IDENTIFIKASI ESTERIFIKASI RETINOL OLEH M~CROSOM DARI MUKOSA USUS HALUS AYAM DENGAN MENGGUNAKAN [ H] RETINOL Retno Murwani*
ABSTRAK IDENTlrlKASI USUS
BALUS
some
dengan
tat yang
DAN
AYAM
KARAXTERISASI
BERRASIL
[3H] retinol
dapat
selama
[ H] retinyl
palmitat
3
dan
konsentrasi
Konsentrasi
pada
dan
meningkat
albumin
RETINOL
cairan
sampai
30
uM.pH
sedikit
MUCOSA micro-
(HPLC).
Esterifika-
370C - 450C. Pembentukan
.
konsentrasi
DARI
Inkubasi
[3H] 'retinyl pal.i-
tinggi
antara
dengan
(DSA)
radioaktif
tekanan
temperatur
MICROSOKK
[ H] RETIONAL.
CoA memberikan
pada
OLKH
3
MKNGGUNAKAN
kromatografi
15 menit
palmitoyl-CoA
serum
DENGAN
dan palmitoyl
dideteksi
si meningkat
ESTERlrlKASI
DILAKUKAN
protein
microsome
optimal
sampai
esterifikasi
mempensaruhi
3
pembentukan
240
yaitu
[H]
us
6,6.
retinyl
palmitat.
ABSTRACT IDENTIrICATION INTESTINAL [3H]
retinol
ponding tion
palmitate
CHARACTERS
without
CoA
palmitate
was
retinyl
for
CoA
concentration was
ESTERIFICATION
EXPERIMENT. produced
palmitate and
15 minutes
enhanced
formation
IN THIS
as substrate
palmitoyl
increased
CoA
OF RETINOL
DEMONSTRATED
palmitoyl
formation
palmotoyl
retinyl
and
WAS
to that of authentic
occured
Esterification
and
AND
MUCOSA
with
at
slightly
and
temperatur
microsomal
up to 30
[3H]
indentified
microsome,
uM.
protein Optimal
dependent
BY MICROSOHE
Incubation retinyl
OF
CHICK
of microsome
with
palmitat
on (HPLC).
corres-
No esterifica-
heat-inactivated
microsome.
370C - 450C. [3H] concentration pH was
on bovine
reached
serum
retinyl
up to 240 at
albumin
6.6.
us
3
[ H]
(DSA).
PENDAHULUAN
Beta-carotene telah lama dikenal sebagai sumber vitamin A alami yang paling potensil di antara carotenoid (1). Beta-carotene ini diubah menjadi vitamin A terutama di dalam mukosa usus halus.
*
Fakultas
peternakan,
Universitas
Diponosoro
797
Retinal
hasil pemecahan
re~inol
\2}.
mukosa
dengan
sebelum
lemak
berhasi I
diteliti
dengan
asam
menunjukkan
mukosa
ayam.
Demikian
vitamin
A dalam
kandungan
retinol
hati.
ternyata
masih menjadi dari
konsumsi
meningkatkan
pertanyaan
pemecahan
diperlukan
indentifikasi
usus
Demikian
oleh kondisi
fraksi
(7). Dalam
hewan
berantai
vitamin
Untuk
adanya
aktivitas
diperlukan
dan
dapat
meningkatkan
A dalam
retinol
be-
SKLAN
peningkatan
konsumsi
beta-carohati.
Namun,
yang dihasilkan
oleh
mengetahui
peningkatan
hal
esterifikasi
karakterisasinya
bagi penelitian
beberapa
beta-carotene
bahwa
dipengaruhi
tersebut.
pada
pemecahan
esterifikasi juga
(3). Esteri-
microsome
diteliti
sel
panjang
penelitiannya
percobaan
simpanan
apakah
pula
optimal
dalam
telah
dalam
chylomicron
itu peningkatan
beta-carotene
beta-carotene
ayam.
pula
ransum
kembali
lemak jenuh
akti vi tas
Selain
lanjut menJadi
dan dikarakterisir
palmi tat
adanya
pemberian
tenepun
asam
(4, 5, 6), ditemukan
terutama
lebih
diesterifikasi
terutama
ini telah
mamalia
dalam
kemudian
direduksi
ke dalam tubuh dalam bentuk
retinol
reaksi (8)
asam
diserap
fikasi jenis
Retinol
beta-carotene
inilah dalam
untuk
maka
mukosa memper-
selanjutnya.
