HYDRAGEL 30 LIPO + Lp(a)

HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) Ref. 4104



2009/12

HYDRAGEL 7, 15 & 30 LIPO + Lp(a) - 2009/12

POUŽITÍ KITU

HYDRAGEL 7, 15 a 30 LIPO + Lp(a) kit je určen ke stanovení profilů liporoteinů a ke skríningu Lp(a) v lidském séru.

Každý agarózový gel je určen k analýze : • 7-mi vzorků (HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) kit), • 15-ti vzorků (HYDRAGEL 15 LIPO + Lp(a) kit), • 30-ti vzorků (HYDRAGEL 30 LIPO + Lp(a) kit).

Určeno pro diagnostické použití in vitro. Schválení FDA pro aplikaci v USA v jednání.

PRINCIP TESTU1-14

Analýza je provedena elektroforezou na agarózových gelech o pH 7.5. Separované lipoproteiny jsou obarveny roztokem Sudanové černi. Přebytek barvičky je odstraněn alkoholovým roztokem. Vyhodnocení je buď vizuální nebo denzitometrické (relativní kvantifikace jednotlivých zón).

Lipoproteiny jsou cirkulující komplexy sestávající z lipidů a proteinů. Jejich klasifikace je založena na vlastnostech, jež umožňují stanovení následujícími separačními technikami : • utracentrifugace (využívá rozdílných hustot), • zónová elektroforéza (el. náboj), • molekulární filtrace polyakrylamidovou elektroforézou (velikost molekuly). Klasifikace hyperlipemie je založena na hodnocení zónové elektroforézy. Na agarózových gelech se lipoproteiny dělí na následující frakce : • Chylomikrony : velké molekuly s vysokým obsahem triglyceridů, přítomny v plazmě jako malé částice – způsobují opalescenci séra a zůstávají v místě aplikace. • Beta-lipoproteiny (LDL-Low Density Lipoproteins) migrují v pozici beta-2 globulinů. • Pre-beta lipoproteiny (VLDL-Very Low Density Lipoproteins) : mají vyšší mol. hmotnost, nižší denzitu a jsou rychlejší než LDL – migrují v pozici beta-1 globulinů. • Rychlé pre-beta lipoproteiny (pokud jsou přítomny) jsou tvořeny Lp(a), které jsou velikostí a složením podobné LDL. Pokud jsou přítomny v dostatečně vysoké koncentraci, migrují mezi VLDL a HDL. • Alfa lipoproteiny – HDL (High Density Lipoproteins) : nejrychlejší frakce. Migrují v pozici alfa-2 globulinů.

Elektroforéza lipoproteinů je běžnou technikou rutinně používanou klinickými laboratořemi ke stanovení abnormalit lipoproteinů a rizikových faktorů ICHS v séru. Rozlišení lipoproteinů dle jejich elektroforetické pohyblivosti je základem Fredricksonovy klasifikace, dle níž lze léčit poruchy metabolizmu lipoproteinů dietou a medikamentózně.

Předností gelů HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) a HYDRAGEL LIPO + Lp(a) 15/30 je, současné určení lipoproteinového profilu i rychlé pre-beta Lp(a) frakce.

REAGENCIE A MATERIÁL OBSAŽENÝ V KITECH HYDRAGEL 7, 15 A 30 LIPO + Lp(a) POLOŽKY Agarózové gely (připraveny k použití) Houbičky s pufrem (připraveny k použití) Sudanová čerň (zásobní roztok) Aplikátory (připraveny k použití) Tenké filtrační papíry

KAT. Č. 4104 10 gelů 10 bal. po 2 ks 1 lahv. 20 mL 1 bal. po 10 ks (7 zubů) 1 bal. po 10 ks


PRO OPTIMÁLNÍ VÝSLEDKY : Všechny reagenty ze stejné sady musí být vždy používány společně a podle pokynů v příbalovém letáku. PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK.


1. AGARÓZOVÉ GELY Příprava

Připraveny k použití, každý gel obsahuje agarózu 0.8 g/dL, pufr – pH 7.5 ± 0.1 a přídavné látky, nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Nosné medium pro elektroforézu lipoproteinů.

