapat digunakan untuk menganalisis kualitas dari pustaka genom yang telah dikonstruksi dan diklasterisasi sebelumnya. Proses analisis ini dilakukan dengan melihat hasil pencitraan terhadap klaster pustaka genom saat proses sekuensing berlangsung (Illumina 2011). Jumlah Basa dan Kualitas Klaster Pustaka Genom Secara Umum Jumlah basa hasil sekuensing secara total diperoleh sebanyak 50.1 x 109 bp atau 50.1 Gbp (Tabel 8). Hasil tersebut memiliki kesamaan dengan jumlah basa yang diprediksi akan diperoleh selama proses sekuensing berlangsung (projected yield total). Nilai projected yield total tergantung pada tipe pembacaan basa yang dipilih selama proses sekuensing. NGS HiSeq 2000 memiliki empat tipe pembacaan yaitu single read, paired end, multiplexed single read dan multiplexed paired end. Tipe pembacaan sekuensing yang dilakukan pada penelitian ini adalah single read dengan jumlah siklus sebanyak 106
siklus. Pembacaan basa melalui tipe tersebut dilakukan sebanyak satu kali untuk satu utas DNA (Illumina 2010a). Yield perfect yang diperoleh selama proses sekuensing yaitu sebesar 6.3 Gbp (Tabel 8). Nilai yang diperoleh tersebut merupakan nilai yield pada lajur kontrol (lajur PhiX) sehingga nilainya hanya seperdelapan dari nilai yield total. Nilai yield perfect menunjukkan jumlah basa yang secara akurat melewati passing filter. Passing filter adalah sejenis algoritma yang dipakai oleh komputer untuk menentukan keakuratan pembacaan basa saat sekuensing. Passing filter yang digunakan berdasarkan data sekuen PhiX yang berperan sebagai kontrol pada tahapan sekuensing menggunakan NGS HiSeq 2000. PhiX merupakan sejenis virus yang termasuk ke dalam Group II (ssDNA), Famili Microviridae, Genus Microvirus, dan spesies Fage PhiX174 (Sanger et al. 1977). DNA genom PhiX pertama kali disekuens pada tahun 1977 oleh Frederick Sanger. Saat ini, genom PhiX digunakan sebagai kontrol untuk mengetahui keefektifan dalam proses sekuensing. Penggunaan genom PhiX sebagai kontrol dalam proses sekuensing memiliki beberapa keunggulan, di antaranya mempunyai ukuran genom yang kecil, mengandung komposisi basa penyusun genom yang beragam (45% GC dan 55 %AT), dan memiliki urutan genom yang telah diketahui secara lengkap (Kircher et al. 2011, Illumina 2012). Tingkat kesalahan selama proses sekuensing dapat dilihat dari nilai yield <= 3 errors, %Perfect, dan %<=3 errors (Tabel 8). Yield <= 3 errors menunjukkan jumlah basa pada lajur kontrol yang memiliki tingkat kesalahan dibawah 3 basa. Nilai yield <= 3 errors dan yield perfect yang dihasilkan juga dapat menunjukkan bahwa jumlah basa pada lajur kontrol memiliki tingkat kesalahan antara 1-3 basa yaitu sebesar 2.8 Gbp. Nilai %perfect yang dihasilkan selama proses sekuensing menunjukkan persentase tingkat kesamaan antara basa yang dihasilkan dengan sekuen PhiX dalam 99 siklus. Nilai %<= 3 errors menunjukkan persentase jumlah basa yang memiliki tingkat kesalahan kurang dari 3 basa.
