II. TRANSPLANTACE I. – přednášky 7. STRUKTURA A ČINNOST ČESKÉHO REGISTRU DÁRCŮ KRVETVORNÝCH BUNĚK Ivašková E, Kupková L., Vágnerová D., Kolaříková I., Krákora T., Stříž I. Institut klinické a experimentální medicíny Praha Český registr dárců (CBMD) získává, eviduje a vyhledává potenciální nepříbuzné dárce kostní dřeně, periferních kmenových buněk a pupečníkové krve pro transplantace českých a zahraničních pacientů. Od počátku svého vzniku v r. 1991 se stal členem mezinárodní asociace registrů Bone Marrow Donor Worldwide a počítačové sítě EDS. National Marrow Donor Program (NMDP) poskytuje dárce na podkladě zvláštní smlouvy, která byla uzavřena v r. 1997. S registrem spolupracuje 5 dárcovských center. Největší počet dárců byl vyšetřen v IKEM (50 %) a Transfúzní stanici (TS) v Brně (32 %). Zbývající centra – TS Zbraslav, Hradec Králové, Plzeň a ÚHKT – se podílejí 2 – 8 %. Celkový počet dobrovolníků se blíží 16ti tisícům. Současně je evidováno 885 zmražených vzorků pupečníkové krve. Ročně přibývá 1000 – 2000 nových evidovaných dárců. Od r. 1994 do 31.12.2002 vyhledal CBMD dárce pro 144 českých pacientů, u kterých se uskutečnila transplantace. Další 2/3 pacientů, indikovaných k transplantaci, k ní nedospěje. Během posledních devíti let poskytli čeští dárci krvetvorné buňky 33 českým a zahraničním pacientům. 16 x se jednalo o kostní dřeň, 13 x o buňky z periferní krve a 4 x o pupečníkovou krev. Největší počet dárců pochází ze zahraničních registrů, zvláště z Německa – 43 %, z NMDP – 12 %, Anglie – 9 %, Francie – 5 %. Řada dalších evropských států se podílí 1 %. 15 % našich pacientů má dárce z CBMD. V poslední době stoupá počet transplantací periferních kmenových buněk. Transplantační centra v Praze a Brně provedla v posledních čtyřech letech 25 těchto transplantací. 8. NEPŘÍBUZENSKÝ TRANSPLANTAČNÍ PROGRAM V ČR Z POHLEDU DAT ČESKÉHO NÁRODNÍHO REGISTRU DÁRCŮ DŘENĚ (ČNRDD) Koza V., Jindra P., Pittrová H., Navrátilová J., Ambrůzová Z., Banzetová H., artoníčková A., Bohoněk M., Čermáková Z., Herynková R., Jílková B., Masopust J., Vyskočilová E. Český národní registr dárců dřeně Plzeň ČNRDD zahájil činnost v roce 1992. Po deset let provádí nejen nábor a HLA typizaci dárců a vyhledávání vhodného dárce pro pac. indikované k UBMT, ale vede i podrobná data o dárcích, žádostech transplantačních center (TC), transplantačních indikacích, průběhu vyhledávání a samozřejmě jednotlivých odběrech. K 31.12.2002 evidoval ČNRDD 23 960 dárců vyšetřených na HLA I.třídu, 14 103 (60%) a 985 (4%) z nich vyšetřených molekulárně DR, resp. ABDR. Medián věku dárců je 33 let, zařazených v posledních 2 létech 28 let. Úspěšnost získání vzorku k DR či CT vyšetření je přes 95% a díky rozsáhlému depozitáři DNA dárců pracuje registr velice rychle. Medián doby od předběžné žádosti do data odběru je 2,5 měsíce. Žádosti zahraničních TC o vyhledání dárce vykazují v létech 1998-2002 exponenciální nárůst (90-163- 287-327-582), na rozdíl od ČR TC (74-66-78-78-152). Aktivita ČR TC v roce 2002: Brno 12, H.Králové 16, Plzeň 51, Motol 20, Olomouc 17, ÚHKT 36 žádostí.
Hlavní indikace ČR TC k UBMT AML (22%), CML (20%), ALL (14%) korespondují s indikacemi zahraničních TC. K prosinci 2002 umožnil ČNRDD 134 nepříbuzenských transplantací, z toho 97 odběry vlastních a 37 odběry zahraničních dárců. V létech 92-96 prováděl registr 1-3 odběry ročně, v roce 2002 uskutečnil 40 odběrů nepříbuzných dárců. Cíle registru do budoucna: 1. Doplnit max. molekulární DR typizaci již zařazených dárců. 2. Zvýšit počet AB DNA typizovaných dárců, zvláště AB sérologických homozygotů 3. Udržovat nízký medián věku dárců limitem věku pro zařazení do registru 35 let. 4. Udržovat standardy registru v plné kompatibilitě s WMDA standardy a připravenost k WMDA akreditaci. 5. Nabízet ČR TC co nejlepší spolupráci s cílem zvýšit počet žádostí o vyhledání dárce na úroveň zahraničních TC.
9. ANALÝZA PRVÝCH 500 PO SOBĚ JDOUCÍCH AUTOLOGNÍCH TRANSPLANTACÍ KRVETVORNÝCH BUNĚK (ASCT) – ZKUŠENOST JEDNOHO PRACOVIŠTĚ Trněný M.1, Pytlík R.1, Vacková B.1, Slabý J.1,2, Benešová K.1,3, Trnková M.1, Kobylka P.3, Gašová Z.3, Černý J.1,4, Slavíčková A.1, Šilerová B.1, Řehořová I.1, Procházka B.5, Klener P.1,3 1 I.interní klinika VFN a 1.LF UK, 2OKH FNKV, 3ÚHKT, 4Roger William Medical Center, 5SZÚ Praha Od 12/1993 do 2/2003 bylo na našem pracovišti provedeno celkem 500 (ASCT) u 389 nemocných (nem) s mediánem věku 47 let (18-70). Ženy tvořily 52,2% (n=203). Nejčastější indikací byly non-hodgkinský lymfom (NHL) (191 ASCT u 169 nem), mnohočetný myelom (MM) (132 ASCT u 79), Hodgkinův lymfom (HL) (86 ASCT u 68 nem), karcinom prsu (cap) (62 ASCT u 45 nem), chronická lymfatická leukémie (14 ASCT u 14 nem) a u 15 ASCT (14 nem) se jednalo o testikulární tumor, sclerosis multiplex, AML, MDS a další. Jako zdroj krvetvorných buněk byla použita 5x (1%) pouze kostní dřeň (BM), 29x (5,8%) kombinace BM a periferních krvetvorných buněk (PBPC) a v 93,2% samotné PBPC. Medián CD34+ buněk v PBPC byl 5,94x106/kg (0,58-69,6). V 21 případech jsme použili k transplantaci ex vivo selektované periferní krvetvorné buňky. Nejčastěji použitým vysokodávkovaným režimem byl BEAM u 231 ASCT (46,2%). 111 transplantací bylo provedeno opakovaně (tandem resp. retransplantace). S mediánem sledování 33 měsíců byla u nejčastější indikace NHL dosažena v 5 letech pravděpodobnost PFS (progression free survival), EFS (event free survival) a OS (overall survival) 42%, 40% a 51%, s dosažením plateu u nemocných transplantovaných v 1.remisi (OS 73%). U nemocných s difúzním velkobuněčným lymfomem transplantovaných v 1.remisi, chemosensitivním relapsu a chemoresist. onem. ve 3.letech byl OS 71%, 65% a 12%, u nemocných s FCL to bylo 85% a 69%. Budou prezentovány výsledky u ostatních diagnóz. Závěr: HDT s ASCT je standardní metodou v léčbě řady chorob, v současné době je cílem zlepšit výsledky zavedením nových metod (např. monoklonální protilátky) zároveň se snížením komplikací.
