Húgyhólyagrákok molekuláris diagnosztikai és prognosztikai módszerei

Húgyhólyagrákok molekuláris diagnosztikai és prognosztikai módszerei Doktori (Ph.D.) értekezés

Szarvas Tibor Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola

Témavezető:

Dr. Kovalszky Ilona, egyetemi tanár, MTA doktora

Hivatalos bírálók:

Dr. Nyirády Péter, osztályvezető adjunktus, Ph.D. Dr. Tordai Attila, MTA doktora

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Kerényi Tibor egyetemi tanár, MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Simon Károly osztályvezető főorvos, egyetemi magántanár Dr. Bán Zoltán egyetemi tanársegéd, Ph.D.

Budapest 2008

Húgyhólyagrákok diagnosztikai és prognosztikai módszerei

Szarvas Tibor

TARTALOMJEGYZÉK

I. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ....................................................................................... 5 II. IRODALMI HÁTTÉR................................................................................................. 5 II.1. A húgyhólyagrákról ............................................................................................... 7 II.1.1. A húgyhólyagrák epidemiológiája .................................................................. 7 II.1.2. A húgyhólyagrák etiológiája........................................................................... 7 II.1.3. A húgyhólyagrák patológiája ......................................................................... 8 II.1.4. A húgyhólyagrák diagnosztikája, kezelése és követése................................. 10 II.1.5. A húgyhólyagrák aktuális diagnosztikai és prognosztkai kérdései............... 12 II.1.5.1. Korai diagnózis...................................................................................... 12 II.1.5.2. Szövettani diagnózis támogatása kérdéses esetekben............................. 12 II.1.5.3. A felületes hólyagtumorok prognosztikája ............................................. 13 II.1.5.4. Tumorok metasztatizáló-képességének előrejelzése .............................. 13 II.2. A genetikai instabilitás szerepe a tumorok kialakulásában és progressziójában . 13 II.2.1. Nukleotid szinten megnyilvánuló genetikai instabilitás................................ 13 II.2.2. Kromoszóma szinten megnyilvánuló genetikai instabilitás .......................... 14 II.3. Az angiogenezis szerepe a tumorok kialakulásában és progressziójában ........... 16 II.3.1. A tumor által indukált angiogenezisben résztvevő faktorok ......................... 18 II.3.2.Angiogén faktorok szöveti expressziója húgyhólyagrákban .......................... 21 II.3.2.1. VEGF ..................................................................................................... 21 II.3.2.2. Angiopoietin-1 és -2............................................................................... 21 II.3.2.3. Tie2 ........................................................................................................ 22 II.3.3.Szolubilis angiogén faktorok szérumkoncentrációja tumoros állapotokban 22 II.3.3.1. VEGF ..................................................................................................... 23 II.3.3.1. Angiopoietin-1 és -2............................................................................... 24 II.3.3.2. Tie2 ........................................................................................................ 24 II.4. Antiangiogén tumorterápia .................................................................................. 25 III. CÉLKITŰZÉSEK..................................................................................................... 27 IV. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK............................................................................... 28 IV.1. Mikroszatellita allélvesztés-vizsgálat (12 markerrel) ........................................ 28 IV.1.1. Vizsgált minták ............................................................................................ 28

2


Szarvas Tibor

IV.1.2. Mintagyűjtés és DNS izolálás ...................................................................... 28 IV.1.3. Polimeráz láncreakció................................................................................. 29 IV.1.4. Elektroforézis............................................................................................... 31 IV.1.5. Kiértékelés ................................................................................................... 31 IV.2. Teljes genom mikroszatellita allélvesztés-vizsgálat (400 marker) .................... 34 IV.2.1. Vizsgált minták ............................................................................................ 34 IV.2.2. Mintagyűjtés és DNS izolálás ...................................................................... 34 IV.2.3. Polimeráz láncreakció................................................................................. 34 IV.2.4. Kapilláris elektroforézis .............................................................................. 36 IV.2.5. Kiértékelés ................................................................................................... 36 IV.3. UroVysion FISH-vizsgálat................................................................................. 37 IV.3.1. Vizsgált minták ............................................................................................ 37 IV.3.2. Mintagyűjtés és előkészítés .......................................................................... 38 IV.3.3. In situ hibridizáció....................................................................................... 39 IV.3.4. Kiértékelés ................................................................................................... 39 IV.4. RNS expressziós vizsgálatok ............................................................................. 40 IV.4.1. Vizsgált minták ............................................................................................ 40 IV.4.2. RNS izolálás................................................................................................. 40 IV.4.3. Reverz transzkripció .................................................................................... 41 IV.4.4. Valós-idejű kvantitatív PCR (RT-PCR) ....................................................... 41 IV.4.5. Kiértékelés ................................................................................................... 43 IV.4.6. Statisztikai analízis ...................................................................................... 44 IV.5. Fehérje szintű vizsgálatok .................................................................................. 44 IV.5.1. Vizsgált minták ............................................................................................ 45 IV.5.2. Mintagyűjtés ................................................................................................ 45 IV.5.2. ELISA........................................................................................................... 45 IV.5.4. Kiértékelés ................................................................................................... 46 IV.6. STATISZTIKAI ANALÍZIS…………………………………………………...47 IV.6.1. Túlélés analízis ............................................................................................ 47 IV.6.2. Kaplan-Meier túlélés teszt és többváltozós Cox-analízis ............................ 47 V. EREDMÉNYEK........................................................................................................ 48 V.1. Mikroszatellita allélvesztés-vizsgálat (12 marker) .............................................. 48 V.2. Teljes genomi mikroszatellita allélvesztés-vizsgálat (400 marker)..................... 51 V.3. FISH vizsgálat .................................................................................................... 55 3


Szarvas Tibor

V.4. Angiogén faktorok RNS szintű expressziós vizsgálata ...................................... 57 V.4.1. Angiogén faktorok génexpresszióinak összevetése a klinikopatológiai adatokkal ... 57 V.4.2. Angiogén faktorok génexpresszióinak összevetése a hisztológiai adatokkal ........... 58

V.4.3. Túlélés analízis.............................................................................................. 59 V.4.3.1. Többváltozós Cox-analízis (multivariancia analízis) ............................ 62 V.5. Angiogén faktorok fehérje szintű vizsgálata szérumban..................................... 63 V.5.1. Angiogén faktorok szérumkoncentrációi (tumor-normál)............................. 63 V.5.2. Angiogén faktorok szérumkoncentrációi (klinikopatológiai adatok)............ 63 V.5.3. Túlélés analízis.............................................................................................. 63 V.5.3.1. Kaplan-Meier túlélésteszt és többváltozós Cox-analízis........................ 64 VI. MEGBESZÉLÉS...................................................................................................... 69 VII. KÖVETKEZTETÉSEK .......................................................................................... 78 VIII. ÖSSZEFOGLALÁS .............................................................................................. 79 IX. SUMMARY ............................................................................................................. 81 X. IRODALOMJEGYZÉK ............................................................................................ 83 XI. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE..................................................................... 96 XI.1. Az értekezés témájában megjelent nemzetközi közlemények ........................... 96 XI.2. Az értekezés témájában megjelent magyar nyelvű közlemények...................... 96 XI.3. Egyéb témában megjelent közlemények ............................................................ 94 XI.4. Idézhető absztraktok........................................................................................... 97 XI.5. Előadások, poszterek.......................................................................................... 98 XII. KÖZLEMÉNYEK IDÉZETTSÉGE ..................................................................... 101 XIII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ............................................................................. 103

4


Szarvas Tibor

I. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE Ang -

angiopoietin

AML -

akut myeloid leukémia

bFGF -

bázikus fibroblaszt növekedési faktor

BCG -

Bacillus Calmette-Guérin immunterápia

BPH -

benignus prosztata hiperplázia

BSA -

bovine serum albumin

CA9 -

carbo anhydrase 9 (karboanhidráz 9)

CDKN2A -

p15 ciklin-dependens kináz inhibitor

CDKN2B -

p16 ciklin-dependens kináz inhibitor

CEACAM1 -

karcinoembrionális antigénszerű sejtadhéziós molekula 1

CEP -

chromosome enumeration probe (centroméraspec. FISH-próba)

CI -

konfidenciaintervallum (Cox analízis)

CIS -

carcinoma in situ

cM -

centimorgan (kromoszómán mért távolság kb. 1 cM = 15 kb)

ECLI -

endothel proliferációs index (endothelial cell labeling index)

ECM -

extracelluláris mátrix

EGF -

epidermal growth factor

ELISA -

enzyme linked immunosorbent assay

FISH -

fluoreszcens in situ hibridizáció

GAPDH -

glyceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz

HIF -

hypoxia inducable factor (hypoxia indukálta faktor)

HR -

hazard ratio (kockázat megadására szolgáló adat Cox analízisben)

hMLH -

humán mutL homológ, mismatch repair géncsalád

hMSH -

humán mutS homológ, mismatch repair géncsalád

LOH -

loss of heterozygosity (allélvesztés)

LSI -

locus-specific identifier (delécióspecifikus FISH-próba)

MMP -

mátrix metalloproteáz

MMR -

mismatch repair (hibajavítás)

MSI -

mikroszatellita instabilitás

MVD -

microvessel density (kapilláris denzitás)

PAGE -

poliakrilamid gélelektroforézis

5


Szarvas Tibor

PCI -

pericyte coverage index (kapillárisok pericytaborítása)

PCR -

polimeráz láncreakció

PTCH -

Gorlin szindróma gén

RFLP -

restrikciós fragmenthossz polimorfizmus

RFU -

relatív fluoreszcencia egység

SDHA -

succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavoprotein

sTie2

oldott állapotú Tie2

TCC -

tranzicionális cellularis carcinoma (átmeneti sejtes karcinóma)

TEM -

Tie2-t expresszáló monociták

TBP -

TATA box binding protein

TGFα és β -

transforming growth factor

Tie2 -

tyrosine kinase with immunoglobulin-like & EGF-like domains 1

TSC1 -

tuberous sclerosis gén

TUR -

transzuretrális rezekció (endoszkópos műtét)

VEGF -

vascular endothelial growth factor

VE-Cadherin -

vascular endothelial cadherin

VHL -

von Hippel-Lindau fehérje

WHO -

World Health Organization (Egészségügyi Világszervezet)

6

Szarvas Tibor


II. IRODALMI HÁTTÉR II. 1. A húgyhólyagrákról II.1.1. A húgyhólyagrák epidemiológiája Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) adatai szerint világszerte évente mintegy 330 000, Magyarországon pedig 2000 új húgyhólyagtumoros megbetegedést diagnosztizálnak. 2002-ben összesen 178 850 ember vesztette életét hólyagrák miatt, közülük 809-en Magyarországon. Ezek alapján a hólyagtumor az előfordulás tekintetében a tizedik, a halálozást figyelbeme véve pedig a tizennegyedik helyet foglalja el a daganatos betegségek között. Előfordulásuk földrajzi eloszlása nem egyenletes; Európában, Észak-Amerikában és Ausztráliában a leggyakoribb. A nemek között is eltérés tapasztalható; a férfiak körében kétszer gyakrabban alakul ki mint a nőknél. A betegek életkora a diagnózis idején átlagosan 65 év.(1,2) II.1.2. A húgyhólyagrák etiológiája Az örökletes genetikai háttér és a családi halmozódás nem jellemző a hólyagrákra, kialakulásában inkább egyes környezeti hatások játszanak szerepet, melyek közül elsősorban a vizeletbe ürülő karcinogén anyagokkal kell számolni. Közülük az aromás aminokat már a múlt század elején azonosították, amikor a hólyagrák halmozott előfordulását figyelték meg festékgyári munkások között.

(3)

Sokáig úgy gondolták,

hogy ezért az anilin a felelős, de később bebizonyosodott, hogy valójában a benne szennyezésként jelen levő vegyületek, a 2-naftil-amin, a benzidin és a 4-amino-bifenil okozzák a gyakori hólyagrákot. Az aromás aminok kóroki szerepét a vegyiparban, gumi- és kábelgyártásban, a bőr- és nyomdaiparban dolgozók között is kimutatták. (2) A legfontosabb rizikófaktornak ma a dohányzást tartják, mely 2-6-szoros kockázatot jelent. A daganat kialakulásban fontos szerepet tulajdonítanak továbbá az ismétlődő, illetve az elhúzódó urológiai fertőzéseknek valamint a krónikus vizeletpangásnak. Itt kell megemlíteni a trópusi és szubtrópusi területeken honos vérmételyt (Schistosoma haematobium), mely a bőrön keresztül jut be a szervezetbe, ahol végül a húgyhólyag vénás plexusaiba fészkeli be magát. Az ennek következtében fellépő gyulladás gyakran hólyagrák (squamous cell carcinoma) kialakulásához vezet. 7

Szarvas Tibor

Húgyhólyagrákok diagnosztikai és prognosztikai módszerei (4)

Kockázatot jelentenek továbbá egyes gyógyszerek (fenacetin, ciklofoszfamid) és a

kismedencei sugárkezelések is. (5,6) Hólyagtumorok gyakoribb előfordulását találták gumi- és textilipari, festékgyári munkások körében valamint fodrászoknál és buszvezetőknél is.

(7-9)

Létezik tehát egy

viszonylag jól körülhatárolható veszélyeztetett populáció, amelynek szűrése a korai kimutatás reményében kívánatos lenne. II.1.3. A húgyhólyagrák patológiája A húgyhólyagdaganatok 90-95%-a az urotheliumból kiinduló úgynevezett átmeneti sejtes karcinóma (tranzicionális cellularis carcinoma – TCC), a nem hámeredetű daganatok ritkák. A TCC-k két megjelenési formája ismert: a papilláris, mely kesztyűujj-szerű alakzatot mutat és a szolid, mely viszonylag egyenletes növekedésű. A carcinoma in situ (CIS) az epithel rétegben laposan terjedő magas malignitású entitás, mely gyakran az egész hólyagra kiterjed. Nagy valószínűséggel és gyorsan invazívvá válik. Felfedezése a jelenleg használt hólyagtükrözéssel nagyon nehéz, hiszen nem türemkedik be a hólyag lumenébe, így nehezen látható. (10) A daganatok szövettani besorolása alapvetően meghatározza a kezelés módját és az életkilátásokat. A stádiumbeosztásnál az Egészségügyi Világszervezet (WHO) által jóváhagyott TNM-rendszer használatos, melyben a T a primer tumor kiterjedését (T0T4), az N a nyirokcsomók érintettségét és a regionális áttéteket (N0-N3), az M pedig a távoli áttétek meglétét vagy hiányát (M0 vagy M1) írja le. A grade a daganatok differenciáltságát jellemzi, amely a malignitás mértékére utal. Ebben az esetben a mitózisok gyakorisága, a sejtes abnormitások és az anaplázia mértéke alapján végzik el a besorolást (GI-GIII) (1. ábra).

8

Szarvas Tibor


Stage

Leírás

Tis

Carcinoma in situ,

Ta

Papilláris, nem invazív

T1

Lamina propriára terjedő

T2 T2a T2b

A hólyag izmos falára terjed: - beszűri a felületes illetve - a mély simaizom réteget

T3 T3a T3b

Az izmos falon áttörő tumor: - mikroszkóposan és - extravezikálisan látható módon

T4 A környező szövetekre terjedő tumor: T4a - prosztatára, méhre, hüvelyre T4b - eléri a kismedence falát Grade

Leírás

GI

Jól differenciált

G II

Közepesen differenciált

G III

Differenciálatlan

1. ábra: A hólyagtumor szövettani besorolása

A hólyagdaganatok klinikailag hagyományosan két csoportba sorolhatók: felületes (nem invazív) és izomra terjedő daganatok. A felületes daganatok közé a Tis, Ta és T1 stádiumú tumorok tartoznak, melyek nem érik el a hólyag falának simaizom rétegét, az invazív T2-4 stádiumú tumorok azonban elérik vagy áttörik azt (2. ábra). A diagnózis idején a daganatok 75 %-a felületes, ezeknek körülbelül 70 %-a Ta, 30%-a T1 stádiumú. (11) A hólyagrákok WHO által jóváhagyott grade besorolása 2004-ben változott.

(12)

A korábbi, 1973 óta érvényben lévő osztályozás jól differenciált (G1), közepesen differenciált (G2) és differenciálatlan (G3) csoportokat különített el. Az új besorolás bevezeti az “alacsony malignitási potenciálú papilláris urothelialis neoplázia” (papillary urothelial neoplasms of low malignant potential – PUNLMP) fogalmát, melybe olyan G1-es tumorok sorolandók, melyek a sejtmagok megnagyobbodott méretén kívül nem mutatnak más citológiai atípiát. Ezen kívül még két entitást vezet be az új WHO grade osztályozás; az egyik a “low grade”, a másik a “high grade” tumor. A low grade csoportba a korábban G1-es tumorok azon része sorolható, amelyek citológiai atípiát mutatnak, valamint a korábban G2-es tumorok közül azok, amelyek enyhe citológiai atípiájuk mellett csak kisebb szöveti, szerkezeti eltéréseket mutatnak.

9


Szarvas Tibor

Minden ennél súlyosabb eltérést hordozó neoplázia a high grade kategóriába sorolandó. Az új grade rendszer hátránya, hogy a mindennapi gyakorlatba még nem épült be. Hiányoznak továbbá azok a hosszú távú követéses vizsgálatok, melyek az új rendszer klinikai relevanciájának felsőbbrendűségét bizonyíthatnák. Kísérleteink eredményeit ezért az 1973-as grade besorolás szerint értékeltük.

2. ábra: Normál (A), felületes - Ta (B) és izomra terjedő T2 (C) hólyagtumor cisztoszkópos (felső sor) és hisztológiai (alsó sor) képe.

II.1.4. A húgyhólyagrák diagnosztikája, kezelése és követése Jellegzetes tünetük a haematuria, ami általában nem jár fájdalommal. Jelenleg a diagnózis felállításának és a betegkövetésnek elsődleges módszere a hólyagtükrözés (cisztoszkópia), amely kellemetlen és invazív beavatkozás. Kiegészítő módszerként használatos a vizelet citológia, mely a spontán ürített vizelet sejtjeit vagy a hólyag steril kimosásával kapott sejteket vizsgálja. A citológia a nagy malignitású tumorok kimutatására alkalmas ugyan, de az alacsony malignitásúaknál érzékenysége alig éri el az 50%-ot, ezért kívánatos lenne olyan technikák kidolgozása, melyek javíthatják a kimutatás hatékonyságát. A szövettani diagnózis alapvetően befolyásolja a betegek várható életkilátásait (3. ábra). A felületes tumorokban szenvedők több mint 90%-a 5 évnél hosszabb ideig él, míg az izomra terjedő tumorok esetén ez az arány már csak 30% körüli. (13)

10

Szarvas Tibor


100

pTa (n=373)

80

pT1 (n=209)

60 Túlélés (%)

40 20

pT2-4 (n=294)

20

40

60

80

100

120

Hónapok 3. ábra: Életkilátások a daganat invazivitásának (stage) függvényében [13]

A jelenlegi gyakorlat szerint – megbízható molekuláris illetve képalkotó vizsgálat hiányában – az urológus a terápia tervezésénél szinte kizárólag a szövettani diagnózisra hagyatkozhat. A kimetszett minta azonban gyakran nehezen értékelhető. A lézeres rezekció (TUR) során gyakran fellépő hőkárosodás főleg a kisebb méretű tumorok esetében nehezíti meg a szövettani diagnózis felállítását. Másfelől előfordul, hogy a műtéti rezekció vonalának mélysége nem éri el a tumor inváziójának rétegét, azaz nem sikerül ép szövetben kimetszeni a tumort. Ilyenkor az invázió mértéke nem állapítható meg, második műtétre (utórezekcióra) van szükség. A daganat műtéti úton történő eltávolítása a kezelés elsődleges módja. A felületes tumorok (Ta, T1G1 ill. T1G2) kezelésére transzuretrális rezekciót (TUR) alkalmaznak, amit egy húgycsövön felvezetett endoszkóp segítségével, altatás nélkül, spinális anesztéziában végeznek. Ezt a súlyosnak nem mondható beavatkozást általában többször meg kell ismételni a reziduális vagy a kiújult daganat miatt. A felületes hólyagrákok 60-70%-a újul ki, emiatt a betegek rendszeres követése igen fontos. A jelenleg alkalmazott protokoll szerint a műtét utáni első 2 évben 3 havonta, és negatív eredmények esetén 2 éven át félévente kell cisztoszkópos vizsgálatot végezni. Molekuláris vizsgálatokkal a citológia érzékenységét és specificitását növelve a szükséges cisztoszkópos vizsgálatok közötti idő meghosszabbítható lenne.

(14)

felületes tumorok átlagosan 5-15%-ánál lehet a betegség progressziójára számítani.

11

A

Szarvas Tibor


Az invazív rákoknál (valamint T1G3 és CIS esetében) általánosan alkalmazott cisztektómia súlyos műtét, melynek során a hólyagot és a regionális nyirokcsomókat, férfiaknál a prosztatát és az ondóhólyagot, nőknél pedig a méhet is eltávolítják. A műtéti megterhelést növeli, hogy a vizeletelvezetést bélhólyag-képzéssel kell megoldani. A betegek többségében idős, leromlott állapotú emberek, akik gyakran nem tudnak elviselni ilyen súlyos beavatkozást. Az ilyen esetekben elvégzett transzuretrális rezekció már csak palliatív jellegű. A beteg életkilátásait elsősorban az dönti el, hogy a primer daganatból a sejtek képesek-e kivándorolni, és a szervezet más helyein áttéteket, metasztázisokat képezni. Erre a hólyag izmos falára terjedő tumorok közel 70%-a képes.(15) Ez a magas arány a metasztázisok korai felderítésére szolgáló módszerek kifejlesztését sürgeti. II.1.5. A húgyhólyagrák aktuális diagnosztikai és prognosztikai kérdései II.1.5.1. Korai diagnózis A korai (felületes) és az előrehaladott (invazív) hólyagrákban szenvedő betegek hosszútávú túlélési esélyei között drámai (95% vs. 35%) különbség látszik. Ez azonban nem csupán felületes-invazív összehasonlításában mutatkozik meg, hiszen a cisztektómián átesett betegek életkilátásait is szignifikánsan befolyásolja, hogy a hólyag eltávolításának idején a tumor milyen mélységben infiltrálta a hólyagfalat.(16) Ebből következik,

hogy

a

hólyagrákok

korábbi

(alacsonyabb

stádiumban)

történő

felfedezésétől az illető beteg életkilátásainak jelentős javulása várható. Az ismert rizikófaktorok (idős kor, dohányzás, bizonyos foglalkozások) lehetővé teszik egy viszonylag jól körülhatárolható veszélyeztetett csoport kiválasztását; ennek pedig nagy jelentősége lehet a költség-hatékonyság növelésében. A hólyagtumor igen magas prevalenciája miatt az egészségbiztosítást egyik legerősebben terhelő betegség. Lotan és mtsai. szerint egy hólyagtumor szűrésére alkalmazandó módszer abban az esetben használható, ha a kiválasztott veszélyeztetett csoportban a hólyagrák prevalenciája magasabb, mint 1,6%, a módszer specificitása eléri az 54%-ot, míg szenzitivitása legalább 26% és a vizsgálat ára nem magasabb 126 $-nál.(17) II.1.5.2. Szövettani diagnózis támogatása kérdéses esetekben A fent említett okokból (hőkárosodás, rezekciós vonal bizonytalansága) egy a tumor invazivitással korreláló marker megerősíthetné a bizonytalan szövettani diagnózist.

12


Szarvas Tibor

II.1.5.3. A felületes hólyagtumorok prognosztikája A hólyagtumorok ezen csoportjában a recidívaképző hajlam előrejelzése terápiás előnyt jelentene. A magas kockázatú csoport már az első diagnózis idején agresszívabb kezelést kaphatna (pl.: BCG), amivel a műtéti beavatkozások száma csökkenthető lenne. A felületes tumorok 5-15%-a progrediál, ezzel párhuzamosan az érintett betegek életkilátásai erősen romlanak. A progresszió veszélyének előrejelzése lehetőséget nyújthat annak mind gyógyszeres, mind sebészi úton történő megelőzésére. II.1.5.4. Tumorok metasztatizáló-képességének előrejelzése Az áttétképzés főleg az invazív tumorokra jellemző és alapvetően meghatározza, befolyásolja a túlélési esélyeket. Míg az invazív (és áttétet nem képző) hólyagtumorok esetében az 5 éves túlélés valószínűsége 39%, addig áttétes rákok esetében ez az arány már csak 12%.(18) Ezért nagy szükség van egy olyan vizsgálómódszerre, amely az áttétképzés valószínűségét képes lenne meghatározni.

II.2. Genetikai instabilitás szerepe a tumorok kialakulásában és progressziójában A genetikai instabilitás általánosan jellemző a tumorokra, irányító szerepe van azok kialakulásában és progressziójában, valamint felelős heterogenitásukért is. Az instabilitás jelzi, hogy a genom hibáit javító mechanizmusok hibásan működnek, ami egyben érzékenységet is jelenthet egyes terápiás ágensekkel szemben. A genetikai instabilitás megnyilvánulhat kromoszóma és nukleotid szinten is. (18) II.2.1. Nukleotid szinten megnyilvánuló genetikai instabilitás Ezek az eltérések az örökítőanyag csupán egy, legfeljebb néhány bázisát érintik, hatásuk viszont súlyos lehet. A kialakuló spontán vagy mutagén ágensek hatására kialakuló eltérések továbbörökítéséhez szükség van a hibajavító mechanizmusok zavarára is. A nukleotid excíziós repair (NER) zavara következtében pontmutációk halmozódnak fel. A nukleotid szintű mutációk másik fajtája a mikroszatellita instabilitás (MSI). Erre a jelenségre a genomban jelen lévő random ismétlődő

13


Szarvas Tibor

szekvenciák (mikroszatelliták) replikációs zavarai hívták fel a figyelmet. A háttérben a mismatch repair (MMR) javító mechanizmusban részt vevő hMLH és a hMSH gének pontmutációi, illetve promoter régióik hipermetilációi állnak. A vastagbélrákoknál a mikroszatellita instabilitásnak fontos differenciáldiagnosztikai szerepe van, amely a terápiás döntéseket is befolyásolja. Hólyagtumorokban a mikroszatellita instabilitás ritkán fordul elő; GonzalezZulueta és mtsai. a vizsgált esetek csupán 3%-ában talált MSI-t. (19) A hólyagtumorokban talált pontmutációk közül az egyik legnagyobb gyakorisággal (20% - 50%-ban) a ras onkogéncsalád eltéréseit mutatták ki, ezek azonban nem mutattak összefüggést a tumor biológiai viselkedésével, sem pedig annak invazivitásával illetve differenciáltsági fokával, ezért feltételezhető, hogy e genetikai eltérések inkább csak kísérő, nem pedig irányítói szerepet töltenek be a hólyagrák patogenezisében. (20) A p53 tumorszupresszor gén pontmutációi ugyancsak gyakori eseménynek számítanak húgyhólyagdaganatban; önálló kóroki szerepük számos vizsgálat ellenére azonban máig vitatott. (21,22) Ugyanakkor megfigyelték, hogy a felületes hólyagrákoknál gyakori p53 pontmutációkat nem kíséri allélvesztés, míg az izominvazív tumoroknál mindkét típusú eltérés egyszerre detektálható. (22) A felületes hólyagtumorokban viszonylag kevés genetikai eltérés figyelhető meg. Közülük a fibroblaszt növekedési faktor (FGFR3) gén pontmutációi gyakoriak. Papilláris hólyagrákokban az FGFR3 mutációk előfordulása a tumorok csökkent recidívaképző hajlamára utal. (23,24) II.2.2. Kromoszóma szinten megnyilvánuló genetikai instabilitás A kromoszóma szinten észlelhető genetikai instabilitás a kromoszómaszegregáció zavarain keresztül vezet numerikus vagy strukturális kromoszóma eltérésekhez. Az ilyen hibákat tartalmazó sejtek túléléséhez és osztódásához szükség van a hibás sejteket a sejtciklus ellenőrzőpontjain kiszűrni hivatott mechanizmusok elégtelen működésére. Ezek normális körülmények között meggátolják, hogy olyan sejtek lépjenek mitózisba, melyek DNS-e sérült, károsodott. A kromoszóma szinten megnyilvánuló genetikai eltérések egyik típusát a transzlokációk képezik. Ezeknek két típusa különíthető el; komplex transzlokációk, ezek főleg véletlenszerű törések következtében alakulnak ki és főleg szolid tumorokban 14

Szarvas Tibor


fordulnak elő, szemben az egyszerű transzlokációkkal, melyek nem-random törések következtében alakulnak ki és főleg leukémiákban és lymphomákban fordulnak elő. A kromoszóma-transzlokációk hólyagtumorban ritkák. A kromoszóma eltérések közül a daganatokra leginkább a deléciók jellemzőek. Kiterjedésük igen eltérő lehet a néhány bázispárt érintőtől, az egyik kromoszómakar elvesztésén keresztül a teljes kromoszóma kieséséig. A deléció a tumorszupresszor gének inaktiválódásának egyik módja. Fontos azonban megjegyezni, hogy a gén egyetlen alléljának deléciója nem jár automatikusan funkcióvesztéssel, mert a másik (megmaradó) addig recesszív allél átveszi annak feladatát (pszeudodominancia). Ezen alapul a Knudson-féle kétlépéses („two hit”) tumorgenezis modell, mely szerint a tumorszuppresszor funkció végleges elvesztéséhez szükséges a másik allél elvesztése vagy más módon – pl. mutációval, promóter hipermetilációval - történő sérülése, csendesítése is. (25) A nem véletlenszerű deléciók azonosítása az 1980-as években citogenetikai módszerekkel történt, majd az 1990-es évektől kezdve a molekuláris technikák fejlődése – RFLP, PCR, fluoreszcens fragment analízis – lehetővé tette egészen nagy felbontású deléciós térképek készítését, és így az egyes sporadikus daganatokra specifikus deléciók kimutatásával

a

betegség

iniciációjában

tumorszuppresszor gének azonosítását.

(26)

és

progressziójában

szerepet

játszó

Húgyhólyagrákokban a 2q, 3p, 5q, 8p, 9p,

10q, 11q, 13q, 17p, 18q kromoszóma régiók gyakori allélvesztését (loss of heterozygosity - LOH) találták.

