KOMPLEXNÍ GENETICKÁ VYŠETŘENÍ U PÁRŮ S PORUCHAMI FERTILITY

DIPLOMOVÁ PRÁCE MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie

KOMPLEXNÍ GENETICKÁ VYŠETŘENÍ U PÁRŮ S PORUCHAMI FERTILITY

Brno 2007

Bc. Kateřina Kvačková

Poděkování Ráda bych poděkovala své školitelce RNDr. Alexandře Oltové, odbornému konzultantovi MVDr. Marcele Vilémové a primářce OLG MUDr. Renatě Gaillyové, Ph.D. za pomoc a cenné rady při zpracování diplomové práce a také celému kolektivu z Oddělení lékařské genetiky FN Brno za vytvoření příjemné pracovní atmosféry.

2

Obsah: 1. ÚVOD..................................................................................................................... 4 1.1 Stanovení karyotypu......................................................................................5 1.2 Získané chromosomové aberace............................................................... 10 1.3 Mikrodelece chromosomu Y......................................................................11 1.4 Mutace v genu CFTR.................................................................................. 12 1.5 Trombofilní mutace..................................................................................... 12

2. CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE........................................................................ 14 3. MATERIÁL A METODY..............................................................................15 3.1 Cytogenetická vyšetření............................................................................. 15 3.1.1 Kultivace lymfocytů z periferní krve............................................... 15 3.1.2 Upřesnění cytogenetických nálezů metodou FISH.................................... 16 3.1.3 Získané chromosomové aberace............................................................... 18 3.2 Detekce mikrodelecí na chromosomu Y................................................. 19

3.3 Molekulárně genetická vyšetření mutací genu CFTR a trombofilních mutací................................................................................ 21 4. VÝSLEDKY....................................................................................................... 23 4.1 Stanovení karyotypu.................................................................................... 23

5.

6. 7. 8.

4.1.1 Výsledky vyšetření žen............................................................................. 23 4.1.2 Výsledky vyšetření mužů.......................................................................... 30 4.2 Získané chromosomové aberace............................................................... 38 4.3 Mikrodelece na chromosomu Y................................................................ 39 4.4 Mutace v genu CFTR.................................................................................. 40 4.4.1 Výsledky vyšetření mužů s patologickým spermiogramem....................... 40 4.4.2 Výsledky vyšetření mužů s normospermií................................................ 41 4.4.3 Výsledky vyšetření žen............................................................................. 41 4.5 Trombofilní mutace..................................................................................... 41 DISKUSE.............................................................................................................43 5.1 Stanovení karyotypu....................................................................................43 5.1.1 Výsledky zahraničních studií.................................................................... 43 5.1.2 Výsledky FN Brno.................................................................................... 47 5.2 Získané chromosomové aberace............................................................... 48 5.3 Mikrodelece na chromosomu Y................................................................ 49 5.3.1 Výsledky zahraničních studií.................................................................... 49 5.3.2 Výsledky FN Brno.................................................................................... 51 5.4 Mutace v genu CFTR.................................................................................. 52 5.4.1 Výsledky zahraničních studií.................................................................... 52 5.4.2 Výsledky FN Brno.................................................................................... 55 5.5 Trombofilní mutace..................................................................................... 56 5.5.1 Výsledky zahraničních studií.................................................................... 56 5.5.2 Výsledky FN Brno.................................................................................... 59 5.6 Shrnutí všech výsledků FN Brno.............................................................. 60 ZÁVĚR................................................................................................................. 62 SUMMARY........................................................................................................ 64 LITERATURA...................................................................................................66 3

1. ÚVOD A PROBLEMATIKA V současné době trpí v České republice, podobně jako v ostatních vyspělých zemích, poruchou fertility přibližně 15 % párů (Kubíček, 1996). Jako neplodnost označujeme stav, kdy se partnerce nedaří více než rok přirozeně otěhotnět (Forti and Krausz, 1998). Dále se do této skupiny párů řadí i partneři, kde partnerka opakovaně samovolně potratila. Současné údaje ukazují, že asi 20 % příčin neplodnosti je zcela způsobeno mužským faktorem a na dalších 27 % se muž a žena podílejí stejnou měrou. Čistě ženským faktorem je zapříčiněno přibližně 38 % poruch fertility a ve zbylých 15 % případů nebyla příčina nalezena (Huynh et al., 2002). Příčiny neplodnosti, ať už jde o ženu či muže, jsou různé. Nejčastěji se vyskytují gynekologické problémy u žen (neprůchodnost vejcovodů, endometrióza) a andrologické na straně mužů (např. postižení transportu spermií). Dále se objevují příčiny endokrinologické (hormonální), imunologické, hematologické (ty především u žen s opakovanými potraty) a genetické. Samozřejmě i životospráva a celkový životní styl ovlivňují schopnost reprodukce (Sharpe, 2000). Specializované genetické poradenství je všem párům s poruchami reprodukce poskytováno v rámci reprodukční genetiky, což je poměrně nové odvětví lékařské genetiky úzce spolupracující s reprodukční medicínou, asistovanou reprodukcí a vývojovou genetikou. Ve FN Brno se ročně vyšetří přibližně 700 osob s poruchou fertility. Základním vyšetřením je stanovení karyotypu a dle klinického stavu pacientů a jejich osobní či rodinné anamnézy jsou zvoleny další postupy – vyšetření mutací genu CFTR, mikrodelecí na chromosomu Y, trombofilních mutací a získaných chromosomových aberací.

4

1.1 Stanovení karyotypu Základní vyšetření všech infertilních osob spočívá ve stanovení karyotypu, kdy se zjišťuje, zda pacient není nositelem vrozených chromosomových aberací. Toto vyšetření je indikováno poté, kdy partnerka přirozeně neotěhotní během jednoho roku až dvou let a není objevena žádná gynekologická, hormonální nebo jiná příčina. Pokud se v rodině vyskytují vrozené chromosomové abnormality nebo spontánní potraty, je cytogenetické vyšetření nezbytné. Také u všech infertilních mužů s oligozoospermií a azoospermií je cytogenetické vyšetření nutné, protože je u nich čtyřnásobně vyšší výskyt aberací autosomů a dvacetinásobně vyšší výskyt aberací gonosomů (Macek et al., 2002). Vrozené chromosomové změny se podle několika kritérií dělí na strukturní a numerické a na aberace autosomů nebo gonosomů (obr. 1).

Obr. 1 - Rozdělení vrozených chromosomových aberací polyploidie

numerické aneuploidie

triploidie tetraploidie . monosomie trisomie kvadrisomie

balancované (bez ztráty gen. materiálu)

inverze inzerce reciproká translokace Robertsonovská translokace

strukturní

nebalancované (se ztrátou gen. materiálu)

delece duplikace kruhový chromosom izochromosom

1.1.1 Výskyt chromosomových změn u osob s poruchami fertility Chromosomové aberace se vyskytují průměrně u 2 - 7 % párů s poruchami fertility (Daniely et al., 1998), zatímco jen u 0,6 % novorozenců (Pandiyan and Jequier, 1996). Nejčastějšími chromosomovými abnormalitami spojenými s infertilitou jsou aneuploidie a mozaiky gonosomů (Mau et al., 1997). 5

U mužů je porucha fertility včetně chromosomových abnormalit úzce spojena s výsledky vyšetření spermatu – spermiogramem. Existuje několik forem patologických nálezů při analýze spermatu (tab. 1), které se od sebe liší několika parametry – množstvím spermií, jejich motilitou a morfologií. Normální ejakulát bez patologií s koncentrací spermií 50 – 250 milionů/ml se označuje jako normospermie.

Tab.1 - Nomenklatura patologických nálezů při analýze spermatu podle WHO (1992)

Četnost výskytu chromosomových abnormalit u mužů vzrůstá se snižujícím se počtem jejich spermií. Např. u jedinců s těžkou formou oligozoospermie a s neobstrukční azoospermií (nepřítomnost spermií v ejakulátu není způsobena absencí nebo blokádou vývodných cest) je výskyt chromosomových změn až 23,2 % (Dada et al., 2003), zatímco u mužů s oligozoospermií je to přibližně 5 % (Johnson, 1998). U žen je hlavním ukazatelem plodnosti přítomnost menstruace a ovulace. Jak už bylo naznačeno výše, žen s abnormálním karyotypem se v infertilních párech vyskytuje zhruba polovina.

Numerické aberace Vyskytují se zpravidla jenom aneuploidie, tri- a tetraploidní embrya jsou neživotaschopná (možnost výskytu pouze malé mozaiky polyploidních buněk). Nejčastěji diagnostikovanou

chromosomovou

změnou

spojenou

s mužskou

infertilitou

je

Klinefelterův syndrom (Huynh et al., 2002), jehož frekvence výskytu je 1 : 670 novorozených chlapců. V 93 % případů je karyotyp mužů 47,XXY, v ostatních případech se vyskytuje mozaicismus 47,XXY/48,XXXY/49,XXXXY/46,XY, i muži s karyotypem 6

48,XXYY mají symptomy typické pro Klinefelterův syndrom (Bielanska et al., 2000). Výskyt jedinců s Klinefelterovým syndromem je mezi infertilními muži poměrně vysoký, u azoospermiků jsou zastoupeni přibližně 11 %, u oligozoospermiků 0,7 % (Huynh et al., 2002). Klasické příznaky tohoto syndromu jsou malá, tuhá varlata, gynekomastie, zvýšená hladina hormonu FSH a těžká porucha spermatogeneze – většinou azoospermie (Bhasin et al., 2000). Oligozoospermie se vyskytuje spíše u mužů s mozaicismem 47,XXY/46,XY (Huynh et al., 2002), u nichž je zřídka zjištěno i přirozené otěhotnění partnerky (Bhasin et al., 2000). V literatuře se objevují protichůdné názory ohledně zárodečných buněk s karyotypem 47,XXY. Obecně je zastáván názor, že buňky s více než jedním chromosomem X jsou eliminovány a spermatogeneze se neúčastní (Huynh et al., 2002). Někteří vědci (Martini et al., 1996) se domnívají, že zárodečné buňky 47,XXY se spermatogeneze účastní, ačkoliv původ hyperhaploidních spermií XX a XY nelze stoprocentně prokázat. S určitostí lze ale konstatovat, že u mužů s Klinefelterovým syndromem je během spermatogeneze vyšší výskyt nondisjunkcí (Bhasin et al., 2000). Nositelé karyotypu 47,XYY, jehož četnost výskytu je 1 : 1000 narozených chlapců, mají většinou normální fenotyp, robustní postavu a normální IQ. Díky metodě FISH (Fluorescent in situ hybridization) se zjistilo, že tito muži mají v 104 spermií jen asi 1 % 24,XY a 24,YY spermií, což dokazuje ztrátu nadbytečného chromosomu Y během meiózy u většiny zárodečných buněk (Shi and Martin, 2001). Většina mužů s tímto karyotypem je fertilní, u některých pacientů však byla zjištěna i azoospermie (Kubíček, 1996). U žen se jako aneuploidie gonosomů objevuje Turnerův syndrom (45,X) s výskytem 1 : 2000 novorozenců ženského pohlaví. Klinickými příznaky tohoto syndromu jsou malý vzrůst do 150 cm, krátký krk s kožní řasou, plochý a široký hrudník, nevyvinutá prsa, objevují se vady aorty a ledvin. Ovaria jsou proužkovitá a genitálie hypoplasické v důsledku absence druhého pohlavního chromosomu, který se podílí na vývoji gonád; z těchto důvodů jsou tyto ženy zpravidla sterilní (Abir et al., 2001). Mezi výše zmíněné numerické aberace gonosomů patří i karyotyp 47,XXX. Tyto ženy s normálním fenotypem a mírnou mentální retardací (v populaci se jich vyskytuje 0,1 %) většinou sníženou plodnost nemají. Existuje u nich však vyšší riziko narození dítěte s aneuploidií chromosomu X, proto je nutné prenatální stanovení karyotypu plodu. Nízké procento (do 3 %) mozaiky gonosomů se často vyskytuje především u žen se sníženou fertilitou. Dříve těmto mozaikám vědci (Toncheva et al., 1994) připisovali neúspěch fertilizace in vitro pomocí intracytoplazmatické injekce spermie (ICSI), ale studie Sonntaga et al. (2001) na 26 ženách s nízkým procentem mozaiky gonosomů 7

neprokázala vyšší výskyt neúspěšného vývoje embrya nebo abortů po ICSI oproti kontrolnímu vzorku. Aneuploidie autosomů jsou většinou tak závažné, že postižené osoby se nedožijí dospělého věku. Někteří lidé s Downovým syndromem (47,XX,+21 nebo 47,XY,+21) se dožívají až 50 let, ale mají těžké fyzické i duševní postižení. Průměrná frekvence výskytu potomka s Downovým syndromem je u matek všech věkových kategorií 1 na 800 novorozenců (Shah et al., 2003). Postižené ženy mohou vzácně otěhotnět, muži jsou vždy sterilní – dochází k zastavení spermatogeneze a redukci počtu zárodečných buněk (Shah et al., 2003).

Strukturní aberace U infertilních osob se objevují všechny strukturní chromosomové aberace uvedené na obr. 1. U osob s Robertsonovskou translokací se při meióze vytvářejí trivalenty mezi translokovaným chromosomem a jeho homologem, přičemž výsledkem jsou gamety s normální chromosomovou výbavou nebo ty, kterým chybí nebo přebývá dlouhé raménko jednoho chromosomu - nebalancované gamety (Shi and Martin, 2001). Frekvence výskytu balancovaných Robertsonovských translokací mezi novorozenci je 1 : 1000. Nejčastěji (přibližně 70 % všech případů) se vyskytuje translokace mezi chromosomy 13 a 14, pak také t(14; 21). U mužů se tyto anomálie vyskytují především u oligozoospermiků (1,5 %, což je 15krát častěji než v běžné populaci), vzácněji u azoospermiků (Mau-Holzmann, 2005). Reciproké translokace mohou vést ke snížení fertility (kvůli defektní gametogenezi) nebo ke spontánním abortům (Shah et al., 2003). U infertilních osob se vyskytují pouze translokace balancované. Reciproké translokace se dají rozdělit podle typu translokovaných chromosomů. Při translokaci autosom - autosom je fertilitita snížena z toho důvodu, že translokovaný chromosom se během synapse v meióze potřebuje spárovat s homologním chromosomem (Shah et al., 2003). Složitý mechanismus a časové nároky vzniku takovéhoto kvadrivalentu zpomalí proces meiózy (Chandley, 1984). Nespárování nebo rozpojení homologních chromosomů vede ke vzniku nebalancovaných gamet. Vznik asynaptických oblastí může vést k přerušení meiózy a následně k zániku zárodečné buňky (Miklos, 1974). Je také dokázáno, že translokované segmenty chromosomů se v průběhu prvního meiotického dělení pokoušejí o nehomologní párování s chromosomy X a Y (Lyon and Meredith, 1966), což překáží inaktivaci chromosomu X

8

(Chandley, 1984). Pokud k inaktivaci chromosomu X nedojde, nadměrná exprese genů způsobí smrt zárodečných buněk (Chandley, 1984). Reciproké translokace gonosom – autosom jsou také poměrně časté. U mužů je reciproká translokace Y – autosom spojena s infertilitou (Buonadonna et al., 2002), přičemž je zastaveno zrání zárodečné buňky a spermatogeneze, což ústí v těžkou oligozoospermii nebo azoospermii (Sasagawa et al., 1993). Při fertilizaci in vitro pomocí ICSI se může stát, že k oplodnění bude vybrána spermie 23,X nesoucí autosom s translokovanou částí chromosomu Y. Pokud tato část ponese gen SRY (sex-determining region Y), který se nachází na horním raménku chromosomu Y a v zárodečném vývoji je zodpovědný za vytvoření mužských pohlavních orgánů a znaků, narodí se jedinec s karyotypem 46,XX, ale s mužským fenotypem. Podobné pokusy na myších prováděli Shah and Smart (1996). Translokace X – autosom u mužů také negativně ovlivňuje fertilitu (Madan, 1983). Při translokaci X – autosom u žen zůstává chromosom X s translokovaným úsekem aktivní, aby nedošlo k inaktivaci důležitých genů na autosomálním úseku, a normální chromosom X se stává inaktivním (Madan, 1983). Mezi infertilními jedinci se translokace autosomů vyskytují sedmkrát častěji než v normální populaci (Krausz and Forti, 2000). Translokace jsou také často nalézány u párů s opakovaným neúspěchem fertilizace in vitro (Stern et al., 1999). Např. neobvyklá translokace (6;11) se vyskytla u muže s jediným klinickým příznakem – oligozoospermií (Pernice et al., 2002). Quintana de la Rosa et al. (2001) poprvé popsali u infertilního muže (OAT) s normálním fenotypem translokaci (3;22), v literatuře jsou popsány i další translokace související s poruchami plodnosti (tab. 2). Inverze také mohou zapříčinit infertilitu tím, že stejně jako u translokací dojde i v tomto případě ke zpomalení meiózy z důvodu složitého mechanismu a časové náročnosti párování pomocí inverzní smyčky (Chandley, 1984). Pokud ve smyčce proběhne crossingover, vznikají nebalancované gamety, což vede k reprodukčním ztrátám (Chandley, 1984). Prevalence pericentrických inverzí je kolem 0,01–0,07 %, paracentrických 0,01–0,05 % (Mau-Holzmann, 2005).