10. SROVNÁNÍ PŘEŽITÍ NEMOCNÝCH NAD 60 LET VĚKU S KONTROLNÍ SKUPINOU NEMOCNÝCH POD 60 LET PO AUTOLOGNÍ TRANSPLANTACI PERIFERNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK KRVETVORBY Černá K., Koza V., Jindra P., Karas M., Škopek P., Vokurka S., Švojgrová M., Vozobulová V., Schützová M. Hematoonkologické oddělení FN Plzeň Cílem práce bylo v retrospektivní studii srovnat výsledky nemocných (nem.) po ASCT starších 60-ti let s kontrolní skupinou nem. pod 60 let. Pacienti a metody: analyzovali jsme 116 nem. (46Ž, 70M) po ASCT v období 1993-2002 rozdělených do 2 skupin se srovnatelnými diagnózami a stavem choroby, lišících se pouze ve věku. Ve sk.I byl med. věku 64 let (60-73) a ve sk.II 46,5 let (16-53), p<0,0001. Výsledky: u všech nem. ve sk.I došlo k přihojení štěpu s med. 11 dní (8-14) dosažení ANC nad 500/ul a s med. 15,5 dní (9-16) dosažení trombocytů nad 20.000/ul. Ve sk.II s výjimkou 1 nem. došlo u všech k přihojení štěpu s med. 11 dní (8-17) dosažení ANC nad 500/ul, p=0,82 a s med. 12 dní (9-19) dosažení trombocytů nad 20.000/ul, p=0,62. Ve sk.I 22 nem. (38%) zemřelo, 3 nem. zemřeli v prvních 100 dnech po ASCT s celkovou TRM 5%. 23 nem. ve sk.II zemřelo (39%), 2 z nich v prvních 100 dnech po ASCT s celkovou TRM 3,5%, p=1,0. 13 nem. (22%) ve sk.I zrelabovalo a zemřelo 3-46 měs.(med. 13) po ASCT, 6 nem. (10%) zemřelo na jinou příčinu 6-56 měs. po ASCT (med. 32,5). Ve sk.II 16 nem. (32%) zrelabovalo a zemřelo 3-85 měs. po ASCT (med. 19), p=0,668. 5 nem. (9%) zemřelo na jinou příčinu 18-73 (med. 34) měs. po ASCT, p=1,0. Ve sk.I přežívá 36 nem. (62%) s med. 24 měsíců (3-82) a pravděpodobností přežití 7 let 31%, ve sk.II přežívá 35 nem. (60%) s med. 38 měs. (2-79) a pravděpodobností přežití 7 let 34%, p=0,311. Závěr: ačkoli nem. ve skupině nad 60 let byli vstupně selektováni s ohledem na celkový status před ASCT, je zřejmé, že engraftment, časná TRM a celkové přežití po vysocedávkované chemoterapii s podporou ASCT u starších nemocných je srovnatelné s obdobnou skupinou mladších pacientů.
11. VYSOCEDÁVKOVANÁ CHEMOTERAPIE S AUTOLOGNÍ TRANSPLANTACÍ U INDOLENTNÍCH LYMFOMŮ, NAŠE ZKUŠENOSTI Vondráková J., Papajík T., Faber E., Jarošová M., Kajaba V., Marešová I., Pikalová Z., Raida L., Skoumalová I., Szotkowská R., Urbanová R., Vlachová Š., Indrák K. Hemato-onkologická klinika FN a LF UP Olomouc Volba optimální léčebné strategie u indolentních lymfoproliferací s typickým chronickým, recidivující průběhem má pro pacienta zásadní význam. V některých případech se setkáváme s agresivnějším průběhem choroby, a proto stratifikace těchto nemocných, vyžadujících intenzivnější léčbu již na začátku onemocnění, může prodloužit období bez známek aktivity nemoci. V našem sdělení hodnotíme retrospektivní soubor nemocných diagnostikovaných a léčených na HOK FN Olomouc v letech 1990-2002. Diagnostika se opírala o histologii, imunofenotypizaci, molekulární biologii a cytogenetiku, hodnocení klinického stádia dle Ann Arbor, IPI, prognostických markerů /B2M, sTK/. Od r. 1997 bylo transplantováno 101 nemocných (37%) pro NHL, 92 autologně, 9 alogenně. Autologní transplantaci po přípravném režimu BEAM podstoupilo 23 nemocných s folikulárním NHL (6 mužů a 17 žen ve věku 30 – 66 let, průměr 46 let), 12 nemocných bylo transplantováno v CR, 9 v PR, 2 refrakterní. Indikováni k transplantaci byli nemocní s inic. pokročilou
chorobou, ev. bulky, extranodálním postižením, nepříznivým IPI či opakovaně relabující. Po primingovém režimu nasbíráno v průměru 8,75 . 10 6 /kg CD 34+ buněk ( interval 2,12 – 23,5). Nikdo nezemřel do dne +30 po ATPKB. 2 chemorezistentní nemocní na uvedenou léčbu nezareagovali, ostatní v den +100 hodnoceni jako CR/MRD, 2x trvající PR.V současnosti je 13 nemocných v CR, 2x PR, 8 zrelabovalo, z toho 4 exitovali na progresi choroby. Podrobná analýza souboru uvedená ve sdělení dokládá léčebný přínos intenzivnějšího způsobu terapie u indolentních lymfomů. Podpořeno grantem MŠ č. MSN 15110004. 12. TRANSPLANTACE KRVETVORNÝCH BUNĚK V LÉČBĚ ROZTROUŠENÉ SKLERÓZY, KLINICKÝ EFEKT A VÝSLEDKY IMUNOLOGICKÉHO MONITOROVÁNÍ Kozák T.1, Havrdová E.2, Piťha J.3, Trněný M.4, Gregora E.1, Pytlík R.4, KozaV. 5, Škopek V.5, Kobylka P.6, Vodvářková Š.6 1 OKH FNKV, 2Neurologická klinika VFN, 3Neurologická klinika FNKV, 4I.interní klinika VFN, 5Hematoonkologické oddělení FN Plzeň, 6ÚHKT, Praha Dle registru EBMT/EULAR bylo do XII/02 provedeno v Evropě 420 transplantací krvetvorných buněk pro autoimunitní onemocnění, z toho 11 alogenních. Zde prezentujeme soubor 22 pacientů se sekundárně progredující RS, kteří se na 3 pracovištích v ČR podrobili imunoablační terapii s podporou autologních krvetvorných buněk. Jde o největší soubor v Evropě. S výjimkou jedné pacientky všichni pacienti vstoupili do studie na chronické dávce kortikosteroidů. V předchozím období byly v léčbě neúspěšně použity alespoň 2 z následujících látek: interferon beta, mitoxantron, cyklofosfamid, pulsy vysokých dávek metylprednisolonu, azathioprin, metotrexát. Mobilizace autologních PBSC byla provedena pomocí cyklofosfamidu 3-4 g/m2 + G-CSF 7-10 µg/kg. Dvacet pacientů podstoupilo transplantaci krvetvorných buněk po přípravném režimu BEAM. Věkový medián transplantovaných pacientů byl 35 let (23 – 51). Klinické výsledky: Toxicita mobilizace a sběru PBPC nebyla odlišná od hematologických malignit. U 14 pacientů byl štěp podroben T depleci, resp. selekci CD34+ buněk in vitro. U 8 pacientů byl použit ATG D+1 a D+2 po převodu PBPC jako forma T deplece in vivo. Toxicita léčebného režimu byla individuální. U 2 pacientů byla významná s rozvojem respirační insuficience při oboustranné bronchopneumonii, resp. krvácení do plic a s nutností přechodné umělé plicní ventilace. Oba pacienti tuto komplikaci překonali. Medián sledování je 28 měsíců. Medián EDSS při vstupu do studie byl 6,5 (6,0-8,5), medián EDSS při posledním sledování byl 6,5 (5,5-10,0). U 3 pacientů došlo k výraznému zlepšení neurologického nálezu v EDSS (1,0-1,5 bodu), u dalších 6 pacientů ke zlepšení o 0,5 bodu. Alespoň ke stabilizaci onemocnění došlo u 17 pacientů (77%). Ke zhoršení neurologického deficitu došlo u 3 pacientů, z nichž 1 pacientka na základní onemocnění zemřela 30 měsíců po léčbě. V klinickém efektu u pacientů transplantovaných s in vitro čištěným štěpem oproti transplantovaným s ATG není významný rozdíl. Po dobu sledování jsou průběžně analyzovány lymfocytové pupulace v periferní krvi. 12 měsíců po léčbě přetrvává statisticky významné snížení IRI a procenta CD4+ a CD4+CD45RA+ lymfocytů. Závěr: Naše výsledky podporují zahájení randomizované studie u pacientů se sekundárně progredující RS.