(27-29)

Ezek előfordulási gyakorisága az invazivitás

függvényében nagy különbségeket mutat. A felületes hólyagrákok esetén meglepően kevés kromoszóma eltérést találtak. Egyedül a 9-es kromoszóma rövid karjának deléciói nevezhetők általánosak.

(30)

Ez a kromoszóma eltérés gyakran az egyetlen, amely

felületes hólyagtumorokban kimutatható. Ez pedig az adott szakaszon a tumor kialakulásának szempontjából fontos tumorszuppresszor gén jelenlétét valószínűsíti. A 9-es kromoszóma finomtérképezése hívta fel a figyelmet arra, hogy az allélvesztést okozó kromoszómatörés elhelyezkedése nem mutat szigorú szabályszerűséget. A következő feladat tehát annak a szakasznak a megtalálása volt, amelyiket a legtöbb esetben tartalmazta az elveszett régió (minimális deléciós hely). Az egyik első tanulmány, mely 252 tumorból 9-ben talált részleges deléciót, a 9p22-9p13 szakaszt azonosította.

(31)

Egy

másik

vizsgálat

ezt

megerősítette

és

egy

további

kromoszómarégiót; a 9p21-22-t nevezte meg minimális deléciós helyként.

(32)

Gyanítható tehát, hogy a 9-es kromoszómán több a hólyagtumor kialakulásában 15

Szarvas Tibor


szerepet játszó tumorszupresszor gén is található. Ezeket azonban még nem sikerült teljes biztonsággal azonosítani. Több gén is szóba került, közülük valószínűleg a p16 (CDKN2A) és a p15 (CDKN2B) tumorszupresszor gének jelentik a 9p21-22 deléció célpontjait.

(33)

A p16 a CDK4-et, a p15 pedig a CDK6-ot gátolja. A gátlás

következtében a Rb foszforilációja elmarad, ami a sejtciklus G1 fázisból történő továbblépését akadályozva fejti ki tumorszupresszor funkcióját.

(1)

A 9-es kromoszóma

hosszú karjának elvesztését pedig a Gorlin szindróma gén (PTCH) és a tuberous sclerosis gén (TSC1) elvesztésével magyarázzák. (34) Invazív hólyagtumorokban a 9-es kromoszóma allélvesztései mellett gyakoriak a 11p, 17p, 18q, 8p, 4p és 4q allélvesztései, melyek alkalmasak lehetnek a magas malignitású, előrehaladott állapotú tumorok kiszűrésére. (26,35,36) Az allélvesztés mellett előfordul az allélnyerés is (gain of heterozygosity), ami hólyagtumorban legtöbbször a 1q, 5p, 6p, 8q, 10p, 17q, 20q régiókat érinti. (27-29) Általánosságban

tehát

elmondható,

hogy

a

felületes

hólyagtumorok

leggyakrabban diploidok és csak igen kevés kromoszóma eltérést tartalmaznak, míg az izomra terjedő (invazív) tumorokra a poliploídia mellett előforduló sokrétű genetikai átrendeződések jellemzők.

(30)

A nem invazív hólyagtumorokban mikroszkópos

citogenetikai módszerrel talált kisszámú genetikai eltérés arra is utalhat, hogy a kezdeti stádiumot „szubmikroszkópikus” genetikai vagy epigenetikai eltérések jellemzik. Ezek lehetnek pontmutációk, változások a gén metilációs mintázatában, vagy rövid szakaszokat átfogó deléciók. Ez utóbbiak felderítésére különösen alkalmas az általunk alkalmazott mikroszatellita allélvesztés-vizsgálat. A tumor különböző altípusaiban előforduló nem-random genetikai eltérések kimutatása segíthet új, az adott tumor kialakulásában oki szerepet játszó tumorszuppresszor gének azonosításában. A húgyhólyagrák egyes stádiumaihoz köthető genetikai események feltérképezésével közelebb juthatunk a tumorprogresszió molekuláris hátterének megértéséhez, ami segíthet olyan kezelési protokollok kidolgozásában melyek végül a betegség mortalitásának csökkenését eredményezik.

II.3. Az angiogenezis szerepe a tumorok kialakulásában és progressziójában Angiogenezisnek a már meglévő véredényekből kiinduló érképződést nevezzük, megkülönböztetve a vaszkulogenezistől, mely angioblaszt sejtek közreműködésével

16


létrejövő de novo érképződés.

(37-39)

Szarvas Tibor

Élettani körülmények között a felnőtt szervezetben

angiogenezis a sebgyógyuláskor és a női havi ciklus során az endometriumban fordul elő. Az érképződés többféle, egymással párhuzamosan lejátszódó mechanizmus szerint is végbe mehet. Legtöbbjük az endothel sejtek migrációjára és proliferációjára épül. Az intuszusszepció során intersticiális szövetelemek nőnek a már meglévő erekbe és ezzel azoktól független ágakat hoznak létre; a kooptáció során a tumorsejtek infiltratív terjedéssel belenőnek a már korábban meglévő érhálózatba. Leírták továbbá a vaszkuláris mimikrit; ebben tumorsejtek alkotnak érszerű csatornákat. Az viszont tisztázatlan, hogy ezek hogyan alakítanak ki kapcsolatokat a „normális” erekkel. A bimbózást valószínűleg a tumor és stróma sejtek által termelt szolubilis citokinek, angiogén faktorok váltják ki. Hatásukra az endothel sejtek bazális membránja feloldódik, a sejtközötti kapcsolataik fellazulnak és az ezt követően meginduló proliferáció hatására a képződő ér belenő a tumorba. Ez utóbbi mechanizmus összhangban áll az először az 1970-es évek elején publikált Folkman-hipotézissel, mely szerint a tumorok egy meghatározott (1-2 mm-es) átmérő elérése után már nem képesek pusztán diffúzió útján kielégíteni oxigén- és tápanyagigényüket. Ezért a daganat túlélésének és továbbnövekedésének feltétele egy megfelelő érhálózat kialakítása.

(40)

Ezt a folyamatot a hypoxia indukálta angiogén

faktorok irányítják. Az angiogenezist gátló és serkentő ágensek addigi dinamikus egyensúlya megbomlik („angiogenic switch”). Ennek következtében a környező szövetek erei a tumor irányába kezdenek növekedni, így biztosítva annak megfelelő oxigén és tápanyagellátását. Humán glioblastoma és Lewis tüdő tumorok vaszkularizációját vizsgálva megfigyelték, hogy a tumorok növekedésének első fázisában azok nem indukálnak angiogenezist, sőt éppen ellenkezőleg, a bekebelezett gazdaszöveti erek apoptózisát indukálják (regresszió), nekrotikus részeket hagyva maguk után. Később a tumor perifériája felől (tumor-stróma határa) erőteljes érképződés indul el. Az érképződés morfológiai alapon történő számszerűsítése lehetővé tenné különböző esetek összevetését. Bár erre többféle módszert is kidolgoztak, mind a mai napig nem áll rendelkezésre széles körben elfogadott, objektív, megfelelően standardizált módszer. A legelterjedtebb a kapilláris denzitás meghatározása (MVD – microvessel density). Ennek során kiválasztják a mikroszkópos metszet legvaszkularizáltabb helyét 17

Szarvas Tibor


(hot spot) és megadják az adott egységnyi területen található immunhisztokémiai módszerrel láthatóvá tett kapillárisok számát. A hot spotok szubjektív módon történő kiválasztása rendkívüli módon megnöveli a mérés szórását.

(41)

Ezen kívül ismert, de

kevésbé elterjedt az endothel proliferációs index (ECLI – endothelial cell labeling index) és a periciták beágyazottságát megadó PCI (pericyte coverage index). (42,43) II.3.1. A tumor által indukált angiogenezisben részt vevő faktorok A fent említett angiogén egyensúly megbomlásában („angiogenic switch”) szerepet játszó citokinek közül a VEGF-nek és az angiopoietineknek (Ang-1, Ang-2) kulcsszerepük van. (44) Az angiopoietin molekulacsalád tagjai (Ang-1, -2, -3, -4) egyenlő affinitással kötődnek a Tie2 tirozin-kináz aktivitású receptorhoz.

(45-47)

Az Ang-1 agonistaként a

Tie2 autofoszforilációját váltja ki, míg az Ang-2 antagonizálja ezt a hatást. (47) Az Ang1 irányítja az endothel sejtek környezetükkel (pericitákkal és simaizomsejtekkel) való kapcsolatának kialakítását, tehát érstabilizáló hatású, ugyanakkor az endothel sejtek proliferációját nem befolyásolja. Az újonnan képződött erek érésében fontos szerepet játszik, továbbá az Akt/survivin szignálúton gátolja az endothel sejtek apoptózisát. (45-48) Az Ang-2 az Ang-1 kompetitív antagonistájaként ugyancsak a Tie2 receptorokhoz kötődik, de annak intracelluláris régiójában nem vált ki autofoszforilációt. Fő hatása tehát az Ang-1 stabilizáló szerepének felfüggesztésén keresztül az erek destabilizálása, amit embrionálisan a fejlődő erekben, felnőtt korban pedig a placentában, az endometriumban és a corpus luteumban fejt ki. (47) Az Ang-2 felnőttekben e fiziológiás angiogenezis helyszíneken kívül (placenta, endometrium, corpus luteum), csak a tumor indukálta angiogenezis során expresszálódik, ott viszont már igen korai stádiumban.(49) A Tie2-ről korábban azt gondolták, hogy kizárólag az endothel sejtek felszínén expresszálódik, ám a legújabb vizsgálatok tanulsága szerint tumorsejtek és keringő monociták (TEM - Tie2 expressing monocytes) egy részének felszínén is megtalálhatók. (50,51)

A tumor asszociált monocitákról pedig már korábban kimutatták, hogy részt

vesznek a tumor indukálta angiogenezisben és metasztázis képzésben.

(52,53)

Proteolitikus aktivitás következtében a Tie2 extracelluláris részének 75 kDa-os darabja oldott formában detektálható a szérumban („Tie2 shedding”). jelentősége még tisztázatlan.

18

(54)

E mechanizmus


Szarvas Tibor

A hypoxia által indukált angiogén egyensúly megbomlásával az Ang-1/Ang-2 arány az Ang-2 javára változik, ezáltal a környező erek destabilizált állapotba kerülnek. VEGF jelenlétében az instabil erek angiogenezis irányába, VEGF hiányában pedig regresszió irányába terelődnek. (44) Az Ang-2 hatása tehát VEGF-függő (4. ábra).

4. ábra: Nyugalmi állapotban, ill. tumor indukálta angiogenezisben az endothel sejtek Tie2 receptorán megvalósuló jelátvitel. Nyugalmi állapotban az Ang-1 van túlsúlyban, ami a Tie2 aktiválásán keresztül antiapoptotikus szignálokat aktivál. Tumor indukálta angiogenezisben az Ang-2 kerül túlsúlyba, amely antagonizálja az Ang-1 hatását (Ang-2 kötésekor a Tie2 nem aktiválódik), ez pedig az ér destabilizációjához vezet. VEGF jelenlétében az instabil állapot az érképződés irányába mozdul el, míg VEGF távollétében az erek regressziója következik be.

A VEGF az egyik legismertebb angiogén citokin. Jelenlétét számos daganatban kimutatták. Szabályozásában a legfontosabb inger a tumorszövetben fellépő hypoxia. A

19

Szarvas Tibor


cadherin/katenin komplex átrendezése révén fokozza a kapilláris permeabilitást, in vitro serkenti az endothel sejtek proliferációját, migrációját, antiapoptotikus hatású, valamint fokozza a mátrix metalloproteázok (MMP-k) termelődését.

(55-61)

A VEGF-et korábban

endothelspecifikus növekedési faktornak tartották, mára azonban kiderült, hogy sok más sejttípusra – többek között simaizomsejtekre, monocitákra, makrofágokra és a lymphatikus endothel sejtekre – is hatást gyakorol. Ezen sejtek felszínén is sikerült ugyanis kimutatni a VEGF tirozin kináz aktivitású receptorait: Flt-1 (VEGFR-1), KDR/Flk-1 (VEGFR-2), Flt-4 (VEGFR-3) és neuropilin-1. (62-65) A VEGF mellett egy sor az angiogenezisben résztvevő faktor (Flt1, Ang-2, glukóz transzporter 1, CA9) expresszióját is a hypoxia szabályozza. Ebben központi szerepe van a hypoxia indukálta faktoroknak (HIF-1 és HIF-2). A HIF-1 aktív formája két alegységből (α és β) áll. Amennyiben az oxigén szükséglet és oxigén kínálat egymással egyensúlyban van (normoxia), az α alegység egy – oxigént is felhasználó reakció következtében – prolin-hidroxilált állapotban van. Ebben a formában kapcsolódni képes a VHL (von Hippel-Lindau) fehérjéhez, ez ubiquitinálja a HIF α-át, amit ennek következtében a proteaszómák lebontanak. Hypoxiában a prolinhidroxiláció és így a proteaszomális degradáció is elmarad, ezáltal létrejöhet a HIF αHIF β komplex, ami a sejtmagban a már korábban felsorolt fehérjék génjeit aktiválja. Az angiogenezisben szerepet játszó további faktorok közül fontos a bFGF (bázikus fibroblaszt növekedési faktor), amely nem csak az endothel, hanem minden mesenchymális sejt proliferációját fokozza és VEGF-el szemben nem az angiogenezis beindításában, hanem inkább annak fenntartásában játszik fontos szerepet. (66) A PDGF (platelet derived growth factor) az angiogenezis során főként a periciták érbimbók körüli proliferációját serkenti, tehát főleg az újonnan képződött erek érésében játszik szerepet. (67) A VE-Cadherin (vascular endothelial cadherin) az endothel sejtek homotípiás kapcsolatainak kialakításában játszik fontos szerepet. (68) A TGFα csakúgy, mint az EGF, az endothel sejtekre mitogén hatást gyakorol. (69,70)

A TGFβ az extracelluláris mátrixhoz (ECM) kötött, inaktív formában

raktározódik. Szabaddá válva a kialakult erek differenciálódásában, érésében vesz részt; azok pericita és simaizomborítását segít kialakítani. (71-72)

20

Szarvas Tibor


II.3.2. Angiogén faktorok szöveti expressziója húgyhólyagrákban II.3.2.1. VEGF Az általunk vizsgált angiogén faktorok (Ang-1, -2, Tie2, VEGF) közül a VEGF esetében áll rendelkezésre a legbőségesebb irodalom, bár az eredmények gyakran egymásnak ellentmondóak. Egyes szerzők in situ hibridizációs valamint Northern blot technikával invazív hólyagrákokban szignifikánsan magasabb VEGF szintet mutattak ki, mint felületes tumorokban.

(73,74)

Mások ezzel szemben valós idejű PCR-rel éppen a

felületes hólyagtumorokban találtak 3-4-szer magasabb VEGF mRNS expressziót. (74-78) A fehérje szintű vizsgálatok ez utóbbi megfigyeléseket támasztották alá. (78,79) Felszínes hólyagtumorokban

a

magasabb

VEGF

expresszió

rövidebb

recidívamentes

időszakokkal és gyakoribb progresszióval járt együtt, összességében tehát kedvezőtlen jelnek számított.

(77,80,81)

Izomra terjedő rákokban pedig a magasabb VEGF szint a

kemoterápiával szembeni rezisztenciával mutatott egyenes összefüggést.

(82)

Ezzel

összhangban Krause és mtsai. hólyagtumor sejtvonalakon végzett kísérletekkel igazolták, hogy a VEGF expresszió antiszenz oligonukleotiddal történő blokkolása növelte a sejtek kemoterápia (mitomycin C, ciszplatin) iránti érzékenységét. (83) II.3.2.2. Angiopoietin-1 és -2 Az angiopoietin-1 és -2 szöveti expressziójával kapcsolatban csak kevés információ áll rendelkezésünkre. Oka és mtsai. Ang-1 és Ang-2 immunhisztokémiai festést végeztek egyazon betegtől származó épnek tűnő és hólyagtumoros szöveteken. Tumor és normál szövetek Ang-1 és Ang-2 szöveti expresszióit összevetve nem találtak szignifikáns eltérést. A tumorok különböző invazivitású stádiumaiban az angiogén faktorok fehérjeszintjeiben csak az Ang-2 esetében mutatkozott különbség; a magasabb invazivitás és alacsonyabb differenciáltsági fok magasabb Ang-2 expresszióval járt együtt. Ezen felül az Ang-2 erősebb kifejeződése rövidebb túlélési idővel mutatott összefüggést, míg az Ang-1 szöveti szintje nem befolyásolta a túlélést.

(84)

Egy másik

munkacsoport RNS-szintű vizsgálatokat végezve ettől által megfigyelttől eltérő expressziós mintázatot talált a betegség különböző invazivitású és differenciáltságú típusai között. Ők tumorban a normálhoz képest erősen lecsökkent Ang-1 szinteket detektáltak,

melyek

az

invazivitással

folyamatosan 21

emelkedtek.

Az

Ang-2

Szarvas Tibor


expressziójának alakulása ezzel ellentétes volt; a normálhoz képest enyhén emelkedett Ang-2 a magasabb invazivitású és rosszabbul differenciált esetek felé haladva kis mértékben emelkedett.

(78)

Ez a mintázat (az erősen emelkedett VEGF szinttel együtt)

egy kifejezett angiogén szignál jelenlétére utal a betegség korai stádiumában, ami a progresszió során folyamatosan gyengül. Az angiopoietinek különböző tumorokban való expressziójáról írt publikációkat Tait foglalta össze. Arra a következtetésre jutott, hogy a legtöbb tumorban a normál szövethez képest mind az Ang-1, mind az Ang-2 szintje emelkedik. Fontos azonban, hogy az emelkedés nem azonos mértékű a két citokin esetében; az Ang-2 expressziója általában nagyobb mértékben emelkedik, mint az Ang-1-é, ennek következtében pedig az Ang-1 / Ang-2 arány az Ang-2 javára változik. (85) II.3.2.3. Tie2 Mivel a Tie2 szöveti expresszióját húgyhólyagrákban eddig még nem vizsgálták ezért itt csak más tumorokra vonatkozó megfigyelésekre támaszkodhatunk. Ezek meglehetősen heterogén képet festenek a Tie2-ről. A normál szövethez képest emelkedett Tie2 expressziót találtak mellrákban, nem kissejtes

tüdőrákban,

gliómában,

gyomorrákban,

és

az

endometrium

adenokarcinómáiban. A Tie2 nem csupán az endothel sejtek felszínén volt detektálható, hanem a tumorsejtekben is

(86-90)

Ezzel szemben csökkent Tie2 szintet írtak le

ováriumrákban és hepatocelluláris karcinómában, bár ez utóbbit egy másik munkacsoport nem tudta megerősíteni.

(91-93)

A Tie2 expressziója asztrocitómában és

gyomorrákban a növekvő malignitással növekszik, míg ováriumkarcinómában nem találtak összefüggést a malignitás és a Tie2 abundancia között. (96-98) II.3.3. Szolubilis angiogén faktorok szérumkoncentrációja tumoros állapotokban Az angiopoietin-1, -2 és a VEGF oldott formában közvetlenül az intersticiális térbe szekretálódik, innen a nyirok- és vérkeringésbe is bejutva a szérumban és a plazmában is kimutathatóvá válik. A Tie2 esetében – lévén sejtfelszíni receptor – a testfolyadékokból való kimutathatóság nem ennyire magától értetődő. Proteolítikus hasítás következtében azonban extracelluláris régiójának egy 75 kDa-os darabja mérhető mennyiségben jelenik meg a szérumban. (54) 22

Szarvas Tibor


II.3.3.1. VEGF A keringésben lévő VEGF forrása lehet egyfelől a daganat, másrészt származhat trombocitákból, granulocitákból, hízósejtekből, monocitákból és makrofágokból is.(97) Bár a VEGF az egyik legfontosabb angiogén faktor, melynek mind a tumor prognosztikában, mind a terápia monitorozásában nagy jövőt jósolnak, keringésből történő kimutatására mégsincs egységes ajánlás. Sem a vizsgálandó minta (szérum vagy plazma), sem annak kezelési módja (gyűjtés, kezelés, tárolás) nincs standardizálva. Valószínűleg ennek köszönhető, hogy az egyes publikációkban a meghatározott VEGF szintek abszolút-értékeiben még a kontroll csoportok esetében is igen nagy eltérések mutatkoznak. (98,99) Hólyagtumorban emelkedett VEGF szérumszinteket találtak a kontrollokhoz képest.

(100,101)

Az RNS szintű vizsgálatok tanulsága szerint a felületes hólyagrákok

sokszorosan több VEGF-et expresszálnak, mint invazív formájuk vagy a normál hólyag epithel. Ezt támasztja alá Beecken és mtsai. munkája is. Ők egy funkcionális tesztben emberi köldökvéna endothel sejtjeit (HUVEC - human umbilical vein endothelial cells) kezelték különböző stádiumú hólyagtumoros betegektől származó szérummal, melyek a VEGF szintjét ELISA módszerrel is meghatározták. Azt figyelték meg, hogy a felszínes tumorokból származó szérumok endothelproliferációt serkentő hatása erősebb volt az invazív tumorokból származó szérumokénál. Ez pedig összefüggött a felszínes tumorokban észlelt magasabb VEGF szintekkel. Az áttétes tumorokban szenvedő betegek szérumai csak kis mértékben serkentették az endothelproliferációt. Ezek alapján azt a következtetést vonták le, hogy a magas angiogén szérumaktivitás kedvező prognosztikus jel. CEACAM1-et

(101)

Oliveira-Ferrer és mtsai. egy karcinoembrionális fehérjét a

(karcinoembrionális

antigénszerű

sejtadhéziós

molekula

1)

azonosították, mint a VEGF egyik lehetséges negatív szabályozóját. Immunhisztokémiai vizsgálatokkal kimutatták, hogy az egészséges húgyhólyag felszíni esernyősejtjeiben expresszálódó CEACAM1 a felületes tumorokban már igen korán eltűnik. Ezzel párhuzamosan a VEGF emelkedett expresszióját detektálták. Ezért in vitro kísérletekben, hólyagtumor sejtekben (RT4) antiszenz technikával csendesítették a CEACAM1-et ami a VEGF szignifikáns emelkedéséhez vezetett. (102)

23

Szarvas Tibor


II.3.3.2. Angiopoietin-1 és -2 Az Ang-1 szérumkoncentrációi különböző tumoros betegek esetében változatos képet mutatnak. Az egészséges kontrollokhoz viszonyítva mellrákban szignifikánsan emelkedett, pajzsmirigyrákban csökkent értékét találtak, míg prosztatarákban és akut myeloid leukémiában (AML) változásai nem voltak szignifikánsak.

(103-105)

Az Ang-2

esetében vagy változatlan, vagy emelkedett plazma illetve szérumkoncentrációkat találtak. Mell-, nyelőcső- és tüdőrákban valamint AML-ben a normál kontrollhoz képest emelkedett, míg mások pajzsmirigyrákban változatlan Ang-2 szintet találtak.

(103-107)

A

magasabb Ang-2 szérumkoncentráció AML-ben összefüggést mutatott a rövidebb túléléssel, tüdőrákban pedig a gyakoribb áttétképződéssel és a szervre korlátozódó (stage) progresszióval.

(105, 107)

Cain és mtsai. prosztatarákos betegek műtét előtti és

műtét utáni Ang-1 és Ang-2 plazmakoncentrációit összehasonlítva kimutatták, hogy a posztoperatív Ang-1 szint a műtét előttinek 82%-ára az Ang-2 pedig 27%-ára csökkent, amiből azt a következtetést vonták le, hogy a plazma Ang-2 tartalma főleg a tumorból származik.

(108)

Hólyagtumor vonatkozásában sem az Ang-1, sem pedig az Ang-2

szérumszintjének alakulásáról nincs irodalmi adat. II.3.3.3 Tie2 A proteolítikus emésztés (shedding) következtében az endothel sejtek felszínéről a keringésbe kerülő 75 kDa méretű extracelluláris Tie2 darab tumorgenezisben, vagy tumor angiogenezisben betöltött szerepe ma még tisztázatlan. Findley és mtsai. azonban kimutatták, hogy a Tie2 extracelluláris szakaszának sejtfelszínről történő proteolítikus emésztése VEGF hatására a foszfatidil-inozitol 3- kináz / Akt szignálúton serkenthető. (102)

Az a néhány vizsgálat melynek eredményei tumorok vonatkozásában elérhetők, a Tie2 szérumszintjének normálhoz képest történő emelkedéséről számol be. (103-105) Veserákos betegeknél a magasabb preoperatív Tie2 szérumkoncentráció, gyengébb túlélési esélyekkel mutatott összefüggést. Ugyanezen munka eredményeinek alapján a Tie2 alkalmasnak monitorozására.

látszik (110)

antiangiogén

kezelések

(razoxane)

hatékonyságának

Húgyhólyagrák vonatkozásában eddig nem született a Tie2

expressziót vagy szérumszintet vizsgáló tanulmány.

24

Szarvas Tibor


A fentiek alapján valószínű, hogy a Tie2 oki szerepet játszik a tumorok fenntartásában ezért mind szöveti expressziójának, mind pedig keringésbe jutó oldott formájának alaposabb megismerése szükséges.

II.4. Antiangiogén tumorterápia A Folkman-hipotézis napvilágra kerülése után több mint 30 évvel jelent meg az első hatóságilag is engedélyezett antiangiogén hatású gyógyszer, a bevacizumab (Avastin®). Az antiangiogén terápia iránti lelkesedést mutatja, hogy jelenleg több mint 1000

klinikai

vizsgálatban

mintegy

40

antiangiogén

szert

tesztelnek

(www.clinicaltrials.gov). A legjobban karakterizált és a terápia által leggyakrabban célba vett molekula a VEGF vagy annak valamely receptora. A bevacizumab a VEGF ellen termelt monoklonális ellenanyag, de létezik a VEGF molekulákat „elfogó” és ezáltal hatástalanító szer is (VEGF-trap, Aflibercept®). Más anyagok az angiogén faktorok termelődését csökkentik (IFNα inhibitorok, COX-2 inhibitorok) és léteznek olyanok is melyek a tirozin kináz jelátvitelt gátolják (sunitinib, sorafenib, erlotinib, gefitinib). A korábban széles körben elfogadott állásponttal szemben az antiangiogén szerek feltehetően nem, vagy nem csak a tumor ereinek regresszióba kényszerítésén, hanem azok normalizálásán keresztül fejtik ki hatásukat.

(111)

Ez lehet az oka annak,

hogy az antiangiogén szerek monoterápiában gyakran nem növelték a túlélési időt, viszont más kemoterápiás szerekkel együtt adva vagy sugárkezeléssel kombinálva már jelentős túlélési előnyt jelentettek.

(112)

Ez azzal magyarázható, hogy a normalizált

érhálózattal rendelkező tumorokban az áramlási viszonyok kiegyenlítettebbek, ami lehetővé teszi, hogy a kemoterápiás szerek több tumorsejthez jussanak el. A javuló (vagy homogénebb) oxigenizáltság pedig a sugárterápiára való érzékenységet növelheti.(113-115) A javuló oxigénellátottság csökkenti a hypoxiás területek méretét és mennyiségét, így csökkenhet annak malignitást fokozó hatása.

(116)

Izomra terjedő,

előrehaladott hólyagtumorok esetében ezek a hatások várhatóan nagy előnyt jelentenének, hiszen a mindennapi gyakorlatban alkalmazott kemo- és sugárterápia hatékonysága igen alacsony. Amíg a hagyományos citosztatikus kezelések maximális dózisának többnyire a toxicitás szabott gátat, addig az antiangiogén kezeléseknél a hatásos és a toxikus dózis között nagyobb különbség van. Ezért az optimális terápiás

25


Szarvas Tibor

dózis meghatározásához a kezelés hatékonyságának monitorozására az antiangiogén kezelések esetében jóval nagyobb szükség van. Kézenfekvőnek tűnik tehát a lehetőség, hogy erre az angiogén faktorok szintjének (szöveti expressziójának vagy szérum-, esetleg vizeletkoncentrációjának) meghatározását használjuk fel. Hólyagtumorok esetében ennek további aktualitást ad, hogy ebben az évben kezdődtek a fázis II. vizsgálatok a tirozin kináz gátló sunitinibbel. Az általunk jelen munkában vizsgált faktorok segítséget nyújthatnak a kezelésre kedvezően reagáló csoport kiválasztásában is.

26

Szarvas Tibor


III. CÉLKITŰZÉSEK

1. Munkánk első részében a hólyagtumorok genetikai eltéréseinek tumorszövetből és vizeletből történő kimutatását tűztük ki célul. Összefüggéseket kerestünk: -

az egyes genetikai eltérések jelenléte és a tumor előfordulása között (nem invazív tumorkimutatás)

-

a mutációk közül megpróbáltuk kiválasztani azokat, amelyek a tumor nagyobb malignitásával és invazív növekedési hajlamával mutatnak összefüggést (szövettani diagnózis támogatása molekuláris biológiai módszerrel)

Ehhez a kétféle vizsgálómódszert alkalmaztunk: -

mikroszatellita allélvesztés vizsgálatot: - 12, irodalmi adatok alapján kiválasztott markerrel (a módszer alkalmazhatóságát teszteltük) - 400, az egész genomot 10 cM felbontásban lefedő markerrel (a tumor jelenlétével és szövettanával legerősebben korreláló markerek kiválasztása céljából)

-

fluoreszcens in situ hibridizációt (FISH): UroVysion Kit

2. Munkánk második felében a tumor indukálta angiogenezisben résztvevő faktorok (VEGF,

Ang-1,

Ang-2,

Tie2)

szöveti

mRNS

expressziójának,

szérumkoncentrációjának prognosztikus értékét vizsgáltuk.

