Použití kitu
HYDRAGEL Lp(a)
kit je ur en ke kvantitativnímu stanovení lipoproteinu Lp(a) elektroimunodifuzí na slab alkalicky pufrovaných agarózových gelech o pH 7.6. Gely obsahují anti-apo(a) monospecifické protilátky. Po migraci jsou výsledné raketky obarveny kyselou violetí. P ebytek barvi ky je odstran n sm sí kyseliny a alkoholu. Kalibra ní k ivka je sestrojena na podklad hodnot Lp(a), získaných zm ením standard – sér se známou koncentrací Lp(a). Výšky raketek pacient poskytují sérové hladiny Lp(a). Každý agarózový gel v kitu HYDRAGEL Lp(a) je ur en k analýze 14 vzork . Ur eno pro diagnostické použití in vitro!
PRINCIP TESTU
Lp(a) je plazmatický lipoprotein svými fyzikáln -chemickými a funk ními vlastnostmi podobný LDL. Liší se však proteinovou složkou. Je to apo B100 spojený pomocí disulfidických m stk se specifickým glykoproteinem apo(a). Tento zvláštní antigen p edstavuje d ležitou strukturální homologii s plazminogenem (týkající se domény Kringle IV). Proto Lp(a) m že sout žit s plazminogenem o vazbu na fibrin). Ú astní se vzniku trombózy i aterosklerózy. Mnoho studií dokazuje jeho d di ný p enos a rovn ž heterogenitu ve velikosti. V sou asné dob je známo šest hlavních fenotyp . Jednozna ný vztah mezi fenotypy a aterogenním rizikem nebyl prokázán. Koncentrace Lp(a) nad 0.3 g/l je dnes považována za další nezávislý rizikový faktor vzniku aterosklerózy. Kvantitativní stanovení Lp(a) by tudíž m lo být bráno v úvahu pro jeho prediktivní hodnotu. Vývoj specifické protilátky proti bílkovinné ásti Lp(a) bez zk ížené reaktivity s LDL a plazminogenem vedl ke zna nému zdokonalení tohoto jednoduchého stanovení pomocí elektroimunodifúze. Pozn.: LDL : Low Density Lipoprotein.
REAGENCIE A MATERIÁL OBSAŽENÝ V KITU HYDRAGEL Lp(a) POLOŽKY Agarózové gely (p ipraveny k použití) TGM pufr (zásobní roztok) Roztok kyselé violeti (zásobní roztok) Odbarvovací roztok (zásobní roztok) Sérový standard ( sušený mrazem) Filtra ní papíry - tenké Filtra ní papíry - tlusté
kat. .: 4057 5 gel 2 lahv. po 100 ml 1 lahv., 75 ml 1 lahv., 100 ml 5 lahv. 1 bal., 10 ks 2 bal. po 10 ks
Pro optimální provedení používejte všechny reagencie pouze z jediné soupravy a dle instrukcí uvedených v p íbalovém letáku. PROSÍME, T TE PE LIV P ÍBALOVÝ LETÁK.
1. AGARÓZOVÉ GELY*
P íprava P ipraveny k použití, každý gel obsahuje agarózu 0.9 g/dl, alkalický pufr o pH 7.6 ± 0.1 a p ídavné látky nezbytn nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro lov ka neškodných. Použití Nosné medium pro elektroimunodifúzi. Skladování, stabilita a známky poškození Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech – šipkou na p ední stran krabice sm rem nahoru. Skladujte v chladni ce (2 – 8 °C). Zamezit prudkým zm nám teploty – neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby expirace vyzna ené na krabici i štítcích na obalech gel . NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v p ípad nálezu krystal nebo precipitát na povrchu gel a pokud struktura gelu v d sledku zmrazení zm kne, (ii) jsou-li p ítomny mikroby a plísn , (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v d sledku nesprávného skladování).