Podporováno grantem IGA MZd č. NF6560-3.
V. TRANSPLANTCE II. – přednášky 25. VOLBA NEMYELOABLATIVNÍHO PŘÍPRAVNÉHO REŽIMU PODLE PŘÍJEMCOVY T-LYMFOPENIE - PRVNÍ ZKUŠENOSTI U NEMOCNÝCH S MALIGNÍMI LYMFOPROLIFERACEMI Raida L.1, Faber E.1, Papajík T.1, Skoumalová I.1, Koupilová M.1, Pikalová Z.1, Jarošová M1, Vlachová Š.1, Kubaláková R.1, Divoká M.1, Indrák K.1, Zapletalová J.2 1 HOK FN Olomouc, 2Katedra biofyziky LF UP Olomouc 11 nemocných podstoupilo alogenní příbuzenskou nemyeloablativní transplantaci kmenových buněk (NTKB) pro diagnózu relabujícího nebo refrakterního NHL (8x, 72,7%), resp. B-CLL (3x, 27,3%). Kombinace fludarabinu s melfalanem (2x, 18,2%), event. doplněná ATG (3x, 27,3%) zajistila v přípravě dostatečnou imunosupresi příjemce a spolehlivé přihojení dárcovských buněk, byla však spojena s významnou toxicitou. Nahrazení melfalanu cyklofosfamidem (5x, 45,5%) snižuje časnou potransplantační toxicitu, avšak bez aplikace ATG (1x, 9,1%) může zajistit dostatečnou imunosupresi pouze již předtransplantačně výrazně imunodeficitním nemocným. 4 z 5 nemocných (80%) připravovaných kombinací fludarabinu a cyklofosfamidu dosáhli již v den +30 kompletního dárcovského chimerismu v Tlymfocytech a následně i remisi (KR) lymfomu. Jejich předtransplantační medián hodnot CD3+ buněk byl 0,29x109/l. Všech 6 příjemců (100%) připravovaných intenzivnějšími imunoablativními režimy dosáhlo v den +30 kompletního dárcovského T-lymfocytárního chimerismu a KR lymfomu. Medián CD3+ buněk byl 0,94x109/l. Zemřeli 3 pacienti (27,3%) transplantovaní po přípravě obsahující melfalan a jediná nemocná (9,1%) po kombinaci fludarabinu s cyklofosfamidem. Ani u jednoho z 10 pacientů (90,9%), kteří dosáhli KR, nedošlo při mediánu sledování 284 dnů k relapsu choroby. Aplikace méně intenzivního nemyeloablativního přípravného režimu umožňuje u imunosuprimovaných jedinců dostatečné přihojení dárcovských buněk s následnou kontrolou lymfomu a současně snižuje riziko časných závažných potransplantačních komplikací. 26. ALOGENNÍ TRANSPLANTACE KRVETVORNÝCH BUNĚK PO NEMYELOABLATIVNÍM REŽIMU S FLUDARABINEM, BUSULFANEM A ATG. ZPRÁVA Z JEDNOHO CENTRA Doubek M., Mayer J., Kořístek Z., Krejčí M., Brychtová Y., Navrátil M., Vášová I., Tomíška M., Buchtová I. Interní hematoonkologická klinika FN Brno Úvod. Nemyeloablativní režimy umožňují provést alogenní transplantaci krvetvorných buněk i u nemocných, u nichž nemůže být konvenční předtransplantační režim podán. 2 Cíle a metody. Nemyeloablativní režim s fludarabinem (30 mg/m /den; 5 dní), busulfanem (celkem 8 mg/kg) a ATG (10 mg/kg/den; 4 dny) byl retrospektivně analyzován u všech 37 nemocných transplantovaných tímto režimem ve Fakultní nemocnici Brno. Výsledky. Medián věku transplantovaných nemocných byl 54 let (27-65). 12
nemocných mělo AML, 10 CML, 5 NHL, 3 HD, 3 CLL, 2 MM, 1 MDS a 1 AA. Nemocní byli transplatováni krvetvornými buňkami z periferní krve. Profylaxi GvHD zajišťoval u všech nemocných cyklosporin A, u jednoho pacienta to byl cyklosporin s metotrexátem. Medián transplantovaných CD34+ buněk a CFU-GM byl 7,6x106/kg, respektive 105,6x104/kg. K přihojení buněk došlo u 36 nemocných, jeden pacient zemřel před jeho přihojením. Leukocyty nad 1x109/l stouply v mediánu 19 dní (9-27) a destičky nad 20x109/l v mediánu 13 dní (0-23). 3 nemocní dostali před přihojením G-CSF. 76% pacientů mělo febrilní neutropenii. Incidence akutní GvHD byla 24 %, akutní GvHD III. a IV. stupně 5 %. Limitovaná chronická GvHD se rozvinula u 9 pacientů (24 %), extensivní chronická GvHD u 2 pacientů (5%). 4 pacienti byli retransplatováni pro relaps nemoci. Nehemtologická toxicita byla minimální. Den +60 mělo 57 % nemocných kompletní chimerismus. CMV nemoc se vyvinula u 1 pacienta. Během sledování relabovala nemoc u 32 % pacientů a 8 pacientů (22 %) zemřelo. Závěr. Režim s fludarabinem, busulfanem a ATG je velmi dobře tolerován a zachovává si dostatečný protinádorový efekt. 27. ALLOGENNÍ TRANSPLANTACE V NEMYELOABLATIVNÍM PŘÍPRAVNÉM REŽIMU, VÝSLEDKY ÚHKT Marková M., Vítek A., Sajdová J., Šponerová D., Maaloufová J., Pohlreich D., Cetkovský P. Ústav hematologie a krevní transfúze, Praha V období červenec 1999 – duben 2003 bylo na ÚHKT Praha provedeno 43 allogenních transplantací v nemyeloablativním přípravném režimu. Jako štěp byla použita dřeň shodného sourozence (3), periferní kmenové buňky shodného sourozence (24), dřeň nepříbuzného dárrce (7), periferní kmenové buňky nepříbuzného dárce (8) a periferní kmenové buňky od HLA neshodné matky (1). Diagnózy, pro které byli pacienti transplantováni, zahrnovaly : CML 8, AML 13, MDS 6, NHL 6, MM 1, CLL 5, HD 1, renální karcinom 1, melanom 1, myelofibrosa 1. Použili jsme tyto přípravné režimy: Flu,Bu,ATG (30), Ida,Flu,Bu,ATG (2), Flu,TBI (4), Flu,TBI,ATG (1), Flu,CPA (3), Flu,Mel (1), Flu,Mel,ATG (1). Průběh samotné transplantace do přihojení štěpu byl u většiny pacientů nekomplikovaný, pouze u 2 pacientů (4.6%) nedošlo k přihojení štěpu. U 9 % pacientů se vyskytla mírná mukositida, u 2 pacientů VOD a u 1 pacienta hemorhagická cystitis. U 32% pacientů byl průběh komplikován krátkodobou febrilní neutropenií. Průměrná doba přihojení neutrofilů (více než 0.5 x 109 /l) byla 19 dní, průměrná doba přihojení trombocytů (nad 20 x 109 /l) byla 20 dní. U 5 pacientů (11,6%) bylo nutné užití G-CSF. Celkem bylo u 29 (65.1%) pacientů dosaženo remise onemocnění. U CML to bylo 6 pacientů (75%), avšak samotná transplantace nenavodila molekulárně genetickou remisi a bylo nutno použít ještě další intervence. U AML zrelabovalo po transplantaci 7 pacientů (53.8%), celkem jsme relaps či progresi zaznamenali u 14 (32.5%) pacientů. 12 pacientům byly potransplantačně převedeny dárcovské lymfocyty. Akutní GVHD se rozvinula u 17 (39.5%) pacientů, z toho u 5 až po aplikaci DLI. U 6 (13.9%) pacientů byla samotná GVHD, či infekce provázející její léčbu příčinou smrti pacienta. Progrese či relaps základního onemocnění byly pak příčinou úmrtí u 10 (23.3%) pacientů . Celkem dosud zemřelo 22 pacientů (51.6 %) s průměrnou dobou přežití u těchto pacientů od transplantace 196 dní. Žijících pacientů je 21 (48.8%), s nejdelší dobou přežití od transplantace 1165 dnů.