27

valamint

Szarvas Tibor


IV. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK IV.1. Mikroszatellita allélvesztés-vizsgálat (12 markerrel) A mikroszatelliták random ismétlődő bázisok alkotta DNS szakaszok. Az ismétlődő egységek állhatnak kettő, három, négy, illetve öt bázisból (di-, tri-, tetra-, pentanukleotid ismétlődések). Mendeli szabályok szerint öröklődnek, vagyis az utód egyik allélja az egyik szülőtől, a másik allélja a másik szülőtől származik. Egy részük polimorf, amit az ismétlődő egységek számának egyénenkénti eltérése okoz. Ha egy adott mikroszatellitát a közeli konzervatív régióra tervezett primerpárral amplifikálunk, heterozigótaság esetén a két allélról különböző hosszúságú PCR-termék keletkezik, így a két allél nagyfelbontású elektroforézissel elválasztva (PAGE, kapilláris elektroforézis) külön-külön látható. Homozigóta lókusznál a két allél egyforma méretű PCR-terméket ad. Az egyén saját, normál (nem tumoros) mintájával való összehasonlítása révén kimutatható a tumoros mintában egy esetleges allélvesztés (loss of heterozigosity – LOH), ami deléció jelenlétére utal. IV.1.1. Vizsgált minták Vizsgálatainkhoz 44 a Semmelweis Egyetem Urológiai Klinikáján hólyagtumor miatt operált beteg (13 nő, 31 férfi, átlagéletkor 74 év) vér, vizelet és tumoros szövetmintáit használtuk. Tizennyolc esetben a tumor, míg 4 esetben a vizelet üledék nem állt rendelkezésre. Vér és vizelet mintákat gyűjtöttünk továbbá 16 egészséges (normál kontroll) és 20 más – nem tumoros – urológiai betegségben szenvedő személytől (urológiai kontroll) is. A szövettani diagnózis felállítása a WHO hólyagtumorokra vonatkozó 2004-es irányelvei alapján történt.

(117)

A betegek stage-

grade eloszlását valamint a kontrollok diagnózisait az 1. táblázat foglalja össze. IV.1.2. Mintagyűjtés és DNS izolálás A tumoros betegektől műtét előtti vér- és vizeletmintákat valamint műtét során kimetszett tumorokat gyűjtöttünk. A vérmintákat EDTA-s csövekbe gyűjtöttük, ezek mononukleáris sejtjei szolgáltak a mikroszatellita-vizsgálat negatív kontrolljaként.

28

Szarvas Tibor

Húgyhólyagrákok diagnosztikai és prognosztikai módszerei 1. táblázat: Betegek és kontrollok klinikai adatai Stage, Grade

n = 44

Kontroll

n = 36

Ta

7

BPH

6

T1

18

Vesekő

6

T2

18

Colica renis

2

T3

1

Cystitis

3

T4

0

Prostatitis

1

G1

4

Phimosis

1

G2

20

Stressz inkont.

1

G3

20

Egészséges

16

A tumormintákat -70 oC-on tároltuk. A vizeletmintákat centrifugálást követően (3000 o

rpm 4

C, 20 perc) felülúszóra és üledékre választottuk szét. A két frakciót

felhasználásig -70 oC-on tároltuk, belőlük később külön-külön izoláltunk DNS-t. A vizelet felülúszókból történő DNS izolálás során az izoláló kit használatát megelőzően a nukleinsavat izopropanol és 5M-os NaCl oldat segítségével kicsaptuk, a csapadékot centrifugáltuk (3000 rpm, 4 oC, 10 perc), a pelletet 70% etanollal mostuk, majd kiszárítottuk. A fentiek szerint előkészített mintákból High Pure PCR Template Preparation Kittel (Roche, Indianapolis, MN, USA) DNS-t izoláltunk a gyártó előírásait követve. Az izolált DNS koncentrációját spektrofotométerrel (GeneQuant II, Cambridge UK) 260 nm hullámhosszon mértük. Az izolált mintákat további felhasználásig 4 oC-on tároltuk. IV.1.3. Polimeráz láncreakció Minden mintában 12 mikroszatellita régiót szaporítottunk fel, melyek hat kromoszóma különböző régióin találhatók (2. táblázat). A primereket irodalmi adatok alapján választottuk ki; a szekvenciák a 2. táblázatban foglalt GDB (genomic database) sorszám alapján a www.gdb.org honlapon visszakereshetők. A forward primer 5’-vége fluoreszcens festékkel (6-FAM, HEX vagy NED) jelölt. A reverse primer 5’-vége a komplementer szekvencia után egy 5’-GTTTCTT-3’ „farkat” (tailed primer) tartalmaz, amivel a Taq DNS polimeráz egy nemkívánatos tulajdonságát lehet kivédeni. A Taq DNS polimerázra jellemző, hogy a PCR termék 3’-

29

Szarvas Tibor


végére további, a templáttal nem komplementer nukleotidot, általában adenozint épít be. Ez a folyamat azonban ritkán megy végbe teljesen, vagyis nem minden fragmentet érint, és így olyan termékek halmozódnak fel, melyek egymástól 1 bp-ban különböznek. Ez megnehezíti a kiértékelést. Brownstein és mtsai. kimutatták, hogy a reverse primer 5’végéhez egy 5’-GTTCTT-3’ szekvenciát kapcsolva a komplementer szál közel teljes adenilációja érhető el. (118) 2. táblázat: A mikroszatellita allélvesztés-vizsgálat során alkalmazott primerek.

primer

GDB #

lokalizáció

ismétlődéstípus (nukleotidok száma)

fluoreszcens jelölés

FGA

215015

4q28

tetra-

HEX

D4S243

182214

4q32

tetra-

HEX

ACTBP

185264

5q15

tetra-

NED

D9S171

188218

9p12

di-

HEX

D9S162

188003

9p21

di-

6-FAM

IFNA

196683

9p21

di-

6-FAM

D9S747

335542

9q32

tetra-

HEX

MJD

1391717

14q24.3

di-

6-FAM

D16S310

182263

16q12

tetra-

6-FAM

D16S476

198392

16q24

penta-

NED

D18S51

187689

18q21

tetra-

6-FAM

MBP

196682

14q32

tetra-

NED

Az amplifikálást ABI 7000 PCR készülékben végeztük (Applied Biosystems). Egy reakcióban egy minta egy mikroszatellita régióját szaporítottuk fel 25 µl végtérfogatú reakcióelegyben, melynek összetétele a következő volt: 12,5 µl reakciópuffer (Sigma-Aldrich, Seelze, Németország), 2-2 µl 2,5 µM forward és reverse primer, 3 µl 10 ng/µl koncentrációjú templát DNS, 5,5 µl desztillált víz (Sigma-Aldrich, Seelze, Németország). Az

anellációs

hőmérsékletek

optimalizálását

célzó

kísérleteink

(ezek

eredményeit itt nem részletezzük) azt mutatták, hogy mindegyik primer jól működik 60oC körüli anellációs hőmérsékleten. Ezért a továbbiakban egy kétlépéses hőmérsékleti profillal rendelkező programot használtunk melyben a denaturáció 95 oC-on 1 percig, míg az anelláció és extenzió egy lépésben 60 oC-on ugyancsak 1 percen át zajlott, 35

30


Szarvas Tibor

cikluson keresztül. Végül egy egyszeri extenziós lépés (72 oC-on, 10 percen át) zárta a reakciót. IV.1.4. Elektroforézis A mikroszatelliták amplifikációja során keletkező termékek mérete 100-300 bp. Az egy lókuszhoz tartozó allélek közötti méretkülönbség kicsi (gyakran csak 2-3 bp) ezért a PCR termékek elválasztásához nagy felbontóképességű módszerre van szükség. Az egyik lehetőség a szekvenáláshoz is használt poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE). Ebben az esetben a radioaktív nukleotidokkal történő jelölés vagy az elválasztás utáni ezüstfestés teszi láthatóvá a PCR termékeket. A kvantitatív kiértékeléshez a terméket jelző sáv intenzitását kell megállapítani szabad szemmel, esetleg denzitométerrel. A másik nagyfelbontású elválasztást lehetővé tévő módszer a kapilláris elektroforézis. A kapilláris egy vékony, géllel telt cső, melyben a PCR termékek elektromos feszültség hatására méretük függvényében különböző sebességgel vándorolnak a pozitív pólus felé. Ennek megfelelően különböző időpontban érkeznek meg a kapilláris egy adott pontjára (a detektorablakba), ahol a primerek által rájuk kapcsolt fluoreszcens festék gerjesztését követően válnak láthatóvá. A jelölésre három különböző fluoreszcens festék használható (FAM, NED, HEX), így az azonos mérettartományban detektált termékekből multiplex módon három-három futtatható együtt. A módszer előnye, hogy gyors és precíz (a termékek méretét ±1 bp eltéréssel adja meg) valamint, hogy a detektált fluoreszcencia-intenzitás arányos a keletkezett termék mennyiségével, és ez az analízis során számszerűsíthető, ami igen objektívvé teszi az eredmény kiértékelését. Az amplifikálás során keletkezett termékeket hígítást és denaturálást (95oC, 5 perc) követően kapilláris elektroforézissel választottuk el (ABI Prism 310 Genetic Analyzer, Applied Biosystems).

IV.1.5. Kiértékelés A kapilláris elektroforézissel kapott eredményeket GeneScan 3.7 szoftverrel értékeltük. Az allélek azonosítása a PCR termékek méretének (fragment-hosszának) meghatározásán alapszik. A „hagyományos” gélelektroforézishez hasonlóan, a 31


Szarvas Tibor

kapilláris elektroforézisnél is szükség van méret-standardra (mólsúly-standard), amit a mintákhoz keverve futtatunk (GeneScan-500, Applied Biosystems). Mivel ez egy negyedik fajta fluoreszcens festékkel van jelölve (ROX) ezért jól elkülönül a vele együtt futtatott mintáktól. Az egyes fragmentek méretét a program a mintával együtt futtatott méret-standardhoz viszonyított elhelyezkedése alapján határozza meg ±1 bp pontossággal. A méret mellett a csúcsmagasság értékeket is megjeleníti a program, ami az adott fragment fluoreszcencia-intenzitását mutatja. Ez arányos a keletkezett PCR termék mennyiségével. Ugyanazon beteg egy mikroszatellita lókuszát vizsgálva a negatív kontroll vérmintához képest a tumorsejteket tartalmazó mintában (vizelet és tumor) az allélek arányaiban bekövetkező eltérés jelzi a deléciót. Ennek megítélésére egy általánosan elfogadott számolási módszert alkalmaztunk: a kapott fragmentek csúcsmagasságának arányát minden mintában külön kiszámoltuk. A kisebb méretű allél csúcsmagasságát elosztottuk a nagyobb méretű allél csúcsmagasságával, (így a futtatások közötti eltérések minimalizálhatók). Ezután az egészséges, mutációmentes szövetben (vér) kapott arányt a tumoros szövetben (tumor, vizelet) kapott arányhoz viszonyítottuk. Ötven százaléknál nagyobb eltérés allélvesztésre utal (5. ábra). A módszer reprodukálhatóságának vizsgálata során (ezen eredmények bemutatására itt nincs mód) arra a következtetésre jutottunk, hogy egy bizonyos csúcsmagasság érték alatt (RFU<100) a párhuzamos mérésekben kapott csúcsmagasságarányok nagymértékű szórást mutattak. Ennek oka legtöbbször a túl alacsony mennyiségű DNS bemérés. Az ilyen eredményeket (nem értékelhető jelöléssel) kizártuk a további vizsgálatból. Ez főleg az egészséges kontrollok vizelet felülúszóinál fordult elő.

32


Szarvas Tibor

5. ábra: Tipikus allélvesztés (D11S1320) tumormintában, kapilláris elektroforézissel megjelenítve. A számolás során a kontrollként használt vérben talált allélarányt osztjuk a vizsgált mintában (vizeletben, tumorban) talált allélaránnyal. Amennyiben a két arány több mint 50%-ban különbözik egymástól (azaz hányadosuk 0,5-nél kisebb vagy 1,5-nél nagyobb) akkor allélvesztésről beszélünk. A deléciót szenvedett allél csak abban az esetben „tűnik el” teljesen, ha a tumorminta egyáltalán nem tartalmaz normál (egészséges) sejteket. Ez a gyakorlatban sosem fordul elő, tehát valamennyi egészséges szövettel való „szennyeződéssel” mindig számolni kell. A minta ezen részéből pedig a tumorsejtekben egyébként elveszett allél is felsokszorozódik, így allélvesztést tartalmazó tumor mintáiból elvégzett vizsgálat eredményeként is (a homozigóta eseteket kivéve) mindig két csúcsot detektálunk, melyek csúcsmagasság arányai rendszerint jelentősen eltérnek a kontrollétól.

33

Szarvas Tibor


IV.2. Teljes genom mikroszatellita-allélvesztés vizsgálat (400 markerrel) IV.2.1. Vizsgált minták Vizsgálataink ezen részében mind a Semmelweis Egyetem Urológiai Klinikáján, mind az Essen-Duisburgi Egyetem Urológiai Klinikáján gyűjtött összesen 17 személy vér- és hólyagtumor mintáit vizsgáltuk (3. táblázat). 3. táblázat: Avizsgált betegek neme és tumoraik szövettani adatai Stage, Grade

n = 17

Ta

13

T1

4

T2-4

0

G1

8

G2

7

G3

2

ffi

13

nő

4

IV.2.2. Mintagyűjtés és DNS izolálás A mintagyűjtés a korábban leírtakkal megegyező módon történt (lásd IV.1.2.). Az egyetlen különbség az volt, hogy ennél a 17 mintánál a tumortartalom igazolására 710 μm vastag metszeteket készítettünk, melyeket hematoxilin-eozin festést követően patológus értékelt. Csak azokból a mintákból izoláltunk DNS-t melyekben a tumorsejtek aránya 50% felett volt. IV.2.3. Polimeráz láncreakció A módszer részletei az előzőekben ismertetettel (IV.1.3.) megegyeznek. A reakció összetétele és a reakció hőmérsékleti profilja viszont eltérő volt (4-5. táblázat). A polimeráz láncreakciót a GenoID Kft. laboratóriumában végeztük ABI 9600-as készüléken (Applied Biosystems).

34

Szarvas Tibor


4. táblázat: A PCR összetétele Komponens

Bemért térfogat (μl)

True Allele Premix®

4,5

Primer Mix (5 μM)

0,5

DNS templát (50ng/ml)

0,6

Desztillált víz

1,9

Összesen

7,5

5. táblázat: A PCR hőprofilja Lépés

Hőmérséklet

Idő

95 oC

12 min.

Kezdeti denaturáció

o

Denaturáció

94 C

15 sec.

Anelláció

55 oC

15 sec.

Extenzió

72 oC

30 sec.

Denaturáció

o

15 sec.

o

15 sec.

o

89 C 55 C

Anelláció Extenzió

72 C

30 sec.

Végső extenzió

72 oC

10 min.

10 ciklus

20 ciklus

A primerek az Applied Biosystems Linkage Mapping Set 2.5 kittjéből származtak. Ez a 400 primerpárt tartalmazó gyűjtemény úgy van összeállítva, hogy az egyes markerek egymástól átlagosan 10 cM távolságban (1cM~15kb) helyezkedjenek el a kromoszómákon. Így a teljes genom 10 cM felbontásban végigszűrhető. A módszer előnye, hogy olyan kisméretű deléciók kimutatására is alkalmas melyek más, citogenetikai módszerekkel nem detektálhatók. A használt mikroszatellita primerek szekvenciái a GDB adatbázisából (www.gdb.org) a markerek neve alapján visszakereshetők (lásd eredmények fejezet: 11. ábra).

35

Szarvas Tibor


IV.2.4. Kapilláris elektroforézis A kapilláris elektroforézis a IV.1.4. fejezetben leírtakkal megegyező módon történt, azzal a különbséggel, hogy az elektroforézist egy 4 kapillárissal ellátott, azaz egy időben 4 minta futtatására alkalmas ABI 3100-Avant (Applied Biosystems) készülék végezte. IV.2.5. Kiértékelés Az eredményeket a Gene Mapper 3.1-es szoftverrel értékeltük. Ez a program (az előre beadott méret és jelölési adatokból) képes automatikusan azonosítani, hogy melyik termék melyik primertől származik, ez alapján táblázatos formában meg is jeleníti az eredményeket, ami nagy segítség ilyen mennyiségű adat kezelésénél. Egy személy mintáinak analíziséhez 800 PCR reakciót (400-at vérből, 400-at szövetből), és 56 kapilláris elektroforézist kell elvégezni, melynek eredményeképpen – minden marker esetében heterozigótasággal számolva – 1600 csúcsmagasság érték generálódik. A Gene Mapper által elkészített táblázatokat és a nyers adatokat is minden esetben egyenként ellenőriztük, majd az eredményeket Excel-táblázatba exportáltuk. Az allélarányok kiszámítása után az eredményeket a 6. ábrán szemléltetett módon összegeztük.

Chromosome 9

Chromosome 5

366 TaG2 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128

D5S1981 D5S406 D5S630 D5S416 D5S419 D5S426 D5S418 D5S407 D5S647 D5S424 D5S641 D5S428 D5S644 D5S433 D5S2027 D5S471 D5S2115 D5S436 D5S410 D5S422 D5S400 D5S408

185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204

D9S288 D9S286 D9S285 D9S157 D9S171 D9S161 D9S1817 D9S273 D9S175 D9S167 D9S283 D9S287 D9S1690 D9S1677 D9S1776 D9S1682 D9S290 D9S164 D9S1826 D9S158

H. H.

H.

H.

H. H. H. LOH LOH LOH LOH LOH LOH LOH LOH LOH H. LOH LOH H. LOH LOH H. H. LOH H.

475 476 571 TaG1 T1G3/CIS TaG2 LOH H. H. H. H. LOH H. LOH N.I. H. H. N.I. N.I. LOH H. LOH LOH LOH LOH LOH H. LOH N.I. N.I. LOH LOH LOH N.I. N.I. LOH N.I. N.I. LOH H. H. LOH LOH N.I. N.I. LOH LOH LOH LOH LOH H. N.I. N.I. LOH N.I. LOH LOH LOH N.I. LOH LOH N.I. H. N.I. N.I.

LOH

H. LOH LOH LOH LOH LOH H. LOH LOH H. LOH LOH N.I. LOH LOH N.I.

LOH H. LOH LOH H. N.I. N.I. H. N.I. LOH H. H. N.I. N.I. H. LOH N.I. H. N.I. N.I.

416 T1G3 H.

499 T1G1

405 TaG2

630 TaG1

535 TaG2

14 TaG2

H.

Shift H.

H.

19 TaG1

125 T1G2

597 TaG1 H.

244 TaG1

252 TaG1 H.

H. LOH

271 TaG1 H.

N.I. LOH LOH H. LOH H. LOH LOH LOH N.I. LOH LOH H. LOH LOH H. LOH LOH LOH LOH LOH LOH LOH H. LOH LOH H. LOH LOH H. LOH LOH H. LOH H. LOH LOH LOH

H. N.I.

H.

H. H.

H. H.

H.

LOH

H.

shift H.

LOH H.

LOH H. H.

N.I.

H.

LOH H.

H. H.

N.I. N.I. N.I.

H.

LOH H.

H.

H.

H. H.

H.

H.

LOH H.

H. H.

LOH

H.

H.

H. H.

H. LOH LOH LOH LOH LOH LOH LOH H. LOH H. H. LOH LOH LOH LOH LOH

H. H.

H. LOH LOH LOH LOH LOH LOH LOH LOH LOH H. LOH LOH LOH LOH H. H. LOH LOH LOH

LOH H. LOH LOH LOH LOH LOH LOH LOH LOH LOH LOH LOH

LOH LOH H. LOH LOH LOH LOH H. H. N.I.

LOH LOH LOH H. H. H.

N.I. N.I. H.

LOH H. H. LOH LOH LOH LOH LOH LOH LOH H. LOH LOH H. H. LOH H. LOH H. LOH

LOH H. H.

H.

LOH LOH H.

H.

H. H. LOH

LOH H. LOH H.

H. H.

658 TaG2 H. LOH LOH LOH LOH H.

LOH LOH LOH H. LOH LOH LOH H. LOH LOH LOH LOH LOH LOH H. H. LOH LOH LOH

LOH H. H. LOH LOH H. LOH LOH LOH LOH H. LOH LOH LOH LOH LOH H. LOH LOH LOH

LOH LOH LOH LOH LOH LOH H. LOH LOH LOH LOH LOH LOH LOH H. N.I. LOH LOH LOH LOH H.

LOH LOH LOH H. LOH LOH LOH H. LOH LOH H. H. LOH LOH

H.

H. H.

H.

H. H.

H.

H.

H. H.

6. ábra: A linkage mapping set-el talált allélvesztések (LOH) az 5-ös és a 9-es kromoszómán. Kék – nem kiértékelhető, Zöld – normál allél, N.I. – nem informatív, H – homozigóta allél, shift – méreteltolódás.

36

Szarvas Tibor


IV.3. UroVysion FISH – vizsgálat A fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) egy molekuláris citogenetikai módszer, mely különféle kromoszóma-rendellenességek kimutatására alkalmas. Használata számos diagnosztikai alkalmazásban a mindennapi gyakorlat részét képezi. Segít a diagnózis felállításában (pl. nem-random kromoszóma-átrendeződések kimutatása leukémiában), a reziduális tumor kimutatásában és a terápia helyes megválasztásában. A módszer DNS hibridizáció elvén működik; a metafázisban vagy interfázisban lévő kromoszómák denaturációját követően egy fluoreszcensen jelölt DNS-próbát juttatunk a sejtmagba, mely a bázispárosodás elvének megfelelően a kívánt szekvenciához kötődik. A sejtmagokat megfelelő festéssel láthatóvá téve megfelelő (fluroeszcens) mikroszkóppal a keresett szekvenciák jelenléte tanulmányozható. Ilyen módon kimutathatók kromoszóma aneuploidiák, deléciók, amplifikációk és nemrandom átrendeződések. Az UroVysion a hólyagtumoros sejtek vizeletből történő kimutatására alkalmas FISH alapú módszer. A kit a hólyagtumoros sejtekben leggyakrabban előforduló kromoszóma

eltérésekre

specifikus

fluoreszcens

szonda

DNS-eket

tartalmaz.

Centromérához közel illeszkedő próbákkal vizsgálja a 3-as, a 7-es és a 17-es kromoszómákat, valamint egy lókusz-specifikus 9p21-es kromoszóma régióra tervezett próbával e szakasz delécióját monitorozza. A kittet a vizelet citológia kiváltására tervezték, mivel annak szenzitivitása korai stádiumú tumorokban alig haladja meg az 50%-ot. IV.3.1. Vizsgált minták Összesen 55 cisztoszkópos vizsgálaton átesett személy vizeletmintáját analizáltuk. Közülük 43 szenvedett hólyagtumorban (6. táblázat). A szövettani diagnózis felállítása ezúttal is a WHO hólyagtumorokra vonatkozó 2004-es irányelvei alapján történt. (117) A betegek stage-grade eloszlását valamint a kontrollok diagnózisait a 6. táblázat foglalja össze.

37

Szarvas Tibor

Húgyhólyagrákok diagnosztikai és prognosztikai módszerei 6. táblázat: UroVysion FISH vizsgálatnak alávetett betegek és kontrollok. Stage, Grade

n = 43

Kontroll

n = 12

Ta

9

Gyulladás

5

T1

24

Hiperplázia

2

T2

10

Papillóma

2

G1

9

Normál

2

G2

18

G3

16

IV.3.2. Mintagyűjtés és előkészítés Napi első (reggeli-) és második vizeleteket gyűjtöttünk. Ezek 33 ml-ét, a mintavételt követő maximum 2 órán belül, 15 ml Carbowax-os fixálóoldattal (2% polietilén-glikol és 50% etanol) kevertük össze és felhasználásig 4 oC-on tároltuk. Ilyen módon a minta legfeljebb egy hétig tárolható. A minta további feldolgozása az UroVysion kit leírásának megfelelően történt. Röviden, a vizelet sejtes elemeinek centrifugálással (600 g, 10 perc) történő elválasztása után a felülúszót eldobtuk és csak az üledékkel dolgoztunk tovább. Tíz ml PBS-sel történő mosást és újabb centrifugálást (600 g, 10 perc) követően a felülúszót ismét kiöntöttük és az üledéket kis térfogatú PBS-sel felszuszpendáltuk. Ezután 5 ml Carnoy fixálóoldatot adtunk a felszuszpendált sejtekhez. A Carnoy-oldat metanol (Fluka, Buchs, Svájc) és jégecet (Sigma-Aldrich, Seelze, Németország) 3:1 arányú keverékéből áll. Az így elkészült elegyet -20 oC-on inkubáltuk 10 percen át, majd centrifugálás következett (600 g, 10 perc). Amennyiben jól látható pellet keletkezett akkor a felülúszó elválasztása után 500 μl fixálószerben vettük fel a sejteket. Ezek után 3 μl, 10 μl és 30 μl sejtszuszpenziót cseppentettünk tárgylemezekre; hagytuk megszáradni és mikroszkóp alatt kiválasztottuk a megfelelő sejtsűrűséget biztosító térfogatot. A kiszárított lemezeket nátrium-klorid, nátrium-citrát oldatba helyeztük és 1 órán át 37 oC-on inkubáltuk, majd 1-es pH-jú 0,5 mg/ml koncentrációjú pepszin oldattal 37 oC-on 15 percig emésztettük. Mosást követően (1x PBS, 5 perc) 1 %-os formaldehiddel 5 percig fixáltuk majd felszálló alkoholsorban inkubáltuk (70% – 85% - 100%) 1-1 percig, végül az így előkészített sejteket kiszárítottuk.

38

Szarvas Tibor


IV.3.3. In situ hibridizáció A hibridizációt az UroVysion kit előírásait követve hajtottuk végre. A direkt jelölt DNS-próbák CEP 3 (piros), CEP 7 (zöld), CEP 17 (világoskék), 9p21 LSI (sárga) egy közös oldatban állnak rendelkezésre. A sejtmagokat DAPI-festéssel tettük láthatóvá. IV.3.4. Kiértékelés Az előzőek szerint elkészített preparátumokat Leica DM RXA fluoreszcens mikroszkóppal (Leica, Wetzlar, Németország) vizsgáltuk, melyre SpectrumRed, SpectrumGreen, SpectrumAqua, SpectrumGold illetve DAPI/FITC/Texas Red filtereket helyeztünk. A felvételeket 1000-szeres nagyításnál Piper FK-7512-IQ nagy felbontású CCD kamerával (PIPER, Schwerte, Németország) készítettük. A kiértékelés során a gyártó útmutatásaiban szereplő kritériumokat követtük. Ezek alapján legalább 25 rendellenes sejtre vonatkozóan azokat az eseteket értékeltük pozitívnak melyekben legalább 12 sejt esetében hiányzik az LSI 9p21 sárga szignálja, vagy legalább 4 sejtben látható egyszerre kettő a 3-as, 7-es vagy 17-es kromoszóma eltéréseiből. Rendellenesnek azokat a sejteket tekintettük, amelyekben a vizsgált markerekkel eltérések látszottak, valamint azokat melyek morfológiai abnormalitást mutattak. Az eredmények statisztikai kiértékelése során a különböző csoportokban előforduló

eltérések

számát

Mann-Whitney-teszt

és

Kruskal-Wallis-teszt

alkalmazásával vetettük össze, amihez GraphPad szoftvert használtunk (San Diego, CA, USA).