2. TGM PUFR
P íprava Každá lahvi ka zásobního pufru je ur ena k na ed ní do 1 litru destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po na ed ní vzniklý pracovní roztok obsahuje : Tris–glycin–MES (Morpholino Ethane Sulfonate) pufr o pH 7.8 ± 0.3, azid sodný a p ídavné látky nezbytn nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro lov ka neškodných. Použití Pufr na elektroforézu. Skladování, stabilita a známky poškození Skladovat p i pokojové teplot nebo v chladni ce. Zásobní roztok je stabilní n kolik let, nejmén do data expirace vyzna eného na balení kitu i na štítcích jednotlivých lahvi ek. Z ed ný roztok je stabilní jeden rok v uzav ené láhvi p i pokojové teplot . Nepoužívejte na ed ný pufr p i zm n jeho vzhledu, nap . vzniku zákalu v d sledku mikrobiální kontaminace.
3. KYSELÁ VIOLE
P íprava Obsah lahvi ky se zásobním roztokem kyselé violeti dopl te do 300 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po roz ed ní pracovní barvící roztok obsahuje kyselý roztok pH 2, kyselou viole , 0.2 g/dl, 3.25% etylen glykol a p ídavné látky nezbytné pro optimální provedení testu, v koncentracích, které neškodí zdraví. Pozor! Nepolykat, zdraví škodlivé!
Použití K barvení gel po elektroimunodifúzi. Skladování, stabilita a známky zhoršení kvality Zásobní i pracovní roztok se skladuje p i pokojové teplot nebo p i 2-8 °C v t sn uzav ených nádobách tak, aby nedošlo k odpa ování. Zásobní roztok je stabilní do data expirace vyzna eného na obalu i na štítku lahvi ky. Pracovní roztok vydrží 6 m síc .
4. ODBARVOVACÍ ROZTOK
P íprava Každá lahvi ka zásobního roztoku se edí do 5 litr destilovanou nebo deionizovanou vodou. Je praktické p ipravit ed ní 1/50 malého množství zásobního roztoku, nap . z edit 20 ml zásobního roztoku do 1 litru. Po z ed ní vznikne odbarvovací roztok, obsahující 1.0g/dl kyseliny citrónové. Nejmén 15 minut p ed použitím p ipravte následující roztok (obj. / obj.): 50% etanolu, 50% odbarvovacího roztoku. Lze rovn ž použít 90 % etanol, v tomto p ípad je nutno upravit objemy. Použití K odbarvení, tj. odstran ní p ebyte né barvi ky a k projasn ní pozadí gel . Skladování, stabilita a známky znehodnocení Zásobní odbarvovací roztok se skladuje p i pokojové teplot nebo v ledni ce (2 - 8°C). Je stabilní do doby expirace vyzna ené na obalu soupravy nebo p ímo na štítcích lahvi ek s odbarvovacím roztokem. Z ed ný roztok v uzav ené láhvi je stabilní p i pokojové teplot po dobu jednoho m síce. Nep idávejte azid sodný! Nepoužívat p i zm n vzhledu, vzniku zákalu nebo precipitátu v roztoku. K zabrán ní mikrobiálního r stu v pracovním roztoku skladovaném déle než 1 týden lze p idat 5 µl/dl ProClin 300. Pracovní odbarvovací roztok s p ídavkem ProClinu je stabilní v uzav ené nádob do doby expirace vyzna ené na obalu soupravy nebo na štítku lahvi ky.
5. SÉROVÝ STANDARD*
Standardní sérum Lp(a) je vyrobeno ze sm si lidských sér, je stabilizováno speciálním postupem a vysušeno zmrazením. POZOR: Sérum bylo testováno na nep ítomnost vir HIV, hepatitidy B a C i dalších infek ních látek. K prevenci nákazy je však nutno dodržet obvyklá bezpe nostní opat ení. P íprava Lahvi ku lyofilizovaného séra na e te 0.5 ml destilované vody. Ponechejte 30 minut stát p i pokojové teplot (15 - 30°C). Jemn promíchejte tak, aby nedošlo ke vzniku p ny. Standard na e te podle následujícího schématu a promíchejte na Vortexu.
