SIFAT LACTOBACILLI YANG DIISOLASI DARI USUS AYAM SEBAGAI PROBIOTIK

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2006

SIFAT LACTOBACILLI YANG DIISOLASI DARI USUS AYAM SEBAGAI PROBIOTIK (The Characteristic of Lactobacilli Isolated from Chicken Intestines as Probiotics) LILY NATALIA dan ADIN PRIADI Balai Penelitian Veteriner, Jl. R.E. Martadinatan No. 30, Bogor 16114

ABSTRACT Surface characteristics, such as the hydrophobic nature of the bacteria cell surface and bacteria coaggregation are used in vitro to evaluate the potentially probiotic strains of lactobacilli. Bacteria adhesion to tissue can determine the colonization capability of a microorganism. Through adhesive ability and colonization of tissues, probiotic microorganisms can prevent pathogen access by specific blockage on the cell receptor. Bacteria coaggregation is thought to facilitate beneficial nutritional interactions between coagregation partners. Five strains of Lactobacillus, identified as Lactobacillus salivarius, Lactobacillus raffinolactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus sporogenes were selected among probiotic isolates from the gut of normal healthy chickens and tested for their in vitro probiotic properties. Coaggregation between Lactobacillus spp., Clostridium perfringens type A, Salmonella enteritidis and Escherichia coli were also studied. Cell surface hydrophobicity and coaggregation ability were found to be high for Lactobacillus acidophilus. The high values indicate greater ability to adhere to epithelial cells. Self aggregation or autoaggregation were also observed in Lactobacillus spp. culture isolates. Lactobacillus spp were able to retain their beneficial characteristics in the presence Salmonella, and Escherichia coli such as presence of lectin-like and ability to grow and compete. Criteria for in vitro selection of probiotic bacteria must be developed since they may reflect certain in vivo effects on the host. The selected organism such as L. acidophilus can be considered as potential ingredients for chicken probiotic intended to control salmonellosis, colibacillosis and clostridial necrotic enteritis. Key Words: Lactobacillus, Chicken Probiotic, Hydrophobicity, Aggregation ABSTRAK Karakteristik permukaan seperti hidrofobisitas permukaan sel bakteri dan koagregasi bakteri, telah digunakan secara in vitro untuk mengevaluasi probiotik potensial dari lactobacillus. Adhesi bakteri ke jaringan dapat menentukan kemampuan kolonisasi mikroorganisme. Dengan kemampuan adhesif dan berkolonisasi di jaringan, mikroorganisme probiotik dapat mencegah agen patogen masuk dengan memblokir secara spesifik sel reseptornya. Koagregasi bacteria dapat mefasilitasi interaksi nutrisi secara menguntungkan diantara pasangan koagregasinya. Dalam penelitian digunakan lima galur Lactobacillus, yang diidentifikasi sebagai Lactobacillus salivarius, Lactobacillus raffinolactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum dan actobacillus sporogenes yang telah diseleksi dari isolat-isolat probiotik asal dari usus ayam sehat dan telah diuji terhadap sifat-sifatnya probiotiknya secara in vitro. Koagregasi juga telah diamati antara Lactobacillus spp., Clostridium perfringens type A, Salmonella enteritidis dan Escherichia coli. Tingkat hidrofobisitas permukaan sel dan kemampuan koagregasi ternyata cukup tinggi untuk L. acidophilus. Nilai yang tinggi ini menunjukkan besarnya kemampuan untuk menempel pada sel epithel. Agregasi sendiri (autoagregasi) juga terjadi pada isolat kultur Lactobacillus spp. Dalam penelitian, Lactobacillus spp dapat mempertahankan sifat yang menguntungkan seperti produksi lectin-like, mampu tumbuh bersaing dengan Salmonella, dan E. coli. Kriteria untuk seleksi bakteri probiotik harus dikembangkan mengingat hal ini dapat mencerminkan pengaruhnya secara in vivo dalam induk semangnya. Mikroorganisme yang telah diseleksi seperti L. acidophilus dapat digolongkan dalam probiotik potensial untuk digunakan pada ayam yang ditujukan untuk pengendalian salmonellosis, colibacillosis dan clostridial necrotic enteritis. Kata Kunci: Lactobacillus, Probiotik Ayam, Hidrofobisitas, Agregasi

