HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING

HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING

Ref. 4357 Ref. 4390*

2017/01

HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING - 2017/01

POUŽITÍ SADY

Sada HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING je navržena pro kvalitativní detekci a identifikaci různých fenotypů alfa-1 antitrypsinu (A1AT). Výsledky fenotypizace společně s klinickými nálezy a dalšími laboratorními vyšetřeními pomáhají při diagnóze deficience alfa-1 antitrypsinu. Analýza se provádí v lidském séru rozděleném elektroforeticky a připraveném pro kvalitativní analýzu. Tento postup zahrnuje isoelektrickou fokusaci na agarosovém gelu prováděnou poloautomatickým systémem HYDRASYS následovanou imunofixací pomocí antiséra anti-alfa-1 antitrypsinu. Použití enzymu označeného antisérem anti-alfa-1 antitrypsinu zlepšuje detekci a identifikaci různých fenotypů. Každý agarosový gel v sadě HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING je určen k analýze 18 vzorků. Pro diagnostické použití In Vitro.

POZNÁMKA : V tomto návodu se název "HYDRASYS" používá pro poloautomatické přístroje HYDRASYS a HYDRASYS 2.

PRINCIP TESTU

Alfa-1 antitrypsin (A1AT) je polymorfní glykoprotein obsažený v normálním lidském séru. Patří do skupiny proteinů, které inhibují různé lidské proteasy, včetně trypsinu, katepsinu G, nutrofilní elastasy atd. (1, 3, 6, 11). Gen pro A1AT je kódován na jednom místě chromozomu 14 a je produkován především v jaterních buňkách a imunitním systémem. Tento polymorfický gen se vyskytuje v různých alelách označovaných písmeny, například M po normální, Z a S pro deficientní, nebo chybějící (2, 4, 7, 12). Jedinci s ZZ, SZ, MZ … nebo nulovým fenotypem vykazují zvýšené riziko onemocnění, které se může lišit u pacientů se stejným fenotypem (5, 8). Deficience A1AT je genetická porucha poprvé popsaná u pacientů s pulmonální emfysémií (5, 14). Vyšetření se provádí ve dvou stupních : • Isoelektrická fokusace na agarosovém gelu s cílem rozštěpit proteiny v vzorcích séra. • Imunofixace enzymem (peroxidasou) označeným antisérem anti-alfa-1 antitrypsin pro detekci různých fenotypů alfa-1 antitrypsinem. Poloautomatický systém HYDRASYS provádí všechny kroky potřebné pro získání gelů připravených k interpretaci.

REAGENTY A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SADÁCH HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy.

POLOŽKA Agarosové gely (připravené k použití) Roztok etylenglykolu (připravený k použití) Anodický roztok (připravený k použití) Katodický roztok (připravený k použití) Proužky Ředicí roztok pro vzorek CSF / A1AT / TRF (připravený k použití) Ředicí roztok pro antisérum A1AT (připravený k použití) Promývací roztok A1AT / TRF (připravený k použití) Rehydratační roztok (připravený k použití) Rozpouštědlo TTF1 / TTF2 (připravené k použití) TTF1 (zásobní roztok) TTF2 (zásobní roztok) Aplikátory (připravené k použití) Nádoby s tlumicím roztokem (připravené k použití) Jednožlábkový antisérový segment (připravený k použití) Filtrační papíry - Tenké Filtrační papíry - Silné

(*) HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING MAXI-KIT

PN 4357 10 gelů 1 lahvička, 3 mL 1 lahvička, 50 mL 1 lahvička, 50 mL 10 balení po 2 kusech 1 lahvička, 85 mL 1 lahvička, 7.5 mL 1 lahvička, 70 mL 2 lahvičky, 70 mL 1 lahvička, 40 mL 2 lahvičky, 0.5 mL 2 lahvičky, 0.5 mL 1 balení po 10 kusech (18 zubů) 1 balení po 2 kusech 2 balení po 5 kusech 1 balení po 10 kusech 4 balení po 10 kusech

PN 4390* 80 gelů 8 lahvičky, 3 mL 8 lahvičky, 50 mL 8 lahvičky, 50 mL 80 balení po 2 kusech 2 lahvičky, 85 mL 6 lahvičky, 7.5 mL 8 lahvičky, 70 mL 16 lahvičky, 70 mL 8 lahvičky, 40 mL 16 lahvičky, 0.5 mL 16 lahvičky, 0.5 mL 8 balení po 10 kusech (18 zubů) 8 balení po 2 kusech 16 balení po 5 kusech 8 balení po 10 kusech 32 balení po 10 kusech

Během přepravy může být souprava uchována bez zmražení (15 až 30 °C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku.

1. AGAROSOVÉ GELY Příprava

Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; amfolyty ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Nosné médium pro isoelektrickou fokusaci a imunofixaci bílkovin.

Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku

Gely skladujte horizontálně v originálním ochranném balení a v chladničce (2 až 8 °C). Jsou stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady a na balení gelu (šipka na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Neskladovat v blízkosti okna nebo tepelného zdroje. Zamezte prudkým změnám teploty při skladování. NEMRAZIT. - 188 -

SEBIA NÁVOD - Czech


Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelu a pokud struktura změkne (oboje v důsledku zmrazení gelu), (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). POZNÁMKA : Po skladování při 2 - 8 °C a před použitím se doporučuje nechat gel v ochranném obalu při pokojové teplotě 5 až 10 minut.

DŮLEŽITÉ : Nepoužité gely musí být vždy skladovány při 2 - 8 °C a neměly by být vystaveny změnám teploty při skladování mezi teplotou 2 - 8 °C a pokojovou teplotou a naopak.

2. ROZTOK ETYLENGLYKOLU Příprava

Roztok etylenglykolu je připraven k použití.

Použití

Účelem je vytvoření efektivního kontaktu mezi plastovým podkladem gelu a tepelně regulační destičkou migračního modulu během elektroforetické migrace. DŮLEŽITÉ : Po každém použití lahvičku s roztokem okamžitě etylenglykolu a těsně uzavřete, abyste zabránili oxidaci roztoku.


Zásobní roztok etylenglykolu skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady či na štítku lahvičky.

3. ANODICKÉ A KATODICKÉ ROZTOKY Příprava

Anodický roztok (kyselý roztok) a katodický roztok (zásaditý roztok) jsou připravené pro použití. Oba tyto roztoky obsahují přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. POZNÁMKA : Anodický roztok má červenou barvu, což napomáhá jeho aplikaci a snadné identifikaci připraveného anodického proužku.

Použití

Jako elektrolyty pro přípravu anodických a katodických proužků pro isoelektrickou fokusaci. DŮLEŽITÉ : Po každém použití lahvičku s katodickým roztokem okamžitě a těsně uzavřete, abyste zabránili karbonaci tohoto roztoku.


