UNIVERSITEIT GENT
RIJKSUNIVERSITEIT GRONINGEN
FACULTEIT FARMACEUTISCHE
FACULTEIT DER WISKUNDE EN
WETENSCHAPPEN
NATUURWETENSCHAPPEN
VAKGROEP GENEESMIDDELENLEER
Basiseenheid Farmaceutische Techologie en
Laboratorium voor Farmaceutische
Biofarmacie
Technologie Academiejaar 2012-2013
IN VITRO TESTEN VAN PENN-CENTURY DP-4M INSUFFLATOR Charlotte HOSTE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor Prof. C. Vervaet Co-promotor Prof. dr. H.W. Frijlink
Commissioners Prof. B. De Geest Dr. K. Raemdonck
UNIVERSITEIT GENT
RIJKSUNIVERSITEIT GRONINGEN
FACULTEIT FARMACEUTISCHE
FACULTEIT DER WISKUNDE EN
WETENSCHAPPEN
NATUURWETENSCHAPPEN
VAKGROEP GENEESMIDDELENLEER
Basiseenheid Farmaceutische Techologie en
Laboratorium voor Farmaceutische
Biofarmacie
Technologie Academiejaar 2012-2013
IN VITRO TESTEN VAN PENN-CENTURY DP-4M INSUFFLATOR Charlotte HOSTE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor Prof. C. Vervaet Co-promotor Prof. dr. H.W. Frijlink
Commissioners Prof. B. De Geest Dr. K. Raemdonck
AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.” 21 mei 2013
Dankwoord Ik wil graag alle mensen bedanken die mij geholpen hebben bij het tot stand brengen van deze thesis. Allereerst wil ik mij richten tot P. Hagedoorn en M. Hoppentocht om mij te laten kennismaken met de wereld van inhalatietechnologie en mij veel goede raad te geven. Daarnaast wil ik ook iedereen van de basiseenheid Farmaceutische Technologie en Biofarmacie in Groningen bedanken om mij zo goed op te vangen en ervoor te zorgen dat ik mij welkom voelde en in een goede omgeving kon werken. Ik bedank graag alle Erasmus studenten die ik leren kennen heb in Groningen, in het bijzonder Liselotte en Eline, omdat ontspanning ook belangrijk is. Tenslotte wil ik ook mijn ouders bedanken voor alle steun deze laatste maanden. Charlotte Hoste
SAMENVATTING In dit onderzoek wordt de werking van de DP-4M Insufflator van Penn-Century in vitro getest. Enerzijds wordt de deeltjesgroottedistributie na dispersie door het apparaat vergeleken met de deeltjesgroottedistributie van een RODOS-disperser. Deze laatste toont de deeltjesgrootte van de primaire partikels aangezien agglomeraten efficiënt verbroken worden. Er wordt dus gekeken in welke mate de Insufflator hetzelfde poeder onder dezelfde omstandigheden kan de-agglomereren. Daarnaast wordt ook gekeken naar de retentie, dit is de hoeveelheid poeder die achterblijft in de Insufflator na het toedienen van de dosis.
Deze twee factoren samen tonen welke fractie van het poeder potentieel diep in de longen van de muis kan terechtkomen en zo een werking kan uitoefenen. Het poeder moet voldoende klein zijn en dus voldoende gedispergeerd en er moet een zo groot mogelijk deel van de dosis de Insufflator verlaten bij toediening.
Er worden verschillende poeders getest: colistine, tobramycine, mannitol en inuline. Deze worden vooraf gemicroniseerd, gesproeidroogd of gesproeivriesdroogd en hebben daardoor verschillende fysicochemische eigenschappen en verschillende deeltjesgrootteverdelingen. Dit beïnvloedt sterk de dispersie uit de Insufflator. Ook door het variëren van de vullingsgraad en het volume aan lucht voor dispersie verschillen de resultaten.
Er wordt gezien dat bij het gebruik van slechts 200 µl aan lucht de deeltjesgrootteverdeling en de retentie minder goed zijn dan bij een groter volume aan lucht, zoals 500 µl of 1000 µl. De DP-4M Insufflator is echter ontworpen voor toediening bij de muis en deze kan maar een hoeveelheid van 200 µl verdragen door zijn klein longvolume. Er is wel potentie voor een goede werking bij grotere dieren die meer longvolume hebben zoals ratten en cavia’s. Voor in vivo testen bij muizen daarentegen is het aan te raden om te zoeken naar een betere methode om het poeder efficiënt toe te dienen. In elk geval moet in de toekomst de deeltjesgrootteverdeling en de retentie door de Insufflator telkens onderzocht worden bij andere geneesmiddelen en samenstellingen voor er conclusies kunnen genomen worden bij in vivo testen in muizen.
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
COLI = colistine DPI = droog poeder inhalator FPF = fine particle fraction HELOS = Helium-Neon Laser Optical System INU = inuline MANN = mannitol MICRO = gemicroniseerd SD = gesproeidroogd (spray-dried) SEM = Scanning Elektronen Microscopie SFD = gesproeivriesdroogd (spray-freeze-dried) TOBRA = tobramycine
INHOUDSOPGAVE 1.
INLEIDING ........................................................................................................................................ 1 1.1
INHALATIE ................................................................................................................................ 1
1.1.1
Algemeen......................................................................................................................... 1
1.1.2
Longmodel ....................................................................................................................... 2
1.1.3
Soorten inhalatoren ........................................................................................................ 4
1.2
DP-4M INSUFFLATOR .............................................................................................................. 5
1.2.1
Algemeen......................................................................................................................... 5
1.2.2
Toepassingen ................................................................................................................... 5
1.2.3
Variabelen bij het gebruik ............................................................................................... 6
1.3
1.2.3.1
Aard van het poeder .................................................................................................... 6
1.2.3.2
Vullingsgewicht............................................................................................................ 7
1.2.3.3
Volume voor dispersie ................................................................................................. 7
LASERDIFFRACTIE .................................................................................................................... 7
2
OBJECTIEVEN ................................................................................................................................... 8
3
MATERIALEN EN METHODES ........................................................................................................... 9 3.1
DP-4M INSUFFLATOR .............................................................................................................. 9
3.2
AP-1 AIR PUMP ...................................................................................................................... 10
3.3
VULLINGSGEWICHT ............................................................................................................... 10
3.4
GEBRUIKTE POEDERS............................................................................................................. 11
3.4.1
Colistine ......................................................................................................................... 11
3.4.2
Tobramycine .................................................................................................................. 12
3.4.3
Mannitol ........................................................................................................................ 12
3.4.4
Inuline ............................................................................................................................ 13
3.5
DEELTJESGROOTTE VERKLEINEN ........................................................................................... 13
3.5.1
Microniseren ................................................................................................................. 14
3.5.2
Sproeidrogen ................................................................................................................. 15
3.5.3
Sproeivriesdrogen ......................................................................................................... 16
3.6
LASER DIFFRACTIE ................................................................................................................. 17
3.6.1
RODOS-metingen........................................................................................................... 21
3.6.2
Insufflatormetingen....................................................................................................... 22
3.7
RETENTIE BEPALING .............................................................................................................. 22
3.7.1
Op basis van gewicht ..................................................................................................... 23
3.7.2
Op basis van chemische analyse ................................................................................... 23
3.8 4
Mannitol .................................................................................................................... 23
3.7.2.2
Inuline ........................................................................................................................ 25
SCANNING ELEKTRONEN MICROSCOPIE ............................................................................... 27
RESULTATEN .................................................................................................................................. 28 4.1
RODOS-METINGEN ................................................................................................................ 28
4.2
DEELTJESGROOTTEVERDELING DOOR INSUFFLATOR............................................................ 28
4.3
RETENTIE ............................................................................................................................... 33
4.3.1
Op basis van gewicht ..................................................................................................... 33
4.3.2
Op basis van chemische analyse ................................................................................... 35
4.4 5
3.7.2.1
SCANNING ELEKTRONEN MICROSCOPIE ............................................................................... 36
DISCUSSIE ...................................................................................................................................... 38 5.1
RODOS METINGEN ................................................................................................................ 38
5.2
INSUFFLATOR METINGEN ...................................................................................................... 38
5.3
RETENTIE ............................................................................................................................... 39
6
CONCLUSIES................................................................................................................................... 41
7
LITERATUUR................................................................................................................................... 42
8
BIJLAGEN ....................................................................................................................................... 46 8.1
RODOS-METINGEN ................................................................................................................ 46
8.2
INSUFFLATOR METINGEN ...................................................................................................... 48
8.3
RETENTIE ............................................................................................................................... 52
8.4
OPSTELLEN IJKLIJNEN MANNITOL ......................................................................................... 53
8.5
OPSTELLEN IJKLIJNEN INULINE .............................................................................................. 57
1. INLEIDING 1.1 INHALATIE 1.1.1 Algemeen Inhalatietechnologie is een zeer belangrijk deel geworden van de farmaceutische technologie. Vooral voor de behandeling van longziektes zoals COPD, astma, longkanker en cystische fibrose, maar ook voor systemische ziektes, biedt deze techniek vele voordelen in vergelijking met andere toedieningsroutes. Zo is er een groot absorptie-oppervlak in de long, een goede bloeddoorstroming en wordt het first-pass effect in de lever omzeild. Daarnaast wordt ook het risico op systemische bijwerkingen beperkt. De pulmonale route is op dit moment het meest veelbelovende alternatief voor het injecteren van geneesmiddelen die niet via de orale weg kunnen toegediend worden. [1]
De effectiviteit van toediening van droog poeder via inhalatie hangt onder andere af van de deeltjesgrootteverdeling van het poeder, het type longziekte en de patiënt. De longfunctie en de manier van inademen kunnen namelijk een grote invloed hebben op de efficiëntie van het poeder. Daarnaast komt zonder de juiste deeltjesgrootte een groot deel van het poeder niet diep genoeg in de longen terecht. De hoeveelheid poeder die een werking kan uitvoeren verkleint naarmate de deeltjes groter worden. Dit is ook het geval bij ratten en muizen, vandaar dat deze zeer interessant zijn als proefdieren. [1], [2]
Muizen worden vaak gebruikt bij ontwikkeling van formuleringen betreffende de werkzaamheid en toxiciteit van een poeder. Hoewel de muis hiervoor zeer geschikt is omwille van het gebruiksgemak, is toediening van een droog poeder bij muizen geen vanzelfsprekendheid. Een interessante methode is intratracheale toediening. Op deze manier kan het geneesmiddel onmiddellijk in de longen gebracht worden en is de dosis accuraat. [3–5]
1
1.1.2 Longmodel Weibel heeft in 1963 een longmodel beschreven. Volgens dit model bestaan de luchtwegen uit 23 vertakkingen waarbij generatie 0 bestaat uit 1 trachea met een diameter van 18 mm. Elke luchtweg splitst in 2 kleinere vertakkingen waardoor uiteindelijk 2 23 alveoli of longblaasjes ontstaan met een 0.41 mm diameter. Dit is generatie 23. Hoewel de diameter per generatie verkleint, stijgt door het toenemende aantal vertakkingen de totale doorsnede exponentieel. Hierdoor zorgen de bovenste luchtwegen voor de meeste luchtweerstand. [6]
Figuur 1.1: Longmodel van Weibel met de verschillende zones volgens generatie. Generatie 0 tot 16 zijn geleidende luchtwegen, generatie 17 tot 23 zijn overgangs- en respiratoire luchtwegen. [6]
De luchtwegen kunnen ingedeeld worden op verschillende manieren, o.a. volgens de diameter en volgens generatie. Als de diameter groter is dan 2 mm, wordt er gesproken over bovenste en centrale (of grote) luchtwegen, terwijl de perifere luchtwegen een diameter hebben kleiner dan deze waarde. Figuur 1.1 toont de verschillende zones ingedeeld volgens generatie. Generatie 0 tot 16 van de luchtwegen worden hogere, geleidende luchtwegen genoemd. Deze gaan van de trachea over de bronchiën tot aan de terminale bronchiolen. De centrale of overgangsluchtwegen en de perifere of respiratoire luchtwegen starten bij de 2
respiratoire bronchiolen bij generatie 17 en gaan tot het niveau van de longblaasjes bij generatie 23. De eerste 16 generaties worden ook wel dode ruimte genoemd omdat in deze geleidende zone geen gasuitwisseling optreedt. In deze zone bevinden zich klieren, veel gladde spiercellen en kraakbeen. In de geleidende luchtwegen is de luchtsnelheid veel hoger dan in het respiratoir gebied, waar de gasuitwisseling optreedt. [6]
De depositie in de longen hangt af van 3 mechanismen die geïllustreerd zijn in figuur 1.2: impactie door inertie, sedimentatie door de zwaartekracht en diffusie door Brownse beweging. Welk mechanisme het belangrijkste is, hangt af van de grootte en de snelheid van het aerosoldeeltje alsook de positie daarvan in de luchtwegen. Deeltjes groter dan 6 µm zullen, afhankelijk van hun snelheid, in het eerste deel, met name in de mond- en keelholte al afgezet worden. Dit gebeurt door inertiële impactie, de partikels hebben een grote inertia of traagheid en kunnen de luchtstroom in de bochten niet meer meevolgen. Daardoor slaan ze neer in de eerste vertakkingen van de luchtwegen en indien sommige deeltjes toch meevolgen, zullen deze al snel neerslaan in de smallere luchtwegen. [6], [7]
Figuur 1.2: Depositiemechanismen in de longen. Diffusie gebeurt door Brownse beweging, sedimentatie door de zwaartekracht en impactie door inertia. (http://www.admit-online.info/nl/behandling/behandeling/inhaleren/)
Sedimentatie leidt ook tot depositie van de ingeademde partikels en is recht evenredig met het kwadraat van de aerodynamische diameter van de deeltjes. Hoe groter de deeltjes, hoe meer de zwaartekracht erop zal inwerken. Bovendien zullen deeltjes die langer in de luchtwegen verblijven logischerwijze ook meer sedimentatie ondergaan, wat van belang is bij de lengte van de ademstop na inademing. De deeltjes tussen 1 en 3 µm zijn gewenst voor 3
diepe inhalatie, aangezien deze de perifere longblaasjes bereiken en daar hun werking kunnen uitvoeren. De totale longdepositie is groter bij deeltjes van 1.5 µm in vergelijking met deeltjes van 3 µm en groter. Deeltjes kleiner dan 1 µm hebben een lage sedimentatiesnelheid en worden deels weer uitgeademd voor ze de kans hebben opgenomen te worden. Dit kan verbeterd worden door de verblijftijd in de longen te verlengen door ademstop. Diffusie is enkel geldig bij deeltjes kleiner dan 0.1 µm en is hier dus niet van toepassing. [6], [7] 1.1.3 Soorten inhalatoren Om het gewenste effect te verkrijgen van een geneesmiddel dat wordt geïnhaleerd, moet de toediening op een efficiënte manier gebeuren. Daarom is men op zoek naar inhalatoren die daar zo goed mogelijk in slagen. Een goede inhalator moet het poeder afschermen van de buitenlucht, moet elke keer een herhaalbare dosis toedienen en het poeder voldoende goed de-agglomereren. [8] Er zijn 3 soorten inhalatoren: de nebulizers of vernevelaars, pressurized metered dose inhalers (pMDIs) en dry-powder inhalers (DPI’s) of droog poeder inhalatoren. Van elk van deze zijn er verschillende uitvoeringstypen op de markt. Droog poeder inhalatoren produceren een aerosol waarbij het geneesmiddel zich in vaste toestand bevindt, waardoor ze een groot voordeel hebben ten opzichte van waterige formulaties op gebied van stabiliteit. DPI’s hebben bovendien een groter gebruiksgemak en de variatie in deeltjesgrootte is afhankelijk van het debiet door het apparaat. Bij een groter debiet worden de deeltjes kleiner en zo kan worden gecompenseerd voor de depositie in hogere luchtwegen. Meestal zijn de droog poeder inhalatoren ook kleiner en goedkoper. [9] Een droog poeder inhalator bevat algemeen een mondstuk, een de-agglomeratie deel en een monsterkamer waarin het poeder wordt aangebracht. Bij de ontwikkeling van nieuwe inhalatoren is vooral de mate van de-agglomeratie van het poeder belangrijk. Het is noodzakelijk dat de agglomeraten in het poeder verbroken worden zodat de partikels niet te groot zijn. In het laatste geval komt er een veel te kleine dosis in de longen terecht en kan het geneesmiddel zijn werking niet voldoende uitvoeren.