Tabel 8 Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom hasil sekuensing secara umum Yield Total (Gbp) 50.1
Projected Total Yield (Gbp) 50.1
Yield Perfect (Gbp)
Yield <=3 errors (Gbp)
% Perfect [Num cycles]
% <=3 errors [Num cycles]
6.3
9.1
65.6 [99]
94.6 [99]
18
Densitas dan Kualitas Pustaka Genom pada Setiap Lajur dalam Flow Cell Pustaka genom yang telah dikonstruksi dialirkan dalam setiap lajur pada flow cell untuk mendapatkan klaster pustaka genom. Klaster pustaka genom tersebut dalam proses sekuensing dihitung densitas (kerapatan klaster) dan kualitasnya. Hasil sekuensing menunjukkan bahwa densitas klaster pustaka genom yang dihasilkan berkisar antara 199 – 447 K/mm2 (Tabel 9 dan lampiran 8). Dari keenam lajur flow cell yang digunakan hanya ada dua lajur flow cell yang termasuk kategori ideal yaitu lajur B3293 7 pM dan B3293 13 pM. Densitas klaster pustaka genom termasuk kategori ideal jika klaster pustaka genom memiliki densitas berkisar 400-600 K/mm2 (Illumina 2009). Densitas klaster pustaka genom yang rendah dapat disebabkan karena konsentrasi pustaka genom yang digunakan dalam proses klasterisasi lebih rendah dari konsentrasi yang seharusnya (7 pM atau 13 pM). Hal tersebut dapat terjadi karena kesalahan dalam pengukuran konsentrasi pustaka genom sebelum klasterisasi (Quail et al. 2008). Selain densitasnya, klaster pustaka genom juga dihitung persentase klaster yang melewati passing filter. Persentase klaster PF yang dihasilkan selama proses sekuensing memiliki nilai lebih dari 93 % (Tabel 9). Hasil tersebut menunjukkan bahwa nilai persen klaster PF termasuk ke dalam kategori ideal. Illumina (2009) menyatakan bahwa nilai persen klaster PF yang ideal memiliki nilai lebih dari 70%. Rendahnya nilai persen klaster PF dapat disebabkan oleh beberapa hal di antaranya densitas klaster yang terlalu tinggi (lebih dari 600 K/mm2), ukuran pustaka genom yang terlalu panjang, dan tingginya persen dephasing (phasing dan prephasing) selama proses sekuensing. Nilai persen phasing dan prephasing merupakan salah satu indikator kualitas
selama proses sekuensing. Nilai persen phasing dan prephasing yang dihasilkan selama proses sekuensing berkisar antara 0.274 - 0.291% untuk phasing dan 0.380 0.429% untuk prephasing. Illumina (2009) menyatakan bahwa kualitas pustaka genom yang baik memiliki nilai phasing kurang dari 0.4% dan nilai prephasing kurang dari 0.5%. Hasil tersebut menunjukkan bahwa pustaka genom yang telah dikonstruksi dan diklasterisasi memiliki kualitas yang baik. Phasing dan prephasing menggambarkan hilangnya sinkronisasi dalam pembacaan basa dari urutan salinan klaster. Hal tersebut mengakibatkan dalam pembacaan basa hasil sintesis selama proses sekuensing ada yang dibaca terlalu cepat (prephasing) dan ada yang terlalu lambat (phasing) (Lampiran 6). Phasing dan prephasing dipengaruhi oleh efisiensi aliran fluida reagen sekuensing dan reaksi kimia yang terjadi selama proses sekuensing (Illumina 2009). Kircher et al. (2011) menyatakan bahwa phasing disebabkan tidak sempurnanya pemutusan ikatan kimia penanda flourescen pada proses terminasi gugus 3’OH dalam suatu klaster. Efek phasing menyebabkan pada siklus selanjutnya tidak ada penempelan basa pada klaster tersebut sehingga pendaran florescen yang terbaca bukan berasal dari siklus sintesis basa yang baru melainkan berasal dari pendaran flourescen hasil sintesis basa sebelumnya. Berbeda dengan phasing, prephasing disebabkan tidak efektifnya proses pemblokiran saat penempelan basa pada gugus 3’OH yang menyebabkan terjadi penempelan dua basa sekaligus dalam waktu yang bersamaan. Selama proses sekuensing juga dihasilkan nilai reads dan reads PF (Tabel 9). Nilai reads menunjukkan hasil pembacaan urutan basa dalam setiap klaster pustaka genom. Sedangkan, nilai reads PF menunjukkan hasil pembacaan urutan basa dalam klaster yang
Tabel 9 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing Densitas (K/mm2)
Klaster PF (%)
Phasing (%)
Prephasing (%)
Reads
Read PF
%>=30
B3293 7 pM
416
94.12
0.274
0.343
76.63
72.06
91.6
Grobogan 7 pM
242
95.58
0.282
0.384
44.61
42.64
93.1
Tambora 7 pM
199
95.49
0.291
0.429
36.68