Skladování, stabilita a známky poškození

Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech – šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Lze skladovat při pokojové teplotě (15 - 30 °C) nebo v chladničce (2 - 8 °C). NEMRAZIT! Zamezit prudkým změnám teploty – neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby exspirace vyznačené na krabici či na obalech gelů. Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). - 110 -

SEBIA NÁVOD - Czech


2. PUFROVANÉ STRIPY Příprava

Pufrované houbovité proužky (stripy), které jsou připraveny k okamžitému použití. Každý obsahuje : pufr o pH 7.5 ± 0.1, azid sodný a přídatné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. POZOR : pufr ve stripech obsahuje 0.30 % azidu sodného. Nepolknout! Toxické! Při požití konzultovat s lékařem. Azid sodný, pokud se dostane do kontaktu s mědí, olovem a kyselinami, může vést k tvorbě explozivních nebo toxických sloučenin. Proto při likvidaci roztoku, např. vylitím do výlevky, vyplachovat velkým množstvím vody!

Použití

Slouží jako rezervoár pufru a zajišťují kontakt mezi gelem a elektrodami.


Skladovat při pokojové teplotě nebo v chladničce. Jsou stabilní nejméně do data exspirace vyznačeného na balení kitu či na štítcích jednotlivých balení. NEMRAZIT! Nepoužívejte stripy z otevřených balení nebo stripy vyschlé!

3. SUDANOVÁ ČERŇ Příprava

Pracovní roztok se připravuje nejméně 30 minut před použitím. Přidávej přesné objemy jednotlivých složek v následujícím pořadí a šetrně promíchejte : 1) Čistého alkoholu 96 % - 120 mL, Sudanová čerň – zásobní roztok (6.6 g/dL v dimetylformamidu), 1.45 mL ; čekejte na úplné rozpuštění barvičky ; destilovaná nebo deionizovaná voda 100 mL ; nejméně 30 minut míchat na magnetické míchačce, nebo, 2) Isopropanol (100 %) - 100 mL, Sudanová čerň-zásobní roztok (6.6 g/dL v dimetylformamidu), 1.45 mL, čekejte na kompletní rozpuštění barvičky ; destilovaná nebo deionizovaná voda 120 mL ; minimálně 30 minut míchat na magnetické míchačce. Nenechávejte v blízkosti tepelného zdroje. Na každé barvení připravujte nový roztok. DŮLEŽITÉ : Použití jiného alkoholu nebo alkoholu denaturovaného může vést k atypickým výsledkům. Při použití čistého alkoholu jiné koncentrace je nutno upravit objemy alkoholu i vody.

POZOR : Nevdechovat! Obsahuje dimetylformamid. Při nedostatečném dýchání použijte dýchací přístroj. Nepolykat ! Při polknutí konzultujte ihned s lékařem. Pokud se dostane do očí nebo na kůži, vyplachujte velkým množstvím vody a vyhledejte lékařskou pomoc!

Použití

K barvení gelů s rozdělenými lipoproteiny po elektroforéze.


Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo při 2 - 8 °C v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. Pracovní roztok vydrží 12 hodin v uzavřeném zásobníku.

4. APLIKÁTORY Použití

K nanesení vzorků - připraveny k použití.

Skladování

Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.

5. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Použití

Proužky tenkého filtračního papíru, na jedno použití. Jsou určeny k odsání přebytečné tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků.

Skladování

Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.

POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ

1. ODBARVOVACÍ ROZTOK (& PROMÝVACÍ ROZTOK č. 1) Příprava

Nejméně 15 minut před použitím, připravte 440 mL roztoku obsahujícího (obj. / obj.) : 1) 45 % čistého alkoholu a 55 % destilované nebo deionizované vody, nebo, 2) 30 % čistého izopropanolu a 70 % destilované nebo deionizované vody. DŮLEŽITÉ : Použití jiného alkoholu nebo etanolu denaturovaného může vést k atypickým výsledkům. Při použití čistého alkoholu jiné koncentrace je nutno upravit objemy alkoholu i vody.

Použití

Slouží k čištění barvícího modulu HYDRASYSu před jeho použitím pro barvení HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) a HYDRAGEL LIPO + Lp(a) 15/30 gelů. K odbarvení, tj. odstranění přebytku barvičky z gelu a z jeho zadní strany.