801


PENDAHULUAN Probiotik adalah suplemen berupa mikroorganisme hidup yang mempunyai efek menguntungkan bagi induk semangnya dengan cara memperbaiki keseimbangan mikroba dalam usus (KOZASA, 1989, FULLER, 1989, DUNNE et al., 2001). Istilah probiotik digunakan untuk menjelaskan mikroorganisme hidup yang aktifitasnya berlawanan dengan antibiotik (TOURNUT, 1989). Beberapa galur probiotik dapat diseleksi berdasarkan beberapa hal antara lain seperti sifatnya sebagai agen antimikrobial aktif terhadap mikroorganisme patogen, kemampuan hidrophobiknya, kemampuannya menstimulasi sistem kekebalan, mempunyai aktifitas ensim yang mendukung absorpsi nutrien esensial dan ionion, dan dihasilkannya bahan yang mampu menempel pada epithelium. Karakter permukaan, salah satu sifat yang dapat dipelajari secara in vitro, telah digunakan untuk mengevaluasi probiotik seperti lactobacillus. Sifat permukaan bakteri berhubungan dengan kemampuannya menempel pada berbagai substrat. Adhesi bakteri adalah tahap awalnya yang kemudian menentukan kemampuan kolonisasi bakteri tersebut. Dengan kemampuan adhesi dan berkolonisasi di jaringan, mikroorganisme probiotik dapat mencegah invasi agen patogen dengan memblokir secara spesifik sel reseptornya (OTERO et al., 2004). Untuk itu perlu dipelajari karakter utama seperti hidrofobisitas dari permukaan sel bakteri. Hidrophobisitas permukaan dari mikroorganisme dapat mempunyai peranan integral dalam patogenesis penyakit (SELTMANN et al., 1986). Sifat hidrofobik sel bakteri dapat mempengaruhi interaksi fagositosis, dan penempelan pada jaringan tubuh induk semang (VAN OSS, 1978; EDEBO et al, 1980). Hidrophobisitas permukaan berbagai sel mikroba dapat ditentukan dengan mengukur kemampuan penempelan sel terhadap berbagai polimer, atau afinitas bakteri terhadap pelarut hidrokarbon dalam sistem 2 fase (daya lekat dan pertumbuhan pada hidrokarbon) (ROSENBERG et al., 1980), perlekatan bacteria pada buccal epithelial dan sel mukosa intestine (NORDE et al., 1993, ROSENBERG et a.l, 1983, SMYTH et al., 1978). Perlekatan (adherence) bakteri yang diikuti

802

terjadinya kolonisasi pada induk semang yang peka adalah suatu hal penting dan diperlukan untuk memulai terjadinya patogenesis penyakit. Interaksi hidrofobik telah diketahui sebagai salah satu penentu untuk mengidentifikasi galur patogenik suatu bakteri (DAS dan KAPOOR, 2004). Koagregasi bakteri dapat memfasilitasi interaksi nutrisi secara menguntungkan diantara pasangan koagregasinya, sedangkan autoagregasi dapat secara substansi meningkatkan kemampuan kolonisasi lactobacilli untuk menetap dalam waktu singkat. Protein atau glikoprotein nonimunologik (lectin) dapat terlibat dalam fenomena adhesi dengan molekul yang spesifik (karbohidrat, glikoprotein atau glikolipid). Lectin merupakan adhesin yang dapat memblokir adhesi dari suatu mikroorganisme patogen dengan kompetisi dengan reseptor intestin (SLIFKIN dan DOYLE, 1990). Tidak semua bakteri dari saluran pencernaan mempunyai struktur lectinlike dalam dinding selnya. Bakteri yang memproduksi lectin-like akan mengaglutinasi sel ragi yang sudah mendapat perlakuan (GUSILS et al., 1999). Dalam tulisan ini akan diamati karakteristik hidrofobisitas permukaan sel Lactobacilli yang telah diisolasi dari saluran pencernaan ayam sehat. Fenomena koagregasi di antara galur Lactobacilli yang mengaglutinasi ragi, dan galur Lactobacilli yang menghasilkan bahan lectin-like juga diamati. MATERI DAN METODE Isolasi Lactobacilli dari ayam Lactobacilli diambil yang dipergunakan dalam penelitian ini berasal dari mukus sekum ayam dewasa yang sehat. Mula-mula isolasi mikroorganisme probiotik dilakukan dengan menggunakan Brain Heart Infusion (BHI) broth dan Robertson’s Cooked Meat medium selama 2 hari pada suhu 37ºC. Kultur bakteri yang tumbuh diisolasi kembali dan kemudian diseleksi. Bakteri yang diambil untuk calon probiotik adalah bakteri yang bersifat Gram positif dan non patogen (Panigraphy dan Ling, 1990, Natalia dan Priadi, 2005). Kultur bakteri yang sudah dimurnikan kemudian diidentifikasi dengan menggunakan API 50 CHL dan API 20 A (Bio Merieux, France). Dari seluruh isolat


bakteri yang diidentifikasi, dipilih 5 isolat Lactobacillus yang kemudian akan diuji sifatsifatnya sebagai probiotik. Hidrophobisitas permukaan sel Hidrofobisitas permukaan sel bakteri (Lactobacilli) ditentukan dengan sedikit modifikasi dari uji perlekatan bakteri pada hidrokarbon. (ROSENBERG et al., 1980; ROSENBERG, 1984; DAS dan KAPOOR, 2004). Dalam penelitian ini, khususnya digunakan nhexadecane adherance assay (HAA). Secara singkat, isolat bakteri yang diuji ditumbuhkan pada 37°C dalam MRS (De Man, Rogosa, Sharpe) broth (Oxoid, CM 359), dengan menggunakan kontrol positif Mycobacterium sp. Dan sebagai kontrol negatif Lactobacillus acidophillus. Bakteri dipanen pada awal pertumbuhan phase logaritmik (kembali 18 jam), dicuci 2 kali, disuspensikan dalam NaCl fisiologis sampai densitas optikalnya pada 600 nm mencapai 0,5 sampai 0,7. Terhadap tabung yang berisi 3 ml sel yang sudah dicuci ditambahkan sebanyak 0,8 ml pelarut hidrokarbon (hexadecane). Campuran dicampur dengan vortex selama 90 detik. Tabung kemudian dibiarkan selama 15 menit hingga terjadi pemisahan menjadi 2 fase larutan. Dan OD dari fase aqueous diukur dengan menggunakan spektrofotometer. Hidrophobisitas dikalkulasi dari 3 ulangan sebagai persentase pengurangan OD dari suspensi mula-mula karena pemisahan sel menjadi lapisan hidrokarbon. Uji agregasi Uji agregasi dilakukan menurut JANKOVIC et al., (2003). Pada uji ini Lactobacillus spp. ditumbuhkan pada MRS broth (Oxoid, CM 359) selama semalam pada suhu 37°C. Agregasi dinilai positif jika pada broth didapatkan agregat yang jelas (partikel seperti pasir) membentuk endapan didasar tabung, dan supernatan akan terlihat jernih. Uji koagregasi Uji koagregasi dilakukan sesuai dengan prosedur yang dikembangkan oleh GUSILS et