Body 1 2 3 4
Fyziol. roztok 180 l 150 l 100 l 0 l
Standard 20 l 50 l 100 l 200 l
koncentrace Standard x 0.1 Standard x 0.25 Standard x 0.5 Standard x 1
Použití Ke kalibraci. Skladování, stabilita a známky znehodnocení Skladujte lyofilizovaný sérový standard v chladni ce (2 - 8°C). Stabilní do data expirace vyzna eného na obalu kitu a štítcích lahvi ek. Na ed ný standard lze v chladni ce skladovat až 5 dní. Kalibra ní roztoky lze skladovat v chladni ce 1 den.
6. TENKÉ FILTRA NÍ PAPÍRY
Použití Proužky tenkého filtra ního papíru, na jedno použití. Jsou ur eny k odsátí p ebyte né tekutiny z povrchu gelu p ed aplikací vzork . Skladování Skladujte na suchém míst p i pokojové teplot nebo v chladni ce.
7. TLUSTÉ FILTRA NÍ PAPÍRY
Použití K odsátí nezprecipitovaných protein z gelu. Skladování Skladujte na suchém míst p i pokojové teplot nebo v chladni ce. * POZN.: B hem transportu gely a sérový standard vydrží p i teplot 15 – 30 °C až 15 dní bez nep íznivých efekt na provedení testu.
DALŠÍ POT EBNÉ REAGENCIE (nejsou sou ástí setu) 1. ISTÝ ETANOL 2. FYZIOLOGICKÝ ROZTOK
P íprava P ipravte 0.15 M (0.9 g/dl) roztok NaCl v destilované nebo v deionizované vod .
Použití Používá se k ed ní vzork . Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku Vydrží asi 3 m síce v t sn uzav ených láhvích p i pokojové teplot . P i zm n vzhledu,
tj. výskytu zákalu zp sobeného mikrobiální kontaminací, odstra te. Pro delší skladování p idejte azid sodný, 0.1g/dl.
ZA ÍZENÍ NEZBYTNÁ K PROVEDENÍ TESTU
1. Zdroj proudu : GD 61 D SEBIA, kat. . 1300, GD 251 D SEBIA, kat. . 1301, MG 300 SEBIA, kat. . 1302 nebo MG 500 SEBIA, kat. . 1303. 2. Elektroforetická komora, K20 SEBIA, kat. . 1400 3. Nádobky a držáky gel pro manipulaci s nimi – HYDRAGEL ACCESSORY KIT SEBIA, kat. . 1420 4. Pipety 5 µl, 20 µl, 100 µl a 200 µl. 5. Suši ka – inkubátor, IS 80 SEBIA, kat. . 1430 6. EID skenovací systém (pro raketky) SEBIA, kat. . 1100.