BAliAN DAN METODA Bahan Kimia. 23.5 Ciimmol. kan dengan diperiksa Gambar retinyl
[15-3HJ all trans retinol
Stok
[3HJ retinol
etanol
sehingga
distribusi
1).
Adanya
palmi tat
diperoleh
dapat
di
(1ihat uj i ARAT) memerlukan pemurnian Hasil pemurnian dengan HPLC diuapkan, etanol
dan
IB). Stok -80oC.
diperikasa [3UJ
Kristal kemurniannya si masksimum nya. Kristal suhu -BOoC.
798
ulang
retinol
retinol dengan
(Serva Shimadzu
pada panjang retinol
yang
lebih
dengan seki tar
mengganggu
cpm
(lihat
daerah
elusi
serta
HPLC
dan
standar
esteri fikasi
terhadap stok [3HJ retinol. dilarutkan kembali dalam radioaktivitasnya
telah dimurnikan Feinbiochima,
disimpan
berdasarkan
325 nm dan dihitung dalam
elanol
dan
(Gambar
pada suhu
Heidelberg,NY)
UV Spektrofotometer
ini dilarutkan
50.000
HPLC
spesifik
dan diencer-
uj i akti v itas
distritNJsi
gelombang
aktivitas
seperlunya
kurang
radioaktivitasnya radioakti vi tas
yang
dengan
ini diambil
deteksi adsorp-
konsentrasidisimpan
pada
Retinyl dilarutkan
palmi tat dalam
dilarutkan
beri
ransum
dengan
yang
Chemical
digunakan
Ayam
leghorn
A ad libitum
tambahan
hari.
dengan
Pure
palmitoyl-CoA
Industry)
(Sigma
Chem. Co. )
fosfat pH 7,4.
lain
Hewan.
vitamin
sepuluh
dicuci
(Wako
dan
memiliki
kemurnian
(99.5%).
Pada
bebas
selama
kimia
tinggi
Percobaan ransum
DPPD BSA
dalam bufer kalium
Bahan-bahan komersial
dan
etanol.
ayam
umur
satu
beta-carotene
Setelah
larutan
putih
selama
satu
sebesar
dibunuh,
hari
minggu.
ZO.OOO
ususnya
dan
lapisan
langsung
mukosa
langsung
diet
diambil
dan
NaCI dingin.
dipisahkan
dengan
dalam nitrogen
pengaduk.
Microso.e.
bufer
ke tabung
Tris-HCl
lain,
pH
Mukosa 7,5
sedangkan
lagi. Kedua
pat an 105,000
beku
yang
dingin dibuka
mukosa
beku
dihomogenisasi
mengandung
pelet
supernatan
g selama
satu
dicampur jam
pada
dalam tiga volume
disentrifus
kecepatan
dengan
ZOC. Pelet dilarutkan Uji aktivitas
ARAT
retinol
Acyl
didasarkan
mitat dari[3H]
105,000
kembali
Aktivitas
retinol (55.000
M
ini
bila
tidak
dengan
tiga
dan
ZOC.
5mM
disentrifus
selama
dengan
Supernatan
bufer kalium g
Sucrose,
dengan kecepatan ZO,OOO diambil dan dipindahkan
dan disentrifus suhu
kece-
dibuang,
fosfat pH 7,4 dan
satu
jam
pada
suhu
(ARAT).
Uj
dala bufer yang sama.
CoA: retinol pada
Acyl
terbentunya
dan palmitoyl-CoA cpm)
0,25
dihomogenisasi
pelet disuspensikan
[3H]
Lapisan
cair dan disimpan
MgS04, dan Z5 mM KCl. Homogenat disentrifus g selama 15 menit pada suhu ZOC. Supernatan sekali
NaCI Usus
dipakai.