9

Tab. 2 – Příklady reciprokých translokací nalezených u infertilních mužů

1.2 Získané chromosomové aberace U infertilních osob, které častěji přicházejí do styku s mutageny (rizikové zaměstnání, prodělaná onkologická léčba), se vyšetřují i získané chromosomové aberace. Jedná se o různé zlomy, dicentrické nebo tricentrické chromosomy, kruhové chromosomy, chromatidové výměny a jiné (obr. 2).

Obr. 2 – Příklady získaných chromosomových aberací

10

Zvýšené procento aberantních lymfocytů poukazuje na možnost výskytu aberantních zárodečných buněk, což může vést ke zvýšenému počtu nebalancovaných spermií nebo oocytů a ke zhoršení plodnosti.

1.3 Mikrodelece chromosomu Y U infertilních mužů se vyskytují i delece chromosomu Y. Protože nejsou detekovatelné běžnými cytogenetickými metodami, ale jen na molekulární úrovni, označují se jako mikrodelece. Tyto mikrodelece zasahují 3 nepřekrývající se oblasti azoospermického faktoru (AZF) na Yq11.23 označované AZFa, AZFb, AZFc (obr. 3) a celosvětově se vyskytují v průměru u 4 % mužů s oligozoospermií, u 14 % pacientů s těžkou formou oligozoospermie, u 11 % mužů s obstrukční azoospermií (CBAVD) a u 18 % postižených idiopatickou azoospermií (Foresta et al., 2001). Mikrodelece vznikají při intrachromosomové rekombinaci mezi velkými bloky homologních repetitivních sekvencí, které se nacházejí na Yq11 v těsném sousedství oblastí azoospermického faktoru (Vogt, 2004).

Obr. 3 – Oblasti azoospermického faktoru na chromosomu Y (Dada et al., 2003 – upraveno)

Co se týče kandidátních genů, v oblasti AZFa byly nalezeny 2 – USP9Y (ubiqitinspecific protease, Y chromosome) a DBY (dead box on Y) (Foresta et al., 2001). Za gen s největším významem ve spermatogenezi je v této oblasti považován DBY (Foresta et al., 2001). V oblasti AZFb se v několika kopiích nachází rodina genů RBMY (RNA-binding motif on Y), které se dále rozdělují do 6 skupin (RBMY1 – RBMY6) (Vogt et al., 1996). Mnoho genů RBMY bylo nalezeno na obou ramenech chromosomu Y, ale jenom exprese genů ležících v oblasti AZFb poskytuje detekovatelné množství proteinu (Huynh et al., 2002). Nejdůležitějším genem pro spermatogenezi je v oblasti AZFc gen DAZ (deleted in 11

azoospermia) (Reijo et al., 1995). Tento gen kóduje podobně jako geny RBMY pro varlata specifický protein obsahující motiv vázající RNA (Reijo et al., 1995). Oblastí, kterou postihují mikrodelece nejvíce, je AZFc (Simoni et al., 1998).

1.4 Mutace v genu CFTR Se sníženou

fertilitou

souvisí

i

mutace

genu

CFTR

(Cystic

Fibrosis

Transmembrane conductance Regulator), jenž kóduje transmembránový regulátor (chloridový kanál) v apikální membráně sekretorických epiteliálních buněk, a mutace v obou jeho alelách způsobuje recesivní autosomálně dědičnou chorobu – cystickou fibrosu (CF). Mutace genu CFTR, který se nachází na 7q31.2 a má 27 exonů, byly zjištěny u mužů s oligospermií a azoospermií (Dohle et al., 2002). Přibližně u 2 % těchto mužů je nepřítomnost spermií v ejakulátu způsobena vrozenou oboustrannou absencí chámovodů (CBAVD) (Donat et al., 1997). Mezi 50 – 83 % infertilních mužů s CBAVD má jednu mutaci v genu CFTR, přibližně 10 % má v tomto genu mutace dvě (Donat et al., 1997). Mutace CFTR byla nalezena i u některých mužů s jednostrannou absencí chámovodu (CUAVD), a pokud u nich např. po úrazu nebo infekci nevznikla blokáda zdravého chámovodu, jsou tito muži normálně fertilní a jejich choroba je diagnostikována jen výjimečně (Meschede and Horst, 1997). Dále se vyšetřuje polymorfismus polytymidinového traktu intronu 8, kde byly nalezeny 3 varianty v 5´ místě sestřihu – 9T, 7T a 5T. Alela s pěti tymidiny je považována za mutantní, protože u 90 % osob s touto variantou nedochází k transkripci exonu 9, a tím je narušena správná funkce proteinu (Mak et al., 2000). V kontrolních skupinách fertilních mužů (normální nebo mírně snížená koncentrace spermií) byla alela 5T přítomna u 3,5 – 4,7 % jedinců (Grangeia et al., 2004; Schulz et al., 2006). Tato varianta je spojena spíše se sníženou fertilitou než úplnou absencí spermií, a tedy i s mírnějšími patologiemi (Larriba et al., 2005).

1.5 Trombofilní mutace Mezi možné rizikové faktory vedoucí u žen ke spontánním abortům v důsledku trombotizace cév choria nebo placenty patří mutace genu pro protrombin, mutace genu MTHFR a tzv. Leidenská mutace (Macek et al., 2002).

12

Leidenská mutace (FVL) je bodová mutace genu pro srážecí faktor V, který se nachází na 2q31. Je způsobena záměnou aminokyseliny argininu za glutamin (mutace G1691A) a projevuje se jako rezistence vůči aktivovanému proteinu C (Dahlbäck, 1995). Prevalence této dominantně dědičné mutace v Evropě je 5 – 9 %, u asijské a černošské populace je vzácná (Lockwood, 2002). Mutace genu MTHFR (gen pro metylen-tetrahydrofolát reduktázu) vede k substituci cytosinu za thymin (bodová mutace C667T), projevuje se nedostatkem tohoto enzymu a v některých případech i zvýšenou plasmatickou hladinou homocysteinu (Lockwood, 2002). Dědí se autosomálně recesivně a mutaci alespoň jedné alely nese asi 11 % obyvatel Evropy (Lockwood., 2002). Heterozygotnost pro mutaci v promotorové oblasti genu pro protrombin (hemokoagulační faktor II) vede ke zvýšené hladině (150 - 200 %) tohoto proteinu v krvi a tím pro svého nositele zvyšuje riziko tromboembolismu (Lockwood, 2002). Tato bodová mutace G20210A s autosomálně dominantní dědičností se vyskytuje u 2 – 3 % jedinců v evropské populaci (Lockwood, 2002).

13

2. CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE Práci jsem vypracovávala v rámci rutinní diagnostické péče o neplodné páry na Oddělení lékařské genetiky FN Brno. Mým úkolem bylo předávat výsledky vyšetření ošetřujícím lékařům a dále je:

♦ shrnout, ♦ vyhodnotit, ♦ a porovnat s dostupnými výsledky podobných studií v zahraničí.

14

3. MATERIÁL A METODY Pacienty byly infertilní páry, které byly vyšetřeny na Oddělení lékařské genetiky FN Brno od ledna 2005 do prosince 2006. Při všech genetických vyšetřeních se používala periferní krev pacientů, přičemž pro účely cytogenetických nebo molekulárně cytogenetických analýz byla odebrána do heparinu, zatímco pro molekulární DNA diagnostiku do EDTA (zabránění srážení krve a inhibice nukleáz).

3.1 Cytogenetická vyšetření 3.1.1 Kultivace lymfocytů z periferní krve Rutinně se v genetických laboratořích vyšetřuje karyotyp lymfocytů z periferní krve. Díky působení fytohemaglutininu (PHA) se T-lymfocyty přeměňují zpět na mladší formy – lymfoblasty, které se během kultivace dále dělí. Při hypotonii dochází ke zvětšení objemu buněk a nabobtnání jádra a chromosomy jsou tak ve fixovaných mitózách dobře rozložené.

Postup: 1. kultivovat 0,6 ml krve v 7 ml media (bovinní sérum, RPMI 1640, NaHCO3, glutamin, penicilin, PHA a redestilovaná voda) při 37 °C v termostatu s CO2; 2. zastavit mitotické dělení po 72 hodinách kultivace 0,001 % kolchicinem (0,4 ml); 3. přelít do označených zkumavek a stočit 10 min/1200 otáček, odsát supernatant; 4. hypotonie - přidat 7 ml 0,075 M roztoku KCl předehřátého na 37 °C, inkubovat 30 min v termostatu; 5. stočit 10 min/1200 otáček a odsát supernatant; 6. opakovaná (3x) fixace v 7 ml roztoku kyseliny octové a metanolu v poměru 1 : 3 (vychlazený roztok zpočátku přidávat po kapkách), mezitím vždy stočit a odsát supernatant, po posledním stočení odsát pouze část supernatantu, ve zbytku resuspendovat sediment; 7. připravit orientační preparát - vzniklou suspenzi kápnout na sklíčko a obarvit.

15

Pro obarvení chromosomů byla použita metoda G-pruhování: 1. příprava roztoků: 0,5 % trypsin – 1 g komerčně dodávaného trypsinu rozpustit v 100 ml Sörensenova pufru pH 6,8 a rozlít do zkumavek po 5 ml, zamrazit; při každém G-pruhování použít 1 zkumavku a rozpustit v 95 ml Sörensenova pufru na vodní lázni při 30 °C (enzym je aktivován za 20 min); barvivo Giemsa-Romanowski – ve skleněné kyvetě smíchat 70 ml Sörensenova pufru a 3 – 4 ml koncentrovaného, komerčně dodávaného barviva Giemsa-Romanowski; 2. nakapané preparáty (jedna kapka připravené suspenze se přenese na mokré podložní sklo) staré nejméně 24 hod. temperovat při 80 °C; 3. preparát na několik sekund (5 – 15 s, optimalizace podle kvality preparátu) ponořit do 0,5 % roztoku trypsinu (proteolytický enzym působící na proteiny nehistonové povahy); 4. rychle opláchnout v Sörensenově roztoku a barvit 1 – 2,5 min v Giemsově barvivu (opět optimalizace podle kvality preparátu); 5. po barvení preparát opláchnout destilovanou vodou; 6. takto připravené preparáty lze pozorovat pod mikroskopem.

Preparáty byly pozorovány pod mikroskopem Olympus BX 41 a karyotyp byl stanoven po zhodnocení 10 nebo 30 (hodnocení na mozaiku) mitóz. Patologie byly snímány a uloženy do počítače pomocí programu Lucia Karyo (Laboratory Imaging, s. r. o., Praha). Celkem byl stanoven karyotyp 670 žen a 653 mužů.

3.1.2 Upřesnění cytogenetických nálezů metodou FISH Fluorescenční hybridizace in situ (FISH) patří mezi molekulárně cytogenetické metody, jež jsou při vyšetřování infertilních pacientů využívány k potvrzení nalezených translokací a k procentuálnímu určení mozaiek a ve vzácnějších případech také k objasnění submikroskopických chromosomových aberací a markerových chromosomů, které nejsou běžnými cytogenetickými technikami detekovatelné. Metoda FISH je založena na hybridizaci fluorescenčně značené sondy s komplementárním řetězcem vyšetřované DNA za přesně daných podmínek.

16

Při potvrzování nalezených translokací byly použity celochromosomové malovací sondy (WCP) od firmy StarFish na metafázních chromosomech. Naopak při procentuálním určení mozaiky byly využity centromerické sondy od firmy Abbott Vysis na interfázních jádrech. Nejčastějším typem mozaiek jsou mozaiky gonosomů, a tak byly nejvíce využívány centromerické sondy pro chromosom X a Y, přičemž bylo většinou hodnoceno 100 nebo 200 jader. Vyhodnocování preparátů proběhlo pod epifluorescenčním mikroskopem Olympus BX 61, který je vybaven sadou fluorescenčních, excitačně bariérových filtrů Olympus a objektivem Uplan Apo 100x a Uplan FI 60x. Obraz byl postupně snímán do počítače vysoce citlivou CCD kamerou Vosskuhler 1300D vždy za použití určitého filtru specifického pro daný fluorochrom. Ke snímání jednotlivých obrazů, jejich skládaní a úpravě výsledného obrazu byl použit program Lucia FISH (Laboratory Imaging, s. r. o., Praha). Všechna molekulárně cytogenetická vyšetření byla provedena v Laboratoři molekulární cytogenetiky OLG FN Brno.

Protokol FISH pro centromerické sondy: 1. nakapání suspenze kultivovaných lymfocytů na podložní sklo; 2. zestaršení preparátu 30 min v 2x SSC (roztok získán ze zásobního roztoku 20x SSC – 50 ml + 450 ml destilované vody); 3. odvodnění preparátu vzestupnou alkoholovou řadou (70 %, 80 % a 96 % etanol) – v každém 2 minuty a pak usušení pod ventilátorem; 4. příprava sondy – smíchat: 5. 14 µl hybridizačního pufru (dodáván přímo firmou společně se sondou), 5 µl destilované vody, 1 µl rozmražené sondy, 5 µl připravené směsi kápnout na krycí sklíčko (22x22 mm), přitisknout na zestaršený preparát tak, aby se sonda rovnoměrně rozlila a nikde nezůstaly bublinky; 6. orámovat krycí sklíčko speciální hmotou – rubber cement (zabraňuje vysychání); 7. kodenaturace sondy a preparátu – 1 min. na topné desce vyhřáté na 75 °C; 8. následná hybridizace uložením preparátu do vlhké komůrky a inkubace přes noc při 37 °C; 9. po hybridizaci strhnout krycí sklíčko pinzetou a nenavázanou sondu odmýt v kyvetě s 0,5x SSC na 4 min při 73 °C; 17

10. opláchnout preparát v roztoku 2x SSC a nechat oschnout ve tmě při laboratorní teplotě; 11. po usušení obarvit pozadí pomocí roztoku DAPI (zabraňuje rychlému vysvěcování fluorochromů) – 10 µl kápnout na krycí skla (24x24 mm) a přitisknout na podložní skla; 12. po chvilce lze preparáty vyhodnocovat pod mikroskopem.