4
1.2 DP-4M INSUFFLATOR 1.2.1 Algemeen De Penn-Century Dry Powder Insufflator™ – Model DP-4M (Penn-Century. Inc. Wyndmoor, PA) is een klein toestel dat wordt gebruikt voor in vivo experimenten in muizen, waarbij het poeder intratracheaal wordt toegediend. Dit is een vorm van intubatie. De tip moet in de trachea van de verdoofde muis gebracht worden zonder de carina, de eerste vertakking van de luchtwegen, te raken (Figuur 1.3). Als de tip zich te hoog bevindt, zal het poeder zich ophopen langs de wand van de trachea. Om dit gemakkelijker uit te voeren, kunnen accessoires gebruikt worden zoals een Muis Intubatie Platform. Om te bepalen waar het poeder terechtkomt, kan gewerkt worden met contrast beeldvorming. Dit toont of het poeder in de longen verdeeld is, opgehoopt is in de trachea of ingeslikt. [10]
Figuur 1.3: Intratracheaal gebruik van Penn-Century toestellen. De tip van de Insufflator wordt in de trachea gebracht zonder de carina te raken. [10] 1.2.2 Toepassingen De Insufflator kan gebruikt worden voor verschillende poeders met verschillende fysicochemische eigenschappen en verschillende deeltjesgroottes. Ook kan het gebruikt worden voor het testen, ontwikkelen en screenen van geneesmiddelen voor inhalatie en voor de evaluatie van inhalatie en depositie in de longen. De DP-4M Insufflator is in eerdere onderzoeken gebruikt om de in vivo werking van een poeder te testen in muizen, net als de DP-4 Insufflator gebruikt wordt bij ratten en cavia’s.[4], [5], [11–25] 5
De deeltjesgroottes van de partikels die de Insufflator verlaten, worden echter vaak niet gemeten. De deeltjesgrootteverdeling wordt in deze onderzoeken enkel bepaald via een effectieve (meestal RODOS) disperser of een andere methode die de primaire partikels meet. Er wordt verondersteld dat de Insufflator in dezelfde mate het poeder deagglomereert en dat primaire partikels toegediend worden aan de muis. In voorliggend onderzoek wordt nu gekeken of dit inderdaad het geval is, of dat er agglomeraten bestaan die niet verbroken worden door de Insufflator. Dat zou betekenen dat het poeder niet diep genoeg in de longen terechtkomt en er foute conclusies kunnen genomen worden betreffende toxiciteit en doeltreffendheid van een geneesmiddel in voorbije en toekomstige onderzoeken met deze Insufflator. Daarbovenop bestaat de mogelijkheid dat niet al het poeder dat in de monsterkamer gebracht wordt, daadwerkelijk het toestel verlaat. Ook dit moet beter onderzocht worden, welke percentage van het poeder achterblijft in de Insufflator na toediening.
Er is eerder opgemerkt dat de retentie en het risico van het gebruik moeilijk in te schatten zijn: “A large number of studies use the commercial PennCentury DP-4 insufflation device connected to a syringe, which puffs powder from a reservoir through a delivery tube. However, unpublished personal observations of this procedure have revealed methodological artifacts affecting precise quantification of administered powder and lung safety/tolerability which may limit its relevance, particularly for toxicity studies.” Er werd besloten dat de gewenste dosis zelden toegediend wordt en er een grote variatie op de resultaten zit. [1] 1.2.3 Variabelen bij het gebruik De vrijstelling uit de Insufflator hangt af van verschillende factoren, waaronder de aard van het poeder, de vullingsgraad in het toestel en de hoeveelheid lucht gebruikt om het poeder te dispergeren. 1.2.3.1 Aard van het poeder Er worden verschillende stoffen onderzocht: colistine, tobramycine, mannitol en inuline. Van elk van deze stoffen worden de deeltjes verkleind door middel van microniseren en sproeidrogen. Mannitol en inuline worden ook gesproeivriesdroogd. Elke stof heeft andere fysicochemische eigenschappen, een andere mate van hygroscopiciteit en een 6
andere deeltjesgrootteverdeling. Deze factoren beïnvloeden hoe cohesief het poeder is en hoe sterk de agglomeraten zijn. Hoe sterker de gevormde agglomeraten in het poeder, hoe minder de dispersiemogelijkheid is. Deze verschillen worden allemaal in kaart gebracht. [26] 1.2.3.2 Vullingsgewicht De Insufflator kan gevuld worden met verschillende hoeveelheden van de te onderzoeken poeders. Dit kan een grote impact hebben op de deeltjesgrootteverdeling in de geproduceerde aerosol en op de graad van retentie. 1.2.3.3 Volume voor dispersie Om het poeder dat in de Insufflator gebracht is efficiënt te kunnen toedienen, is een bepaalde hoeveelheid lucht noodzakelijk en de dispersie is vaak afhankelijk van het debiet van de luchtstroom. [8] 1.3 LASERDIFFRACTIE Om de deeltjesgrootteverdeling in kaart te brengen, bestaan er verschillende technieken. Deze bepaling moet steeds gebeuren onmiddellijk nadat de aerosol het apparaat verlaten heeft om sedimentatie te voorkomen. Een veelgebruikte techniek is cascade impactor analyse. Deze methode is echter zeer tijdrovend en het inademingsmanoeuvre kan niet helemaal nagebootst worden zonder het gebruik van ingewikkelde hulpstukken. Een snellere, meer betrouwbare en accurate methode is laser diffractie analyse. [27] Laser diffractie toont op een snelle manier de deeltjesgroottedistributie van het onderzochte poeder. De laser diffractor is gemakkelijk in gebruik en de bijhorende software berekent automatisch de data. De HELOS laser diffractor wordt hier toegepast om de deeltjesgrootteverdeling te bepalen van het poeder dat gedispergeerd wordt door de RODOS disperser en de door de DP-4M Insufflator.
7
2
OBJECTIEVEN Het doel van dit onderzoek is de Penn-Century Dry Powder Insufflator™ - Model DP-4M
for Mouse (Penn-Century. Inc. Wyndmoor, PA) in vitro te evalueren. Met name zal worden onderzocht hoe het apparaat verschillende poeders dispergeert in vergelijking met de RODOS Disperser (Sympatec GmbH, Clausthal-Zellerfel, Germany) aan de hand van een aantal vastgestelde parameters. Zo zullen het type poeder, de hoeveelheid toegediend poeder, het luchtvolume gebruikt om het poeder te dispergeren en de wijze waarop het poeder fijn werd gemaakt, variëren om te zien wat het effect is op de deeltjesgrootteverdeling. Deze deeltjesgrootteverdelingen worden gemeten met de HELOS BR laser diffractor (Sympatec GmbH, Clausthal-Zellerfel, Germany).
De gebruikte poeders zijn colistimethaat natrium, tobramycine base, mannitol en inuline. Deze zullen worden gemicroniseerd en gesproeidroogd en mannitol en inuline zullen ook worden gesproeivriesdroogd om zo poeders met verschillende deeltjesgroottes en verschillende fysicochemische eigenschappen te verkrijgen. Afhankelijk van het volume dat de verschillende poeders innemen, zal de Insufflator gevuld worden met 0.5, 1, 3 en 5 mg van het poeder. Er is een bepaalde hoeveelheid lucht nodig met een bepaalde snelheid om dit poeder efficiënt te kunnen dispergeren. Er zal gebruik worden gemaakt van 200 µl, 500 µl en 1000 µl aan lucht. De AP-1 Air Pump wordt gebruikt voor de experimenten met 200 µl en een 3ml spuitje voor de grotere volumes. Al deze experimenten zullen driemaal uitgevoerd worden met drie verschillende Insufflators.
Naast de deeltjesgrootteverdeling zal ook de retentie van de Insufflator bepaald worden en hoe deze afhankelijk is van dezelfde parameters. Dit zal enerzijds gebeuren door gewichtsbepaling, maar voor kleine hoeveelheden poeder is het nauwkeuriger een chemische analyse te gebruiken. Voor mannitol en inuline zal er gebruik gemaakt worden van dergelijke chemische analyse via een colorimetrische methode.
Tot slot zullen ook SEM-foto’s worden gemaakt om de structuur en de vorm van het gemicroniseerde, gesproeidroogde en gesproeivriesdroogde poeder in beeld te brengen aangezien dit ook een invloed kan hebben op de dispersie van het poeder. 8
3
MATERIALEN EN METHODES
3.1 DP-4M INSUFFLATOR De Dry Powder Insufflator™ - Model DP-4M (Penn-Century. Inc. Wyndmoor, PA) is de nieuwere versie van de Dry Powder Insufflator™ - Model DP-4. Deze laatste wordt gebruikt voor pulmonale toediening bij grotere species zoals ratten, terwijl de DP-4M ontwikkeld is voor gebruik bij muizen. Beide zijn ontworpen om een groot bereik aan poeder in de long te brengen, in een wolk van fijne partikels. De kleinere versie kan gemakkelijk onderscheiden worden door middel van de zwarte band op het toestel. De Insufflator bestaat uit 3 delen die getoond worden in figuur 3.1. Enerzijds de monsterkamer waarin het poeder wordt aangebracht, daarnaast een delivery tube die wordt ingebracht in het dier en een Air Intake. Deze laatste wordt verbonden met een AP-1 Air Pump of een 3ml spuitje tijdens de toediening voor de dispersie van het poeder. De Insufflator is gemaakt uit PEEK™ (polyetheretherketone). De delivery tube is van roestvrij staal en gebogen onder een hoek van 120 graden voor een gemakkelijke intratracheale toediening. [10]
Figuur 3.1: DP-4M Insufflator met AP-1 Air Pump. De Insufflator bestaat uit een Air intake, een monsterkamer en een delivery tube. (http://penncentury.com/products/dry-powderdevices/dry-powder-insufflator-dp-4m/model-dp-4m/)
De monsterkamer wordt geopend door de 2 delen van de Insufflator via een draaibeweging van elkaar te trekken. Met een kleine spatel kan een aantal milligram van het gewenste poeder toegevoegd worden, afhankelijk van het volume dat het poeder inneemt. Daarna worden de 2 delen weer bij elkaar gebracht, met voldoende kracht zodat ze op elkaar blijven, maar zonder het systeem te forceren. Bij het sluiten kan er ongewenst poeder 9
uit het toestel verdwijnen, daarom moet dit met de nodige voorzichtigheid gebeuren. Zolang de dosis niet toegediend is, blijft het poeder in de monsterkamer door een kleppensysteem dat speciaal ontwikkeld is tegen verlies van het poeder en blootstelling aan vocht of contaminatie van buitenaf. [10] 3.2 AP-1 AIR PUMP Om het poeder in de Insufflator te kunnen dispergeren is een bepaald volume aan lucht nodig. Hiervoor kan een Air Pump – Model AP-1 (Penn-Century. Inc. Wyndmoor, PA) gebruikt worden (Figuur 3.2). Deze pomp kan ingesteld worden op een volume van 0 tot 5 milliliter. De Air Pump wordt ingedrukt met de duim en zorgt ervoor dat er telkens een reproduceerbaar volume aan lucht wordt gebruikt. Ook is de afstand waarover de Air Pump moet worden ingedrukt zeer klein, waardoor er minder druk moet worden gebruikt en er minder kans is op beschadiging van de muis bij in vivo onderzoek. [10] Voor gebruik bij muizen wordt deze Air Pump ingesteld op een volume van 200 µl aangezien muizen een zeer klein ademvolume hebben en geen groter volume lucht kunnen verdragen zonder schade toe te brengen aan de long. Er wordt ook gekeken naar het effect van een groter volume aan lucht en daarvoor wordt een spuit van 3 milliliter gebruikt. Deze wordt gebruikt voor luchtvolumes van 500 µl en 1000 µl.
