HYDRAGEL 7 ISO-LDH HYDRAGEL 15 ISO-LDH HYDRAGEL 30 ISO-LDH

HYDRAGEL 7 ISO-LDH

Ref. 4110

HYDRAGEL 15 ISO-LDH

Ref. 4130

HYDRAGEL 30 ISO-LDH

Ref. 4136

2016/06

HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-LDH - 2016/06

POUŽITÍ KITU

HYDRAGEL 7 ISO-LDH, HYDRAGEL 15 ISO-LDH a HYDRAGEL 30 ISO-LDH kity jsou určeny k elektroforetické identifikaci a kvantifikaci pěti izoenzymů laktát dehydrogenázy lidského séra na alkalicky pufrovaných (pH 8.4) agarózových gelech. Kity se používají ve spojení s poloautomatizovaným elektroforetickým systémem HYDRASYS. Výsledným produktem jsou gely, jež lze okamžitě interpretovat. Po elektroforetické separaci jsou izoenzymy LD vizualizovány pomocí specifického chromogenního substrátu. Po osušení jsou agarózové plotny připraveny k vizuálnímu i denzitometrickému vyhodnocení. Denzitometrie poskytuje přesnou relativní kvantifikaci jednotlivých zón. Každý agarózový gel je určen k analýze : • 7-mi vzorků (HYDRAGEL 7 ISO-LDH kit), • 15-ti vzorků (HYDRAGEL 15 ISO-LDH kit), • 30-ti vzorků (HYDRAGEL 30 ISO-LDH kit). Pouze pro diagnostické použití in Vitro.

POZNÁMKA : V tomto návodu se název "HYDRASYS" používá pro poloautomatické přístroje HYDRASYS a HYDRASYS 2.

PRINCIP TESTU

Každý izoenzym LD je tetramer složený ze čtyř podjednotek (polypeptidických řetězců). Existují 2 typy těchto podjednotek označované M ("muscle") a H ("heart"). Jejich kombinací vzniká pět izoenzymů lišících se elektroforetickými vlastnostmi - LD1 je izoenzym s největší elektroforetickou pohyblivostí, tj. putuje nejblíže k anodě. V následující tabulce jsou sumarizovány nomenklatura, složení a primární tkáňové zdroje LD izoenzymů. NOMENKLATURA

SLOŽENÍ

LD3

H2M2

LD1 LD2 LD4

ZDROJOVÁ TKÁŇ

H4

srdce (myocardium)

H3M

srdce (myocardium)

různá množství-různé tkáně

HM3

LD5

různá množství-různé tkáně

M4

kosterní svalstvo. játra

Největší význam elektroforézy izoenzymů LD spočívá v diagnostice infarktu myokardu (MI). V séru zdravého člověka je poměr LD1 / LD2 < 1, u srdečního infarktu stoupá především hodnota LD1 a v menší míře LD2 a poměr LD1 / LD2 > 1 (tzv. LD1 / LD2 flip). Během 12 - 24 hodin po MI se zvyšuje koncentrace celkové LD 2 - 3x. Maxima aktivity celkové LD je dosaženo po 2 - 3 dnech a ještě přibližně 14 dnů zůstává ve zvýšených hodnotách. Analýza izoenzymů LD se obvykle provádí současně s analýzou izoenzymů CK nebo jiných časných markerů MI k jeho vyloučení nebo potvrzení a stanovení jeho vážnosti a monitorování pacientova stavu. Protože izoenzymy LD jsou dosti specifické pro různé tkáně, jejich stanovení v séru pomáhá diagnostikovat tkáňové poškození a odlišit např. plicní a ledvinné infarkty a jaterní onemocnění. Všechny izoenzymy LD katalyzují tutéž reverzibilní reakci, která je využita při jejich vizualizaci. V kitech HYDRAGEL 7 ISO-LDH, HYDRAGEL 15 ISO-LDH a HYDRAGEL 30 ISO-LDH je k vizualizaci izoenzymů LD využito následujících reakcí : Laktát + NAD

LD

NADH2 + PMS

Pyruvát + NADH2

Reduk. PMS + NAD

Reduk. PMS + NBT Množství výsledného formazánového precipitátu je přímo úměrné enzym. aktivitě LD.

PMS + reduk. NBT precipitát formazán. modři

POZN. : NAD : Nicotinamid Adenin Dinucleotid PMS : Phenazin Methosulfát NBT : Nitro Blue Tetrazolium

REAGENCIE A MATERIÁL OBSAŽENÝ V KITECH HYDRAGEL 7, 15 A 30 ISO-LDH VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy.

POLOŽKY Agarózové gely (připraveno k použití) Houbičky s pufrem (připraveno k použití) Rozpouštědlo substrátu (připraveno k použití) Substrát ISO-LDH (připraveno k použití) Zastavovací roztok ISO CK/LD (připraveno k použití) Aplikátory (připraveno k použití) Tenké filtrační papíry Tlusté filtrační papíry

KAT. Č. 4110 10 ks 10 bal. po 2 ks 1 lahv. 45 mL 10 lahv. 1 lahv. 40 mL 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks

KAT. Č. 4130 10 ks 10 bal. po 2 ks 1 lahv. 45 mL 10 lahv. 1 lahv. 40 mL 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks

KAT. Č. 4136 10 ks 10 bal. po 2 ks 1 lahv. 45 mL 10 lahv. 1 lahv. 40 mL 2 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks

Během přepravy může být souprava uchována bez zmražení (15 až 30 °C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. - 129 -

SEBIA NÁVOD - Czech

HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-LDH - 2016/06

OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku.