Anodický a kyselý roztok může být skladován při pokojové teplotě nebo v chladničce do doby expirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Roztoky nesmí obsahovat sraženiny.

4. PROUŽKY Příprava

Namočte dva sací proužky do anodického případně katodického roztoku 5 minut před použitím : Na rovný povrch položte šedou nádobu pro anodický proužek a modrou pro katodický. Naneste 5 mL červeného anodického roztoku do šedé nádoby a 5 mL bezbarvého katodického roztoku do modré nádoby. Otevřete balení sacích proužků položte je do každé nádoby. Při manipulaci držte proužky za plastové konce. Rovnoměrně je namočte několikerým stlačením špičkou odpovídajících pipet. Namočené proužky ihned použijte. DŮLEŽITÉ : Proužky namáčejte těsně před použitím, abyste zabránili karbonaci katodického roztoku.

POZNÁMKA : Pokud jsou houbovité proužky suché (pevné) doporučuje se je nejprve namočit v anodickém nebo katodickém roztoku takto :

- vložit do vyhrazené nádoby, - překrýt houbičky 6 mL destilované nebo deionizované vody a namočit na přibližně 30 sekund. Několikrát stlačte houbovitý proužek v celé délce za pomoci pipetovací špičky pro zajištění úplného namočení houbičky, - vyždímejte houbičku absorpčním papírem, abyste odstranili přebytečnou vodu, - před saturací houbičky anodickým nebo katodickým roztokem pečlivě zkontrolujte, že jsou nádoby prázdné a suché.

Použití

Proužky namočené v anodickém nebo katodickém elektrolytickém roztoku zaručují kontakt mezi gelem a elektrodami a určují rozsah pH během fokusace.


Vlhké proužky v originálním ochranném obalu mohou být ukládány při pokojové teplotě nebo v chladničce. Musí být ukládány vodorovně (šipka na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Jsou stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na balení proužků. NEMRAZIT.

5. ŘEDICÍ ROZTOK NA VZOREK CSF / A1AT / TRF Příprava

Ředicí roztok vzorku je připraven k použití. Obsahuje : přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Pro ředění vzorků séra.


Ředicí roztok vzorku skladujte v chladničce (2 až 8 °C). Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Ředicí roztok nesmí obsahovat sraženiny.

6. ŘEDICÍ ROZTOK NA ANTISÉRUM A1AT Příprava

Ředicí roztok na antisérum je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok s pH 10.0 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. - 189 -


Použití

Pro ředění antiséra těsně před použitím.


Ředicí roztok na antisérum může být uchováván při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Ředicí roztok na antisérum nesmí obsahovat sraženiny. POZNÁMKA : Během uložení může ředicí roztok na antisérum zmodrat. Nemá to vliv na jeho funkci.

7. PROMÝVACÍ ROZTOK A1AT / TRF Příprava

Promývací roztok A1AT / TRF je připraven k použití. Obsahuje : tlumivý roztok s pH 10,5 ± 0,5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Pro vymývání agarózového gelu po odsávacím kroku, který následuje po inkubaci s peroxidázou značeném antiséru.

Skladování, stabilita a známky zhoršování

Promývací roztok může být skladován při pokojové teplotě nebo v chladničce a je stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Promývací roztok nesmí obsahovat sraženinu.

8. REHYDRATAČNÍ ROZTOK Příprava

Rehydratační roztok je připraven k použití. Obsahuje složky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Pro rehydratici agarosového gelu před vizualizačním krokem na základě peroxidasy.


Rehydratační roztok může být skladován při pokojové teplotě nebo v chladničce do doby expirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Rehydratační roztok nesmí obsahovat sraženiny.

9. ROZPOUŠTĚDLO TTF1 / TTF2 Příprava

Rozpouštědlo TTF1 / TTF2 je připraveno k použití. Obsahuje složky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Pro přípravu vizualizačního roztoku TTF, jak je popsáno v bodu 10.


Rozpouštědlo TTF1 / TTF2 lze skladovat a je stabilní při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla TTF1 / TTF2. Rozpouštědlo TTF1 / TTF2 nesmí obsahovat sraženiny.

10. TTF1 A TTF2 Příprava

- 30 minut před použitím uložte lahvičky TTF1 a TTF2 při pokojové teplotě. - Každou lahvičku před přípravou pracovního vyvolávacího roztoku dobře homogenizujte promícháním. - Těsně před použitím připravte pracovní vyvolávací roztok TTF. Abyste vyloučili riziko srážení, přidávejte nezbytné reagencie v následujícím pořadí : 4 mL rozpouštědla TTF1 / TTF2, 100 μL TTF1, 100 μL TTF2 a 4 μL 30 % peroxidu vodíku (H2O2).

Použití

Pro vizualizaci fenotypů alfa-1 antitrypsinu separovaného pomocí isofokusace pomocí antiséra označeného peroxydasou.


Lahvičky TTF1 a TTF2 skladujte v chladničce. Stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítcích lahviček TTF1 a TTF2. Roztoky TTF1 a TTF2 nesmí obsahovat sraženiny. DŮLEŽITÉ : Po skladování při 2 – 8 °C mají zásobní roztoky TTF1 a TTF2 pevné skupenství, ale při pokojové teplotě se snadno znovu rozpustí. Lahvičky TTF1 a TTF2 musí být umístěny v pokojové teplotě 30 minut před použitím. Každou lahvičku před přípravou pracovního vyvolávacího roztoku dobře homogenizujte promícháním.

11. APLIKÁTORY Použití

Nařezané aplikátory pro jednorázové použití určené k nanášení vzorků na gel.


Aplikátory skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.

12. NÁDOBY NA TLUMICÍ ROZTOK Použití

Barevné nádoby pro opakované použití při přípravě anodických a katodických proužků. Šedá nádoba je určena na anodický proužek a modrá nádoba je určena na katodický proužek. Po každém použití vypláchněte obě dvě nádoby destilovanou nebo deionizovanou vodou a vysušte je.

Skladování, stabilita a známky znehodnocení

Čisté nádoby na tlumicí roztok skladujte na rovném povrchu při pokojové teplotě.

13. ANTISÉROVÉ SEGMENTY Použití

Barvené segmenty na jedno použití pro aplikaci antiséra na gely k imunofixaci pomocí dynamické masky. VAROVÁNÍ : Se segmeny s antisérem musí být zacházeno opatrně. - 190 -


14. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Použití

Nařezané bločky tenkého absorpčního papíru pro jednorázové použití jsou určeny pro odsátí přebytečné vlhkosti z povrchu gelu před nanesením vzorků.

Skladování

Tenké filtrační papíry skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.

15. SILNÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Použití

Bločky tlustého absorpčního papíru pro jednorázové použití určené k odsátí nevysrážených bílkovin z povrchu gelů po provedení imunofixace, vymývání, rehydratace a přebytků vizualizačního činidla.