39


Szarvas Tibor

IV.4. RNS expressziós vizsgálatok Az RNS-szintű génexpressziós vizsgálatokat húgyhólyagrákban szenvedő betegek fagyasztott mintáiból kiindulva végeztük el. Célunk a tumor indukálta angiogenezisben részt vevő angiogén faktorok (Ang-1, Ang-2, Tie2, VEGF) szöveti expressziójának a tumor későbbi viselkedésében betöltött szerepének tisztázása volt. IV.4.1. Vizsgált minták RNS expressziós vizsgálatainkhoz 321 darab, az Essen-Duisburgi Egyetem Urológiai Klinikájának tumorbankjából származó, 1991 és 1996 között gyűjtött hólyagtumormintát és 5 normál hólyagepithelt választottunk ki. A mintavétel óta -70oCon tárolt szövetdarabokból 7-10 μm vastagságú metszeteket készítettünk, melyeket hematoxilin-eozin festés után az Essen-Duisburgi Egyetem Patológiai Intézetének patológus munkatársai a WHO 2004-ben közzétett irányelvei alapján újból értékeltek. A szövettani diagnózis pontosítása mellett a százalékos tumortartalmat is megállapították. Ezután csak azt a 113 mintát vetettük alá további vizsgálatoknak melyekben a tumorsejtek aránya 50% fölött volt. A 113 beteg (25 nő, 88 férfi) átlagéletkora a mintavétel idején 71,6 év volt (3696). A minták szövettanuk szerint a következő eloszlást mutatták: Ta (31), T1 (17), T2 (13), T3 (39), T4 (13), G1 (17), G2 (40), G3 (56) (lásd eredmények fejezet: 13. táblázat). Hatvanhárom esetben a mintavétel az első diagnózis idején történt, míg 50 esetben visszatérő tumortól származott. A betegek nagyjából fele dohányos volt (49 igen, 54 nem, 10 nem ismert). IV.4.2. RNS izolálás Az RNS-izolálást megelőzően a mintákat 1 ml QIAzol reagensben (Qiagen, Hilden, Németország) Turrax T25 készülékkel (Janke & Kunkel, Freiburg, Németország) homogenizáltuk. Az elegyhez 200 μl kloroformot mértünk, majd vortexelés és 3 perces szobahőmérsékleten történő inkubáció után, 15 percig 12 000 gvel centrifugáltuk. Ezt követően leszívtuk a felső fázist, amihez 500 μl izopropanolt

40


Szarvas Tibor

adtunk. Tíz perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után 12 000 g-vel 10 perces centrifugálás következett. A felülúszó leöntése után 1 ml 75%-os etanolt mértünk a csőbe, és 10 percig 7500 g-vel centrifugáltuk. A felülúszó leöntését követően az RNS precipitátumot tartalmazó csövet jégbe állítva hagytuk megszáradni. Az így kapott pelletet azután RNeasy mini kittel (Qiagen, Hilden, Németország) tisztítottuk tovább, annak előíratát követve. Az RNS-koncentrációt fotométer (Peqlab ND-1000, Erlangen, Németország) segítségével mértük 260 nm hullámhosszon. E mellett az izolált nukleinsavat 1,5%-os agaróz gélen elektroforézissel is elválasztottuk. IV.4.3. Reverz transzkripció (RT) A reverz transzkripciót a Qiagen Omniscript RT kittjével (Qiagen, Hilden, Németország) 20 μl végtérfogatban, 10 egység RN-áz inhibitor, 40 egység reverz transzkriptáz, 1,8 μM oligo dT, 0,5 mM dNTP, 1x RT puffer és 200 ng RNS felhasználásával végeztük. A cDNS szintézis 37 oC-on 60 percen keresztül egy Eppendorf Mastercycler (Hamburg, Németország) készülékben történt. IV.4.4. Valós-idejű kvantitatív PCR (RT-PCR) A vizsgált angiogén faktorok szöveti expresszióját RNS-izolálást és reverz transzkripciót követően valós idejű PCR technikával határoztuk meg. A valós-idejű PCR lehetővé teszi, hogy a láncreakció minden ciklusában meghatározzuk az addig keletkezett termékek összmennyiségét. Ez többféle módszerrel lehetséges, melyek közül mi az Applied Biosystems TaqMan rendszerét használtuk. Ezen belül is az előre beállított, ezáltal jól reprodukálható ún. Gene Expression AssayTM-t. Az eredmények kiértékeléséhez szükség van egy referenciaként használt belső standard ún. háztartási gén (hausekeeping gene) expressziójának párhuzamosan történő meghatározására. A legfontosabb kritérium a háztartási génnel szemben, hogy expressziója megegyezzen a tumorban és annak a szövetnek az egészséges sejtjeiben melyből a tumor ered. Mivel a tumor terjedési stratégiájának egyik fontos eleme, hogy a környező sejtek génjeinek kifejeződését megváltoztatja ezért a megfelelő háztartási gén felkutatása nem egyszerű feladat. Ohl és mtsai. 9 általánosan használt referencia gén expresszióját vizsgálták egészséges húgyhólyagepithel és hólyagtumorban. Arra a következtetésre jutottak, hogy 41


Szarvas Tibor

a leggyakrabban alkalmazott GAPDH expressziója szignifikáns eltérést mutatott a normál és a tumorszövet között így nem alkalmazható referenciagénként. Ezzel szemben a TBP és a SDHA gének expressziói nem mutattak különbséget a malignus és normál szövet összehasonlítása során, így ezek alkalmazhatók hólyagtumor vizsgálatára. (119) Közülük mi az TBP-t (TATA box binding protein) használtuk. A TaqMan® detektálás lényege, hogy a két primer mellett (forward és reverse) egy harmadik oligonukleotid is belekerül a rakcióelegybe. Ennek szekvenciáját úgy választják meg, hogy az anelláció során a két primer közé kötődjön. A próba 5’ végéhez egy fluoreszcens festékkel jelölt ún. riporter molekula kapcsolódik, míg a próba 3’ végén egy nem fluoreszcens quencher (kioltó) molekula található. Ha a próba intakt állapotban van a quencher molekula kioltja a riporter fluoreszcenciáját. A használt polimeráz enzim az elongáció során 5’ exonukleáz aktivitásának köszönhetően lehasítja az útjába kerülő próbát, méghozzá oly módon, hogy az azt alkotó bázisok egyenként szakadnak le. Ennek következtében a riporter- és a quencher molekula eltávolodik egymástól így az előbbi felszabadul a gátlás alól, fluoreszcenciája mérhető lesz. A TaqMan® rendszernek köszönhetően tehát a PCR minden ciklusában megmérhető a termék DNS mennyisége, ezáltal felrajzolható a reakció kinetikai görbéje, amiből kiszámítható a vizsgált termék kiindulási mennyisége. Ezt a módszert relatív kvantifikálásnak nevezzük, mivel a változások csak egy másik mintához képest (mi esetünkben az 5 egészséges hólyagepithel) adhatók meg (legtöbbször a változás százalékában). Ennek hátránya, hogy azonos változásokat csak ugyanahhoz a kontrollhoz viszonyítva kaphatunk, így a különböző laboratóriumok által kapott eredmények erősen eltérhetnek egymástól. Ennek kiküszöbölésére alkalmaztuk a Stratagene (La Jolla, CA, USA) által gyártott Universal Human Reference RNATM terméket, mely 10 különböző humán sejtvonalból izolált RNS-t tartalmaz. Ezek stabil mRNS összetételüknek köszönhetően mindenki számára hozzáférhető kontrollként szolgálhatnak. Így különböző munkacsoportok is azonos kontrollhoz viszonyíthatják méréseiket, ami nagyban elősegíti a kísérletek reprodukálhatóságát. A használt primerpróba szettek lokalizációjára vonatkozó adatokat a 7. táblázat mutatja. A valós-idejű polimeráz láncreakció összetételét a 8. táblázat mutatja, míg annak hőmérsékleti profilja a 9. táblázatban látható.

42

Szarvas Tibor


7. táblázat: Primerek és próbák lokalizációja, termék mérete, referencia szekvencia és azonosítószám.

Gén

Lokalizáció exon-határ

Termékhossz

NCBI referencia szekvencia

Assay ID / Part Nr.

Ang-1

7-8

86

NM_001146.3

Hs00919202_m1

Ang-2

3-4

95

NM_001147.1

Hs01048042_m1

Tie2

20-21

92

NM_000459.1

Hs00945144_m1

VEGF

3-4

59

NM_001025366.1

Hs00900055_m1

TBP

6

127

-

4333769

8. táblázat: A valós idejű PCR összetétele. Komponens

Bemérés

TaqMan® Master Mix

10 μl

Assay (primer és próba)

1 μl

cDNS templát

200 ng

Desztillált víz

20 μl-ig

Összesen

20 μl

9. táblázat: A valós idejű PCR hőprofilja. Lépés

Hőmérséklet

Idő

95 oC

10 min.

Kezdeti denaturáció Denaturáció

o

15 sec.

o

60 sec.

95 C 60 C

Anelláció-Extenzió

40 ciklus

IV.4.5. Kiértékelés Az adatokat a Sequence Detection SoftwareTM (SDS) 1.3 használatával értékeltük. A görbék analízisénél először meghatározunk egy a reakciók exponenciális fázisába eső fluoreszcencia küszöbértéket. A program ezután automatikusan táblázatba foglalja azokat a ciklusszámokat melyekben az adott reakció eléri a küszöbértéket. Ezeket a ciklusszám értékeket nevezzük CT értéknek. Az általunk alkalmazott ∆∆CT módszer szerint először meghatároztuk a vizsgált gén (pl. VEGF) CT-értékét valamint a belső standard (TBP) CT-értékét a kérdéses (tumor) mintában és a kontroll mintában is. 43

Szarvas Tibor


Az így kapott négy érték a következő: CT (VEGF-minta), CT (VEGF-kontroll), CT (TBP-minta), CT (TBPkontroll).(Az

egyes színek megfelelnek a 7. ábrán látható amplifikációs görbék színeinek.)

A számolás menete az alábbiakban látható: ΔCT (VEGF) = CT (VEGF-MINTA) - CT (VEGF-KONTROLL) ΔCT (TBP) = CT (TBP-MINTA) - CT (TBP-KONTROLL) ΔΔCT = ΔCT (VEGF) - ΔCT (TBP) Relatív expresszió (VEGF/TBP) = 2 ΔΔCT

ΔCT (TBP)= 6 ΔCT (TBP)= -1 ΔΔCT = 7

Relatív expresszió (VEGF/TBP) = 2 ΔΔCT (27) = 128

7. ábra: Génexpressziós értékek kiszámítása ∆∆CT módszerrel.

IV.4.6. Statisztikai analízis Csoportok

közötti

különbségek

megítélésére

a

Mann-Whitney-tesztet

alkalmaztuk, míg az egyes faktorok túlélésre (áttétmentes-, recidívamentes- és betegségfüggő túlélés) gyakorolt befolyásának vizsgálatára Kaplan-Meier és Cox-tesztet használtunk (lásd IV.6.). A szignifikancia határértéke minden esetben 0,05 volt. A számolásokat SPSS 14.0 programmal végeztük.

IV.5. Fehérje szintű vizsgálatok E mérések a korábban valós idejű PCR-rel meghatározott molekulák (Ang-1, Ang-2, Tie2, VEGF) szérumban történő fehérje-meghatározásra irányultak. Azt vizsgáltuk, hogy ezen molekulák analízise szolgáltat-e a mindennapokban is felhasználható prognosztikus információt a betegség lefolyására nézve. Összefüggéseket

44

Szarvas Tibor


kerestünk tehát az egyes angiogén fehérjék szérumkoncentrációja és a betegség kiújulási, áttétképzési képessége valamint a betegség-specifikus túlélés között. IV.5.1. Vizsgált minták Összesen 117 az Essen-Duisburgi Egyetem Urológiai Klinikáján 1990 és 1994 között hólyagtumor miatt operált beteg és 64 egészséges személy szérummintáját vizsgáltuk szendvics ELISA módszerrel. A betegek átlagéletkora a mintavétel idején 65,3 (36-87) év volt. A tumorok hisztopatológiai adatait a 10. táblázat tartalmazza. IV.5.2. Mintagyűjtés A műtét előtt vett vérmintából a szérum elválasztása az alvadást követően centrifugálással (1500 g, 10 min, 4 oC) történt. A mintákat ezután felhasználásig -70 oCon tároltunk. 10. táblázat: Szérum ELISA vizsgálatnak alávetett betegek Stage, Grade

n = 117

Ta T1 T2 T3 T4

12 26 25 42 12

G1 G2 G3

6 42 69

ffi nő

94 23

IV.5.3. ELISA A

vizsgálni

kívánt

molekulák

szérumkoncentrációit

enzim

kapcsolt

immunszorbens vizsgálattal (ELISA) határoztuk meg. Ennek lényege, hogy a célfehérjét (antigén) szilárd felületen immobilizáljuk és az ellene termelt – enzimmel ellátott – specifikus antitestek segítségével valamilyen az adott enzim által katalizált reakcióval kvantitatív módon mérhetővé tesszük. Két főbb típusa (direkt- és szendvics-módszer) közül mi a szendvics-módszert alkalmaztuk (8. ábra).

45


Szarvas Tibor

A mérésekhez mind a négy vizsgált molekula (Ang-1,-2, Tie2, VEGF) esetében az R&D Systems DuoSetTM kittjét használtuk, melynek előírásait minden tekintetben betartottuk. Eszerint minden 96-os plate-en a kittel kapott rekombináns antigénből, 7 pontból álló felező standard hígítási sort készítettünk 2-2 párhuzamos méréssel. Kémiai negatív kontrollként minden sorozattal olyan mérést is végeztünk, melyben minden lépés és reagens megegyezett a többivel, egyedül a minta helyett használtunk 1%-os BSA oldatot. A vizsgált minták esetében mindig 3 párhuzamos mérést végeztünk. Az abszorbancia mérésére (570 nm) BioTek ELX-808 (Bad Friedrichshall, Németország) fotométert használtunk.

8. ábra: Szendvics ELISA A: Első lépésben a vizsgálni kívánt célmolekulánk (antigén) ellen termelt ellenanyagot (ellenanyag 1) műanyag felülethez kötünk. A felesleges (nem kötődött) frakciót háromszori mosással (PBS, 0,05% Tween 20) eltávolítjuk. A műanyag felületen esetleg szabadon maradt kötőhelyeket 1%-os BSA oldattal blokkoljuk, majd ismét mossuk. B: Ezután a vizsgálandó szérummintával inkubálunk, ekkor a mintában található antigén specifikusan kötődik az ellenanyag 1-hez. C: Újabb mosást követően egy ugyancsak az antigén ellen termelt biotinnal jelölt második ellenanyaggal (ellenanyag 2) inkubálunk. D: Mosást követően sztreptavidinnel konjugált (peroxidáz) enzimet adunk a rendszerhez, mely erősen specifikus biotin-avidin kötés révén az épülő „szendvics struktúrához” kötődik. E: Végül szubsztráttal (hidrogén-peroxid, tetrametil-benzidin) inkubálunk és az antigén mennyiségével arányos színreakció kifejlődése után a reakciót 2N kénsavval blokkoljuk. Az abszorbanciát 570 nm-en fotométerrel mérjük.

IV.5.4. Kiértékelés A kapott abszorbancia értékekből átlagot számoltunk és minden átlagértékből levontuk a (kémiai) negatív kontrollok átlagát. A hígítási sor értékeit a koncentráció függvényében ábrázoltuk és az így kapott pontokra egyenest illesztettünk. Az egyenes egyenletét használva számoltunk az abszorbanciákból koncentráció értékeket. A statisztikai analízist VI.6. fejezetben tárgyaltak szerint végeztük. 46


Szarvas Tibor

IV.6. Statisztikai analízis IV.6.1. Túlélés analízis A túlélés analízis a statisztikai tesztek olyan típusa, mely egy bizonyos esemény bekövetkezésének valószínűségét adja meg az idő függvényében. A „túlélés analízis” elnevezés félrevezető lehet, hiszen a módszer használatával nem csupán a túlélés, hanem bármilyen más esemény (pl. áttét- vagy recidívaképződés) időpontokhoz köthető valószínűsége is megadható. Jelen munkában Kaplan-Meier analízissel és Cox multivariancia analízissel vizsgáltuk a recidívamentes túlélés, az áttétmentes túlélés és a betegségfüggő túlélés valószínűségét (10 évre vonatkoztatva) az egyes angiogén faktorok génexpressziós értékeinek és szérumkoncentációinak függvényében. A betegségfüggő túlélés analízisénél csak azokkal a halálozásokkal számoltunk, melyeket a húgyhólyagrák jelenléte okozott. A felületes, főleg a Ta tumorok esetében a metasztázis igen ritka esemény (0,5%) ezért ennek rizikóját csak invazív (T2-4) hólyagtumorok esetében vizsgáltuk. Az invazív tumorok kezelése főképp radikális sebészi módon történik (jelen betegcsoportban 65 invazív hólyagtumorból 55-nél), ennek következtében helyi recidíva kialakulásának valószínűsége (a húgyhólyag teljes eltávolítása miatt) erősen korlátozott. Ezért a recidívaképződés kialakulásának kockázatát csak felületes tumorok esetében vizsgáltuk. IV.6.2. Kaplan-Meier túlélés teszt és többváltozós Cox-analízis A markerek prognosztikus értékének meghatározására a következő megfigyelési végpontokat vizsgáltuk; az első recidíva kialakulása (csak Ta/T1-es stádiumú tumornál), metasztázis (csak izomra terjedő tumornál), tumorral összefüggő halálozás. A mintákat minden marker esetében a medián érték mentén (cut-off) két csoportba osztottuk (alacsony- és magas abundanciájú ill. szérumkoncentrációjú csoport). A multivariancia analízis egyszerre több faktor szerepét vizsgálja egymás mellett. Használatával eldönthető, hogy a kérdéses tényező (esetünkben génexpresszió vagy szérumkoncentráció) más tényezőktől (pl.: szövettani eredmények) függetlenül befolyásolja-e a megfigyelt eseményt (áttét, recidíva, halálozás).

47

Szarvas Tibor


V. EREDMÉNYEK V.1. Mikroszatellita allélvesztés-vizsgálat Összesen 44 hólyagtumoros beteg mintáit analizáltuk. A 3 vizsgált minta (tumor, vizelet üledék, vizelet felülúszó) közül az esetek 93%-ában legalább az egyikben, minimum egy eltérést találtunk. Tizennyolc esetben a tumorminta, 4 esetben pedig a vizelet üledék nem állt rendelkezésünkre. Így a vizsgált 26 tumormintából (12 mikroszatellita markert használva) 22-ben sikerült legalább egy allélvesztést (LOH) kimutatni (85%). A vizeletminták üledékéből (sejteket is tartalmazó frakció) és a vizelet felülúszóból (oldott, sejtmentes DNS-t tartalmazó rész) külön-külön végeztük el a vizsgálatokat. A vizelet felülúszóban 86 %-os (38/44) érzékenységet találtunk, míg a vizelet üledékben 68% (27/40) volt ugyanez az érték. Klinikailag nem invazív tumoroknál (Ta/T1) a két vizeletfrakció között az érzékenységben jelentős eltérést tapasztaltunk; ami a vizelet felülúszónál 84% (21/25), a vizelet üledéknél pedig 67% (14/21) volt. Klinikailag invazív tumoroknál ezzel szemben a különbség elhanyagolható volt; a vizelet felülúszóban 74% (14/19), a vizelet üledékben pedig 68% (13/19) (11. táblázat). 11. táblázat: Mikroszatellita allélvesztés-vizsgálat eredményei 44 beteg mintáiban. Hólyagrákos betegek

LOH legalább egy mintában Legalább egy LOH a vizelet felülúszóban Legalább egy LOH a vizelet üledékben

Σ (n=44)

Beteg kontroll

Egészséges kontroll

(n=20)

(n=16)

Ta/T1 (n=25)

T2-4 (n=19)

23/25 92%

18/19 95%

41/44 93%

4/20 20%

5/16 31%

21/25 84%

14/19 74%

35/44 80%

4/20 20%

3/16 19%

14/21 67%

13/19 68%

27/40 68%

1/20 5%

2/16 12,5%

A 20 nem rákos jellegű urológiai betegségben szenvedő személy (beteg kontroll) közül 4-nél, míg a 16 egészséges kontroll közül 5-nél találtunk eltéréseket. Ezek alapján a specificitást a beteg kontrolloknál 80%-ra, míg az egészséges kontrolloknál 69%-ra becsüljük. A vizelet üledékben talált specificitás mindkét kontroll csoport esetében a vizelet üledéknél kedvezőbb (95% ill. 88%), mint a vizelet felülúszóban (80% ill. 81%).

48

Izominvazív (T2/T3)

Húgyhóólyagrák

Felületes (Ta/T1)


Diagnózis TaG1 TaG2 TaG2 TaG2 TaG2 TaG2 TaG2 T1G1 T1G3 T1G1 T1G1 T1G2 T1G2 T1G2 T1G2 T1G2 T1G2 T1G2 T1G2 T1G3 T1G2 T1G3 T1G3 T1G3 T1G3 T2G2 T2G2 T2G2 T2G2 T2G3 T2G3 T2G3 T2G3 T2G3 T2G3 T2G3 T2G3 T2G3 T2G3 T2G3 T2G3 T2G3 T2G3 T3G2 Phimosis Stressz ink. Prostatitis BPH

Szarvas Tibor

FGA D4S243 ACTBP D9S171 D9S162 IFNA D9S747 MJD MBP D16S310 D16S476 D18S51 4q28 4q32 5q15 9p12 9p21 9p21 9q32 14q24 14q32 16q12 16q24 18q21 T Uf Us T Uf Us T Uf Us T Uf Us T Uf Us T Uf Us T Uf Us T Uf Us T Uf Us T Uf Us T Uf Us T Uf Us

Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us

Kontroll

Urológiai kontroll

Colica renis

Vesekő Vesekő Cystitis BPH Vesekő BPH Colica renis

BPH BPH Vesekő Cystitis Cystitis BPH Vesekő Vesekő


Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us Uf Us

9. ábra: Mikroszatellita allélvesztés-vizsgálat eredményei. T – tumor, Uf – vizelet felülúszó, Us – vizelet üledék, zöld – normál allél, piros – LOH, szürke – hiányzó minta, kék – homozigóta allél, sárga – nem értékelhető, hibás amplifikáció

49

Szarvas Tibor


A nem értékelhető amplifikációk eloszlását a 12. táblázat foglalja össze. 12. táblázat: Sikertelen reakciók a különböző mintákban és a különböző csoportok között. A tumoros betegek esetében a legmagasabb hibaszázalékot a vizelet felülúszónál tapasztaltuk a legalacsonyabbat pedig a tumornál. A vizelet üledékben elvégzett mérések mindhárom csoportban alacsony hibaszázalékot mutattak, míg a vizelet felülúszónál a hibák előfordulását nagyban befolyásolta az, hogy melyik csoportot vizsgáltuk.

Csoport /

Hólyagtumoros

/ Minta

beteg

Kontroll beteg


Vizelet felülúszó

80/528

15.2 %

64/240

26.7 %

92/192

47.9 %

Vizelet üledék

19/480

4.0 %

7/240

2.9 %

0/96

0%

Tumor

9/300

3.0 %

-

-

-

-

A leggyakrabban deléciót szenvedő lókusz a 9p21 (46%) volt, ezt követte a 9q32 (34%), majd az 5q15 (34%). Az érzékenység elérte az 57%-ot ha csak a 9p21 és a 4q32-es allélvesztéseit vettük figyelembe és 64%-ra nőtt ha ezek mellé a 16q24-es régió allélvesztéseit is tekintetbe vettük.

50


Szarvas Tibor

V.2. Teljes genomi mikroszatellita allélvesztés-vizsgálat

Ennek a vizsgálatnak az volt a célja, hogy olyan lókuszokat azonosítsunk, melyek deléciói a hólyagrák kialakulásában szerepet játszhatnak. Ezek vizsgálatával lehetőség nyílna a betegség korai kimutatására, ami a túlélési esélyek emelkedéséhez vezetne. Tizenhét felületes (13 Ta és 4 T1) hólyagtumorban szenvedő beteg vér és tumormintájának összehasonlítását végeztük el. Folyamatban van további 7 izomra terjedő tumor vizsgálata is, ezek eredményei azonban e sorok írásának idején még nem állnak rendelkezésre. A használt mikroszatellita markereket allélvesztés-gyakoriságuk szerint 4 csoportba osztottuk; az elsőbe azok a stabilnak tekinthető régiók kerültek melyekben nem találtunk allélvesztést, a második csoportba a ritkán deléciót szenvedő (1 - 3 LOH) szakaszokat soroltuk, a harmadikba a gyakran allélvesztést mutató (4 – 6 LOH) részek kerültek, végül a negyedik csoportba a nagyon instabil régiókat soroltuk (10. ábra). Az egyes csoportok összehasonlításából kitűnik, hogy a leginstabilabb régiók szinte mind a 9-es kromoszómán találhatók (15/16). Az egyetlen igen nagy gyakorisággal deléciót szenvedő szakasz, ami a 9-es kromoszómán kívül esik a D11S905 volt. Gyakori allélvesztéseket találtunk továbbá az 5q, 11p, 17p kromoszóma régiókban és elszórt kisebb deléciókat a 8p és 10p szakaszokon. Ezzel szemben 6-os, 7-es, 12-es, 14-es, 21es, 22-es kromoszómákon csak igen ritkán találtunk eltéréseket a 2-es, 3-as, 11-es, 13as, 15-ös, 16-os, 20-as kromoszómákon pedig szórványosan (11. ábra). A legtöbb esetben a D9S167, a D9S171 és a D9S1690 régiók mutattak eltérést. A D9S167 egyedül 65%-os érzékenységgel (11/17) mutatta ki a tumort. A D9S288-al együtt 82%-ra, harmadikként a D17S944-es markert is figyelembe véve 94%-ra nőtt az érzékenység, amit egy újabb mikroszatellita régió vizsgálatával pl. D11S968 100%-osra növelhetünk. Ezek alapján tehát 4 marker elég mind a 17 eset azonosítására.

51

Szarvas Tibor


189 D9S171

11

115 D5S647

3

155 D7S484

2

73 D3S1271

1

375 D21S266

194 D9S167

11

118 D5S428

3

159 D7S669

2

74 D3S1278

1

376 D22S420

1

197 D9S1690

11

130 D6S309

3

160 D7S630

2

82 D3S1580

1

383 DXS1060

1

185 D9S288

10

140 D6S287

3

164 D7S530

2

85 D4S412

1

385 DXS987

1

188 D9S157

10

141 D6S262

3

167 D7S661

2

91 D4S1592

1

386 DXS1226

1

190 D9S161

10

146 D6S264

3

179 D8S260

2

95 D4S414

1

387 DXS1214

1

191 D9S1817

10

157 D7S519

3

182 D8S514

2

100 D4S424

1

388 DXS1068

1

200 D9S1682

10

166 D7S684

3

183 D8S284

2

102 D4S1597

1

393 DXS1106

1

192 D9S273

9

171 D8S264

3

201 D9S290

2

103 D4S1539

1

394 DXS8055

1

193 D9S175

8

172 D8S277

1

399 DXS8091

202 D9S164

8

198 D9S1677

3

206 D10S591

2

107 D5S1981

1

2

D1S214

0

230 D11S905

8

216 D10S1686

3

207 D10S189

2

108 D5S406

1

8

D1S255

0

187 D9S285

7

235 D11S901

3

208 D10S547

2

122 D5S471

1

11 D1S230

0

196 D9S287

7

237 D11S898

3

219 D10S597

2

129 D6S1574

1

15 D1S206

0

199 D9S1776

7

240 D11S4151

3

220 D10S1693

2

134 D6S276

1

16 D1S2726

0

3

205 D10S249

2

106 D4S426

1

1

203 D9S1826

7

254 D12S351

3

221 D10S587

2

138 D6S462

1

17 D1S252

0

186 D9S286

6

255 D12S346

3

222 D10S217

2

142 D6S292

1

24 D1S413

0

204 D9S158

6

261 D12S1723

3

231 D11S4191

2

144 D6S441

1

27 D1S213

0

227 D11S902

6

264 D13S171

3

232 D11S987

2

145 D6S1581

1

42 D2S2368

0

228 D11S904

6

268 D13S156

3

233 D11S1314

2

150 D7S517

1

43 D2S286

0

87 D4S403

5

271 D13S159

3

238 D11S908

2

152 D7S507

1

45 D2S2216

0

117 D5S641

5

274 D13S1265

3

239 D11S925

2

153 D7S493

1

47 D2S347

0

124 D5S436

5

317 D17S849

3

242 D11S968

2

154 D7S516

1

76 D3S1292

0

195 D9S283

5

326 D17S787

3

252 D12S83

2

156 D7S510

1

78 D3S1279

0

225 D11S4046

5

331 D17S928

3

256 D12S78

2

161 D7S657

1

80 D3S1565

0

226 D11S1338

5

332 D18S59

3

260 D12S1659

2

163 D7S486

1

92 D4S392

0

318 D17S831

5

334 D18S452

3

262 D13S175

2

168 D7S636

1

93 D4S2964

0

321 D17S799

5

335 D18S464

3

266 D13S263

2

169 D7S798

1

96 D4S1572

0

322 D17S921

5

337 D18S478

3

267 D13S153

2

170 D7S2465

1

97 D4S406

0

21 D1S196

4

338 D18S1102

3

273 D13S173

2

176 D8S1771

1

99 D4S1575

60 D2S338

4

340 D18S64

3

276 D14S261

2

177 D8S505

1

62 D3S1297

4

2

178 D8S285

1

101 D4S413 113 D5S418

0 0

342 D18S61

3

277 D14S283

89 D4S391

4

343 D18S1161

3

280 D14S288

2

180 D8S270

1

132 D6S422

0

104 D4S415

4

344 D18S462

3

282 D14S63

2

184 D8S272

1

133 D6S289

0

0

116 D5S424

4

361 D20S186

3

283 D14S258

2

209 D10S1653

1

135 D6S1610

0

119 D5S644

4

378 D22S315

3

290 D15S128

2

210 D10S548

1

139 D6S434

0

120 D5S433

4

379 D22S280

3

294 D15S1012

2

223 D10S1651

1

147 D6S446

0

121 D5S2027

4

381 D22S423

3

296 D15S978

2

224 D10S212

1

148 D6S281

0

123 D5S2115

4

382 D22S274

3

297 D15S117

2

236 D11S4175

1

158 D7S502

0

126 D5S422

4

3

D1S450

2

299 D15S131

2

241 D11S1320

1

162 D7S515

0

127 D5S400

4

5

D1S2697

2

312 D16S503

2

246 D12S364

1

165 D7S640

0

128 D5S408

4

6

D1S199

2

316 D16S520

2

249 D12S345

1

181 D8S1784

0

173 D8S550

4

10 D1S2890

2

324 D17S798

2

250 D12S85

1

211 D10S197

0

174 D8S549

4

18 D1S498

2

328 D17S949

2

251 D12S368

1

212 D10S208

0

175 D8S258

4

19 D1S484

2

329 D17S785

2

258 D12S86

1

217 D10S185

0

213 D10S196

4

20 D1S2878

2

333 D18S63

2

259 D12S324

1

243 D12S352

0

214 D10S1652

4

23 D1S238

2

345 D18S70

2

265 D13S218

1

244 D12S99

0

215 D10S537

4

25 D1S249

2

352 D19S220

2

270 D13S265

1

245 D12S336

0

218 D10S192

4

26 D1S425

2

360 D20S115

2

275 D13S285

1

247 D12S310

0

229 D11S935

4

31 D1S2836

2

363 D20S195

2

279 D14S70

1

248 D12S1617

0

234 D11S937

4

32 D2S319

2

367 D20S196

2

287 D14S65

1

253 D12S326

0

269 D13S170

4

33 D2S2211

2

371 D21S1256

2

289 D14S292

1

257 D12S79

0

292 D15S165

4

34 D2S162

2

372 D21S1914

2

291 D15S1002

1

263 D13S217

0

307 D16S3103

4

39 D2S2259

2

374 D21S1252

2

293 D15S1007

1

272 D13S158

0

319 D17S938

4

50 D2S142

2

377 D22S539

2

298 D15S153

1

278 D14S275

320 D17S1852

4

52 D2S335

2

380 D22S283

2

300 D15S205

1

281 D14S276

0

323 D17S1857

4

53 D2S364

2

1

D1S468

1

301 D15S127

1

284 D14S74

0

0

325 D17S1868

4

54 D2S117

2

4

D1S2667

1

302 D15S130

1

285 D14S68

0

327 D17S944

4

55 D2S325

2

7

D1S234

1

304 D16S423

1

286 D14S280

0

336 D18S53

4

56 D2S2382

2

9

D1S2797

1

305 D16S404

1

288 D14S985

0

339 D18S474

4

58 D2S396

2

12 D1S2841

1

306 D16S3075

1

295 D15S994

0

341 D18S68

4

65 D3S2338

2

13 D1S207

1

310 D16S3136

1

303 D15S120

0

357 D19S210

4

75 D3S1267

2

14 D1S2868

1

311 D16S415

1

308 D16S3046

0

362 D20S112

4

77 D3S1569

2

22 D1S218

1

313 D16S515

1

309 D16S3068

0

28 D1S2800

3

79 D3S1614

2

35 D2S168

1

314 D16S516

1

347 D19S216

0

29 D1S2785

3

81 D3S1262

2

36 D2S305

1

315 D16S3091

1

348 D19S884

0

30 D1S2842

3

83 D3S1601

2

37 D2S165

1

330 D17S784

1

350 D19S226

0

40 D2S391

3

86 D4S2935

2

38 D2S367

1

346 D19S209

1

353 D19S420

0

51 D2S2330

3

59 D2S206

3

2

44 D2S2333

1

351 D19S414

1

369 D20S171

0

61 D2S125

3

109 D5S630

90 D4S405

2

46 D2S160

1

354 D19S902

1

384 DXS8051

0

66 D3S1266

3

110 D5S416

2

48 D2S112

1

355 D19S571

1

389 DXS993

0

68 D3S1289

3

112 D5S426

2

49 D2S151

1

356 D19S418

1

390 DXS991

0

71 D3S1566

3

125 D5S410

2

57 D2S126

1

358 D20S117

1

391 DXS986

0

84 D3S1311

3

131 D6S470

2

63 D3S1304

1

359 D20S889

1

392 DXS990

0

88 D4S419

3

136 D6S257

2

64 D3S1263

1

364 D20S107

1

395 DXS1001

94 D4S1534

2

41 D2S337

1

349 D19S221

1

366 D20S178

0

0

98 D4S402

3

137 D6S460

2

67 D3S1277

1

365 D20S119

1

396 DXS1047

0

105 D4S1535

3

143 D6S308

2

69 D3S1300

1

368 D20S100

1

397 DXS1227

0

111 D5S419

3

149 D7S531

2

70 D3S1285

1

370 D20S173

1

398 DXS8043

0

114 D5S407

3

151 D7S513

2

72 D3S3681

1

373 D21S263

1

400 DXS1073

0

10. ábra: A mikroszatellita allélvesztés-vizsgálatban alkalmazott 400 marker a 17 mintában talált allélveszés-gyakoriság szerint sorba rendezve. Az első oszlop a kromoszóma lokalizációt jelöli 1-400-ig, a második oszlopban a markerek neveit tartalmazza, a harmadik pedig az allélvesztések 17 mintában talált számát jelöli. A legstabilabb régiókat (0 LOH) sárgával, a ritkán deléciót szenvedő régiókat (1-3 LOH) zölddel, a gyakran deléciót szenvedő régiókat narancssárgával, míg a kiemelkedően érintett régiókat (4
52