Protokol FISH pro celochromosomové sondy: Body 1 – 4 stejné jako u centromerických sond. 5. denaturace sondy - inkubace připravené směsi 10 min při 65 °C a 1 hod. při 37 °C v termostatu; 6. denaturace nakapaných skel – v roztoku 70 % formamidu, 2x SSC (pH 7) (naředění: 4 ml 20x SSC, 8 ml destilované vody, 28 ml formamidu) při 70 °C na 2 min; 7. zastavení denaturace nakapaných skel v ledové (-20 °C) alkoholové řadě (70 %, 80 % a 96 % etanol) - v každém 2 min a pak v 96 % etanolu při laboratorní teplotě, nechat usušit pod větrákem; 8. 5 µl denaturované směsi kápnout na krycí sklíčko (22x22 mm), přitisknout na denaturovaný preparát a orámovat; 9. následná hybridizace uložením preparátu do vlhké komůrky a inkubace přes dvě noci při 37 °C. Další postup je stejný jako u centromerických sond v bodech 9 – 12.

3.1.3 Získané chromosomové aberace Kultivace probíhá stejně jako při detekci vrozených chromosomových aberací, ale k zastavení buněčného cyklu kolchicinem musí dojít již po 48 hodinách, kdy došlo k prvnímu dělení, aby bylo možno zachytit všechny získané aberace. Také barvení je pouze konvenční – obarvení barvivem Giemsa-Romanovski bez předchozího působení trypsinu. Bylo hodnoceno 100 mitóz, buňka byla považována za aberantní, pokud měla alespoň jednu získanou změnu (např. zlom). Do 5 % aberantních buněk byl nález považován za normální. Celkem byly získané chromosomové aberace vyšetřeny u 91 žen a u 98 mužů. 18

3.2 Detekce mikrodelecí na chromosomu Y Pro detekci mikrodelecí na chromosomu Y pomocí PCR bylo použito 6 základních primerů (vždy 1 pro určitou oblast v jedné reakci): sY84 a aY86 pro AZFa, sY127 a sY134 pro AZFb, sY254 a sY255 pro oblast AZFc (gen DAZ). Sadu těchto primerů, které zachytí přes 90 % mikrodelecí v oblastech azoospermického faktoru, navrhl Simoni (1998) a Evropská andrologická akademie je schválila jako minimum pro standardizaci a porovnávání mezi jednotlivými laboratořemi v různých státech (Dada et al., 2003). Celkem bylo za oba roky vyšetřeno 109 mužů.

Izolace DNA: 1. 6 – 10 ml plné krve odebrané do 300 ml 0,5 M EDTA naředit sterilní chlazenou destilovanou vodu v poměru 1 : 1 a zamrazit; 2. před izolací krev rozmrazit ve studené vodě (asi 30 min) a stočit v chlazené centrifuze – 5 min/10 000 otáček; 3. slít supernatant a sediment roztřepat v chlazené destilované vodě (tu dolít asi do 2/3 zkumavky); 4. stočit v chlazené centrifuze – 5 min/10 000 otáček; 5. slít supernatant a sediment roztřepat v chlazeném fyziologickém roztoku (ten dolít asi do 1/4 zkumavky); 6. stočit v chlazené centrifuze – 5 min/10 000 otáček; 7. slít supernatant a sediment roztřepat ve směsi: 0,5 ml fyziologického roztoku, 8 – 10 µl proteinázy K, 3 ml lyzačního pufru FASANO (příprava: 4 ml 5 M NaCl, 4 ml 0,5 M EDTA, 4 ml 1 M Tris Cl (pH 7,8), 2,5 ml 20 % SDS, destilovaná voda – doplnit do 100 ml); 8. inkubovat při 50 °C přes noc (do projasnění); 9.

nechat vychladnout na laboratorní teplotu, přidat po jednom objemovém dílu chloroformu a isopropylalkoholu a na 5 hod. umístit na „kývačku“;

10. po této době se vysráží vlákno DNA – to pomocí špičky přenést do zkumavky s 1 ml chlazeného 70 % etanolu – pomalu promíchávat na rotační třepačce 5 min; 11. stočit 10 s/6000 otáček; 12. opatrně slít supernatant a do zkumavky přidat 1 ml 96 % etanolu – ten po 5 s vylít a zbylé kapičky vysušit filtračním papírem; 19

13. DNA usušit v exikátoru – 3 min; 14. usušenou DNA rozpustit ve 200 – 500 µl 10 mM TE pufru (množství se určí podle velikosti sedimentu) a nechat 3 dny rozpouštět.

Multiplex PCR: 1. připravit master mix A pro multiplex PCR A (množství na 1 vzorek): 12,5 µl Qmix 2x koncentrovaný (kit od firmy QIAGEN, složení: pufr, Taq polymeráza, dNTP, Mg2+), primery (obsahují F i R primer zároveň): 1 µl sY14 (SRY na Yp), 1,5 µl sY86 (pro oblast AZFa), 2 µl sY127 (pro oblast AZFb), 1 µl sY254 (pro oblast AZFc), 0,3 µl ∆F508 (kontrolní primery – zda reakce proběhla); 2. připravit master mix B pro multiplex PCR B (množství na 1 vzorek): 12,5 µl Qmix, primery: 1 µl SRY, 1 µl sY84 (pro oblast AZFa), 1,5 µl sY134 (pro oblast AZFb), 1 µl sY255 (pro oblast AZFc), 1 µl ZFY (kontrolní primery); 3. připravit zkumavky (Eppendorf pro PCR) – pro každého pacienta 2 + 2 pro negativní kontroly – pro multiplex A a B a do 1 napipetovat 16,5 µl master mixu A a do druhé 16,5 µl master mixu B; 4. připravit 20 µl 5x naředěné DNA od každého pacienta: 4 µl DNA + 16 µl sterilní vody; 5. 8 µl 5x naředěné DNA dát do každé ze dvou zkumavek (multiplex A a multiplex B) určené pro 1 pacienta, do zkumavek pro negativní kontrolu napipetovat vodu; 6. spustit PCR (přístroj GeneAmp PCR system 2400) – na 25 cyklů.

20

Gelová elektroforéza a barvení gelu stříbrem: Detekce produktů PCR probíhá pomocí gelové elektroforézy na 5 % polyakrylamidovém gelu při 200 V přibližně 2,5 hod. 1. gel nechat sklouznout ze skla pod proudem destilované vody ze střičky do skleněné vany, promýt destilovanou vodou a vodu odsát vývěvou; 2. fixovat 2x po 5 min ve směsi 15 % metanolu a 0,5 % kyseliny octové (1 : 1) na třepačce; 3. fixační směs odsát vývěvou a gel proprat v destilované vodě 2x 30 s a vodu odsát; 4. barvit v 0,1 % AgNO3 ve tmě po dobu 30 min na třepačce; 5. AgNO3 odsát a gel proprat v destilované vodě 2x 10 s a vodu odsát; 6. krátce proprat v 1,5 % NaOH a odsát; 7. vyvolat v roztocích 1,5 % NaOH, 0,08 % Na2B4O7 a 0,16 % formaldehyd (1 : 1 : 1) na třepačce minimálně 10 min; 8. opláchnout destilovanou vodou; 9. stabilizovat proužky 0,75 % roztokem Na2CO3 po dobu 5 min; 10. gel zatavit do PVC fólie (pro uchování se používá 2 % kyselina octová).

3.3 Molekulárně genetická vyšetření mutací genu CFTR a trombofilních mutací Ke kompletaci genetického vyšetření párů s poruchami fertility mi byly poskytnuty výsledky vyšetření mutací genu CFTR z Laboratoře molekulární genetiky OLG FN Brno a také výsledky vyšetření trombofilních mutací z Laboratoře molekulární biologie a genetiky Oddělení klinické hematologie FN Brno.

Mutace genu CFTR - vlastní metodika spočívá v dílčích krocích: 1. izolace DNA z lymfocytů periferní krve (postup uveden u vyšetření mikrodelecí na chromosomu Y); 2. real-time PCR cílové DNA sekvence pomocí specificky navržených primerů

(ohraničujících

místo

mutace

v

příslušném

genu)

a fluorescenčně značených sond FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer); 3. analýza teploty tání nasyntetizovaných produktů PCR.

21

Tato metodika a využití přístroje Light Cycler od firmy Roche umožňují rychlou (méně než 1 hodinu) detekci všech 5 nejfrekventovanějších mutací v české populaci - ∆F508, deleci 2. a 3. exonu (21kb), G551D, G542X a R553X (od poloviny roku 2006 přidána 6. mutace – N1303K). Tato základní mutační analýza pokryje 80 % všech mutací u obyvatel České republiky. Rozšířená mutační analýza na 36 mutací (tab. 4) se stanovuje pomocí systému INNO-LIPA.

Tab. 4 – 36 mutací genu CFTR vyšetřovaných při rozšířené mutační analýze

Varianty polytymidinového traktu: 1. amplifikace intronu 8; 2. nested PCR (amplifikace užšího úseku); 3. štěpení enzymem XNMI; 4. detekce produktů gelovou elektroforézou na 5 % polyakrylamidovém gelu, barvení stříbrem.

22

4. VÝSLEDKY 4.1 Stanovení karyotypu 4.1.1 Výsledky vyšetření žen Karyotyp jsme stanovili u 670 žen, normální karyotyp mělo 565 pacientek, přičemž u 73 z nich nelze vyloučit malou mozaiku (do 3 %) chromosomu X. Co se týče nalezených aberací, mezi numerickými převažovala mozaika chromosomu X – 45,X/47,XXX/46,XX, kterou jsme našli u 78 žen v procentuálním rozmezí od 3 do 20 %. Dále jsme u dvou pacientek objevili mozaiku s nadbytečným chromosomem 21 – 47,XX,+21 [3]/46,XX [97 %] a 47,XX,+21 [7]/46,XX [200] a u jedné mozaiku s nadbytečným markerovým chromosomem – 47,XX,+mar [3]/46,XX [97]. Jedna žena měla karyotyp 47,XXX. Ze strukturních aberací byly nalezeny translokace a inverze (tab. 5) celkem u 23 vyšetřených. Nositelkami reciproké translokace byly tři ženy – 46,XX,t(2;8)(q35;q13) (obr. 4), 46,XX,t(5;12)(q33.1;p13) (obr. 6) a 46,XX,t(14;22)(q32.1;q13.1) (obr. 8). Všechny tyto translokace byly potvrzeny metodou FISH (obr. 5; obr. 7; obr. 9). Robertsonovské translokace jsme nalezli u tří pacientek – u dvou to byla translokace mezi chromosomy 13 a 14 – 45,XX,der(13;14)(q10;q10) (obr. 10) a u jedné se spojily oba chromosomy 21 – 45,XX,der(21;21)(q10;q10) (obr. 11). Inverze jsme objevili u 17 žen, pericentrické – 46,XX,inv(2)(p11.1;q12) (obr. 12), 46,XX,inv(5)(p13;q13) (obr. 13) a inv(9)(p11;q13)

u

13

žen.

Paracentrické

inverze

nesly

dvě

pacientky

–

46,XX,inv(4)(q12;q27) (obr. 14) a 46,XX,inv(6)(p21.1;p12.1) (obr. 15)

Tab. 5 – Strukturní aberace nalezené u vyšetřených žen

23

Obr. 5 – Reciproká translokace 46,XX,t(2;8)(q35;q13)

Obr. 6 – Translokace 46,XX,t(2;8)(q35;q13) potvrzená metodou FISH

Červeně: celochromosomová sonda na chromosom 2; zeleně: celochromosomová sonda na chromosom 8

24

Obr. 6 – Reciproká translokace 46,XX,t(5;12)(q33.1;p13)

Obr. 7 – Translokace 46,XX,t(5;12)(q33.1;p13) potvrzená metodou FISH

Červeně: celochromosomová sonda na chromosom 5; zeleně: celochromosomová sonda na chromosom 12

25

Obr. 8 – Reciproká translokace 46,XX,t(14;22)(q32.1;q13.1)

Obr. 9 – Translokace 46,XX,t(14;22)(q32.1;q13.1) potvrzená metodou FISH

Červeně: celochromosomová sonda na chromosom 21; zeleně: celochromosomová sonda na chromosom 14

26

Obr. 10 – Robertsonovská translokace 45,XX,der(13;14)(q10;q10)

Obr. 11 – Robertsonovská translokace 45,XX,der(21;21)(q10;q10)

27

Obr. 12 – Pericentrická inverze 46,XX,inv(2)(p11.1,q12)

Obr. 13 – Pericentrická inverze 46,XX,inv(5)(p13;q13)

28

Obr. 14 – Paracentrická inverze 46,XX,inv(4)(q12;q27)

Obr. 15 – Paracentrická inverze 46,XX,inv(6)(p21.1;p12.1)

29

4.1.2 Výsledky vyšetření mužů Ve vyšetřovaném souboru bylo 653 mužů, z nichž 281 (43 %) mělo patologický spermiogram. Normální karyotyp mělo 626, u 12 nelze vyloučit malou mozaiku gonosomů. Numerické aberace byly objeveny celkem u 7 pacientů, jeden muž měl karyotyp typický pro Klinefelterův syndrom – 47,XXY (hodnoceno 200 interfázních jader), jeden muž měl nadbytečný markerový chromosom 47,XY,+mar.ish idic (15ps→15q11: :15q11→15ps) (obr. 16), jehož původ byl zjištěn pomocí C-pruhování a ověřen metodou FISH (obr. 17). Jednalo se o isodicentrický marker tvořený satelity a genově inaktivními oblastmi centromer chromosomu 15. U dalšího muže byla objevena mozaika markerového chromosomu pocházejícího z chromosomu 21 – 47,XY,+mar [58]/46,XY [42] (obr. 18) (zjištěno metodou SKY, potvrzeno metodou FISH – obr. 19). Nejčastěji se opět vyskytla mozaika gonosomů – u dvou mužů 4,5 % 45,X/47,XXY/46,XY, u jednoho 3 % 47,XYY/46,XY a u dalšího 10 % 45,X/46,XY. Ze strukturních aberací (tab. 6) bylo nalezeno 5 reciprokých translokací: 46,XY,t(1;18)(q25;p11.1) 46,XY,t(3;4)(p13;q31.1)

(obr. (obr.

20), 24),

46,XY,t(4;5)(p13;q12) 46,XY,t(7;11)(p21;p14)

(obr. (obr.

22), 26)

a

46,XY,t(5;19)(q15;p12) (obr. 28). První čtyři translokace byly rovněž potvrzeny pomocí metody FISH (obr. 21, obr. 23, obr. 25 a obr. 27). Nositeli Robertsonovské translokace mezi chromosomy 13 a 14 – 45,XY,der(13;14)(q10;q10) (obr. 29) byli dva muži. Pericentrické inverze byly nalezeny u 13 jedinců, 12 z nich mělo inverzi chromosomu 9 – 46,XY,inv(9)(p11;q13) a jeden 46,XY,inv(19)(p13.12;q13.13) (obr. 30).