Figuur 3.2: Penn-Century Air Pump – Model AP-1 [10] 3.3 VULLINGSGEWICHT De Insufflator kan gevuld worden met verschillende hoeveelheden van de te onderzoeken poeders. Dit kan een grote impact hebben op de deeltjesgrootteverdeling in de geproduceerde aerosol en op de graad van retentie. De onderzochte hoeveelheden zijn 1, 3, en 5 mg. Echter, bij de meeste poeders nemen de deeltjes een te groot volume in en past 5 mg poeder niet meer in de monsterkamer. Het poeder dat in overmaat in de Insufflator 10
wordt gebracht, kan er niet uit verwijderd worden bij dispersie, waardoor de retentie zeer groot is. Daarom worden gegevens voor 5 mg slechts voor een aantal poeders bepaald. Gesproeivriesdroogd poeder heeft een zeer lage dichtheid, waardoor ook 3 mg of zelfs 1 mg poeder niet meer kan onderzocht worden. Daarom wordt naast deze dosissen ook 0.5 mg opgenomen in het onderzoek voor mannitol en inuline. 3.4 GEBRUIKTE POEDERS 3.4.1 Colistine Colistine is een antibioticum dat wordt gebruikt voor het bestrijden van onder andere Pseudomonas aeruginosa bij cystische fibrose. Bij deze ziekte, ook wel taaislijmziekte genoemd, is het slijm veel taaier dan normaal en dus ook moeilijker op te hoesten. Hierdoor kunnen gemakkelijker luchtweginfecties optreden. Een chronische infectie met Pseudomonas aeruginosa zorgt voor een daling van de longfunctie. De infectie kan efficiënt worden bestreden door het geneesmiddel te inhaleren waardoor het onmiddellijk in de longen terechtkomt. Colistine (Figuur 3.3) bestaat onder twee vormen: colistinesulfaat en colistimethaat natrium. Beide vormen worden op een verschillende manier uit het lichaam verwijderd. Colistimethaat natrium is als inactief prodrug van colistine werkzaam tegen Pseudomonas aeruginosa en is in droog poedervorm veilig en effectief. [28], [29]
Figuur 3.3: Structuurformule colistine
11
3.4.2 Tobramycine Tobramycine (Figuur 3.4) is ook een bewezen werkzaam antibioticum tegen Pseudomonas aeruginosa bij cystische fibrose. De eensecondewaarde van de ademhaling verbetert bij gebruik van dit geneesmiddel. Het is een aminoglycoside en wordt dus niet opgenomen via de maag en de darm, maar moet intraveneus, intramusculair of via inhalatie ingenomen worden. Voor inhalatie wordt de base-vorm van tobramycine gebruikt. [30]
Figuur 3.4: Structuurformule tobramycine 3.4.3 Mannitol Vaak wordt ook geprobeerd om vaccins zo goed mogelijk toe te dienen via inhalatie om een lokale immuunrespons te triggeren. De longen zijn zeer sterk gevasculariseerd, hebben een groot absorptieoppervlak en er zijn vele lokale antigeen presenterende cellen aanwezig, wat een voordeel is voor de opname van het virus pathogeen. Aangezien hierbij het vaccin bestaat uit eiwitten, moeten deze in droge vorm gestabiliseerd worden. Bovendien wordt er met lage concentraties gewerkt. Daarom wordt er gebruik gemaakt van een hulpstof om een stabiliserende matrix te vormen. Deze zijn meestal suikers, bijvoorbeeld D-mannitol (Figuur 3.5). [21], [24], [31]
Deze zijn in grotere concentraties aanwezig waardoor de eigenschappen van het mengsel vooral bepaald worden door deze laatste. Bij het onderzoek naar de werking van de DP-4M Insufflator kunnen daarom de suikers getest worden als maat voor het gedrag van in deze suikers ingesloten vaccins.
12
Figuur 3.5: Structuurformule D-mannitol 3.4.4 Inuline Inuline (Figuur 3.6) is een ander voorbeeld van een suiker, meer specifiek een oligosaccharide, dat kan gebruikt worden voor de pulmonale toediening van vaccins om deze eiwitten te stabiliseren. [3], [14], [32–34]
Figuur 3.6: Structuurformule inuline 3.5 DEELTJESGROOTTE VERKLEINEN De partikels van de batches te onderzoeken poeder moeten eerst verkleind worden tot een grootte tussen 1 µm en 5 µm. Enkel deze partikels komen op de juiste plaats in de luchtwegen terecht bij inhalatie. Te grote partikels slaan neer door impactie in de bovenste luchtwegen en te kleine partikels zullen terug uitgeademd worden omdat ze niet snel genoeg sedimenteren in de longblaasjes. Dit kan gedaan worden door middel van microniseren, sproeidrogen of sproeivriesdrogen. Elk van deze methoden geeft een poeder met verschillende deeltjesgrootte en verschillende fysicochemische eigenschappen. Op die manier worden ook verschillende resultaten bekomen bij gebruik van de poeders in inhalatoren.
13
3.5.1 Microniseren Microniseren is een eerste methode om de deeltjes van een poeder te verkleinen, bijvoorbeeld door middel van een jet mill (luchtmolen). De jet mill die gebruikt wordt, is de Alpine Spiral Jet Mill 50 AS (Hosokawa Alpine Aktiengesellschaft, Augsburg, Germany). Deze is ideaal om deeltjes kleiner dan 5 µm te verkrijgen bij een relatief lage druk en in kleine hoeveelheden. Deze jet mill is bovendien zeer compact, zoals te zien in figuur 3.7, en daarom gemakkelijk in gebruik voor farmaceutische toepassingen. Nog een voordeel van deze compactheid is dat hij snel uit elkaar te halen en schoon te maken is. [35] De nozzle van een jet mill zorgt ervoor dat het poeder een versnelling ondergaat en vermengd wordt met de toegevoerde stikstof waardoor de deeltjes in de molen tegen de wanden en tegen elkaar botsen en uiteenvallen in kleinere partikels. Enkel de deeltjes die klein genoeg zijn, kunnen de molen verlaten. De grotere deeltjes blijven rondcirkelen en worden steeds kleiner tot ze ook de molen kunnen verlaten en opgevangen worden. Zo wordt een heel fijn poeder bekomen, afhankelijk van de toegevoerde druk die de snelheid in de maalkamer bepaalt en daarmee de effectieve cut-off waarde van deze kamer. Bij het microniseren wordt een nozzledruk toegepast van 6 bar en een molendruk van 2 bar. Een voordeel van de jet mill is dat er een koelingseffect is en daardoor geen warmteeffect plaatsvindt dat het poeder eventueel kan beschadigen.
Figuur 3.7: Alpine Pharma Spiral Jet Mill 50 AS (http://www.lochtec.dk/produkter/lab/lab.html)
14
3.5.2 Sproeidrogen Een andere manier om zeer fijn poeder te verkrijgen is via sproeidrogen. Dit wordt uitgevoerd met behulp van de Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI Labortechnik AG,Flawil, Switzerland) [36] (Figuur 3.8). Het algemene principe van sproeidrogen is schematisch te zien in figuur 3.9. Een opgelost poeder wordt in zeer kleine druppeltjes verdeeld door een nozzle. Bij hoge temperatuur met een hete gasstroom wordt vervolgens de vloeistof verdampt zodat er droge sferische poederdeeltjes gevormd worden. Het verwarmde gas wordt in de droogkamer gebracht via een luchtdisperser zodat het gas gelijkwaardig verdeeld is over de hele kamer. Voor het poeder gecollecteerd wordt, moet het door een doorvalsluis. De allerkleinste deeltjes verlaten de luchtstroom richting filter, terwijl de gewenste deeltjes in de cycloon terechtkomen en worden opgevangen. (http://www.pharmainfo.net/reviews/spray-drying-review)
De deeltjesgrootteverdeling wordt bepaald door de inlaattemperatuur, de concentratie van de geneesmiddeloplossing, de sproeisnelheid en de verstuiverdruk. Ook de vochtigheid van het eindproduct en de opbrengst kunnen variëren met de ingestelde parameters.
Figuur 3.8: BÜCHI Mini Spray Dryer B-290 [36] De gebruikte inlaattemperatuur is 120 °C en de aspirator, gebruikt om een onderdruk te produceren en zo een stroom te genereren doorheen de sproeidroger, wordt ingesteld op 100%. De pompsnelheid is 8%, dit komt overeen met een snelheid van 2.8 ml/min bij de gebruikte diameter van het buisje. De verstuiverdruk wordt ingesteld op 50 %. Bij deze 15
omstandigheden is de uitlaattemperatuur, afhankelijk van het gebruikte materiaal en de concentratie hiervan, rond de 75 °C. Door deze hoge temperaturen kunnen via sproeidrogen geen proteïnen bepaald worden als deze niet thermostabiel zijn. Voordelen van sproeidrogen zijn dat het zeer snel gebeurt, een groot bereik aan poedersoorten verwerkt kan worden en de kwaliteit van het poeder behouden blijft zolang dit thermostabiel is. De partikels die gevormd worden zijn meestal sferisch, redelijk uniform van grootte, meestal amorf en soms hol binnenin. Een nadeel hierbij is dat de dichtheid van het poeder is verlaagd ten opzichte van de kristallijne modificatie, waardoor het volume van eenzelfde massa groter wordt. Mannitol vormt een uitzondering tussen de verwerkte poeders, aangezien dit niet lang amorf blijft, maar snel terug uitkristalliseert.
Figuur 3.9: Principe van sproeidrogen. De oplossing wordt verneveld bij een gasstroom met hoge temperatuur en in een droogkamer gebracht waar de vloeistof verdampt. De deeltjes worden opgevangen in een cycloon waarna een droog poeder overblijft. (http://www.malvern.de/ProcessEng/processes/spraydrying/overview.htm)
3.5.3 Sproeivriesdrogen De laatste techniek gebruikt om deeltjes kleiner te maken, is sproeivriesdrogen. Het is, naast sproeidrogen, een andere techniek die vaste dispersies in poedervorm kan opleveren. Het principe wordt weergegeven in figuur 3.10.
De eerste fase is het verstuiven van de vloeistof met een nozzle, gelijk aan de nozzle die wordt gebruikt voor het sproeidrogen. Deze druppels worden bevroren door ze bijvoorbeeld te verstuiven in vloeibaar stikstof, waarbij bij voorkeur de vorming van grote 16
ijskristallen wordt vermeden. Hoe meer water bevriest, hoe groter de concentratie in de overgebleven vloeistof wordt. Tijdens de tweede fase, het primair drogen, wordt het ijs gesublimeerd gedurende een aantal dagen. De druk wordt verlaagd om sublimatie te versnellen en de temperatuur wordt voldoende verhoogd. Hierna blijft nog een kleine hoeveelheid vocht over die kan worden verwijderd tijdens de secundaire droging. Dit wordt gedaan door de temperatuur te verhogen tot 50 graden boven de temperatuur van het primaire drogen onder vacuüm.
Het resultaat van sproeivriesdrogen is vaak een hygroscopisch poeder en is zeer volumineus doordat het poeder zeer poreus is met een kleine dichtheid. Gesproeivriesdroogde stoffen zijn meestal amorf. Mannitol vormt ook hierop, net als bij sproeidrogen, een uitzondering. Mannitol wordt zeer snel terug kristallijn, waardoor ook het volume terug verkleint. Deze methode wordt vaak gebruikt bij eiwitten, omdat deze snel denatureren bij de hoge temperaturen van sproeidrogen. (http://www.authorstream.com/Presentation/robin_vinnu-623370-spray-freeze-drying-technique/)
Figuur 3.10: Principe van sproeivriesdrogen. De oplossing wordt verstoven in vloeibaar stikstof waardoor de druppels bevriezen. Daarna wordt het ijs gesublimeerd bij hogere temperatuur en lagere druk. De overige vloeistof wordt verwijderd tijdens het secundaire drogen. (http://www.powderpro.se/spray-freezing-and-freeze-drying/) 3.6 LASER DIFFRACTIE Laser diffractie analyse is een methode, naast cascade impactor analyse, om deeltjesgroottedistributies te bepalen van verschillende soorten poeders. Voordelen van 17
laser diffractie zijn dat het een tijdbesparende methode is en zeer reproduceerbaar. De laser diffractor waarmee in dit onderzoek gewerkt wordt, is een HELOS BR (Helium-Neon Laser Optical System) (Sympatec GmbH, Clausthal-Zellerfel, Germany) (Figuur 3.11) met een laserstraal met golflengte 632.8nm. Er zijn meerdere lenzen beschikbaar, waaronder de R3 lens (0.9–175 µm) en de R5 lens (4.5-875 µm). Aangezien er voor inhalatie meer interesse is in de kleinst mogelijke deeltjes, wordt de R3 lens toegepast. (http://www.sympatec.com/EN/LaserDiffraction/HELOS.html)
Figuur 3.11: Sympatec HELOS BR diffractor (http://www.sympatec.com/EN/LaserDiffraction/HELOS.html)
De laser diffractor meet de deeltjesgrootteverdeling van het gebruikte poeder, maar dit is slechts een hulpmiddel om te bepalen wat werkelijk onderzocht wordt: de mate waarin het poeder gedispergeerd wordt tot zijn primaire partikels. Dit hangt voor het grootste deel af van de gebruikte disperser, hier de DP-4M Insufflator. Daarnaast hangt er ook veel af van het gebruikte poeder. Het soort poeder en de wijze waarop het verkleind is, met name door microniseren, sproeidrogen of sproeivriesdrogen, speelt ook een belangrijke rol in de dispergeerbaarheid. Soms kunnen de deeltjes zeer cohesief zijn en dus moeilijk te deagglomereren, bijvoorbeeld omdat het poeder te hygroscopisch is en vochtgevoelig. Tijdens het onderzoek varieerde de luchtvochtigheid tussen de 18 en 54%, wat geen extreem hoge waarden zijn die de resultaten sterk kunnen beïnvloeden. [37], [38] Het poeder dat gedispergeerd wordt, gaat door de laserstraal van de laser diffractor en zorgt, naast absorptie en refractie, voor diffractie van de straal. De straal gaat verder door een Fourierlens die een bepaald brandpunt heeft dat een beeld vormt op de detector. De detector van een laser diffractor bestaat uit 31 concentrische ringen waarop de deeltjes 18
afgebeeld worden. De Fourier lens zorgt er voor dat het afgebogen licht van alle deeltjes die dezelfde grootte hebben maar zich op verschillende plaatsen in het meetvolume bevinden, op dezelfde ring terecht komt. Daarbij buigen de kleinste deeltjes het licht het sterkst af waardoor dit terecht komt op de buitenste ringen, terwijl de grootste deeltjes het licht minder afbuigen, zoals te zien is in figuur 3.12. Op deze manier kan met behulp van ingewikkelde algoritmes efficiënt de deeltjesgroottedistributie in beeld worden gebracht.
Figuur 3.12: Verschil in diffractie van de laserstraal door grote en kleine partikels. Kleine deeltjes buigen de laserstraal af onder een grote hoek, grote deeltjes onder een kleine hoek. (http://www.malvern.com/labeng/technology/laser_diffraction/laser_diffraction.htm) Tijdens de meting wordt 1 ring van de detector gekozen waarop bepaald wordt wanneer de detectie start en stopt. Aangezien hier geprobeerd wordt om zo klein mogelijke deeltjes te meten, wordt het 30e kanaal gekozen, dat zich aan de periferie van de detector bevindt. Er wordt ingesteld dat de meting begint van zodra de concentratie op ring 30 hoger is dan 0.2% en eindigt 1 seconde nadat de concentratie onder deze waarde daalt. Deze 1 seconde wordt ingevoerd als veiligheid opdat de meting niet zou beëindigd worden als de concentratie even daalt, maar er nog meer poeder moet gemeten worden. De deeltjesgrootte kan automatisch berekend worden op 2 manieren: via de Mie of Fraunhofer methode. De Mie theorie omvat ook de absorptie en refractie en is daardoor een meer precieze methode. Hiervoor moeten echter meer optische parameters opgegeven worden die niet altijd gekend zijn. Daarom wordt vaker gebruik gemaakt van de Fraunhofer methode. [27] 19
Deze vergelijkingen zijn ingebouwd in de toegepaste software van de laserdiffractie, WINDOX 5, onder de naam van Fraunhofer Enhanced Evaluation (FREE) of Mie Enhanced Evaluation (MIEE). Na het instellen van de keuze, wordt deze automatisch toegepast tijdens de meting om de deeltjesgrootteverdeling te berekenen. Het resultaat wordt gegeven in een cumulatieve volumeverdeling als functie van de diameter, dit toont welk volume van het poeder zich in een bepaald deeltjesgroottebereik bevindt.