al. (1999). Kultur bacteria dipanen dengan sentrifugasi pada 10.0000 x g selama 10 menit dan dicuci 2 kali dengan PBS, pH 7,4 yang per liter mengandung 8 g NaCl, 0,34 KH2PO4, dan 1,21 K2HPO4. Sel disuspensikan kembali dalam buffer yang sama hingga mencapai OD akhir pada 550 nm: 0,60 + 0,02 (diukur dengan spektrofotometer). Suspensi dari 8 galur bakteri dikombinasikan dalam pasangan untuk uji koagregasi, yang dalam hal ini koaggregasi dievaluasi dengan pemeriksaan visual akan adanya flokulasi setelah 4 jam pada suhu ruangan. Volume 4 ml dari suspensi sel yang sudah dicuci dari tiap galur dari pasanganpasangan tersebut yang dapat memperlihatkan flokulasi diperlakukan serupa dan digunakan sebagai kontrol. Setelah pencampuran, 4 ml volume suspensi ditransfer ke cuvette steril, dan OD pada 550 nm dimonitor selama 24 jam pada suhu ruangan untuk menentukan kuantitas perlekatan bakteri. Koaggregasi dapat diobservasi sebagai pengurangan dalam OD550nm dibandingkan dengan OD550nm dari suspensi sel murni. Produksi bahan lectin like oleh Lactobacilli dalam kultur tunggal dan campuran Produksi bahan lectin like ditentukan dengan modifikasi uji aglutinasi yang mencampurkan sedimen sel berbeda dari kultur tunggal dan campuran Lactobacilli dengan sel ragi Saccharomyces cerevisiae (GUSILS et al., 1999; ANNUK et al., 2001). Sel ragi disiapkan dengan melakukan preinkubasi dengan PBS dengan glutaraldehida (1 mg/ml) selama 1 jam pada suhu 25ºC. Sel ragi kemudian dicuci dua kali dengan PBS, diinkubasi 30 menit pada 25ºC dengan PBS yang mengandung glycine (10mg/ml). Selanjutnya dicuci dua kali lagi dengan PBS. Sel ragi yang sudah mendapat perlakuan disimpan pada 4ºC sebagai suspensi dalam PBS (1 X 105 sel per ml) dan ditambahkan sodium azide 0.02%. Aglutinasi dilakukan pada mikroplat steril yang mempunyai dasar bulat (U bottom), yaitu mencampurkan 40 µl suspensi mikroorganisme dengan 10 µl PBS (pH 7,4) dan 10 µl suspensi S. cerevisiae (108 sel per ml PBS) yang telah diberi perlakuan dengan glutaraldehida. Hasil dibaca dengan pemeriksaan secara visual. Hasil positif

803


ditunjukkan dengan adanya lapisan bahan sel yang teragregasi di dasar lubang. Sedangkan hasil negatif ditunjukkan adanya titik bahan seluler di pusat dasar lubang. Hasil negatif dapat dikonfirmasi dengan memiringkan mikroplat pada sudut lebih dari 45º, dan perhatikan pergerakan bahan seluler di dasar lubang. Produksi bahan lectin like oleh Lactobacilli dalam kultur tunggal dan campuran Produksi bahan lectin like ditentukan dengan modifikasi uji aglutinasi yang mencampurkan sedimen sel berbeda dari kultur tunggal dan campuran Lactobacilli dengan sel ragi Saccharomyces cerevisiae (GUSILS et al., 1999; ANNUK et al., 2001). Sel ragi disiapkan dengan melakukan preinkubasi dengan PBS dengan glutaraldehida (1 mg/ml) selama 1 jam pada suhu 25ºC. Sel ragi kemudian dicuci dua kali dengan PBS, diinkubasi 30 menit pada 25ºC dengan PBS yang mengandung glycine (10mg/ml). Selanjutnya dicuci dua kali lagi dengan PBS. Sel ragi yang sudah mendapat perlakuan disimpan pada 4ºC sebagai suspensi dalam PBS (1 X 105 sel per ml) dan ditambahkan sodium azide 0.02%. Aglutinasi dilakukan pada mikroplat steril yang mempunyai dasar bulat (U bottom), yaitu mencampurkan 40 µl suspensi mikroorganisme dengan 10 µl PBS (pH 7,4) dan 10 µl suspensi S. cerevisiae (108 sel per ml PBS) yang telah diberi perlakuan dengan glutaraldehida. Hasil dibaca dengan pemeriksaan secara visual. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya lapisan bahan sel yang teragregasi di dasar lubang. Sedangkan hasil negatif ditunjukkan adanya titik bahan seluler di pusat dasar lubang Hasil negatif dapat dikonfirmasi dengan memiringkan mikroplat pada sudut lebih dari 45º, dan perhatikan pergerakan bahan seluler di dasar lubang. HASIL DAN PEMBAHASAN Dari usus ayam sehat berhasil diisolasi berbagai bakteri yang bersifat Gram positif dan non pathogen, yaitu., Lactobacillus salivarius, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sporogenes,