Skladování

Tlusté filtrační papíry skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.

POTŘEBNÁ ČINIDLA PRODÁVANÁ SAMOSTATNĚ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy.

1. ANTISÉRUM ANTI-A1AT - PER Příprava

Lahvička anti-A1AT – PER antiséra (SEBIA, PN 4746) obsahuje savčí imunoglobuliny namířené proti lidskému alfa-1-antitrypsinu, konjugované peroxidázou. Antisérum anti-A1AT - PER je ve stabilizované lyofilní formě. Pro snadnou identifikaci a jako pomůcka pro sledování jeho použití je antisérum obarveno neškodným barvivem tak, aby jeho barva odpovídala štítku lahvičky. Rekonstituce lyofilizovaného anti-A1AT - PER antiséra a příprava pracovního roztoku (zředěného antiséra) : Viz pokyny pro použití anti-A1AT – PER antiséra, SEBIA.

Použití

Pro imunofixaci a vizualizaci fenotypů lidského alfa-1 antitrypsinu rozdělených isoelektrickou fokusací.


Viz pokyny pro použití anti-A1AT – PER antiséra, SEBIA.

2. PEROXID VODÍKU : H2O2, 30 % (110 Obj.)

Peroxid musí být uchováván v tmavé lahvi a v chladničce (2 až 8 °C). Při dávkování vždy používejte čistou pipetu, abyste zabránili kontaminaci obsahu lahve.

3. ODBARVOVACÍ ROZTOK Příprava

Každá lahvička zásobního Odbarvovacího Roztoku (SEBIA, kat č. 4540, 10 lahviček, 100 mL v každé) může být zředěna destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 100 litrů. Praktické je zředit pouze 5 mL zásobního roztoku na 5 litrů, což je objem láhve na odbarvovací roztok. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok pH ≈ 2.

Použití

Pro opláchnutí gelu po enzymatické vizualizaci a sušení a pro vypláchnutí barvicího prostoru HYDRASYS. K neutralizaci kyselé reakce odbarvovacího roztoku nalijte do prázdné nádoby na odpady 15 mL 50 % (w/w) komerčně dostupného roztoku NaOH (≈ 19 M NaOH).


Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní jeden týden při skladování v uzavřené láhvi při pokojové teplotě. Pracovní odbarvovací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. Nepřidávat azid sodný. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μL/dL roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička, 5 mL). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky.

4. HYDRASYS - PROMÝVACÍ ROZTOK Příprava

Každá lahvička Promývacího Roztoku HYDRASYS (SEBIA, kat č. 4541, 10 lahviček, 80 mL každá) může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 5 litrů. Promývací pracovní roztok po zředění obsahuje : tlumicí roztok pH 8.7 ± 0.5.

Použití

Prací roztok HYDRASYS je určen pro čištění barvicího prostoru HYDRASYS. Používejte jej pravidelně – například při každodenním používání přístroje promývejte barvicí prostor jednou týdně. Viz příbalový leták s návodem k použití.


Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách. Stabilní jsou do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. - 191 -


POZNÁMKY :

Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr ≤ 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µS/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm.

POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ

1. HYDRASYS Systém SEBIA, kat. č. 1211 s OPTION FOCUSING HYDRASYS SEBIA, kat. č. 1235 nebo HYDRASYS FOCUSING System SEBIA, kat. č. 1212.

nebo

2. HYDRASYS 2 Systém SEBIA, kat. č. 1200, kat. č. 1201 s OPTION FOCUSING HYDRASYS 2 SEBIA, kat. č. 1207 nebo HYDRASYS 2 FOCUSING System SEBIA, kat. č. 1202, kat. č. 1203.

3. Pro alternativní plnění vzorkových aplikátorů manuální nebo automatická mikropipeta například HYDRAPLUS SEBIA, kat. č. 1216 nebo HYDRAPLUS 2 SEBIA, kat. č. 1217 nebo ASSIST SEBIA, kat. č. 1218.

4. Vlhká Zásobní Komora, kat. č. 1270, dodávána se systémem HYDRASYS.

5. Vodicí tyčka šablony dodávaná se systémem HYDRASYS SEBIA.

6. Dynamická maska, SEBIA, kat. č. 1255 nebo, pokud je to nutné, návod k Dynamické masce, SEBIA, kat. č. 31002698.

7. Pomocná sada pro HYDRASYS A1AT ISOFOCUSING SEBIA, kat. č. 1253. obsahuje reagenční aplikační masku ENZ 4 mL a jednožlábkový držák segmentů, který je potřebné pro tuto metodu.

8. Souprava nádob dodávaná se systémem HYDRASYS.

9. Pipety : 20 μL, 100 μL, 200 μL, 1 mL a 5 mL (nebo značené pipety / pipetory : 0 - 100 μL, 100 - 500 μL a 1 - 10 mL).

VZORKY PRO ANALÝZU

Odběr a skladování vzorků

Pro analýzu je třeba používat čerstvé vzorky séra. Vzorky séra musí být odebírány v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky mohou být uskladněny v tmavé lahvi a v chladničce (2 až 8 °C) až dva týdny.

VAROVÁNÍ : Vzorky séra by měly být považovány za biologicky nebezpečné a proto je třeba dodržovat standardní laboratorní zásady a postupy bezpečného zacházení.

Příprava vzorků

Zřeďte vzorky séra 10x pomocí ředicího roztoku na vzorky.

POZNÁMKA : Analýzu lze provádět na vzorcích plné krve odebraných na filtrační papírky pro sběr vzorků krve. Poté je při přípravě nutné řídit se zvláštním protokolem pro extrakci vzorku a přípravě pomocí ředidla pro A1AT suchý vzorek krve, SEBIA, PN 4584. Pro analýzu tohoto druhu vzorků zvolte konkrétní migrační program nástroje HYDRASYS. Viz pokyny pro použití ředidla A1AT pro suchý vzorek krve, SEBIA.

POZNÁMKA : Odběrové zkumavky pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků…). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů.

POSTUP

Systém HYDRASYS je poloautomatický víceparametrový přístroj. Automatizované kroky zahrnují zpracování agarosových gelů HYDRAGEL v následujícím pořadí : nanesení vzorku, isolelektrická zaostřovací migrace, inkubace s enzymem označeným antisérem, inkubace pomocí enzymového substrátu, zastavení enyzmatické reakce, odsátí, vysušení, omytí a konečné vysušení gelu. Manuální kroky zahrnují manipulaci se vzorky a gely, nanesení reagentů a nastavení přístroje k činnosti. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE UŽIVATELSKÝ NÁVOD K PŘÍSTROJI HYDRASYS / HYDRASYS 2. DŮLEŽITÉ : Zkontrolujte, zda je dynamická maska správně umístěna a zda jsou perfektně vyrovnány elektroforetické profily a jamky masky.