35.02
91.9
Kontrol (PhiX)
603
91.15
0.297
0.336
111.19
101.34
84.0
B3293 13 pM
447
93.85
0.273
0.380
82.45
77.38
91.9
Grobogan 13 pM
302
94.90
0.280
0.399
55.70
52.86
92.5
Tambora 13 pM
264
94.94
0.282
0.387
48.63
46.17
92.8
Lajur
19
melewati passing filter. Jumlah keseluruhan nilai reads PF yang dihasilkan dari semua klaster pustaka genom dan kontrol PhiX merepresentasikan nilai yield total (Tabel 8). Kualitas urutan basa hasil sekuensing dapat diketahui melalui nilai Q scores. Nilai Q scores didefinisikan sebagai hubungan logaritmik antara proses base calling selama sekuensing dengan kemungkinan tingkat kesalahan yang dihasilkan dalam proses tersebut (Ewing & Green 1998). Voelkerderling et al. (2009) menyatakan bahwa base calling diartikan sebagai proses konversi data hasil pencitraan pendaran flourescen selama proses sekuensing menjadi basa-basa yang berurutan. Nilai Q scores yang dihasilkan pada penelitian ini termasuk ke dalam nilai Q scores 30 dengan nilai persentase di atas 90% di setiap lajurnya (Tabel 9). Nilai Q score 30 berarti bahwa dari 1000 basa yang dibaca hanya ada satu basa yang salah pembacaan (Ewing & Green 1998, Voelkerderling et al. 2009). Secara keseluruhan, nilai Q scores 30 yang dihasilkan selama proses sekuensing yaitu 88.6% dengan jumlah basa sebanyak 47.6 Gbp atau 47.6 x 109 bp (Gambar 7). Tingkat Kesalahan (error rate), Nilai Penyejajaran (aligned) dan Intensitas Basa Hasil Sekuensing Selama proses sekuensing, sekuen yang dihasilkan di lajur kontrol (PhiX) dibandingkan dengan sekuen PhiX yang telah tersedia di database. Hal tersebut bertujuan untuk mengetahui tingkat kesamaan antara sekuen yang dihasilkan pada lajur kontrol dengan sekuen PhiX pada database. Nilai penyejajaran (aligned) yang diperoleh selama proses sekuensing yaitu sebesar 95.3% (Tabel 10). Tingkat kesalahan selama proses
sekuensing juga dapat diketahui dari nilai %error rate. Nilai %error rate menunjukkan persentase perbandingan kesalahan pembacaan basa antara pustaka genom dengan kontrol yang dibaca pada beberapa sikus sekuensing yaitu pada siklus 35, 75 dan 100. Secara keseluruhan, nilai error rate yang dihasilkan selama proses sekuensing pada penelitian ini yaitu sebesar 0.97 % (Tabel 10). Hasil tersebut menunjukkan bahwa sekuensing yang telah dilakukan berlangsung dengan baik dengan tingkat kesalahan yang kecil. Basa adenin, timin, guanin dan sitosin yang dihasilkan selama proses sekuensing dihitung intensitas setiap siklusnya. Intensitas keempat basa tersebut dideteksi melalui hasil pendaran flourescen yang dihasilkan dari sintesis basa selama proses sekuensing. Intensitas basa yang dihasilkan setiap lajur flow cell pada siklus pertama memiliki nilai lebih dari 3000 (Tabel 10). Intensitas basa kemudian dihitung kembali pada siklus ke 20 dan menghasilkan persen intensitas sekitar 80% dari intensitas basa pada siklus pertama. Intensitas basa adenin pada siklus pertama dalam setiap lajur flow cell terlihat pada lampiran 7 dengan warna biru menunjukkan intensitas basa paling rendah dan warna jingga menunjukkan intensitas basa paling tinggi. Secara keseluruhan, intensitas keempat basa setiap siklus dapat dilihat pada gambar 8. Keempat basa yang dihasilkan memiliki intensitas lebih dari 1000 kecuali intensitas beberapa basa setelah siklus 100. Hal tersebut terjadi karena kemungkinan pendaran flourescen yang dideteksi setelah siklus 100 berasal label adapter yang menempel pada flow cell. Kircher et al. (2011) menjelaskan bahwa rendahnya intensitas dapat disebabkan oleh beberapa hal, di antaranya rendahnya
Gambar 7 Histogram jumlah klaster berdasarkan kualitas sekuen yang dihasilkan
20
klaster pustaka genom yang dihasilkan selama proses bridge amplification, ukuran pustaka genom yang terlalu panjang, penempelan primer yang tidak efisien, aktivitas enzim polimerase yang tidak optimal dan terjadi gangguan dalam pendeteksian pendaran
flourescen. Namun, secara umum intensitas keempat basa yang dihasilkan selama proses sekuensing termasuk ke dalam kategori ideal. Illumina (2009) menyatakan bahwa nilai intensitas ideal yang dihasilkan selama proses sekuensing yaitu sebesar 1000.