4

D1S2667

1

84 D3S1311

3

5

D1S2697

2

85 D4S412

1

6

D1S199

2

86 D4S2935

2

7

D1S234

1

87 D4S403

5

8

D1S255

0

88 D4S419

3

9

D1S2797

1

89 D4S391

4

163 D7S486

1

243 D12S352

0

164 D7S530

2

244 D12S99

0

165 D7S640

0

245 D12S336

0

166 D7S684

3

246 D12S364

1

167 D7S661

2

247 D12S310

0

168 D7S636

1

248 D12S1617

0

169 D7S798

1

249 D12S345

1

90 D4S405

2

170 D7S2465

1

0

91 D4S1592

1

171 D8S264

3

12 D1S2841

1

92 D4S392

0

172 D8S277

3

13 D1S207

1

93 D4S2964

0

173 D8S550

4

14 D1S2868

1

15 D1S206

0

16 D1S2726

0

17 D1S252

0

18 D1S498

2

19 D1S484

2

20 D1S2878

2

21 D1S196

4

22 D1S218 23 D1S238 24 D1S413

94 D4S1534

2

95 D4S414

1

96 D4S1572

0

97 D4S406

0

98 D4S402

3

99 D4S1575

0

100 D4S424

1

101 D4S413

0

1

102 D4S1597

1

2

103 D4S1539

1

0

104 D4S415

4

Kromoszóma 8

2

11 D1S230

Kromoszóma 4

10 D1S2890

174 D8S549

4

175 D8S258

4

176 D8S1771

1

177 D8S505

1

3

335 D18S464

3

256 D12S78

2

257 D12S79

0

3

182 D8S514

2

262 D13S175

2

183 D8S284

2

263 D13S217

0

184 D8S272

1

264 D13S171

3

107 D5S1981

1

187 D9S285

7

3

108 D5S406

1

188 D9S157

10

29 D1S2785

3

109 D5S630

2

189 D9S171

11

30 D1S2842

3

110 D5S416

2

190 D9S161

10

31 D1S2836

2

111 D5S419

3

191 D9S1817

10

32 D2S319

2

112 D5S426

2

192 D9S273

9

33 D2S2211

2

113 D5S418

0

193 D9S175

8

34 D2S162

2

114 D5S407

3

194 D9S167

35 D2S168

1

115 D5S647

3

195 D9S283

36 D2S305

1

116 D5S424

4

37 D2S165

1

117 D5S641

5

38 D2S367

1

118 D5S428

3

39 D2S2259

2

119 D5S644

4

40 D2S391

3

120 D5S433

4

41 D2S337

1

42 D2S2368

0

43 D2S286

0

44 D2S2333

1

45 D2S2216 46 D2S160

Kromoszóma 9

334 D18S452

3

2

0

Kromoszóma 5

3

261 D12S1723

28 D1S2800

2

347 D19S216

0

3

348 D19S884

0

269 D13S170

4

349 D19S221

1

270 D13S265

1

271 D13S159

3

272 D13S158

0

273 D13S173

2

11

274 D13S1265

3

5

275 D13S285

1

196 D9S287

7

276 D14S261

2

197 D9S1690

11

277 D14S283

2

198 D9S1677

3

278 D14S275

199 D9S1776

7

200 D9S1682

10

1 4

0

358 D20S117

1

279 D14S70

1

359 D20S889

1

280 D14S288

2

360 D20S115

2

205 D10S249

2

4

206 D10S591

2

47 D2S347

0

127 D5S400

4

207 D10S189

2

48 D2S112

1

128 D5S408

4

208 D10S547

2

288 D14S985

0

49 D2S151

1

129 D6S1574

1

209 D10S1653

1

289 D14S292

1

50 D2S142

2

130 D6S309

3

210 D10S548

1

290 D15S128

51 D2S2330

3

131 D6S470

2

211 D10S197

0

52 D2S335

2

132 D6S422

0

212 D10S208

0

53 D2S364

2

133 D6S289

0

213 D10S196

4

54 D2S117

2

134 D6S276

1

214 D10S1652

4

55 D2S325

2

135 D6S1610

0

215 D10S537

4

56 D2S2382

2

136 D6S257

2

216 D10S1686

3

57 D2S126

1

137 D6S460

2

217 D10S185

0

58 D2S396

2

138 D6S462

1

218 D10S192

4

59 D2S206

3

139 D6S434

0

219 D10S597

2

60 D2S338

4

140 D6S287

3

220 D10S1693

2

61 D2S125

3

141 D6S262

3

221 D10S587

2

62 D3S1297

4

142 D6S292

1

222 D10S217

2

302 D15S130

63 D3S1304

1

143 D6S308

2

223 D10S1651

1

303 D15S120

64 D3S1263

1

144 D6S441

1

224 D10S212

1

304 D16S423

1

65 D3S2338

2

145 D6S1581

1

225 D11S4046

5

66 D3S1266

3

146 D6S264

3

226 D11S1338

5

67 D3S1277

1

147 D6S446

0

227 D11S902

6

68 D3S1289

3

148 D6S281

0

228 D11S904

6

69 D3S1300

1

149 D7S531

2

229 D11S935

4

70 D3S1285

1

150 D7S517

1

230 D11S905

8

71 D3S1566

3

151 D7S513

2

72 D3S3681

1

152 D7S507

1

73 D3S1271

1

153 D7S493

1

79 D3S1614 80 D3S1565

2 0

3

158 D7S502 159 D7S669 160 D7S630

Kromoszóma 16

0

1

157 D7S519

281 D14S276

0

282 D14S63

2

283 D14S258

2

284 D14S74

0

285 D14S68

0

286 D14S280

0

287 D14S65

1

361 D20S186

3

362 D20S112

4

363 D20S195

2

364 D20S107

1

365 D20S119

1

366 D20S178

0

367 D20S196

2

368 D20S100

1

369 D20S171

0

2

370 D20S173

1

291 D15S1002

1

371 D21S1256

2

292 D15S165

4

372 D21S1914

2

293 D15S1007

1

294 D15S1012

2

373 D21S263

1

374 D21S1252

2

375 D21S266

1

295 D15S994

0

296 D15S978

2

376 D22S420

1

297 D15S117

2

377 D22S539

2

298 D15S153

1

378 D22S315

3

299 D15S131

2

379 D22S280

3

300 D15S205

1

301 D15S127

1

380 D22S283

2

381 D22S423

3

1

382 D22S274

3

0

383 DXS1060

1

384 DXS8051

0

305 D16S404

1

385 DXS987

1

306 D16S3075

1

386 DXS1226

1

307 D16S3103

4

387 DXS1214

1

308 D16S3046

0

388 DXS1068

1

309 D16S3068

0

389 DXS993

0

310 D16S3136

1

390 DXS991

0

311 D16S415

1

312 D16S503

2

313 D16S515

1

234 D11S937

4

314 D16S516

1

235 D11S901

3

315 D16S3091

1

236 D11S4175

1

316 D16S520

2

237 D11S898

3

317 D17S849

3

0

238 D11S908

2

318 D17S831

2 2

239 D11S925 240 D11S4151

2 3

319 D17S938 320 D17S1852

Kr. 17

78 D3S1279

156 D7S510

Kromoszóma 11

2

Kromoszóma 15

2

126 D5S422

Kromoszóma 10

125 D5S410

1

Kromoszóma 6

0

2

0

357 D19S210

7

233 D11S1314

2

353 D19S420

356 D19S418

6

2

352 D19S220

1

204 D9S158

2

1

1

203 D9S1826

232 D11S987

0

351 D19S414

355 D19S571

4

231 D11S4191

350 D19S226

354 D19S902

5

0

3

268 D13S156

124 D5S436

77 D3S1569

3

344 D18S462

267 D13S153

123 D5S2115

76 D3S1292

3

343 D18S1161

2

2

1

4

342 D18S61

1

8

2

3

341 D18S68

345 D18S70

201 D9S290

154 D7S516

340 D18S64

346 D19S209

202 D9S164

155 D7S484

3 4

1

4

1

338 D18S1102 339 D18S474

2

1

2

4 3

265 D13S218

122 D5S471

75 D3S1267

336 D18S53 337 D18S478

266 D13S263

121 D5S2027

74 D3S1278

3

254 D12S351

260 D12S1659

27 D1S213

1

255 D12S346

0

6

330 D17S784 331 D17S928

3

1

10

2

2

181 D8S1784

185 D9S288

2

329 D17S785

333 D18S63

180 D8S270

186 D9S286

4

328 D17S949

0

1

3

327 D17S944

253 D12S326

1

1

4 3

332 D18S59

258 D12S86

105 D4S1535

325 D17S1868 326 D17S787

2

259 D12S324

106 D4S426

2

252 D12S83

1

2

4

324 D17S798

1

2

2

5

323 D17S1857

1

178 D8S285

26 D1S425

5

322 D17S921

250 D12S85

179 D8S260

25 D1S249

321 D17S799

251 D12S368

Kromoszóma 18

2

2

Kromoszóma 19

83 D3S1601

1

242 D11S968

Kromoszóma 20

2

241 D11S1320

0

Kr. 21

D1S450

1

162 D7S515

Kr. 22

3

161 D7S657

Kromoszóma X

1

Kromoszóma 12

2

82 D3S1580

Kromoszóma 13

81 D3S1262

Kromoszóma 14

0

Kromoszóma 7

1

D1S214

Kr. 3

D1S468

2

Kromoszóma 7

Kromoszóma 1 Kromoszóma 2 Kromoszóma 3

1

Kromoszóma 17

Szarvas Tibor


391 DXS986

0

392 DXS990

0

393 DXS1106

1

394 DXS8055

1

395 DXS1001

0

396 DXS1047

0

397 DXS1227

0

5

398 DXS8043

0

4 4

399 DXS8091 400 DXS1073

1 0

11. ábra: A mikroszatellita allélvesztés-vizsgálatban alkalmazott 400 marker lokalizáció szerint sorba rendezve. A jelölések megegyeznek a 10. ábrán leírtakkal.

53

Szarvas Tibor


A

tumor

invazivitásának

növekedésével

és

differenciáltsági

fokának

csökkenésével egyre növekvő számú genetikai eltérést tapasztaltunk. A 13 Ta tumorban átlagosan 34,6 allélvesztést találtunk (450/13), míg a 4 db T1-es tumorban 92-t (368/4). A differenciáltsági fok (grade) fordított arányosságot mutatott az átlagos allélvesztés számmal; jól differenciált tumoroknál 34,6 (277/8), közepesen differenciált tumoroknál 48,2 (289/7), rosszul (gyengén) differenciált tumoroknál pedig 126 (252/2) volt

160 140 120 100 80 60 40 20 0

Stage, Grade

n = 17

Σ LOH

LOH/esetszám

Ta

13

450

34,6

T1

4

368

92,0

T2-4

0

0

0

G1

8

277

34,6

G2

7

289

48,2

G3

2

252

126

*

p = 0.05

átlagos LOH-szám

átlagos LOH-szám

(12.ábra).

92

35

Ta

150 130 110 90 70 50 30 10 -10

p = 0.007

126

48

35

G1

T1

*

G2

G3

12. ábra: Mikroszatellita analízis során talált allélvesztések száma és átlaga a tumor invazivitásának és differenciáltsági fokának függvényében.

Nem csupán az allélvesztések számában, hanem azok elhelyezkedésében is eltérések mutatkoztak a különböző differenciáltsági fokú és invazivitású tumorok között. Kilenc darab olyan markert találtunk (D4S403, D5S422, D5S436, D5S641, D9S164, D9S1682, D11S338, D11S904, D11S935, D17S799), amelyeknél a deléció előfordulási gyakorisága (LOH száma / esetszám) a T1-es tumorokban több mint 50%kal meghaladta a Ta stádiumú tumorokban talált előfordulási gyakoriságot. Ezek részben egymáshoz közel helyezkednek el az 5p, 9q és 11p régiókban. Azonosítottunk továbbá 20 db olyan kromoszómaszakaszt, melyek Ta tumorokban stabilak, viszont a T1 tumorok 50%-ában deléciót szenvednek (D1S2697, D1S199, D1S2890, D2S319,

54

Szarvas Tibor


D2S2259, D2S142, D2S364, D2S117, D4S2935, D4S405, D4S1534, D5S426, D6S257, D8S514, D8S284, D10S249, D16S503, D16S520, D18S70, D22S539).

V.3. A FISH vizsgálat eredményei A vizsgált 43 hólyagtumoros betegtől származó vizelet közül a korábban ismertetett kritériumok szerint 34 bizonyult pozitívnak, 4 nem volt értékelhető, 5 pedig negatív volt. Ez alapján a módszer érzékenysége 87% (34/39). A kontroll minták minden esetben negatívak voltak, így a specificitás 100% (34/34). Az 5 negatívnak talált hólyagtumor mindegyike Ta stádiumú (4 db G1 és 1 db G2) volt (13. táblázat) és az 5ből 3 átmérője kisebb volt 5 mm-nél. 13. táblázat: UroVysion FISH vizsgálat eredményei.

Beteg

n = 43

Pozitív n = 34

Negatív n = 16

Nem értékelhető n=5

Ta

9

3

5

1

T1

24

21

0

3

T2

10

10

0

0

G1

9

4

4

1

G2

18

14

1

3

G3

16

16

0

0

Kontroll

n = 12

Gyulladás

5

0

5

0

Hiperplázia

2

0

2

0

Papillóma

2

0

2

0

Normál

2

0

1

1

Tizenkét esetben a protokoll által ajánlott második mellett az első, reggeli vizelet is rendelkezésünkre állt. Közülük 9 hólyagrákos betegtől származott. Ebből 8 esetben legalább az egyik (első vagy a második) minta pozitívnak bizonyult (3 esetben mindkettő pozitív volt, 4 esetben az egyik nem volt értékelhető, 1 esetben az egyik negatív volt), míg 1 esetben az egyik negatív, a másik értékelhetetlen volt. A napi első és második vizeletek értékelhetőségben nem mutattak különbséget.

55

Szarvas Tibor


A 34 pozitív vizsgálatból 4-ben egyedül a 9p21 delécióját találtuk, míg 30-ban a 3-as, a 7-es vagy a 17-es kromoszóma multiplikációja volt megfigyelhető. E mellett a 30 esetből 8-ban a 3/7/17 sokszorozódás mellett 9p21 deléciót is találtunk, két esetben pedig érdekes módon a 9p21 amplifikáció is detektáltuk (13. ábra). Így összességében a leggyakrabban jelentkező citogenetikai eltérés a 9p21 deléciója volt, ami az esetek 32%ában (11/34) fordult elő.

A

B

13. ábra: UroVysion FISH vizsgálat hólyagtumoros betegek vizelet üledékében. Bal felső sarokban mindkét képen egy-egy normál epithel sejt látható. A vörös színű pontok a 3-as kromoszóma centromérájához kötődő próbától származnak (CEP 3), a zöld pontok a 7-es kromoszóma centróméráját jelölik (CEP 7), a kék szignálok pedig a 17-es kromoszómától származnak (CEP 17). A: Egy sejtben kettőnél több szignál látható mind a 4 próbával, így 3-as, 7-es, 17-es kromoszómaszám-növekedés és 9p21 sokszorozódás állapítható meg. B: A 9p21 régió deléciójára a sárga szignál hiánya utal.

A magasabb invazivitású és malignitású esetekben egyre emelkedő számú aberráns (mutációt tartalmazó) sejtet detektáltunk. Ez a különbség a Ta – T1 ill. Ta – T2

60

aberrált sejtek számának átlaga

abberált sejtek számának átlaga

valamint G1 és G3 között is szignifikáns volt (p < 0,05).

40

20

0 Ta

T1

T2

60

40

20

0 G1

G2

G3

14. ábra: Citogenetikai eltérések számának eloszlása a tumor invazivitásának és differenciáltsági fokának függvényében.

56

Szarvas Tibor


V.4. Angiogén faktorok RNS szintű expressziós vizsgálata Összesen 113 beteg esetében végeztük el a valós idejű PCR vizsgálatot. Az átlagos követési idő 39 hónap volt (maximum 189 hónap). Ez alatt az idő alatt a felületes (Ta/T1) tumorok 67%-a (32/48) tért vissza (recidíva), átlagosan 5 hónapos latenciával. A 65 izominvazív tumorban szenvedő beteg közül 28-nál (43%) progrediált a betegség távoli áttéttel (tüdő, máj, csont). A betegektől származó minták mellett 5 nem rákos, kontroll mintát is vizsgáltunk. Ezek az anyagok benignus prosztata hiperpláziában

(BPH)

szenvedő

betegek

enukleációs

műtéteiből

származtak.

Rosszindulatú betegség egyikük esetében sem volt ismert.

V.4.1. Angiogén faktorok génexpresszióinak összehasonlítása a klinikopatológiai adatokkal Az analizált mintákban a VEGF, az Ang-1, az Ang-2 és a Tie2 RNS szintű expresszióját mértük. A VEGF szignifikáns (p=0,031) négyszeres emelkedést mutatott az egészségeshez képest. Az Ang-1 esetében pedig még nagyobb eltérést; 137-szeres szignifikáns csökkenést tapasztaltunk (p<0,001). Ugyanakkor az Ang-2 és a Tie2 tumorban és kontrollban mért értékei nem tértek el lényegesen egymástól (p=0,510, p=0,106), bár a Tie2 tumorban enyhén csökkent. Egyik vizsgált gén expressziója sem mutatott összefüggést a beteg nemével, életkorával és a dohányzási szokásaival. Kivétel ez alól az Ang-1, mely a 65 évesnél idősebbek esetén erősebb kifejeződést mutatott (p=0,01) (14. táblázat). Öt mintában nem kaptunk értékelhető eredményt egyik primerpárral sem. A rossz minőségűnek tekintettük azokat az eredményeket, ahol a párhuzamos mérések standard eltérése (standard deviáció) meghaladta a 0,5-ös értéket. Ezeket a reakciókat megismételtük, ám néhány esetben ehhez már nem volt elegendő RNS mintánk. Ezért a VEGF-nél 1 esetben, az Ang-1-nél 8 esetben és a Tie2-nél pedig 5 esetben nem szerepel expressziós érték.

57

Szarvas Tibor


V.4.2. Angiogén faktorok génexpresszióinak összevetése a hisztológiai adatokkal A VEGF és az Ang-2 abundanciája fordított arányosságot mutatott mind az invazivitással (p<0,001, p=0,001), mind a malignitással (p=0,023, p=0,075) (14. táblázat és 15. ábra). Ezzel szemben az Ang-1 expresszió a tumor invazivitással párhuzamosan növekedett (p<0,001, p<0,001), de így is jóval alatta maradt a normál szövetben mért értékeknek. A Tie2 abundanciája nem változott szignifikánsan sem az invazivitással sem a malignitással (p=0,071, p=0,064), bár egy kismértékű emelkedés látható volt az előrehaladottabb tumoroknál. 14. táblázat: Betegek adatai és a vizsgált génexpressziók közötti összefüggések. VEGF Medián (range)

p érték

Ang-1 Median (range)

Életkor 71,6 (36 - 96) ≤ 65 (n = 51) > 65 (n = 62)

9,11 (0,77-76,11) 6,5 (0,17-101,83)

Nem férfi nő

(n = 88) (n = 25)

8,86 (0,17-101,83) 7,23 (0,42-82,71)

0,29 (0,01-2,01) 0,17 (0,001-3,34)

Invazivitás Ta T1 T2 T3 T4 Nem inv. Inv.

(n = 31) (n = 17) (n = 13) (n = 39) (n = 13) (n = 48) (n = 65)

25,41 (1,06-78,25) 8,11 (1,19-101,83) 7,08 (1,03-51,09) 4,52 (0,77-76,11) 4,89 (0,17-42,96) 13,55 (1,1 -101,83) 4,92 (0,17-76,11)

0,07 (0,001-3,34) 0,10 (0,01-0,85) 0,22 (0,02-2,43) 0,31 (0,01-2,11) 0,36 (0,005-2,01) <0,001 0,31 (0,01-2,11) 0,36 (0,005-2,01)

(n = 17) (n = 40) (n = 56) (G 1-2) (n = 57) (G 3) (n = 56)

18,32 (1,06-101,83) 9,04 (1,03-82,71) 5,98 (0,17-76,11) 10,85 (1,03-101,83)

0,05 (0,005-3,34) 0,11 (0,001-1,21) 0,36 (0,005-2,43) 0,09 (0,001-3,34)

Malignitás G1 G2 G3 Alacsony Magas

0,195

5,98 (0,17-76,11)

8,65 (0,42-82,71) 7,83 (0,17-101,83)

Dohányzás igen (n = 49) nem (n = 54) ismeretlen (n = 10)

6,50 (0,42-82,71) 7,39 (0,17-101,83)

Kontroll Tumor

2,12 (0,98-7,89) 8,08 (0,17-101,83)

(n = 5) (n = 113)

0,023

<0,001

0,728

0,031

948 (110-3126) 322 (68-2427) 316 (113-1783) 326 (20-3009) 189 (7-3373) 671 (68-3126) 285 (7-3373)

0,86 (0,27-14,47) 0,76 (0,16-11,47) 1,47 (0,04-10,09) 1,77 (0,23-12,64) 1,06 (0,18-6,66) 0,84 (0,16-14,47) 1,49 (0,04-12,64)

0,247

27,85 (6,89-46,53) 0,2 (0,001-3,34)

58

0,001

0,075

0,84 (0,16-14,47) 0,90 (0,29-7,67) 1,57 (0,04-12,64) 0,86 (0,16-14,47)

0,300

1,39 (0,04-12,64) 0,91 (0,16-14,47)

0,353

530 (215-1704) 396 (7-3373)

0,071

0,064

1,57 (0,04-12,64)

317 (30-3373) 481 (7-3009) <0,001

0,245 1,59 (0,19-6,66) 0,97 (0,04-14,47)

335 (7-3373)

0,15 (0,005-2,01) 0,28 (0,005-3,34)

0,110

0,820

369 (20-3373) 541 (7-3126)

p értek

1,46 (0,11-14,47) 0,86 (0,04-12,64)

386 (7-3373) 401 (42-3126)

626 (110-2427) 426 (20-3126) 336 (7-3373) <0,001 519 (20-3126)

0,697

Tie2 Medián (range)

0,089

0,164

0,16 (0,001-2,01) 0,24 (0,005-3,34)

p érték

509 (68-3373) 336 (7-3072)

0,36 (0,005-2,43)

0,926

Ang-2 Medián (range)

0,01 0,30 (0,005-3,34) 0,13 (0,001-1,21)

0,334

Tumortípus primer (n = 63) recidív (n = 50)

p érték

0,936 0,195

0,94 (0,04-11,47) 1,58 (0,11-14,47) 0,510

1,96 (1,40-5,22) 1,20 (0,04-14,47)

0,106

Szarvas Tibor


15. ábra: Angiogén faktorok génexpressziójának változása húgyhólyagrák különböző stádiumaiban. A vastag fekete vonal a génexpressziók medián értékeit mutatja. A színes oszlopok az értékek mediánhoz legközelebb eső 50%-át, a vonalak pedig a 90%-át jelölik; míg a színes körök a legmagasabb expressziót mutatják.

V.4.3. Túlélés analízis A markerek prognosztikus értékének meghatározása során a IV.6. fejezetben leírtak szerinti megfontolásokat követtük. A mintákat minden marker esetében a medián érték mentén (cut-off) két csoportba osztottuk (alacsony- és magas abundanciájú csoport). Ezek a határértékek a következők voltak; VEGF-nél 8,08, Ang-1-nél 0,20; Ang-2-nél 396,21; Tie2-nél pedig 1,20. Nem találtunk összefüggést a VEGF mRNS mennyisége és a tumor-függő túlélés között (p=0,269). Ellenben az Ang-1 és az Ang-2 esetében szignifikáns összefüggés mutatkozott az emelkedett hírvivő RNS szintek és a rövidebb túlélés között (p=0,041, p=0,051). Ez a hatás azonban nem volt független az invazivitástól és a malignitástól.

Izominvazív

tumorok

esetében

a

magasabb

Tie2

expresszió

szignifikánsan hosszabb túléléssel járt együtt (p=0,035) (15. táblázat és 15. ábra).

59

Szarvas Tibor


15. táblázat: Áttétmentes-, recidívamentes- és betegségfüggő túlélés valószínűsége az angiogén faktorok mRNS expressziójának függvényében. HR – hazard ratio – a kockázat mértékét adja meg az önkényesen megválasztott referencia csoporthoz viszonyítva. Például, a betegségfüggő halálozás invazív hólyagtumornál 6,69-szer nagyobb valószínűséggel fordul elő, mint a felületes hólyagtumoroknál. Piros szín – szignifikáns összefüggés (p<0,05) HR Életkor 71,6 (36 - 96) ≤ 65 (n = 51) > 65 (n = 62) Nem Férfi (n = 88) Nő (n = 25) Invazivitás Ta/T1 (n = 48) T2-T4 (n = 65) Malignitási fok Alacsony (n = 57) High-grade (n = 56) Tumor típusa Primer (n = 63) Recidív (n = 50) Dohányzás igen (n = 49) nem (n = 54) ismeretlen (n = 10) VEGF génexpresszió (n =107) Nem informatív (n = 6) alacsony (n = 53) magas (n = 54) nem invazív esetekben Ta/T1 alacsony (n = 15) magas (n = 32) Invazív esetekben (T2-T4) alacsony (n = 38) magas (n = 22) Ang-1 génexpresszió (n = 100) not informative (n = 13) alacsony (n = 50) magas (n = 50) nem invazív esetekben Ta/T1 alacsony (n = 31) magas (n = 10) invazív esetekben (T2-T4) alacsony (n = 19) magas (n = 40) Ang-2 génexpresszió (n = 108) nem informatív (n =5) alacsony (n = 53) magas (n = 55) nem invazív esetekben Ta/T1 alacsony (n = 16) Magas (n = 31) invazív esetekben (T2-T4) alacsony (n = 37) magas (n = 24) Tie2 génexpresszió (n = 103) nem informatív (n = 10) alacsony (n = 52) magas (n = 51) nem invazív esetekben Ta/T1 alacsony (n = 28 ) magas (n = 15) Invazív esetekben (T2-T4) alacsony (n = 24) magas (n = 36)

Betegségfüggő túlélés 95% CI P 0,850*

ref. 1,056

0,601 – 1,855

0,850 0,318*

ref. 0,728

0,391 – 1,356

0,316

ref. 6,695

3,000 – 14,942

< 0,001* < 0,001 < 0,001*

ref. 3,800

2,040 – 7,081

< 0,001 0,233*

ref. 1,414

0,798 – 2,506

0,235 0,408*

ref. 0,788

0,447 – 1,389

0,410

HR

Áttétmentes túlélés 95% CI

ref. 0,576

0,256 – 1,297

0,183 0,953*

ref. 0,971

0,362 – 2,603

0,953

ref. 9,115

2,706 – 30,705

< 0,001* < 0,001 0,005*

ref. 3,190

1,539 – 7,483

0,008 0,621*

ref. 0,812

0,354 – 1,859

0,622 0,534*

ref. 1,298

0,569 – 2,964

0,535

0,269* ref. 0,718

0,398 – 1,295

0,271 0,362*

ref. 0,496

0,107 – 2,300

0,371 0,232*

ref. 1,474

0,776 – 2,789

0,236 0,041*

ref. 1,841

1,017 – 3,332

0,044 0,466*

ref. 1,864

0,341 – 10,199

0,473 0,469*

ref. 0,786

0,409 – 1,512

0,471 0,051*

ref. 0,563

0,314 – 1,011

0,054 0,974*

ref. 0,975

0,211 – 4,500

0,974 0,598*

ref. 0,840

0,439 – 1,608

0,599 0,890*

ref. 0,960

0,538 – 1,712

0,890 0,997*

ref. 1,004

0,193 – 5,210

0,997 0,035*

ref. 0,511

0,271 – 0,965

0,039

P 0,177*

Recidívamentes túlélés HR 95% CI P 0,779* ref. 1,097 0,574 – 2,093 0,780 0,609* ref. 0,816 0,816 – 0,373 0,611 ref. 0,817 ref. 0,800 ref. 0,965 ref. 0,951

0,858* ref. 0,928

0,409 – 2,105

0,858 0,827*

ref. 1,309

0,116 – 14,719

0,827 0,072*

ref. 2,216

0,910 – 5,392

0,080 0,524*

ref. 1,321

0,560 – 3,119

0,525 0,494*

ref. 1,101

0,230 – 1,160

0,669 0,135*

ref. 0,506

0,203 – 1,260

0,143 0,038*

ref. 0,400

0,163 – 0,983

0,046 0,808*

ref. 1,346

0,121 – 14,987

0,809 0,270*

ref. 0,567

0,204 – 1,587

0,277 0,585*

ref. 0,795

0,348 – 1,815

0,586 0,977*

ref. 1,037 0,094 – 11-453 ref. 0,395

0,163 – 0,961

0,977 0,034* 0,041

0,632* 0,356 – 1,875 0,633 0,618* 0,332 – 1,928 0,620 0,913* 0,511 – 1,822 0,913 0,891* 0,462 – 1,957 0,891 0,265*

ref. 1,461 ref. 2,220 ref. 0,311 ref. 0,996 ref. 1,183 ref. 0,634 ref. 1,985 ref. 3,178 ref. 0,432 ref. 1,154 ref. 1,057 ref. 1,259

0,746 – 2,862 0,269 0,059* 0,947 – 5,200 0,066 0,247* 0,037 – 2,604 0,282 0,992* 0,472 – 2,102 0,992 0,706* 0,494 – 2,836 0,706 0,556* 0,134 – 3,004 0,566 0,048* 0,992 – 3,973 0,053 0,009* 1,273 – 7-939 0,013 0,420* 0,051 – 3,633 0,440 0,681* 0,581 – 2,289 0,682 0,886* 0,497 – 2,246 0,886 0,793* 0,218 – 7,261 0,796

A metasztázis kialakulásának veszélyét eredményeink szerint nem befolyásolja sem az Ang-1, sem az Ang-2 szöveti abundanciája (p=0,135, p=0,270). Az emelkedett VEGF mRNS szint ugyanakkor kedvezőtlen jelnek látszik az áttét kialakulásának szempontjából. Ez az összefüggés azonban kívül esik a szignifikancia határon 60


Szarvas Tibor

(p=0,072). A magas Tie2 expresszió a VEGF-el szemben kedvező prognosztikus jelnek bizonyult az áttét kialakulásában (p=0,034) (15. táblázat és 15. ábra). A recidíva kialakulását a legerősebben az Ang-2 szöveti kifejeződése befolyásolta (p=0,029). míg a VEGF ismét a szignifikancia határon lévő p értékkel kedvezőtlen faktornak bizonyult (p=0,059).