Skladovat při pokojové teplotě v těsně uzavřené láhvi. Stabilní jeden měsíc při laboratorní teplotě. Roztok odtraňte při změně vzhledu, tj., mikrobiální kontaminací vzniklého zákalu. - 111 -


2. PROMÝVACÍ ROZTOK č. 2 Příprava

Připravte 1 litr roztoku obsahujícího (obj./obj.) : 1) 75 % čistého etanolu a 25 % destilované nebo deionizované vody, nebo, 2) 70 % čistého izopropanolu a 30 % destilované nebo deionizované vody. Lze použít i denaturovaný etanol.

Použití

K vypláchnutí barvícího prostoru HYDRASYSu po obarvení gelů.


Skladujte při pokojové teplotě v těsně uzavřené láhvi. Stabilní tři měsíce při lab. teplotě. Vyřaďte z používání při změně vzhledu, tj. při bakteriální kontaminací způsobeném zákalu.

3. FLUIDIL Příprava

Fluidit (SEBIA, kat. č. 4587,1 lahv. 5 mL) – připraveno k použití.

Použití

K ředění viskózních nebo zakalených vzorků – např. sér obsahujících kryoglobulin nebo kryogel.


Při teplotě místnosti. Stabilní do doby exspirace vyznačené na štítku. Nesmí obsahovat sraženiny.

NUTNÉ VYBAVENÍ

1. HYDRASYS Systém SEBIA, kat. č. 1200, kat. č. 1201, kat. č. 1202, kat. č. 1203, kat. č. 1210 nebo kat. č. 1211. 2. Manuální nebo automatizovaný mikropipetor SEBIA HYDRAPLUS, kat. č. 1216 nebo SEBIA HYDRAPLUS, kat. č. 1217, 2 jako alternativu k nanášení vzorků na aplikátory vzorků. 3. Vlhká Skladovací Komora kat. č. 1270, dodávaná s HYDRASYS systémem. 4. Accessory Kit HYDRASYS LIPOPROTEINS SEBIA, kat. č. 1263. 6. Pipety – 10 µL a 200 µL a 1000 µL. 5. Držák gelů – SEBIA, kat. č. 1278. 7. Denzitometr pro skenovaní gelových ploten 82 x 51 mm nebo 82 x 102 mm při 570 nm nebo se žlutým filtrem (HYRYS SEBIA, GELSCAN SEBIA, DVSE SEBIA nebo PHORESIS softwearem pro plošný skener, viz pokyny výrobce.

ANALYZOVANÉ VZORKY

Odběr a skladování vzorků

Pro analýzu se doporučuje používat čerstvé vzorky séra. Doporučuje se odebírat vzorky od pacientů, kteří jsou nejméně 12 hodin nalačno. Odběr musí být v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky uložte do chladničky (2 až 8 °C) co nejdříve po odběru maximálně na 3 dny. Vzorky nezmrazujte. Nepoužívejte vzorky upravené heparinem. Skladování snižuje mobilitu pre-ß-lipoproteinu a dochází tak k podhodnocení odpovídající frakce. Mobilita rychlého pre-ß-lipoproteinu - nebo-li lipoproteinu Lp(a) - skladováním ovlivněna není.

Příprava vzorků

Používejte neředěná séra. Při skladování v ledničce nebo po zmrazení, se některá séra mohou stát viskózními nebo se vyvine zákal – v takovém případě přidejte 25 µL Fluidilu k 75 µL séra a 15 vteřin promíchejte na Vortexu. Obvykle tato séra obsahují kryoglobulin způsobující problémy (špatná difúze skrze zuby aplikátoru) při nanášení vzorku.

PRACOVNÍ POSTUP

HYDRASYS systém je poloautomatický, multiparametrický přístroj. Automatizované kroky zahrnují zpracování agarózových gelů v následujícím pořadí : aplikace vzorků, elektro-foretické dělení, sušení, barvení, odbarvování a konečné osušení. Manuální kroky zahrnují různé manipulace se vzorky a gely a nastavení přístroje. DODRŽUJTE PEČLIVĚ POKYNY UVEDENÉ V MANUÁLU PŘÍSTROJE!