POZNÁMKA : Postup s HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING může být prováděn s verzí softwaru 7.01.18 systému HYDRASYS nebo verzí softwaru 2.2x systému HYDRASYS 2 a následujících verzích.

- 192 -


I. NASTAVENÍ MIGRACE

1. Zapněte přístroj HYDRASYS 2. Pro dosažení vysokého napětí potřebného pro isoelektrickou fokusaci stiskněte zelený spínač vysokého napětí pro zapnutí vysokonapěťového režimu. Spínač zčervená. POZNÁMKA : Vysokonapěťový spínač zobrazuje informace o migraci. Během migrace jsou zobrazeny hodnoty volt. hodiny (Vh) a proudu (mA). Při stisknutí během migrace se zobrazí hodnoty napětí (V) a výkonu (W). Při opakovaném stisknutí se na displeji opět zobrazí hodnoty Vh a mA.

Když je HYDRASYS ve vysokonapěťovém režimu, je na displeji zobrazena skutečná hodnota proudu a jedna z deseti dalších hodnot, například napětí, volt. hodiny a výkon. 3. Umístěte jeden aplikátor na rovný povrch s čísly jamek vpravo nahoře. 4. Naneste 10 μL vzorku séra zředěného 10x (ředicím roztokem na vzorek) do každé jamky aplikátoru (Obr. 1). Aplikátor naplňte do 2 minut. - Vložte aplikátory do vlhké zásobní komory zoubky směrem nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček) ; - nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut od nanesení posledního vzorku. Další informace jsou uvedeny v příbalovém letáku pro vlhkou komoru.

5. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte nahoru migrační rámeček s elektrodami a nosičem aplikátorů. VAROVÁNÍ : Nikdy nezavírejte víčko, pokud jsou držáky zdviženy!

6. Z nabídky přístroje vyberte program migrace "A1AT FOCUSING TTF". 7. Připravte elektrodové proužky s katodickým a anodickým roztokem. Viz bod 4 v DODÁVANÁ ČINIDLA A MATERIÁLY. 8. Vyjměte proužky z anodické a katodické nádoby. Přitom je držte za plastové konce. Na zdviženém nosiči je děrovanými konci plastikového vyztužení upevněte na kovové výstupky elektrodového nosiče, přičemž musí plastikové vyztužení proužků směřovat k nosiči (Obr. 2). Červený anodický proužek je na dně (anoda), bezbarvý katodický proužek je nahoře (katoda). 9. Vybalte agarózovou desku HYDRAGEL a nechte při pokojové teplotě. 10. Položte plastovou stranu dolů na látku nebo filtrační papír, abyste odstranili kapky vody. 11. Odsajte přebytečnou kapalinu tak, že na povrch gelu rychle a rovnoměrně narolujete filtrační papír. Papír ihned odstraňte. VAROVÁNÍ : Neponechávejte filtrační papír delší dobu na povrchu, mohlo by dojít k dehydrataci gelu.

12. Naneste pás 300 μL etylenglykolu (EG) do dolní třetiny rámu vyraženého na destičce pro sledování teploty migračního modulu. 13. Opřete gelovou desku (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (Obr. 3). Ohněte gel a položte jej pomalu dolů na pás EG. Ověřte, zda nedošlo k zachycení vzduchových bublin, že je EG rozprostřen po celém povrchu gelové desky a že je gel vyrovnán s vyznačeným rámečkem. 14. Sklopte oba držáky dolů. V této pozici se pufrované proužky nedotýkají gelu. NESTLAČUJTE DRŽÁKY AŽ DOLŮ. 15. Vyjměte aplikátor z vlhké komory. Uchopte jej při tom za ochranný rámeček. - Odlomte ochranný rámeček chránící zuby aplikátoru. - Položte aplikátor do polohy č. 1 na rámečku. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátorech musí směřovat k operátorovi (Obr. 4).

16. Uzavřete víko migračního modulu. 17. Ihned zahajte postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici.

DŮLEŽITÉ : Zkontrolujte, zda nejsou blokovány vzduchové otvory přístroje.

MIGRACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ

• Oba nosiče jsou sklopeny a proužky s pufrem i aplikátory jsou v kontaktu s povrchem gelu. • Probíhá aplikace vzorků do gelu. • Migrace se provádí při napětí 400 V, dokud není naakumulováno 360 Vh a při 1500 V do akumulace 150 Vh (konečná hodnota 510 Vh) při 20 °C. Migrace je řízena Peltierovým efektem (přibližně jednu hodinu). • Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. • Ozve se pípnutí a víko se odjistí. Signál zní do zásahu obsluhy. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "e AS" / "e ANTISERA" signalizující nutnost nanesení antiséra. POZNÁMKA : Víko migračního modulu zůstává během migrace zavřené.

II. NASTAVENÍ IMUNOFIXACE

Několik minut před koncem migrace sestavte dynamickou masku, která obsahuje antisérový segment, držák segmentu a rámeček dynamické masky (viz Obr. 5). 1. Položte rámeček dynamické masky na rovný povrch. 2. Vložte antisérový segment do držáku (viz obr. 6) : - Antisérový segment nakloněný v úhlu 45° vtlačte proti plastikovým pružinkám do držáku. - Zatáhněte za segment a otočte jej, dokud nezapadne do zářezů na držáků segmentů.

VAROVÁNÍ : Ujistěte se, že jsou segmenty správně umístěny na držáku. výstupky na konci segmentu musí být upevněny v zářezech držáku. 3. Vložte držák se segmentem do rámečku dynamické masky (viz Obr. 7).

III. IMUNOFIXACE 1. 2. 3. 4.

Po skončení migrace otevřete víko. Vyjměte a zneškodněte aplikátor vzorku. Zdvihněte oba nosiče a vyjměte je. Vyjměte pufrované proužky za plastové konce a zneškodněte. - 193 -