Tab. 6 – Strukturní aberace nalezené u vyšetřených mužů

30

Obr. 16 – Nadbytečný markerový chromosom pocházející z chromosomu 15 47,XY,+mar.ish idic(15ps→15q11::15q11→15ps)

Obr. 17 – Potvrzení, že markerový chromosom se sestává z centromerických oblastí chromosomu 15, pomocí metody FISH

Červeně: lokusově specifická sonda pro chromosom 15; zeleně: centromerická sonda pro chromosom 15

31

Obr. 18 – Nadbytečný markerový chromosom - G-pruhování

Obr. 19 – Markerový chromosom pocházející z chromosomu 21 (FISH)

Červeně: lokusově specifická sonda pro chromos. 21; zeleně: celochromosomová sonda na chromosom 14

32

Obr. 20 – Reciproká translokace 46,XY,t(1;18)(q25;p11.1)

Obr. 21 – Translokace 46,XY,t(1;18)(q25;p11.1) potvrzená metodou FISH

Červeně: celochromosomová sonda na chromosom 1; zeleně: celochromosomová sonda na chromosom 18

33

Obr. 22 – Reciproká translokace 46,XY,t(4;5)(p13;q12)

Obr. 23 – Potvrzení translokace 46,XY,t(4;5)(p13;q12) metodou FISH

Fialově: celochromosomová sonda na chromosom 5; zeleně: celochromosomová sonda na chromosom 4; 4; růžově: centromerická sonda pro chr. 4

34

Obr. 24 – Reciproká translokace 46,XY,t(3;4)(p13;q31.1)

Obr. 25 – Potvrzení translokace 46,XY,t(3;4)(p13;q31.1) metodou FISH

Červeně: celochromosomová sonda na chromosom 4; zeleně: celochromosomová sonda na chromosom 3

35

Obr. 26 – Reciproká translokace 46,XY,t(7;11)(p21;p14)

Obr. 27 – Potvrzení translokace 46,XY,t(7;11)(p21;p14) metodou FISH

Červeně: celochromosomová sonda na chromosom 11; zeleně: celochromosomová sonda na chromosom 7

36

Obr. 28 – Reciproká translokace 46,XY,t(5;19)(q15;p12)

Obr. 29 – Robertsonovská translokace 45,XY,der(13;14)(q10;q10)

37

Obr. 30 – Pericentrická inverze 46,XY,inv(19)(p13.12;q13.13)

4.2 Získané chromosomové aberace Celkem bylo vyšetřeno 91 žen a 98 mužů, kteří přišli do styku s mutageny. U 33 žen a 42 mužů byl nalezen patologický počet (5 % a více) aberantních buněk (tab. 7).

Tab. 7 – Počet žen a mužů s určitým procentem aberantních lymfocytů

38

4.3 Mikrodelece na chromosomu Y Mikrodelece v oblastech azoospermického faktoru byly zjišťovány u 109 mužů, z nichž 74 trpělo těžkou formou oligoashenoteratozoospermie (OAT) a 29 azoospermií. Delece byly objeveny u 6 pacientů (5 azoospermiků a 1 s OAT), ve 4 případech se jednalo o deleci oblasti AZFc (obr. 31), u jednoho byla deletována oblast AZFb (obr. 31) a jeden muž měl parciální deleci v oblasti AZFb (delece sY134). Obr. 31 – Elektroforetický gel (detekce mikrodelecí na chromosomu Y)

K-............................. negativní kontrola 3 a 7......................... pacient s delecí oblasti AZFb 4 a 8......................... pacient s delecí oblasti AZFc 5 a 9......................... pacient bez delece oblastí AZF, zároveň slouží jako pozitivní kontrola 3............................... multiplex A – chybí produkt sY127 (pro oblast AZFb) 4............................... multiplex A – chybí produkt sY254 (pro oblast AZFc) 5............................... multiplex A – všechny produkty jsou přítomny 7............................... multiplex B – chybí produkt sY134 (pro oblast AZFb) 8............................... multiplex B – chybí produkt sY255 (pro oblast AZFc) 9............................... multiplex B – všechny produkty jsou přítomny 10............................. volná dráha 11............................. žebříček pro určení délky produktů V každém multiplex reakci jsou označeny šipkami 3 detekované oblasti AZF (platí pro celý řádek), nepřítomnost proužku značí deleci. Neoznačené proužky patří kontrolním produktům.

39

4.4 Mutace v genu CFTR 4.4.1 Výsledky vyšetření mužů s patologickým spermiogramem Celkem bylo vyšetřeno 281 mužů s patologickým spermiogramem – 35 azoospermiků,

127

jedinců

s oligoasthenozoospermií,

43

s

OAT,

43

s

asthenozoospermiků,

asthenoteratozoospermií, 6

oligozoospermiků

23 a

4

teratozoospermici. U 236 mužů byla provedena základní mutační analýza na 5 mutací, u 42 základní mutační analýza na 6 mutací a u 3 pacientů byla z důvodu pozitivní rodinné anmnézy provedena rozšířená mutační analýza na 36 mutací (ani u jednoho nebyla žádná ze 36 mutací objevena). Mutace v heterozygotním stavu byla detekována u 14 pacientů, nejčastěji to byla ∆F508 u 10 mužů, dvakrát byla nalezena mutace G542X; dele2,3 a G551D se každá vyskytla u jednoho jedince. Výskyt mutací dle rozdělení podle patologického spermiogramu ukazuje tab. 8.

Tab. 8 – Výskyt mutací genu CFTR u mužů s patologickým spermiogramem

Dále byly u 227 mužů s patologickým spermiogramem vyšetřeny varianty polytymidinového traktu. Variantu 7T/7T mělo 54 jedinců, 7T/9T 47 mužů a 9T/9T měli tři muži. Patologická alela 5T se v heterozygotním stavu vyskytla u 23 pacientů – u 22 v sestavě 5T/7T a u jednoho v sestavě 5T/9T. Při rozdělení podle patologického spermiogramu se alela 5T nacházela u 2 azoospermiků, u 12 pacientů s OAT, u 5 mužů s asthenoteratozoospermií, u 1 s oligoasthenozoospermií a u 3 asthenospermiků.

40

4.4.2 Výsledky vyšetření mužů s normospermií Kvůli pozitivní rodinné anamnéze bylo klinickými genetiky doporučeno vyšetření 116 mužů s normospermií. Byla provedena základní mutační analýza genu CFTR, u žádného z nich nebyla detekována mutace. U 28 mužů byly analyzovány i varianty polytymidinového traktu intronu 8 – 22krát byla nalezena sestava 7T/7T a šestkrát 7T/9T. DNA dalších 9 mužů byla podrobena rozšířené mutační analýze a vyšetření polytymidinových variant z důvodu výskytu patologie genu CFTR u jejich partnerek. Žádná ze 36 mutací ani alela 5T nebyla nalezena.

4.4.3 Výsledky vyšetření žen Kvůli pozitivní rodinné anamnéze bylo klinickými genetiky doporučeno vyšetření i 273

infetilních

žen.

Základní

mutační

analýza

odhalila

6

nositelek

mutací

v heterozygotním stavu – třikrát byla nalezena ∆F508, dvakrát dele2,3 a jednou mutace G542X. U 3 pacientek byla objevena varianta 5T v polytymidinovém traktu intronu 8. U partnerů těchto devíti žen byla provedena rozšířená mutační analýza, ani u jednoho nebyla žádná ze 36 mutací nalezena (viz kapitola 4.4.2). Dále bylo vyšetřeno 29 žen, jejichž partneři jsou nositeli mutace, rozšířenou mutační analýzou a na varianty polytymidinového traktu – 1 žena nesla mutaci 2143delT a jedna alelu 5T v heterozygotním stavu.

4.5 Trombofilní mutace Za oba dva roky bylo na trombofilní mutace vyšetřeno 241 žen s opakovanými samovolnými potraty neznámé příčiny nebo neúspěšnými cykly fertilizace in vitro. Zdravých bylo 181 žen (95 z nich neneslo žádnou mutaci a 86 bylo heterozygotních nositelek mutace v genu pro MTHFR) a u 60 byla nalezena patologie v trombofilních faktorech. Konkrétně 18 žen neslo Leidenskou mutaci v heterozygotním stavu (10 z nich bylo zároveň ještě nositelkami mutace G776T na jedné alele genu pro MTHFR) a dvě ženy byly homozygotkami pro Leidenskou mutaci. Co se týče genu pro protrombin, mutace G20210A byla v heterozygotní sestavě objevena u 6 pacientek, z nichž jedna byla zároveň heterozygotní pro mutaci G776T. Dále bylo nalezeno 32 žen, které byly homozozygotkami pro mutaci G776T. Kombinace patologických mutací byla detekována 41

u dvou žen – jedna nesla v heterozygotním stavu Leidenskou mutaci a navíc byla homozygotní pro mutaci G776T, druhá byla také homozygotka pro mutaci G776T a ještě nesla mutaci G20210A v jedné alele genu pro koagulační faktor II. Kvůli pozitivní rodinné anamnéze bylo vyšetřeno 102 žen. Zdravých bylo 84 pacientek (u 32 nebyla nalezena žádná mutace, 52 bylo heterozygotních pro mutaci G776T). Heterozygotními nositelkami Leidenské mutace bylo 8 žen, přičemž 4 nesly zároveň mutaci v genu pro MTHFR. Heterozygotní pro mutaci G20210A byly dvě pacientky, obě zároveň nesly i mutaci v jedné alele genu pro MTHFR. Homozygotních pro mutaci G776T bylo 8 žen. Pro zátěž v rodu byly trombofilní mutace analyzovány i u 100 mužů, 73 jich bylo zdravých (35 bez mutace, 38 heterozygotů pro mutaci G776T). Mezi 27 nositeli mutací bylo 11 mužů homozygotních pro mutaci G776T, 11 heterozygotů pro Leidenskou mutaci, z nichž 5 neslo zároveň mutaci v jedné alele genu pro MTHFR, 1 homozygot pro Leidenskou mutaci, 1 heterozygot pro mutaci G20210A. U 3 mužů byla nalezena kombinace mutací: 1 muž byl heterozygotní pro všechny hledané mutace – Leidenskou, G20210A i G776T, 1 pacient byl heterozygot pro mutaci v genu pro protrombin a navíc homozygotní pro mutaci G776T a další jedinec nesl Leidenskou mutaci v heterozygotním stavu a k tomu byl homozygotní pro mutaci G776T.

42

5. DISKUSE 5.1 Stanovení karyotypu 5.1.1 Výsledky zahraničních studií Výzkumy probíhají především u párů, které se rozhodly podstoupit fertilizaci in vitro (IVF) pomocí ICSI, což je metoda řešící především problém mužské infertility. Cytogenetická vyšetření partnerek byla proto překvapující – až 50 % všech nalezených abnormálních karyotypů patřilo ženám (van der Ven et al., 1998). Dříve se cytogenetickým vyšetřením podrobovali zpravidla pouze muži, ale tyto výzkumy dokazují, že na straně partnerek je stejné riziko přítomnosti gamety s abnormální genetickou výbavou. Následující výsledky výzkumů ukazují, že ve vyspělých zemích se procenta výskytu chromosomových změn příliš neliší. Mau et al. (1997) zkoumali karyotypy 150 párů před podstoupením in vitro fertilizatice pomocí ICSI. Ve vzorku bylo 76 % párů z Německa a 24 % z jiných evropských států, zejména z Turecka. Analýza spermatu všech 150 mužů prokázala u 4 % z nich normospermii, u 15,3 % mužů 1. a 2. stupeň oligoasthenoteratozoospermie (OAT), u 36,6 % mužů 3. stupeň OAT, u 37,3 % mužů kryptozoospermii a u 6 % mužů azoospermii. Chromosomové abnormality včetně nízkého procenta mozaiky gonosomů byly nalezeny u 12 % mužů a 6 % žen. Mozaiky pohlavních chromosomů se vyskytly u 3,9 % žen a 4,6 % mužů, u většiny se jednalo o nízké procento mozaicismu. Robertsonovská translokace se nacházela u 2,6 % mužů, ve všech případech to byla translokace mezi chromosomy 13 a 14. Reciproké translokace byly nalezeny u dvou žen (1,3 %) a tří mužů (2 %). Inverze byla prokázána u tří osob, kdy u jedné ženy to byla paracentrická inverze na chromosomu 10, u jednoho muže pericentrická inverze na chromosomu 16 a u dalšího muže s 3. stupněm OAT pericentická inverze na chromosomu X. Markerový chromosom se nacházel v karyotypu jednoho muže. Výzkumy německých párů připravujících se na IVF pomocí ICSI proběhly od května 1995 do června 1997 v Centru asistované reprodukce v Düsseldorfu (Scholtes et al., 1998) a od května 1995 do dubna 1998 na univerzitě v Bonnu (Peschka et al., 1999). Scholtes et al. (1998) vyšetřili 1116 mužů a 1164 žen. Celkem byl nalezen patologický karyotyp u 164 osob (7,2 %). Byli objeveni 3 muži (0,3 %) s karyotypem 47,XXY, 3 muži 43

s karyotypem 47,XYY a 1 žena (0,09 %) s karyotypem 47,XXX. Dalších 9 mužů (0,8 %) a 84 žen (7,2 %) mělo mozaiku gonosomů. U 3 mužů (0,003 %) byl přítomen markerový chromosom. Strukturní aberaci mělo 32 mužů (2,9 %), konkrétně bylo nalezeno 11 Robertsonovských translokací (1 %), 9 reciprokých (0,8 %) a 12 inverzí (1,1 %), z nichž 8 bylo inv(9)qh, která není považována za patologii. Mezi ženami bylo objeveno 29 (2,5 %) se strukturními aberacemi - 8 (0,7 %) s reciprokou translokací, 17 (1,5 %) s inverzí [u 12 žen inv(9)qh], 2 (0,2 %) s duplikací, 1 (0,09 %) s delecí chromosomu X a 1 s kruhovým chromosomem X v mozaice. Peschka et al. (1999) zkoumali 781 párů, abnormální karyotyp mělo celkem 204 pacientů (13,1 %), což odpovídá 4,4 % vrozených aberací, 3 % fragilních míst na autosomech a 4 % nízkého procenta mozaiky gonosomů. Z 69 pacientů s vrozenými aberacemi mělo 14 (20,3 %) reciprokou translokaci, 5 (7,2 %) Robertsonovskou translokaci, 6 (8,7 %) inverzi, 1 osoba (1,4 %) markerový chromosom a 35 osob (50,7 %) aberaci pohlavních chromosomů. Pokud jde o srovnání mužů a žen, pak 1,6 % žen mělo abnormality gonosomů, zatímco u mužů to bylo 0,6 %. Abnormality autosomů se našly u 0,9 % žen a 1,3 % mužů. Ze všech vrozených aberací nalezených u 1562 sledovaných pacientů patřilo 56,5 % ženám. Nízké procento mozaiky gonosomů bylo nalezeno u 51 žen (3,3 %) a 11 mužů (0,7 %). Dvě velké studie francouzských párů před podstoupením ICSI provedli Gekas et al. (2001) a Morel et al. (2004). Gekas et al. (2001) studovali ve spolupráci s dvaceti centry asistované reprodukce karyotypy 2196 francouzských mužů a 1012 žen. Bylo nalezeno 183 osob (5,7 %) s abnormálním karyotypem. Z celkového počtu 1012 žen mělo 49 (4,8 %) abnormální karyotyp, mezi 2196 muži to bylo 134 osob (6,1 %). Procenta výskytu chromosomových abnormalit u mužů a žen byla: 1,2 % (n = 27) a 0,7 % (n = 7) reciprokých translokací, 0,8 % (n = 18) a 0,7 % (n = 7) Robertsonovských translokací, 0,1 % (n = 3) a 0,7 % (n = 7) inverzí, 3,3 % (n = 73) a 2,8 % (n = 28) numerických aberací gonosomů a 0,6 % (n = 13) ostatních strukturních aberací, které se vyskytly pouze u mužů, z nichž 9 mělo tyto strukturní aberace na chromosomu Y. Ze 73 mužských pacientů s numerickými aberacemi gonosomů mělo 49 (2,2 %) karyotyp 47,XXY, 7 (0,3 %) karyotyp 47,XYY a 17 (0,8 %) mozaiku. Všech 28 (2,8 %) žen s numerickými aberacemi gonosomů mělo mozaiku, přičemž u 22 (2,2 %) z nich se jednalo o nízké procento mozaiky gonosomů. Po rozdělení mužů do tří skupin podle koncentrace spermií v ejakulátu (normospermici, oligozoospermici a azoospermici) bylo porovnáváno procento žen s abnormálním karyotypem podle toho, do jaké skupiny jejich partneři patřili. Zjistilo se, že nejvyšší výskyt (7,6 %, 21/278) žen s abnormálním karyotypem je v párech, kdy 44

muž má normální koncentraci spermií. Partnerky mužů s oligozoospermií měly chromosomové aberace v 3,8 % případů (28/734), partnerky azoospermiků ve 4,2 % případů (27/639). Morel et al. (2004) vyšetřili 370 žen a 334 mužů v Univerzitní nemocnici v Brestu. 48 žen (13 %) a 9 mužů (2,7 %) mělo abnormální karyotyp. U žen se nejčastěji vyskytly mozaiky gonosomů (43 = 11,6 %), jedna žena (0,3 %) měla karyotyp 47,XXX a čtyři (1,1 %) nesly Robertsonovskou translokaci. Mezi muži byly nejvíce zastoupené translokace - 3 Robertsonovské (0,9 %) a 3 reciproké, jeden pacient (0,3 %) měl markerový chromosom a dva (0,6 %) karyotyp 47,XXY. Pouze muže z párů, které se chystaly podstoupit IVF pomocí ICSI, studovali Dohle et al. (2002) v Nizozemí a Bor et al. (2002) v Dánsku. V prvním výzkumu mělo z celkového počtu 150 mužů 16 (10,6 %) abnormální karyotyp. Numerické aberace pohlavních chromosomů se vyskytly u 9 (6 %) z nich, přičemž karyotyp 47,XXY mělo 6 (4 %) mužů, karyotyp 47,XYY 2 (1,3 %) a v jednom případě byl nalezen markerový chromosom Jako strukturní aberace byly objeveny translokace. U dvou mužů se jednalo o Robertsonovskou translokaci, u čtyř o reciprokou translokaci, kdy u jednoho pacienta to byla translokace Y – autosom, konkrétně t(Y;2). Analýza spermatu u postižených mužů ukázala,