I. NASTAVENÍ MIGRACE

1. Zapněte HYDRASYS. 2. Umístěte aplikátory – jeden aplikátor pro HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) (na 7 vzorků) a HYDRAGEL 15 LIPO + Lp(a) (15 vzorků) nebo 2 aplikátory při použití HYDRAGEL 15/30 LIPO + Lp(a) (30 vzorků) na rovnou plochu očíslováním jamek vzhůru (viz Obr. 1). - naneste 10 µL vzorku do každé jamky. Každý aplikátor musí být naaplikován nejdéle ve dvou minutách. - vložte aplikátory do vlhké komůrky zoubky směrem nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček), nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut po nanesení posledního vzorku. Komůrka se může vložit až na 8 hodin do chladničky a analýza může být tak po tuto dobu odložena. Detaily viz v příbalovém letáku vlhké skladovací komůrky. 3. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte migrační rámrček s elektrodami a nosičem aplikátorů nahoru. POZOR : Nikdy nezavírejte víko pokud je migrační rámeček nahoře! - 112 -

HYDRAGEL 7, 15 & 30 LIPO + Lp(a) - 2009/12 4. Z menu na přístroji zvolte program migrace "7 LIPO + Lp(a)" pro HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) nebo "15/30 LIPO + Lp(a)" pro HYDRAGEL LIPO + Lp(a) 15/30. 5. Vyjměte z ochranného obalu pufrované stripy – uchopením za plastikové konce. Děrovanými konci plastikového vyztužení je upevněte na kovové výstupky elektrodového nosiče. Plastikové vyztužení stripů musí směřovat k nosiči (viz Obr. 2). 6. Vybalte agarózovou plotnu HYDRAGEL. - Plotnu rychle osušte tenkým filtračním papírem tak, že jej po povrchu gelu narolujete, aby přilnul k celé ploše a odsál přebytek tekutiny. Papír ihned odstraňte. POZOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu – hrozí dehydratace gelu! - Naneste 120 µL destilované nebo deionizované vody při použití HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) nebo 200 µL pro HYDRAGEL LIPO + Lp(a) 15/30 na dolní třetinu rámečku vyznačeného na migrační ploše. - Opřete gelovou plotnu (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (viz Obr. 3). - Nyní gel ohněte a pokládejte do kontaktu s kapkou vody tak, aby se voda rozprostřela rovnoměrně pod celým gelem bez vzduchových bublin. Gel musí být zarovnán s vyznačeným rámečkem (viz Obr. 3). 7. Snižte migrační rámeček dolů. V této pozici se pufrované stripy nedotýkají gelu. NA MIGRAČNÍ RÁMEČEK NETLAČTE DOLŮ SILOU. 8. Aplikátory nyní vyjměte z vlhké skladovací komůrky. Manipulujte s nimi za pomoci ochranného rámečku. - Odlomte ochranný rámeček chránící zuby aplikátoru. - Pro analýzu 7 a 15 vzorků umístěte aplikátor na nosič do pozice č. 4. - V případě analýzy 30 vzorků umístěte 2 aplikátory na nosič do pozic č. 1 a 7. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátoru musí směřovat k operátorovi (viz Obr. 4).

9. Uzavřete víko migračního modulu. 10. Stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou (levá strana klávesnice) je procedura ihned zahájena. DŮLEŽITÉ : Přesvědčte se, zda není blokován otvor vzduchové ventilace na pravé straně přístroje.

MIGRACE – POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ

• Všechny části migračního rámečku jsou sníženy – stripy s pufrem i aplikátory jsou v kontaktu s povrchem gelu – probíhá aplikace vzorků do gelu. • Nosič aplikátorů vzorků se zvedne, části s elektrodami nesoucí stripy s pufrem zůstávají v kontaktu s povrchem gelu. • Proběhne migrace při konstantních 7.5 W pro HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a), nebo při 15 W pro HYDRAGEL LIPO + Lp(a) 15/30 při 20 °C, řízených pomocí Peltierova efektu až do 100 Vh (po asi 30 minut). • Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. • Teplota migrační plochy stoupá až na 60 °C na dobu 15-ti minut, po kterou se gel suší. • Po vysušení gelu zazní zvukový signál informující o odblokování víka migračního modulu. Po otevření víka teplota dále klesá až na 20 °C (za méně než 5 minut), kdy je možné začít další migraci. POZN. : Víko migračního modulu zůstává uzavřeno během všech migračních kroků.