1. AGARÓZOVÉ GELY Příprava

Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok pH 8.4 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Podpůrné medium pro elektroforézu izoenzymů LD.

Skladování, stabilita a známky poškození

Skladujte v horizontální poloze v originálním ochranném obalu při pokojové teplotě (15 - 30 °C) nebo v chladničce (2 - 8 °C). Stabilní do data exspirace (šipka na čelní straně krabice musí směřovat vzhůru). Neukládejte v blízkosti oken nebo tepelných zdrojů. Teplota skladování nesmí mít velké výkyvy. NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování).

2. PUFROVANÉ STRIPY Příprava

Pufrované houbovité proužky (stripy) jsou připraveny k použití. Každý obsahuje : tlumicí roztok s pH 8.2 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Pufrované stripy slouží jako rezervoár pufru pro elektroforézu a zajišťují kontakt mezi gelem a elektrodami.

Skladování, stabilita a známky poškození

Stripy se skladují v ledničce nebo při pokojové teplotě (šipka na čelní straně krabice musí směřovat vzhůru). Jsou stabilní nejméně do data exspirace vyznačeného na štítcích balení. NEMRAZIT! Otevřená balení a vyschlé proužky okamžitě vyřaďte z používání.

3. ROZPOUŠTĚDLO SUBSTRÁTU Příprava

Rozpouštědlo je hotovo k použití, obsahuje laktát lithný a přísady nezbytné pro správné pro- vedení - v použité koncentraci je neškodné.

Použití

K přípravě vyvíjecího roztoku – viz odstavec 4.

Skladování, stabilita a známky poškození

Skladuje se při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu kitu nebo na štítku lahvičky. Roztok vyřaďte z používání při změně jeho vzhledu, tj. vzniku zákalu v důsledku mikrobiální kontaminace.

4. ISO-LDH SUBSTRÁT Příprava

Každá lahvička substrátu obsahuje : nikotinamid adenin dinukleotid (NAD), nitro blue tetrazolium (NBT), phenazin methosulfát (PMS) a přísady neškodné v použité koncentraci, nezbytné pro optimální provedení testu. HYDRAGEL 7 ISO-LDH : Roztok se připravuje (na nepřímém světle) 10 minut před použitím přidáním 2.25 mL rozpouštědla do lahvičky se substrátem. Zavřete lahvičku, ponechejte 5 minut při pokojové teplotě a poté jemně promíchejte. HYDRAGEL 15 & 30 ISO-LDH : Roztok se připravuje (na nepřímém světle) 10 minut před použitím, přidáním 4.5 mL rozpouštědla do lahvičky se substrátem. Zavřete lahvičku, ponechej 5 minut při pokojové teplotě a poté jemně promíchejte.

Použití

K vizualizaci elektroforeticky rozdělených LD izoenzymů.

Skladování, stabilita a známky poškození

ISO-LDH substrát je nutno skladovat v ledničce (2 - 8 °C). Je stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu soupravy nebo přímo na lahvičkách se substrátem. Substrát nesmí být zeleně nebo fialově zbarvený.

POZN. : ISO-LDH je možno ponechat až 15 dní při pokojové teplotě (15 - 30 °C) bez nepříznivých efektů na provedení - tohoto poznatku lze využít při transportu kitu.

5. ZASTAVOVACÍ (BLOKOVACÍ) ROZTOK ISO CK/LD Příprava

Blokovací roztok je připraven k použití. Obsahuje kyselý roztok pH ≈ 2.

Použití

K zastavení enzymatické reakce po inkubaci gelů.

Skladování, stabilita a známky poškození

Zastavovací roztok může být skladován při pokojové teplotě nebo v ledničce a je stabilní do data exspirace vyznačeného na štítku lahvičky. - 130 -

HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-LDH - 2016/06

6. APLIKÁTORY Použití

Na jedno použití, k aplikaci vzorků.

Skladování

Na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.

7. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Použití

K odstranění přebytku tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků.

Skladování

Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.

8. TLUSTÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Použití

Bločky silného absorpčního papíru na jedno použití, určené k odsání přebytečného zastavovacího roztoku z povrchu gelu před sušením.

Skladování

Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.

POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr ≤ 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µS/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm.

NUTNÉ VYBAVENÍ

1. HYDRASYS Systém SEBIA : HYDRASYS 2 SCAN kat. č. 1200, HYDRASYS 2 kat. č. 1201, HYDRASYS 2 SCAN FOCUSING kat. č. 1202, HYDRASYS 2 FOCUSING kat. č. 1203, HYDRASYS kat. č. 1210 nebo kat. č. 1211 nebo HYDRASYS FOCUSING kat. č. 1212. 2. Manuální nebo automatizovaný mikropipetor, SEBIA HYDRAPLUS, kat. č. 1216 nebo SEBIA HYDRAPLUS 2, kat. č. 1217 nebo SEBIA ASSIST, kat. č. 1218 jako alternativu k vzorkovým aplikátorům. 3. Vlhká Zásobní Komora kat. č. 1270, dodávaná s HYDRASYS systémem. 4. Vodící Tyčka Šablony Dodávaná s HYDRASYS systémem. 5. HYDRASYS Accessory kit ISO-LDH, ISO-PAL, CHOL, SEBIA kat. č. 1261. 6. Pipety : 10 µL, 200 µL, 5 mL. 7. Densitometr / skener pro skenování gelových ploten 82 x 51 mm nebo 82 x 102 mm : Software HYRYS SEBIA, GELSCAN SEBIA, DVSE SEBIA nebo PHORESIS pro plochý skener. Pro postupy činnosti a kalibrace viz pokyny výrobce. 8. Materiály ke kontrole kvality.