že

3

muži

s Klinefelterovým

syndromem

trpěli

azoospermií

a

3

kryptozoospermií, oba muži s karyotypem 47,XYY trpěli OAT. Všichni pacienti s translokací také trpěli OAT. Ve druhé studii bylo vyšetřeno 400 mužů, u 14 (3,5 %) z nich byl nalezen abnormální karyotyp. Při rozdělení podle počtu spermií výsledky vypadaly takto: mezi 49 azoospermiky byla patologie nalezena u 3 (6,1 %); mezi 149 kryptozoospermiky také u 3 (2 %); mezi 94 pacienty s těžkou formou oligozoospermie rovněž u 3 (3,1 %); mezi 81 oligozoospermiky byla objevena opět u 3 (3,6 %) a mezi 27 muži s normální koncentrací spermií u 2 (7,4 %). Celkově dva muži měli numerickou aberaci - 47,XXY a 47,XYY. Ze strukturních aberací bylo nalezeno 6 Robertsonovských translokací, 2 reciproké, 2 delece (obě se týkaly chromosomu Y) a 2 inverze. Muže s patologickým spermiogramem (60 s azoospermií, 100 s oligozoospermií a 5 s asthenozoospermií) vyšetřili i Pina-Neto et al. (2006) v Brazílii. Abnormální karyotyp mělo 16 z nich (9,7 %); 12 azoospermiků (20 %) a 4 oligozoospermici (4 %). Nejčastěji byl nalezen Klinefelterův syndrom – u 10 pacientů (6,1 %), přičemž 3 z nich měli mozaiku 46,XY/47,XXY. Jeden pacient měl ženský karyotyp 46,XX a další mozaiku 45,X/46,X,del(Y). 3 muži nesli Robertsonovskou translokaci Nutnost sledování karyotypů i u žen potvrzují svými výzkumy van der Ven et al. (1998) a Schreurs et al. (2000). V prvně jmenované studii autoři nalezli mezi 305 45

německými ženami 10 (3,3 %) s abnormálním karyotypem, z nichž 1 žena měla karyotyp 47, XXX, u 2 se vyskytovala reciproká translokace, u 3 Robertsonovská translokace a u 2 žen inverze. Ve druhém výzkumu autoři cytogeneticky vyšetřili 263 belgických žen před fertilizací in vitro pomocí ICSI a našli 6 žen (2,3 %) s abnormálním karyotypem, 2 ženy měly nízké procento mozaiky gonosomů, 3 reciprokou translokaci a 1 žena paracentrickou inverzi. Raziel et al. (2002) poukázali na zvýšený výskyt chromosomových aberací u žen s opakovanými neúspěchy IVF. Mezi 65 izraelskými pacientkami nalezli 10 (15,4 %) s patologickým karyotypem. 6 žen (9,2 %) mělo reciprokou translokaci, 2 (3,1 %) mozaiku gonosomů, jedna deleci (1,5 %) a jedna inverzi (1,5 %). Shrnutí výsledků výše uvedených studií je uvedeno v tab. 9 a 10.

Tab. 9 – Shrnutí výsledků zahraničních studií – vyšetření mužů STÁT

ANAMNÉZA$

POČET

ABNORMÁLNÍ KARYOTYP (%)

STRUKTURNÍ ABERACE (%)*

Mau et al. (1997)

Německo

před ICSI

150

18 (12 %)

9 (50 %)

Scholtes et al. (1998)

Německo

patol. SPG

1116

114 (9,8 %)

32 (28,1%)

Peschka et al. (1998)

Německo

před ICSI

781

41 (5,2 %)#

21 (51,2 %)

Gekas et al. (2001)

Francie

před ICSI

2196

134 (6,1 %)

61 (45,5 %)

Morel et al. (2004)

Francie

před ICSI

334

9 (2,7 %)

6 (66,7 %)

Dohle et al. (2002)

Nizozemí

před ICSI

150

16 (10,6 %)

7 (43,8 %)

Bor et al. (2002)

Dánsko

před ICSI

400

14 (3,5 %)

12 (85,7 %)

Pina-Neto et al. (2006)

Brazílie

patol. SPG

160

16 (9,7 %)

3 (18,8 %)

$ ..........patol. SPG = ve studii pouze muži s patologickým spermiogramem; před ICSI = ve studii muži s patologickým i normálním spermiogramem * .......... procenta udávají podíl strukturních aberací mezi všemi nalezenými aberacemi # .......... nezapočítány fragilní místa a získané chromosomové změny

46

Tab. 10 – Shrnutí výsledků zahraničních studií – vyšetření žen STÁT

ANAMNÉZA

POČET

ABNORMÁLNÍ KARYOTYP (%)

STRUKTURNÍ ABERACE (%)*

Mau et al. (1997)

Německo

před ICSI

150

9 (6 %)

3 (33,3 %)

Scholtes et al. (1998)

Německo

před ICSI

1164

114 (9,8 %)

29 (25,4%)

Peschka et al. (1998)

Německo

před ICSI

781

90 (11,5 %)#

14 (15,6 %)

Gekas et al. (2001)

Francie

před ICSI

1012

49 (4,8 %)

21 (42,9 %)

Morel et al. (2004)

Francie

před ICSI

370

48 (13 %)

4 (8,3 %)

Van der Ven et al. (1998)

Německo

před ICSI

305

10 (3,3 %)

9 (90 %)

Schreurs et al. (2000)

Belgie

před ICSI

264

6 (2,3 %)

4 (66,7 %)

Raziel et al. (2002)

Izrael

neúspěšné IVF

65

10 (15,4 %)$

8 (80 %)

* .......... procenta udávají podíl strukturních aberací mezi všemi nalezenými aberacemi # .......... nezapočítány fragilní místa a získané chromosomové změny $ ..........nezapočítány varianty heterochromatinu ani satelitů, které autoři zahrnuli mezi patologie

5.1.2 Výsledky FN Brno V letech 2005 – 2006 byl karyotyp stanovem u 670 žen a 653 mužů, 565 žen (84,3 %) a 626 mužů (95,8 %) mělo normální karyotyp. Chromosomové aberace byly tedy nalezeny u 105 žen (15,7 %) a 27 mužů (4,2 %) (tab. 11), přičemž u žen převažovaly numerické aberace (většinou mozaika gonosomů) – 82 (78,1 % ze všech nalezených aberací u žen) a u mužů naopak strukturní aberace – 20 (74,1 % ze všech aberací u mužů). Mezi numerické aberace byly započítány 3 a více procentní mozaiky gonosomů a ke strukturním aberacím i pericentrická inverze chromosomu 9 – inv(9)(p11;q13), jež je považována za nepatologickou aberaci bez fenotypového projevu, nicméně u infertilních osob může způsobovat nerovnováhu v meióze a tím zapříčinit vznik nebalancovaných gamet. Zejména u mužů tak může být v různé míře postižena spermatogeneze (Collodel et al., 2006). V případě mozaiek nelze určit zastoupení patologického karyotypu v zárodečných buňkách, a tak stanovit přesné riziko případného postižení potomka. Pacientce s Robertsonovskou translokací der(21;21) bylo vysvětleno, že při dosažení spontánní gravidity je namístě prenatální genetické vyšetření a stanovení karyotypu plodu, neboť její strukturní aberace výrazně zvyšuje riziko narození potomka s Downovým syndromem (jednalo by se o tzn. translokační Downův syndrom). Tyto výsledky korespondují s těmi, které byly prezentovány u infertilních párů v zahraničí (viz. tab. 9 a 10). Lišící se procenta jsou částečně dána nejen různě velkým 47

počtem vyšetřených osob, ale i zvolenými kritérii – zda jsou do studie zahrnuti pouze muži s patologickým spermiogramem, jaké aberace [např. inv(9)(p11;q13)] se považují za patologické. V některých studiích (Raziel et al., 2002) zahrnuli do abnormálních karyotypů i zvětšenou/zmenšenou oblast tvořenou heterochromatinem, nacházejícím se v oblasti centromery převážně u chromosomů 1, 9 a 16 a na dlouhém raménku chromosomu Y (označení qh+/-), anebo zvětšené/zmenšené satelity akrocentrických chromosomů (označení ps+/-). Liší se i hladina mozaicismu gonosomů, od které je považován za numerickou aberaci (obecně je brána hodnota od 3 % aberantních buněk výše). Vzhledem k tomu, že vrozené chromosomové aberace se vyskytují u 0,6 % novorozenců, bylo u vyšetřených žen i mužů nalezeno statisticky významné zvýšení výskytu aberací (na hladině významnosti 0,05).

Tab. 11 – Počty nalezených chromosomových aberací u všech 1323 vyšetřených osob (670 žen a 653 mužů)

5.2 Získané chromosomové aberace Bylo vyšetřeno celkem 189 osob, které přicházejí do kontaktu s mutageny, u 75 (39,7 %) byl nalezen abnormální počet aberantních lymfocytů. Těmto jedincům byla doporučena 3 měsíční vitaminová kúra (vitaminy A, C, E, u žen kyselina listová) a poté kontrolní odběr na získané chromosomové aberace.

48

V zahraničí získané chromosomové změny zkoumali Peschka et al. (1997) u 781 pacientů. Chromosomové nebo chromatidové zlomy, gapy a výměny byly zjištěny u 66 osob (4,2 %). Počet změn na chromosomech v jedné mitóze se pohyboval od jedné do pěti. Za fyziologický byl považován nález do 6 % aberantních buněk.

5.3 Mikrodelece na chromosomu Y 5.3.1 Výsledky zahraničních studií Španělské muže (128) s azoospermií nebo s počtem spermií menším než 2 mil/ml a normálním karyotypem (nebo abnormálním raménkem Yq) vyšetřili Martínez et al. v roce 2000. Pro detekci mikrodelecí použili multiplex PCR a zvolili primery pro tyto STS (Y-linked Sequence Tagged Sites) markery: pro oblast AZFa sY84, sY85 a sY86; pro AZFb sY124 a sY127; pro AZFc sY149 a sY157. Delece byla objevena u celkem 9 mužů (7 %), přičemž u 3 z nich byla „naznačena“ chromosomovou aberací – dicentrickým chromosomem u jednoho pacienta s azoospermií a rozsáhlou delecí Yq u dvou pacientů s azoospermií. Tito 3 muži s chromosomovou aberací a jeden s normálním karyotypem měli deleci 2 oblastí – AZFb i AZFc. U jednoho pacienta s azoospermií byla nalezena delece AZFb a u zbylých 5 (4 azoospermičtí a 1 kryptozoospermický) byla objevena delece oblasti AZFc. Krausz et al. (1999) zkoumali mikrodelece u 134 italských mužů před podstoupením ICSI pomocí 6 základních STS markerů (AZFa – sY84, AZFb – sY131, sY134, AZFc – sY152, sY157 a sY158). Tito pacienti byli dále rozděleni do skupin podle vyšetření spermiogramu - 4 s normospermií, 13 s astenozoospermií, 27 s oligozoospermií, 26 s těžkou formou oligozoospermie, 42 s kryptozoospermií a 22 s azoospermií. Delece byla nalezena u 3 pacientů (2 kryptozoospermici a 1 azoospermik), což z celkového počtu vyšetřených činí 2,2 %, vztáhne-li se to pouze na jedince s těžkým postižením spermatogeneze (90 mužů), u kterých je toto vyšetření vždy indikováno, dostaneme číslo 3,3 %. U všech 3 pacientů byla deletována oblast AZFc a po rozšířené analýze (přidány markery sY114, sY116, sY125, sY129, sY139, sY254 a sY255) byla u jednoho z nich nalezena ještě částečná delece v oblasti AZFb a u dalšího částečné delece v oblasti AZFb i AZFa. Dada

et

al.

(2003)

provedli

v

Indii

vyšetření

83

azoospermických

a

oligozoospermických mužů s normálním karyotypem. Pro detekci mikrodelecí zvolili 6 základních primerů (AZFa: sY84 a sY86; AZFb: sY127 a sY134; AZFc: sY254 a sY255). Mikrodelece byla zachycena u 8 pacientů (9,6 %) – 4 muži měli deletovanou oblast AZFc, 1 49

oblast AZFb, u 2 byly deletovány 2 oblasti – AZFa a AZFb a jeden muž měl deleci AZFa a parciální deleci oblasti AZFb. Za použití 25 primerů pro STS markery (AZFa: sY84; AZFb: sY117, sY164, sY132, sY138, sY139, RBM1, sY143; AZFc: sY144, sY150, sY152, sY153, sY155, sY255, sY254, SPGY, sY277, sY243, sY269, sY158, sY272, sY273, sY166, sY160; kontrolní – SRY) vyšetřili Bor et al. (2002) 400 dánských pacientů. Při rozdělení do skupin podle koncentrace spermií bylo 49 azoospermiků, 149 kryptozoospermiků, 175 oligozoospermiků (94 s těžkou formou) a 27 normospermiků. Delece byla nalezena u 3 mužů (dva s kryptozoospermií a jeden s azoospermií), což z celkového počtu vyšetřených činí 0,8 %, vztáhne-li se to pouze na jedince s těžkým postižením spermatogeneze (198 mužů), u kterých je toto vyšetření vždy indikováno, dostaneme číslo 1,5 %. Všichni muži měli deleci oblasti AZFc, jeden z nich navíc ještě deleci AZFb. Hellani et al. (2006) vyšetřovali mikrodelece u 247 mužů s azoospermií nebo oligozoospermií, kteří měli normální karyotyp, v Saudské Arábii. Použili 19 primerů – AZFa: sY82, sY84, sY87; AZFb: sY125, sY129, sY132, sY134, sY136, sY143, sY130; AZFc: sY153, sY148, sY277, sY279, sY254, sY154, sY157, sY158, sY160. U 8 (3,2 %) pacientů byla detekována delece, 5 z nich mělo deleci oblasti AZFc, 1 parciální deleci (jednoho STS markeru) v oblasti AZFc, 1 muž měl deletovánu oblast AZFb a u jednoho muže byly nalezeny 2 malé delece (po jednom STS markeru) v oblastech AZFa a AZFb. Na přítomnost mikrodelecí na chromosomu Y testovali Dohle et al. (2002) 150 pacientů (37 azoospermiků a 113 mužů s těžkou formou oligozoospermie) v Nizozemí. Pro analýzu vybrali tyto primery: DYS148 a DYS273 (AZFa); DYS218 a DYS224 (AZFb); sY254 a sY255 (AZFc). U 5 mužů s těžkou formou oligozoospermie a 3 azoospermiků (5,3 %) byla nalezena delece oblasti AZFc. Shrnutí výše uvedených výsledků jednotlivých studií je v tab. 12.