16. ábra: Kaplan-Meier túlélési görbék. Angiogén faktorok génexpressziós értékeinek (alacsony/magas) hatása a betegségfüggő-, áttétmentes- és recidívamentes túlélés idő hosszára. Megfigyelési idő: 120 hónap. A szignifikancia határértéke minden esetben 0,05 volt.

61

Szarvas Tibor


V.4.3.1. Többváltozós Cox-analízis (multivariancia analízis) A multivariancia analízis egyszerre több faktor szerepét vizsgálja egymás mellett. Használatával eldönthető, hogy az adott faktor expressziója például a szövettani eredményhez

képest

szolgáltat-e

többletinformációt

a

megfigyelt

esemény

kialakulásával kapcsolatban (lásd IV.6.2.). A multivariancia analízisben együtt vizsgáltuk a következő tényezőket: invazivitás, malignitás, dohányzás, életkor, recidív/primer tumor, valamint a VEGF, Ang-1,-2 és a Tie2 szöveti mRNS expresszióját a metasztázismentes, a recidívamentes és betegségspecifikus túlélés kockázatára nézve. Ennek alapján a Tie2 magas szöveti szintje független és kedvező prognosztikus faktornak bizonyult a metasztázis kialakulásának és a tumor-függő halálozás tekintetében (p=0,003, p=0,029). A magas Ang-2 expresszió pedig független és kedvezőtlen prognosztikus faktor a recidíva kialakulásában (p=0,001). A VEGF magas abundanciája befolyásolni látszik az áttét kialakulását, ám ez az összefüggés nem érte el a szignifikancia határt (p=0,070) (16. táblázat). 16. táblázat: Multivariancia analízis eredményei. Invazivitás nem invazív (Ta-T1) invazív (T2-T4) Malignitás alacsony magas Dohányzás igen nem ismeretlen Életkor ≤ 65 > 65 Tumortípus primer nem VEGF génexpresszió alacsony magas Ang-1 génexpresszió alacsony magas Ang-2 expression alacsony magas Tie-2 génexpresszió alacsony magas

Betegségfüggő túlélés HR 95% CI p 9,655 2,666 – 34,96 0,001

Áttétmentes túlélés HR 95% CI p 22,211 3,357 – 146,945 0,001

Recidívamentes túlélés HR 95% CI p 8,853 2,220 – 35,299 0,002

0,970 0,397 – 2,365

0,946

0,653

0,196 – 2,176

0,487

0,347

0,097 – 1,246

0,105

0,650 0,324 – 1,305

0,226

1,115

0,397 – 3,131

0,837

0,632

0,227 – 1,755

0,378

0,993 0,488 – 2,019

0,985

0,685

0,234 - 2,009

0,491

1,011

0,340 – 3,007

0,984

1,341 0,672 – 2,676

0,406

0,942

0,342 – 2,593

0,907

0,209

0,072 – 0,605

0,004

1,499 0,735 – 3,059

0,266

2,550

0,928 – 7,011

0,070

0,549

0,190 – 1,583

0,267

1,655 0,668 – 4,100

0,277

-

-

-

1,072

0,331 – 3,472

0,908

1,040 0,430 – 2,516

0,931

0,711

0,216 – 2,342

0,575

10,179

2,691 – 38,498

0,001

0,249 0,100 – 0,619

0,003

0,311

0,109 – 0,889

0,029

0,727

0,241 – 2,204

0,573

(n = 48) (n = 65) (n = 57) (n = 56) (n = 49) (n = 54) (n = 10) (n = 51) (n = 62) (n = 63) (n = 50) (n = 53) (n = 54) (n = 50) (n = 50) (n = 53) (n = 55) (n = 52) (n = 51)

62


Szarvas Tibor

V.5. Angiogén faktorok fehérjeszintű vizsgálata szérumban Összesen 117, hólyagtumor miatt operált beteg és 64 egészséges személy szérum mintáját vizsgáltuk ELISA-val. Összefüggést kerestünk a vizsgált angiogén faktorok szérumkoncentrációi és a betegség stádiuma illetve lefolyása között. V.5.1. Angiogén faktorok szérumkoncentrációinak összehasonlítása (tumor-normál) Az Ang-1 szérumkoncentrációja szignifikánsan (p<0,001) 2-szer olyan magas volt a daganatos betegeknél. Ezzel szemben az Ang-2 és a sTie2 szérumszintjei a tumorban szignifikánsan alacsonyabbak voltak, mint a kontroll szérumokban (p=0,016, p=0,001). A VEGF kismértékű emelkedést mutatott tumoros betegek szérumaikban a kontrollokhoz képest, ez a különbség azonban nem volt szignifikáns (p=0,309). V.5.2. Angiogén faktorok szérumkoncentrációjának összevetése a klinikopatológiai adatokkal Az Ang-1 és a sTie2 nem mutatott semmilyen összefüggést a betegek nemével, életkorával, dohányzási szokásaikkal és azzal sem, hogy a tumor primer (a műtét előtt első alkalommal diagnosztizált) vagy visszatérő (recidív) volt-e. A VEGF szérumszintje viszont magasabb volt a 65 évnél idősebb betegeknél, mint az annál fiatalabbaknál (p=0,048), és az Ang-2 szérumkoncentrációja magasabbnak (p=0,025) mutatkozott nőknél, mint férfiaknál. A tumor invazivitásával és malignitásával sem a VEGF, sem az angiopoietin (-1 és -2) koncentrációk nem mutattak szignifikáns összefüggést, a sTie2 viszont magasabb volt felületes hólyagtumoroknál (p=0,025) (17. táblázat és 16. ábra) V.5.3. Túlélés analízis A túlélés analízisre vonatkozó megfontolások megegyeztek az VI.6. alatt leírtakkal.

63

Szarvas Tibor


V.5.3.1. Kaplan-Meier túlélés teszt és többváltozós Cox-analízis A markerek prognosztikus értékének meghatározására – csakúgy, mint génexpressziós vizsgálatoknál – a következő megfigyelési végpontokat vizsgáltuk; az első recidíva 17. táblázat: Betegek adatai és a vizsgált faktorok szérumkoncentrációi közti összefüggések. VEGF (pg/ml) Medián (range)

p érték

Ang-1 (ng/ml) Medián (range)

p érték

Ang-2 (pg/ml) Medián (range)

p érték

sTie2 (pg/ml) Medián (range)

p érték

Életkor 65,3 (36 - 87) ≤ 65 (n = 56) > 65 (n = 61)

114 (0-546) 79 (0-663)

0,048

53,6 (25,5-83,5) 53,2 ( 0 -80,5)

0,168

178 (0-1537) 213 (0-5585)

0,667

1584 (284-5594) 1741 ( 0-5754)

0,680

Nem Férfi Nő

106 (0-663) 79 (0-293)

0,763

54,3 ( 0 -83,5) 50,2 (30,2-80,5)

0,497

183 (0-4238) 407 (0-5585)

0,041

1693 (136-4949) 1374 ( 0-5754)

0,849

(n = 94) (n = 23)

Invazivitás Ta (n = 12) T1 (n = 26) T2 (n = 25) T3 (n = 42) T4 (n = 12) Nem-inv. (n = 38) Invazív (n = 79)

131 (3-293) 102 (0-459) 55 (0-445) 99 (0-663) 225 (0-546) 124 (0-495) 87 (0-663)

Malignitás G1 G2 G3 Alacsony

111 (20-195) 96 ( 0-445) 93 ( 0-663) 100 ( 0-446)

Magas

(n = 6) (n = 42) (n = 69) (G 1-2) (n = 48) (G 3) (n = 69)

0,202

0,784

93 ( 0-663)

49,9 (31,5-61,8) 51,2 (25,5-63,8) 53,3 (39,1-80,5) 53,9 ( 0 -83,5) 57,7 (30,6-62,6) 50,3 (25,5-63,8) 54,1 ( 0 -83,5) 50,0 (15,2-55,3) 54,5 (27,5-80,5) 53,4 ( 0 -83,5) 50,3 (15,2-80,5)

0,130

0,955

53,4 ( 0 -83,5)

209 (0-5585) 177 (0-3935) 169 (0-1292) 234 (0-1833) 162 (0-1537) 177 (0-5585) 213 (0-1833) 305 (0- 343) 155 (0-5585) 222 (0-1833) 162 (0-5585)

0,193

0,211

222 (0-1833)

1707 ( 98-5754) 1838 (290-4949) 1338 (284-5594) 1458 ( 0-5414) 2202 (523-4847) 1789 ( 98-5754) 1522 ( 0-5594) 2086 (734-4324) 1777 ( 98-5754) 1542 ( 0-5414) 1700 ( 98-5754)

0,025

0,115

1542 ( 0-5414)

Tumor típus Primer (n = 57) Recidív (n = 60)

93 (0-546) 105 (0-663)

0,278

53,5 ( 0 -83,5) 53,3 (25,5-80,5)

0,598

248 (0-5585) 157 (0-1833)

0,405

1702 ( 0-5754) 1563 ( 98-4949)

0,363

Dohányzás igen nem

(n = 56) (n = 61)

111 (0-445) 87 (0-663)

0,338

52,9 (22,2-78,6) 53,9 ( 0 -83,5)

0,989

248 (0-1682) 162 (0-5585)

0,066

1808 ( 0-5754) 1566 (264-5594)

0,132

Kontroll Tumor

(n = 64) (n = 17)

51 (0-452) 100 (0-663)

0,309

23,4 ( 0 -74,8) 53,3 ( 0 -83,5)

<0,001

309 (0-6606) 205 (0-5585)

0,016

3881 (625-7018) 1684 ( 0-5754)

0,001

17. ábra: Angiogén faktorok szérumkoncentrációinak változása húgyhólyagrák különböző stádiumaiban. A vastag fekete vonal a szérumszintek (pg/ml) medián értékeit mutatja. A színes oszlopok az értékek mediánhoz legközelebb eső 50%-át a vonalak pedig a 90%-át jelölik, míg a színes körök a legmagasabb koncentrációértékeket mutatják.

64


Szarvas Tibor

kialakulása (csak Ta/T1es stádiumú tumornál), metasztázis, tumorral összefüggő halálozás. A mintákat minden marker esetében a medián érték mentén (cut-off) két csoportba osztottuk (alacsony- és magas abundanciájú csoport). Ezek a határértékek a következők voltak; VEGF-nél 96 pg/ml, Ang-1-nél 53 pg/ml; Ang-2-nél 205 pg/ml; Tie2-nél pedig 1699 pg/ml. Nem invazív tumoroknál a magasabb VEGF szérumszint szignifikánsan hosszabb betegség-függő túléléssel járt együtt (p=0,001) (18. táblázat és 17. ábra), bár a multivariancia analízisben a VEGF nem bizonyult független faktornak (p=0,744) (19. táblázat és 18. ábra). Az Ang-1 és az Ang-2 szérumszintjei nem mutattak összefüggést sem a betegségfüggő túléléssel, sem a metasztázismentes túléléssel. A magas sTie2 szérumkoncentráció azonban erősen befolyásolni látszott a metasztázis kialakulását mind a Kaplan-Meier (p=0,022) (18. táblázat és 17. ábra), mind pedig a multivariancia analízis szerint (p=0,016) (19. táblázat és 18. ábra). Így a sTie2 a metasztázis kialakulásának független prognosztikus markere. Ugyanígy a sTie2 a betegségspecifikus halálozás szempontjából is prognosztikus markernek tűnik, ezek az összefüggések ugyanis csak alig maradtak el a szignifikancia határtól (p=0,081, p=0,069). 65


Szarvas Tibor

18. ábra: A VEGF és a sTie2 szérumszintjének (alacsony/magas) hatása a betegségfüggő túlélési idő hosszára. Megfigyelési idő: 120 hónap. A szignifikancia határértéke minden esetben 0,05 volt.

66

Szarvas Tibor


18. táblázat: Áttétmentes, recidívamentes és betegségfüggő túlélés valószínűsége az angiogén faktorok szérumszintjeinek függvényében. HR – hazard ratio – a kockázat mértékét adja meg az önkényesen megválasztott referencia csoporthoz viszonyítva. Például, a betegségfüggő halálozás invazív hólyagtumornál 3,84-szer nagyobb valószínűséggel fordul elő, mint a felületes hólyagtumoroknál. Piros szín – szignifikáns összefüggés (p<0,05) HR Életkor 65.3 (36 - 87) ≤ 65 (n = 56) > 65 (n = 61) Nem férfi (n = 94) nő (n = 23) Invazivitás nem inv. (n = 38) invazív (n = 79) Malignitás alacsony (n = 48) magas (n = 69) Tumor típusa primer (n = 57) recidív (n = 60) Dohányzás nem (n = 61) igen (n = 56) VEGF szérumszint (n = 117) alacsony (n = 60) magas (n = 57) Nem invazív esetekben alacsony (n = 15) magas (n = 23) Invazív esetekben alacsony (n = 45) magas (n = 34) Ang-1 szérumszint (n = 117) alacsony (n = 59) magas (n = 58) Nem invazív esetekben alacsony (n = 22) magas (n = 16) Invazív esetekben alacsony (n = 37) magas (n = 42) Ang-2 szérumszint (n = 117) alacsony (n = 60) magas (n = 57) Nem invazív esetekben alacsony (n = 21) magas (n = 17) Invazív esetekben alacsony (n = 39) magas (n = 40) Tie2 szérumszint (n = 117) alacsony (n = 61) magas (n = 56) Nem invazív esetekben alacsony (n = 15) magas (n = 23) Invazív esetekben alacsony (n = 46) magas (n = 33)

Betegségfüggő túlélés 95% CI p érték 0,272*

ref. 1,251

0,838 – 1,867

0,274 0,705*

ref. 0,915

0,576 – 1,452

0,706 <0,001*

ref. 3,841

2,344 – 6,297

<0,001 <0,001*

ref. 2,414

1,572 – 3,707

<0,001 0,362*

ref. 1,208

0,804 – 1,815

0,363 0,445*

ref. 0,855

0,573 – 1,278

0,446 0,143*

ref. 0,699

0,431 – 1,133

0,146 0,001*

ref. 0,171

0,056 – 0,523

0,002 0,320*

ref. 1,315

0,765 – 2,263

0,322 0,591*

ref. 1,139

0,707 – 1,836

0,593 0,923*

ref. 1,052

0,373 – 2,965

0,923 0,936*

ref. 0,978

0,567 – 1,687

0,936 0,446*

ref. 0,831

0,515 – 1,342

0,449 0,092*

ref. 0,376

0,120 – 1,183

0,095 0,993*

ref. 1.002

0,585 – 1,719

0,993 0,372*

ref. 1,257

0,759 – 2,082

0,373 0,826*

ref. 1,130

0,378 – 3,377

0,826 0,076*

ref. 1,674

0,941 – 2,979

0,081

Metasztázismentes túlélés HR 95% CI p érték 0,945* ref. 0,980 0,556 – 1,727 0,945 0,457* ref. 0,786 0,415 – 1,485 0,458 <0,001* ref. 4,091 2,034 – 8,228 <0,001 0,001* ref. 2,721 1,476 – 5,015 0,001 0,258* ref. 0,719 0,404 – 1,278 0,260 0,306* ref. 0,740 0,415 – 1,320 0,308 0,279* ref. 0,689 0,350 – 1,359 0,283 0,365* ref. 0,482 0,096 – 2,422 0,376 0,982* ref. 1,009 0,475 – 2,140 0,982 0,091* ref. 1,777 0,903 – 3,497 0,096 0,379* ref. 2,037 0,404 – 10,264 0,388 0,335* ref. 1,444 0,681 – 3,058 0,338 0,663* ref. 1,160 0,598 – 2,253 0,661 0,613* ref. 0,648 0,119 – 3,538 0,616 0,454* ref. 1,320 0,636 – 2,738 0,456 0,113* ref. 1,748 0,868 – 3,521 0,118 0,730* ref. 1,348 0,246 – 7,382 0,731 0,018* ref. 2,466 1,138 – 5,346 0,022

67

HR

Recidívamentes túlélés 95% CI p érték 0,565*

ref. 0,856

0,504 – 1,454

0,566 0,440*

ref. 1,276

0,685 – 2,377

0,442 0,491*

ref. 0,787

0,398 – 1,559

0,493 0,088*

ref. 0,552

0,276 – 1,104

0,093 0,765*

ref. 0,923

0,545 – 1,562

0,766 0,401*

ref. 0,780

0,435 – 1,398

0,403 0,916*

ref. 0,963

0,457 – 2,026

0,920 0,229*

ref. 1,960

0,641 – 5,994

0,238 0,146*

ref. 0,026

0,000 – 112,0

0,392 0,327*

ref. 0,675

0,306 – 1,488

0,329 0,085*

ref. 0,410

0,144 – 1,166

0,095 0,346*

ref. 1,822

0,508 – 6,531

0,357 0,058*

ref. 0,479

0,219 – 1,047

0,065 0,519*

ref. 0,735

0,287 – 1,880

0,520 0,009*

ref. 0,098

0,012 – 0,813

0,006 0,428*

ref. 0,725

0,326 – 1,614

0,431 0,760*

ref. 1,177

0,413 – 3,353

0,760 0,052*

ref. 0,251

0,057 – 1,107

0,068

Szarvas Tibor


19. táblázat: Betegek adatai és a vizsgált faktorok szérumkoncentrációi közti összefüggések Cox multivariancia-analízissel.

Invazivitás Malignitás VEGF szérumszint Invazivitás Malignitás Ang-1 szérumszint Stage Grade Ang-2 szérumszint Invazivitás Malignitás Tie-2 szérumszint

(Ta, T1) (T2-T4) (G1-G2) (G3) alacsony magas (Ta, T1) (T2-T4) (G1-G2) (G3) alacsony magas (Ta, T1) (T2-T4) (G1-G2) (G3) alacsony magas (Ta, T1) (T2-T4) (G1-G2) (G3) alacsony magas

Betegségfüggő túlélés HR 95% CI p ref 2,222 1,177 – 4,193 0,014 ref 0,112 0,901 – 2,709 0,112 ref 0,921 0,561 – 1,511 0,744 ref 2,159 1,158 – 4,025 0,015 ref 1,540 0,890 - 2,665 0,123 ref 1,038 0,640 – 1,683 0,880 ref 2,213 1,188 – 4,123 0,012 ref 1,589 0,915 – 2,759 0,100 ref 0,794 0,491 – 1,285 0,347 ref 2,361 1,231 – 4,528 0,010 ref 1,632 0,918 – 2,901 0,095 ref 1,615 0,963 – 2,709 0,069

HR ref 2,922 ref 1,709 ref 0,959 ref 2,512 ref 1,866 ref 1,675 ref 2,892 ref 1,691 ref 1,114 ref 2,947 ref 2,039 ref 2,393

Áttétmentes túlélés 95% CI

p

1,102 – 7,746

0,031

0,761 – 3,838

0,194

0,481 – 1,912

0,904

0,962 – 6,559

0,060

0,837 – 4,157

0,127

0,841 – 3,333

0,142

1,101 – 7,594

0,031

0,755 – 3,787

0,201

0,573 – 2,167

0,750

1,095 – 7,932

0,032

0,869 – 4,786

0,102

1,174 – 4,880

0,016

Recidívamentes túlélés HR 95% CI p ref 1,571 0,604 – 4,086 0,355 ref 0,902 0,376 – 2,161 0,816 ref 1,083 0,454 – 2,585 0,857 ref 1,480 0,640 – 3,422 0,359 ref 0,825 0,349 – 1,950 0,661 ref 0,661 0,297 – 1,473 0,311 ref 1,758 0,744 – 4,154 0,198 ref 0,799 0,382 – 2,099 0,799 ref 0,448 0,203 – 0,989 0,047 ref 0,724 0,594 – 3,488 0,420 ref 1,439 0,291 – 1,803 0,488 ref 0,666 0,292 – 1,517 0,333

19. ábra: Az Ang-1, Ang-2, VEGF és a sTie2 szérumszintjének (alacsony/magas) hatása a metasztázismentes túlélésre. Megfigyelési idő 120 hónap. A szignifikancia határértéke 0,05.

68

Szarvas Tibor


VI. MEGBESZÉLÉS Jelen tanulmányban a húgyhólyagrákok korszerű, molekuláris diagnosztikai illetve prognosztikai vizsgálatának lehetőségeivel foglalkoztunk. A diagnosztikai alkalmazások során a vizeletből történő DNS-károsodások kimutatására koncentráltunk, míg a prognosztikai célú analíziseknél angiogén faktorok szöveti génexpresszióját, illetve szérumkoncentrációját vizsgáltuk. A vizeletből történő mikroszatellita allélvesztés-vizsgálat a hólyagtumor diagnosztikájának egyik ígéretes módszere. Előnye, hogy nem igényel invazív beavatkozást, így elvégzése a betegre nem jelent semmiféle kockázatot. A módszer felhasználhatóságának elméleti lehetőségei sokfélék; tumor kimutatása panaszmentes, veszélyeztetett populációban, vagy hólyagtumor tüneteivel orvoshoz forduló betegek esetében. Alkalmas továbbá ismert betegség követése a recidíva korai felismerésére, a sebészi rezekciós vonal tumormentességének megállapítása („distance dissection”), az esetleg bizonytalan hisztológiai leletek megerősítése illetve korrigálása, a tumor várható viselkedésének (pl.: gyakran visszatérő vagy gyorsan progrediáló) meghatározása. Azt, hogy e lehetőségek közül melyik váltható valóra; a specificitás, a szenzitivitás valamint a vizsgálat munkaigénye és költsége határozza meg, illetve az, hogy léteznek-e olyan kromoszóma régiók melyek elvesztése determinálja a tumor későbbi viselkedését. Ezen kérdések megválaszolása csak alapos, nagy esetszámot felölelő szisztematikus vizsgálatsorozattal lehetséges, melynek első lépése szükségszerűen a már diagnosztizált esetek párhuzamos vizsgálata kell legyen. E megfontolások alapján 44 hólyagtumorban szenvedő beteg mintáit vizsgáltuk mikroszatellita allélvesztés céljából. Megállapítottuk, hogy a módszer a tumorszövetek 85%-ában talált legalább egy deléciót míg a vizeletből történő kimutatás érzékenysége 68 és 80% között változik attól függően, hogy a vizelet mely részét vizsgáljuk. A vizelet üledékből elvégzett analízis során a húgyhólyag faláról lesodródó tumorsejtek örökítőanyagában kerestünk eltéréseket. Ilyenkor azonban számolni kell azzal, hogy a tumorsejtek mellett normál epithel sejtek is a vizeletbe jutnak, melyek nem tartalmaznak deléciókat,

ezért

a

tumorokban

jelen

lévő

allélvesztéseket

(egészséges

szövetszennyezésként) elfedhetik, csökkentve ezzel a módszer szenzitivitását. Vizsgálható mennyiségű DNS azonban nem csupán a vizelet üledékben, hanem a felülúszóban is található. Az ún. sejtmentes DNS-t plazmában már 1948-ban kimutatták,

69


Szarvas Tibor

ez a munka azonban majd 30 éven át visszhang nélkül maradt. (120) Leon és munkatársai 1977-ben megjelent írása törte meg a csendet, melyben hasnyálmirigyrákos betegek szérumának emelkedett szabad DNS tartalmáról számoltak be.

(121)

Később

bizonyították azt is, hogy a sejtmentes DNS rákos betegeknél főleg a tumorból származik.

(122-127)

Jelenlétét kimutatták rákos betegek szérum, plazma pleurális

folyadék és vizeletmintájában is. A legvalószínűbb, hogy a DNS a rákos sejtek apoptózisával illetve nekrózisával jut a keringésbe. Hólyagtumornál a vizelet emelkedett sejtmentes DNS tartalma összefüggést mutatott a tumor jelenlétével és nagyrészt apoptotikus eredetű volt

(128-130)

Ezek alapján feltételeztük, hogy a vizelet felülúszó

sejtmentes DNS-e – mivel az túlnyomó részt a tumorból származik – nem, vagy csak a vizelet üledékénél kisebb arányú egészséges DNS-szennyeződést tartalmaz. A két frakcióból kapott érzékenység jelentősen eltért egymástól; míg az üledékből 68%-os érzékenységet sikerült elérni, addig a vizelet felülúszóból elvégzett vizsgálat 80%-os szenzitivitást mutatott. A specificitás azonban a vizelet üledék esetében volt kedvezőbb; 95% a beteg kontrolloknál és 88% az egészséges személyek vizeletét vizsgálva, szemben a vizelet felülúszóban tapasztalt 80 és 81%-os specificitással. Ez valószínűleg azzal magyarázható, hogy az egészséges, ill. nem tumoros személyek vizelet felülúszójában alacsonyabb koncentrációban van jelen a DNS ezért több az amplifikációs hiba következtében pozitívnak mutatkozó lókusz. Ezt a magyarázatot támasztja alá a nem értékelhető eredmények eloszlása is. Míg a vizelet üledéknél mind a tumoros esetek (4%), mind pedig a kontroll csoportok (urológiai kontroll 3%, egészséges kontroll 0%) esetében hasonlóan alacsony volt a nem értékelhető eredmények száma, addig a vizelet felülúszóban ez a tumoros betegeknél jóval alacsonyabb volt (15%), mint az urológiai kontroll csoportban (25%) és az egészséges kontroll csoportban (48%). A vizelet felülúszó tehát magasabb érzékenységet biztosít tumor jelenlétében, specificitása viszont alacsonyabb. A már diagnosztizált tumor monitorozására tehát valószínűleg a vizelet felülúszó alkalmazása ajánlható, míg az első alkalommal történő kimutatásra a vizelet üledék látszik alkalmasabbnak. A tumorban talált deléciók 67%-a a vizeletben is kimutatható volt, találtunk viszont olyan allélvesztéseket is, melyeket a vizeletben igen, a tumorban viszont nem sikerült kimutatni. A hólyagtumoroknál gyakori, hogy egyszerre több tumorklón is jelen van a szervben, így előfordulhat, hogy a vizeletben talált deléció nem attól a tumorklóntól származik, melynek szövetmintáját vizsgáltuk.