II. PROMYTÍ Č. 1 : MODUL PRO BARVENÍ

1. Umístěte prázdný držák gelů do modulu na zpracování a barvení gelů. DŮLEŽITÉ : Před zahájením mycího programu zkontrolujte : - kontejner na odbarvovací roztok obsahuje nejméně 220 mL odbarvovacího roztoku ; - kontejner na odpad je vyprázdněn (není plný). Pro připojení přívodů reagencií se řiďte pokyny zobrazovanými na obrazovce (zvolte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte zablokovat nepoužité přívody.

2. Zvolte mycí / barvící program "LIPO + Lp(a) & LIPO" z menu přístroje. Stisknutím tlačítka "START" (zelená šipka na pravé straně klávesnice) započnete cyklus. Během promývání zůstává tento oddíl uzamčen. Odemčení je signalizováno slyšitelným pípnutím. Z modulu na zpracování / barvení vyjměte držák gelů.

III. PŘÍPRAVA ZPRACOVÁNÍ GELU 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Otevřete víko. Vyjměte aplikátor(y) a odstraňte jej(je). Zvedněte migrační rámeček, vyjměte pufrované stripy uchopením za plastikové konce a odstraňte je. Vyjměte usušený gel pro další zpracování. Po každém použití otřete podélně elektrody i migrační plochu vlhkým hadříkem. Otevřete držák gelu, umístěte usušenou gelovou plotnu (gelovou stranou nahoru) do žlábků obou tyček a držák uzavřete. Ujistěte se, že plotna je umístěna správně uvnitř držáku (viz Obr. 5). 7. Vložte držák gelu do modulu na zpracování / barvení gelu. DŮLEŽITÉ : Před nastartováním programu pro zpracování a barvení zkontrolujte : - zda kontejner pro barvení je naplněn alespoň 220 mL barvícího roztoku ; - zda kontejner pro odbarvování obsahuje nejméně 220 mL odbarvovacího roztoku ; - zda kontejner na odpad je prázdný (není plný). Pro připojení přívodů reagencií se řiďte pokyny zobrazovanými na obrazovce přístroje (zvolte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte zablokovat nepoužité přívody.

8. Stiskněte "START" (zelená šipka na pravé straně klávesnice).

Během barvení, odbarvování, oplachování a sušení gelu, zůstává tento modul uzavřen. Po ochlazení se ozve pípnutí, signalizující odemknutí – ventilace běží až do vyjmutí držáku gelu. - 113 -


IV. DOKONČENÍ ZPRACOVÁNÍ GELU

1. Vyjměte držák s gelem, otevřete ho a vyjměte osušený gel Je-li třeba, očistěte zadní plastikovou podpůrnou část gelové plotny měkkým hadříkem nebo buničinou namočenou v 70 % roztoku etanolu. 2. Denzitometricky / skenerem vyhodnoťte při 570 nm nebo za použití žlutého filtru k získání semikvantitatívních, relativních hodnot jednotlivých či kombinovaných frakcí. POZN. : Délka jednotlivých elektroforeogramů se může lehce lišit na gelech obsahujících vzorky ve 2 nebo 3 řadách, bez následku na provedení testu.

V. PROMYTÍ Č. 2 : MODUL PRO BARVENÍ

1. Umístěte prázdný držák gelů do modulu na zpracování a barvení gelů. DŮLEŽITÉ : Před zahájením mycího programu zkontrolujte, že : - kontejner na promývací roztok č. 2 obsahuje nejméně 250 mL promývacího roztoku č. 2 ; - kontejner na odpad je vyprázdněn (není plný). Pro připojení přívodů reagencií se řiďte pokyny zobrazovanými na obrazovce (zvolte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte zablokovat nepoužité přívody. 2. Po stisknutí tlačítka "START" začne promývání (zelená šipka na pravé straně klávesnice). Během promývání zůstává tento modul uzamčen. Po osušení, slyšitelné pípnutí signalizuje odemčení barvícího modulu.