Závěr: Allogenní transplantace v nemyeloablativním přípravném režimu jsou pacienty dobře snášené, většinou bez problémů s přihojením, avšak podobně jako v ostatních transplantačních centrech je hlavním úskalím rozvoj akutní GVHD a progrese, či relaps základního onemocnění. 28. NEPŘÍBUZENSKÉ HSCT V LETECH 1994–2002 Z HLEDISKA HLA KOMPATIBILITY Dobrovolná M.1, Vraná M.1 , Loudová M.1 , Vítek A.1, Sedláček P.2 1 Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha, 2II.dětská klinika 2. LF UK, Praha V ÚHKT Praha provádíme genotypizaci HLA (hlavního histo-kompatibilního systému) dospělých a dětských pacientů, kterým byla indikována transplantace hematopoetických kmenových buněk (HSCT) od nepříbuzného dárce. Od roku l994 provádí naše pracoviště DNA analýzu HLA II.třídy (lokusy -DRB1, DQB1) a od roku 1998 HLA I.třídy (lokusy -A,-B-C) na úrovni určení jednotlivých alel (medium/high resolution). Za toto období se podařilo shromáždit soubor DNA 106 dvojic transplantovaných pacientů a jejich nepříbuzných dárců, u kterých jsme schopni definovat jejich HLA kompatibilitu. Přehled HLA kompatibility testovaného souboru HLA shoda nesh. jen I.tř. nesh.jen II.tř. počet 45 39 8 dvojic
neshoda II.tř. 14
I.a
Celkový počet nalezených neshod A B lokus C lokus -DRB1 -DQB1 neshoda lokus lokus lokus alel.skupiny 4 6 39 0 13 alely 6 15 6 8 4 Nízký počet nalezených neshod na úrovni alelických skupin v lokusech -A,-B,-DRB1 je dán skutečností, že právě tyto údaje jsou kritériem výběru nepříbuzného dárce v registru. Vyšší počet neshod na úrovni alel jsme nalezli u alelických skupin HLA-A *02; -B *27, *35, *51; -DRB1 *04, *11. Má-li pacient některou z jmenovaných alelických skupin, je vhodné právě v nich přednostně sledovat shodu mezi pacientem a dárcem. Studie byla provedena za podpory grantu IGA MZ, reg. č. NH/7615-3 a Institucionálního výzkumného záměru ÚHKT CEZ MZ 0023736001. 29. PULZNÍ CYKLOFOSFAMID V LÉČBĚ TĚŽKÉ GVHD Mayer J., Doubek M., Brychtová Y., Navrátil M., Obořilová A., Král Z., Tomíška M., Buchtová I. Interní hematoonkologická klinika Fakultní nemocnice Brno Těžká GvHD je obávanou komplikací alogenních transplantací krvetvorných buněk, která může nemocného ohrozit na životě. Prognóza této komplikace se dále výrazně zhoršuje, nedojde-li k promptní reakci na kortikoidy. Steroidrezistentní GvHD má vysokou mortalitu a její léčba je velmi neuspokojivá, jak svými výsledky, tak cenou (ATG, ovlivnění cytokinů).Cyklofosfamid je léta používané imunosupresivum. Dobré výsledky jsou s ním dosahovány v léčbě některých autoimunit, přičemž GvHD se jako
autoimunitní onemocnění chová také. Cyklofosfamid je též základním imunosupresivem používaným před transplantací krvetvorných buněk k potlačení imunity příjemce. Na podkladě výše uvedených skutečností jsme se rozhodli začít používat pulzní cyklofosfamid i k ovlivnění imunitních buněk dárce v případě těžké a jinak nezvladatelné GvHD, v dávce 1000-2500 mg, podle stavu krevního obrazu. První nemocné (2 podání s 2-letým odstupem) byl aplikován pulzní cykofosfamid s velmi dobrým efektem primárně pro hemolytickou anémii v rámci chronické GvHD. Těžká slizniční GvHD byla ale ovlivněna minimálně. Dalších 8 nemocných (9 podání) již dostalo cyklofosfamid primárně pro akutní GvHD s malou nebo žádnou odpovědí na kortikoidy. Typy GvHD a jejich ovlivnění: 1x slizniční v d. ústní – výrazné zlepšení, obnoven příjem per os; 3x střevní – 1x beze změny, 1x zlepšení, 1x regrese; 5x jaterní – výrazné zlepšení nálezu, někdy až překvapivě rychlý ústup z hodnot ALT přes 20 ukat/l; 2x kožní – výrazný ústup až normalizace. Léčebné odpovědi se většinou dostavily do 7-15 dnů po podání pulzu. Dále pokračováno v kombinované imunosupresi bez cyklofosfamidu. Komplikace: 5x reaktivace CMV, zvládnuto, z 11 podání 5x mírný přechodný zvladatelný dřeňový útlum. 30. VYSOKÁ HLADINA REZIDUÁLNÍ NEMOCI PŘED TRANSPLANTACÍ HEMATOPOETICKÝCH KMENOVÝCH BUNĚK U DĚTÍ S ALL PREDIKUJE RIZIKO RELAPSU ONEMOCNĚNÍ Šrámková L.1,2, Krejčí O.1,2, Mužíková K.1,2, Kalinová M.1,2, Zörnerová T.1,2, Sedláček P.2, Keslová P.2, Zuna J.1,2, Starý J.2, Trka J.1,2 1 CLIP- Childhood Leukaemia Investigation Prague,2II. dětská klinika, UK 2.LF a FN Motol Hladina minimální reziduální nemoci (MRN) je důležitým prognostickým znakem u pacientů s akutní lymfoblastickou leukémií (ALL) podstupujících allogenní transplantaci kmenových buněk krvetvorby (SCT). Pro sledování MRN jsme použili metodiku detekce přestaveb imunoreceptorových genů (IRG) – genů pro imunoglobuliny (Ig) a T-buněčných receptory (TCR) s následnou kvantitativní PCR s použitím klonálně specifických primerů. Dosud jsme vyšetřili 13 dětí s ALL, kteří byli prošli SCT s dobou sledování minimálně 6 měsíců po transplantaci. U všech pacientů bylo možno sledovat MRN: u 11 pacientů (85%) byla nalezena alespoň jedna přestavba IRG vhodná ke sledování MRN, 4 pacienti (31%) jsou sledováni pomocí dvou cílů, 7 pacientů (54%) pomocí jednoho cíle, oba pacienti bez IRG přestavby jsou sledováni pomocí fúzních genů. U všech pacientů s BCR/ABL přestavbou (n=4) provádíme současně kvantitativní detekci transkriptu. Ve skupině pacientů s nízkou MRN (n=9) jsme zaznamenali 1 hematologický a 1 molekulárně genetický relaps, 7 dětí je v kompletní remisi. Ve skupině s vysokou MRN (n=4) prodělali 2 pacienti potransplantační hematologický relaps, 1 pacient molekulárně genetický relaps a 1 zemřel na časné potransplantační komplikace. Přežití pacientů s vysokou předtransplantační MRN je významně horší než u pacientů, kteří vstupují do transplantace s nízkou MRN. Všichni pacienti byli zařazeni do studie mezinárodní skupiny ESG-MRD-ALL (European Study Group for Minimal Residual Disease in ALL), která se zabývá standardizací detekce MRN. Podporováno granty IGA MZ 6512, GAUK 43, FNM, VZ MŠMT 111300003 a 111300005.