Persiapan volume
di-
ug/kg
Persiapan Mukosa Usus. Usus dicuci dengan larutan untuk membersihkan sisa kotoran dan sisa-sisa makanan.
dibekukan
diberi
Kemudian
dan
10 nmol
Transferasi
i
radioaktif
retinyl
pal-
(4). Substrat
terdiri
dari
retinol.
Substrat
ditambah
DPPD (0,8 ug) dan diuapkan di bawah aliran gas NZ' Selanjutnya 1.25 mg BSA bebas asam-asam lemak dan kalium fosfat bufer pH 7,4 ditambahkan
sehingga
ditambahkan dimulai
dan
dengan
inkubasi ml etanol
hasil ekstraksi
volume
480 ul. Protein
diirikubasi selama penambahan
370 selama dingin
tercapai
5
menit
pada
10 ul palmitoyl-CoA
15 menit.
Reaksi
dan lemak diekstrak heksan diuapkan
dihentikan dengan
di bawah
microsome suhu
15 nmol) dengan
370C. Reaksi dengan
suhu
penambahan
2 x 3ml heksan.
aliran nitrogen
(70 ug)
2
Empat ml
dan residu-
799
nya dilarutkan
dalam
ke HPLC
dan
diambil
dan ditambah
nya dengan merupakan
difraksinasi
alat
"Liquid
High
30 detik.
scintilasi
Scintilation
Liquid
Injector"
ini diinjeksikan
Fraksi
retinyl
dan dicacah
Counter". palmi tat
palmitate
radioaktivitas-
Hasil
yang
radioakti vi tas setelah
Pressure
"Rheodyne
180 ul larutan
[3H]retinyl
"Recovery"
HPLC
setiap
larutan
persentase
inkubasi.
melalui
200 ul etanol.
yang diperoleh
terbentuk
selama
penguj ian >80%.
Chromatography.
(1000 ul loop)
Sampel
diinjeksikan
dan dipisahkan
komponen-
komponennya pada kolom Licrosorb ODS 5 uM (4,6 x 250 cm). Sampel dibawa keluar melalui kolom dengan larutan 100% metanol berkecepatan alir 2 ml/menit pompa
Waters
dan tekanan
Model
510.
1500 psi. Larutan
Sampel
dideteksi
dipompa
dengan
650-10 Liq.Chrom.Flourescence Spectrophotometer rekorder Hitachi Model 461-4203.
HASIL'DAN
lebih
9 - 11 menit. palmitat. tif
terlihat
Radioaktif
sebagai
pula
tersebut
etanol
radioaktif
Setelah
Stok yang dan secara
tersebut
Hitachi
direkam
pada
pemurnian,
seki tar 20-50 telah
dimurnikan
periodik
hasil
pelmitat
yang
30 detik
elusi
dengan
radiok-
palmi tat.
lebih pendek pendugaan
aktivitas
ARAT.
radioaktif
asing
semakin
lamanya
hasil
[3H)retinol
pe-
uji ARAT.
dimurnikan
dan
2.
hanya retinyl
muncul
untuk
kemurniannya.
pada
palmitat
merupakan
ini dipakai
etanol,
salah
dan menganggu stok
setelah' retinyl
menjadi
uji
metanol
dari
retinyl
meskipun
namun
melebar
daerah
diperiksa
retinyl
inkubasi
pada Gambar
dpm
pelarut
mengakibatkan
metanol,
radioaktif
sedangkan
Dengan
fraksinasi
dapat
radioaktivitas
adalahg
daerah
percohaan,
terlihat
pada
waktu
30 detik
ketelitian
retinol,
radioaktif
pelarut
selama
hasil pemurniannya
800
palmi tat
1.
ini terpisah di
tersebut
dengan
Untuk menjamin
tepat
asing
terpisah
nyimpanan
standar
dan
Distribusi
yang dipakai
pelarut
[3H)retinYI
Demikian
terdeteksi
bila pelarut
radioaktif
Gambar
"asing"
terdeteksi
dengan
[3Hlretinol. pada
2% radioaktif
Namun,
tersebut
Meskipun namun
Radioaktivitas
(3H)retinol
kurang
bantuan
PEMBAHASAN
Distribusi stok
dengan
detektor
pack
daerah
elusi
hanya memberikan ground
penelitian
count
saja
selanjutnya
~o
-
.-
20:10
.~~ :.: Q
:E
c...