50

Tab. 12 – Výsledky zahraničních studií mikrodelecí chromosomu Y

* ................... uvedeni pouze muži s těžkou patologií SPG, u kterých je vyšetření běžně indikováno Az.................. azoospermie Ol................... oligozoospermie Ol<5mil/ml.... těžká forma oligozoospermie (koncentrace spermií pod 5 milionů/ml) AZFa(parc.)... parciální delece oblasti AZFa

5.3.2 Výsledky FN Brno Mikrodelece na chromosomu Y byly vyšetřeny u 109 mužů s azoospermií nebo těžkou formou OAT (tab. 13). U 6 pacientů (5,5 %) byly tyto delece objeveny, nejčastěji byla deletována oblast AZFc a to u 2/3 vyšetřených (4) a dále se vyskytly u jednoho muže delece oblasti AZFb a u dalšího parciální delece (sY134) oblasti AZFb. Tyto výsledky se shodují s výsledky jiných studií, kde u pacientů také byla nejčastěji deletována oblast AZFc a procento mužů s delecí se pohybovalo mezi 1,5 – 9,6 % (viz. tab. 12). Pokud by partnerky těchto 6 mužů s nalezenou mikrodelecí chromosomu Y podstoupily fertilizaci in vitro pomocí metody ICSI, která překonává přirozené bariéry při početí, všichni jejich potencionální synové by také nesli tuto mikrodeleci, a tudíž by 51

zdědili i stejné reprodukční potíže. Těmto párům byla proto nabídnuta možnost preimplantační genetické diagnostiky, kdy by pro implantaci do dělohy byla vybrána pouze embrya ženského pohlaví.

Tab. 13 – Výsledky vyšetření mužů na mikrodelece chromosomu Y

* ..........procento počítáno pouze z mužů s konkrétním spermiogramem, nikoliv ze všech vyšetřených # ..........podíl jednotlivých delecí z celkového počtu nalezených delecí

5.4 Mutace v genu CFTR 5.4.1 Výsledky zahraničních studií Stuppia et al. (2005) studovali mutace genu CFTR u 1195 infertilních osob ve čtyřech italských centrech asistované reprodukce. U 304 párů byla příčinou neplodnosti neobstrukční azoospermie nebo oligozoospermie, u 16 obstrukční azoospermie (CBAVD), u 93 to byla příčina na straně ženy a u zbylých 782 párů byla příčina neznámá. Z párů, u nichž byl faktor neplodnosti znám, byl testován partner nesoucí tento faktor, z 782 párů s nejasnou etiologií byl vždy náhodně vybrán a otestován jeden z partnerů. Celkem tedy bylo vyšetřeno 721 žen a 474 mužů. Byl proveden skríning na 29 nejfrekventovanějších mutací v italské populaci. Z mutací byla nejčastější ∆F508, nalezená u 40 pacientů (3,3 %). Dále byla nalezena u 7 osob (0,6 %) W1282X, G542X u 6 osob (0,5 %), N1303K a G85E, každá u 3 osob (0,3 %), 1717-1G→A a 2789+5G→A, každá u jedné osoby (0,1 %). U 78 testovaných osob (6,5 %) byla objevena mutantní alela 5T. Larriba et al. (2005) podrobili 47 španělských mužů s neobstrukční azoospermií a 36 s těžkou formou oligozoospermie kompletnímu skríningu na mutace genu CFTR a varianty polytymidinového traktu intronu 8. U 5 pacientů (6 %) byla nalezena kauzální 52

mutace (2x ∆F508, 1x R117H, 1x R334W a 1x I148T), u 22 (26,5 %) mužů byly nalezeny sekvence, které jsou spojovány s fenotypy příbuznými s CF, a u 3 (3,6 %) byly nalezeny sekvence, jež zatím nebyly zařazeny do předchozích kategorií. Dalších 5 jedinců (6 %) neslo mutantní variantu 5T v intronu 8. Na 12 nejčastějších mutací (∆F508, A445E, G542X, 1717-1G→A, R553X, R1162X, R117H, N1303K, W1282X, 3659delC, E60X a S1251N) bylo v Nizozemí vyšetřeno 150 mužů před podstoupením ICSI s koncentrací spermií méně než 1 mil/ml (Dohle et al., 2002). Mutace byly nalezeny u 14 pacientů (9,3 %). Z 37 azoospermiků neslo mutaci 9 (24,3 %), přičemž u 4 z nich byla asociována s CBAVD. Jeden pacient s CBAVD měl dvě mutace v genu CFTR (∆F508/R117H), další 2 měli jednu mutaci a zároveň alelu 5T. Ze 113 mužů s OAT neslo mutaci 5 (4,4 %). Nejfrekventovanější byla mutace ∆F508 u 9 pacientů, dále R117H u 4, E60X a A445E, každá u jednoho muže. Mak et al. (2000) provedli kompletní skríning genu CFTR u 45 mužů s neobstrukční azoospermií na Andrologické klinice v Torontu. Pouze u jednoho (2,2 %) muže (byl zakavkazského původu) byla objevena mutace v tomto genu - konkrétně se jednalo o mutaci ∆F508. Dále byla u 5 pacientů (11,1 %) nalezena mutantní alela 5T v intronu 8 (u čtyř v sestavě 5T/7T a u jednoho 5T/9T). Přítomnost devíti mutací genu CFTR a polytymidinové varianty intronu 8 zkoumali u 25 azoospermických mužů s diagnostikovanou CBAVD Phillipson et al. (2000) na Novém Zélandu a v Austrálii. 5 mužů (20 %) bylo složených heterozygotů ∆F508/R117H (kombinace závažnější – ∆F508 a méně závažné - R117H mutace nemusí vést k onemocnění cystickou fibrózou, ale pouze ke CBAVD), 9 mužů (36 %) mělo mutaci ∆F508, 4 další nesli tutéž mutaci a navíc ještě variantu 5T v intronu 8. Mutace R117H a R117C se každá objevila u jednoho muže (4 %). Celkem tedy byla objevena mutace u 20 pacientů (80 %) se CBAVD. Schulz et al. (2006) vyšetřili 597 německých mužů s patologickým spermiogramem. Z 9 vyšetřovaných mutací byly nalezeny 3 – ∆F508 u 26 mužů (4,4 %), R117H u 5 mužů (0,8 %) a dele2,3 u 3 mužů (0,5 %). Celkem tedy mělo mutaci 5,7 % vyšetřených jedinců. Při rozdělení nálezu podle patologického spermiogramu mužů nesl mutaci 1 ze 13 oligozoospermiků (7,7 %) (∆F508), 5 ze 39 pacientů s asthenozoospermií (12,8 %) (5x ∆F508), žádný ze 7 asthenoteratozoospermiků, 7 ze 138 mužů s oligoasthenozoospermií (5,1 %) (5x ∆F508, 2x R117H), 13 z 280 pacientů s OAT (4,6 %) (9x ∆F508, 2x R117H a 2x dele2,3), 1 z 51 kryptozoospermiků (2 %) (1x dele2,3), 7 ze 67 azoospermiků (10,4 %)

53

(6x ∆F508 a 1x R117H), přičemž 3 muži s azoospermií nesli zároveň mutaci i alelu 5T, ta byla celkově nalezena u 40 pacientů (6,7 %). V Itálii byla provedena velká studie u 867 infertilních mužů a 987 infertilních žen (Morea et al., 2005). Byli vyšetřeni na přítomnost 48 mutací v genu CFTR a na polytymidinové varianty IVS8. Celkem u 49 mužů (6,1 %), přičemž 2 trpící CBAVD byli složení heterozygoti – ∆F508/R117H a R1162X/2789+5G→A, a u 36 žen (3,6 %) bylo nalezeno 20 různých mutací, z nichž nejčastější byla ∆F508 (u 26 mužů – 3 % a 16 žen – 1,6 %), druhá nejčastější byla R1162X (u 6 mužů – 0,7 % a 2 žen – 0,2 %) a na třetím místě byla 2183AA→G (u 4 mužů - 0,5 % a 1 ženy - 0,1 %). Co se týče variant T(n) traktu, 13 mužů (1,5 %) neslo zároveň mutaci i alelu 5T. Tato alela tedy byla detekována u 67 mužů (7,7 %) a 66 žen (6,7 %). Shrnutí výše uvedených výsledků zaraničních studií je uvedeno v tab. 14. Tab. 14 – Shrnutí výsledků zahraničních studií mutací genu CFTR

* ...........SPG/DG – spermiogram/diagnóza gynek. příč. – infertilita páru je způsobena gynekologickým problémem inf. bez příč. – infertilita párů je nejasné etiologie OAT<1mil/ml – OAT s koncentrací spermií méně než 1 milion/ml patol. – ve studii zahrnuti muži s různými patologickými spermiogramy #...........varianty polyT intronu 8 vyšetřeny jen u 14 mužů s mutací

54

5.4.2 Výsledky FN Brno Bylo vyšetřeno 281 mužů s patologickým spermiogramem a bylo nalezeno 14 (5 %) nositelů mutace v heterozygotním stavu. Nějčastěji byla detekována mutace ∆F508 – u 10 pacientů (71,4 % ze všech detekovaných mutací u mužů s patologickým spermiogramem) a dále byly nalezeny: 2x G542X (14,2 %), 1x G551D (7,1 %) a 1x delece exonů 2 a 3 (7,1 %). U 227 z těchto mužů byly stanoveny i polytymidinové varianty intronu 8 a u 24 (10,6 %) mužů byla v heterozygotní sestavě nalezena patologická alela 5T. Celkem byla nalezena patologie v genu CFTR u 38 pacientů, u 29 partnerek těchto mužů byla proto provedena rozšířená mutační analýza a vyšetření polyT variant. U 2 žen byla objevena patologie – jedna nesla mutaci 2143delT (u partnera 5T) a jedna alelu 5T v heterozygotním stavu (u partnera ∆F508). V souboru se tedy nacházely dva infertilní páry, v nichž oba partneři byli nositeli patologie v genu CFTR. Tyto páry byly seznámeny s tím, že při graviditě partnerky je vhodná prenatální genetická diagnostika, kde by po izolaci DNA plodu byly cíleně hledány mutace obou rodičů. Vyšetření

mužů

s

patologickým

spermiogramem

odpovídají

výsledkům

zahraničních studií, kde se procento mužů (nezapočítáni pacienti s diagnostikovanou CBAVD) s nalezenou mutací pohybovalo mezi 2,2 – 9,3 %, přičemž v souboru našich pacientů to bylo 5 %, a procento jedinců s alelou 5T mezi 6 – 11,1 %, 10,6 % námi vyšetřených mužů. Dále bylo kvůli pozitivní rodinné anamnéze vyšetřeno 116 mužů s normospermií a 273 žen, u mužů nebyla mutace nalezena. U žen bylo objeveno 6 nositelek (2,2 %) mutace a 3 ženy (1,1 %) s variantou 5T. U partnerů těchto žen byla provedena rozšířená mutační analýza a vyšetření polyT variant, žádné patologie nebyly detekovány. V ČR je výskyt CF u novorozenců 1 : 3000, přenašečem mutace (v exonu) je přibližně každý 26. obyvatel, frekvence heterozygotů v naší populaci je tedy 3,8 %. U mužů s patologickym spermiogramem je výskyt heterozygotů 5 %, což je 1,3krát více než v běžné populaci. Shrnutí vyšetření párů na mutace a varianty polytymidinového traktu intronu 8 genu CFTR je uvedeno v tab. 15.

55

Tab. 15 – Výsledky vyšetření párů na mutace a varianty polyT intronu 8 genu CFTR

* ...........procenta vypočítána z 227 vyšetřených mužů

5.5 Vyšetření trombofilních mutací 5.5.1 Výsledky zahraničních studií Behjati et al. (2006) zkoumali výskyt trombofilních mutací u íránských žen. V souboru bylo 36 žen s nejasnou příčinou infertility, 65 žen s opakovanými spontánními potraty a 62 zdravých fertilních žen (kontrola). Leidenská mutace byla objevena u 11 (30,6 %) infertilních žen, u 13 žen (20 %) s opakovanými aborty a u žádné ženy z kontrolní skupiny. Byl tedy nalezen statisticky významný rozdíl mezi kontrolní skupinou a oběma skupinami dysfertilních žen. Mutace v genu pro MTHFR (C667T) byla nalezena u 18 (50 %) infertilních žen, u 41 žen (63,1 %) s opakovanými potraty a u 24 (38,7 %) fertilních žen. Spojitost byla potvrzena mezi mutací C667T a opakovanými potraty a nebyla potvrzena mezi touto mutací a neplodností. Jedna infertilní žena (2,8 %), 3 (4,6 %) s opakovanými potraty a 2 ženy (3,2 %) z kontrolní skupiny měly mutaci v genu pro protrombin. Ani u jedné ze studovaných skupin nebyla nalezena spojitost mezi touto mutací G20210A a daným problémem. Sto osm izraelských pacientek s opakovanými potraty nejasné příčiny a 82 fertilních žen jako kontrolu vyšetřili Carp et al. (2002). 4 ženy (3,7 %) s opakovanými potraty a 5 fertilních žen (6,1 %) bylo nositelkami Leidenské mutace. U 5 žen (4,6 %) s opakovanými aborty a u stejného počtu (6,1 %) plodných žen byla nalezena mutace G20210A. Mutace v genu pro MTHFR byla objevena u 14 žen (12,9 %) s opakovanými potraty a u 7 (8,5 %)

56

fertilních žen. Ani u jedné ze tří zjišťovaných trombofilních mutací nebyla prokázána spojitost s opakovanými potraty. Výskyt Leidenské mutace a mutace G20210A zkoumali Finan et al. (2002) u 110 libanonských žen s opakovanými potraty a u 67 plodných žen (kontrola). 45 žen (40,1 %) s opakovanými potraty neslo Leidenskou mutaci, přičemž 38 bylo heterozygotek a 7 homozygotek, mezi kontrolními ženami bylo 11 heterozygotek (16,4 %) pro Leidenskou mutaci. Mutace v genu pro protrombin byla zaznamenána u 15 žen (13,6 %) s opakovanými potraty a u 2 žen (3 %) bez problémů. Mezi výskytem obou dvou mutací ve studované a kontrolní skupině byl zaznamenán statisticky významný rozdíl a potvrzena spojitost mezi nimi a opakovanými aborty. Sottilotta et al. (2006) vyšetřili v Itálii 55 žen s opakovanými potraty, 47 žen, kterým se narodilo mrtvé dítě, a 217 fertilních žen jako kontrolu. Mezi ženami s opakovanými potraty bylo 5 nositelek (9,1 %) Leidenské mutace a 5 nositelek (9,1 %) mutace G20210A. Mezi ženami s mrtvě rozeným dítětem neslo 11 (23,4 %) Leidenskou mutaci a 9 (19,1 %) mutaci v genu pro protrombin. Při porovnání výsledků kontrolní skupiny a žen s opakovanými potraty nebyl nalezen statisticky významný rozdíl výskytu uvedených mutací, naopak u žen, kterým se narodilo mrtvé dítě, byl prokázán vztah mezi nosičstvím Leidenské mutace i mutace G20210A a jejich diagnózou. Brazilské ženy s opakovanými potraty podrobili vyšetření na Leidenskou mutaci a mutace genu pro protrombin Souza et al. (1999). V souboru bylo 56 žen s opakovanými aborty a 384 plodných žen bez problémů (kontrola). U 4 žen (7,1 %) s opakovanými potraty a u 6 (1,6 %) z kontrolní skupiny byla nalezena Leidenská mutace. Mutace G20210A byla objevena u 2 studovaných žen (3,6 %) a u 4 žen z kontrolní skupiny (1 %). U Leidenské mutace i u mutace G20210A byla statisticky potvrzena spojitost s opakovanými aborty nejasné příčiny. Frekvenci trombofilních mutací u 80 řeckých žen s opakovanými potraty a u 100 žen bez reprodukčních potíží zkoumali Foka et al. (2000). Mezi studovanými ženami byla Leidenská mutace objevena u 15 (18,8 %) a mezi ženami z kontrolní skupiny u 4 (4 %). Mutaci v genu pro protrombin neslo 7 žen (8,8 %) s opakovanými potraty a 2 (2 %) fertilní ženy. Homozygotní pro mutaci C667T bylo 6 žen (7,5 %) ze studované skupiny a 15 (15 %) z kontrolní skupiny. Statisticky byla prokázána spojitost mezi opakovanými spontánními aborty a Leidenskou mutací i mutací G20210A, ale nebyla prokázána u mutace v genu pro MTHFR.