XIII. TRANSPLANTACE III. – přednášky 67. BONE MARROW-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS AS PRECURSORS FOR TUMOR STROMA AND TARGETED DELIVERY OF THERAPEUTIC GENES IN CANCER Studeny M.1, Dembinski J., Cabriera-Hansen M., Zompetta C., Champlin R. E., Marini III F. C., Andreeff M. 1 National Cancer Institute, Bratislava, Slovakia, Department of Blood and Marrow Transplantation, The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Houston, TX We showed that bone marrow derived Mesenchymal Stem Cells serve as precursors for stromal fibroblasts in solid tumors. It allow development of novel therapeutic strategy based on the local production of biologically active molecules by genemanipulated mesenchymal stem cells (MSC) in the tumor microenvironment. Mesenchymal stem cells transduced with adenoviral vector carrying human interferon-beta (MSC-IFN-β directly inhibit growth of malignant cells in coculture experiments in vitro. MSC-IFN-β intravenously injected into mice with established breast carcinoma and melanoma, pulmonary metastases gave rise to stromal cells in tumors and inhibited tumor growth in vivo. In contrast, systemically administered interferon-beta (IFN-β) was completely ineffective in the same model. Our data indicate that MSC-IFN-β suppressed malignant cell growth by local production of IFN-β in the tumor microenvironment and that this effect does not correlate with IFNβ serum levels. Therefore, gene-manipulated mesenchymal stem cells may serve as a new platform for targeted delivery of therapeutic proteins into sites of cancer. 68. CÍLENÝ HOMING KMENOVÝCH BUNĚK POMOCÍ PHAGE DISPLAY- PRVNI KROK K TRANSDIFERENCIACI Černý J.1,2, Demers D.2, Dooner M.S.2, Colvin G.A.2, Queseneberry P.J.2 1 st 1 Department of Internal Medicine Charles University General Hospital, Prague, Czech Republic, 2Roger Williams Medical Center, Department of Research, Center for Stem Cell Biology, Providence, Rhode Island, USA Schopnost krvetvorných kmenových buněk (HSC) přihojit se a diferencovat v buňky krevní či jiné tkáně (transdiferenciace) závisí na mnoha faktorech. Jedním z velmi významných faktorů je vliv mikroprostředí a tzv. “homing” HSC. Nedávno jsme prezentovali, že 48 hodinová expozice HSC (lin-Sca+) cytokínům (IL-3, 6, 11 steel factor) rezultuje v defektním homingu HSC do kostní dřeně (BM), což má za následek defekt přihojení. (Cerny et al. J Hematother Stem Cell Res 2002; 11: 813) Současně jsme pozorovali, že po 24 hodinové kultivaci dochází k desetinasobně vyššímu homingu lin-Sca+ buněk do plicní tkáně. Pro určení molekulární podstaty divergentního homingu HSC jsme použili phagemid display cDNA library z plicní tkáně (PhDL). Provedli jsme celkem 4 kola in vitro panningu na buňkách kostní dřeně. Vytvořili jsme následné PhDL: A- PhDL – klony, které se vázaly na buňky čerstvé BM (0 hod); B- PhDL – klony, které se vázaly na buňky BM (0 hod) a dále na BM 24 hod; C - PhDL – klony, které se nevázaly (supernatant) na buňky BM (0 hod) a dále se pak
vázaly na BM 24 hod; D - PhDL – klony, které se v každém kole nevázaly (supernatant) na buňky čerstvé BM a dále se pak vázaly na BM 24 hod. Zhodnocení jednotlivých titrů ukázalo, že v případě klonů A došlo k časnému nasycení systému, ostatní klony (B, C a D) vykazovaly selektivní narůst. Sekvenováním namnožených klonů a porovnáním sekvencí pomocí NCBI Genbank jsme zatím určili homologii např. s beta-chimerinem aj. Věříme, že znalost molekulární podstaty homingu do nehematopoetických tkání může přinést nejen vysvětlení, ale i brzké využití transdiferenciace a plasticity kmenových buněk. 69. EX VIVO EXPANZE NEURÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK A ZACHOVÁNÍ JEJICH HEMOPOETICKÉ IDENTITY Filip S.1, Mokrý J.2, Karbanová J.2, Duspivová J.2, Vávrová J.3 1 Klinika onkologie a radioterapie FN, Hradec Králové, 2Ústav embryologie a histologie LF UK, Hradec Králové, 3Ústav imunologie a radiobiologie VLA JEP, Hradec Králové Kmenové buňky pro své jedinečné vlastnosti slibují všestranné využití v klinické medicíně, zejména možnosti reparace většiny orgánů a tkání lidského těla. Cílem našeho experimentu je prokázat hematopoetickou identitu neurálních kmenových buněk s možnosti jejich ex vivo expanze a získávání funkčních buněk, které se uplatňují v regeneraci po poškození kostní dřeně. V experimentu jsme použili myši Balb-c. Z myších embryí (D14) jsme izolovali neurální kmenové buňky, které jsme dále pasážovali s kombinací cytokinů: SCF 50 ng/ml, FLT-3L 50 ng/ng, IL-3 50 ng/ml a G-CSF 50 ng/ml. Doba pasážování byla 50 dní. Pro identifikaci hemopoetických buněk jsme použili analýzu Sca-1 (stem cell antigen) a metodu kultivace CFU-GM. Pro analýzu neurálních kmenových buněk jsme použili retrovirovou transfekci (LacZ) a histochemickou analýzou X-Gal+ buněk. Po 30 dni pasážování jsme identifikovali již první hemopoetické buňky. Pro určení zachování hemopoetické identity jsme použili model, kdy jsme celotělově subletálně ozářeným myším Balb-c LD 8,5 Gy (4Gy+4.5Gy) aplikovali expandované plastické neurální kmenové buňky a testovali jejich hemopoetickou identitu pro reparaci poškozené hematopoézy metodou kultivace CFU-GM v kostní dřeni a slezině, dále také metodou endogenních slezinných kolonií (CFU-S). V našem experimentu jsme zjistili, že transplantace expandovaných plastických neurálních kmenových buněk vedla k reparaci hematopoézy. 70. IZOLACE, KULTIVACE A EXPANZE HEMATOPOETICKÝCH KMENOVÝCH BUNĚK EX VIVO Klabusay M., Kořístek Z., Vinklárková J., Adler J., Mayer J. Interní hematoonkologická klinika, Fakultní nemocnice Brno Hematopoetické kmenové buňky jsou schopny úplné obnovy krvetvorby ve všech liniích, čehož se klinicky využívá při transplantaci krvetvorby. Rychlost engraftmentu je více ovlivněna zadanými progenitorovými buňkami, pro dlouhodobý engraftment jsou nepostradatelné pluripotentní kmenové buňky. Podáním dostatečného množství progenitorových a prekursorových buněk, které lze získat kultivací hematopoetických kmenových buněk in vitro, je možno teoreticky zkrátit období hluboké pancytopenie indukované cytostatiky a předejít tak často závažným komplikacím.