Tabel 10 Tingkat kesalahan (error rate), nilai penyejajaran (aligned) dan intensitas basa hasil sekuensing
B3293 7 pM
0
Error Rate (%) 0
Grobogan 7 pM
0
0
Aligned (%)
Lane
Error Rate 35 cycle (%) 0
Error Rate 75 cycle (%) 0
Error Rate 100 cycle (%) 0
0
0
0
4669
% Intensity Cycle 20 80.2
4900
80.9
Intensity Cycle 1
Tambora 7 pM
0
0
0
0
0
4586
80.0
Kontrol (PhiX)
95.3
0.97
0.20
0.59
0
3864
80.5
B3293 13 pM
0
0
0
0
0
4557
80.1
Grobogan 13 pM
0
0
0
0
0
4673
79.7
Tambora 13 pM
0
0
0
0
0
4832
79.4
Gambar 8 Grafik intensitas basa-basa nitrogen selama proses sekuensing.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Pada penelitian ini, pustaka genom tiga genotipe kedelai (Tambora, B3293, dan Grobogan) berhasil dikonstruksi dan telah memenuhi persyaratan untuk sekuensing genom total menggunakan Next Generation Sequencing HiSeq2000. Pustaka genom yang telah berhasil dikonstruksi berukuran 400 bp dan memiliki konsentrasi 23.20 ng/µL (Tambora), 64.50 ng/µL (B3293), dan 21.20 ng/µL (Grobogan). Jumlah basa yang dihasilkan selama proses sekuensing yaitu sebanyak 50.1 Gbp atau 50.1 x 109 bp. Klaster pustaka genom dengan nilai Q scores di atas 30 yang dihasilkan sebesar 88.6%. Tingkat kesalahan pembacaan basa selama proses sekuensing sebesar 0.97%. Nilai densitas
klaster, persen klaster PF, intensitas basa, persen phasing, dan persen prephasing yang dihasilkan selama proses sekuensing menunjukkan bahwa kualitas klaster pustaka genom termasuk kategori ideal. Saran Pada penelitian selanjutnya, analisis bioinformatika perlu dilakukan untuk menyusun basa-basa hasil sekuensing pustaka genom menjadi urutan basa genom kedelai yang utuh dan runut.
DAFTAR PUSTAKA [BB Biogen] Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian. 2004.
21
Katalog Data Paspor Plasma Nutfah Tanaman Pangan. Bogor : BB-Biogen. [BPS] Badan Pusat Statistik. 2011. Luas Panen, Produktivitas, dan Produksi Kedelai. [terhubung berkala]. http//www.bps.go.id. (30 Mei 2012) [Kementan] Kementerian Pertanian. 2007. Prospek dan Arah Pengembangan Agribisnis Kedelai. Jakarta : Departemen Pertanian Republik Indonesia. Adhie MM, Krisnawati A. 2007. Biologi tanaman kedelai. Di dalam : Sumarno, Suryamto, Widjono A, Kasim H,editor. Kedelai : Teknik Produksi dan Pengembangan Tanaman Pangan. Bogor : Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Hlm 45-73. Agencourt Bioscience Corp. 2009. Agencourt® AMPure® XP. Massachussets : Beckman Coulter Company. Ansorge WJ. 2009. Next generation DNA sequencing techniques. Nat.Biotechnol 25: 195-203. Argout X, Salse J, Marc-Aury J, Guiltinan MJ, Droc G, Gouzy J, Allegre M, Chaparro C, Legavre T, Maximova SN, Abrouk M, Murat F, Fouet O, Poulain J, Ruiz M, Roguet Y, Rodier-Goud M, Neto JFB, Sabot F, Kudrna D, Ammiraju JSS, Schuster SC, Carlson JE, Sallet E, Schiex T, Dievart A, Kramer M, Gelley L, Shi Z, Berard A, Viot C, Boccara M, Risterucci AE, Guignon V, Sabau X, Axtell MJ, Ma Z, Zhang Y, Brown S, Bourge M, Golser W, Song X, Clement D, Rivallan R, Tahi M, Akaza JM, Pitollat B, Gramacho K, D’Hont A, Brunel D, Infante D, Kebe I, Costet P, Wing R, McCombie WR, Guideroni E, Quietier F, Panaud O, Wincjner P, Bocs S, Lanaud C. 2011. The genome of Theobroma cacao. Nature Genetics 4 : 101-108. Barnum S R. 2005. Biotechnology an Introduction 2nd Ed. USA: Brooks/Cole. Brenner S, Johnson M, Bridgham J, Golda G, Lloyd DH, Johnson D, Luo S, McCurdy S, Foy M, Ewan M, Roth R, George D, Eletr S, Albrecht G, Vermaas E, Williams SR, Moon K, Burcham T, Pallas M, DuBridge RB, Kirchner J, Fearon K, Mao J, Corcoran K. 2000. Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays. Nature Biotecnology 18:630-634.