5. Očistěte elektrody opatrným otřením vlhkou látkou. 6. Gel ponechejte na místě v migračním modulu. 7. Připravte dynamickou masku pro aplikaci antiséra následujícím postupem (viz Obr. 8) : - Umístěte vodicí kovovou tyčku dynamické masky na ukotvující trny (může být ponechána v migračním modulu po celou dobu). - Uchopte dynamickou masku a položte ji na vodicí tyčku, přičemž zářezy jsou vyrovnané se značkami. - Sklopte dynamickou masku na desku HYDRASYS. - Ujistěte se, že je držák segmentu v nejnižším bodu vodicího rámečku dynamické masky, směrem k operátorovi. 8. Do prostoru mezi segmentem a gelem opatrně a postupně naneste jednorázově celé množství v předchozím kroku připraveného antiséra anti-A1AT – PER (490 μL) přes středovou jamku (jamka č. 8). Při pipetování se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. DŮLEŽITÉ : Pro tento krok použijte špičku pipety 1 mL a kontrolujte, aby špička pipety nezapadla do jamky segmentu. 9. Nanesení činidel (viz Obr. 9) : - Držte pipetu rovně a lehce opřete špičku pipety o dno jamky (na segment netlačte). - Opatrně a postupně vstřikujte antisérum během přibližně 5 sekund. Činidlo se rozšíří po celém segmentu. - Zkontrolujte, zda je antisérum rovnoměrně ve styku s gelem pod antisérovým segmentem. 10. Nyní, za použití úchytky držáku segmentu, pohybujte segmentem pomalu, ale plynule nahoru a dolů po celé délce gelu, aby došlo k rovnoměrné aplikaci činidla. Opakujte tento krok 3krát. Aplikace by měla trvat přibližně 5 sekund pro každý průchod (viz obr. 10). Během tohoto kroku držte masku pouze za úchytku držáku segmentu pro nanášení antisér. Nedotýkejte se vodicího rámečku. 11. Ponechte dynamickou masku v komoře HYDRASYS s antisérovým segmentem v nejnižším bodě vodicího rámečku masky. 12. Uzavřete víko migračního modulu. 13. Ihned zahajte inkubační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "[INCUBATION]".

IMUNOFIXACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ

• Inkubace řízená Peltierovým efektem trvá 10 minut při 20 °C. • Ozve se pípnutí a odjistí se víko migračního modulu. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "e PAP." / "e THICK FILTER PAPER". POZNÁMKA : Víko migračního modulu zůstává během inkubace zajištěné.

IV. ODSÁTÍ GELU

1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Vyjměte sestavu dynamické masky : - Vyjměte držák segmentu za úchyt ; - Vyjměte antisérový segment z držáku a zneškodněte jej. VAROVÁNÍ : Se segmeny s antisérem musí být zacházeno opatrně. 3. Položte na gel silný filtrační papír hladkou stranou dolů : - Skloňte filtrační papír v úhlu přibližně 45°. - Vyrovnejte dolní stranu filtračního papíru s okrajem gelu. - Položte filtrační papír na gel. DŮLEŽITÉ : Pevně přitlačte na celý povrch filtračního papíru k zajištění jeho dokonalého přilnutí ke gelu. 4. Uzavřete víko migračního modulu. 5. Odsávací sekvenci zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici.

ODSÁTÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ

• Odsátí při 20 °C trvá 3 minuty a je řízeno Peltierovým efektem. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "[BLOTTING]". • Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a PAP. + e WASH" / "a THICK FILTER PAPER, e WASH" signalizuje nutnost odstranit filtrační papír a nanést promývací roztok A1AT / TRF.

V. OMYTÍ GELU 1. 2. 3. 4. 5.

Otevřete víko migračního modulu. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na desce migračního modulu, Připravte masku pro aplikaci činidel ENZ 4 mL (viz obr. 11). Při pipetování promývacího roztoku A1AT / TRF se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. Otvorem v šabloně naneste 7 mL promývacího roztoku A1AT / TRF (obr. 12). Zkontrolujte, že je roztok rovnoměrně rozprostřen v obdélníkovém prostoru pod šablonou. - Pipetu držte kolmo. - Lehce zatlačte špičku pipety do otvoru šablony. - Opatrně a postupně vstříkněte roztok pod šablonu, aniž by došlo ke vniknutí vzduchu. 6. Uzavřete víčko migračního modulu. 7. Ihned zahajte inkubační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici.

PROMÝVÁNÍ GELU – POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ

• Inkubace řízená Peltierovým efektem trvá 5 minut při 20 °C. • Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a WASH + e PAP." / "a WASH, e THICK FILTER PAPER" signalizuje odstranění promývacího roztoku A1AT / TRF odpipetováním přebytku kapaliny a použitím tlustého filtračního papíru.

VI. ODSTRANĚNÍ PROMÝVACÍHO ROZTOKU 1. 2. 3. 4. 5.

Otevřete víko migračního modulu. Odstraňte promývací roztok. Držte pipetu kolmo a lehce vtiskněte špičku do jamky (obr. 12). Opatrně a postupně odstraňte promývací roztok. Uchopte aplikační šablonu na činidla za výstupek, zdvihněte a odstraňte. Oblast gelu musí být rehydratována. - 194 -


VII. ODSÁTÍ GELU 1. 2. 3. 4.

Položte na gel silný filtrační papír, jak je popsáno v odstavci IV (hladkou stranou dolů na gel). Celý povrch filtračního papíru pevně přitlačte ke gelu pro zajištění dokonalého přilnutí. Uzavřete víčko migračního modulu. Odsávací sekvenci zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici.

ODSÁVÁNÍ – POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ

• Odsátí při 20 °C trvá 3 minuty a je řízeno Peltierovým jevem. Na displeji se zobrazí následující zpráva : „[BLOTTING]“. • Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a PAP. + e REHYD 1 " / "a THICK FILTER PAPER, e REHYDRATING 1" signalizuje nutnost odstranit filtrační papír a nanést první rehydratační roztok.

VIII. REHYDRATACE GELU 1. 2. 3. 4. 5.

Otevřete víko migračního modulu. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na desce migračního modulu. Připravte masku pro aplikaci činidel ENZ 4 mL (viz Obr. 11). Naneste 7 mL rehydratačního roztoku skrz otvor v šabloně (viz Obr. 12). Při pipetování rehydratačního roztoku se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. Zkontrolujte, že je roztok rovnoměrně rozprostřen v obdélníkovém prostoru pod šablonou. Pipetu držte kolmo. Lehce zatlačte špičku pipety do otvoru šablony. Opatrně a postupně vstříkněte roztok pod šablonu, aniž by došlo ke vniknutí vzduchu. 6. Uzavřete víko migračního modulu. 7. Zahajte inkubační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici.

REHYDRATACE GELU - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ

• Peltierovým efektem řízená inkubace trvá 5 minut při 20 °C. • Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a REHYD1 + e PAP." / "a REHYDRATING 1, e THICK FILTER PAPER", která signalizuje nutnost odstranit první rehydratační roztok odpipetováním nadbytečného množství kapaliny a pomocí silného filtračního papíru.

IX. ODSTRANĚNÍ REHYDRATAČNÍHO ROZTOKU

1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Odstraňte rehydratační roztok, jak bylo popsáno v odstavci VI. 3. Uchopte aplikační šablonu na činidla za výstupek, zdvihněte a odstraňte. Oblast gelu musí být rehydratována.

X. ODSÁTÍ GELU 1. 2. 3. 4.

Položte na gel silný filtrační papír, jak je popsáno v odstavci IV (hladkou stranou dolů na gel). Celý povrch filtračního papíru pevně přitlačte ke gelu pro zajištění jeho dokonalého přilnutí. Uzavřete víko migračního modulu. Odsávací sekvenci zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici.