Autoři analyzovali metody selekce kmenových buněk pomocí imunomagnetické separace Lin- buněk a jejich expanzi v podmínkách in vitro kultivace se všemi možnými kombinacemi 5 cytokinů (SCF, Flt-3, IL-3, IL-6, TPO, +/- G-CSF). Kultury byly analyzovány kvantitativně, mofrologicky, imunofenotypizačně a testy CFU-GM a CFU-Meg. Kmenové buňky v kultuře diferencují a množství progenitorů narůstá, zatímco relativní zastoupení CD34+ buněk klesá v průměru pod 10% den +14. Množství progenitorů granulocytární linie koreluje s nárůstem kolonií CFU-GM. Den +14 nejvyšší nárůst CFU-GM kolonií byl dosažen s cytokiny SCF+IL-3, SCF+IL3+FLT3+TPO a/nebo +IL-6, nejvyšší nárůst CFU-Meg kolonií s cytokiny SCF+IL-3+TPO. Absolutní počet CD34+ buněk narůstá 5-20x den +14. Doplnění G-CSF zvyšuje celkovou buněčnost kultury 2x, významně přibývá morfologicky zralých forem. Tyto výsledky ukazují, že kmenové buňky je možné efektivně kultivovat, expandovat a diferencovat v ex vivo podmínkách. Úspěšný průkaz expanze CFU-GM a CFU-Meg kolonií podporuje možné použití těchto kultur in vivo u pacientů ke zkrácení doby pancytopenie. 71. SUBPOPULACE CD34+ BUNĚK: ANALÝZA FENOTYPU PERIFERNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK PACIENTŮ MOBILIZOVANÝCH G-CSF Klabusay M., Kovářová L., Kořístek Z., Vorlíček J. Interní hematoonkologická klinika, Fakultní nemocnice Brno Hematopoetické kmenové buňky jsou u pacientů podstupujících autologní transplantaci periferních kmenových buněk (PBSC) mobilizovány do periferní krve pomocí stimulační chemoterapie s aplikací G-CSF. Populace CD34+ buněk netvoří homogenní populaci – zahrnuje nejen pluripotentní hematopoetické kmenové buňky, ale rovněž zadané progenitorové buňky. K analýze fenotypu CD34+ buněk byla použita vícerozměrná flow cytometrická analýza. Vzorky periferní krve 10 pacientů s diagnosou non-hodgkinského lymfomu byly analyzovány denně ode dne +10 od zahájení stimulační chemoterapie, vzorky PBSC z transplantátu byly analyzovány v den odběru pomocí přímo značených monoklonálních protilátek. Maximální počet leukocytů v periferní krvi byl dosažen den +15 (21,9x10^9/l), relativní zastoupení CD34+ buněk dosáhlo maxima den +15 (0,3x10^9/l). Kinetika CD34+ buněk byla sledována ode dne +11, bez signifikantních změn v expresi antigenů. Průměrné exprese sledovaných antigenů na CD34+ buňkách byly následující: CD38 92,2%, CD2 6,0%, CD5 10,6%, CD14 13,7%, CD3 13,7%, CD10 1,8%, CD33 13,2%, CD15 14%, CD41 42,7%, CD61 34,6%, CD7 12,5%, CD135 6,4%, CD235a 40,8%, CD86 5,6%, HLA-DR 52,3%, CD90 1,6%, CD19 21,9%, CD20 8,8%, CD45 99,8%, CD56 14,5%, CD13 22,6%, CD11b 25,2%, CD117 5,9%, CD54 23,7%, CD71 77,2%, CD1a 8,8%. Z uvedených dat vyplývá, že většinu CD34+ buněk tvoří zadané progenitory jednotlivých linií - 11% CD34+ buněk exprimuje antigeny T-linie, 22% antigeny Blinie, 13% antigeny myeloidní linie, 43% antigeny megakaryocytární linie; minoritní část CD34+ buněk vykazuje fenotyp hematopoetických kmenových buněk (3,2% CD34+38- a 1,9% CD34+90+). Tyto výsledky poukazují na možnost identifikace populací v transplantátu PBSC zodpovídajících za krátkodobý či dlouhodobý engraftment pomocí fenotypizace.
72. IDENTIFIKACE INDIVIDUÁLNÍCH KLONŮ T LYMFOCYTŮ U PACIENTŮ PODSTUPUJÍCÍCH ALOGENNÍ TRANSPLANTACI KOSTNÍ DŘENĚ Michálek J.1-4, Collins R.H.4, Douek D.C.5, Vitetta E.S.4 1 Laboratoř experimentální hematologie a buněčné imunoterapie, 21.Dětská klinika, 3 Klinika dětské onkologie, FN Brno, 4Cancer Immunobiology Center, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas, U.S.A., 5Vaccine Research Center, National Institute of Health, Bethesda, Maryland, U.S.A. Autoři studovali možnost identifikace antigen-specifických T lymfocytů v situaci alogenní transplantace kostní dřeně. Jednalo se o identifikaci individuálních klonů dárcovských T lymfocytů vyvolávajících reakci štěpu proti hostiteli (graft-versus-host disease;GVHD) a dále o identifikaci dárcovských T lymfocytů vyvolávajících reakci štěpu proti nádoru (graft-versus-tumor; GVT). Pomocí smíšené leukocytární kultury, průtokové cytometrie a molekulární detekce T lymfocytárního receptoru beta bylo možno identifikovat individuální klony GVHD-specifických (Michálek et al. Lancet 2003, 361: 1183-5) a GVT-specifických T lymfocytů in vitro před samotnou transplantací a sledovat jednotlivé klony kvantitativně in vivo po transplantaci (Michálek et al. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 1180-4). Tento nový přístup lze aplikovat pro identifikaci a kvantitativní monitorování individuálních klonů T lymfocytů v alogenní i autologní situaci a využít jej při sestavování klinických studií využívajících adoptivní specifické imunoterapie nádorově-specifickými klony T lymfocytů. Částečně sponzorováno z grantu Leukemia Association of North Texas.