804

Lactobacillus raffinolactis, Bacillus spp. dan Streptococcus sp. Dalam penelitian ini digunakan masing-masing satu isolat dari 5 species Lactobacillus, yaitu L. raffinolactis, L. salivarius, L. acidophilus, L. plantarum, dan L. sporogenes. Mikroorganisme yang diseleksi dalam penelitian ini ditujukan untuk memilih probiotik yang dapat digunakan pada ayam secara per oral (dapat juga dicampurkan pada pakan). Probiotik ini diharapkan dapat digunakan untuk mengurangi atau menghilangkan penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisme patogen yang masuk melalui mukosa saluran pencernaan seperti Clostridial necrotic enteritis (disebabkan oleh Clostridium perfringens), Salmonellosis, colibacillosis dan sebagainya. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa Lactobacillus sp. dapat melindungi host terhadap infeksi atau masuknya agen patogen ke saluran pencernaan. Lactobacillus menghasilkan hidrogen peroksida dan asam organik seperti asam laktat dalam jumlah tinggi, sehingga akan menurunkan pH lingkungannya dan juga sekaligus menekan tumbuhnya patogen. Berbagai tipe antibiotik juga dapat dihasilkan oleh Lactobacillus spp. contohnya, L. acidophilus dapat memproduksi lactacin dan L. plantarum dapat menghasilkan plantaricin (ANDERSON et al., 1988; RACCACH et al., 1989; EL NAGGAR, 2004). Persentase hidrophobisitas dikalkulasi dengan menggunakan persamaan sbb: % hidrophobisitas: (OD550nm awal – OD 550nm akhir

=

X 100 OD 550nm awal

dmana: OD awal

=

OD akhir =

Absorbans suspensi bakteri tanpa penambahan hexadecane Absorbans sesudah penambahan hexadecane

Hasil dianggap positif kuat (++) jika hidrofobisitas di atas 75%, sedang jika 25 sampai 75% dan negatif jika berada di bawah 25%. Beberapa spesies Lactobacillus mempunyai protein lapisan permukaan atau surface layer protein (SLP) yang terikat dengan amplop sel. Lapisan permukaan tersebut terdiri atas suatu glycoprotein, dan disebut S-protein yang


membentuk 2 dimensi lapisan kristalin pada permukaan sel. Lapisan S (S layer) dari Lactobacilli penting untuk kemampuannya melekat pada permukaan seperti juga SLP yang mencerminkan hidrofobisitas dari permukaan sel lactobacillus (RODRIGUEZ et al., 2004). Pada kenyataannya, adhesi lactobacilli pada permukaan dipengaruhi oleh hidrofobisitas permukaan sel lactobacillus yang tergantung juga pada lingkungan seperti pH dan kekuatan ion. Dalam penelitian ini, hidrofobisitas permukaan sel bakteri ditentukan dengan uji perlekatan bakteri pada hidrokarbon. Hasil pengamatan (lihat Tabel 1) menunjukkan bahwa hidrofobisitas yang tertinggi diantara spesies lactobacillus yang diuji adalah L. acidophilus. JIN et al. (2001) menyatakan bahwa persentase hidrofobisitas suatu bakteri berkorelasi dengan kemampuan flokulasinya. Hal ini menunjukkan bahwa L. acidophilus (MCS 20) juga mempunyai kemampuan flokulasi yang baik. Tabel 1. Hidrofobisitas dari berbagai spesies Bakteri yang diuji

Hidrofobisitas (%)

Lactobacillus salivarius (MCS 17)

26,32

Lactobacillus raffinolactis (MCS 10)

18,63

Lactobacillus acidophilus (MCS 20)

55,81

Lactobacillus plantarum (MCS 10 LB)

29,59

Lactobacillus sporogenes (MCS 28)

6,535

Salmonella Enteritidis (AP/01)

12,57

Escherichia coli (SP/06)

29,92

Clostridium perfringens tipe C (CWC /JP)