57

Azem et al. (2004) vyšetřili 45 izraelských žen, které bez úspěchu podstoupily 4 a více cyklů fertilizace in vitro, a porovnávali je se 44 plodnými ženami stejného věku a etnika. Leidenská mutace byla objevena u 3 (6,7 %) studovaných žen a rovněž u 3 (6,8 %) kontrolních žen. Mutaci G20210A nesly 4 ženy (8,9 %) ze studované skupiny a 1 (2,3 %) z kontrolní skupiny. Homozygotek pro mutaci v genu pro MTHFR bylo mezi studovanými ženami 8 (17,8 %) a v kontrolní skupině 4 (9,1 %). Byla prokázána souvislost neúspěchů IVF a mutací G20210A a C667T, souvislost neúspěchů IVF a Leidenské mutace se nepotvrdila. Čtyři kolektivy autorů potvrdily souvislost Leidenské mutace a opakovaných samovolných potratů v souboru svých pacientek, naopak tři kolektivy tento vztah nezaznamenaly. Také čtyři týmy vědců potvrdily a tři týmy vyvrátily souvislost mezi mutací G20210A v genu pro protrombin a opakovanými spontánními aborty. Mutaci v genu pro MTHFR jako příčinu opakovaných potratů uvádějí 2 ze 4 kolektivů autorů, kteří tuto mutaci u žen zkoumali. Shrnutí těchto výsledků je uvedeno v tab. 16.

Tab. 16 – Shrnutí výsledků zahraničních studií detekce trombofilních mutací

op. SA...... ženy s opakovanými potraty FVL.......... Leidenská mutace P............... souvislost mezi danou mutací a diagnózou byla prokázána N...............souvislost mezi danou mutací a diagnózou nebyla prokázána

58

5.5.2 Výsledky FN Brno Ve FN Brno bylo na mutace v tromboembolických faktorech vyšetřeno 241 žen se spontánními aborty a neúspěšnými cykly fertilizace in vitro. 60 pacientek (24,9 %) neslo jednu nebo více mutací trombofilních faktrorů (tab. 17). Vzhledem k tomu, že tromboembolické stavy jsou jednou z nejčastějších příčin úmrtí v ČR, bylo vyšetřeno také 102 infertilních žen a 100 mužů s pozitivní rodinnou nebo osobní anamnézou (křečové žíly, tromboembolie, infarkty aj.). Mezi ženami bylo nalezeno 18 (17,6 %) nositelek mutace, mužů s detekovanou trombofilní mutací bylo 27 (27 %) (tab. 17). Osobám, u nichž byla nalezena některá z trombofilních mutací, bylo doporučeno podrobné vyšetření a sledování (dispenzarizace) na hematologii a navrženo i vyšetření blízkých příbuzných. U žen s mutacemi může individuálně volená terapie kyselinou listovou, komplexem vitaminů B a antikoagulačními léky přispět k otěhotnění a donošení plodu (Macek et al., 2002). Výsledky zahraničních studií jsou rozdílné v tom, že někteří autoři nalezli spojitost mezi opakovanými potraty a neúspěchy při IVF a trombofilními mutacemi a jiní nenalezli. Různí se i to, které konkrétní mutace jsou za to zodpovědné. V rámci výzkumu autoři vždy vyšetřili zároveň kontrolní skupinu fertilních žen a vypočítali, zda se počty nalezených mutací mezi oběma skupinami statisticky významně liší. Tak mohli určit, zda je v jejich souboru žen spojitost mezi danou mutací a spontánními aborty (případně neúspěchy fertilizaci in vitro), nebo není. V práci Macka et al. (2002) je jako kontrolní skupina vyšetřeno 436 osob na Leidenskou mutaci, 130 osob na mutaci G20210A a 204 osob na mutaci v genu pro MTHFR. Nositelů Leidenské mutace bylo 5,7 %, nositelů mutace G20210A 2,3 % a nositelů mutace C667T 38,2 %. Pokud bychom brali tato čísla jako běžná pro populaci ČR, u námi vyšetřených žen nebyla neprokázána spojitost mezi opakovanými spontánními potraty, neúspěšnými cykly IVF a třemi zkoumanými trombofilními mutacemi (na hladině významnosti 0,05). Všech získané výsledky jsou uvedeny v tab. 17.

59

Tab. 17 – Výsledky vyšetření trombofilních mutací u infertilních žen a mužů

* ................ Het. – heterozygoti pro Leidenskou mutaci ..................Hom. – homozygoti pro Leidenskou mutaci PR Het........ heterozygoti pro mutaci G20210A (gen pro protrombin) MT Hom..... homozygoti pro mutaci C667T (gen pro MTHFR) KOMB........ osoby nesoucí více mutací

5.6 Shrnutí všech výsledků FN Brno Celkem byla genetická příčina neplodnosti nalezena u 198 žen (započítány ženy s abnormálním karyotypem, s patologickou hladinou získaných aberací a ženy s opakovanými potraty nebo neúspěchy při IVF, u kterých byla objevena trombofilní mutace) a 113 mužů (započítáni jedinci s abnormálním karyotypem, s patologickou hladinou získaných aberací, muži s patologickým SPG, u kterých byla detekována mutace v genu CFTR nebo alela 5T, a muži s mikrodelecí chromosomu Y). Ve 3 infertilních párech měli oba partneři abnormální karyotyp (tab. 18), u 31 osob bylo nalezeno více genetických změn (u žen započítány i mutace v genu CFTR a u mužů také trombofilní mutace) (tab. 19 a 20).

Tab. 18 – Patologické karyotypy obou partnerů

60

Tab. 19 – Muži se dvěma genetickými změnami

Tab. 20 – Ženy se dvěma genetickými změnami

61

6. ZÁVĚR Infertilita způsobená různými příčinami postihuje ve vyspělých zemích včetně České republiky přibližně 15 % párů. Nejčastěji jsou na vině gynekologické, andrologické a hormonální faktory. Počátkem 90. let se vědci začali více zabývat genetickými faktory jako možným příčinám infertility. Ve FN Brno bylo od ledna 2005 do prosince 2006 v rámci rutinní genetické diagnostiky provedeno vyšetření stovek neplodných párů, konkrétně 670 žen a 653 mužů. U všech osob byl jako základní vyšetření stanoven karyotyp a dle klinického stavu pacientů a jejich osobní či rodinné anamnézy byly zvoleny další postupy – vyšetření mutací genu CFTR, mikrodelecí na chromosomu Y, trombofilních mutací a získaných chromosomových aberací. Genetická příčina neplodnosti byla odhalena u 198 žen a 113 mužů. Abnormální karyotyp mělo 105 žen (15,7 %), u nichž byla nejčastěji detekována mozaika gonosomů (78 případů), a 27 mužů (4,2 %), u nichž naopak převládaly strukturní aberace (20 případů). U osob, které přicházejí do kontaktu s mutageny (rizikové povolání, onkologická léčba), byly zjišťovány získané chromosomové aberace. Patologická hladina (5 % a více) aberantních lymfocytů byla nalezena u 33 žen (36,3 %) a 42 mužů (42,9 %). Pacienti s těžkým postižením spermatogeneze nebo úplnou nepřítomností spermií v ejakulátu byli vyšetřeni na mikrodelece oblastí azoospermického faktoru na chromosomu Y. Celkem u 6 mužů (5,5 %) byla nalezena delece, nejčastěji oblasti AZFc (ve 4 případech). Také u mužů s patologickým spermiogramem byly vyšetřeny mutace genu CFTR a polytymidinové varianty intronu 8 tohoto genu. Některou z mutací v heterozygotním stavu neslo 14 mužů (5 %), u 10 z nich se jednalo o nejrozšířenější mutaci ∆F508. Patologická alela 5T taktéž v heterozygotním stavu byla objevena u 24 mužů (10,6 %). U žen s opakovanými samovolnými potraty nebo neúspěšnými cykly fertilizace in vitro byly analyzovány tzv. trombofilní mutace. Leidenskou mutaci hemokoagulačního faktoru V neslo 20 žen (8,3 %), mutaci G20210A v genu pro protrombin (srážecí faktor II) 6 žen (2,5 %) a mutace C667T v genu pro MTHFR v homozygotním stavu byla objevena u 32 pacientek (13,3 %). Všechny získané výsledky korespondují s vědeckými poznatky publikovanými v zahraničí. Hlavním přínosem této diagnostiky je možnost zvolit individuální přístup k léčbě sledovaných párů, který ve svém důsledku může zvýšit efektivitu léčby neplodnosti a

62

snížit riziko narození postiženého potomka. Zároveň tyto poznatky mohou přispět k vývoji nových terapeutických metod.

63

7. SUMMARY Complex genetic screening of couples with fertility failure In developed countries including the Czech Republic approximately 15 % of couples suffer from infertility which may be caused by different factors. These factors can be gynecological, andrological, and hormonal. In the early 90’s scientists begun to study genetic factors as another possible cause of infertility. At the Faculty Hospital in Brno between January 2005 and December 2006 hundreds of infertile couples underwent a routine genetic diagnostic evaluattion, precisely 670 women and 653 men. Every person had its karyotype examined as a basic test. The choice of following procedures was based on the clinical state of the patient and his/her family anamnesis. These procedures include CFTR mutation test, Y-linked microdeletion test, trombophilic mutations test, and secondary chromosomal aberrations diagnostics. These procedures revealed that 198 women and 113 men with a genetic factor causing infertility. An abnormal karyotype was found in 105 women (15.7 %) and the most frequent subtype was gonosomal mosaicism (78 cases). Among men, 27 patients (4.2 %) had abnormal karyotype and the structural aberrations were prevalent (20 cases). The patients who come in contact with mutagens (high-risk occupation, oncological treatment) were investigated for chromosomal aberrations. Pathological numbers (5 % and more) of aberrant metaphases were observed in 33 women (36.3 %) and 42 men (42.9 %). Patients afflicted with severe spermatogenesis disorder or the complete absence of sperms in ejaculate were examined for the azoospermic factor Y-linked microdeletions. A deletion was found in 6 men (5.5 %). The most prevalent deletion was AZFc which was found in 4 cases. Also the men with pathological spermiogram were screened for CFTR mutations and intron 8 polythimidine variants of this gene. 14 men (5 %) carried one copy of a pathological mutation and the most common ∆F508 mutation was identified in 10 of them. Pathological allele 5T also in heterozygous state was found in 24 men (10.6 %). Women with recurrent spontaneous abortions or unsuccessful cycles of in vitro fertilization were screened for trombophilic mutations. 24 women (8,3 %) carried Leiden mutation of hemocoagulation factor V, 6 women (2.5 %) carried mutation G20210A in the prothrombin-coding region (coagulation factor II), and 32 female patients (13.3 %) had C667T mutation in MTHFR gene in heterozygous state. These results correspond to the scientific data published abroad.

64

The main contribution of these diagnostical methods is the possibility of individual treatment of each patient and it also lowers the risk of birth of handicapped child. Furthermore, these results may contribute to the development of new diagnostical methods.

65

8. LITERATURA


Abir R., Fisch B., Nahum R., Orvieto R., Nitke S., Ben Rafael Z. 2001. Turner's syndrome and fertility: current status and possible putative prospects. Hum. Reprod. Update 7 (6): 603-610.




Antonelli A., Gandini L., Petrinelli P., Marcucci L., Elli R., Lombardo F., Dondero F. and Lenzi A. 2000. Chromosomal alterations and male infertility. J Endocrinol Invest. 23 (10): 677-683.




Aydos S. E. and Tőkőn A. 2006. Infertility in a man with oligoasthenoteratozoospermia associated with nonrobertsonian translocation t(9;15)(p10;q10). Fertil Steril. 86 (4): 10011009.




Azem F., Many A., Ben Ami I., Yovel I., Amit A., Lessing J. B. and Kupferminc M. J. 2004. Increased rates of thrombophilia in women with repeated IVF failures. Hum Reprod. 19 (2): 368-370.




Behjati R., Modarressi M. H., Jeddi-Tehrani M., Dokoohaki P., Ghasemi J., Zarnani A. H., Aarabi M., Memariani T., Ghaffari M. and Akhondi M. A. 2006. Thrombophilic mutations in Iranian patients with infertility and recurrent spontaneous abortion. Ann Hematol. 85 (4): 268-271.




Bhasin S., Mallidis C. and Ma K. 2000. The genetic basis of infertility in men. Clin. Endocrinol. Metab. 14 (3): 363-388.




Bielanska M., Tan S. L. and Ao A. 2000. Fluorescence in-situ hybridization of sex chromosomes in spermatozoa and spare preimplantation embryos of a Klinefelter 46,XY/47,XXY male. Hum. Reprod. 15 (2): 440-444.




Bor P., Hindkjaer J., Kolvraa S. and Ingerslev H. J. 2002. Y-chromosome microdeletions and cytogenetic findings in unselected ICSI candidates at a Danish fertility clinic. J Assist Reprod Genet. 19 (5): 224-231.




Buonadonna A. L., Cariola F., Caroppo E., Di Carlo A., Fiorente P., Valenzano M. C., D'Amato G. and Gentile M. 2002. Molecular and cytogenetic characterization of an azoospermic male with a de-novo Y;14 translocation and alternate centromere inactivation. Hum. Reprod. 17 (3): 564-569.




Carp H., Salomon O., Seidman D., Dardik R., Rosenberg N. and Inbal A. 2002. Prevalence of genetic markers for thrombophilia in recurrent pregnancy loss. Hum. Reprod. 17 (6): 1633-1637.

66




Dada R., Gupta N. P. and Kucheria K. 2003. Molecular screening for Yq microdeletion in men with idiopathic oligozoospermia and azoospermia. J. Biosci. 28 (2): 163-168.




Dahlbäck B. 1995. Inherited thrombophilia: resistance to activated protein C as a pathogenic factor of venous thromboembolism. Blood 85 (3): 607-614.