70


Szarvas Tibor

A teljes genom mikroszatellita allélvesztés-vizsgálat során korai, felületes hólyagtumorok deléciós mintázatát vizsgáltuk. A használt 400 primerpár az egész genom 10 cM felbontású analízisét tette lehetővé (ez kb. 150 kilobázisnak felel meg). Előnye, hogy kisebb régiókra fókuszál, így olyan kisméretű deléciók kimutatására is alkalmas, amelyek hibridizációs technikával észrevétlenek maradnának. A nagyszámú marker kipróbálásával alkalmunk nyílt egy szisztematikus vizsgálat elvégzésére. Célunk egyrészt az volt, hogy egy olyan optimális primerkombinációt állítsunk össze, amellyel a lehető legkisebb számú marker alkalmazásával a lehető legmagasabb érzékenységet tudjuk elérni. Másrészt, a Ta és T1 invazivitású valamint a G1, G2, G3 esetek összevetésével, lehetőségünk nyílt olyan kromoszóma régiók felkutatására, amelyek összefüggésbe hozhatók a tumor infiltratív növekedésével és magasabb malignitásával. A nagyszámú primerpár viszonylag kisszámú mintán való alkalmazása szükségszerűen azonosít olyan régiókat, amelyek deléciói látszólag összefüggést mutatnak a tumorprogresszióval. Ezért hangsúlyozzuk, hogy az itt kiválasztott ígéretes régiók delécióinak további nagyobb mintaszámon történő vizsgálatát a jövőben szükségesnek tartjuk. A leggyakoribb eltéréseket az irodalmi adatoknak megfelelően a 9-es kromoszómán találtuk. A 16 leggyakrabban allélvesztést szenvedő régió közül 15 a 9-es kromoszómán található, egy pedig a 11-esen. Továbbá gyakoriak voltak az 5q, a 11p és a 17p deléciói, illetve kisebb régiók elvesztései a 8p és a 10p kromoszómakarokon. A legkevesebb eltérést a 6-os, 7-es, 12-es, 14-es, 21-es és 22-es kromoszómákon találtuk. Mind a 17 tumor azonosításához 4 régió vizsgálata elegendő volt. Több kombináció is elképzelhető, ezek közül az egyik: D9S167, D9S288, D17S944, D11S968, melyek közül csupán az első hármat használva is 94%-os szenzitivitás érhető el. Ezek az értékek összevethetők a korábban 44 betegen elvégzett vizsgálatéival, hiszen ott a vizeletek mellett 26 tumormintát is analizáltunk. Abban a vizsgálatban 12 primerpárt alkalmazva 85%-os szenzitivitást (22/26) értünk el. Látható tehát, hogy a nagyszámú markerrel elvégzett mérések eredményeképpen sikerült kiválasztanunk egy olyan primer kombinációt, amely kevesebb mikroszatellita markerrel (4 db) jelentősen magasabb szenzitivitást (100%) biztosít. A várakozásoknak megfelelően a magasabb invazivitású illetve alacsonyabb differenciáltsági fokú tumoroknál nagyobb számú allélvesztést detektáltunk. A G1-es és G2-es tumorok közötti különbség (35 vs. 48) nem volt olyan jelentős, mint a G3-as esetekben, ahol 126 volt az átlagos allélvesztésszám. A felületes Ta tumorokban 71


Szarvas Tibor

esetenként átlagosan 34 allélvesztést találtunk, míg a T1-es besorolásúaknál (tehát azoknál ahol a tumor a lamina propriára terjed, de még nem töri át a bazális membránt) majdnem háromszor olyan magas (92) volt az átlagos allélvesztésszám. Ez a meglepően magas különbség rámutat arra, hogy jó esély van olyan kromoszóma régiók felkutatására, melyek eltérései korrelálnak a szövettani besorolással. Ennek a hólyagtumorok kezelése során esszenciális jelentősége lenne, hiszen a mai gyakorlat szerint a terápia kiválasztása során az urológus szinte kizárólag a kórszövettani leletre támaszkodik. Ezért különösen veszélyes az a helyzet, amikor az első, általában endoszkópos műtét során a rezekciós vonal nem éri el a tumor terjedésének vonalát (tehát nem sikerül azt épben kimetszeni), hiszen ilyenkor nem állapítható meg a tumor stage. Ebből következően sok esetben nem lehet eldönteni, hogy szükség ven-e radikális beavatkozásra (cisztektómiára) vagy elegendő a beteg számára sokkal kevésbé megterhelő és veszélyes transzuretrális kezelés. Ezért az ilyen esetekben egy ún. második ülésben elvégezett újabb transzuretrális kezelést (utórezekciót) szoktak végrehajtani. Ekkor azonban egyrészt megnő a beavatkozás egyik legveszélyesebb komplikációjának számító perforáció valószínűsége, hiszen ilyenkor a már egyszer rezekált területen keletkezett seb mélyítése történik, másrészt pedig az utórezekciók esetében sokkal gyakoribb az értékelhetetlen, hőkárosodott minta. Ilyen komplikációk esetén egy molekuláris módszerrel a hisztológiailag értékelhetetlen minta vizsgálata is elvégezhető lenne, akár a paraffinos beágyazást követően is, de lehetőség volna a vizeletből történő analízis elvégzésére is. Ezek figyelembevételével tehát értékes információt nyerhetünk abból a 20 kromoszóma régióból, melyek Ta tumorokban nem mutattak allélvesztést, viszont a T1 tumorok 50%-ában deléciót szenvedtek: D1S2697, D1S199, D1S2890, D2S319, D2S2259, D2S142, D2S364, D2S117, D4S2935, D4S405, D4S1534, D5S426, D6S257, D8S514, D8S284, D10S249, D16S503, D16S520, D18S70, D22S539. Ezek közül a legalkalmasabbak kiválasztására azonban egy nagyobb esetszámot felölelő vizsgálatra van szükség. Az UroVysion FISH vizsgálat során a mikroszatellita allélvesztés-analíziséhez hasonló méretű betegcsoportból indultunk ki. A két módszer érzékenysége igen hasonló volt: 87% az előbbivel és 86% (mindkét vizeletfrakció figyelembevételével) az utóbbival. A FISH vizsgálat során tapasztalt 100%-os (11/11) specificitáshoz képest a mikroszatellita allélvesztés-vizsgálatnál a vizelet felülúszóból detektált 95%-os értéke (e mintaszám mellett) nem jelent nagy különbséget, ám a felülúszó esetében kapott 80%72


Szarvas Tibor

os érték már számottevő. A legnagyobb esetszámot (265) felölelő fluoreszcens in situ hibridizációs analízis Halling és mtsai. nevéhez fűződik. Ők mind a szenzitivitás (81%), mind specificitás (95%) vonatkozásában az általunk tapasztalttal szinte megegyező értékeket publikáltak. (131) A vizsgált genetikai eltérések közül egyedül a 9p21 deléciója volt az, amit mind a fluoreszcens, mind a mikroszatellita módszerrel vizsgáltunk. E régió delécióinak gyakorisága a két módszerrel igen eltérő eredményt mutatott. A FISH analízissel a vizeletminták 32%-ában (11/34) találtuk a 9p21 mutációját, míg a mikroszatellita allélvesztés-vizsgálattal 12 markerrel 50%-os gyakoriságot (22/44), 400 markerrel pedig 82%-os (14/17) gyakoriságot mutat. Ez valószínűleg azzal magyarázható, hogy a mikroszatellita markerekkel kisebb méretű deléciók is kimutathatók, míg a FISH-próbák mérete csak a nagyobb méretű kromoszómatöréseket képes detektálni. A FISH analízissel is ugyanazt a tendenciát találtuk a genetikai eltérések száma és a tumor invazivitása között, mint a 400 primerpárral elvégzett mikroszatellita vizsgálattal. Nevezetesen, hogy a T1-es tumorokban a Ta stádiumúakhoz képest többszörös számú mutáció található. A hibridizációs módszerrel T1-es és T2-es stádiumú tumorok között már nem volt ilyen nagy különbség. Ez arra utal, hogy a klinikailag gyakran azonos csoportba sorolt ún. felületes (Ta-T1-es) hólyagtumorok legalábbis genetikai hibáikat tekintve igen eltérőek egymástól; a T1-es tumorok inkább a klinikailag már invazív csoportba sorolt és így alapvetően másképp kezelt T2-es hólyagrákokhoz állnak közelebb. Az angiopoietin családba tartozó citokinek a – főleg az endothel sejtek felszínén expresszálódó – Tie2 tirozin kináz aktivitású receptorok ligandjai. A Tie2-ről a közelmúltig azt gondolták, hogy kizárólag az endothel sejtek felszínén expresszálódik, ám újabban megfigyelték egyes monociták felszínén is (TEM). Az Ang-1 agonistaként hat e receptorra és annak intracelluláris doménjén autofoszforilációt vált ki, ami többek között antiapoptotikus szignál kifejlődéséhez vezet. Az Ang-1/Tie2 kötődésnek szerepe van az endothel sejtek és környezetük (ECM, periciták, szomszédos sejtek) kapcsolatának kialakításában. Tehát az Ang-1 elsősorban az erek érését és stabilizálását irányítja. Az Ang-2 azonos affinitással kötődik a Tie2 receptorhoz, mint az Ang-1, de antagonistaként nem vált ki autofoszforilációt. Az Ang-2 legfontosabb funkciója tehát az Ang-1 hatásának felfüggesztése. A tumorok gyakran termelnek Ang-2-t amivel hozzájárulnak a meglévő erek destabilizálásához. Erre az erek tumor által indukált átépüléséhez (remodelling) feltétlenül szükség van. Az Ang-2 túlsúly hatására kialakuló 73

Szarvas Tibor


destabilizált állapotban a VEGF koncentrációja dönti el, hogy e labilis állapot érképződésbe (angiogenezis) vagy érpusztulásba (regresszió) torkollik. Nagyobb VEGF koncentráció esetén az instabil állapot angiogenezis felé, míg alacsonyabb VEGF koncentráció esetén regresszió felé terelődik. Az általunk elvégzett vizsgálatok tanulsága szerint a hólyagtumorok génexpressziós mintázata határozott proangiogén (érképződést serkentő) stimulusra utal. Nevezetesen, a VEGF expresszió (endothel proliferációs szignál) a normálhoz képest szignifikánsan emelkedik, az Ang-1 expresszió (érstabilizációs hatás) pedig drámai mértékben csökken. Emellett az Ang-2 szintje tumorban nem változik szignifikánsan, egyedül Ta stádiumban látszik némi emelkedés. A Tie2 pedig kis mértékben, nem szignifikáns módon csökken. A legmagasabb VEGF expresszió a felületes (főleg Ta) tumoroknál figyelhető meg és a tumor invazivitásával szignifikáns módon csökken. Az Ang-1-nél éppen fordított volt a tendencia; a legnagyobb mértékű expresszió csökkenést a felületes tumoroknál tapasztaltuk, ami a növekvő invazivitással párhuzamosan emelkedett. Ezek az eredmények mind a tumor-normál mind pedig a tumor stádiumok közötti összehasonlításban megegyeznek a Quentin és mtsai. által publikáltakkal.

(78)

E

szerint tehát a proangiogén szignál a felületes hólyagtumorban a legerősebb és tumorprogresszió során folyamatosan csökken. Ezzel az expressziós mintázattal szinte teljesen megegyezőt találtak prosztatarák megelőző állapotokban (ún. intraepithelialis neopláziában) ami együtt járt az erek destabilizációjával (periciták és endothel sejtek közti

kapcsolatok

fellazulása)

és

az

endothel

sejtek

bazálmembránjának

degradációjával. (132) A Ta stádiumú hólyagrákokban a tumorsejtek a hólyag lumene felé növekednek, és gyakran meghaladják az 1-2 mm-es méretet, miközben a tumor nem rendelkezik saját erekkel, hiszen a bazális membrán érintetlen. Érthető tehát, hogy ebben a fázisban hypoxia alakul ki, ami pedig a már ismert HIF1α-n keresztüli szignálúton, növeli a VEGF gén aktivitását.

(133)

Az invazív hólyagrákok már

rendelkeznek saját érhálózattal, illetve infiltratív módon növekedve képesek a már meglévő erek közé migrálni, így a hypoxia valószínűleg nem általánosan, sokkal inkább lokálisan jelentkezik. Ezt látszik alátámasztani az a megfigyelés mely szerint az invazív tumorokban gyakran egyidőben figyelhető meg hypoxiás nekrózis és erőteljes angiogenezis. (44) Munkánk során nem csak az angiogén faktorok hólyagtumorok kifejlődésében illetve progressziójában betöltött szerepének alaposabb megértésére, hanem e markerek prognosztikus értékének felmérésére is törekedtünk. Ezért a megfigyelt angiogén 74


Szarvas Tibor

faktorok relatív expressziója és a betegség lefolyása között is összefüggéseket kerestünk. A felületes (Ta-T1) és izom invazív hólyagtumorok kezelése és veszélyei alapvetően eltérnek egymástól. A felületes hólyagtumoroknál előforduló egyik veszélyforrás, hogy a tumor progrediál (pl.: izom invazívvá válik) ez azonban csak az esetek 10-15%-ában fordul elő, így ennek megfigyeléséhez és korrekt statisztikai kiértékelhetőségéhez nagyobb esetszámra lenne szükség. A másik veszélyforrás a betegség visszatérése (recidíva), ami már jóval gyakoribb esemény (70-80%). Ebben a stádiumban (Ta) a távoli áttét előfordulásának valószínűsége elhanyagolható (0,5%). Az invazív húgyhólyagrákokat cisztektómiával kezelik, ezért itt a lokális recidíva vizsgálatának nincs értelme. Ebben a csoportban azonban jóval gyakoribb (30% körüli) a távoli áttét előfordulása illetve a tumor következtében bekövetkező halálozás. E megfontolások alapján a felületes (Ta-T1) és invazív (T2-4) hólyagtumorok esetében más-más megfigyelésekre koncentráltunk; az előbbi csoportban a recidívamentes intervallumok hosszát vetettük össze az angiogén faktorok relatív expressziójával, míg az invazív tumorok esetén metasztázismentes periódus hosszát és a betegséggel kapcsolatos halálozást vizsgáltuk. A VEGF-ről ismert, hogy mind szérum, mind vizelet koncentrációjának, mind pedig szöveti expressziójának emelkedése kockázatot jelent a recidíva képződésre nézve.

(134,135)

Ezt az összefüggést a mi vizsgálataink is alátámasztják, bár a Kaplan-

Meier analízissel számolt korreláció (p=0,072) csak megközelítette, de nem érte el a szignifikancia határt. A felületes tumorok recidívaképződésének prognosztizálására alkalmas marker az Ang-2, melynek magas (396,21 feletti) szöveti expressziója a multivariancia analízis szerint 10-szeres kockázati tényezőt jelent (HR=10,18, 95% CI 2,69-38,49, p<0,001). Az invazív hólyagrákok esetében a metasztázisképződésre vonatkozóan a magas VEGF expresszió kockázati tényezőnek tűnik, ám a korreláció erőssége (p=0,059) ezúttal is csak közelítette, de nem érte el szignifikancia határt. A magas VEGF expresszió és az erősebb metasztázisképző hajlam közti összefüggést korábban Bernardini és mtsai. már igazolták.

(100)

Jelen vizsgálat azonban a VEGF mellett

azonosította a Tie2-t, mint a metasztázisképződés lehetséges prognosztikus markerét. A tirozin kináz receptor magas expressziója kedvező és független prognosztikus jelnek bizonyult (HR=0,31, 95%, CI 0,11-0,89, p=0,029). A hólyagtumortól függő túléléssel egyedül a Tie2 mutatott szignifikáns összefüggést; magasabb expressziója kedvező és független prognosztikus jelnek mutatkozott (HR=0,25, 95% CI 0,10-0,62, p=0,003). A 75

Szarvas Tibor


Tie2 expressziója és a tumorok jelenléte valamint malignitása közötti összefüggésről ellentmondó információk állnak rendelkezésre.

(86-96)

Az angiogenezisben betöltött

meghatározó szerepe ellenére prognosztikus értékét eddig kevesen vizsgálták. Az egyetlen ilyen irányú, immunhisztokémiai módszerrel mellrák esetében elvégzett munka a Tie2, tumorsejtek felszínén történő expresszióját rizikófaktorként azonosította. Fontos azonban hangsúlyozni, hogy a kiértékelés során Dales és mtsai. nem az expresszió erősségét vették alapul, hanem azt, hogy tumorsejtek felszínén detektálható-e a receptor. (136)

Jelen munkában a Tie2 magas mRNS expressziója kedvező, független és

szignifikáns

prognosztikus

faktornak

bizonyult

húgyhólyagrákokban

mind

a

metasztázisképződés, mind a tumorhoz kapcsolódó halálozás szempontjából. Ez alátámasztani látszik azt a megfigyelést, hogy az Ang-1/Tie2 kapcsolat a tumornövekedést gátolja és ezt érstabilizáló hatásán keresztül fejti ki.

(137)

Ergün és

mtsai. pedig arra a következtetésre jutottak, hogy az érstabilizáció önmagában is tumornekrotizáló hatású. hólyagtumorban

(138,139)

valószínűleg

Az Ang-1 expressziójának erős csökkenése hozzájárul

a

környező

szövetek

ereinek

destabilizálásához. A Tie2 magasabb expressziója pedig az érstabilitás megtartásában, ezáltal a tumor indukálta angiogenezis mérséklésében játszhat szerepet. Véleményünk szerint ezzel magyarázható, hogy kísérleteinkben a magasabb Tie2 abundancia, alacsonyabb metasztázisképző hajlammal és hosszabb túléléssel járt együtt. Az angiogén faktorok szöveti expressziója mellett meghatároztuk azok szérumszintjét is. Az angiopoietinek illetve a VEGF oldott formában az intersticiális térbe szekretálódnak, így könnyedén bekerülnek a keringésbe. A Tie2 extracelluláris doménjének egy 75 kDa-os darabja pedig proteolítikus hasítás következtében kerül a szérumba. A VEGF szérumkoncentrációja hólyagtumorban kétszeres, nem szignifikáns emelkedést mutatott a kontrolhoz képest, ami összhangban van a szövetben mért mRNS expresszióval. Beecken és mtsai. köldökvénából származó endothel sejteket kezeltek hólyagtumoros betegek szérummintáival. Megállapították, hogy a felületes tumorban szenvedő betegek szérumai erősebb proliferációt indukáltak és ez szoros összefüggést mutatott a magasabb VEGF szérumszinttel. Azoknál a betegeknél ahol a VEGF alacsony koncentrációban volt jelen, a metasztázis előfordulásának kockázata magasabb volt.

(101)

Ez egyezni látszik az általunk felületes hólyagtumoroknál talált

összefüggéssel, mely szerint az alacsony VEGF szérumszint magasabb tumorfüggő halálozással jár (p=0,002), bár ezt a multivariancia analízis nem erősítette meg. 76

Szarvas Tibor


Oliveira-Ferrer és mtsai. úgy találták, hogy a felületes hólyagtumorok magasabb VEGF szintjéért egy karcinoembrionális sejt adhéziós molekula, a CEACAM1 alacsonyabb expressziója a felelős. (102) Az angiopoetinek szöveti expressziója tumorokban általában emelkedést mutat. (85)

Munkacsoportunk és mások az Ang-1 mRNS expressziójának erőteljes csökkenését

mutattuk ki húgyhólyagrákokban.(78) Oka és mtsai. viszont immunhisztokémiai analízissel nem találtak eltérést tumor-normál összehasonlításban, sem az Ang-1, sem pedig az Ang-2 esetében ellentmondást

(84)

Az RNS és fehérje szintű megfigyelések közötti

magyarázhatja,

hogy

e

két

fehérje

termelődése

jelentős

poszttranszkripcionális szabályozás alatt állhat. Egy másik lehetséges magyarázat szerint – mivel Oka és mtsai. cisztektómiából származó egészségesnek tűnő szöveteket használtak kontrollként, mi pedig tumormentes hólyagból származó epithelt – elképzelhető, hogy az Okáék által vizsgált morfológiailag normálisnak tűnő szövet fehérje expressziója a szervben jelen lévő tumor által befolyásolva már nem reprezentálja az egészséges szövetre jellemző fehérjeexpressziót. Az angiopoietin szérumkoncentrációi nem mutattak összefüggést sem a tumor recidíva- és metasztázisképző hajlamával, sem pedig a túléléssel. A

Tie2

hólyagtumorban

extracelluláris független

és

részének

magas

szignifikáns

szérumkoncentrációja rizikófaktornak

invazív

bizonyult

a

metasztázisképződés vonatkozásában (HR=2,393, 95% CI 1,17-4,88, p=0,016). Ez ellentmondani látszik azzal a megállapításunkkal, hogy Tie2 magas szöveti mRNS expressziója kedvező prognosztikus jel az áttétképződésre nézve. Nem szabad azonban elfelejteni, hogy a szérumban egy proteolítikus hasítás következtében a keringésbe kerülő peptid koncentrációját mérjük. Amíg tehát a génexpressziós vizsgálatok során a (funkcióképes) receptor termelődési aktivitását mértük, addig a szérumban a hasítás nyomán inaktívvá vált (funkcióját elvesztő) receptor mennyiséget határoztuk meg. Ezek alapján úgy tűnik, hogy a funkcióképes Tie2 jelenléte fontos metasztázisellenes szerepet tölt be. Ezt az elképzelést támasztja alá az a megfigyelés is, mely szerint a VEGF, a PI3K/Akt szignálúton serkenti a Tie2 lehasítását az endothél sejtek felszínéről.

(109)

És

erre utal a szérumban talált VEGF és sTie2 koncentrációjának szoros összefüggése is (p=0,02). A Tie2 (és Ang-1) tehát valószínűleg fontos szerepet játszik a tumor indukálta angiogenezis csillapításában, ezáltal hátráltatja annak növekedését, metasztázisképző hajlandóságát. 77

Szarvas Tibor


VII. KÖVETKEZTETÉSEK

1.

A vizeletből történő mikroszatellita allélvesztés- és FISH vizsgálat érzékeny, nem invazív módszer a húgyhólyagrák kimutatására.

2.

A nagyszámú mikroszatellita markerrel elvégzett vizsgálatok megmutatták, hogy léteznek olyan kromoszómális régiók, melyek deléciói a betegség progressziójával hozhatók összefüggésbe. E régiók azonosítása újabb, a tumor invazív növekedése szempontjából fontos szupresszor géneket azonosíthatnak, valamint a szövettannal is korreláló, pontosabb diagnózis felállítását teszi lehetővé.

3.

A kontroll és tumormintákban talált citokinek szöveti expressziós mintázata arra utal, hogy a felületes hólyagtumorok erőteljes angiogenezist serkentő hatást fejtenek ki, mely a tumorprogresszió során csökken.

4.

A tumor indukálta angiogenezis irányításában részt vevő faktorok segítenek a hólyagtumor várható viselkedésének pontosabb leírásában, prognosztikus értékük jelentős: a. Az Ang-2 és a VEGF magas szöveti mRNS expressziója a felületes húgyhólyagtumorok

recidíva

képződése

szempontjából

kockázati

tényezőt jelent. b. A VEGF magas és a Tie2 alacsony szöveti expressziója invazív hólyagrákokban a magasabb áttétképződési valószínűséggel mutat összefüggést. c. A Tie2 csökkent szöveti mRNS expressziója a magasabb tumortól függő halálozás kockázati tényezője. d. A szérumban mért sTie2 magas koncentráció a metasztázisképződés rizikófaktora invazív hólyagrákokban.

78

Szarvas Tibor


VIII. ÖSSZEFOGLALÁS Ez a disszertáció a hólyagtumorok aktuális diagnosztikai és prognosztikai kérdéseire keres válaszokat. Ehhez pedig a molekuláris biológia modern módszereit hívja segítségül. A diagnosztikai alkalmazások során a vizeletből történő DNS-károsodások kimutatására koncentráltunk. Beállítottuk az UroVysion FISH és a mikroszatellita allélvesztés-vizsgálatot, meghatároztuk azok saját laboratóriumunk körülményei között elérhető érzékenységét és specificitását. Megállapítottuk, hogy a vizelet felülúszóból a sejt-mentes DNS-en elvégzett mikroszatellita-vizsgálatok nagyobb érzékenységet biztosítanak e módszer számára, mint a vizelet üledékből történő kimutatás. Egy az egész genomot lefedő marker gyűjteménnyel sikerült, olyan primer kombinációt összeállítanunk, mellyel az eredetileg használt 12 helyett, akár 4 primerpár együttes használatával is 100%-os érzékenység érhető el. Ez nagyban javítja a módszer alkalmazhatóságának esélyeit. Azonosítottunk továbbá olyan kromoszómális régiókat, melyek deléciói összefüggést mutatnak a tumorok invazivitásával és malignitásával. Ennek főleg olyan esetekben lehet jelentősége melyekben a szövettani vizsgálat nem ad egyértelmű eredményt. A molekuláris sajátságaik alapján a tumorok várható viselkedése pontosabban kiszámítható. Ez utat nyithat az egyén igényeihez pontosabban igazodó terápia számára, javítva annak hatékonyságát. Az angiogenezis prognosztikus szerepét mind morfológiai, mind molekuláris biológiai bizonyítékok alátámasztják. Olyan angiogén fakorok szöveti mRNS expresszióját és szérumkoncentrációját határoztuk

meg,

melyek

irányító

szerepet

töltenek

be

a

tumor

indukálta

angiogenezisben. Ezeket az értékeket a betegek követési adataival összevetve állapítottuk meg azok prognosztikai értékét. Ilyen módon a felületes hólyagtumorok fokozott recidíva képződésére utaló faktorként azonosítottuk a magas VEGF és Ang-2 génexpressziót. Előrehaladott (izomra terjedő) húgyhólyagrákoknál a VEGF magas mRNS szintje kockázati tényezőnek, míg a Tie2 magas abundanciája kedvező prognosztikus

jelnek

bizonyult

a

tumor

79

metasztázisképző

képességének


Szarvas Tibor

vonatkozásában. A Tie2 magas szöveti szintje összefüggést mutatott a hosszabb túléléssel. A génexpressziós mintázat tumor-normál illetve invazivitás függvényében történő összehasonlítása; erős angiogén szignál jelenlétét bizonyítja felületes hólyagtumorokban. Ennek főbb jellemzői; magas VEGF és erősen lecsökkent Ang-1 kifejeződés. A progresszió során azonban az angiogén jel egyre csökken. Ugyanezen angiogén faktorok szérumkoncentrációi közül a Tie2 extracelluláris doménjének magas szérumkoncentrációja kockázati tényezőt jelentett a hólyagtumor áttétképző képességének szempontjából. Ezek alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a Tie2 fontos szerepet játszik a tumor metasztázisképző képességének visszaszorításában, amit valószínűleg érstabilizáló hatásán keresztül valósít meg. A fent kifejtett eredmények igazolják, hogy az angiogenezisben szerepet játszó faktorok

expressziója

szignifikánsan befolyásolja a húgyhólyagrákos betegek

életkilátásait. Ez alapján az antiangiogén terápia e tumorban való hatékonysága várható. Az új gyógyszerek alkalmazása pedig olyan vizsgálómódszerek kifejlesztését igénylik, melyekkel azonosítható a betegek azon csoportja melyben a kezelés magasabb hatékonysága várható. Másrészt szükség lehet olyan markerek felkutatására is, melyek segítségével a terápia hatékonysága követhető.

80


Szarvas Tibor

IX. SUMMARY The present work tries to answer some current diagnostic and prognostic questions of urinary bladder cancer using new molecular methods. In the diagnostic applications, we focused on detection of DNA alterations in human urine samples. We installed the UroVysion FISH method and microsatellite deletion analysis and defined their specificity and sensitivity in our laboratory conditions. The analysis of cell-free DNA of urine supernatant provided higher sensitivity as urine sediment. Performing a genom wide screening by a set of 400 microsatellite markers (mapped on all chromosomes). We were able to reduce the minimal number of microsatellite primers to 4 with a sensitivity of 100%. Furthermore we identified chromosomal regions deleted only in muscle-invasive or in high grade tumors. The analysis of these regions would have an importance in cases with unclear results of histological examination. Based on their molecular characteristics, future behavior of tumors become more and more predictive. The prognostic value of angiogenesis was confirmed by both morphologic and molecular biologic evidence. We identified tissue mRNA expressions and serum protein concentrations of five angiogenic factors critically involved in normal and pathological angiogenesis. To explore these markers clinical relevance, their expression data was compared with a long follow-up period. We found a characteristic “angiogenic switch” in gene expression pattern with strong down-regulation of Ang-1 and concurrent up-regulation of Ang-2 and VEGF expression in bladder tumor stage pTa, a superficial non-invasive tumor stage. This shift is probably a main driving force of vascular destabilization and initiation of angiogenesis in bladder cancer. Remarkably, this switch is less pronounced in later stages of bladder cancer. We identified Ang-2 and VEGF as an independent predictor of disease recurrence and demonstrated the predictive potential of Tie2 expression for bladder cancer metastasis and disease-specific survival. Serum protein levels of the same factors were analyzed by sandwich ELISA. These experiments identified high serum concentrations of extracellular domain of Tie2

81


Szarvas Tibor

as a significant risk factor for bladder cancer metastasis. Based on these we concluded that Tie2 plays an important role in preventing bladder cancer metastasis. The detailed results above show that the expressions of angiogenic factors do have a significant impact on patients’ survival in bladder cancer. This indicates the need for new antiangiogenic therapy modalities in this disease. The advances on this field lay claim to markers to measureing the biological effects of targeted agents and to identifieing patients most likely to benefit from treatment.

82


Szarvas Tibor

X. IRODALOMJEGYZÉK 1.

Brauers A, Jakse G. (2000) Epidemiology and biology of human urinary bladder cancer. J Cancer Res Clin Oncol, 126 (10): 575-83.

2.

Wai CY, Miller DS. (2002) Urinary bladder cancer. Clin Obstet Gynecol, 45 (3): 844-54.

3.

Jones PA, Ross RK. (1999) Prevention of bladder cancer. N Engl J Med, 340 (18): 1424-6.

4.

IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum (1994) Schistosomes, liver flukes and Helicobacter pylory, vol 61. IARC Press, Lyon

5.

Derby LE, Jick H. (1996) Acetaminophen and renal and bladder cancer. Epidemiology, 7 (4): 358-62.

6.

Neugut AI, Ahsan H, Robinson E, Ennis RD. (1997) Bladder carcinoma and other second malignancies after radiotherapy for prostate carcinoma. Cancer, 79 (8): 1600-4.

7.

Golka K, Wiese A, Assennato G, Bolt HM. (2004) Occupational exposure and urological cancer. World J Urol, 21 (6): 382-91.

8.

Boffetta P, Jourenkova N, Gustavsson P. (1997) Cancer risk from occupational and environmental exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Cancer Causes Control, 8 (3): 444-72.

9.

Boffetta P, Silverman DT. (2001) A meta-analysis of bladder cancer and diesel exhaust exposure. Epidemiology, 12 (1): 125-30.

10.

Bast RC, Kufe DW, Pollock RE, Weichselbaum RR, Holland JF, Frei E (szerk.). Bladder Cancer. Cancer Medicine, BC Decker Inc. 2000

11.

Helpap B, Schmitz-Drager BJ, Hamilton PW, Muzzonigro G, Galosi AB, Kurth KH, Lubaroff D, Waters DJ, Droller MJ. (2003) Molecular pathology of noninvasive urothelial carcinomas. Virchows Arch, 442 (4): 309-16.

12.

Sauter G, Algaba F, Amin MB, Non-invasive urothelial neoplasias: WHO Classification of non-invasive papillary urothelial tumors. In: Eble JN, Sauter G, Epstein JL, Sesterhenn I, eds. World Health Organization Classification of Tumors. Pathology and Genetics Tumours of the Urinary System and Male Genital Organs. Lyon, France: IARCC Press; 2004: 110.

83

Szarvas Tibor


13.

Varga A. (1996) A húgyhólyagdaganatok és kezelésük modern szemlélete. Háziorvos Továbbképző Szemle, 1: 235-237.

14.

Helpap B, Schmitz-Drager BJ, Hamilton PW, Muzzonigro G, Galosi AB, Kurth KH, Lubaroff D, Waters DJ, Droller MJ. (2003) Molecular pathology of noninvasive urothelial carcinomas. Virchows Arch, 442 (4): 309-16.

15.

Wallmeroth A, Wagner U, Moch H, Gasser TC, Sauter G, Mihatsch MJ. (1999) Patterns of metastasis in muscle-invasive bladder cancer (pT2-4): An autopsy study on 367 patients, Urol Int, 62 (2): 69-75.

16.