19,46

Adhesi bakteri pada permukaan dapat dilihat sebagai 2 tahap kejadian yaitu: adhesi yang reversibel karena tekanan yang lama dan terjadi interaksi lanjutan berupa kontak langsung antara permukaan seperti interaksi hidrophobik karena struktur permukaan bacteria. Adhesi awal bakteri terhadap permukaan microlayer tergantung pada

beberapa faktor dan interaksi hidrofobik merupakan satu hal yang sangat penting (DAHLBACK et al., 1981). Hal yang menguntungkan dari Lactobacillus spp. antara lain adalah kemampuanmya mengkolonisasi jaringan epitelium usus. Jadi, jika galur Lactobacillus tersebut tidak mempunyai daya lekat (adherence capacity) pada epitelium, tetapi dapat melakukan koagregasi dengan mikroorganisme yang mempunyai daya lekat, maka mereka dapat berguna untuk digunakan dalam saluran pencernaan (GUSILS, et al., 1999). Keberadaan dan kemampuan Lactobacillus spp. untuk bertahan hidup dalam saluran pencernaan disebabkan antara lain oleh kemampuannya untuk melakukan agregasi (HUIS IN’TVELD et al., 1994, JANKOVIC, et al., 2003). Protein yang merupakan agregating promoting factor (APF) sangat penting untuk Lactobacillus sp. yang secara langsung dapat mengendalikan bentuk selnya, dan secara tidak langsung terlibat dalam proses sintesis peptidoglycan, exopolysaccharide, lipotechoic acid dan techoic acid (JANKOVIC et al., 2003). Dalam Gambar 1 terlihat agregasi Lactobacillus salivarius. Agregasi positif jika setelah kultur Lactobacillus spp. dalam broth diinkubasikan pada suhu 37ºC semalam terlihat jernih dengan agregat sel-sel menggumpal pada dasar tabung. Agregasi dinilai negatif (nonaggregating) jika kultur yang inkubasi semalam memperlihatkan kekeruhan yang nyata.

A

B

Gambar 1. Aggregating dan nonaggregating Lactobacillus sp. (A): Agregasi negatif (B): Aregasi positif

805


Pada Tabel 2 dapat dilihat hasil uji agregasi dari berbagai isolat Lactobacillus spp. Uji ini sangat sederhana dan dapat diandalkan untuk jika akan melakukan seleksi sejumlah besar galur untuk dijadikan probiotik (EL-NAGGAR, 2004). Tabel 2. Hasil uji agregasi dari Lactobacillus spp. Hasil uji agregasi

Isolat Lactobacillus spp. L. acidophilus MCS 20

+++

L. salivarius MCS 17

+++

L. raffinolactis MCS 10

-

L. lactis subsp. Lactis MCS 26

-

L. plantarum MCS 10LB

++

Koagregasi diperkirakan dapat memfasilitasi interaksi nutrisi yang menguntungkan antara pasangan koagregasinya, dan fenomena umum ini dapat berperanan penting dalam usaha mencari probiotik yang baik karena dapat mencegah infeksi bakteri patogen (GUSILS et. al., 1999). Kemampuan Lactobacillus untuk dapat melakukan koagregasi dengan bakteri patogen dapat dilihat pada Gambar 2, 3 dan 4. Dalam gambar-gambar ini dapat dilihat bahwa

L. acidophilus mempunyai kemampuan yang sangat baik setelah inkubasi selama 25 jam. Densitas optikal terlihat sangat menurun sesuai dengan jalannya waktu inkubasi. Pengamatan dengan bakteri patogen seperti E. coli, Salmonella enteritidis dan Clostridium perfringens tipe A juga telah dilakukan untuk mempelajari sifat yang menguntungkan dan juga mengukur kemampuan agregasinya (Gambar 2, 3 dan 4). Terlihat L. acidophillus mempunyai kemampuan lebih dibandingkan lactobacillus lainnya dan dapat menghambat E. coli, C. perfringens tipe A dan S. enteritidis. Terutama L. acidophilus efektif dalam menghambat C. perfringens tipe A. L. salivarius, L. raffinolactis, L. plantarum dan L. sporogenes juga terlihat kurang mampu menghambat E. coli. Dari hasil ini dapat dinyatakan bahwa L. acidophilus merupakan probiotik yang potensial untuk digunakan. Mekanisme proteksi yang melibatkan koagregasi antara Lactobacillus spp. dan bakteri patogen saluran pencernaan juga terjadi sama seperti yang terjadi antara Streptococci dan Actinomycetes di rongga mulut, atau lactobacillus yang berkoagregasi dengan patogen saluran urine sehingga terjadinya mekanisme pertahanan induksemang terhadap infeksi (EL-NAGGAR, 2004, SPENCER, 1994).

Densitas optikal (550 nm)

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2 0

5

10

15

20

25

30

Waktu (jam) L. salivarius

L. raffinolactis

L. lactis subsp. lactis

L. sporogenes

L. acidophilus

Gambar 2. Koagregasi antara Lactobacillus spp. dengan Clostridium perfringens tipe A

806



0,6

0,5

0,4

0,3

0,2 0

5

10

15

20

25

30


L. raffinolactis


L. sporogenes

L. acidophilus

Gambar 3. Koagregasi antara Lactobacillus spp. dengan S. Enteritidis

Densitas optikal (550nm)

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2 0

5

10

15

20

25

30


L. raffinolactis


L. sporogenes

L. acidophilus

Gambar 4. Koagregasi antara Lactobacillus spp, dengan E. coli

Pada Gambar 5. dapat dilihat agregasi di antara Lactobacillus spp. L. acidophilus dapat melakukan agregasi paling baik dibandingkan dengan Lactobacillus spp. lainnya Dalam penelitian ini dan juga hasil peneliti lainnya (WADSTROM et al., 1987; KMET, et al., 1995; EL-NAGGAR, 2004) menunjukkan bahwa galur