Brown TA. 2007. Gene Cloning and DNA Analysis : An Introduction. Sixth Edition. New York: John Wiley and Sons. Commins J, Toft C, Fares MA. 2011. Computational biology methods and their application to the comparative genomics of endocellular symbiotic bacteria of insect. Biological Procedures Online 11: 52-78. Direktorat Jenderal Tanaman Pangan. 2010. Luas panan Kedelai Menurut Provinsi (hektar)2007-2010. Jakarta : Sekretariat Direktorat Jenderal Tanaman Pangan. Doyle JJ, Doyle JL. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12 : 13-15. Englund PT. 1971. Analysis of nucleotide sequences at 3’ termini of duplex deoxyribonucleic acid with the use of the T4 deoxyribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chemistry 246 : 3269-3276. Englund PT. 1972. The 3’terminal nucleotide sequences of T7 DNA. J.molec.Biol 66 : 209-224. Ewing B, Green P. 1998. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res 8: 186194. Franca LTC, Carrilho E, Kist TBL. 2002. A review of DNA sequencing techniques. Quaterly Reviews of Biophysics 35: 169200. Hidajat O. 1985. Morfologi Tanaman Kedelai. Di dalam : Somaatmadja, Ismunadji M, Sumarno, Syam M, Manurung SO, Yuswadi, editor. Kedelai. Bogor: Badan Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. Hlm 73-101. Horison C, Rustikawati, Eliyanti. 2003. Penentuan protokol yang tepat untuk menyiapkan DNA genom cabai (Capsicum Sp.). Jurnal Akta Agrosia 6(2): 38-43. Illumina. 2008. Preparing Samples for Sequencing Genomic DNA. San Diego : Illumina Inc. Illumina. 2009. Sequencing Analysis Software : User Guide. San Diego : Illumina Inc. Illumina. 2010a. HiSeq Sequencing Systems. San Diego : Illumina Inc. Illumina. 2011. HiSeq 2000 Quick Reference Guide. San Diego : Illumina Inc.
22
Illumina. 2012. Using PhiX Control for HiSeq® Sequencing Runs. San Diego : Illumina Inc.
Pattersson E, Lundeberg J, Ahmadian A. 2009. Generations of sequencing technologies. Genomics 93: 105-111.
Illumina.2010b. cBot Quick Reference Guide. San Diego : Illumina Inc.
Pesole G, Cecilia S.2003. Handbook of Comparative Genomics : Principles and Methodology. New York : Wiley Liss.