Figuur 3.13: Voorbeelden van deeltjesgrootteverdelingen (gesproeidroogde inuline met 1000 µl en 0.5 mg) – (gesproeidroogde mannitol met 200 µl en 3 mg) Er zijn, zoals in de voorbeelden in figuur 3.13, 2 curves zichtbaar. Dit zijn de dichtheidsdistributie en de cumulatieve volumeverdeling. Uit deze laatste kan besloten worden welk volume van het poeder een deeltjesgrootte heeft kleiner dan een bepaalde diameter. Voor inhalatie bij de mens is het gewenst dat de deeltjes kleiner zijn dan 5 µm, liever nog 3 µm, om diep genoeg in de longen terecht te komen en een goede werking te kunnen uitvoeren. Voor de muis is deze waarde niet precies gekend, maar het spreekt voor zich dat hier ook kleine deeltjes noodzakelijk zijn. Dit is dan ook een belangrijke parameter die in beschouwing moet worden genomen. De fractie van het poeder die kleiner is dan een bepaalde gekozen waarde, hier 5 µm, wordt ook de FPF of de Fine Particle Fraction van het gedispergeerde poeder genoemd. [38] De software berekent ook automatisch verschillende karakteristieke diameters zoals de X10, X25, X50, X75, X90 en de optische concentratie. De X50 is de mediane diameter van de deeltjes in het gedispergeerde poeder; de diameter waarvoor geldt dat 50 volumeprocent van het poeder zich in kleinere en 50 % zich in grotere deeltjes bevindt. De overige X20
waarden worden gebruikt om niet enkel een idee te hebben van de gemiddelde diameter, maar ook van de spreiding van de deeltjesgrootte. Zo is de X10 een waarde die aanduidt dat 10 % van het volume van de deeltjes een diameter heeft kleiner dan deze waarde. Bij een poeder met grote deeltjes zal de FPF laag zijn door de kleine hoeveelheid aan kleine deeltjes, maar het kan ook gebeuren dat er een lage FPF voorkomt bij poeder met kleine deeltjes. Dit komt door de cohesiekrachten tussen de partikels, waardoor ze minder goed kunnen gedispergeerd worden. Dit kan opgelost worden door het luchtdebiet door de inhaler te verhogen [38]. 3.6.1 RODOS-metingen Het poeder dat geanalyseerd wordt, kan op verschillende manieren toegebracht worden aan de laser diffractor. De RODOS T4 disperser (Sympatec GmbH, Clausthal-Zellerfel, Germany) (Figuur 3.14) is er een van. Via een venturi-principe wordt het poeder met de RODOS gedispergeerd waarbij gevormde agglomeraten worden verdeeld in primaire partikels. De cohesieve krachten tussen de deeltjes worden efficiënt verbroken. (http://www.sympatec.com/EN/LaserDiffraction/RODOS.html)
Figuur 3.14: Sympatec RODOS T4 disperser (http://www.sympatec.com/EN/LaserDiffraction/RODOS.html)
Dit toestel kan werken onder een bepaalde druk en bij een bepaalde rotatiesnelheid van de vulring. De rotatiesnelheid is de snelheid waarmee het poeder toegediend wordt aan de laser diffractor en door deze snelheid lager dan 100 % in te stellen, wordt er minder poeder ineens toegediend. Bij dit onderzoek wordt de rotatiesnelheid vastgezet op 15% en
21
als inlaatdruk wordt 1, 3 en 5 bar toegepast. Deze variatie in druk is nodig om te onderzoeken of er een minimale druk nodig is voor een efficiënte dispersie. Het poeder wordt op de vulring van de RODOS aangebracht over een afstand van ongeveer 1 cm, waarna de meting kan gestart worden. Eerst wordt een referentiemeting uitgevoerd om te corrigeren voor eventuele verstoringen van het signaal door bijvoorbeeld vervuiling van de lens. 3.6.2 Insufflatormetingen In het geval van de RODOS wordt de primaire deeltjesgroottedistributie gegeven van het poeder, aangezien het poeder gedispergeerd is tot enkelvoudige partikels. Bij inhalatieapparaten, hier de DP-4M Insufflator, gebeurt deze dispersie niet volledig en kunnen de agglomeraten niet helemaal verbroken worden. Daardoor worden meestal grotere deeltjes gemeten. Het doel bij het ontwikkelen van inhalatieapparatuur is om de distributie zo dicht mogelijk bij de RODOS-distributie te krijgen en er voor zorgen dat er dus zo veel mogelijk deagglomeratie optreedt bij het gebruik ervan. Om de Insufflatormetingen uit te voeren, wordt het hulpstuk dat getoond wordt in figuur 3.15 gebruikt. Dit kan gemakkelijk op de laser diffractor gemonteerd worden, zodat het zich altijd in dezelfde positie ten opzichte van de laserstraal bevindt.
Figuur 3.15: Hulpstuk voor Insufflatormetingen via laserdiffractie 3.7 RETENTIE BEPALING Naast de deeltjesgroottedistributie, zal ook de retentie van de Insufflator bepaald worden bij elke meting. Dit is de hoeveelheid poeder die achterblijft in het toestel na 22
toediening van het poeder. Zelfs na verschillende puffs kan het zijn dat er een gedeelte zich nog in de monsterkamer bevindt. De retentiebepaling wordt meestal gedaan door weging. Wanneer de hoeveelheid poeder echter te klein wordt, namelijk 0.5 mg, is het wegen niet meer voldoende nauwkeurig en wordt overgeschakeld op een chemische analyse. Voor mannitol bestaat er een colorimetrische bepaling gebaseerd op de Hantzsch reactie. Voor de bepaling van inuline wordt de anthron-test gebruikt, eveneens een colorimetrische bepaling. 3.7.1 Op basis van gewicht De retentie kan enerzijds worden bepaald aan de hand van het gewicht. Er wordt nauwkeurig bepaald hoeveel poeder er in de monsterkamer wordt aangebracht en het toestel wordt gewogen voor en na toediening van het poeder. Hiervoor is een precieze balans nodig, nauwkeurig op 0.01 mg, aangezien met zeer kleine hoeveelheden wordt gewerkt. De gebruikte balans is de Mettler Toledo XP105 Delta Range Analytical Balance (Mettler-Toledo Inc., 1900 Polaris Parkway, Columbus). De Insufflator is relatief licht, wat dit proces van afwegen gemakkelijker maakt. 3.7.2 Op basis van chemische analyse 3.7.2.1 Mannitol
Figuur 3.16: Hantzsch reactie voor de colorimetrische bepaling van mannitol. Formaldehyde reageert met acetylaceton en ammoniak tot een heterocyclische pyridinering, die een gele kleur geeft aan de oplossing.
Een andere manier om de hoeveelheid mannitol te bepalen, naast de gewichtsbepaling, is een colorimetrische methode. Eerst wordt mannitol geoxideerd door natrium periodaat bij een pH van 3.0. Hierbij wordt formaldehyde gevormd dat daarna aan de Hantzsch reactie onderworpen wordt. Het formaldehyde reageert met ammoniak en acetylaceton, waardoor een heterocyclische pyridinering bekomen wordt die het mengsel een gele kleur geeft (Figuur 3.16). Deze kleur is binnen bepaalde grenzen evenredig met de 23
concentratie aan mannitol en kan bepaald worden via een spectrofotometer bij 412nm, waar de maximale absorptie optreedt. [39]
Procedure: een hoeveelheid van 5 tot 150 nmol mannitol wordt opgelost in 0.1 ml water. Dit wordt overgebracht in een 1.5 ml Eppendorfcupje. Daar wordt 0.5 ml 0.5M formaat (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinhem, Germany, Lot#BCBH2575V), pH 3.0 aan toegevoegd, samen met 0.3 ml 5 mM natrium periodaat (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinhem, Germany, Lot#MKBJ8889V). Hierna wordt het Eppendorfcupje gevortext en 15 seconden op kamertemperatuur geplaatst. Dan wordt 0.3 ml van een oplossing toegevoegd die bestaat uit 0.1 M acetylaceton (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinhem, Germany, Lot#STBC6076V), 2 M ammoniumacetaat (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinhem, Germany, Lot#STBB9337V) en 0.02 M natriumthiosulfaat (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinhem, Germany, Lot#BCBH1741V). Het cupje wordt gesloten, 2 minuten verwarmd in kokend water en daarna afgekoeld onder lopend kraanwater. [39]
Na dit proces kan de absorbantie bij 412nm worden gemeten. De sterkte van het signaal is recht evenredig met de concentratie aan mannitol in het cupje binnen het concentratiegebied tussen 5 nmol en 150 nmol per 0.1 milliliter, dus tussen 50 en 1500 µM. Buiten dit gebied loopt de ijklijn niet meer lineair. Verschillende concentraties aan mannitol worden gemeten via spectrofotometrie voor het opstellen van een ijklijn: 1500, 1200, 1000, 800, 600, 400, 200, 150, 120, 100, 80 en 50 nmol/ml. Hiervoor wordt een verdunningsreeks gemaakt, waarbij uitgegaan wordt van een stockoplossing (50.00 ml) met concentratie 2000 nmol/ml. Om deze oplossing te maken, moet berekend worden hoeveel mannitol er nodig is. Het moleculair gewicht van mannitol is 182.172 g/mol, hieruit volgt: 2000 nmol/ml * 50.00 ml = 100 000 nmol = 0.1 mmol 0.1 mmol * 182.172 mg/mmol = 18.2172 mg mannitol Uit deze stockoplossing worden bepaalde hoeveelheden gepipetteerd en aangelengd tot 10.00 ml met gedemineraliseerd water om een verdunningsreeks te bekomen. Om een concentratie van 1500 nmol/ml te bekomen, wordt 7.50 ml stockoplossing aangelegd met 2.50 ml gedemineraliseerd water. 24
1500 nmol/ml * 10.00 ml = 2000 nmol/ml * 7.50 ml Een analoge berekening wordt gedaan voor de andere concentraties aan mannitol volgens tabel 3.1. Tabel 3.1: Verdunningsreeks mannitolbepaling Concentratie (nmol/ml) 1500
Stockoplossing (ml) 7.50
Gedemineraliseerd water (ml) 2.50
1200
6.00
4.00
1000
5.00
5.00
800
4.00
6.00
600
3.00
7.00
400
2.00
8.00
200
1.00
9.00
150
0.75
9.25
120
0.60
9.40
100
0.50
9.50
80
0.40
9.60
50
0.25
9.75
De mate van kleurvorming kan gemeten worden via de UV-VIS spectrofotometer Unicam UV 500 (Gemini BV, Apeldoorn, Nederland). 3.7.2.2 Inuline Ook inuline kan nauwkeuriger bepaald worden via een chemische analyse methode dan via wegen. Hiervoor wordt de anthron-test gebruikt. Eerst wordt een 0.1 % anthronreagent gemaakt door 0.100 mg op te lossen in 100 ml geconcentreerd zwavelzuur. Daarna wordt 1.00 ml monster in een proefbuis gemengd met 2.00 ml anthron reagent. Dit mengsel warmt op tot kooktemperatuur, daarom moet deze afgekoeld worden tot kamertemperatuur, waarna deze gevortext wordt en de absorbantie bij 630 nm bepaald wordt.
25
Het suiker reageert met anthron in aanwezigheid van een dehydraterend zuur en vormt een blauw-groen complex, volgens de reacties in figuur 3.17. [40]
Figuur 3.17: Anthron reactie. Een suiker zoals glucose of inuline reageert in aanwezigheid van een dehydraterend zuur met anthron tot een blauw-groen complex. Voor het opstellen van de ijklijn worden 10 verdunningen gemaakt, gaande van 10 µg/ml tot 100 µg/ml. Eerst wordt een stockoplossing bereid door 10 mg inuline op te lossen in 100 ml water. Vanuit deze stock worden verdunningen bereid volgens tabel 3.2. Tabel 3.2: Verdunningsreeks inulinebepaling Concentratie
Stockoplossing
Gedemineraliseerd
(µg/ml)
(ml)
water (ml)
100
1
0
90
0.9
0.1
80
0.8
0.2
70
0.7
0.3
60
0.6
0.4
50
0.5
0.5
40
0.4
0.6
30
0.3
0.7
20
0.2
0.8
10
0.1
0.9
0
0
1
26
3.8 SCANNING ELEKTRONEN MICROSCOPIE Scanning Elektronen Microscopie (SEM) is een manier om poeder in beeld te brengen met een zeer sterke vergroting. Eerst moet het poeder voorbereid worden door het aan te brengen op een monsterhouder voorzien van geleidende tape. Door sputteren wordt onder vacuüm omstandigheden een dunne laag van ongeveer 10 nm goud/palladium aangebracht over het hele poeder. Er wordt gebruik gemaakt van argon om een diffuse verspreiding van het goud/palladium over het preparaat te krijgen en ervoor te zorgen dat er geen zuurstof meer aanwezig is in de preparaatkamer die in oxidatie van het monster zou kunnen resulteren. Daarna worden de volledig droge preparaten aangebracht in de SEM onder hoog vacuüm. Hierbij wordt een elektronenbundel afgeschoten met een versnelling van 4 kV op het preparaat. De op het preparaat invallende elektronen brengen allerlei processen op gang zoals het vrijmaken van secundaire elektronen uit het oppervlak van het preparaat die op een detector worden opgevangen. Daarmee wordt een beeld gevormd terwijl het oppervlak van het preparaat ‘gescand’ wordt. De teruggestrooide elektronen worden gemeten als elektrische stroom en zo wordt de oppervlakte in beeld gebracht. Er kunnen vergrotingen waargenomen worden van 10 tot 500000 maal, de afbeeldingen van mannitol worden gemaakt met vergrotingen van 250 en 5000 maal.
27
4
RESULTATEN
4.1 RODOS-METINGEN Eerst en vooral wordt voor elk poeder de primaire deeltjesgroottedistributie bepaald, gemeten via de RODOS-disperser. Hiermee kan achteraf de deeltjesgroottedistributie van de Insufflator vergeleken worden. RODOS-metingen worden in tweevoud uitgevoerd bij 1, 3 en 5 bar. Tabellen 8.1-8.10 in bijlage tonen de gemiddelde waarden voor de deeltjesgrootteverdeling na dispersie met de RODOS disperser. In figuur 4.1 zijn dezelfde waarden in grafiekvorm waarneembaar.