VZORKY K ANALÝZE

Odběr vzorků a jejich skladování

Pro analýzu jsou vhodné čerstvé vzorky séra. Odběr proveďte způsobem obvyklým v dané laboratoři. V případě potřeby je možno takto odebrané vzorky skladovat 7 dnů při pokojové teplotě (15 - 30 °C). DŮLEŽITÉ : Neskladujte vzorky při teplotě 2 - 8 °C.

Příprava vzorků

Použijte čiré vzorky séra. Pokud aktivita celkové LDH přesahuje hodnotu 750 IU/L, je nutno vzorek ředit fyziologickým roztokem tak, aby se výsledek byl > 750 IU/L. Po promíchání inkubujte 10 minut při pokojové teplotě.

Nepoužívat

Nepoužívejte zmražené nebo hemolyzované vzorky!

POZNÁMKA : Odběrové zkumavky pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků…). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů.

POSTUP

HYDRASYS je multiparametrický, poloautomatizovaný systém. Automatizované kroky zahrnují postupně nanesení vzorku, elektroforetickou migraci, inkubaci se substrátem, odsávání, oplach a osušení gelové plotny. Manipulace se vzorky, gely, vkládání reagencií a nastavení přístroje k uvedení do chodu se provádí ručně. Teplota migračního modulu je řízena na principu peltierova efektu. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE UŽIVATELSKÝ NÁVOD K PŘÍSTROJI HYDRASYS / HYDRASYS 2. - 131 -

HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-LDH - 2016/06

I. NASTAVENÍ MIGRACE

1. Zapněte HYDRASYS. 2. Umístěte jeden aplikátor pro gel HYDRAGEL 7 ISO CK/LD (na 7 vzorků), popř. pro HYDRAGEL ISO CK/LD 15/30 (na 15 vzorků) nebo 2 aplikátory pro gel HYDRAGEL ISO CK/LD 15/30 (pro 30 vzorků) na rovnou plochu, čísly jamek směrem nahoru (viz Obr. 1). - naneste v průběhu 2 minut 10 µL čirého vzorku séra do každé jamky aplikátoru, - vložte aplikátory do vlhké komůrky zoubky směrem nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček), - nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut po nanesení posledního vzorku. Komůrka se může vložit až na 8 hodin do chladničky a analýza může být tak po tuto dobu odložena. Detaily viz příbalový leták vlhké skladovací komůrky. 3. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte migrační rámrček s elektrodami a nosičem aplikátorů nahoru. POzOR : Nikdy nezavírejte víko pokud je migrační rámeček nahoře!

4. Z menu na přístroji zvolte program migrace "7 ISO-LDH" pro HYDRAGEL 7 ISO CK/LD, "15 ISO-LDH" pro HYDRAGEL 15 ISO CK/LD nebo "30 ISO-LDH" pro HYDRAGEL 30 ISO CK/LD. 5. Vyjměte z ochranného obalu pufrované stripy - uchopením za plastikové konce. Děrovanými konci plastikového vyztužení je upevněte na kovové výstupky elektrodového nosiče. Plastikové vyztužení stripů musí směřovat k nosiči (viz Obr. 2). 6. Vybalte agarózovou plotnu HYDRAGEL. - Plotnu rychle osušte tenkým filtračním papírem tak, že jej po povrchu gelu narolujete, aby přilnul k celé ploše a odsál přebytek tekutiny. Papír ihned odstraňte. POzOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu - hrozí dehydratace gelu! - Naneste 120 µL destilované nebo deionizované vody při použití HYDRAGEL 7 ISO CK/LD nebo 200 µL pro HYDRAGEL 15 ISO CK/LD nebo HYDRAGEL 30 ISO CK/LD na dolní třetinu rámečku vyznačeného na migrační ploše. - Opřete gelovou plotnu (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (viz Obr. 3). - Nyní gel ohněte a pokládejte do kontaktu s kapkou vody tak, aby se voda rozprostřela rovnoměrně pod celým gelem bez vzduchových bublin. Gel musí být zarovnán s vyznačeným rámečkem (viz Obr. 3). 7. Snižte migrační rámeček dolů. V této pozici se pufrované stripy nedotýkají gelu. NA MIGRAČNÍ RÁMEČEK NETLAČTE DOLŮ SILOU! 8. Aplikátory nyní vyjměte z vlhké skladovací komůrky. Manipulujte s nimi za pomoci ochranného rámečku. - Odlomte ochranný rámeček chránící zuby aplikátoru. - Pro analýzu 7 a 15 vzorků umístěte aplikátor na nosič do pozice č. 6. - V případě analýzy 30 vzorků umístěte 2 aplikátory na nosič do pozic č. 4 a 9. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátoru musí směřovat k operátorovi (viz Obr. 4). 9. Uzavřete víko migračního modulu. 10. Stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou (levá strana klávesnice) je procedura ihned zahájena. DŮLEŽITÉ : Přesvědčte se, zda není blokován otvor vzduchové ventilace na pravé straně přístroje.

MIGRACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ

• Všechny části migračního rámečku jsou sníženy - stripy s pufrem i aplikátory jsou v kontaktu s povrchem gelu - probíhá aplikace vzorků do gelu. • Nosič aplikátorů vzorků se zvedne, části s elektrodami nesoucí stripy s pufrem zůstávají v kontaktu s povrchem gelu. • Proběhne migrace při konstantních 10 W pro HYDRAGEL 7 ISO CK/LD, při konstantních 20 W pro HYDRAGEL 15 ISO CK/LD, při 20 °C, řízených pomocí Peltierova efektu až do 40 Vh (asi po dobu 8-mi minut) nebo při konstantních 20 W pro HYDRAGEL 30 ISO CK/LD, při 20 °C až do 30 Vh (asi po dobu 6-ti minut). • Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. • Ozve se pípnutí a odjistí se víko. Signál trvá do zásahu operátora. Na displeji se objeví blikající zpráva : "e SUBST." / "e SUBSTRATE". POZN. : Víko migračního modulu zůstává uzavřeno během všech migračních kroků.

II. PŘÍPRAVA INKUBACE SE SUBSTRÁTEM LDH

1. Po ukončení migrace otevřete víko. 2. Vyjměte aplikátory vzorků a odstraňte je. 3. Zvedněte migrační rámeček a vyjměte jej : - odstraňte proužky s pufrem, - pečlivě podélně otřete elektrody měkkým zvlhčeným hadříkem nebo gázou, - gel ponechejte na místě v migračním modulu. 4. Připravte reagenční, žlutou aplikační šablonu č. 4 následujícím postupem (viz Obr. 5) : - umístěte vodič aplikační šablony na ukotvující svorky (může být ponechán), - podržte šablonu za ouško a vložte ji vruby na značky vodiče, - přiložte tuto šablonu na gel. 5 Aplikujte 2 mL roztoku ISO-LDH substrátu pro HYDRAGEL 7 ISO CK/LD kit, nebo 4 mL roztoku substrátu ISO-LDH pro HYDRAGEL 15 ISO CK/LD nebo HYDRAGEL 30 ISO CK/LD dle následujícího schematu (viz Obr. 6) : - držte vertikálně pipetu, - lehce vtiskněte její špičku do otvoru v šabloně, - postupně pečlivě pipetujte reagencii bez zanechání bublin pod šablonou. 6. Uzavřete víko HYDRASYSu. 7. Stisknutím klávesy se zelenou šipkou "START" na levé straně klávesnice proces nastartujete. Na displeji se zobrazí nápis : "[INCUBATION]".

INKUBACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH KROKŮ

• Inkubace při teplotě 45 °C, řízené Peltierovým efektem, po dobu 20-ti minut. • Ochlazení plotny na 20 °C během 5-ti minut. • Zazní pípnutí a víko se odjistí. Signál trvá až do zásahu obsluhy. Na displeji se objeví následující blikající zpráva : "a SUBST." / "a SUBSTRATE". POZN. : Během inkubace zůstává víko migračního modulu uzamčeno. - 132 -

III. ODSTRANĚNÍ SUBSTRÁTU A APLIKACE ZASTAVOVACÍHO ROZTOKU

HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-LDH - 2016/06

1. Otevřete víko. 2. Stiskněte tlačítko "START" (zelená šipka vlevo na klávesnici). 3. Odstraňte zbývající roztok substrátu během 15-ti vteřin odpočítávání : - držte pipetu vertikálně a lehce vtlačte její špičku do jamky (viz Obr. 6), - pečlivě odsajte zbylý substrát. 4. Po 15-ti vteřinách zazní pípnutí a je zobrazena následující blikající zpráva : "e BLOC." / "e BLOCKING SOLUTION". 5. Napipetujte 2 mL zastavovacího roztoku pro HYDRAGEL 7 ISO CK/LD nebo 4 mL pro HYDRAGEL 15 ISO CK/LD nebo HYDRAGEL 30 ISO CK/LD do téže šablony (viz Obr. 6). Pozor na vniknutí bublin při pipetování! 6. Uzavřete víko HYDRASYSu. 7. Po stisknutí tlačítka "START" (zelená šipka na levé straně klávesnice) se na displeji zobrazí nápis "BLOCKING".

POPIS AUTOMATICKÝCH KROKŮ "BLOCKING"

• Inkubace při 20 °C po dobu 10-ti minut. • Pípnutí signalizuje odjištění víka. Na displeji se zobrazí "a BLOC." / "a BLOCKING SOLUTION". POZN. : Během inkubace zůstává víko migračního modulu uzavřeno.

IV. ODSTRANĚNÍ ZASTAVOVACÍHO ROZTOKU A APLIKACE FILTRAČNÍHO PAPÍRU 1. 2. 3. 4.

5. 6.

7. 8. 9.