ANALYZOVANÉ VZORKY
Odb r a skladování vzork Nejlepších výsledk se dosahuje analýzou erstvých vzork – v p ípad nutnosti lze po dobu jednoho týdne skladovat v chladni ce. Mražené vzorky jsou stabilní nejmén 1 m síc. P íprava vzork Používejte ne ed ná séra
PRACOVNÍ POSTUP I. MIGRACE
1. Z obalu vyjm te gel. Je výhodné jej položit po vybalení na svou zav enou krabi ku. 2. Naneste 5 µl ne ed ného vzorku nebo na ed ného standardu do každé jamky. P ed každou aplikací vym te / ot ete špi ku pipety. Do první a poslední jamky neaplikujte ani vzorky, ani standardy – vyhnete se tzv. okrajovému efektu. Tyto jamky napl te 5 µl fyziologického roztoku. 3. Ponechejte vzorky 20 minut difundovat do gelu. 4. P i použití migra ní komory SEBIA K20, vložte HYDRAGEL do zub m stku, gelovou stranou sm rem dol ; m stek musí být p i tom mimo komoru pro zabrán ní vniknutí pufru do jamek. Potom m stek i s gelem umíst te pe liv do komory – vzorky na katodické stran . Gel se pono í do pufru asi 1 cm hluboko na každé stran . Další detaily viz v p íbalovém letáku kom rky K20. 5. Kom rku nyní p ipojte ke zdroji proudu. PODMÍNKY D LENÍ Objem pufru ke každé elektrod Celkový objem pufru Doba d lení Konstantní nap tí Po áte ní proud (na gel)
SEBIA K20 150 ml 300 ml 4 hodiny 50 V 18 ± 3 mA
6. Po migraci komoru odpojte a gelovou plotnu vyjm te a položte na rovnou plochu.
II. ODSTRAN NÍ ZBÝVAJÍCÍCH BÍLKOVIN
1. Jeden tenký filtra ní papír se vsáknutým fyziologickým roztokem položte na gel. P idejte dv vrstvy tlustého filtra ního papíru a na vrchol umíst te na 20 minut závaží o hmotnosti 1-1.5 kg. Závaží musí p sobit rovnom rn . Pokud je zpracováváno n kolik gel najednou, mohou se nakupit na sebe a na vrchol se položí závaží. 2. Odstra te filtra ní papíry. Gely oplachujte ve fyziologickém roztoku 60 minut ve svislé poloze. 3. Nyní na gel položte op t jeden tenký filtra ní papír namo ený p edtím do fyziologickéroztoku. P idejte 2 vrstvy tlustého filtra ního papíru a na vrchol takto vzniklé hromádky položte na 10 minut 1-1.5 kg závaží. 4. Odstra te filtra ní papíry a gel dokonale osušte v suši ce-inkubátoru p i 80 °C.
III. BARVENÍ A ODBARVOVÁNÍ
1. Usušený a ochlazený gel pono te ve svislé poloze na 5 minut do barvícího roztoku. 2. Odbarv te ve t ech po sob následujících lázních s odbarvovacím roztokem, dokud není pozadí zcela bezbarvé a pr hledné. 3. Odsajte p ebyte nou tekutinu z povrchu gelu tenkým papírem a osušte gel proudem 80 °C teplého vzduchu. Je-li t eba, o ist te zadní plastikovou podp rnou ást gelové plotny vlhkým m kkým had íkem nebo buni inou.
IV. ODE TENÍ
1. Zm te raketky 2. Sestrojte kalibra ní k ivku s vyzna ením koncentrací standardu Lp(a) na ose X a odpovídajících výšek raketek na ose Y.
VÝSLEDKY Kontrola kvality Doporu uje se za adit za každou sérii vzork kat. . 4782.
kontrolní sérum LIPO + Lp(a) Control SEBIA,
Hodnoty Zm te výšky raketek vzork a naneste je na osu Y kalibra ní k ivky. P ímo ode t te koncentrace Lp(a). Fyziologické hodnoty:
0.03 g/dl.
Interpretace U jedinc s normálními hladinami lipid jsou plazmatické koncentrace Lp(a) vyšší než 0.3 g/l považovány za d ležitý rizikový faktor ateriosklerózy. Pokud hladiny Lp(a) dosáhnou 0.5 g/l, zvyšuje se riziko ischemické choroby srde ní 2.5 krát.
Problémy Pokud testy nevycházejí p i dodržení veškerých instrukcí pro p ípravu, skladování a provedení testu uvedených v p íbalovém letáku, volejte technicko-servisní st edisko vašeho dodavatele. Soupravy, reagencie, bezpe nostní listy a informace o likvidaci odpadu jsou dostupné na technicko-servisním st edisku vašeho dodavatele.
LITERATURA