RODOS deeltjesgrootteverdeling Deeltjesgrootte (µm)
30,00 25,00 20,00 15,00
X10
10,00
X50
5,00
X90
0,00 1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5 COLI COLI SD TOBRA TOBRA MANN MICRO MICRO SD MICRO
MANN SD
MANN SFD
INU INU SD INU SFD MICRO
Figuur 4.1: Deeltjesgrootteverdelingen door de RODOS disperser bij 1, 3 en 5 bar. De X10-, X50-, en X90-waarden betekenen dat respectievelijk 10 %, 50 % en 90% van het volume van de deeltjes kleiner is dan deze waarde. (COLI = colistine; TOBRA = tobramycine; MANN = mannitol; INU = inuline; MICRO = gemicroniseerd ; SD = gesproeidroogd; SFD = gesproeivriesdroogd) 4.2 DEELTJESGROOTTEVERDELING DOOR INSUFFLATOR Na de RODOS-metingen, kan via laserdiffractie ook de deeltjesgrootteverdeling bepaald worden van het poeder dat de Insufflator verlaat. Tabellen 8.11-8.20 in bijlage tonen de gemiddelde waarden van 3 Insufflatormetingen, met een maximum van 4 puffjes per Insufflator. Dit betekent dat de gegeven waarden een gemiddelde zijn van 3 tot 12 waarden. In figuur 4.2 tot 4.5 worden deze waarden samengevat weergegeven waarbij van elke stof 28
de gemicroniseerde, gesproeidroogde en gesproeivriesdroogde vorm worden vergeleken met elkaar. Omdat er gebruik gemaakt wordt van gemiddelde waarden voor de mediane diameter (X50), zijn ook foutenbalken weergegeven om de spreiding van de resultaten aan te duiden. Dit zijn standaarddeviaties op de waarden van alle metingen.
Colistine vergelijking X50 Deeltjesgrootte (µm)
25,00
Gemicroniseerd
Gesproeidroogd
20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 -5,00
Figuur 4.2: Vergelijking mediane diameters van gemicroniseerde en gesproeidroogde colistine. (RODOS 1/3/5: waarden van de RODOS-metingen bij 1, 3 en 5 bar. 200/500/1000: hoeveelheid lucht gebruikt voor dispersie in µl. 1/3/5: vullingsgewicht Insufflator in mg)
Tobramycine vergelijking X50 30,00 Gemicroniseerd
Deeltjesgrootte (µm)
25,00
Gesproeidroogd
20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 -5,00
RODOS1 RODOS3 RODOS5
200-1
200-3
500-1
500-3
1000-1
1000-3
Figuur 4.3: Vergelijking mediane diameters van gemicroniseerde en gesproeidroogde tobramycine (RODOS 1/3/5: waarden van RODOS-metingen bij 1, 3 en 5 bar. 200/500/1000: hoeveelheid lucht gebruikt voor dispersie in µl. 1/3: vullingsgewicht Insufflator in mg) 29
Deeltjesgrootte (µm)
30,00
Inuline vergelijking X50 Gemicroniseerd
Gesproeidroogd
Gesproeivriesdroogd
25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00
Figuur 4.4: Vergelijking mediane diameters van gemicroniseerde, gesproeidroogde en gesproeivriesdroogde inuline (RODOS 1/3/5: waarden van de RODOS-metingen bij 1, 3 en 5 bar. 200/500/1000: hoeveelheid lucht gebruikt voor dispersie in µl. 0.5/1/3/5: vullingsgewicht Insufflator in mg)
Mannitol vergelijking X50 50,00
Deeltjesgrootte (µm)
Gemicroniseerd
Gesproeidroogd
Gesproeivriesdroogd
40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 -10,00
RODOS RODOS RODOS 200-0,5 200-1 1 3 5
200-3 500-0,5 500-1 500-3 100-0,5 1000-1 1000-3
Figuur 4.5: Vergelijking mediane diameters van gemicroniseerde, gesproeidroogde en gesproeivriesdroogde mannitol (RODOS 1/3/5: waarden van de RODOS-metingen bij 1,3 en 5 bar. 200/500/1000: hoeveelheid lucht gebruikt voor dispersie in µl. 0.5/1/3: vullingsgewicht Insufflator in mg)
30
Naast de mediane diameters kan ook gekeken worden naar de fine particle fractions, de fractie deeltjes in de toegediende dosis die kleiner is dan 5 µm. Dit wordt wederom vergeleken tussen de verschillende poeders in figuren 4.6-4.9. Het is het percentage van de deeltjes die de Insufflator verlaten hebben, dus van de hoeveelheid die gedetecteerd is door de laser diffractor.
% van toegediende dosis
Colistine < 5µm 100,00 80,00 60,00 40,00
MICRO
20,00
SD
0,00
Figuur 4.6: Percentage van de toegediende dosis kleiner dan 5 µm bij gemicroniseerde en gesproeidroogde colistine (RODOS 1/3/5: waarden van de RODOS-metingen bij 1, 3 en 5 bar. 200/500/1000: hoeveelheid lucht gebruikt voor dispersie in µl. 1/3/5: vullingsgewicht Insufflator in mg)
Tobramycine < 5µm % van toegediende dosis
100,00 80,00 60,00
MICRO
40,00
SD
20,00 0,00 RODOS1 RODOS3 RODOS5 200-1
200-3
500-1
500-3
1000-1 1000-3
Figuur 4.7: Percentage van de toegediende dosis kleiner dan 5 µm bij gemicroniseerde en gesproeidroogde tobramycine (RODOS 1/3/5: waarden van de RODOS-metingen bij 1, 3 en 5 bar. 200/500/1000: hoeveelheid lucht gebruikt voor dispersie in µl. 1/3: vullingsgewicht Insufflator in mg) 31
% van toegediende dosis
Inuline < 5µm 100,00 80,00 60,00
MICRO
40,00
SD
20,00
SFD
0,00
Figuur 4.8: Percentage van de toegediende dosis kleiner dan 5 µm bij gemicroniseerde, gesproeidroogde en gesproeivriesdroogde inuline (RODOS 1/3/5: waarden van de RODOSmetingen bij 1, 3 en 5 bar. 200/500/1000: hoeveelheid lucht gebruikt voor dispersie in µl. 0.5/1/3/5: vullingsgewicht Insufflator in mg)
% van toegediende dosis
Mannitol < 5µm 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00
MICRO SD SFD
0,00
Figuur 4.9: Percentage van de toegediende dosis kleiner dan 5 µm bij gemicroniseerde, gesproeidroogde en gesproeivriesdroogde mannitol (RODOS 1/3/5: waarden van de RODOS-metingen bij 1, 3 en 5 bar. 200/500/1000: hoeveelheid lucht gebruikt voor dispersie in µl. 0.5/1/3: vullingsgewicht Insufflator in mg)
32
4.3 RETENTIE 4.3.1 Op basis van gewicht Allereerst wordt de retentie bepaald op basis van gewicht, dit wordt gedaan door de Insufflator te wegen voor en na de toediening van het poeder, met een maximum van 4 puffs per Insufflator. Voor colistine en tobramycine is dit de enige manier waarop de retentie bepaald wordt. De waarden in figuur 4.10 en 4.11 zijn de gemiddelde retenties in procent van het vulgewicht uit de 3 gebruikte Insufflators en na maximaal 4 puffs per toestel. De foutenbalken tonen de minimale en de maximale retentie.
% van vulgewicht
Colistine retentie 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 -10,00 -20,00
MICRO SD
200-1
200-3
200-5
500-1
500-3
500-5
1000-1 1000-3 1000-5
Figuur 4.10: Retentie gemicroniseerde en gesproeidroogde colistine (op basis van gewicht) (200/500/1000: hoeveelheid lucht gebruikt voor dispersie in µl. 1/3/5: vullingsgewicht Insufflator in mg) Bij het gemicroniseerde colistine past 5 mg in de monsterkamer van de Insufflator, waar dit bij het gesproeidroogde colistine en bij tobramycine niet lukt door het te grote volume, vandaar dat er hiervoor geen resultaten te vinden zijn. Voor mannitol en inuline wordt, waar mogelijk, de retentie van 1, 3 en 5 mg van gemicroniseerd en gesproeidroogd poeder bepaald op basis van gewicht. Door het grote volume van het gesproeivriesdroogde poeder wordt ook 0.5 mg onderzocht op basis van een chemische analyse. De resultaten voor mannitol en inuline worden getoond in Figuur 4.13 en Figuur 4.14.
33
% van vulgewicht
Tobramycine retentie 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 -10,00 -20,00 -30,00
MICRO SD
200-1
200-3
500-1
500-3
1000-1
1000-3
Figuur 4.11: Retentie gemicroniseerde en gesproeidroogde tobramycine (op basis van gewicht) (200/500/1000: hoeveelheid lucht gebruikt voor dispersie in µl. 1/3: vullingsgewicht Insufflator in mg) Als er verschillende puffs worden gegeven met 1 Insufflator, kunnen naast het beginen eindgewicht ook de tussenliggende gewichten bepaald worden. Dit wordt geïllustreerd in figuur 4.12 voor het gemicroniseerde tobramycine en is vergelijkbaar voor de andere materialen. Er worden maximaal 4 puffs per Insufflator toegediend.
Tobramycine micro 120,00
% van vulgewicht
100,00 200-1
80,00
200-3
60,00
500-1
40,00
500-3
20,00
1000-1
0,00 -20,00
1000-3 0
1
2
3
4
5
Puff
Figuur 4.12: Retentie per puff voor gemicroniseerde tobramycine (200/500/1000: hoeveelheid lucht gebruikt voor dispersie in µl. 1/3: vullingsgewicht Insufflator in mg) 34
4.3.2 Op basis van chemische analyse In bijlage worden de ijklijnen opgesteld voor de chemische analyse voor mannitol en inuline. Voor de gemicroniseerde, gesproeidroogde en gesproeivriesdroogde vormen van beide poeders is de beste ijklijn geselecteerd. Op basis van deze ijklijnen kunnen de concentraties berekend worden van de suikeroplossing. Deze oplossing bevat het resterende poeder uit de Insufflator opgelost in 5 ml gedemineraliseerd water, dus er kan berekend worden hoeveel poeder er exact achtergebleven is na toediening. Figuren 4.13 en 4.14 tonen de gemiddelde retenties van 3 metingen voor mannitol en inuline in hun verschillende vormen. De resultaten voor 0.5 mg worden bepaald via de chemische analyse, alsook de resultaten voor 1 mg bij gesproeivriesdroogde mannitol. De overige resultaten zijn voldoende nauwkeurig via gewichtsbepaling dus deze worden niet volgens de chemische analyse bepaald.
Mannitol retentie 110,00
% van vulgewicht
90,00 70,00 MICRO
50,00
SD
30,00
SFD
10,00 -10,00 -30,00 200-0.5 200-1
200-3 500-0.5 500-1
500-3 1000-0.5 1000-1 1000-3
Figuur 4.13: Retentie gemicroniseerde, gesproeidroogde en gesproeivriesdroogde mannitol (op basis van gewicht en chemische analyse) (200/500/1000: hoeveelheid lucht gebruikt voor dispersie in µl. 0.5/1/3: vullingsgewicht Insufflator in mg)
35
Inuline 120,00
% van vulgewicht
100,00 80,00 60,00
MICRO
40,00
SD
20,00
SFD
0,00 -20,00
Figuur 4.14: Retentie gemicroniseerde, gesproeidroogde en gesproeivriesdroogde inuline (op basis van gewicht en chemische analyse) (200/500/1000: hoeveelheid lucht gebruikt voor dispersie in µl. 0.5/1/3/5: vullingsgewicht Insufflator in mg) 4.4 SCANNING ELEKTRONEN MICROSCOPIE Van mannitol zijn er 4 soorten poeder ter beschikking: het uitgangsproduct, de gemicroniseerde vorm, de gesproeidroogde vorm en de gesproeivriesdroogde vorm. Deze worden allemaal bekeken met SEM om de verschillen in deeltjesgrootte, in textuur en in vorm te zien. Bij het uitgangsproduct zijn de deeltjes groot genoeg om te bekijken bij een vergroting van 250x (Figuur 4.15). De poeders die verkleind zijn door microniseren (Figuur 4.16), sproeidrogen (Figuur 4.17) of sproeivriesdrogen (Figuur 4.18) worden vergeleken bij een 5000x vergroting.