• Odsátí při 20 °C trvá 3 minuty a je řízeno Peltierovým efektem. • Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a PAP. + e REHYD2" / "a THICK FILTER PAPER, e REHYDRATING 2", která signalizuje nutnost odstranit filtrační papír a nanést druhý rehydratační roztok.

XI. REHYDRATACE GELU 1. 2. 3. 4. 5.

Otevřete víko migračního modulu. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na desce migračního modulu. Připravte masku pro aplikaci činidel ENZ 4 mL (viz Obr. 11). Otvorem v šabloně naneste 7 mL rehydratačního roztoku (viz Obr. 12). Při pipetování rehydratačního roztoku se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. Zkontrolujte, že je roztok rovnoměrně rozprostřen v obdélníkovém prostoru pod šablonou. Pipetu držte kolmo. Lehce zatlačte špičku pipety do otvoru šablony. Opatrně a postupně vstříkněte roztok pod šablonu, aniž by došlo ke vniknutí vzduchu. 6. Uzavřete víko migračního modulu. 7. Zahajte inkubační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici.

REHYDRATACE GELU POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ

• Inkubace řízená Peltierovým efektem trvá 5 minut při 20 °C. • Po uplynutí doby první inkubace zazní pípnutí a na displeji se zobrazí následující zpráva : "a REHYD2 + e TTF" / "a REHYDRATING 2, e TTF", která signalizuje nutnost odstranit rehydratační roztok a nanést vizualizační roztok.

XII.ODSTRANĚNÍ REHYDRATAČNÍHO ROZTOKU

1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Odstraňte rehydratační roztok, jak bylo popsáno výše v odstavci VI. 3. Šablonu nechte na místě.

XIII. VIZUALIZACE

1. Naneste 3.5 mL vizualizačního roztoku TTF připraveného těsně před použitím do prostoru pod šablonu. Dodržujte stejné zásady, jako jsou popsané výše. 2. Při pipetování vizualizačního roztoku TTF se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. Zkontrolujte, že je roztok pod šablonou rovnoměrně rozprostřen v obdélníkovém prostoru se středem v otvoru šablony. - 195 -

3. Uzavřete víko migračního modulu. 4. Ihned zahajte inkubační postup stisknutím tlačítka "START" na klávesnici.


INKUBACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ

• Inkubace řízená Peltierovým efektem trvá 10 minut při 30 °C. • Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a TTF + e PAP." / "a TTF, e THICK FILTER PAPER", která signalizuje nutnost odstranit vizualizační roztok a nanést jeden silný filtrační papír.

XIV. ODSTRANĚNÍ VIZUALIZAČNÍHO ROZTOKU

1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Odstraňte vizualizační roztok, jak bylo popsáno výše v odstavci VI. 3. Uchopte aplikační masku na činidla za výstupek, zdvihněte a odstraňte.

XV.ODSÁTÍ GELU 1. 2. 3. 4. 5.

Položte na gel silný filtrační papír, jak je popsáno v odstavci IV (hladkou stranou dolů na gel). Celý povrch filtračního papíru pevně přitlačte ke gelu k zajištění jeho dokonalého přilnutí. Uzavřete víko migračního modulu. Odsávací sekvenci zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. Opláchněte šablonu destilovanou vodou a důkladně ji vysušte měkkým absorpčním papírem. Před opakovaným použitím zkontrolujte, že je šablona zcela suchá a odstraňte kapky z jamek poklepáním na měkkém papíru. POZNÁMKA : Po vizualizačním kroku s TTF je možné pro očištění aplikační šablony ENZ 4 mL použít alkohol.


• Odsátí trvá 3 minuty při 30 °C a je řízeno Peltierovým efektem. • Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "a PAP." / "a THICK FILTER PAPER", která signalizuje nutnost odstranit filtrační papír.

XVI. VYSUŠENÍ GELU 1. 2. 3. 4.

Otevřete víko migračního modulu. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na místě. Zavřete kryt HYDRASYSU. Vysoušení zahájíte stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. Na displeji se zobrazí následující zpráva : "[DRYING]".

VYSUŠENÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ • • • •

Gel vysušujte při 50 °C po dobu 3 minut. Ozve se pípnutí signalizující nutnost otevření víka. Otevřete víko. Když je gel vysušen, ihned jej vyjměte k dalšímu zpracování.

POZNÁMKY :

- Po dokončení cyklu klesne teplota desky na 20 °C za méně než 5 minut. Když je dosažena teplota 20 °C, je možné zahájit novou migraci. - Položte aplikátor vzorků a nosič elektrod zpět na místo. - Otřete migrační plochu jemnou vlhkou látkou.

XVII. OMYTÍ A KONEČNÉ ZPRACOVÁNÍ GELU

Po vysušení se musí gel bez prodlení promýt v barvicím prostoru pomocí programu "WASH ISOENZ/GEL". Pokud byl tento prostor použit k barvení gelu, vyčistěte jej pomocí programu "WASH CHAMBER". 1. Otevřete držák gelu. Položte jej na rovnou plochu a gel umístěte (gelovou stranou vzhůru) do žlábků obou tyček a držák uzavřete. Ujistěte se, že gel je uvnitř držáku správně umístěn (viz Obr. 13). 2. Držák gelu vložte do modulu pro vyvíjení a barvení gelu. DŮLEŽITÉ : Před spuštěním programu pro vyvíjení / barvení zkontrolujte následující : - zda nádoba na odbarvovací roztok obsahuje nejméně 400 mL odbarvovacího roztoku ; - zda je nádoba na odpad prázdná. 3. Připojení vedení činidel : viz informace zobrazené na obrazovce přístroje (vyberte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte uzavřít nepoužité přívody.

4. Z menu přístroje vyberte promývací program "WASH ISOENZ/GEL" a spusťte program stisknutím tlačítka "START" na klávesnici. Během promývání, odbarvování a sušení je tento prostor uzamčen. Po ochlazení se odjistí víko migračního modulu (větrání zůstane zapnuté až do vyjmutí držáku gelu). 5. Vyjměte držák gelu z modulu, otevřete úchytky a vyjměte vysušený gel. Je-li zapotřebí, očistěte zadní stranu (plastovou nosnou stranu) vysušeného filmu vlhkým jemným papírem. Gel je připraven pro vyhodnocení.

KONTROLA KVALITY

Doporučuje se do každé řady analýzy zařadit normální vzorek nebo testovaný vzorek séra obsahují isoformy alfa-1 antitrypsinu (například A1AT Controls, SEBIA, kat. č. 4771). POZNÁMKA : Kontrolní roztok A1AT se prodává samostatně.

VAROVÁNÍ : Kontrolní roztok A1AT, SEBIA, kat. č. 4771, by měl být používán pro kontrolu kvality dokazující 3 odpovídající fenotypy, jak je uvedeno v příbalovém letáku kontrolního roztoku A1AT. Kontrolní roztok A1AT je navržen jako prostředek pro kontrolu migrace isoformních vzorů A1AT pomocí postupu HYDRAGEL.