Lactobacillus yang mempunyai aktivitas koagregasi yang tinggi juga akan memperlihatkan kemampuan autoaggregasi yang tinggi pula. Uji agregasi dan koagregasi merupakan cara yang mudah dan dapat diandalkan untuk menyeleksi berbagai galur bakteri probiotik (EL-NAGGAR, 2004). Adanya

807


probiotik yang mampu menunjukkan agregasi sendiri atau autoagregasi (lihat Gambar 6.) dan sifat adhesif akan menyebabkan probiotik tersebut mampu melakukan kolonisasi pada epitel mukosa dengan pembentukan bacterial film yang berperan dalam menyingkirkan bakteri patogen dari mukosa usus (BORIS et al., 1988). Pada Gambar 6 sangat jelas terlihat kemampuan L. acidophilus yang sangat potensial digunakan sebagai probiotik. L. acidophilus ini mampu melakukan agregasi dibandingkan dengan Lactobacillus lain yang diuji. Menurut ANNUK et al. (2001), sebagian besar galur L. acidophilus, dapat mempertahankan kemampuan dan sifat autoaglutinasinya karena mempunyai S layer yang mengikat erat pada permukaan selnya. Mekanisme molekuler tentang cara lactobacilli menempel pada sel epitel mukosa usus masih banyak dipelajari. Beberapa peneliti juga menyatakan ada peranan karbohidrat yang ada dalam amplop sel Lactobacillus (Gram positif) yaitu teichoic acids, lipoteichoic acids dan polisakarida (BORIS et al., 1999; ANNUK, et al., 2001; CORCORAN et al., 2005). Beberapa peneliti juga menyatakan bahwa daya lekat (adherence) Lactobacillus pada epitel mukosa dimediasi oleh lectin (RICKARD et al., 2000; JIN, et al., 2001). Lectin adalah protein atau glikoprotein nonimunologik yang dapat terlibat dalam fenomena adhesi dengan molekul yang

spesifik (karbohidrat, glikoprotein atau glikolipid). Struktur lectin yang multimeric menyebabkan lectin mempunyai kemampuan untuk mengaglutinasi sel atau membentuk presipitat dengan glikokonjugat dengan cara yang serupa seperti reaksi antigen-antibodi (ANNUK et al., 2001). Pada Tabel 3 dapat dilihat bahwa semua Lactobacillus spp. yang diuji menghasilkan lectin. Dan pencampuran kultur lactobacillus dengan kultur Salmonella dan E. coli tidak menghambat produksi lectin oleh lactobacillus. Adanya bahan lectin like pada lapisan luar bakteri Lactobacilli akan dapat membantu bakteri melakukan kolonisasi karena lectin mempunyai kemampuan untuk mengikat karbohidrat yang spesifik (ESHDAT et al.,1978; COHEN et al., 1985; GUSIL et al., 1999). Karbohidrat lactobacilli menunjukkan monosakarida seperti N-acetylglucosamine dan N-acetylgalactosamine yang ada pada glycocalyx dalam jumlah cukup besar (ONYSHCHENKO, et al., 1999). Adanya bahan ini dan monosakarida lain dalam glycopolymers pada glycocalyx lactobacilli berhubungan dengan sifat adhesif dari galur lactobacilli yang bersangkutan. Demikian pula telah diketahui bahwa adanya media glukosa atau gula-gula yang dapat dimetabolisir akan dapat memperbaiki daya hidup probiotik lactobacilli (CORCORAN et al., 2005).

0.6 0.55 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0

5

10

15

20

25

Wak t u ( jam )

L salivarius & L. raffinolactis

L. salivarius dan L. lactis sub sp lactis

L. salivarius & L. sporogenes

L. acidophilus & L.lactis sub sp lactis

L.acidophilus & L.sporogenes

L. acidophilus & L. salivarius

L. raffinolactis & L. acidophilus

L. raffinolactis & L. lactis sub sp lactis

L. raffinolactis & L. sporogenes

Gambar 5. Koagregasi di antara Lactobacillus spp.

808



0,6

0,5

0,4

0,3

0,2 0

5

10

15

20

25

30

Waktu (jam) L. salivarius MCS 17 L. acidophillus MCS 20 L. sporogenes M 28

L. raffinolactis MCS 10 L. lactis subsp. lactis MCS 26

Gambar 6. Auto agregasi dari Lactobacillus spp.

Tabel 3. Produksi bahan lectin-like dalam kultur tunggal dan campuran

Kultur tunggal L. salivarius L. acidophilus L. plantarum L. sporogenes Kultur campuran L. acidophilus dan S. enteritidis L. salivarius dan S. enteritidis L. plantarum dan S. enteritidis L. sporogenes dan S. enteritidis L. salivarius dan E. coli L. acidophilus dan E. coli L. plantarum dan E. coli L. sporogenes dan E. coli

Waktu inkubasi (jam) 6 12

2

4

-

-

-

-

-

-

18

24

-

+ -

+ + + +

-

+ + -

+ + + + + + + +

+ = aglutinasi positif; - = aglutinasi negatif

Hal-hal yang telah diamati tentang sifat Lactobacillus spp. dapat menjelaskan tentang penggunaan Lactobacillus sebagai probiotik. Seleksi bacteria probiotik seperti Lactobacillus spp. harus dilakukan karena dapat mencerminkan pengaruh probiotik tersebut secara in vivo dalam induk semangnya. Ada

beberapa uji lain seperti uji resistensi terhadap empedu, uji resistensi terhadap antibiotik dan lain sebagainya juga dapat dilakukan untuk seleksi lebih lanjut terhadap probiotik. Dalam penelitian ini, mikroorganisme yang telah diseleksi seperti L. acidophilus MCS 20, dapat digolongkan dalam probiotik potensial untuk