10
:I 2
o
1
2
3
~
5
6
1
6
II 10 11 12 13
Time(minute) 1. Distribusi radioakti stok [3H] retinol. c==r, menunjukan kuantitas radioaktif, -,menunjukan standar retinol (1,5 - 3 menit) dan retinyl palmitat (7 -9 men it) .
Gambar
Identifik8si
Esterifik8si
mengidentifikasikan hasil
esterifikasi
dikatalis pengaruh
oleh
baan
pembentukan
subtrat
yang
5),
cobaan
6)
dengan
lebih
stok
sama
inkubasi
dengan
[3H]retinol
dengan
yang
[3H] retinyl
dan
microsome
sebagai
dicobakan
dengan
yang
(Gambar 2). Dengan
enzim
yang
yang
berbagai
(Tabel saja
1).
(Perco-
enzim
di tidak-aktifkan
palmi tat
background
sumber
maka
3), tanpa sumber telah
adalah
palmitoyl-CoA
[3H]retinol
(Per(Per-
radioakti vitas
diperoleh komponen
lengkap (Percobaan 2) terbentuk [3H] retinyl DPM. Hasil ini menunjukan bahwa esterifikasi apabila
ARAT. Untuk
palmitat
microsome,
inkubasi
(Percobaan
microsome
menghasilkan
kurang
pemurnian
dan
[3H]retinYl
dalam
komponen-komponen
heksan dari
yang Dik8t81is
[3H]retinol
terdapat
1), tanpa palmitoyl-CoA
cobaan
yang
dari
enzim
hadirnya
Hasil ekstraksi
bahwa
{3Hlretinol
pad a hasil
inkubasi
yang
palmitat sebesar 1553 retinol hanya terjadi
mengkatalis
reaksi
ter-
801
sebut tersedia toyl-CoA.
bersama-sama
dengan
subtrat
[3H] retinol
dan
palmi-
60
-
Q Q cQ -"' :a :E 'X a..
,,-...,
2040.-
5" r-
:U1l1~ -
o
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13
lime (minute)
Gambar 2. Distribusi radioaktif stok c3r:r) re- . tinol setelah pernumian dengan HPLC.D,rnemmjukkan kuanti tas radi oakti f
Gambar 3 memperlihatkan distribusi radioaktif hasil ekstraksi dengan heksan yang kemudian diinjeksikan ke HPLC. lnkubasi lengkap dengan microsome menunjukan ada radioakti vi tas pada fraksi retinol dan retinyl palmitat, sedangkan inkubasi lengkap dengan microsome yang telah dipanaskan hanya menunjukkan radioakti vi tas di daerah elusi retinol saja. Hasil ini menegaskan bahwa produk radioaktif yang
802
Tabel
1. P3ngaruh komponen inkubasi [ H]retinyl palmi tat
terhadp
pembentukan
Percobaan Komponen 2 3 4 5 lnkubasi 1 -------------------------------------------------------------------
+ + + + + +
[3H]retinol retinol DPPD BSA Palmitoyl-CoA Microsome
82
)[3H]retinyl Palmitat (DPM)
*
Microsome
terelusi
yang berasal
bila
substrat
et al.
yang ditemukan
terdapat
fraksi
pada
sebesar
bahwa
memiliki
Protein)
mudah
tanpa
43% dari
nunjukan
BSA
oleh
(4) dan HELGERUD
saja,
tetapi
63
dan palmitoyl-CoA. asam
Hal
palmitat
et al.