Illumina.2010c. Truseq DNA Sample Preparation Guide. San Diego : Illumina Inc. Invitrogen.2004. Nebulizers. Carlsbad, CA : Invitrogen Corporation. Kircher M, Heyn P, Kelso J. 2011. Addressing challanges in the production and analysis of illumina sequencing data. BMC Genomics 12: 382-396. Mardis ER. 2008. Next generation DNA sequencing methods. The Annual Review of Genomics and Human Genetics 9 :387402. Margulies M, Egholm M, Altman WE, Attiya S, Bader JS, Bemben LA, Berka J, Braverman MS, Chen CJ, Chen Z, Dewell SB, Du L, Fierro JM, Gomes XV, Godwin BC, He W, Helgesen S, Ho CH, Irzyk GP, Jando AC, Alenquer ML, Jarvie TP, Jirage KB, Kim JB, Knight JR, Lanza JR, Leamon JH, Lefkowitz SM, Lei M, Li J, Lohman K L, Lu Hong, Makhijani VB, McDade KE, McKenna MP, Myers EW, Nickerson E, Nobile JR, Plant R, Puc BP, Ronan MT, Roth GT, Sarkis GJ, Simon JF, Simpson JW, Srinivasan M, Tartaro KR, Tomasz A, Vogt KA, Greg AV, Wang SH, Wong Y, Weiner MP, Yu P, Begley RF, Rothberg JM. 2005. Genome sequencing in open microfabricated high density picolitre reactors. Nature 437: 376380. Metzker ML. 2010. Sequencing technologies the next generation. Nature Review 11. 3146. Michiels AN, Ende WVD, Tucker M, Riet L, Laere V. 2003. Extraction of high quality genomic DNA from latex containing plants. Analytical Biochemistry 315 : 8589. Olsvik O, Whalberg J, Petterson B, Uhlen M, Popovic T, Wachmuth IK, Fields PI. 1993. Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to indentify three types of cholera toxin subunit B in Vibrio cholerae O1 strains. Journal of Clinical Microbiology 31 : 22-25.
Pitojo S. 2007. Benih Kedelai. Jakarta : Kanisius. Poehlman JM, Sleper DA. 1995. Breeding Field Corps 4th Edition. Iowa : Iowa State University Press. Poirel L, Naas T, Nordmann Pyrosequencing as a rapid identification of GES-Type Spectrum lactamase. J.Clin 44:3008-3011.
P. 2006. tool for ExtendedMicrobiol
Purwono, Purnawati H. 2008. Budidaya 8 Jenis Tanaman Pangan Unggul. Jakarta : Penebar Swadaya. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. 2012. Daftar Varietas Unggul Kedelai. [terhubung berkala]. http://puslittan.bogor.net/index.php?bawa an=varietas/gerbang&proses=daftarstok &komoditas=05025&varietas=1. (30 Mei 2012) Quail MA, Kozarewa I, Smith F, Scally A, Stephens PJ, Durbin R, Swerdlow H, Turner DJ .2008. A large genome center’s improvements to the illumina sequencing system. Nature Methods 5: 1005-1010. Rukmana R, Yuniarsih Y. 1995. Kedelai Budidaya dan Pascapanen. Jakarta : Kanisius. Rusk N. 2011. Torrents of sequence. Nat Method 8 : 44. Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular cloning: A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Sanger F, Air GM, Barrell BG, Coulson AR, Fiddes CA, Hutchinson CA, Slocombe PM, Smith M. 1977. Nucleotide sequence of bacteriophage φX174 DNA. Nature 265: 687-695. Sanger F, Coulson AR. 1975. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal Molecular Biology 94: 441-448. Sari DF. 2011. Analisis daya saing dan strategi pengembangan agribisnis kedelai
23
lokal di Indonesia [Skripsi]. Bogor: Departemen Agribisnis, Fakultas Ekonomi Manajemen, Institut Pertanian Bogor. Schmutz J, Cannon SB, Schulueter J, Ma J, Mitros T, Nelson W, Hyten DL, Song Q, Thelen JJ, Cheng J, Xu D, Hellsten U, May GD, Yu Y, Sakurai T, Umezawa T, Bhattacharyya MK, Sandhu D, Valliyodan B, Lindquist E, Peto M, Grant D, Shu S, Goodstein D, Barry K, Furell-Griggs M, Abernathy B, Du J, Tian X, Zhu L, Gill N, Joshi T, Libault M, Sethuraman A, Zhang XC, Shinozaki K, Nguyen HT, Wing RA, Cregan P, Specht J, Grimwood J, Rokhsar D, Stacey G,Shoemaker RC, Jackson SA. 2010. Genome sequence of the paleopolyploid soybean. Nature 463 : 178183. Schuster SC. 2008. Next generation sequencing transform today’s biology. Nature Method 5: 16-18. Shanmugasundaram S, Sumarno. 1993. Glycine max (L). Di dalam : Westphal and PCM Jansen (Eds). Bogor: Plant Resources of South East Asia, A Selection. Suharsono. 2002. Konstruksi Pustaka Genom Kedelai Kultivar Slamet. Hayati 9 :67-70. Sumarno, Harnoto. 1983. Kedelai dan Cara Bercocok Tanamnya. Bogor : Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. Suprapto. 2002. Bertanam Kedelai. Jakarta : Penebar Swadaya. Surzcky S. 1990. A Fast method to prepare random fragment sequencing libraries using a new procedure of DNA shearing by nebulization and electroporation. Di dalam : The International Conference on The Status and Future of Research on The Human Genome. San Diego : Human Genom II. hlm 51. Surzcky S. 2003. Human Molecular Biology Laboratory. London: Blackwell Publishing. Swiss Federal Institute of Technology Zurich.2012. Illumina NGS Data Management [Terhubunf Berkala]. http://www.cisd.ethz.ch/software/openBIS/ Deep_Sequencing. (31 Oktober 2012) Tasma IM, Warsun A, Asadi. 2008. Development and Characterization of F2 Population for Molecular Mapping of
Aluminum-Toxicity Tolerant Soybean. AgroBiogen 4 : 1-8.