809


pencegahan infeksi patogen dalam saluran pencernaan dan uji autoagregasi, Lactobacilus acidophilus MCS 20 kembali menunjukkan hasil yang terbaik. Pada pengamatan produksi bahan lectin like oleh lactobacilli, L. Salivarius menunjukkan yang terbaik, walaupun lactobacilus lain juga mempunyai kemampuan memproduksi dalam waktu yang lebih lama. Dari hasil pengamatan terhadap beberapa sifat lactobacilus, diatas ternyata Lactobacillus acidophilus MCS 20 merupakan probiotik potensial yang diharapkan dapat digunakan dalam pakan ayam guna mengendalikan penyakit seperti salmonellosis, colibacilosis dan clostridial necrotic enteritis. KESIMPULAN Lactobacillus acidophilus MCS 20 dalam penelitian ini mempunyai hidrofobisitas sel permukaan tertinggi diantara spesies lactobacillus lainnya yang diuji. Dalam uji koagregasi antara Lactobacillus spp. dan Cl. Perfringens, E. coli dan S. enteritidis, diantara lactobacilli yang diuji, Lactobacillus acidophilus MCS 20 menunjukkan hasil yang terbaik. Pada uji koagregasi antar Lactobacillus dan uji autoagregasi, Lactobacilus acidophilus MCS 20 kembali menunjukkan hasil yang terbaik. Pada pengamatan produksi bahan lectinlike oleh lactobacilli, L. salivarius menunjukkan yang terbaik, walaupun lactobacillus lain juga mempunyai kemampuan memproduksi dalam waktu yang lebih lama. Dari hasil pengamatan terhadap beberapa sifat lactobacillus, diatas ternyata Lactobacillus acidophilus MCS 20. merupakan probiotik potensial yang diharapkan dapat digunakan dalam pakan ayam guna mengendalikan penyakit seperti salmonellosis, colibacilosis dan clostridial necrotic enteritis. DAFTAR PUSTAKA ANDERSON, R.E., M.A. DAESCHEL and H.M. HASSAN. 1988. Antibacterial activity of plantaricin SIK-83, a bacterocin produced by Lactobacillus plantarum. Biochem. 70: 381 – 390. ANNUK, H., S.O. HYNES, S. HIRMO, M. MIKELSAAR and T. WADSTROM. 2001. Characterisation and differentiation of lactobacilli by l lectin typing. J. Med. Microbiol. 50: 1069 – 1074.

810

BORIS, S., J.E. SUAREZ, F. VAZQUEZ and C. BARBES. 1988. Adherence of human vaginal lactobacilli to vaginal epithelial cells and interaction with uropathogens. Infect. Immun. 66(5): 1985 – 1989. COHEN, P.S., J.C. ARRUDA, T.J. WILLIAMS and D.C. LAUX. 1985. Adhesion of a human fecal Escherichia coli to mouse colonic mucus. Infect. Immun. 48:139 – 145. CORCORAN, B.M., C. STANTON, G.F. FITZGERALD and R.P.ROSS. 2005. Survival of probiotic in acidic environments is enhanced in the presence of metabolizable sugars. Appl. Environ. Microbiol. 71(6): 3060 – 3067. DAHLBACK, B., M. HERMANSSON, S. KJELLBERG and B. NORKRANS. 1981. The hydrophobicity of bacteria an important factor in their initial adhesion at the air water interface. Arch. Microbiol. 128: 267 – 270. DAS, S.C. and K.N. KAPOOR. 2004. Efect of growth medium on hydrophobicity of Staphylococcus epidermidis. Indian J. Med. Res. 119: 107 – 109. DUNNE, C., L.O. MAHONY, L. MURPHY, G. THORNTON, D. MORRISSEY, S.O. HALLORAN, M. FEENEY, S. FLYNN, G. FITZGERALD, C. DALY, B. KIELY, G.C. O’SULLIVAN, F. SHANAHAN and J.K. COLLINS. 2001. In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings. Am. J. Clin. Nutr. 73 (suppl.): 386S – 392S EDEBO, L., E. KIHLSTROM, K.E. MGNUSSON and O. STENDAHL. 1980. Cell Adhesion and Motility. A.G.G. CURTIS and H. PITTS (Eds.). Cambridge University Press. Pp. 124 – 132. EL-NAGGAR, M.Y.M. 2004. Comparative study of probiotic cultures to control the growth of Escherichia coli O157 : H7 and Salmonella typhimurium. Biotech. 3(2):173 – 180. ESHDAT, Y., I. OJEK, Y. JASHOWN-GAN, N. SHARON and D. MIRELMAN. 1978. Isolation of a mannose specific lectin from E. coli and its role in the adherence of the bacteria to epithelial cells. Biochem Biophys. Res. Commun. 85: 1551 – 1559. GREENE, R.T., C. LAMMLER and M. SCHMITT. 1992. Surface hydrophobicity of Stahylococcus intermedius and Staphylococcus hyicus. Res. In Vet. Sci. 52: 90 – 96. GUSILS, C., A.P. CHAIA, S. GONZALEZ and G. OLIVER. 1999. Lactobacilli isolated from chicken intestines: Potential use as probiotics. J. Food. Protect. 2(3): 252 – 256.