(5) dengan
membuktikan
pula bahwa
dari hasil ekstraksi
retinol
59
[3H]retinyl-palmitat
digantikan
[1-14C]palmitat
+ + + + + +
30 menit.
adlah
[15-3H]
+ + + + + +
juga
lemak tidak hanya di
daerah
fraksi
palmitat.
lnkubasi
diduga
retinol
berlabel
radioaktivitas
retinyl
661
palmitoyl-CoA
(9). Pene lit ian HELGERUD menggunakan
71
retinyl-palmitat
radioaktif
terjadi
+ + + + + +
pada suhu 800C selama
standar
dari
+ + + + + +
1533
dipanaskan
bersama
ini tidak
+ + + + + +
6
BSA
hasil
BSA
struktur
mengikat
mengalami
inkubasi
diperlukan
yang ditemukan
mampu
menghasilkan
diteliti
dalam
retinol
esterifikasi
kondisi berbagai
[3H]retinYl
optimal
palmi tat naik perlahan
sel-sel
cRBP
Gambar selama
kondisi
di
dalam
4 menunjukan awal 5 menit
bahwa
(10,11,12) lebih terlarut
Usu Ayam.
terhadap
Untuk
retinol,
maka
pembentukan
pembentukan
inkubasi
Binding
be bas
esterifikasi
inkubasi
BSA
retinol
bentuk
Jari Microsome
ini me-
sini.
(cellur Retinol
memungkinkan
daripada
palmi tat
4). Hal
inkubasi
usus halus dan hati
sehingga
Retinol
retinyl
(percobaan
sistim
bagi aktivitas
pengaruh
palmitat.
lengkap dalam
yang meyerupai
dalam larutan organik (9). BiEat-siEat EsteriEikasi memperoleh
radiokatif
dan naik
retinyl hampir
803
- 0x0 oc~r..
-g 10 o -
5 10-~
or-
X
~
C-
o 4 2 O'.~N'"""---
r~
5
Time
....
o
10
5
(minute)
Time
10
(minute)
Ganbar 3. Pembentukan (7+1)retinyl palmi tat oleh microsom usus ayam. A, Inkubasi lengkap dengan microsom; B, Inkubasi dengan microsom yang telah dip anask an ; (J, memmjukkan standar retinol (1~5 - 3 menit) dan retinyl 9 menit). Kondisi dan prosedur inkubasi palmi tat seperti tersebut dalam materi clan meto de
(r -
liner
dari
5 sampai
15 menit
menit hanya memberikan
sedikit
tinyl
A).
pelmi tat
konsentrasi dan
mencapai
(panel
protein
C). Est~rifikasi antara
temperatur
palmi tat sekitar BSA.
pada
retinol
kenaikan
terhadap
sampai
mencapai
lama dari
pembentukan
secara
Tanpa
optimal
dengan
(panel
60
15
[3H]re-
linier
inkubasi
palmitoyl-CoA
maksimal
45°C.
kondisi
naik
lebih
240 ug per
konsentrasi
37°C sampai 45% dari
lnkubasi
Esterifikasi
microsome
maksimum
inkubasi.
uM
B)
(panel
pada pH 6,6 dan meningkat BSA t~rbentuk yang
dicapai
[3H]retinYl dengan
mg/ml
KESIMPULAN Dari keseluruhan kasi
804
pembentukan
hasil di atas dapat
[3H]retinYl
palmitat
disimpulkan
dari
inkubasi
bahwa
identifi-
[3H]retinol
clan
palmitoyl-CoA Aktivitas oleh
beserta
microsom
esterifikasi
retinol
Acyl-CoA:retinol
Kondisi
optimal
ARAT
untukmenentukan
UCAPAN
ini
yang
saran
dapat
yang
terdapat
dikarakterisir
terhadap
sebesar-besarnya
segal a bimbingannya
kepada
dengan
berbagai
dalam
dan
dapat
perlakuan
Dr. dan
Kato bantuan
atas
selama
saran
teknis
dan
yang
kepada
penulis
HPLC.
microsome. digunakan
percobaan.
Soichi
melaksanakan
kritiknya; diberikan;
Prof. kepada
serta
Masushige
penelitiannya
Mr.