- 196 -


VÝSLEDKY

Očekávané hodnoty

Následující tabulka znázorňuje pro informaci fenotypy A1AT a koncentrace (15). A1AT fenotyp MM MS SS MZ SZ ZZ Nulový / Nulový

Interpretace

Koncentrace A1AT (mg/dL) 103 - 200 100 - 180 70 - 105 66 - 120 45 - 80 10 - 40 0

SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. Fenotypizace se používá společně s klinickými nálezy a dalšími laboratorními vyšetřeními. Zahrnuje kvantifikační a funkční aktivitu (10) při určování deficience A1AT. Interpretace je kvalitativní : Cílem této techniky je charakterizovat různé A1AT fenotypy podle pozice samostatných frakcí isoforem (7). Pomocí isoelektrické fokusace lze dosáhnout isoelektroforetického rozdělení 8 isoformních proužků alely M : Hlavní frakce jsou na pozici č. 4 a 5 a používají se jako "markery" pro fenotypizaci A1AT (viz VZORY MIGRACE). Do současné doby bylo identifikováno více než 75 variant A1AT. Jsou klasifikovány v abecedním pořadí podle jejich elektroforetické mobility, nejrychlejší a kyselé varianty jsou klasifikovány písmeny od A do K, nejpomalejší a zásadité jsou klasifikovány písmeny N až Z (2, 4, 6). U osob s vážnou deficiencí A1AT je fenotyp ZZ spojen s variantou, která migruje k nejvyššímu isoelektrickému bodu. POZNÁMKA : Frakce na pozicích č. 7 a 8 fenotypu Z nemusí být na elektroforetickém záznamu isoforem A1AT viditelné, vzhledem k nízké koncentraci A1AT nebo slabé denaturaci. Charakterizaci fenotypu Z potom umožňují frakce v pozicích 2, 4 a 6. Jsou popsány dvě hlavní poruchy (14) : - Onemocnění jater u dětí ve spojení s chronickou hepatitidou a klinické diagnostikovanými anomáliemi jater. Představuje predispozici k cirhóze u dětí, která může vést k transplantaci jater (8). - Plicní onemocnění je spojeno s emyfysemií u pacientů mladších než jsou osoby bez A1AT deficience. Souvisí s nevyrovnanou aktivitou proteasy / antiprosteasy. A1AT je antiproteasa s antielastasovou aktivitou. Její hlavní funkcí je ochrana pojivové tkáně v plicích proti proteolytickému poškození neutrofilní elastasou syntetizovanou polynukleárními neutrofilními buňkami ; deficience A1AT výsledků vede k destrukci této pojivé tkáně (12). Riziko emfysemie se zvyšuje u pacientů-kuřáků a úroveň plicního onemocnění se může lišit. Doporučuje se používat doplňkové techniky, jako je genotypizace, například pro identifikaci fenotypů alfa-1 antitrypsinu detekovaných, ale necharakterizovaných postupem HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING a rovněž fenotyp "Nulový / Nulový" (13, 14).

Interference a Omezení

Nebylo zjištěno žádné rušení postupu HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING v důsledku vysoké koncentrace cholesterolu (≤ 6.9 mmol/L), triglyceridy (≤ 8.0 mmol/L), bilirubin (≤ 20 mg/dL) a hemoglobin (≤ 0.35 g/dL) ve vzorku. Náhradní léčba A1AT může změnit fenotyp pacienta. Tento jev pozorovali Snyder et al. (Clin. Chem., 2006). Použití jiného antiséra, než je součástí sady HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING, může ovlivnit výsledky. Vzhledem k omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy je možné, že některé isoformy alfa-1 antitrypsinu nebudou touto metodou detekovány. Společnost SEBIA při výrobě reakčních látek pečlivě vybírá suroviny. V závislosti na vyrobených šaržích gelu však může být elektroforetický záznam odlišně centrován, aniž by to mělo nežádoucí vlivu na výkon.

Odstraňování závad a řešení problémů

Pokud při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku testy nevycházejí, kontaktujte technickou podporu společnosti SEBIA. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : www.sebia.com.

ÚDAJE O VÝKONU

Byly použity standardní materiály, příprava vzorku a postupy. Všechny elektroforetické záznamy byly vyhodnoceny vizuálně. Po vizuální kontrole elektroforetických záznamů nebyly viditelné žádné rozdíly mezi opakováními. Byla dosažena dobrá reprodukovatelnost mezi gely a na gelu (přesnost).

Reprodukovatelnost v rámci gelu

Reprodukovatelnost v rámci gelu byla demonstrována na 2 vzorcích normálního séra (MM fenotyp) a 1 vzorku patologického séra s použitím postupu HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING na gelech ze stejné šarže. Každý vzorek byl analyzován na 18 stopách jednoho gelu. Všechna opakovaná stanovení vedla ke shodným výsledkům v rámci gelu a vzory odpovídaly typu každého testovaného vzorku. Postupem HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING byly správně učeny různé isoformy alfa-1 antitrypsinu pomocí imunofixace každého z 3 analyzovaných vzorků a na každém gelu. Nebyly zjištěny falešně pozitivní výsledky a nebyly zjištěny rozdíly mezi opakovanými pokusy. V normálních vzorcích nebyl zjištěn žádný abnormální fenotyp. - 197 -


Reprodukovatelnost mezi gely

Reprodukovatelnost mezi gely byla demonstrována na 9 vzorcích normálního séra a na 9 vzorcích patologického séra představujících různé fenotypy alfa-1 antitrypsinu. Tyto vzorky byly analyzovány desetkrát na gelech ze stejné šarže pomocí postupu HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING. Všechna opakovaná stanovení vedla ke shodným výsledkům mezi gely v rámci jedné šarže a vzory odpovídaly typu každého testovaného vzorku. Postupem HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING byly správně učeny různé isoformy alfa-1 antitrypsinu odpovídající každému fenotypu pomocí imunofixace každého z 18 analyzovaných vzorků a na každém gelu. Nebyly zjištěny falešně pozitivní výsledky a nebyly zjištěny rozdíly mezi opakovanými pokusy. V normálních vzorcích nebyl zjištěn žádný abnormální fenotyp.

Citlivost

Postupným ředěním byly připraveny homozygotní ZZ fenotypové sérové vzorky s koncentrací alfa-1 antitrypsinu 27 mg/dL a ty byly analyzovány postupem HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING. Minimální limit detekce isoformy alfa-1 antitrypsinu byl kolem 5 mg/dL.