P – X. TRANSPLANTACE – postery P57. MOBILIZÁCIA PERIFÉRNYCH KMEŇOVÝCH BUNIEK(PKB) CYKLOFOSFAMIDOM 5g/m2+G-CSF. ZHODNOTENIE EFEKTIVITY A KOMPLIKÁCIÍ U 38 PACIENTOV Markuljak I.1, Baňáková J.1,Hudec J.2, Králiková E.1, Rudolfová I.2, Olvecká S.1, Wildová B.1,Wild A.1, Mociková K.1, Žarnovičanová M.1 l Hematologické oddelenie NsP FDR B.Bystrica, 2Oddelenie klinickej transfuziológie NsP FDR B.Bystrica Mobilizácia PKB cyklofosfamidom /CFA/ v kombinácii s rastovým faktorom /RF/ sa stala štandardnou v získavaní transplantátu pri autológnych transplantáciách PKB. Rôzni autori udávajú v mobilizačných režimoch rôzne dávky CFA /1,5 - 7g/m2/. Hoci so zvýšením dávky CFA stúpa aj výťažnosť zvyšuje sa aj toxicita podanej chemoterapie. Autori prezentujú v súbore 38 pacientov výťažnosť vo veľkoobjemových aferézach po režime CFA 5g/m2+G-CSF a komplikácie súvisiace s chemoterapiou / 32 pac. s plazmocytómom, 5 pac. s B-NHL, l s M.Hodgkin/. U 38 pacientov bolo vykonané celkovo 50 veľkoobjemových aferéz, ktoré boli zahájené 8.-18. /medián 12./deň od aplikácie CFA, ako RF bol použitý G-CSF /Neupogen alebo Granocyte 34/. Na l pacienta bolo nazbierané priemerne 4,329 x108/kg mononukleárnych buniek /MNC/, medián 3,98 /1,00-10,5/ x108/kg a CD34+buniek 10,64x10 6/kg, medián 6,24 /0,54-46,66/ x 106/kg. Na l pacienta boli vykonané l až 3 aferézy (medián l), pri l aferéze bolo nazbierané v priemere 8,08x106/kg/CD34+ bb., medián 5,13 / 0,36-46,66/ x 106/kg a MNC 3,28x108/kg,
medián 2,85 /0,56-10,5/ x108/kg. Cieľovú hodnotu na 1 transplantáciu 2,0x106/kg CD34+buniek sme nazbierali u 36 pacientov 94,7%. Komplikácie súvisiace s chemoterapiou sa vyskytli u 12 pacientov /31,6%/, najčastejšie febrility-5 pac., hnačky-4 pac, infekt HDC-3 pac., prechodne arytmie u 1 pac. Celkovo hodnotíme mobilizácie popísaným režimom efektívne s akceptovateľnou toxicitou. P58. MAGNETICKÁ BUNĚČNÁ SEPARACE A CHIMÉRISMUS T-LYMFOCYTÁRNÍ POPULACE PO ALOGENNÍ TRANSPLA-NTACI HEMATOPOETICKÝCH KMENOVÝCH BUNĚK PO NEMYELOABLATIVNÍCH PŘÍPRAVNÝCH REŽIMECH (NST) Heczko M., Skoumalová I., Raida L., Faber E., Jarošová M., Pikalová Z., Vlachová Š., Koupilová M., Lakomá I. HOK FN Olomouc Soubor pacientů a metody: U 9 pacientů po NST byl vyšetřován chimé-rismus periferní T-buněčné populace metodami molekulární biologie a molekulární cytogenetiky. Byla prováděna detekce mikroalelických vyso-ce variabilních polymorfismů -variable number of tandem repeats –metodou jednokolové PCR VNTR lokusů (YNZ22 17p13.3, D1S111 1q23, D1S80 1p35-p36, ApoB 2p23-p24) páru příjemce-dárce před transplantací a po transplantaci kmenových buněk. V případě rozdílného pohlaví dárce a příjemce byla použita fluorescenční in situ hybridizaceFISH (detekce SRY). Imunomagnetická izolace T-lymfocytů byla získána jako negativní depleční frakce použitím panT-cell isolation kit (kokteil paramagneticky značených protilátek anti CD11b, CD16, CD19, CD36 a CD56) na přístroji MIDI MACS. Výsledky: Bylo provedeno 17 separací T-lymfocytů z periferní krve. Průměrná celková čistota produktu představovala 66,8% u CD3 pozitivních buněk a 73,3% u CD2 pozitivních buněk (medián 80%, resp. 90%, směrodatné odchylky 26%, korelační koeficient 0,928 v Pearsonově testu). Produkt imunomagnetické separace byl použit k vyšetření chimérismu, u 4 pacientů metodou FISH (smíšený chimérismus u 1 pacienta a kompletní chimérismus u 3 pacientů). U dalších 5 pacientů byly srovnávány genotypy VNTR (chimérismus smíšený u 2 pacientů a kompletní chimérismus u 3 pacientů). Práce byla podpořena výzkumným záměrem MŠ č. MSN 15110004 a interním grantovým projektem LF UP v Olomouci č.12331102. P59. ANALÝZA CHIMERISMU KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZOU S FLUORESCENČNÍ DETEKCÍ U PACIENTŮ PO ALOGENNÍ TRANSPLANTACI HEMATOPOETICKÝCH KMENOVÝCH BUNĚK Horký O., Freiberger T., Mayer J. Centrum molekulární biologie a genové terapie, IHOK, FN Brno Vyšetřování chimerismu se stalo nedílnou součástí sledování pacientů, kteří podstoupili alogenní transplantaci hematopoetických kmenových buněk. Jako takové vyžaduje použití spolehlivé, přesné, citlivé, a zároveň poměrně rychlé metody detekce. Tyto nároky plně splňuje fragmentační analýza fluorescenčně značených PCR produktů.
Metoda je založena na amplifikaci vysoce polymorfních úseků genomové DNA (STR - short tandem repeats, respektive VNTR - variable number of tandem repeats), jež jsou analyzovány a kvantifikovány s využitím kapilárního elektroforetického přístroje (v našem případě ABI PRISM 310, Applied Biosystems). V rámci sledovaného informativního polymorfismu je stupeň smíšeného chimerismu určován poměrem plochy píku jedinečného pro příjemce a plochy píku(ů) dárce, a to na základě kalibrační křivky sestrojené z několika různých ředění předtransplantační příjemcovské DNA v DNA dárce. V období od září 2002 do konce března 2003, kdy se metoda fragmentační analýzy stala jedinou používanou k detekci chimerismu na našem pracovišti, bylo s použitím polymorfismů VNTR (PKU-HindIII, D1S80, ApoB-100, YNZ-22, HVR-Ig) a STR (TH, CSF1R, PLA2A, AR) vyšetřeno celkem 462 vzorků od 67 pacientů. Hlavní výhodou oproti původně používané elektroforéze na agarózovém gelu je především vyšší citlivost, přesnost a současně jednoduchost provedení. Jistá omezení mohou působit arteficiální píky a je potřeba počítat s vyššími náklady. V současné době probíhají v několika evropských laboratořích práce na uvedení kapilární elektroforézy s fluorescenční detekcí jako standardní metody pro analýzu chimerismu. Práce je podporovaná VZ MZ č. 00065269705. P60. SEKVENACE HLA-DRB1 GENU: PRVNÍ ZKUŠENOSTI SE ZAVEDENÍM METODY DO RUTINNÍ PRAXE Karvunidis T., Jindra P., Koza V. Hematologicko-onkologické odd. FN Plzeň, Česká republika Typizace HLA přímou sekvenací je považována za „zlatý standard“ a referenční typizační metodu. Pouze takto lze totiž získat kompletní sekvenci nukleotidů daného polymorfního genu. Metodika: Od 01/2003 je HLA-DRB1 gen v naší laboratoři rutinně a obligátně typizován přímou sekvenací u všech pacientů zařazených do programu nepříbuzenských transplantací a u jejich dárců. Do 03/2003 bylo takto typizováno celkem 30 vzorků, z čehož 21 (70%) tvořili naši pacienti a 9 (30%) dárci. K „all-alleles“ PCR amplifikaci exonu 2 DRB1 genu jsme užili komerčně dodávané kity. Použití biotinylizovaného 3’primeru v každé PCR umožnilo následnou izolaci ssDNA během vlastní sekvenační reakce prováděné pomocí T7 polymerázy s interním sekvenačním primerem. K analýze sekvence bazí bylo využito PAGE (8%) v automatickém sekvenátoru ALFexpress a příslušného softwaru. Výsledky: U všech vzorků (100%) analýza sekvence bazí odpovídala výsledkům jejich PCR-SSP typizace. 27 (90%) vzorků bylo heterozygotních a 3 (10%) homozygotní v DRB1 genu. V 10 příp. (33%) byl výsledek bez ambiguozit, u 20 (66%) s ambiguozitami (mimo „silent substitution“). Ambiguozity se vyskytovaly 12x (60%, z toho 1x u homozygota) pouze v 1 alele vyšetřovaného vzorku, 8x (40%) u obou typizovaných alel v rámci 1 vzorku. Ambiguozity byly zjištěny u následujících alel: DRB1*11– 8x (28,6% ze všech ambiguozit), DRB1*03– 8x (28,6%), DRB1*15 – 6x (21,4%), DRB1*04 – 4x (14,3%), DRB1*01 –1x (3,6%), DRB1*14 – v 1x (3,6%). Tyto ambiguozity nebylo možno stávajícím postupem rozlišit, polymorfismy v sekvenci bazí se nacházely mimo amplifikovanou a analyzovanou oblast exonu 2 DRB1 genu nebo kombinace alel heterozygotního vzorku znemožňovala jejich odlišení. Závěr: Naše první zkušenosti se sekvenací DRB1 genu potvrzují přesnost této metody.