Mr.
memberi ij in untuk menggunakan fasili tas di Pusat University of Agriculture yang dipimpinnya.
DAFTAR
bantuan
pada mucosa usus ayam ini dikatalisis
traferase
aktivitas
dideteksi
TERIMKASIH
Terimaksih atas
acyl
dapat
Furusho
Ota
yang
Radioisotop
atas telah Tokyo
PUSTAKA
1. BAURENFEIND, J.C., Carotenoid vitamin A precursors and analog foods and feeds, J. Agric. Food Chem. 20-3 (1972) 456. 2. OLSON, J.A., The conversion of radioactive B-carotene vitamin A by the rat intestine in vivo, J. Biol. Chem. 2 (1961) 349. 3. GOODMAN, 2716.
D.S., Vitamin
A
metabolism,
Federation
Proc.
in
into 236-
39 (1980)
4. HEGERUD, P, PETERSON, L.B., and NORUM, K.R., Acyl CoA:retinol aclyltransferase in rat small intestine: its activity and some properties of the enzymic reaction, J.Lipid Res 23 (1982) 609.
5. HEGERUD, P, PETERSON, L.B., and NORUM, .K.R., Retinol esterification by microsome from the mucosa of human small intestine;evidence for acyi-coenzyme A retinol acyl transferase activity, J. Clin. Invest. 71 (1982) 747.
6.
MAC DONALD, P.N., and ONG, D.E., Evidence for a lecithinretinol acyltransferase activity in the rat small intestine, J.Biol Chem. 263-25 (1988) 12478.
805
7. FUTTERMAN, S., and ANDREWS, J.S. The composition of liver vitamin A ester and the synthesis of vitamin A ester by liver microsome,
J. BioI. Chem.
239-12(1964)4077
8. SKLAN, D., Carotene-cleavage activity in chick intestinal mucosa cytosol:association with a high-moleculer-weight lipid-protein aggregate fraction and partial characterization of the activity, British J. Nutr. 50 (1983)417 9. ROSS, A.C., Retinol esterification evidence for a fatty acyl coenzyme J.Biol Chern. 257-5 (1982) 2453.
by rat liver microsome; A: retinol acytransferese.
10. ONG, D.E., KAKKAD, B, and MAC DONALD, P.N., . Acyl-CoA-Independent esterification of retinol bound to cellular retinol-binding protein (type II) by microsome from rat small intestine, J.Biol.Chem 6(1987)2729 11. OGN, D.E., MAC DONALD, P.N., and GIBITOSI, A.M., Esterification of retinol in rat liver; Possible participication by cellular 'retinol-binding protein and cellular retinol-binding protein IL, J. BioI. Chern. 263-12 (1988) 5789. 12. YOST, R.W., HARRISON, E.H., and ROSS, A.C., Esterification by rat liver microsome os retinol bound to cellular retinolbinding protein, J. Biol.Chem 5(1989) 18693
806
-oo o -x
0
3
A
-
10 -'" 0xc O C-
B
-
,....
20
~
0._
01::1
2
,....
X
,....
-10 ~ C--
~
0;)
a...
o
o
o 5
is
25
o
35
Time (minute)
-
pH
0c-
F j!;6, 50 !;J5. 5 1:1
.
0
D
;2
(mg/ml)
o-J
60
Microsomal
2.5 10
°O2
120
240
~1
30
60
Palmitoyl-CoA
Protein f,ug}
Temperature r~C) 37 Bovine Serum Albumin 2
f(E
00
C
120 CuM)
0~0 ,....
aLl
ft
Gani>ar4. Pengaruh-penganil waktu (A); konsentrasi protein rnicrosorre(B); konsen trasi palrnitoyl-CoA(C); pH(D); suhu(EJ; clan. BSA(F). Setiap titik adalah nilai rata-rata hasil percobaan secara duplo yang telah dikoreksi dengan kontrol dari inkti:>asi tanpa rnicrosorre atau rengan rnicrosorre yang telah dipanaskan