QTL
in
Valouev A, Ichikawa J, Tonthat T, Stuart J, Ranade S, Peckham, Zeng K, Malek JA, Costa G, McKernan K, Sidow A, Fire A, Johnson SM. 2008. A high resolution, nucleosome position map of C.elegans reveals a lack of universal sequence dictated positioning. Genome Res 18 : 1051-1065. Voelkerding KV, Dames SH, Durtschi JD. 2009. Next generation sequencing : from basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55: 41-47. Wahyudi AT. 2001. Perpustakaan gen : Bagaimana mengontruksinya? [ulasan]. Hayati 8: 27-30. Walker JM, Wilson K. 2000. Principles and Techniques of Practical Biochemistry. UK: Cambridge University Press. Woo SS, Jiang J, Gill BS, Paterson AH, Wing RA. 1994. Construction and characterization of a bacterial artifical chromosome library of Sorghum bicolor. Nucleic Acid Research 22: 4922-4931. Wulandari YRE. 2009. Konstruksi pustaka genom Tibouchina langsdorffiana Baill [Tesis]. Bogor : Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Yepyhardi. 2009. Elektroforesis: Pintu Gerbang Penelitian Biologi Molekular [terhubung berkala]. http://sciencebiotech.net/elektroforesispintu-gerbang-penelitian-biologimolekular. (14 Januari 2012) Yuwono T. 2005. Biologi Molekular. Jakarta : Erlangga. Zamroni Muhamad. 2012. Kedelai Mulyowilis [Terhubung berkala]. http://muhamadzamroni.wordpress.com/20 12/01/14/kedelai-mulyowillis/. (27 September 2012) Zhang J, Chiodini R, Badr A, Zhang G. 2011. The impact of next generation sequencing on genomics. J Genet Genomics 38 : 95109
24
LAMPIRAN
25
Lampiran 1 Strategi penelitian
Isolasi DNA Kedelai
Konstruksi genom kedelai (fragmentasi DNA, preparasi fragmen DNA cetakan, modifikasi ujung fragmen DNA, adenilasi ujung 3’OH fragmen DNA, penempelan adaptor, purifikasi fragmen DNA hasil ligasi, amplifikasi fragmen DNA, validasi pustaka genom)
Klasterisasi DNA
Sekuensing DNA
Analisis kualitas pustaka genom hasil sekuensing
26
Lampiran 2 Flow cell Illumina HiSeq2000 (Swiss Federal Institute of Technology Zurich 2012)
27
Lampiran 3 Prinsip sequencing by synthesis next generation sequencing Illumina HiSeq 2000 (Mardis 2008)
28
Lampiran 4 Tahapan klasterisasi pustaka genom (Illumina 2011)
29
Lampiran 5 Tabung nebulisasi (Invitrogen 2004)
30
Lampiran 6 Ilustrasi phasing dan prephasing yang dapat terjadi saat proses sekuensing (Illumina 2009)
31
Lampiran 7 Gambar intensitas basa adenin pada siklus 1 proses sekuensing
32
Lampiran 8 Grafik jumlah densitas klaster setiap lajur
Keterangan : : Densitas klaster : Klaster PF (Passing Filter) : Median klaster
33
Lampiran 9 Grafik nilai Qscores pada setiap siklus selama proses sekuensing