VÝSLEDKY

Kontrola kvality

Za každou sérii vzorků se doporučuje zařadit kontrolní sérum s hladinami triacylglycerolů a cholesterolu v mezích normy.

Hodnoty

Normální hodnoty hlavních elektroforetických zón sér 200 zdravých mužů a žen metodou HYDRAGEL 7 LIPO + Lp(a) nebo HYDRAGEL LIPO + Lp(a) 15/30 denzitometrií obarvených elektroforeogramů při 570 nm, poskytující relativní, v procentech vyjádřené hodnoty každé frakce (průměr ± 2 SD) : Beta lipoproteiny (LDL) : 38.6 - 69.4 % Pre-beta lipoproteiny (VLDL) : 4.4 - 23.1 % Alfa lipoproteiny (HDL) : 22.3 - 53.3 %

Rychlé pre-beta lipoproteiny Lp(a) lze vidět i na lipidogramech zdravých osob. Je doporučeno, aby si každá laboratoř stanovila své vlastní referenční hodnoty.

Pořadí migrace

Dle složení vzorku lze pozorovat jeden ze dvou základních typů rozdělení : HDL

HDL

VLDL

VLDL

Od bodu aplikace směrem k anodě

Od bodu aplikace směrem k anodě

Lp(a)

LDL

Interpretace

LDL

Vizuální hodnocení srovnáním vyšetřovaného vzorku s normální kontrolou. Denzitometrie – relativní procenta jednotlivých lipoproteinových frakcí. Kvalitativní (přítomnost abnormálních frakcí nebo nepřítomnost normálních frakcí) i semikvantitatívní (relativní zvýšení či snížení frakcí) abnormality vyžadují další analýzu. Další pomocí při interpretaci lipidogramů je Fredricksonova klasifikace.

Fredricksonova klasifikace TYP HYPERLIPEMIE CELKOVÝ CHOLESTEROL g/L mM TRIGLYCERIDY g/L mM VZHLED SERA CHYLOMIKRA LDL VLDL HDL

TYP I

TYP II a

30 - 70 34 - 79 mléčné ++++ --N až -----

< 1.6 <2 čiré 0 +++ N N až -

2-4 5.2 - 10.4

3 -10 7.8 - 26

TYP II b

2.8 - 3.5 7.3 - 9.1 2-5 2.3 - 5.6 opal. 0 ++ ++ N až -

- 114 -

TYP III

TYP IV

TYP V

2-9 2.3 - 10.2 opal. 0 ++ çiftli ++ -

2 - 10 2.3 -11.3 zákal 0 +++ -

≤ 30 ≤ 34 mléčné ++++ -++ -

3-5 7.8 - 13

< 2.7 <7

≤5 ≤ 13


Lp(a) skríning

Frakce mezi alfa a pre-beta zónami odpovídá Lp(a). Pohyblivost se může lišit v závislosti na fenotypu. Minimální hladina detekce je 0.03 g/dL. Pokud se frakce Lp(a) na lipidogramu prokáže, je vhodná její kvantifikace nefelometricky nebo elektroimunodifúzí.

Zvláštní případy

• U typů IV a V dle Fredricksona, kde pre-beta frakce je vysoká a posunutá anodicky, může skrývat Lp(a). Doporučuje se nechat sérum stát 24 - 48 hod. při pokojové teplotě (což sníží mobilitu VLDL) a opakovat elektroforézu, příp. vyšetřit Lp(a) kvantitativně. • Lp X – zůstává na katodické straně, chylomikra nejsou přítomna – nachází se v ikterických sérech v případě cholestázy nebo biliárního onemocnění.

Interference a omezení

Nepoužívat mražené vzorky. Skladování snižuje mobilitu VLDL, může dojít k podhodnocení. Pohyblivost Lp(a) není skladováním ovlivněna. 8 mm před zónou alfa migruje albumin, který se barví Sudanem – nesmí být zahrnut do vyhodnocení. Difúzní stopa před alfa-liproteinovou frakcí (HDL), vyskytující se u některých sér, se do vyhodnocení musí zahrnout (tato zóna odpovídá HDL částečně zbavených lipidů). • Metoda je kvalitativní, zjištěné změny vyžadují další analýzu. • • • •

Problémy

Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte TechnickoServisní středisko vašeho dodavatele. Soupravy, reagencie, bezpečnostní listy a informace o likvidaci odpadu jsou dostupné na Technicko-Servisním středisku vašeho dodavatele.