36
Figuur 4.15: SEM foto uitgangsproduct mannitol
Figuur 4.16: SEM foto gemicroniseerde
(vergroting 250x)
mannitol (vergroting 5000x)
Figuur 4.17: SEM foto gesproeidroogde mannitol
Figuur 4.18: SEM foto gesproeivriesdroogde
(vergroting 5000x)
mannitol (vergroting 5000x)
37
5 DISCUSSIE 5.1 RODOS METINGEN In figuur 4.1 is de deeltjesgrootteverdeling na RODOS-dispersie zichtbaar en dus de verdeling van primaire partikels na het verbreken van de agglomeraten in het poeder. De verdelingen van gesproeivriesdroogde poeders vertonen duidelijk grotere deeltjes. De resultaten voor 1, 3 en 5 bar zijn min of meer hetzelfde voor de meeste stoffen, wat wil zeggen dat een druk van 1 bar hoog genoeg is om de agglomeraten te verbreken. Enkel bij het gesproeivriesdroogde mannitol is een groot verschil te zien. Daarom is voor deze stoffen een grotere druk nodig voor de dispersie. 5.2 INSUFFLATOR METINGEN In figuur 4.2-4.5 wordt de dispersie van de poeders uit de Insufflator voor de gemicroniseerde, gesproeidroogde en gesproeivriesdroogde vormen vergeleken met de RODOS dispersie. De opgegeven waarden zijn de X50-waarden, dit is de mediane deeltjesgrootte van het poeder op basis van de volumeverdeling verkregen via dispergeren met de Insufflator. Omdat het een gemiddelde waarde betreft van 4 tot 12 metingen, worden de standaarddeviaties op de resultaten aangeduid door foutenbalken toe te voegen. Algemeen kan bij alle poeders duidelijk worden gezien dat bij het gebruik van 200 µl lucht de mediane diameter groter is dan bij 500 µl of 1000 µl lucht. Bij een grotere hoeveelheid lucht sluit de verdeling meer aan bij de RODOS-metingen, wat aantoont dat er meer primaire deeltjes aanwezig zijn. Er zit ook meer spreiding op de resultaten bij 200 µl, waardoor aerosolen met verschillende deeltjesgroottes worden ingeademd. Dit betekent dat de fractie geneesmiddel die daadwerkelijk de plaats van werking bereikt, moeilijk te voorspellen is. Ook tonen de grafieken dat de deeltjesgrootteverdeling van het gesproeidroogde poeder vaak kleiner is dan de gemicroniseerde of de gesproeivriesdroogde vorm van hetzelfde poeder en dus meer de primaire deeltjesgrootte benadert. Vooral bij het gebruik van 200 µl is een opmerkelijk verschil zichtbaar. Dit zou kunnen betekenen dat het gesproeidroogde poeder gemakkelijker te dispergeren is, vooral met een lager volume aan lucht. Waarschijnlijk is dit omdat er minder onderlinge krachten tussen de gesproeidroogde 38
deeltjes werkzaam zijn. Figuur 4.15 tot 4.18 tonen de verschillen tussen het gemicroniseerde, gesproeidroogde en gesproeivriesdroogde mannitol en hierop is te zien dat door de sferische vorm van de gesproeidroogde partikels, ze een kleiner contactoppervlak hebben met omliggende deeltjes en er dus waarschijnlijk minder kracht nodig is om deze partikels van elkaar te scheiden. Gemicroniseerde en gesproeivriesdroogde deeltjes hebben een groter contactoppervlak waardoor het moeilijker is deze onderlinge krachten te verbreken met slechts een klein volume aan lucht. Hoe groter het volume wordt, hoe kleiner het verschil wordt tussen de verschillende soorten poeders. Bij het kijken naar het effect van de vullingsgraad is er een algemene trend voor alle stoffen, met uitzondering van colistine, dat hoe hoger het dosisgewicht gebruikt, hoe groter de deeltjes zijn die de Insufflator verlaten. Er is namelijk een groter volume nodig om de agglomeraten te kunnen verbreken in een grotere hoeveelheid poeder. De uitzonderingen hierop tonen echter aan dat het effect variabel kan zijn en moeilijk te voorspellen. In figuren 4.6-4.9 is de fractie aan deeltjes kleiner dan 5 µm in procenten van de afgegeven dosis te zien. Dezelfde conclusies kunnen genomen worden als voor de mediane diameters. Bij het gebruik van 200 µl is het percentage aanzienlijk kleiner dan bij 500 µl of 1000 µl, vooral bij gesproeivriesdroogd poeder. Dezelfde verklaring als bij de mediane diameters kan gegeven worden voor deze resultaten. 5.3 RETENTIE Bij de retentie zijn er vergelijkbare zaken op te merken. Wanneer slechts 200 µl gebruikt wordt, zijn ook in het geval van retentie de resultaten minder veelbelovend dan met 500 µl of 1000 µl. De retentie, het percentage van het poeder dat achterblijft in de Insufflator na de verschillende puffs, is veel hoger en vaak hoger dan 50 %. Indien een verschillende vullingsgraad toegepast wordt, zijn er minder duidelijke conclusies te trekken. Deze resultaten zijn meer variabel, soms is de retentie kleiner bij het gebruik van 1 mg dan bij 3 mg of 5 mg en vice versa. Hierdoor kan het effect bij in vivo gebruik van de Insufflator bij muizen variëren naargelang de graad van retentie, die moeilijk op voorhand te voorspellen is. De foutenbalken die de minimum en maximum retentie aanduiden vertonen geen algemene trend, maar zijn willekeurig bij de verschillende 39
poeders, verschillende luchtvolumes en verschillende vullingsgraden. Hieruit kan enkel besloten worden dat de retentie zeer moeilijk te voorspellen is. Meestal moeten ook meerdere puffs met de Insufflator gegeven worden om de dosis toe te dienen, waarbij het grootste deel van de dosis bij de eerste puff gedispergeerd wordt. Dit is te zien in figuur 4.12. Dit zijn voorbeelden hoe de Insufflator werkt met deze vier poeders. Het is echter mogelijk dat bij gebruik van andere geneesmiddelen of complexe verbindingen, de dispersie anders zal zijn dan met deze geteste poeders. Het is wel reeds opmerkelijk dat bij alle 10 poeders globaal dezelfde conclusies genomen kunnen worden, ondanks het feit dat deze al zeer verschillend zijn. Er kan meer onderzoek gedaan worden naar andere materialen en hoe deze zich gedragen in de Insufflator, maar het is waarschijnlijk dat de resultaten vergelijkbaar zullen zijn.
40
6 CONCLUSIES De Penn-Century Dry Powder Insufflator™ - Model DP-4M for Mouse (Penn-Century. Inc. Wyndmoor, PA) werd geëvalueerd op basis van deeltjesgrootteverdeling in de afgegeven aerosol en op retentie van verschillende soorten poeders met verschillende fysicochemische eigenschappen. RODOS-metingen werden uitgevoerd om de primaire deeltjesgrootteverdeling van elk poeder in beeld te brengen en de resultaten van de Insufflator werden hiermee vergeleken.
Colistine, tobramycine, mannitol en inuline werden gemicroniseerd en gesproeidroogd en mannitol en inuline werden in aanvulling daarop ook gesproeivriesdroogd. Verschillende hoeveelheden, meerbepaald 0.5 mg, 1 mg, 3 mg en 5 mg, van deze poeders werden toegediend via de Insufflator met telkens een verschillend volume aan lucht. De gebruikte volumes zijn 200 µl, 500 µl en 1000 µl. Deze factoren beïnvloeden de deeltjesgrootteverdeling na dispersie en ook de retentie in de Insufflator. De deeltjesgroottedistributie werd bepaald via laserdiffractie, de retentie werd bepaald op basis van gewicht en voor de kleine dosissen ook op basis van chemische analyses.
Uit alle resultaten blijkt dat 200 µl te weinig is om de poeders voldoende te dispergeren: de deeltjes zijn te groot, de grootteverdeling is te breed en bovendien is de retentie zeer hoog. Bij de grotere volumes sluiten de resultaten dichter aan bij de RODOS-metingen en is de retentie een stuk lager. De muis kan echter geen grotere volumes lucht verdragen door het kleine longvolume, daarom kan geconcludeerd worden dat de DP-4M Insufflator geen goed apparaat om te gebruiken bij muizen. Grotere volumes kunnen wel toegepast worden bij ratten of cavia’s, bij deze dieren kunnen zelfs volumes van 5 ml gebruikt worden, waardoor de dispersie waarschijnlijk beter is.
In elk geval is het noodzakelijk om de deeltjesgrootteverdeling en de retentie van de Insufflator telkens te bepalen bij in vivo onderzoek in muizen voor er sluitende conclusies kunnen genomen worden in verband met de werking of toxiciteit van een bepaald geneesmiddel.
41
7 LITERATUUR [1]
a Guillon, J. Montharu, L. Vecellio, V. Schubnel, G. Roseau, J. Guillemain, P. Diot, and M. de Monte, “Pulmonary delivery of dry powders to rats: tolerability limits of an intra-tracheal administration model.,” International journal of pharmaceutics, vol. 434, no. 1–2, pp. 481–7, Sep. 2012.
[2]
P. J. Kuehl, T. L. Anderson, G. Candelaria, B. Gershman, K. Harlin, J. Y. Hesterman, T. Holmes, J. Hoppin, C. Lackas, J. P. Norenberg, H. Yu, and J. D. McDonald, “Regional particle size dependent deposition of inhaled aerosols in rats and mice,” Inhalation Toxicology, vol. 24, no. 1, pp. 27–35, 2012.
[3]
V. Saluja, J.-P. Amorij, J. C. Kapteyn, a H. de Boer, H. W. Frijlink, and W. L. J. Hinrichs, “A comparison between spray drying and spray freeze drying to produce an influenza subunit vaccine powder for inhalation.,” Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, vol. 144, no. 2, pp. 127–33, Jun. 2010.
[4]
M. Morello, C. L. Krone, S. Dickerson, E. Howerth, W. Andreas, Y. Wong, D. Edwards, B. R. Bloom, and M. K. Hondalus, “Dry-powder pulmonary insufflation in the mouse for application to vaccine or drug studies,” Tuberculosis, vol. 89, no. 5, pp. 371–377, 2009.
[5]
J.-P. Amorij, V. Saluja, a H. Petersen, W. L. J. Hinrichs, a Huckriede, and H. W. Frijlink, “Pulmonary delivery of an inulin-stabilized influenza subunit vaccine prepared by spray-freeze drying induces systemic, mucosal humoral as well as cell-mediated immune responses in BALB/c mice.,” Vaccine, vol. 25, no. 52, pp. 8707–17, Dec. 2007.
[6]
R. J. Lorenz, “Weibel, E.R.: Morphometry of the Human Lung. Springer Verlag, BerlinGöttingen-Heidelberg 1963; 151 S., 109 Abb., DM 36,-,” Biometrische Zeitschrift, vol. 8, no. 1– 2, pp. 143–144, 1966.
[7]
O. S. Usmani, M. F. Biddiscombe, and P. J. Barnes, “Regional lung deposition and bronchodilator response as a function of beta2-agonist particle size.,” American journal of respiratory and critical care medicine, vol. 172, no. 12, pp. 1497–504, Dec. 2005.
[8]
A. Voss and W. H. Finlay, “Deagglomeration of dry powder pharmaceutical aerosols,” vol. 248, pp. 39–50, 2002.
[9]
a H. de Boer, “Introduction to pulmonary drug delivery,” in Optimisation of Dry Powder Inhalation, 2005, pp. 9–66.
[10]
Penn-Century Inc., “DRY POWDER INSUFFLATORTM - MODEL DP-4 AND MODEL-DP-4M Instructions for Use,” pp. 1–11, 2012.
[11]
C. I. Grainger, R. Alcock, T. G. Gard, a. V. Quirk, G. van Amerongen, R. L. de Swart, and J. G. Hardy, “Administration of an insulin powder to the lungs of cynomolgus monkeys using a Penn Century insufflator,” International Journal of Pharmaceutics, vol. 269, no. 2, pp. 523– 527, Jan. 2004.
42
[12]
S. Suarez, P. O’Hara, M. Kazantseva, C. E. Newcomer, R. Hopfer, D. N. McMurray, and a J. Hickey, “Airways delivery of rifampicin microparticles for the treatment of tuberculosis.,” The Journal of antimicrobial chemotherapy, vol. 48, no. 3, pp. 431–4, Sep. 2001.
[13]
M. Yokohira, T. Kuno, K. Yamakawa, N. Hashimoto, F. Ninomiya, S. Suzuki, K. Saoo, and K. Imaida, “An intratracheal instillation bioassay system for detection of lung toxicity due to fine particles in f344 rats.,” Journal of toxicologic pathology, vol. 22, no. 1, pp. 1–10, Mar. 2009.
[14]
S. a L. Audouy, G. van der Schaaf, W. L. J. Hinrichs, H. W. Frijlink, J. Wilschut, and A. Huckriede, “Development of a dried influenza whole inactivated virus vaccine for pulmonary immunization.,” Vaccine, vol. 29, no. 26, pp. 4345–52, Jun. 2011.
[15]
N. a Beinborn, J. Du, N. P. Wiederhold, H. D. C. Smyth, and R. O. Williams, “Dry powder insufflation of crystalline and amorphous voriconazole formulations produced by thin film freezing to mice.,” European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft für Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V, vol. 81, no. 3, pp. 600–8, Aug. 2012.
[16]
N. El-Gendy, K. L. Aillon, and C. Berkland, “Dry powdered aerosols of diatrizoic acid nanoparticle agglomerates as a lung contrast agent.,” International journal of pharmaceutics, vol. 391, no. 1–2, pp. 305–12, May 2010.
[17]
L. a Mitchell, M. M. Channell, C. M. Royer, S. W. Ryter, A. M. K. Choi, and J. D. McDonald, “Evaluation of inhaled carbon monoxide as an anti-inflammatory therapy in a nonhuman primate model of lung inflammation.,” American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology, vol. 299, no. 6, pp. L891–7, Dec. 2010.
[18]
S. Azarmi, R. Lobenberg, W. H. Roa, S. Tai, and W. H. Finlay, “Formulation and in vivo evaluation of effervescent inhalable carrier particles for pulmonary delivery of nanoparticles.,” Drug development and industrial pharmacy, vol. 34, no. 9, pp. 943–7, Sep. 2008.
[19]
J. C. Sung, D. J. Padilla, L. Garcia-Contreras, J. L. Verberkmoes, D. Durbin, C. a Peloquin, K. J. Elbert, A. J. Hickey, and D. a Edwards, “Formulation and pharmacokinetics of self-assembled rifampicin nanoparticle systems for pulmonary delivery.,” Pharmaceutical research, vol. 26, no. 8, pp. 1847–55, Aug. 2009.
[20]
V. Codrons, F. Vanderbist, B. Ucakar, V. Préat, and R. Vanbever, “Impact of formulation and methods of pulmonary delivery on absorption of parathyroid hormone (1-34) from rat lungs.,” Journal of pharmaceutical sciences, vol. 93, no. 5, pp. 1241–52, May 2004.
[21]
C. Duret, N. Wauthoz, R. Merlos, J. Goole, C. Maris, I. Roland, T. Sebti, F. Vanderbist, and K. Amighi, “In vitro and in vivo evaluation of a dry powder endotracheal insufflator device for use in dose-dependent preclinical studies in mice.,” European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft für Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V, vol. 81, no. 3, pp. 627–34, Aug. 2012.
[22]
M. Sakagami, “In vivo, in vitro and ex vivo models to assess pulmonary absorption and disposition of inhaled therapeutics for systemic delivery.,” Advanced drug delivery reviews, vol. 58, no. 9–10, pp. 1030–60, Oct. 2006. 43
[23]
W. H. Roa, S. Azarmi, M. H. D. K. Al-Hallak, W. H. Finlay, A. M. Magliocco, and R. Löbenberg, “Inhalable nanoparticles, a non-invasive approach to treat lung cancer in a mouse model.,” Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, vol. 150, no. 1, pp. 49–55, Feb. 2011.
[24]
C. Duret, R. Merlos, N. Wauthoz, T. Sebti, F. Vanderbist, and K. Amighi, “Pharmacokinetic evaluation in mice of amorphous itraconazole-based dry powder formulations for inhalation with high bioavailability and extended lung retention.,” European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V, no. March, Mar. 2013.
[25]
C. Bosquillon, V. Préat, and R. Vanbever, “Pulmonary delivery of growth hormone using dry powders and visualization of its local fate in rats.,” Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, vol. 96, no. 2, pp. 233–44, Apr. 2004.
[26]
S. Adi, H. Adi, H.-K. Chan, W. H. Finlay, Z. Tong, R. Yang, and A. Yu, “Agglomerate strength and dispersion of pharmaceutical powders,” Journal of Aerosol Science, vol. 42, no. 4, pp. 285– 294, Apr. 2011.
[27]
a H. de Boer, D. Gjaltema, P. Hagedoorn, and H. W. Frijlink, “Characterization of inhalation aerosols: a critical evaluation of cascade impactor analysis and laser diffraction technique,” International journal of pharmaceutics, vol. 249, no. 1–2, pp. 219–231.
[28]
A. Schuster, C. Haliburn, G. Döring, and M. H. Goldman, “Safety, efficacy and convenience of colistimethate sodium dry powder for inhalation (Colobreathe DPI) in patients with cystic fibrosis: a randomised study.,” Thorax, vol. 68, no. 4, pp. 344–50, Apr. 2013.