Otevřete víko. Stiskněte tlačítko "START" (zelená šipka vlevo na klávesnici). Odstraňte zastavovací roztok pipetou během 15-ti vteřin odpočítávání (viz ODSTRANĚNÍ SUBSTRÁTU). Vyjměte šablonu : - Uchopte šablonu za ouško. - Zvedněte ji a vyjměte. Po 15-ti vteřinách zazní pípnutí a je zobrazena následující blikající zpráva : "e PAP." / "e THICK FILTER PAPER". Položte jeden silný filtrační papír na gel : - Filtrační papír držte v úhlu 45°. - Jeho dolní část zarovnejte se spodním okrajem gelu. - Položte jej na gel. - Jemným tlakem přitiskněte filtrační papír tak, aby přilnul celým svým povrchem k gelu. Uzavřete víko HYDRASYSu. Odsávací procedura se nastartuje po stisknutí tlačítka "START" (zelená šipka na levé straně klávesnice). Opláchněte šablonu destilovanou vodou nebo alkoholem a důkladně osušte savým papírem. Před opakovaným použitím musí být šablona vždy dokonale suchá.

ODSÁVÁNÍ (BLOTTING) – POPIS AUTOMATIZOVANÝCH KROKŮ

• Odsávání při 20 °C po dobu 3 minut. Na displeji je nápis "[BLOTTING]". • Plotna se zahřívá na 35 - 40 °C - na 1 minutu. • Do zásahu obsluhy zní pípání. Na displeji se zobrazí nápis "a PAP." / "a THICK FILTER PAPER".

V. SUŠENÍ GELU 1. 2. 3. 4.

Otevřete víko. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na místě. Zavřete víko. Sušení nastartujete stiskem klávesy "START" (zelená šipka vlevo na klávesnici).

SUŠENÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH KROKŮ

• Gel se suší po dobu 4 minut, při 50 °C. • Zazní pípnutí a víko se odjistí. Teplota plotny zůstává až do otevření na 50 °C. POZN. : V průběhu sušení zůstává víko migračního modulu zajištěno.

VI. SKENOVÁNÍ GELU

1. Otevřete víko. 2. Vyjměte osušený gel. 3. Očistěte zadní stranu (plastiková podpůrná) osušené plotny pomocí zvlhčeného měkkého hadříku nebo buničiny. 4. Pozor na vlákna buničiny na gelové straně! 5. Nasnímejte denzitometrem / skenerem výběrem vhodného programu snímání. POZN. : Délka jednotlivých elektroforeogramů se může lehce lišit na gelech obsahujících vzorky ve 2 nebo 3 řadách, bez následku na provedení testu. 6. Teplota migrační plochy klesne v méně než 5-ti minutách na 20 °C a může být nastartováno další dělení. 7. Umístěte migrační rámeček zpět na své místo do HYDRASYSu. 8. Otřete migrační plochu měkkým, vlhkým hadříkem.

KONTROLA KVALITY

Doporučuje se zařadit kontrolní vzorek se známými hodnotami (např. Enzycontrol SEBIA, kat. č. 4790) do každé série měření.

- 133 -

HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-LDH - 2016/06

VÝSLEDKY Hodnoty

Denzitometrické skenování nabarvených polí elektroforegramů (procentuálních hodnot) relativních koncentrací každé frakce. Po elektroforetickém rozdělení a vizualizaci, jsou jednotlivé frakce identifikovány takto : LD1 - nejrychlejší frakce se nachází v zóně albuminu, LD5 - frakce nejblíže katodě se vyskytuje v zóně gamaglobulinů. U vzorků zdravých pacientů (v normě) je největší frakcí LD2, následovně LD1 a LD3, LD4 a LD5 jsou minoritními složkami. Referenční hodnoty (průměr ± 2 SD) jednotlivých frakcí stanovené metodou HYDRAGEL 7 ISO CK/LD, HYDRAGEL 15 ISO CK/LD nebo HYDRAGEL 30 ISO CK/LD byly stanoveny vyšetřením 200 zdravých dospělých jedinců (mužů i žen) : LDH1 : 16.1 - 31.5 % LDH2 : 29.2 - 41.6 % LDH3 : 17.0 - 26.2 % LDH4 : 5.9 - 12.3 % LDH5 : 3.2 - 17.3 % Je doporučeno, aby si každá laboratoř stanovila své vlastní referenční hodnoty.

Interpretace2-4

SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace.

Výsledky rozdělení LD izoenzymů by neměly být interpretovány bez znalosti pacientova klinického stavu a anamnézy. Příklady abnormálního rozdělení LD izoenzymů : 1. Zvýšení LD1 a LD2 - hodnota frakce LD1 je větší než hodnota LD2 (LD1 / LD2 flip) : - infarkt myokardu, stavy po chirurgických výkonech, - perniciózní anemie, hemolytická anemie, akutní srpkovitá anemie a megaloblastická anemie, - hemolýza z jakékoli příčiny, - Duchennova svalová dystrofie (relativní zvýšení LD1 a LD2). 2. Zvýšení frakcí "střední zóny" : LD3 a obecně i frakcí LD2 a LD4 : - masívní rozpad krevních destiček : např. u plicního infarktu, - postižení lymfatického systému : infekční mononukleóza, lymfomy a lymfatické leukemie. 3. Zvýšení LD5 : - poranění, zánětlivá a degenerativní onemocnění kosterního svalstva, - poškození jater - cirhóza jater, zánět jater, městnání v játrech, - městnavé srdeční selhání.