HUIS IN’TVELD, J.H.J., R. HAVENAAR and P. MARTEAU. 1994. Establishing A Scientific Basis for Probiotic. R & D Trends Biotechnol. 12: 6 – 8. JANKOVIC, I., M. VENTURA, V. MEYLAN, M. ROUVET, M. ELLI and R. ZINK. 2003. Contribition of aggregation-promoting factor to maintenance of cell shape in Lactobacillus gasseri 4B2. J. Bacteriol. 185(11): 3288 – 3296. JIN, Y.L., L.L. RITCEY and R.A. SPEERS. 2001. Effect of cell surface hydrophobicity, charge and zymolectin density on the flocculation of Saccharomyces cerevisiae. J. Am. Soc. Brew. Chem. 59(1): 1 – 9. KMET, V., M. CALLEGARL, V. BOTTAZZI and L. MORELLI. 1995. Aggregation-promoting factor in pig intestinal Lactobacillus strains. Lett. Appl. Microbiol. 21: 351 – 353. KOZASA, M. 1989. Probiotics for animal use in Japan. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 8(2): 517 – 531. NATALIA, L. dan A. PRIADI. 2005. Penggunaan probiotik untuk pengendalian clostridial necrotic enteritis pada ayam pedaging. JITV 10(1): 71 – 78. NORDE, W. and J. LYKLEMN. 1993. Protein adsorption and bacterial adhesion to solid surfaces: A colloid chemical approach. Colloids Surf. 38: 1 – 13. ONYSHCHENKO, A.M. K.S. KOROBKOVA, N.K. KOVALENKO, S.K. KASUMOVA and I.H. SKRYPAL. 1999. The role of carbohydrate composition of the glycocalyx in some species of lactobacilli in the manifestation of their adhesive properties. Microbiol Zh. 61: 22 – 28. OTERO, M.C., V.S. OCANA, N.M. ELENA. 2004. Bacterial surface characteristics applied to selection of probiotic microorganisms. Methods Mol. Biol. 268: 435 – 440. PANIGRAPHY, B. and Y. LING. 1990. Differentiation of pathogenic and nonpathogenic Escherichia coli isolated from poultry. Avian Dis. 34: 941 – 943. RACCACH, M., R. MCGRATH and H. DAFTARIAN. 1989. Antibiosis of some lactic acid bacteria including Lactobacillus acidophilus towards Listeria monocytogenes. Int. J. Food Microbiol. 9: 25 – 32.

RICKARD, A.K., S.A. LEACH, C.M. BUSWELL, N.J. HIGH and P.S. HANDLEY. 2000. Coaggregation between aquatic bakteri is mediated by specific growth phase dependent lectinsaccharide interactions. Appl. Envinron. Microbiol. 66(1): 431 – 434. RODRIGUEZ, V.V., H.J. BUSSCHER, W. NORDE, J. DE VRIES and H.C. VAN DER Mei. 2004. Dynamic cell surface hydrophobicity of Lactobacillus strains with and without surface layer proteins. J. Bacteriol. 186(19): 6647 – 6650. ROSENBERG, E., A. GOTTLIEB and M. ROSENBERG. 1983. Inhibition of bacteria adherence to hydrocarbons and epithelial cells by emulsan. Infect. Immun. 39: 1024 – 1028. ROSENBERG, M. 1984. Bacteria adherence to hydrocarbons:a useful technique for studying cell-surface hydrophobicity. FEMS Microbiology letters 22: 289 – 295. ROSENBERG, M.D., D. GUTNICK and E. ROSENBERG. 1980. Adherence bacteria to hydrocarbons: A simple method for measuring cell-surface hydrophobicity. FEMS Microbiology letters 9: 29 – 33. SELTMANN, G., T. PAL and H. TSCHAPE. 1986. Surface hydrophobicity of plasmid-carrying virulent Shigella flexneri and their avirulent variants. J. Basic Microbiol. 26: 283 – 287. SLIFKIN, M. and R. DOYLE. 1990. Lectins and their application to clinical microbiology. Clin. Microbiol. Rev. 3: 197 – 218. SPENCER, R.J. and A. CHESSON. 1994. The effect of Lactobacillus spp., on the attachment of enterotoxigenic Escherichia coli to isolated porcine enterocytes. J. Appl. Bacteria. 77: 215 – 220. TOURNUT, J. 1989. Application of probiotics to animal husbandry. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 8(2): 551 – 556. WADSTROM, T., K. ANDERSON, M. SYDOW, L. AXELSSON, S. LINDGREN and B. GULMAR. 1987. Surface properties of lactobacilli isolated from small intestine of pigs. J. Appl. Bacteia. 62: 513 – 520. VAN OSS, C.J. 1978. Phagocytosis as a surface phenomenon. An. Rev. in Microbiol. 32: 19 – 39.

811

SIFAT LACTOBACILLI YANG DIISOLASI DARI USUS AYAM SEBAGAI PROBIOTIK

Recommend Documents