[29]
P. J. Bergen, J. Li, C. R. Rayner, and R. L. Nation, “Colistin methanesulfonate is an inactive prodrug of colistin against Pseudomonas aeruginosa.,” Antimicrobial agents and chemotherapy, vol. 50, no. 6, pp. 1953–8, Jun. 2006.
[30]
M. W. Konstan, D. E. Geller, P. Minić, F. Brockhaus, J. Zhang, and G. Angyalosi, “Tobramycin inhalation powder for P. aeruginosa infection in cystic fibrosis: The EVOLVE trial.,” Pediatric pulmonology, vol. 238, no. July 2010, pp. 230–238, Oct. 2010.
[31]
C. Duret, N. Wauthoz, T. Sebti, F. Vanderbist, and K. Amighi, “New inhalation-optimized itraconazole nanoparticle-based dry powders for the treatment of invasive pulmonary aspergillosis.,” International journal of nanomedicine, vol. 7, pp. 5475–89, Jan. 2012.
[32]
W. L. J. Hinrichs, M. G. Prinsen, and H. W. Frijlink, “Inulin glasses for the stabilization of therapeutic proteins,” International Journal of Pharmaceutics, vol. 215, no. 1–2, pp. 163–174.
[33]
J. de Jonge, J.-P. Amorij, W. L. J. Hinrichs, J. Wilschut, A. Huckriede, and H. W. Frijlink, “Inulin sugar glasses preserve the structural integrity and biological activity of influenza virosomes during freeze-drying and storage,” European journal of pharmaceutical sciences, vol. 32, no. 1, pp. 33–44.
[34]
J.-P. Amorij, J. Meulenaar, W. L. J. Hinrichs, T. Stegmann, a Huckriede, F. Coenen, and H. W. Frijlink, “Rational design of an influenza subunit vaccine powder with sugar glass technology: 44
Preventing conformational changes of haemagglutinin during freezing and freeze-drying,” Vaccine, vol. 25, no. 35, pp. 6447–6457. [35]
Alpine®, “50 AS Spiral Jet Mill.”
[36]
Büchi Labortechnik, “Mini Spray Dryer B-290.” .
[37]
S. Jaffari, B. Forbes, E. Collins, D. J. Barlow, G. P. Martin, and D. Murnane, “Rapid characterisation of the inherent dispersibility of respirable powders using dry dispersion laser diffraction.,” International journal of pharmaceutics, vol. 447, no. 1–2, pp. 124–31, Apr. 2013.
[38]
N. Y. K. Chew and H.-K. Chan, “The role of particle properties in pharmaceutical powder inhalation formulations.,” Journal of aerosol medicine : the official journal of the International Society for Aerosols in Medicine, vol. 15, no. 3, pp. 325–30, Jan. 2002.
[39]
J. Sánchez, “Colorimetric Assay of Alditols in Complex Biological Samples.,” Journal of agricultural and food chemistry, vol. 46, no. 1, pp. 157–160, Jan. 1998.
[40]
H. J. . Eriksson, W. . Verweij, K. Poelstra, W. L. . Hinrichs, G. . de Jong, G. . Somsen, and H. . Frijlink, “Investigations into the stabilisation of drugs by sugar glasses: II,” International Journal of Pharmaceutics, vol. 257, no. 1–2, pp. 273–281, May 2003.
Internet pagina’s:
http://www.admit-online.info/nl/behandling/behandeling/inhaleren/ (Februari 2013) http://penncentury.com/products/dry-powder-devices/dry-powder-insufflator-dp4m/model-dp-4m/ (Februari 2013) http://www.lochtec.dk/produkter/lab/lab.html (Maart 2013) http://www.pharmainfo.net/reviews/spray-drying-review (Maart 2013) http://www.malvern.de/ProcessEng/processes/spraydrying/overview.htm (Maart 2013) http://www.authorstream.com/Presentation/robin_vinnu-623370-spray-freezedrying-technique/ (April 2013) http://www.powderpro.se/spray-freezing-and-freeze-drying/ (April 2013) http://www.sympatec.com/EN/LaserDiffraction/HELOS.html (Februari 2013) http://www.malvern.com/labeng/technology/laser_diffraction/laser_diffraction.htm (Februari 2013) http://www.sympatec.com/EN/LaserDiffraction/RODOS.html (Februari 2013)
45
8 BIJLAGEN 8.1 RODOS-METINGEN Colistine Tabel 8.1: Deeltjesgrootteverdeling RODOS gemicroniseerde colistine X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
1bar
1.43 ± 0.08
3.51 ± 0.08
7.24 ± 0.06
72,80%
3bar
1.45 ± 0.01
3.52 ± 0.01
7.16 ± 0.04
73,10%
5bar
1.47 ± 0.06
3.51 ± 0.07
7.02 ± 0.08
73,72%
Tabel 8.2: Deeltjesgrootteverdeling RODOS gesproeidroogde colistine X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
1bar
0.79 ± 0.00
2.30 ± 0.02
6.32 ± 0.07
83.39%
3bar
0.78 ± 0.01
2.18 ± 0.04
5.33 ± 0.04
88.31%
5bar
0.79 ± 0.01
2.13 ± 0.02
4.83 ± 0.01
91.27%
Tobramycine Tabel 8.3: Deeltjesgrootteverdeling RODOS gemicroniseerde tobramycine X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
1bar
0.64 ± 0.01
1.32 ± 0.04
3.27 ± 0.29
95.65%
3bar
0.62 ± 0.00
1.16 ± 0.03
2.42 ± 0.10
99.82%
5bar
0.62 ± 0.00
1.17 ± 0.01
2.43 ± 0.00
99.91%
Tabel 8.4: Deeltjesgrootteverdeling RODOS gesproeidroogde tobramycine X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
1bar
1.04 ± 0.04
3.07 ± 0.05
7.20 ± 0.06
76,43%
3bar
0.97 ± 0.06
2.97 ± 0.08
7.04 ± 0.08
77,30%
5bar
0.91 ± 0.00
2.82 ± 0.09
6.60 ± 0.33
79.62%
46
Mannitol Tabel 8.5: Deeltjesgrootteverdeling RODOS gemicroniseerde mannitol X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
1bar
0.63 ± 0.00
1.22 ± 0.00
4.25 ± 0.94
90.76%
3bar
0.61 ± 0.00
1.09 ± 0.01
2.21 ± 0.10
98.83%
5bar
0.60 ± 0.00
1.07 ± 0.00
2.10 ± 0.00 100.00%
Tabel 8.6: Deeltjesgrootteverdeling RODOS gesproeidroogde mannitol X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
1bar
0.71 ± 0.04
1.74 ± 0.17
3.95 ± 0.18
95.96%
3bar
0.71 ± 0.02
1.73 ± 0.06
3.91 ± 0.01
96.35%
5bar
0.69 ± 0.02
1.65 ± 0.13
3.89 ± 0.08
96.03%
Tabel 8.7: Deeltjesgrootteverdeling RODOS gesproeivriesdroogde mannitol X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
1bar
1.09 ± 0.01
4.81 ± 0.03
26.52 ± 2.72
51.78%
3bar
0.84 ± 0.03
2.80 ± 0.18
8.39 ± 0.46
74.46%
5bar
0.79 ± 0.00
2.42 ± 0.03
6.92 ± 0.01
80.85%
Inuline Tabel 8.8: Deeltjesgrootteverdeling RODOS gemicroniseerde inuline X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
1bar
0.67 ± 0.00
1.50 ± 0.01
3.27 ± 0.04
98.83%
3bar
0.65 ± 0.00
1.39 ± 0.02
3.00 ± 0.05
99.50%
5bar
0.66 ± 0.00
1.41 ± 0.01
3.05 ± 0.03
99.39%
47
Tabel 8.9: Deeltjesgrootteverdeling RODOS gesproeidroogde inuline X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
1bar
0.85 ± 0.01
2.41 ± 0.01
5.42 ± 0.10
87.49%
3bar
0.83 ± 0.00
2.35 ± 0.01
5.39 ± 0.10
87.71%
5bar
0.83 ± 0.00
2.36 ± 0.02
5.40 ± 0.05
87.65%
Tabel 8.10: Deeltjesgrootteverdeling RODOS gesproeivriesdroogde inuline X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
1bar
5.00 ± 0.04
10.70 ± 0.03
21.43 ± 0.05
10.01%
3bar
4.08 ± 0.13
9.55 ± 0.04
19.35 ± 0.03
15.43%
5bar
3.73 ± 0.26
9.10 ± 0.06
18.05 ± 0.05
17.55%
8.2 INSUFFLATOR METINGEN Colistine Tabel 8.11: Deeltjesgrootteverdeling Insufflator gemicroniseerde colistine
200µl-1mg 200µl-3mg 200µl-5mg 500µl-1mg 500µl-3mg 500µl-5mg 1000µl-1mg 1000µl-3mg 1000µl-5mg
X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
2.52 ± 1.14 2.20 ± 0.58 2.20 ± 0.64 1.61 ± 0.13 1.65 ± 0.24 1.66 ± 0.16 1.65 ± 0.20 1.70 ± 0.21 1.67 ± 0.15
9.38 ± 11.95 7.18 ± 5.37 7.00 ± 6.92 3.77 ± 0.17 3.94 ± 0.20 4.14 ± 0.21 3.72 ± 0.25 3.99 ± 0.24 3.74 ± 0.37
20.55 ± 25.43 24.61 ± 19.93 20.06 ± 19.11 7.40 ± 0.27 7.98 ± 0.78 9.61 ± 2.61 7.19 ± 0.50 8.34 ± 1.13 11.25 ± 14.55
47.63 % 45.52 % 52.47 % 69.54 % 66.49 % 62.71 % 71.13 % 65.37 % 71.18 %
48
Tabel 8.12: Deeltjesgrootteverdeling Insufflator gesproeidroogde colistine
200µl-1mg 200µl-3mg 500µl-1mg 500µl-3mg 1000µl-1mg 1000µl-3mg
X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
1.65 ± 1.12 1.59 ± 0.89 0.93 ± 0.09 0.85 ± 0.08 0.92 ± 0.12 0.90 ± 0.06
7.49 ± 4.97 10.35 ± 9.77 3.43 ± 0.57 3.07 ± 1.31 2.83 ± 0.42 3.01 ± 0.51
23.80 ± 14.73 35.67 ± 30.53 16.19 ± 19.29 12.09 ± 12.15 7.52 ± 2.31 11.51 ± 9.46
43.21 % 43.54 % 66.01 % 72.89 % 77.75 % 73.35 %
Tobramycine Tabel 8.13: Deeltjesgrootteverdeling Insufflator gemicroniseerde tobramycine
200µl-1mg 200µl-3mg 500µl-1mg 500µl-3mg 1000µl-1mg 1000µl-3mg
X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
5.02 ± 2.63 5.37 ± 3.58 0.76 ± 0.10 1.32 ± 1.05 0.76 ± 0.13 0.81 ± 0.13
16.43 ± 7.19 19.75 ± 6.92 2.70 ± 1.37 8.45 ± 10.47 3.18 ± 2.10 3.25 ± 2.50
36.29 ± 12.84 48.52 ± 15.72 10.20 ± 6.57 22.63 ± 21.40 15.26± 10.80 16.78 ± 17.88
14.36 % 12.87 % 75.74 % 56.40 % 71.24 % 74.76 %
Tabel 8.14: Deeltjesgrootteverdeling Insufflator gesproeidroogde tobramycine
200µl-1mg 200µl-3mg 500µl-1mg 500µl-3mg 1000µl-1mg 1000µl-3mg
X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
1.42 ± 0.27 1.91 ± 1.17 0.92 ± 0.13 1.18 ± 0.12 1.41 ± 0.51 1.09 ± 0.13
4.40 ± 1.10 10.21 ± 13.18 2.88 ± 0.41 3.74 ± 0.72 4.16 ± 0.88 3.46 ± 0.68
19.01 ± 13.42 40.34± 25.86 8.23 ± 2.45 15.68 ± 10.34 12.94 ± 5.76 16.05 ± 15.56
59.23 % 48.35 % 76.32 % 66.39 % 60.82 % 69.93 %
49
Mannitol Tabel 8.15: Deeltjesgrootteverdeling Insufflator gemicroniseerde mannitol X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
200µl-1mg
3.11 ± 1.51
15.44 ± 6.37
36.42 ± 11.62
16.06 %
200µl-3mg 500µl-1mg 500µl-3mg 1000µl-1mg 1000µl-3mg
6.18 ± 4.37 0.81 ± 0.21 1.96 ± 2.43 0.69 ± 0.09 0.84 ± 0.33
25.01 ± 9.42 3.40 ± 2.31 10.48 ± 12.96 2.18 ± 1.69 4.66 ± 5.29
57.05 ± 12.57 13.13 ± 6.47 27.36 ± 26.67 9.98 ± 7.32 18.73 ± 14.95
12.73 % 67.24 % 49.60 % 80.31 % 66.09 %
Tabel 8.16: Deeltjesgrootteverdeling Insufflator gesproeidroogde mannitol X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
200µl-1mg
1.00 ± 0.17
3.03 ± 0.76
22.26 ± 32.41
75.76 %
200µl-3mg 500µl-1mg 500µl-3mg 1000µl-1mg 1000µl-3mg
1.20 ± 0.50 0.74 ± 0.04 0.71 ± 0.05 0.76 ± 0.07 0.73 ± 0.04
6.86 ± 7.27 1.92 ± 0.19 1.83 ± 0.41 1.96 ± 0.22 1.97 ± 0.35
25.55 ± 27.60 4.69 ± 0.80 6.40 ± 6.84 4.80 ± 0.99 7.74 ± 6.81
64.39 % 92.30 % 90.67 % 92.34 % 87.89 %
Tabel 8.17: Deeltjesgrootteverdeling Insufflator gesproeivriesdroogde mannitol X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
200µl-0.5mg
4.32 ± 1.16
12.82 ± 3.03
36.24 ± 8.97
13.48 %
200µl-1mg 500µl-0.5mg 500µl-1mg 1000µl-0.5mg 1000µl-1mg
5.24 ± 2.45 2.04 ± 0.33 1.49 ± 0.24 1.18 ± 0.27 0.89 ± 0.10
28.05 ± 14.67 6.87 ± 1.25 9.09 ± 5.21 4.40 ± 1.73 3.50 ± 0.94
65.87 ± 13.91 17.60 ± 4.77 47.97 ± 7.67 11.26 ± 5.93 33.12 ± 10.15
11.94 % 34.76 % 36.30 % 60.64 % 62.73 %
50
Inuline Tabel 8.18: Deeltjesgrootteverdeling Insufflator gemicroniseerde inuline X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
200µl-0.5mg
1.95 ± 0.87
14.51 ± 13.89
35.49 ± 27.16
40.63 %
200µl-1mg
1.12 ± 0.20
3.72 ± 1.20
10.36 ± 3.82
67.07 %