HODNOTY

Denzitometr HYRYS fy SEBIA byl použit pro denzitometrická hodnocení. Všechny elektroforeograby byly interpretovány taktéž vituálně.

Reprodukovatelnost

Ve všech studiích reprodukovatelnosti, byly nejdříve naskenované elektroforeogramy a poté zapsána procentuální hodnota relativní koncentrace každé lipoproteinové frakce. Průměry, SD a CV byly kalkulovány s ohledem na analyzované parametery. Po vizuální analýze elektroforeogramů nebyly pozorované žádné rozdíly mezi opakováními. Výsledky testů indikují velice dobrou reprodukovatelnost. V tabulkách níže jsou uvedeny reprezentativní příklady.

Reprodukovatelnost na gelu

Každý ze tři patologických vzorků s Lp(a) frakcí byl podroben analýze metodou HYDRAGEL 15 & 30 LIPO + Lp(a). Každý vzorek byl testován na všech 15-ti drahách gelu dvou různých šarží. Tabulka ukazuje výsledky na gelu (jeden gel / šarže) pro všechny tři vzorky : FRAKCE

PRŮMĚR SD CV %

HDL (%)

38.2 - 23.4 - 27.0 0.8 - 0.6 - 0.6 2.1 - 2.8 - 2.2

Lp(a) (%)

4.6 - 6.4 - 9.7 0.2 - 0.3 - 0.3 4.2 - 4.2 - 3.5

VLDL (%)

13.0 - 23.8 - 8.7 0.3 - 0.3 - 0.3 2.7 - 1.2 - 3.4

LDL (%)

44.2 - 46.4 - 54.7 0.8 - 0.6 - 0.6 1.7 - 1.2 - 1.1

Reprodukovatelnost mezi gely

Patnáct (15) různých vzorků bylo podrobeno testům na gelech soupravy HYDRAGEL 15 & 30 LIPO + Lp(a) dvou šarží. Každý vzorek byl testován na jedné dráze každého z 10-ti gelů pro obě šarže. Tabulka ukazuje výsledky reprezentativních vzorků : FRAKCE PRŮMĚR SD CV %

Linearita a citlivost

HDL (%) 30.5 0.8 2.7

Lp(a) (%) 4.3 0.1 3.5

VLDL (%) 10.8 0.2 2.0

LDL (%) 54.4 0.9 1.7

Relativní koncentrace lipoproteinových frakcí byly stanoveny následnými ředěními sérového vzorku. Denzitometricky stanovené koncentrace nebyly závislé na ředícím faktoru. Nejvyšší ředění (1 : 4) za předpokladu, že elektroforeogram bylo možné skenovat (obecně stejné jako s nativním vzorkem séra). Koncentrace Lp(a) byla stanovena v sérových vzorcích elektroimunodifuzí. Detekční limit byl okolo 30 mg/dL.

Přesnost

Denzitometricky stanovené relativní koncentrace jednotlivých lipoproteinových frakcí byly měřeny pomocí normálních a patologických vzorků séra (n = 56) ; 16 vzorků bylo s Lp(a). Všechny vzorky byly podrobeny analýze metodou HYDRAGEL 15 & 30 LIPO + Lp(a) a ekvivalentnímu elektroforetickému testu. Po vizuální analýze elektroforeogramů nebyly pozorované žádné rozdíly. Denzitometrické hodnoty byly analyzovány za použití lineární regrese : Frakce HDL Lp(a) VLDL LDL

Korelační koef. 0.985 0.988 0.994 0.985

* % hodnoty byly stanovené na SEBIA systému.

y - úsek -1.860 -0.168 -0.037 -0.731 - 115 -

Sklon 1.035 1.013 1.044 1.016

Rozsah % hodnot * 5.1 - 53.5 2.4 - 18.4 3.1 - 44.5 32.2 - 92.0


Identifikace rychlé pre-beta frakce jako Lp(a)

Imunofixační a imunosubstrakční techniky byly použité pro demonstraci toho, že Lp(a) migruje jako rychlá pre-beta frakce a jako jediná detekovatelná komponenta v tomto případě chybí v LDL, VLDL a HDL frakcích.