Studie shody

Studie shodnosti byla prováděna mezi postupem HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING a jiným postupem isoelektrické fokusace v agarózovém gelu pro fenotypizaci alfa-1 antitrypsinu, a to na 90 vzorcích séra : pomocí obou technik bylo analyzováno 72 normálních a 18 různých patologických vzorků séra. Studie prokázala 100 % shodu mezi oběma technikami. U 72 normálních vzorků séra : úplná shoda U 18 patologických vzorků séra : úplná shoda U všech analyzovaných patologických vzorků séra byly výsledky získané jednotlivými postupy ve shodě a různé fenotypy byly charakterizovány ve všech patologických vzorcích podle obou postupů.

- 198 -


BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY

Bienvenu J. Les protéines de la réaction inflammatoire. Définition, physiologie et méthodes de dosage. Ann. Biol. Clin., 1984, 42 : 47 – 52. Cox DW, Johnson AM, Fagerhol MK. Report of nomenclature meeting for α1-antitrypsin. Am. J. Hum. Genet., 1980, 32 : 429 – 433. Engler R. Protéines de la réaction inflammatoire. Fonctions régulatrices. Ann. Biol. Clin., 1988, 46 : 336 – 342. Fagerhol MK, Laurell CB. The polymorphism of "prealbumins" and alpha-1-antitrypsin in human sera. Clin. Chim. Acta, 1967, 16 : 199 – 203. Fagerhol MK. Quantitative studies on the inherited variant of serum alpha-1-antitrypsin. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1969, 23 : 97 – 102. International Alpha-1-Antitrypsin Pi System Workshop. Lancet, 1975, 1 : 118. Jeppsson JO, Franzen B. Typing of genetic variants of alpha 1-antitrypsin by electrofocusing. Clin. Chem., 1982, 28 : 219 – 225. Johnson AM, Alper CA. Deficiency of alpha 1-antitrypsin in childhood liver disease. Pediatrics, 1970, 46 : 921 – 925. Keren DF. "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, MA, USA, 1994, 397 pp. 10. Mullins RE, Miller RL, Hunter RL, Bennett B. Standardized automated assay for functional alpha 1-antitrypsin. Clin. Chem., 1984, 30 : 1857 – 60. 11. Romette J. Les marqueurs protéiques de l’inflammation et de la dénutrition. Feuillets de Biologie, 1987, XXVIII, 156 : 69 – 73. 12. Silverman EK et al. Variability of pulmonary function in alpha 1-antitrypsin deficiency : Clinical correlation. Ann. Intern. Med., 1989, 111 : 982 – 991. 13. Snyder MR et al. Diagnosis of α-1-antitrypsin deficiency : An algorithm of quantification, genotyping and phenotyping. Clin. Chem., 2006, 52 : 2236 – 2242. 14. Stoller JK, Aboussouan LF. α1-antitrypsin deficiency. Lancet, 2005, 365 : 2225 – 2236. 15. Vidal et al. Guidelines for the diagnosis and management of α-1-antitrypsin deficiency. Arch. Bronconeumol., 2006, 42 (12) : 645 – 659. 16. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, 1986, Sept : 93-97. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

- 288 -


SCHÉMAS / FIGURES Figure 1

Figure 2

9 10 78 56 34 12

11

12

13

15 14

Figure 3

Figure 4

12

123

456

789

10 11

12 13

14 15

- 289 -

34

5 6 sebia 78 9 10 11

12



Barrette antisérum Antiserum Segment Bossage (Boss)

Ergot (Pin) Puits (wells)

Support barrette Segment Holder Poignée (Flap) Encoche (notch)

Point d'appui central (Central Pressure Point)

Ressorts (Springs)

Guide du masque dynamique Dynamic Mask Guide

Poignée (Flap)

- 290 -

SCHÉMAS / FIGURES

Figure 6

Figure 7

1

2 1

Figure 8

Figure 9

9 CS

GEL 2

2'

F ISO 3'

3''

SING FOCU 5 5'

7' 6

6'

8

8'

9

9'

7

4'

4

5

2'

1'

2

D R

A G

E

3

L

9

3'

C

S

4

F

IS

4'

O

F O

C

5'

U

S

6

IN

G

6'

7

7'

8

8'

9

9'

Figure 10

- 291 -




Figure 11

Figure 13 sebia

/30 28 ) 15 27 26 IN(E 25 OTE 24 23 EL PR 22 21 RAG HYD 18 19 20 16

29

30

17

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

11

12

13

14

15

sebia

HYD 16

/30 28 ) 15 27 26 IN(E 25 OTE 24 23 EL PR 22 21 RAG 20 17

18

29

30

19

1

- 292 -

2

3

4

5

6

7

8

9 10

11

12

13

14

15


SCHÉMAS / FIGURES

Figure 14

PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES - ELECTROPHORETIC PATTERNS

Représentation schématique des allèles Pi M, Pi S et Pi Z après isoélectrofocalisation Schematic pattern of alleles Pi M, Pi S and Pi Z after isoelectric focusing M

Z

S

2 4

2

6

4

+

2

7

6 4

8

7 6 8

7 8

- 293 -

–

Benelux SCS / Comm. V

Jan Olieslagerslaan 41 1800 Vilvoorde Belgique / België Tél. : 32 (0)2 702 64 64 : 32 (0)2 702 64 60 Fax e-mail : [email protected]

Brasil

Edifício Baker Office Tower Rua Barão do Triunfo, 73, conjunto 51 CEP 04602-000 Bairro Brooklin Paulista, São Paulo - SP Brasil Tel. : 55 11 3849 0148 Fax : 55 11 3841 9816 e-mail : [email protected]

GmbH

Münsterfeldallee, 6 36041 Fulda Deutschland Tel. : 49 (0)661 3 30 81 Fax : 49 (0)661 3 18 81 e-mail : [email protected]

Hispania S.A.

C/Sicilia, n° 394 08025 Barcelona España Tel. : 34 93 208 15 52 Fax : 34 93 458 55 86 e-mail : [email protected]

Inc.

400-1705 Corporate Drive Norcross, GA 30093 U.S.A. Tel. : 1 770 446 - 3707 Fax : 1 770 446 - 8511 e-mail : [email protected]

Italia S.r.l.

Via Antonio Meucci, 15/a 50012 Bagno a Ripoli (FI) Italia Tel. : 39 055 24851 Fax : 39 055 0982083 e-mail : [email protected]

UK Ltd

River Court, Meadows Business Park Station Approach, Blackwater Camberley, Surrey, GU17 9AB United Kingdom Tel. : 44 (0)1276 600636 Fax : 44 (0)1276 38827 e-mail : [email protected]

Parc Technologique Léonard de Vinci CP 8010 Lisses - 91008 EVRY Cedex - France Tél. : 33 (0)1 69 89 80 80 - e-mail : [email protected]

Shanghai Representative Office Cross Tower, Room 2306-07 318 Fuzhou Road Shanghai 200001 China Tel. : 00 86 (21) 6350 1655 Fax : 00 86 (21) 6361 2011 e-mail : [email protected]

HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING

Recommend Documents