Problémy

Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte TechnickoServisní středisko vašeho dodavatele. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : www.sebia.com.

HODNOTY

HYRYS

Denzitometr HYRYS fy SEBIA byl použit pro denzitometrická hodnocení.

Reprodukovatelnost na gelu a mezi šaržemi

Tři různé vzorky séra (A, B a C) byly analyzovány elektroforézou na HYDRAGEL ISO CK/LD 15/30 gelech dvou šarží. Vzorek A byl normální z hlediska izoenzymů LD, B a C měl zvýšenou LD5. Každý vzorek byl testován na všech 15ti drahách jednoho gelu obou šarží. Elektroforeogramy byly hodnoceny denzitometricky. Následující tabulka ukazuje reprodukovatelnost na gelu jako průměry, SD´ a CV´ vypočítané pro směsná data pro každou frakci (15 drah každého gelu/šarže bylo kombinováno pro každý vzorek). PARAMETR LD1 LD2 Vzorek A : šarže č. 1 / šarže č. 2 / směsná data PRŮMĚR (%) 28.0 - 28.9 - 28.5 34.8 - 35.2 - 35.0 SD 0.60 - 0.96 - 0.92 0.76 - 0.67 - 0.73 CV % 2.1 - 3.3 - 3.2 2.2 - 1.9 - 2.1 Vzorek B : šarže č. 1 / šarže č. 2 / směsná data PRŮMĚR (%) 6.8 - 7.0 - 6.9 14.7 - 14.8 - 14.8 SD 0.33 - 0.34 - 0.35 0.52 - 0.53 - 0.52 CV % 4.9 - 4.8 - 5.0 3.5 - 3.6 - 3.5 Vzorek C : šarže č. 1 / šarže č. 2 / směsná data PRŮMĚR (%) 16.5 - 16.8 - 16.7 17.1 - 17.0 - 17.0 SD 0.45 - 0.47 - 0.47 0.30 - 0.48 - 0.40 CV % 2.7 - 2.8 - 2.8 1.8 - 2.9 - 2.4

LD3

LD5

19.4 - 19.1 - 19.2 0.57 - 0.54 - 0.56 2.9 - 2.8 - 2.9

8.2 - 7.7 - 8.0 0.38 - 0.54 - 0.51 4.7 - 6.9 - 6.4

9.6 - 9.0 - 9.3 0.45 - 0.51 - 0.56 4.6 - 5.6 - 5.0

18.3 - 18.2 - 18.3 0.24 - 0.27 - 0.25 1.3 - 1.5 - 1.4

12.9 - 13.0 - 13.0 0.26 - 0.20 - 0.23 2.0 - 1.5 - 1.8

35.1 - 35.0 - 35.1 0.57 - 0.48 - 0.52 1.6 - 1.4 - 1.5

13.3 - 13.5 - 13.4 0.23 - 0.18 - 0.22 1.8 - 1.4 - 1.7

- 134 -

LD4

11.5 - 11.3 - 11.4 0.32 - 0.28 - 0.31 2.8 - 2.5 - 2.7

53.6 - 53.4 - 53.6 1.18 - 1.22 - 1.19 2.2 - 2.3 - 2.2

HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-LDH - 2016/06

Přesnost - Srovnávací studie

Sto dvacet (120) různých vzorků séra (normálních i patologických) bylo analyzováno pomocí HYDRAGEL 15 & 30 ISO-LDH souprav fy SEBIA a jiného, komerčně dostupného elektroforetického systému pro stanovení izoenzymů LD. Výsledky lineární regresní analýzy denzitometrických hodnot obou technik jsou vyneseny v následné tabulce. Poměr LD1 / LD2 byl spočítán pro každý vzorek a techniku. Shoda byla v 97.5 % mezi oběmi technikami v identifikaci vzorků podle LD1 / LD2 poměrů ratio < 1.0 a s LD1 / LD2 poměr > 1.0. PARAMETR

Korelační koef. y - úsek

Sklon Rozsah % hodn. (SEBIA's test)

y = hodnoty SEBIA

LD1

0.96

LD2

LD3

LD4

LD5

2.7

0.96

- 0.08

0.95

0.96 1.1

- 0.7

6.6 - 36.5

13.3 - 52.9

7.7 - 30.4

3.1 - 16.6

5.6 - 60.1

0.94

0.6

0.96

1.01

0.89

0.99 0.97

Linearita - Citlivost

Na gel byl aplikován vzorek s celkovou aktivitou 50 IU/L - 750 IU/L, který vykazoval perfektní linearitu pro všech 5 frakcí. Dobrou citlivost dokazuje průměrná variace of 2 IU/L na frakci, která může být detekována.

GELSCAN

Pro veškerá denzitometrická měření byl použit Denzitometr GELSCAN SEBIA. Tyto výsledky získané pomocí denzitometru GELSCAN snímáním postupů s gely HYDRAGEL 7 ISO-LDH, HYDRAGEL 15 ISO-LDH a HYDRAGEL 30 ISO-LDH prováděné na systému HYDRASYS ukázaly velice dobrou reprodukovatelnost v rámci stejných gelů a i při srovnání gelů mezi sebou použitelnou pro kvantitativní rozbory pomocí GELSCANu s průměrným variačním koeficientem okolo 1.3 % pro každou frakci laktátdehydrogenázy.