- 116 -


BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. 2. 3. 4.

5.

6. 7. 8. 9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

Berg K. A new serum type system in man : the Lp(a) system. Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1963, 59, 369-382. Buxtorf JC, Dachet C, Jacotot C. Dosage de la lipoprotéine Lp(a). Pathologie Biologie, Vol 39, 4, 328-331. Campos E., Fievet P., Caces E., Fruchart J-C and Fievet C.: A screening method for abnormally high lipoprotein (a) concentrations by agarose lipoprotein electrophoresis. Clin. Chim. Acta., 1994, 230, 43-50. Carlson LA, Ericsson M. Quantitative and qualitative serum lipoprotein analysis. Part 1 : Studies in healthy men and women. Atherosclerosis, 1975, 21, 417-433. Dahlen GH, Guyton JR, Arrar M, Farmer JA, Kautz JA, Gotto AM. Association of level of lipoprotein Lp(a), plasma lipids, and other lipoproteins with coronary artery disease documented by angiography. Circulation, 1986, 74, 758-65. Fredrickson DS and Lees RS. A system for phenotyping hyperlipemias. Circulation, 1965, 31, 321-327. Fruchart JC, Clavey V, Vanhoutte G. Méthodes d’exploration biochimique des hyperlipoprotéinémies. Path. Biol., 1983, 31, 4, 235-245. Fruchart JC, Puchois P. Méthodes d’analyses des lipoprotéines. Ann. Biol. Clin., 1986, 44, 551-555. Kostner GM, Avogaro P, Cazzolato G, Marth E, Bittolo-Bon G, Quinci GB. Lipoprotein Lp(a) and the risk for myocardial infarction. Atherosclerosis, 1981, 38, 51-61. Morisett JD, Guyton JR, Gaubatz JW, Gotto AM Jr. Lipoprotein Lp(a) : Structure, metabolism and epidemiology. In: Gotto AM Jr, ed. Plasma lipoproteins. Amsterdam: Elsevier Science Publishers, 1987, 129-52. Naito H. The association of serum lipids, lipoproteins, and apolipoproteins with coronary disease, assessed by coronary arteriography. Ann. Ny. Ac. Sc., 1984, 454, 230-238. Papadopoulos NM. Detection of lipoprotein abnormalities by a sensitive electrophoretic test system for the prevention of cardiovascular disease. International Angiology, 1985, vol 4, 2, 249-253. Schreiner PJ, Morrisett JD, Sharett AP, Patsh W, Tyroler HA, Wu K, Heiss G. Lipoprotein (a) as a risk factor for preclinical atherosclerosis. Arterioscler. Thromb., 1993, 13, 826-33. Schreiver H, Assmann G, Sandkamp M, Schulte H. The relationship of lipoprotein (a) (Lp(a) ) to risk factors for coronary disease. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1984, 22, 591-6. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97.

- 160 -


SCHÉMAS / FIGURES Figure 1

Figure 2

9 10 78 56 34 12

11

12

13

15 14

Figure 3

Figure 4

12

123

456

789

10 11

14 12 13

15

Figure 5 sebia

15/30 27 28 (E) 26 EIN 25 24 PROT 23 22 AGEL 21 HYDR 18 19 20 16

29

30

17

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

11

12

13

14

15

sebia

15/30 27 28 (E) 26 EIN 25 24 PROT 23 22 AGEL 21 HYDR 18 19 20 16

29

30

17

1

2

AGEL HYDR

3

4

7 PR

5

6

7

OTEIN

8

9 10

11

12

13

7 PR

OTEIN

(E)

1

2

3

5

sebia 4

6

7

- 161 -

15

(E)

1

AGEL HYDR

14

2

3

5

sebia 4

6

7

34

5 6 sebia 78 9 10 11

12

HYDRAGEL 30 LIPO + Lp(a)

Recommend Documents