Nevýhodou je časová i finanční náročnost oproti základním DNA metodám. Do budoucna počítáme s rozšířením i na další geny HLA.
P61. VARIANTY S HLA A KOMPLIKACE PO TRANSPLANTACI KOSTNÍ DŘENĚ Matějková E., Suttnar J., Vítek A., Dyr J.E. Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha Zavedli jsme metody ke stanovení rozpustných molekul HLA I. třídy (sHLA-I) a jejich hmotnostních variant v séru (testy ELISA a Western blot). Jednotlivé varianty sHLA by mohly být časným indikátorem imunitních reakcí spojených s potransplantačními komplikacemi jako jsou GVHD, rejekce štěpu nebo infekce. V séru se sHLA-I molekuly vyskytují min. ve třech formách o molekulární váze 43, 39 a 35 kD. V pilotní studii jsme sledovali hladiny sHLA-I a jejich hmotnostních variant u 32 hematologických nemocných (cca 300 krevních vzorků) po transplantaci kostní dřeně (TKD). Dynamika hladin sHLA a jejich variant po TKD měla individuální charakter závislý jak na potransplantačních komplikacích, tak na způsobu léčby. Při rozvoji GVHD (8 nemocných) docházelo ke zvyšování hladin sHLA, a to zejména 43kD variant. Hladiny 39, resp. 35kD variant v průběhu GVHD většinou poklesly (u 6 z 8 nemocných). Při infekčních komplikacích stoupaly koncentrace variant o nižší molekulární hmotnosti (5/6 pacientů), zatímco v relapsu onemocnění docházelo spíše k poklesu celkových hladin sHLA (3/4 nemocných). Výsledky nasvědčují odlišné úloze, resp. zdrojích jednotlivých variant sHLA při různých typech potransplantačních komplikací. Poděkování: Projekt byl řešen s finanční podporou VZ ÚHKT č. 237360001. Za technickou spolupráci děkujeme paní R. Kocingerové a paní O. Prouzové. P62. REGRESE OSTEOMYELOSKLEROSY U NEMOCNÉHO S MYELOFIBROSOU PO ALOGENNÍ TRANSPLANTACI PERIFERNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK Skořepová M., Žák P., Benešová P., Voglová J., Kmoníček M., Jebavý L., Malý J. Oddělení klinické hematologie, Fakultní nemocnice v Hradci Králové Úvod: Primární myelofibrosa je charakterizována extrémní fibrosou kostní dřeně, někdy i osteomyelosklerosou, splenomegalií a extramedulární hematopoesou. Metody: Autoři popisují případ 50ti-letého nemocného sledovaného od r. 1981 pro myelofibrosu. Z důvodů selhávání krvetvorby a progrese hepatosplenomegalie byla v březnu r. 2002 provedena alogenní transplantace periferních kmenových buněk (PKB). Jako přípravný režim byla zvolena kombinace busulfanu 3mg/kg D-7 až -4 s cyklofosfamidem 60mg/kg D-3 a -2. Dárcem PKB byl HLA-identický bratr. Histologickým vyšetřením kostní dřeně před transplantací byla zjištěna velmi výrazně zmnožená retikulární síť s významně redukovanou hematopoetickou tkání. Nález byl hodnocen jako osteomyelosklerosa. Sedmý měsíc po transplantaci PKB byla v histologickém vzorku nalezena jemná retikulární síť a obraz aktivace hematopoesy. Současně došlo i k výraznému ústupu hepatosplenomegalie a
k takovému zlepšení celkového stavu pacienta, které umožnilo jeho částečný návrat do práce. Toto zlepšení trvá doposud, tj. 13 měsíců po provedení transplantace. Nemocný má známky limitované chronické formy GVHD při léčbě cyklosporinem. Nebyl zaznamenán častější výskyt infekcí. Hodnoty krevního obrazu jsou uspokojivé a pacient nepotřebuje hemosubstituci. V kostní dřeni trvá stoprocentní dárcovský chimerismus. Závěr: Případ dokumentuje reversibilitu těžké osteomyelosklerosy a následné osídlení kostní dřeně funkční dárcovskou krvetvorbou. Ukazuje na možnost provedení alogenní transplantace jako účinné metody k zlepšení kvality života pacientů s touto chorobou. P63. VÝSKYT SKUPINY ANTIGENŮ HLA-B70 U ČESKÝCH PACIENTŮ S HEMATOLOGICKÝMI MALIGNITAMI Vraná M.1, Matějková E.1, Dobrovolná M.1, Vítek A.1, Sedláček P.2, Loudová M.1 1 Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha, 2II.dětská klinika 2. LF UK, Praha V letech 1999-2002 byla na našem pracovišti testována skupina 568 pacientů (většinou s hematologickými malignitami) potenciálně indikovaných k transplantaci hematopoetických kmenových buněk (HSC). Sérotypizací byl u pěti z těchto pacientů detekován antigen ze skupiny HLA-B70, která je jednou z málo běžných skupin široké rodiny antigenů HLA-B15. U čtyř z uvedených pacientů jsme provedli analýzu DNA. Užitím metody PCR-SSP jsme určili alely B*1518 u tří z nich a u jednoho vzácnou alelu B*1529. Tyto výsledky jsme jednoznačně potvrdili pomocí přímého sekvenování uvedených alel. Alela HLA-B*1529 byla podle dostupných informací popsána pouze v jednom případě, a to u jedince asijského původu. Studie prováděné na kavkazoidní populaci výskyt této alely dosud neuváděly. Alela HLA-B*1529 se od B*1518 liší v jednom páru bází v šedesátém sedmém kodonu. To vede k záměně aminokyseliny v exprimovaném proteinu v pozici, která je spoluodpovědná za vazbu peptidu. HLA-B*1518 se od nejběžnější B*1501 liší v dalších jedenácti párech bazí. Uvedené rozdíly mají vliv na rozlišovací schopnost imuno-kompetentních buněk. Případná neshoda mezi pacientem a dárcem HSC, způsobená neurčením některé neběžné alely u jednoho z nich, by mohla proto ovlivnit potransplantační průběh.