Reprodukovatelnost na gelu

Na zařízení HYDRASYS byly analyzovány tři (3) různé vzorky sér pomocí postupů s gely HYDRAGEL 7, 15 a 30 ISO-LDH a byly denzitometricky snímány na GELSCANu. Každý vzorek měl analyzovány všechny stopy každého gelu. Pro každý vzorek a gel byl určen průměr, směrodatná odchylka a variační koeficient (pro n = 7, 15 nebo 30 podle zvoleného postupu). Následující tabulka ukazuje hodnoty spočítané pro tři testované vzorky pro každou frakci laktátdehydrogenázy změřenou třemi postupy na zařízení HYDRASYS a po denzitometrickém snímání na GELSCANu. FRAKCE

LD1

LD2

LD3

Skupina normálních vzorků séra: HYDRAGEL 7 ISO-LDH - 15 ISO-LDH - 30 ISO-LDH PRŮMĚR (%) SD

CV (%)

21.4 - 20.5 - 21.3 0.26 - 0.56 - 0.93 1.2 - 2.7 - 4.4

35.1 - 32.8 - 33.7

22.7 - 26.0 - 25.4

0.33 - 0.83 - 0.85

0.28 - 0.41 - 0.60

1.0 - 2.5 - 2.5

1.2 - 1.6 - 2.4

Patologický vzorek séra č. 1: HYDRAGEL 7 ISO-LDH - 15 ISO-LDH - 30 ISO-LDH PRŮMĚR (%) SD

CV (%)

14.2 - 14.4 - 13.7 0.16 - 0.43 - 0.62 1.1 - 3.0 - 4.5

23.1 - 21.4 - 22.3

17.3 - 18.5 - 18.3

0.50 - 0.81 - 0.57

0.45 - 0.49 - 0.50

2.2 - 3.8 - 2.6

2.6 - 2.7 - 2.7

Patologický vzorek séra č. 2: HYDRAGEL 7 ISO-LDH - 15 ISO-LDH - 30 ISO-LDH PRŮMĚR (%) SD

CV (%)

30.8 - 31.7 - 32.6 0.46 - 0.34 - 0.51 1.5 - 1.1 - 1.6

16.4 - 16.8 - 16.9

20.9 - 20.5 - 19.9

0.16 - 0.33 - 0.31

0.17 - 0.48 - 0.48

1.0 - 2.0 - 1.8

0.8 - 2.3 - 2.4

LD4

11.0 - 12.3 - 11.1

LD5

9.8 - 8.3 - 8.5

0.38 - 0.64 - 0.86

0.56 - 0.62 - 0.84

11.4 - 11.4 - 11.0

34.0 - 34.3 - 34.8

11.2 - 10.9 - 10.6

20.8 - 20.1 - 20.0

3.5 - 5.2 - 7.8

0.34 - 0.81 - 0.67 3.0 - 7.1 - 6.1

0.22 - 0.28 - 0.21 1.9 - 2.6 - 1.9

Reprodukovatelnost mezi jednotlivými snímáními bez posunování gelu na držáku na GELSCANu

5.7 - 7.4 - 9.9

0.37 - 0.51 - 0.59 1.1 - 1.5 - 1.7

0.27 - 0.47 - 0.35 1.3 - 2.3 - 1.8

Reprodukovatelnost byla stanovena analýzou jednoho kontrolního séra postupem HYDRAGEL 15 ISO-LDH (15 analýz na gel) na zařízení HYDRASYS se šesti následnými denzitometrickými snímáními na GELSCANu bez posunování gelu v držáku na GELSCANu. Pro každý rozbor kontrolního séra a každou zónu byl ze šesti snímání spočítán průměr, směrodatná odchylka a variační koeficient (n = 6). Tabulka ukazuje limitní hodnoty pro testované vzorky včetně průměrných variačních koeficientů určených z variačních koeficientů pro každou frakci LD (n = 15). FRAKCE LD1 LD2 LD3 LD4 LD5

PRŮMĚR (%)

SD

CV (%)

PRŮMĚR CV (%)

0.2 - 0.6

0.4

30.7 - 32.2

0.04 - 0.26

0.1 - 0.8

19.8 - 21.4

0.04 - 0.13

0.2 - 0.6

19.7 - 21.0

0.04 - 0.29

15.9 - 17.1 10.6 - 11.3

0.04 - 0.11 0.05 - 0.11

- 135 -

0.4 - 1.0 0.2 - 1.4

0.4 0.4 0.7 0.7

HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-LDH - 2016/06

Reprodukovatelnost mezi jednotlivými snímáními po přenastavení gelu v držáku na GELSCANu

Reprodukovatelnost byla stanovena analýzou jednoho kontrolního séra postupem HYDRAGEL 15 ISO-LDH (15 analýz na gel) na zařízení HYDRASYS se šesti následnými denzitometrickými snímáními na GELSCANu po přenastavení gelu v držáku na GELSCANu. Pro každý rozbor kontrolního séra a každou zónu byl ze šesti snímání spočítán průměr, směrodatná odchylka a variační koeficient (n = 6). Tabulka ukazuje limitní hodnoty pro testované vzorky včetně průměrných variačních koeficientů určených z variačních koeficientů pro každou frakci LD (n = 15). FRAKCE

PRŮMĚR (%)

LD1 LD3 LD4 LD5

PRŮMĚR CV (%)