Daniely M., Aviram-Goldring A., Barkai G. and Goldman B. 1998. Detection of chromosomal aberration in fetuses arising from recurrent spontaneous abortion by comparative genomic hybridization. Hum. Reprod. 13 (4): 805-809.




Dohle G. R., Halley D. J., Van Hemel J. O., van den Ouwel A. M., Pieters M. H., Weber R. F. and Govaerts L. C. 2002. Genetic risk factors in infertile men with severe oligozoospermia and azoospermia. Hum. Reprod. 17 (1): 13-16.




Donat R., McNeill A. S., Fitzpatrick D. R. and Hargreave T. B. 1997. The incidence of cystic fibrosis gene mutations in patients with congenital bilateral absence of the vas deferens in Scotland. Br. J. Urol. 79 (1): 74-77.




Finan R. R., Tamim H., Ameen G., Sharida H. E., Rashid M. and Almawi W. Y. 2002. Prevalence of factor V G1691A (factor V-Leiden) and prothrombin G20210A gene mutations in a recurrent miscarriage population. Am J Hematol. 71 (4): 300-305.




Foka Z. J., Lambropoulos A. F., Saravelos H., Karas G. B., Karavida A., Agorastos T., Zournatzi V., Makris P. E., Bontis J. and Kotsis A. 2000. Factor V leiden and prothrombin G20210A mutations, but not methylenetetrahydrofolate reductase C677T, are associated with recurrent miscarriages. Hum Reprod. 15 (2): 458-462.




Foresta C., Ferlin A. and Moro E. 2000. Deletion and expression analysis of AZFa genes on the human Y chromosome revealed a major role for DBY in male infertility. Hum. Mol. Genet. 9 (8): 1161-1169.




Forti G. and Krausz C. 1998. Clinical review 100: Evaluation and treatment of the infertile couple. J. Clin. Endocrinol. Metab. 83 (12): 4177-4188.




Gekas J., Thepot F., Turleau C., Siffroi J. P., Dadoune J. P., Briault S., Rio M., Bourouillou G., Carre-Pigeon F., Wasels R., Benzacken B.; Association des Cytogeneticiens de Langue Francaise. 2001. Chromosomal factors of infertility in candidate couples for ICSI: an equal risk of constitutional aberrations in women and men. Hum. Reprod. 16 (1): 82-90.




Geneix A., Schubert B., Force A., Rodet K., Briancon G. and Boucher D. 2002. Sperm analysis by FISH in a case of t(17; 22) (q11; q12) balanced translocation: case report. Hum Reprod. 17 (2): 325-331. 67




Grangeia A., Niel F., Carvalho F., Fernandes S., Ardalan A., Girodon E., Silva J., Ferras L., Sousa M. and Barros A. 2004. Characterization of cystic fibrosis conductance transmembrane regulator gene mutations and IVS8 poly(T) variants in Portuguese patients with congenital absence of the vas deferens. Hum Reprod. 19 (11): 2502-2508.




Hellani A., Al-Hassan S., Iqbal M. and Coskun S. 2006. Y chromosome microdeletions in infertile men with idiopathic oligo- or azoospermia. J Exp Clin Assist Reprod. 3 (1): 17.




Huynh T., Mollard R. and Trounson A. 2002. Selected genetic factors associated with male infertility. Hum. Reprod. Update 8 (2): 183-198.




Chandley A. C. 1984. Infertility and chromosome abnormality. Oxf. Rev. Reprod. Biol. 6: 1-46.




Johnson M. D. 1998. Genetic risks of intracytoplasmic sperm injection in the treatment of male infertility: recommendations for genetic counseling and screening. Fertil. Steril. 70 (3): 397-411.




Krausz C., Bussani-Mastellone C., Granchi S., McElreavey K., Scarselli G. and Forti G. 1999. Screening for microdeletions of Y chromosome genes in patients undergoing intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod. 14 (7): 1717-1721.




Krausz C. and Forti G. 2000. Clinical aspect of male infertility. Results Probl. Cell Differ. 28: 1-21.




Kubíček V. 1996. Mužská infertilita a erektilní dysfunkce. 1. vydání. Galén, Praha.




Larriba S., Bonache S., Sarquella J., Ramos M. D., Gimenez J., Bassas L. and Casals T. 2005. Molecular evaluation of CFTR sequence variants in male infertility of testicular origin. Int J Androl. 28 (5): 284-290.




Lockwood C. J. 2002. Inherited thrombophilias in pregnant patients: detection and treatment paradigm. Obstet. Gynecol. 99 (2): 333-341.




Lorda-Sanchez I., Tejedor C., Sanz R., Rodriguez de Alba M., de la Fuente A., Fernandez E., Ayuso C. and Ramos C. 2001. A maternal inherited translocation t(1;22)(q11;p11) in two infertile brothers. Genet Couns. 12 (1): 95-100.




Lyon M. F. and Meredith R. 1966. Autosomal translocations causing male sterility and viable aneuploidy in the mouse. Cytogenetics 5 (5): 335-354.




Macas E., Imthurn B. and Keller P. J. 2001. Increased incidence of numerical chromosome abnormalities in spermatozoa injected into human oocytes by ICSI. Hum. Reprod. 16 (1): 115-120.

68




Macek M., Vilímová Š., Potužníková P., Yurov Y., Vorsanova S., Diblík J., Krebsová A., Machatková M., Koudová M., Alánová R., Matějčková M., Hladíková E., Broučková M., Hüttelová R., Vincenciová R., Paulasová P., Brandjeská M., Uhrová E., Kratěnová A., Smetanová I., Novotná D., Chudoba D., Kulovaný E., Krutílková V., Hromadníková I., Mardešič T. and Macek M. Jr..2002. Využití lékařské genetiky v reprodukční medicíně. Čas. Lék. čes. 1: 28-34.




Madan K. 1983. Balanced structural changes involving the human X: effect on sexual phenotype. Hum Genet. 63 (3): 216-221.




Mak V., Zielenski J., Tsui L. C., Durie P., Zini A., Martin S., Longley T. B. and Jarvi K. A. 2000. Cystic fibrosis gene mutations and infertile men with primary testicular failure. Hum Reprod. 15 (2): 436-439.




Mark H. F and Sigman M. 1999. Male infertility associated with a unique 8;22 translocation. Exp Mol Pathol. 67 (1): 57-61.




Martínez M. C., Bernabe M. J., Gomez E., Ballesteros A., Landeras J., Glover G., Gil-Salom M., Remohi J. and Pellicer A. 2000. Screening for AZF deletion in a large series of severely impaired spermatogenesis patients. J Androl. 21 (5): 651-655.




Martini E., Geraedts J. P., Liebaers I., Land J. A., Capitanio G. L., Ramaekers F. C. and Hopman A. H. 1996. Constitution of semen samples from XYY and XXY males as analysed by in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11 (8): 1638-1643.




Martini E., von Bergh A. R., Coonen E., de Die-Smulders C. E., Hopman A. H., Ramaekers F. C. and Geraedts J. P. 1998. Detection of structural abnormalities in spermatozoa

of

a

translocation

carrier

t(3;11)(q27.3;q24.3)

by

triple

FISH.

Hum Genet. 102 (2):157-165.


Mau U. A., Backert I. T., Kaiser P. and Kiesel L. 1997. Chromosomal findings in 150 couples referred for genetic counselling prior to intracytoplasmic sperm injection. Hum. Reprod. 12 (5): 930-937.




Mau-Holzmann U. A. 2005. Somatic chromosomal abnormalities in infertile men and women. Cytogenet Genome Res. 111 (3-4): 317-336.




Meschede D. and Horst J. 1997. The molecular genetics of male infertility. Mol. Hum. Reprod. 3 (5): 419-430.




Miklos G. L. 1974. Sex-chromosome pairing and male fertility. Cytogenet. Cell Genet. 13 (6): 558-577.

69




Mercier S., Morel F., Fellmann F., Roux C. and Bresson J. L. 1998. Molecular analysis of the chromosomal equipment in spermatozoa of a 46, XY, t(7;8) (q11.21;cen) carrier by using fluorescence in situ hybridization. Hum Genet. 102 (4): 446-451.




Morea A., Cameran M., Rebuffi A. G., Marzenta D., Marangon O., Picci L., Zacchello F. and Scarpa M. 2005. Gender-sensitive association of CFTR gene mutations and 5T allele emerging from a large survey on infertility. Mol Hum Reprod. 11 (8): 607614.




Morel F., Douet-Guilbert N., Le Bris M. J., Amice V., Le Martelot M. T., Roche S., Valeri A., Derrien V., Amice J. and De Braekeleer M. 2004. Chromosomal abnormalities in couples undergoing intracytoplasmic sperm injection. A study of 370 couples and review of the literature. Int J Androl. 27 (3): 178-182.




Pandiyan N. and Jequier A. M. 1996. Mitotic chromosomal anomalies among 1210 infertile men. Hum. Reprod. 11 (12): 2604-2608.




Paoloni-Giacobino A., Kern I., Rumpler Y., Djlelati R., Morris M. A. and Dahoun S. P. 2000. Familial t(6;21)(p21.1;p13) translocation associated with male-only sterility. Clin Genet. 58 (4): 324-328.




Pernice F., Mazza G., Puglisi D., Luppino M. G. and Frisina N. 2002. Nonrobertsonian

translocation

t(6;11)

is

associated

with

infertility

in

an

oligoazoospermic male. Fertil. Steril. 78 (1): 192-194.


Peschka B., Leygraaf J., Van der Ven K., Montag M., Schartmann B., Schubert R., van der Ven H. and Schwanitz G. 1999. Type and frequency of chromosome aberrations in 781 couples undergoing intracytoplasmic sperm injection. Hum. Reprod. 14 (9): 2257-2263.




Phillipson G. T., Petrucco O. M. and Matthews C. D. 2000. Congenital bilateral absence of the vas deferens, cystic fibrosis mutation analysis and intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod. 15 (2): 431-435.




Pina-Neto J. M., Carrara R. C., Bisinella R., Mazzucatto L. F., Martins M. D., Sartoratto E. and Yamasaki R. 2006. Somatic cytogenetic and azoospermia factor gene microdeletion studies in infertile men. Braz J Med Biol Res. 39 (4): 555-561.




Quintana de la Rosa J. L., Gallegos Avila G., Garcia Cavazos R. and Zungri Telo E. 2001. Chromosomal translocation 3;22 in an infertile man. Fertil. Steril. 75 (6): 1222-1223.

70




Raziel A., Friedler S., Schachter M., Kasterstein E., Strassburger D. and Ron-El R. 2002. Increased frequency of female partner chromosomal abnormalities in patients with high-order implantation failure after in vitro fertilization. Fertil Steril. 78 (3): 515-519.




Reijo R., Lee T. Y., Salo P., Alagappan R., Brown L. G., Rosenberg M., Rozen S., Jaffe T., Straus D. and Hovatta O. 1995. Diverse spermatogenic defects in humans caused by Y chromosome deletions encompassing a novel RNA-binding protein gene. Nat Genet. 10 (4): 383-393.




Sasagawa I., Nakada T., Adachi Y., Kato T., Sawamura T., Ishigooka M. and Hashimoto T. 1993. Y-autosome translocation associated with azoospermia. Scand. J. Urol. Nephrol. 27 (2): 285-288.




Shah K., Sivapalan G., Gibbons N., Tempest H. and Griffin D. K. 2003. The genetic basis of infertility. Reproduction 126 (1): 13-25.




Shah V. C. and Smart V. 1996. Human chromosome Y and SRY. Cell. Biol. Int. 20 (1): 3-6.




Sharpe R. M. 2000. Lifestyle and environmental contribution to male infertility. Br. Med. Bull. 56 (3): 630-642.




Shi Q. and Martin R. H. 2001. Aneuploidy in human spermatozoa: FISH analysis in men with constitutional chromosomal abnormalities, and in infertile

men.

Reproduction. 121 (5): 655-666.


Schreurs A., Legius E., Meuleman C., Fryns J. P. and D'Hooghe T. M. 2000. Increased frequency of chromosomal abnormalities in female partners of couples undergoing in vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 74 (1): 94-96.




Scholtes M. C., Behrend C., Dietzel-Dahmen J., van Hoogstraten D. G., Marx K., Wohlers S., Verhoeven H. and Zeilmaker G. H. 1998. Chromosomal aberrations in couples undergoing intracytoplasmic sperm injection: influence on implantation and ongoing pregnancy rates. Fertil Steril. 70 (5): 933-937.




Schulz S., Jakubiczka S., Kropf S., Nickel I., Muschke P. and Kleinstein J. 2006 Increased frequency of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations in infertile males. Fertil Steril. 85 (1):135-138.




Simoni M. 1998. The EAA International Quality Control Programme for YChromosomal microdeletions. European Academy of Andrology. Int J Androl. 21 (6): 315-316.

71




Simoni M., Kamischke A. and Nieschlag E. 1998. Current status of the molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions in the work-up of male infertility. Initiative for international quality control. Hum. Reprod. 13 (7): 1764-1768.




Sonntag B., Meschede D., Ullmann V., Gassner P., Horst J., Nieschlag E. and Behre H. M. 2001. Low-level sex chromosome mosaicism in female partners of couples undergoing ICSI therapy does not significantly affect treatment outcome. Hum. Reprod. 16 (8): 1648-1652.




Sottilotta G., Oriana V., Latella C., Luise F., Piromalli A., Ramirez F., Mammi C., Santoro R., Iannaccaro P., Muleo G. and Lombardo V. T. 2006. Genetic prothrombotic risk factors in women with unexplained pregnancy loss. Thromb Res. 117 (6): 681-684.




Souza S. S., Ferriani R. A., Pontes A. G., Zago M. A. and Franco R. F. 1999. Factor V leiden and factor II G20210A mutations in patients with recurrent abortion. Hum Reprod. 14 (10): 2448-2450.




Stern C., Pertile M., Norris H., Hale L. and Baker H. W. 1999. Chromosome translocations in couples with in-vitro fertilization implantation failure. Hum. Reprod. 14 (8): 2097-2101.




Stuppia L., Antonucci I., Binni F., Brandi A., Grifone N., Colosimo A., De Santo M., Gatta V., Gelli G., Guida V., Majore S., Calabrese G., Palka C., Ravani A., Rinaldi R., Tiboni G. M., Ballone E., Venturoli A., Ferlini A., Torrente I., Grammatico P., Calzolari E. and Dallapiccola B. 2005. Screening of mutations in the CFTR gene in 1195 couples entering assisted reproduction technique programs. Eur J Hum Genet. 13 (8): 959-964.




Toncheva D., Ilieva P. and Mavrudieva M. 1994. Detection of low level sexchromosomal mosaicism. Genet. Couns. 5 (4): 363-367.




van der Ven K., Peschka B., Montag M., Lange R., Schwanitz G. and van der Ven H. H. 1998. Increased frequency of congenital chromosomal aberrations in female partners of couples undergoing intracytoplasmic sperm injection. Hum. Reprod. 13 (1): 48-54.




Vogt P. H. 2004. Genomic heterogeneity and instability of the AZF locus on the human Y chromosome. Mol Cell Endocrinol. 224 (1-2): 1-9.




Vogt P. H., Edelmann A., Kirsch S., Henegariu O., Hirschmann P., Kiesewetter F., Kohn F. M., Schill W. B., Farah S., Ramos C., Hartmann M., Hartschuh W., Meschede D., Behre H. M., Castel A., Nieschlag E., Weidner W., Grone H. J., 72

Jung A., Engel W. and Haidl G. 1996. Human Y chromosome azoospermia factors (AZF) mapped to different subregions in Yq11. Hum. Mol. Genet. 5: 933-943.

73