200µl-3mg 500µl-0.5mg 500µl-1mg 500µl-3mg 1000µl-0.5mg 1000µl-1mg 1000µl-3mg
2.57 ± 1.72 0.78 ± 0.04 0.89 ± 0.19 0.74 ± 0.07 0.75 ± 0.06 0.69 ± 0.03 0.71 ± 0.05
11.95 ± 7.85 2.15 ± 0.18 3.83 ± 2.82 2.02 ± 0.60 1.98 ± 0.35 1.62 ± 0.21 1.89 ± 0.48
32.40 ± 18.71 6.21 ± 0.95 23.46 ± 31.06 6.63 ± 4.77 5.19 ± 1.24 15.69 ± 38.69 17.86 ± 20.42
32.18 % 86.31 % 73.46 % 87.72 % 88.93 % 93.03 % 84.32 %
Tabel 8.19: Deeltjesgrootteverdeling Insufflator gesproeidroogde inuline
200µl – 0.5mg 200µl-1mg 200µl-3mg 200µl-5mg 500µl-0.5mg 500µl-1mg 500µl-3mg 500µl-5mg 1000µl-0.5mg 1000µl-1mg 1000µl-3mg 1000µl-5mg
X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
1.53 ± 0.31 1.45 ± 0.29 1.44 ± 0.38 1.89 ± 0.58 1.02 ± 0.09 0.92± 0.05 1.03 ± 0.10 0.94 ± 0.15 1.01 ± 0.15 1.00 ± 0.09 1.07± 0.19 0.89 ± 0.05
5.41 ± 2.96 4.09 ± 1.06 6.10 ± 3.66 11.36 ± 10.69 2.86 ± 0.23 2.71 ± 0.32 3.23 ± 0.69 3.08 ± 1.21 2.70 ± 0.18 2.88 ± 0.27 3.25 ± 0.94 2.62 ± 0.33
28.14 ± 16.29 15.31 ± 10.94 26.22 ± 19.58 43.92 ± 24.75 6.23 ± 0.58 9.54 ± 12.78 18.70 ± 20.87 13.89 ± 16.07 5.62 ± 0.24 6.29 ± 0.58 15.05 ± 18.16 9.53 ± 10.45
55.89% 63.91% 55.75% 40.66% 81.58% 82.30% 73.40% 77.25% 85.56% 80.84% 75.09% 83.20%
Tabel 8.20: Deeltjesgrootteverdeling Insufflator gesproeivriesdroogde inuline
200µl – 0.5mg 500µl-0.5mg 1000µl-0.5mg
X10 (µm)
X50 (µm)
X90 (µm)
<5µm
5.73 ± 0.36 4.78 ± 0.27 4.20 ± 0.52
18.35 ± 3.19 11.11 ± 0.64 10.49 ± 1.3
61.24 ± 14.30 26.22 ± 6.43 25.43 ± 7.04
7.40% 11.16% 15.02% 51
8.3 RETENTIE Tabel 8.21: Retentie in procent van vullingsgewicht %
200µl/0.5mg
COLI COLI MICRO SD
TOBRA TOBRA MAN MAN MICRO SD MICRO SD
MAN SFD
INU INU MICRO SD
INU SFD
/
/
/
/
75.17
59.26
90.32
23.91
35.95
26.72
200µl/1mg
54.91
60.25
66.29
39.81
90.37
58.49 103.39
91.88
73.15
/
200µl/3mg
24.65
27.45
53.08
53.94
75.18
42.02
/
65.49
62.05
/
200µl/5mg
43.92
/
/
/
/
/
/
/
66.23
/
/
/
/
/
31.12
27.91
57.27
31.03
24.50
8.14
500µl/1mg
42.12
11.06
7.29
31.65
61.82
19.10
63.80
36.12
51.19
/
500µl/3mg
31.24
15.61
33.18
19.07
22.29
16.13
/
38.67
22.75
/
500µl/5mg
10.88
/
/
/
/
/
/
/
45.41
/
1ml/0.5mg
/
/
/
/
25.75
18.90
16.95
16.55
5.77
19.90
1ml/1mg
11.82
33.41
-13.35
2.60
39.43
16.73
53.96
45.27
42.46
/
1ml/3mg
13.70
8.31
20.68
4.02
25.41
16.31
/
18.99
16.62
/
1ml/5mg
19.59
/
/
/
/
/
/
/
35.15
/
500µl/0.5mg
52
8.4 OPSTELLEN IJKLIJNEN MANNITOL Eerst worden de reagentia voorbereid. Om de gewenste concentraties te verkrijgen, worden volgende stoffen nauwkeurig afgewogen en opgelost in een bepaalde hoeveelheid water.
Formaat : 1124.18 mg / (50 ml * 45.017 mg/mmol) = 0.4994 M
Deze oplossing wordt via een pH-meter op pH 3 gebracht door toevoegen van 1M NaOH aan de mierenzuur-oplossing.
Reagent 1: Natrium perjodaat: 53.42 mg / (50 ml * 213.892 mg/mmol) = 0.0050 M Reagent 2: Acetylaceton: 602.93 mg / (60 ml * 100.12 mg/mmol) = 0.1004 M Ammoniumacetaat: 9263.02 mg / (60 ml * 77.08 mg/mmol) = 2.0029 M Natriumthiosulfaat: 190.98 mg / (60 ml * 158.18 mg/mmol) = 0.0201 M
Daarna wordt het protocol gevolgd. Tijdens het koken van het Eppendorfcupje wordt duidelijk een gele kleur gevormd waarvan de absorbantie kan gemeten worden via de UVspectrofotometer. Voor de gemicroniseerde, gesproeidroogde en gesproeivriesdroogde vorm van mannitol wordt een ijklijn in duplo gemaakt. De hoeveelheid afgewogen gesproeidroogde mannitol voor de stockoplossing is 18.24 mg, waaruit volgt dat de concentratie gelijk is aan: 18.24 mg / (182.172 mg/mmol * 50 ml) = 0.002 mmol/ml = 2002,50 nmol/ml Hiermee wordt de verdunningsreeks gemaakt volgens tabel 3.1 en de absorbantie tweemaal gemeten.
53
Tabel 8.22: Verdunningsreeks met absorbanties voor ijklijn gesproeidroogde mannitol concentratie (nmol/ml) 1503,52
absorbantie bij 412 nm ijklijn 1 1,353
Absorbantie bij 412 nm Ijklijn 2 1,379
1202,82
1,064
1,173
1002,35
0,955
0,945
801,88
0,779
0,77
601,41
0,597
0,538
400,94
0,377
0,398
200,47
0,202
0,205
150,35
0,166
0,152
120,28
0,128
0,113
100,23
0,076
0,099
80,19
0,105
0,072
50,12
0,123
0,042
Ijklijn 1 : R2 = 0.9958
Ijklijn 2 : R2 = 0.9981
Aangezien de tweede ijklijn de beste correlatie vertoont, wordt met deze verder gewerkt.
Ijklijn gesproeidroogde mannitol
1,6
y = 0,0009x + 0,0057 R² = 0,9981
Absorbantie bij 412 nm
1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,00
200,00
400,00
600,00 800,00 1000,00 1200,00 1400,00 1600,00 concentratie (nmol/ml)
Figuur 8.1: Ijklijn gesproeidroogde mannitol
54
Om de ijklijnen voor gemicroniseerde mannitol op te stellen wordt de volgende hoeveelheid afgewogen voor de stockoplossing: 18.48mg 18.48 mg / (50 ml * 182.172 mg/mmol) = 2028.85 nmol/ml De verdunningsreeks wordt op dezelfde manier gemaakt volgens tabel 3.1 en de absorbantie wordt gemeten bij 412 nm.
Tabel 8.23: Verdunningsreeks met absorbanties voor ijklijn gemicroniseerde mannitol concentratie (nmol/ml) 1521.64
absorbantie bij 412 nm ijklijn 1 1,422
Absorbantie bij 412 nm Ijklijn 2 1,379
1217.31
1,146
1,173
1014.43
1.007
0,945
811.54
0,778
0,77
608.66
0,606
0,538
405.77
0,386
0,398
202.89
0,201
0,205
152.16
0,153
0,152
121.73
0,116
0,113
101.44
0,106
0,099
81.15
0,083
0,072
50,72
0,060
0,042
Ijklijn 1: R2 = 0.9988
Ijklijn 2: R2 = 0.9922
Aangezien de eerste ijklijn de beste correlatie vertoont, wordt met deze verder gewerkt.
55
Ijklijn gemicronseerde mannitol
Absorbantie bij 412 nm
1,6
y = 0,0009x + 0,0122 R² = 0,9988
1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,00
200,00
400,00
600,00
800,00
1000,00
1200,00
1400,00
1600,00
concentratie (nmol/ml)
Figuur 8.2: Ijklijn gemicroniseerde mannitol Om de ijklijnen voor gesproeivriesdroogde mannitol op te stellen wordt de volgende hoeveelheid afgewogen voor de stockoplossing: 18.26 mg 18.26 mg / (50 ml * 182.172 mg/mmol) = 2004.70 nmol/ml De verdunningsreeks wordt op dezelfde manier gemaakt volgens tabel 3.1 en de absorbantie wordt gemeten bij 412 nm. Tabel 8.24: Verdunningsreeks met absorbanties voor ijklijn gesproeivriesdroogde mannitol concentratie (nmol/ml) 1503.52
absorbantie bij 412 nm ijklijn 1 1,252
Absorbantie bij 412 nm Ijklijn 2 1.186
1202.82
0.992
0.959
1002.35
0.784
0.796
801.88
0,642
/
601.41
0,486
0.475
400.94
0,322
0.350
200.47
0,166
0.167
150.35
0,118
0.144
120.28
0,111
0.104
100.23
0,081
0.083
80.19
0,074
0.071
50.12
0,051
0.041 56
Ijklijn 1: R2 = 0.9987
Ijklijn 2: R2 = 0.9994
Aangezien de tweede ijklijn de beste correlatie vertoont, wordt met deze verder gewerkt.
Ijklijn gesproeivriesdroogde mannitol Absorbantie bij 412 nm
1,400 y = 0,0008x + 0,0121 R² = 0,9994
1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0,00
200,00
400,00
600,00
800,00
1000,00
1200,00
1400,00
1600,00
concentratie (nmol/ml)
Figuur 8.3: Ijklijn gesproeivriesdroogde mannitol
8.5 OPSTELLEN IJKLIJNEN INULINE Eerst wordt 0.100 g anthron reagens opgelost in 100 ml geconcentreerd zwavelzuur (9597%). Om een ijklijn op te stellen wordt een stockoplossing gemaakt. Er wordt 10.12 mg gesproeivriesdroogde inuline afgewogen en opgelost in 100 ml water in een maatkolf. Uit deze stockoplossing wordt een verdunningsreeks opgesteld volgens tabel 3.2. Aan elk van deze proefbuizen wordt 2 ml anthron reagens toegevoegd, waardoor onmiddellijk een kleurverandering optreedt. De blanco oplossing blijft geel, de kleur van het anthron reagens. De andere verdunningen kleuren groen en blauw door de anthron reactie met het suiker. Deze kleur wordt gemeten via een spectrofotometer bij 630nm. Er worden 3 ijklijnen opgesteld aan de hand van de gemaakte verdunningsreeks.
57
Tabel 8.25: Verdunningsreeks met absorbanties voor ijklijn gesproeivriesdroogde inuline Concentratie (µg/ml)
Absorbantie bij 630 nm ijklijn 1
Absorbantie bij 630 nm ijklijn 2
Absorbantie bij 630 nm ijklijn 3
101.2
0.972
1.226
1.231
91.08
1.107
1.167
1.007
80.96
1.010
0.939
0.914
70.84
0.664
0.832
0.811
60.72
0.567
0.628
0.653
50.6
0.461
0.624
0.649
40.48
0.266
0.638
0.485
30.36
0.387
0.409
0.376
20.24
0.203
0.239
0.249
10.12
0.123
0.111
0.122
0
0.000
0.000
0.001
Ijklijn 1 R2 = 0.9291
Ijklijn 2 R2 = 0.9751
Ijklijn 3 R2 = 0.9909
Aangezien de derde ijklijn de beste correlatie vertoont, wordt met deze verder gewerkt.
Ijklijn gesproeivriesdroogde inuline Absorbantie bij 630 nm
1,4 y = 0,0114x + 0,0124 R² = 0,9909
1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
20
40
60
80
100
120
Concentratie inuline (µg/ml)
Figuur 8.4: Ijklijn gesproeivriesdroogde inuline 58
Er wordt 10.21 mg gemicroniseerde inuline afgewogen en opgelost in 100 ml water. Uit deze stockoplossing wordt een verdunningsreeks opgesteld volgens tabel 3.2. Tabel 8.26: Verdunningsreeks voor ijklijn gemicroniseerde inuline Concentratie (µg/ml)
Absorbantie bij 630 nm ijklijn 1
Absorbantie bij 630 nm ijklijn 2
102.1
1.368
1.322
91.89
1.143
1.138
81.68
1.075
1.034
71.47
0.808
1.042
61.26
0.655
0.955
51.05
0.533
0.934
40.84
0.478
0.544
30.63
0.354
0.417
20.42
0.210
0.286
10.21
0.103
0.149
0
0.000
0.000
Ijklijn 1 R2 = 0.9824
Ijklijn 2 R2 = 0.9542
Aangezien de eerste ijklijn de beste correlatie vertoont, wordt met deze verder gewerkt. 1,6
Absorbantie bij 630 nm
1,4
y = 0,0131x - 0,0557 R² = 0,9824
1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 0
20
40 60 80 Concentratie inuline (µg/ml)
100
120
Figuur 8.5: Ijklijn gemicroniseerde inuline 59
Er wordt 9.93 mg gesproeidroogde inuline afgewogen en opgelost in 100 ml water. Uit deze stockoplossing wordt een verdunningsreeks opgesteld volgens tabel 3.2. Tabel 8.27: Verdunningsreeks met absorbanties voor ijklijn gesproeidroogde inuline Concentratie (µg/ml)
Absorbantie bij 630 nm ijklijn 1
Absorbantie bij 630 nm ijklijn 2
99.3
1.39
1.388
89.37
1.178
1.246
79.44
1.032
1.092
69.51
0.959
0.917
59.58
0.854
0.806
49.65
0.670
0.564
39.72
0.641
0.462
29.79
0.469
0.402
19.86
0.239
0.342
9.93
0.101
0.133
0
0.000
0.000
Ijklijn 1 R2 = 0.9887
Ijklijn 2 R2 = 0.9874
Aangezien de eerste ijklijn de beste correlatie vertoont, wordt met deze verder gewerkt.
Absorbantie bij 630 nm
Ijklijn gesproeidroogde inuline 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
y = 0,0136x + 0,0107 R² = 0,9887
0
20
40
60
80
100
120
Concentratie inuline (µg/ml)
Figuur 8.6: Ijklijn gesproeidroogde inuline 60