0.2 - 0.7

0.4

0.2 - 0.8

19.9 - 21.5

0.05 - 0.15

0.2 - 0.7

10.6 - 11.3

Přesnost – Srovnávací studie

CV (%)

0.05 - 0.24

16.0 - 17.1

LD2

SD

30.8 - 32.2

19.5 - 20.9

0.04 - 0.12 0.05 - 0.13

0.4 - 1.2

0.05 - 0.27

0.2 - 1.3

0.4 0.4 0.7 0.7

Rozbor 104 různých patologických a normálních vzorků sér elektroforézou na agarózovém gelu postupy HYDRAGEL 7, 15 a 30 ISO-LDH na systému HYDRASYS a snímáním denzitometry GELSCAN nebo HYRYS ukázal na 5 frakcích laktátdehydrogenázy dokonalou shodu mezi oběma kvantifikačními systémy. Korelační parametry pro jednotlivé zóny vypočítané ze směsných hodnot pro gely HYDRAGEL 7, 15 a 30 ISO-LDH a GELSCAN vs. srovnávací systém (y = HYDRAGEL 7, 15 a 30 ISO-LDH a GELSCAN) byly : Frakce LD1 LD2 LD3 LD4 LD5

Linearita - Citlivost

0.947

Rozsah hodnot (%) HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-LDH (GELSCAN) 7.7 - 33.4

0.952

6.4 - 19.7

Korelační koeficient

y-úsek

Sklon

0.983

2.216

0.891

0.984 0.972 0.843 0.989

1.972 2.723 0.869 1.059

0.859 0.972

13.6 - 44.7 14.4 - 29.9 5.1 - 52.9

V různých poměrech byly smíchány dva různé vzorky sér (s 225 IU/L celkové LD aktivity) a roztoky byly elektroforeticky analyzovány postupem HYDRAGEL 15 ISO-LDH. Tento test ukázal dobrou linearitu pro každou frakci LD a jakákoli změna mohla být detekována podle poměru jednotlivých vzorků ve směsi. Dobrá citlivost byla prokázána dobrou variací 2 IU/L na detekovanou frakci. Vzorek séra, který byl postupně zředěn na celkovou aktivitu LD v rozsahu 50 – 750 UI/L ukázal pro 5 frakcí vynikající linearitu v celém sledovaném rozsahu

- 136 -

BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. 2. 3. 4.

HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-LDH - 2016/06

Amador E, Dorfman LE, Wacker WEC: Serum lactic dehydrogenase: An analytical assessment of current assays. Clin. Chem. 9:391, 1963. Erickson RJ, Morales DR: Clinical use of lactate dehydrogenase. N. Engl. J. Med. 265:478, 1961. Kachmar JF, Moss DW: Enzymes. In Fundamentals of Clinical Chemistry. NW Tietz, Editor, Saunders, Philadelphia, 1976, pp 652-660. Zimmerman HJ, Henry JB: Clinical Enzymology. In Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 16th ed., JB Henry, Editor, Saunders, Philadelphia, 1979, pp 365-368.

- 203 -

SCHÉMAS / FIGURES

Figure 1

HYDRAGEL 7, 15 & 30 ISO-LDH - 2016/06

Figure 2

9 10 78 56 34 12

11

12

13

15 14

Figure 3

Figure 4

12

123

456

789

10 11

12 13

14 15

Figure 5

Figure 6

- 204 -

34

5 6 sebia 78 9 10 11

12

Benelux SCS / Comm. V Jan Olieslagerslaan 41 1800 Vilvoorde Belgique / België Tél. : 32 (0)2 702 64 64 : 32 (0)2 702 64 60 Fax e-mail : [email protected]

Brasil Edifício Baker Office Tower Rua Barão do Triunfo, 73, conjunto 51 CEP 04602-000 Bairro Brooklin Paulista, São Paulo - SP Brasil Tel. : 55 11 3849 0148 Fax : 55 11 3841 9816 e-mail : [email protected]

GmbH Münsterfeldallee, 6 36041 Fulda Deutschland Tel. : 49 (0)661 3 30 81 Fax : 49 (0)661 3 18 81 e-mail : [email protected]

Hispania S.A. C/Sicilia, n° 394 08025 Barcelona España Tel. : 34 93 208 15 52 Fax : 34 93 458 55 86 e-mail : [email protected]

Inc. 400-1705 Corporate Drive Norcross, GA 30093 U.S.A. Tel. : 1 770 446 - 3707 Fax : 1 770 446 - 8511 e-mail : [email protected]

Italia S.r.l. Via Antonio Meucci, 15/a 50012 Bagno a Ripoli (FI) Italia Tel. : 39 055 24851 Fax : 39 055 0982083 e-mail : [email protected]

UK Ltd River Court, Meadows Business Park Station Approach, Blackwater Camberley, Surrey, GU17 9AB United Kingdom Tel. : 44 (0)1276 600636 Fax : 44 (0)1276 38827 e-mail : [email protected]

Parc Technologique Léonard de Vinci CP 8010 Lisses - 91008 EVRY Cedex - France Tél. : 33 (0)1 69 89 80 80 - e-mail : [email protected]

Shanghai Representative Office Cross Tower, Room 2306-07 318 Fuzhou Road Shanghai 200001 China Tel. : 00 86 (21) 6350 1655 Fax : 00 86 (21) 6361 2011 e-mail : [email protected]