Lotan Y, Gupta A, Shariat SF, Palapattu GS, Vazina A, Karakiewicz PI, Bastian 89H

90H

91H

92H

93H

94H

95H

PJ, Rogers CG, Amiel G, Perotte P, Schoenberg MP, Lerner SP, Sagalowsky AI. 96H

97H

98H

9H

10H

10H

(2005) Lymphovascular invasion is independently associated with overall survival, cause-specific survival, and local and distant recurrence in patients with negative lymph nodes at radical cystectomy. J Clin Oncol, 23: 6533–6539. 17.

Lotan Y, Svatek RS, Malats N. (2008) Screening for bladder cancer: a perspective. World J Urol, 26 (1): 13-8.

18.

Lengauer C, Kinzler KW, and Vogelstein B. (1998) Genetic instabilities in human cancers. Nature, 396 (6712): 643-9.

19.

Gonzalez-Zulueta M, Ruppert JM, Tokino K, Tsai YC, Spruck CH 3rd, Miyao N, Nichols PW, Hermann GG, Horn T, Steven K, Summerhayes IC, Sidransky D, and Jones PA. (1993) Microsatellite instability in bladder cancer. Cancer Res, 53 (23): 5620-3.

20.

Knowles MA, Williamson M. (1993) Mutation of H-ras is infrequent in bladder cancer: confirmation by single-strand conformation polymorphism analysis, designed restriction fragment length polymorphisms, and direct sequencing. Cancer Res, 53 (1): 133-9.

21.

Sidransky D, Von Eschenbach A, Tsai YC, Jones P, Summerhayes I, Marshall F, Paul M, Green P, Hamilton SR, Frost P, (1991). Identification of p53 gene mutations in bladder cancers and urine samples. Science, 252 (5006): 706-9.

22.

Dalbagni G, Presti J, Reuter V, Fair WR, Cordon-Cardo C. (1993) Genetic alterations in bladder cancer. Lancet, 342 (8869): 469-71.

23.

Lindgren D, Liedberg F, Andersson A, Chebil G, Gudjonsson S, Borg A, Månsson W, Fioretos T, Höglund M. (2006) Molecular characterization of earlystage bladder carcinomas by expression profiles, FGFR3 mutation status, and loss of 9q. Oncogene, 25 (18): 2685-96. 84

Szarvas Tibor


24.

van Rhijn BW, Vis AN, van der Kwast TH, Kirkels WJ, Radvanyi F, Ooms EC, Chopin DK, Boevé ER, Jöbsis AC, Zwarthoff EC. (2003) Molecular grading of urothelial cell carcinoma with fibroblast growth factor receptor 3 and MIB-1 is superior to pathologic grade for the prediction of clinical outcome. J Clin Oncol, 21 (10): 1912-21.

25.

Knudson AG Jr. (1971) Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma. Proc Natl Acad Sci U S A, 68 (4): 820-3.

26.

Orntoft TF, Wolf H. (1998) Molecular alterations in bladder cancer. Urol Res, 26 (4): 223-33.

27.

Richter J, Beffa L, Wagner U, Schraml P, Gasser TC, Moch H, Mihatsch MJ, Sauter G. (1998) Patterns of chromosomal imbalances in advanced urinary bladder cancer detected by comparative genomic hybridization. Am J Pathol, 153 (5): 1615-21.

28.

Höglund M, Säll T, Heim S, Mitelman F, Mandahl N, Fadl-Elmula I. (2001) 102H

103H

104H

105H

106H

107H

Identification of cytogenetic subgroups and karyotypic pathways in transitional cell carcinoma. Cancer Res, 61 (22): 8241-6. 108H

29.

Yamamoto Y, Matsuyama H, Kawauchi S, Furuya T, Liu XP, Ikemoto K, Oga A, Naito K, Sasaki K. (2006) Biological characteristics in bladder cancer depend on the type of genetic instability. Clin Cancer Res, 12 (9): 2752-8.

30.

Fadl-Elmula I. Chromosomal changes in uroepithelial carcinomas. (2005) Cell Chromosome, 4:1-5

31.

Cairns P, Shaw ME, Knowles MA. (1993) Preliminary mapping of the deleted region of chromosome 9 in bladder cancer. Cancer Res, 53(6) :1230-2

32.

Ruppert JM,Tokino K,Sidransky D. (1993) Evidence for two bladder cancer suppressor loci on human chromosome 9. Cancer Res. 53 (21): 5093-5.

33.

Williamson MP, Elder PA, Shaw ME, Devlin J, Knowles MA. (1995) p16 (CDKN2) is a major deletion target at 9p21 in bladder cancer. Hum Mol Genet, 4 (9): 1569-77.

34.

Habuchi T, Devlin J, Elder PA, Knowles MA. (1995) Detailed deletion mapping of chromosome 9q in bladder cancer: evidence for two tumour suppressor loci. Oncogene, 11 (8): 1671-4.

35.

Ross JS, Cohen MB. Biomarkers for the detection of bladder cancer. (2001) Adv Anat Pathol, 8 (1): 37-45.

85

Szarvas Tibor


36.

Berger AP, Parson W, Stenzl A, Steiner H, Bartsch G, Klocker H. (2002) Microsatellite alterations in human bladder cancer: detection of tumor cells in urine sediment and tumor tissue. Eur Urol, 41 (5): 532-9.

37.

Risau W, Flamme I. (1995) Vasculogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol, 11: 7391.

38.

Auerbach R, Gilligan B, Lu LS, Wang SJ. (1997) Cell interactions in the mouse yolk sac: vasculogenesis and haematopoesis. J Cell Physiol, 173: 202-205.

39.

Jain RK, Schlenger K, Hockel M, Yuan F. (1997) Quantitative angiogenesis assays: progress and problems. Nat Med, 3:1203-8.

40.

Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. (1971) N Engl J Med, 285: 1182-6.

41.

Hansen S, Grabau DA, Sorensen FB, Bak M, Vach W, Rose C. (2000) The prognostic value of angiogenesis by Chalkley counting in a confirmatory study design on 836 breast cancer patients. Clin Cancer Res, 6: 139–146.

42.

Vermeulen PB, Gasparini G, Fox SB, Colpaert C, Marson LP, Gion M, Belien JAM, de Waal RMW, Van Marck E, Magnani E, Weidner N, Harris AL, Dirix LY. (2002) Second international consensus on the methodology and criteria of evaluation of angiogenesis quantification in solid human tumours. Eur J Cancer, 38: 1564–79.

43.

Eberhard A, Kahlert S, Goede V, Hemmerlein B, Plate KH, Augustin HG. (2000) Heterogeneity of angiogenesis and blood vessel maturation in human tumors: implications for antiangiogenic tumor therapies. Cancer Res, 60: 1388– 1393. Holash J, Maisonpierre PC, Compton D, Boland P, Alexander CR, Zagzag D,

44. 109H

Yancopoulos GD, Wiegand SJ. (1999) Vessel cooption, regression, and growth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF. Science, 284: 1994-8. 45.

Davis S, Aldrich TH, Jones PF, Acheson A, Compton DL, Jain V, Ryan TE, 10H

1H

12H

13H

14H

15H

16H

Bruno J, Radziejewski C, Maisonpierre PC, Yancopoulos GD. (1996) Isolation 17H

18H

19H

120H

of angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 receptor, by secretion-trap expression cloning. Cell, 87: 1161-9. 46.

Papapetropoulos A, Garcia-Cardena G, Dengler TJ, Maisonpierre PC, 12H

Yancopoulos GD, Sessa WC. (1999) Direct actions of angiopoietin-1 on human endothelium: evidence for network stabilization, cell survival, and interaction with other angiogenic growth factors. Lab Invest, 79: 213-23. 86

Szarvas Tibor


47.

Maisonpierre PC, Suri C, Jones PF, Bartunkova S, Wiegand SJ, Radziejewski C, 12H

Compton D, McClain J, Aldrich TH, Papadopoulos N, Daly TJ, Davis S, Sato TN, Yancopoulos GD. (1997) Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science, 277: 55-60. 48.

Papapetropoulos A, Fulton D, Mahboubi K, Kalb RG, O'Connor DS, Li F, 123H4

125H

126H

127H

128H

129H

Altieri DC, Sessa WC. (2000) Angiopoietin-1 inhibits endothelial cell apoptosis 130H

13H

via the Akt/survivin pathway. J Biol Chem, 275: 9102-5. 49.

Zagzag D, Hooper A, Friedlander DR, Chan W, Holash J, Wiegand SJ, Yancopoulos GD, Grumet M. (1999) In situ expression of angiopoietins in astrocytomas identifies angiopoietin-2 as an early marker of tumor angiogenesis. Exp Neurol, 159: 391–400.

50.

Lewis CE, De Palma M, Naldini L. (2007) Tie2-expressing monocytes and 132H

13H

134H

tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Cancer Res, 67: 8429-32. 51.

De Palma M, Murdoch C, Venneri MA, Naldini L, Lewis CE. (2007) Tie2expressing monocytes: regulation of tumor angiogenesis and therapeutic implications. Trends Immunol, 28 (12): 519-24.

52.

Condeelis J, Pollard JW. (2006) Macrophages: obligate partners for tumor cell migration, invasion, and metastasis. Cell, 124 (2): 263-6.

53.

Lin EY, Li JF, Gnatovskiy L, Deng Y, Zhu L, Grzesik DA, Qian H, Xue XN, 135H

136H

137H

138H

139H

140H

14H

142H

Pollard JW. (2006) Macrophages regulate the angiogenic switch in a mouse 143H

model of breast cancer. Cancer Res, 66 (23): 11238-46 54.

Reusch P, Barleon B, Weindel K, Martiny-Baron G, Gödde A, Siemeister G, Marmé D. (2001) Identification of a soluble form of the angiopoietin receptor TIE2 released from endothelial cells and present in human blood. Angiogenesis, 4: 123-31.

55.

Kevil CG, Payne DK, Mire E, Alexander JS. (1998) Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor-mediated permeability occurs through disorganization of endothelial junctional proteins. J Biol Chem, 273: 15099– 15103.

56.

Kohn S, Nagy JA, Dvorak HF, Dvorak AM. (1992) Pathways of macromolecular tracer transport across venules and small veins. Structural basis for the hyperpermeability of tumor blood vessels. Lab Invest, 67: 596–607.

87


57.

Szarvas Tibor

Bussolino F, Wang JM, Defilippi P, Turrini F, Sanavio F, Connolly DT, Heuvelman DM, Nelson R, Olander JV, Eppley BL, Delfino JJ, Siegel NR, Leimbgruber RM, Feder J. (1989) Tumor vascular permeability factor stimulates endothelial cell growth and angiogenesis. J Clin Invest, 84: 1470–78.

58.

Dimmeler S, Dernbach E, Zeiher AM. (2000) Phosphorylation of the endothelial nitric oxide synthase at Ser-1177 is required for VEGF-induced endothelial cell migration. FEBS Lett, 477: 258–262.

59.

Gerber HP, McMurtrey A, Kowalski J, Yan M, Keyt BA, Dixit V, Ferrara N. (1998) Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J Biol Chem, 273: 30336–43.

60.

Pepper MS, Ferrara N, Orci L, Montesano R. (1991) Vascular endothelial growth factor (VEGF) induces plasminogen activators and plasminogen activator inhibitor-1 in microvascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 181: 902–6.

61.

Unemori EN, Ferrara N, Bauer EA, (1992) Amento EP. Vascular endothelial growth factor induces interstitial collagenase expression in human endothelial cells. J Cell Physiol, 153: 557-562.

62.

Quinn TP, Peters KG, de Vries C, Ferrara N, Williams LT. (1993) Fetal liver kinase 1 is a receptor for vascular endothelial growth factor and is selectively expressed in vascular endothelium. Proc Natl Acad Sci USA, 90: 7533–37.

63.

De Vries C, Escobedo JA, Ueno H, Houck K, Ferrara N, Williams LT. (1992) The fms -like tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor. Science, 255: 989–991.

64.

Terman BI, Dougher-Vermazen M, Carrion ME, Dimitrov D, Armellino DC, Gospodarowicz D, Bohlen P. (1992) Identification of the KDR tyrosine kinase as a receptor for vascular endothelial cell growth factor. Biochem Biophys Res Commun, 187: 1579–1586.

65.

Pajusola K, Aprelikova O, Korhonen J, Kaipainen A, Pertovaara L, Alitalo R, Alitalo K. (1992) FLT4 receptor tyrosine kinase contains seven immunoglobulin -like loops and is expressed in multiple human tissues and cell lines. Cancer Res, 52: 5738–5743.

66.

Thomas KA. (1987) Fibroblast growth factors. FASEB J, 1: 434–40.

88


67.

Szarvas Tibor

Hellstrom M, Kal NM, Lindahl P, Abramsson A, Betsholtz C. (1999) Role of PDGF-B and PDGFR-ß in recruitment of vascular smooth muscle cells and pericytes during embryonic blood vessel formation in the mouse. Development, 126: 3047–55.

68.

Lampugnani MG, Resnati M, Raiteri M, Pigott R, Pisacane A, Houen G, Ruco LP, Dejana E. (1992) A novel endothelial-specific membrane protein is a marker of cell-cell contacts. J Cell Biol, 118: 1511–1522.

69.

Todaro GJ, Rose TM, Spooner CE, Shoyab M, Plowman GD. (1990) Cellular and viral ligands that interact with the EGF receptor. Semin Cancer Biol, 1: 257–263.

70.

Schreiber AB, Winkler ME, Derynck R. (1986) Transforming growth factor-a: a more potent angiogenic mediator than epidermal growth factor. Science, 232:1250–53.

71.

Orlidge A, D’Amore PA. (1987) Inhibition of capilla ry endothelial cell growth by pericytes and smooth muscle cells. J Cell Biol, 105:1455–62.

72.

Oshima M, Oshima H, Taketo MM. TGF-ß receptor type II deficiency results in defects of yolk sachematopoiesis and vasculogenesis. (1996) Dev Biol, 179: 297–302.

73.

Izawa JI, Slaton JW, Kedar D, Karashima T, Perrotte P, Czerniak B, Grossman HB, Dinney CP. (2001) Differential expression of progression-related genes in the evolution of superficial to invasive transitional cell carcinoma of the bladder. Oncol Rep, 8(1): 9-15.

74.

Sato K, Sasaki R, Ogura Y, Shimoda N, Togashi H, Terada K, Sugiyama T, Kakinuma H, Ogawa O, Kato T. (1998) Expression of vascular endothelial growth factor gene and its receptor (flt-1) gene in urinary bladder cancer. Tohoku J Exp Med, 185 (3): 173-84.

75.

Crew JP. (1999) Vascular endothelial growth factor: an important angiogenic 14H

mediator in bladder cancer. Eur Urol, 35 (1): 2-8 145H

76.

Crew JP, Fuggle S, Bicknell R, Cranston DW, de Benedetti A, Harris AL. (2000) Eukaryotic initiation factor-4E in superficial and muscle invasive bladder cancer and its correlation with vascular endothelial growth factor expression and tumour progression. Br J Cancer, 82 (1): 161-6.

89


77.

Szarvas Tibor

O'Brien T, Cranston D, Fuggle S, Bicknell R, Harris AL. (1995) Different angiogenic pathways characterize superficial and invasive bladder cancer. Cancer Res, 55(3): 510-3.

78.

Quentin T, Schlott T, Korabiowska M, Käthei N, Zöller G, Glaser F, Kunze E. (2004) Alteration of the vascular endothelial growth factor and angiopoietins-1 and -2 pathways in transitional cell carcinomas of the urinary bladder associated with tumor progression. Anticancer Res, 24 (5A): 2745-56.

79.

Campbell SC, Volpert OV, Ivanovich M, Bouck NP. (1998) Molecular mediators of angiogenesis in bladder cancer. Cancer Res, 58 (6): 1298-304.

80.

Crew JP, O’Brien TS, Harris AL. (1996) Baldder cancer angiogensis, its role in recurrence, stage progression and as a therapeutic target. Cancer Metastasis Rev, 15: 221-230.

81.

Crew JP, O’Brien T, Brandbrun M, Fuggle S, Bicknell R, Cranston D, Harris AL. (1997) Vascular endothelial growth factor is a predictor of relapse and stage progression in superficial bladder cancer. Cancer Res, 57: 5281-85.

82.

Slaton JW, Millikan R, Inoue K, Karashima T, Czerniak B, Shen Y, Yang Y, Benedickt WF, Dinney CP. (2004) Correlation of metastasis related gene expression and relapse-free survival in patinets with locally advanced bladder cancer treated with cystectomy and chemotherapy. J Urol, 171: 570-574.

83.

Krause S, Forster Y, Kraemer K, Fuessel S, Kotzsch M, Schmidt U, Wirth MP, Meye A, Schwenzer B. (2005) Vascular endothelial growth factor antisense pretreatment of bladder cancer cells significantly enhances the cytotoxicity of mitomycin C, gemcitabine and Cisplatin. J Urol, 174: 328-331.

84.

Oka N, Yamamoto Y, Takahashi M, Nishitani M, Kanayama HO, Kagawa S. 146H

(2005) Expression of angiopoietin-1 and -2, and its clinical significance in human bladder cancer. BJU Int, 95: 660-3. 85.

Tait CR, Jones PF. (2004) Angiopoietins and tumours: the angiogenic switch. J Pathol, 204 (1): 1-10.

86.

Peters KG, Coogan A, Berry D, Marks J, Iglehart JD, Kontos CD, Rao P, Sankar S, Trogan E. (1998) Expression of Tie2/Tek in breast tumour vasculature provides a new marker for evaluation of tumour angiogenesis. Br J Cancer, 77: 51-6.

87.

Takahama M, Tsutsumi M, Tsujiuchi T, Nezu K, Kushibe K, Taniguchi S, Kotake Y, Konishi Y. (1999) Enhanced expression of Tie2, its ligand 90


Szarvas Tibor

angiopoietin-1, vascular endothelial growth factor, and CD31 in human nonsmall cell lung carcinomas. Clin Cancer Res, 5 (9): 2506-10. 88.

Stratmann A, Risau W, Plate KH. (1998) Cell type-specific expression of angiopoietin-1 and angiopoietin-2 suggests a role in glioblastoma angiogenesis. Am J Pathol, 153 (5): 1459-66.

89.

Wang J, Wu K, Zhang D, Tang H, Xie H, Hong L, Pan Y, Lan M, Hu S, Ning X, Fan D. (2005) Expressions and clinical significances of angiopoietin-1, -2 and Tie2 in human gastric cancer. Biochem Biophys Res Commun, 337: 386-93.

90.

Saito M, Sato Y, Watanabe J, Kuramoto H, Kaba S, Fukuda T. (2007) Angiogenic factors in normal endometrium and endometrial adenocarcinoma. Pathol Int, 57: 140-7.

91.

Hata K, Udagawa J, Fujiwaki R, Nakayama K, Otani H, Miyazaki K. (2002) Expression of angiopoietin-1, angiopoietin-2, and Tie2 genes in normal ovary with corpus luteum and in ovarian cancer. Oncology, 62 (4): 340-8.

92.

Chen L, Yang Z, Wang G, Wang C. (2001) Expression of angiopoietin-2 gene and its receptor Tie2 in hepatocellular carcinoma. J Tongji Med Univ, 21 (3): 228-30.

93.

Zhang ZL, Liu ZS, Sun Q. (2006) Expression of angiopoietins, Tie2 and vascular endothelial growth factor in angiogenesis and progression of hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol, 12 (26): 4241-5.

94.

Zadeh G, Qian B, Okhowat A, Sabha N, Kontos CD, Guha A. (2004) Targeting the Tie2/Tek receptor in astrocytomas. Am J Pathol, 164 (2): 467-76.

95.

Moon WS, Park HS, Yu KH, Jang KY, Kang MJ, Park H, Tarnawski AS. (2006) Expression of angiopoietin 1, 2 and their common receptor Tie2 in human gastric carcinoma: implication for angiogenesis. J Korean Med Sci, 21 (2): 2728.

96.

Hata K, Nakayama K, Fujiwaki R, Katabuchi H, Okamura H, Miyazaki K. (2004) Expression of the angopoietin-1, angopoietin-2, Tie2, and vascular endothelial growth factor gene in epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol, 93 (1): 215-22.

97.

Salven P, Orpana A, Heikki JH. (1999) Leukocytes and platelets of patients with cancer contain high levels of vascular endothelial growth factor. Clin Cancer Res, 5:487–491.

91

Szarvas Tibor


98.

Yamamoto Y, Toi M, Kondo S, Matsumoto T, Suzuki H, Kitamura M, Tsuruta K, Taniguchi T, Okamoto A, Mori T, Yoshida M, Ikeda T, Tominaga T. (1996) Concentrations of vascular endothelial growth factor in the sera of normal controls and cancer patients. Clin Cancer Res, 2: 821–826.

99.

Obermair A, Tempfer C, Hefler L, Preyer O, Kaider A, Zeillinger R, Leodolter S, Kainz C. (1998) Concentration of vascular endothelial growth factor (VEGF) in the serum of patients with suspected ovarian cancer. Br J Cancer, 77: 1870– 1874.

100.

Bernardini S, Fauconnet S, Chabannes E, Henry PC, Adessi G, Bittard H. (2001) 147H

148H

149H

150H

15H

152H

Serum levels of vascular endothelial growth factor as a prognostic factor in bladder cancer. J Urol, 166 (4): 1275-9 153H

101.

Beecken WD, Engl T, Hofmann J, Jonas D, Blaheta R. (2005) Clinical relevance 154H

15H

156H

157H

158H

of serum angiogenic activity in patients with transitional cell carcinoma of the bladder. J Cell Mol Med, 9(3): 655-61. 102.

Oliveira-Ferrer L, Tilki D, Ziegeler G, Hauschild J, Loges S, Irmak S, Kilic E, Huland H, Friedrich M, Ergün S. (2004) Dual role of carcinoembryonic antigenrelated cell adhesion molecule 1 in angiogenesis and invasion of human urinary bladder cancer. Cancer Res, 64 (24): 8932-8.

103.

Caine GJ, Blann AD, Stonelake PS, Ryan P, Lip GY. (2003) Plasma angiopoietin-1, angiopoietin-2 and Tie-2 in breast and prostate cancer: a comparison with VEGF and Flt-1. Eur J Clin Invest, 33 (10): 883-90.

104.

Niedźwiecki S, Stepień T, Kopeć K, Kuzdak K, Komorowski J, Krupiński R, Stepień H. (2006) Angiopoietin 1 (Ang-1), angiopoietin 2 (Ang-2) and Tie-2 (a receptor tyrosine kinase) concentrations in peripheral blood of patients with thyroid cancers. Cytokine, 36 (5-6): 291-5.

105.

Schliemann C, Bieker R, Thoennissen N, Gerss J, Liersch R, Kessler T, Büchner T, Berdel WE, Mesters RM. (2007) Circulating angiopoietin-2 is a strong prognostic factor in acute myeloid leukemia. Leukemia, 21 (9): 1901-6

106.

Zhou YZ, Fang XQ, Li H, Diao YT, Yang YF, Zhao DL, Wu K, Li HQ. (2007) Role of serum angiopoietin-2 level in screening for esophageal squamous cell cancer and its precursors. Chin Med J, 120 (14): 1216-9.

107.

Park JH, Park KJ, Kim YS, Sheen SS, Lee KS, Lee HN, Oh YJ, Hwang SC. (2007) Serum angiopoietin-2 as a clinical marker for lung cancer. Chest, 132 (1): 200-6. 92

Szarvas Tibor


108.

Caine GJ, Ryan P, Lip GY, Blann AD. (2007) Significant decrease in angiopoietin-1 and angiopoietin-2 after radical prostatectomy in prostate cancer patients. Cancer Lett, 251 (2): 296-301.

109.

Findley CM, Cudmore MJ, Ahmed A, Kontos CD. (2007) VEGF induces Tie2 159H

160H

16H

162H

shedding via a phosphoinositide 3-kinase/Akt dependent pathway to modulate Tie2 signaling. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 27: 2619-26. 163H

110.

Harris AL, Reusch P, Barleon B, Hang C, Dobbs N, Marme D. (2001) Soluble Tie2 and Flt1 extracellular domains in serum of patients with renal cancer and response to antiangiogenic therapy. Clin Cancer Res, 7 (7): 1992-7. Jain RK. (2005) Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in

111. 164H

antiangiogenic therapy. Science, 307 (5706): 58-62. Review. 112.

Hurwitz H, Fehrenbacher L, Novotny W, Cartwright T, Hainsworth J, Heim W, 165H

16H

167H

168H

169H

170H

Berlin J, Baron A, Griffing S, Holmgren E, Ferrara N, Fyfe G, Rogers B, Ross 17H

172H

173H

174H

175H

176H

17H

178H

R, Kabbinavar F. (2004) Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and 179H

leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med, ;350 (23): 2335-42 113.

Ma J, Pulfer S, Li S, Chu J, Reed K, Gallo JM. (2001) Pharmacodynamicmediated reduction of temozolomide tumor concentrations by the angiogenesis inhibitor TNP-470. Cancer Res, 61 (14): 5491-8.

114.

Murata R, Nishimura Y, Hiraoka M. (1997) An antiangiogenic agent (TNP-470) inhibited reoxygenation during fractionated radiotherapy of murine mammary carcinoma. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 37 (5): 1107-13.

115.

Fenton BM, Paoni SF, Ding I. (2004) Effect of VEGF receptor-2 antibody on vascular function and oxygenation in spontaneous and transplanted tumors. Radiother Oncol. 2004 Aug;72(2):221-30.

116.

Nelson DA, Tan TT, Rabson AB, Anderson D, Degenhardt K, White E. (2004) Hypoxia and defective apoptosis drive genomic instability and tumorigenesis. Genes Dev, 18 (17): 2095-107.

117.

Eble JN, Epstein JI, Sesterhenn I. World Health Organization classification of tumors. Pathology and genetics of tumors of the urinary system and male genital organs. Lyon, IARCC Press 2004; 89-158.

118.

Brownstein MJ, Carpten JD, Smith JR. (1996) Modulation of non-templated nucleotide addition by Taq DNA polymerase: primer modifications that facilitate genotyping. Biotechniques, 20 (6): 1004-10

93


119.

Szarvas Tibor

Ohl F, Jung M, Radonic A, Sachs M, Loening SA, Jung K. (2006) Identification 180H

and validation of suitable endogenous reference genes for gene expression studies of human bladder cancer. J Urol, 175: 1915-20. 120.

Mandel P, Metais P. (1948) Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l’homme. CR Acad.Sci.Paris, 142: 241-243.

121.

Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, Yaros MJ. (1977) Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res, 37 (3): 646-50.

122.

Stroun M, Anker P, Maurice P, Lyautey J, Lederrey C, Beljanski M. (1989) Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients. Oncology, 46 (5): 318-22.

123.

Goessl C, Heicappell R, Munker R, Anker P, Stroun M, Krause H, Muller M, 18H

Miller K. (1998) Microsatellite analysis of plasma DNA from patients with clear cell renal carcinoma. Cancer Res, 58 (20): 4728-32. 124.

Nawroz H, Koch W, Anker P, Stroun M, Sidransky D. (1996) Microsatellite 182H

alterations in serum DNA of head and neck cancer patients. Nat Med, 2 (9): 1035-7. 125.

Swarup V, Rajeswari MR. (2007) Circulating (cell-free) nucleic acids--a 183H

184H

promising, non-invasive tool for early detection of several human diseases. FEBS Lett, ;581 (5): 795-9. 126.

Gormally E, Caboux E, Vineis P, Hainaut P. (2007) Circulating free DNA in plasma or serum as biomarker of carcinogenesis: practical aspects and biological significance. Mutat Res, 635 (2-3): 105-17.

127.

Anker P, Mulcahy H, Chen XQ, Stroun M. (1999) Detection of circulating tumor DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients. Cancer Metastasis Rev, 18: 65-73.

128.

Zancan M, Franceschini R, Mimmo C, Vianello M, Di Tonno F, Mazzariol C, 185H

Malossini G, Gion M. (2005) Free DNA in urine: a new marker for bladder cancer? Preliminary data. Int J Biol Markers, 20 (2): 134-6. 129.

Chang HW, Tsui KH, Shen LC, Huang HW, Wang SN, Chang PL. (2007) Urinary cell-free DNA as a potential tumor marker for bladder cancer. Int J Biol Markers, 22 (4): 287-94.

130.

Ellinger J, Bastian PJ, Ellinger N, Kahl P, Perabo FG, Büttner R, Müller SC, Ruecker A. (2008) Apoptotic DNA fragments in serum of patients with muscle invasive bladder cancer: A prognostic entity. Cancer Lett, 264 (2): 274-80. 94

Szarvas Tibor


131.

Halling KC, King W, Sokolova IA, Karnes RJ, Meyer RG, Powell EL, Sebo TJ, 186H

Cheville JC, Clayton AC, Krajnik KL, Ebert TA, Nelson RE, Burkhardt HM, Ramakumar S, Stewart CS, Pankratz VS, Lieber MM, Blute ML, Zincke H, Seelig SA, Jenkins RB, O'Kane DJ. (2002) A comparison of BTA stat, hemoglobin dipstick, telomerase and Vysis UroVysion assays for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Urol, 167 (5): 2001-6. 132.

Tilki D, Irmak S, Oliveira-Ferrer L, Hauschild J, Miethe K, Atakaya H, 187H

18H

189H

190H

19H

192H

Hammerer P, Friedrich MG, Schuch G, Galalae R, Stief CG, Kilic E, Huland H, 193H

194H

195H

196H

197H

198H

19H

Ergun S. (2006) CEA-related cell adhesion molecule-1 is involved in angiogenic 20H

switch in prostate cancer. Oncogene, 25 (36): 4965-74. 133.

Semenza G. (2002) Signal transduction to hypoxia-inducible factor 1. Biochem 201H

Pharmacol, 64 (5-6): 993-8. 134.

Inoue K, Slaton JW, Karashima T, Yoshikawa C, Shuin T, Sweeney P, Millikan R, Dinney CP. (2000) The prognostic value of angiogenesis factor expression for predicting recurrence and metastasis of bladder cancer after neoadjuvant chemotherapy and radical cystectomy. Clin Cancer Res, 6 (12): 4866-73.

135.

Crew JP, O'Brien T, Bicknell R, Fuggle S, Cranston D, Harris AL. (1999) Urinary vascular endothelial growth factor and its correlation with bladder cancer recurrence rates. J Urol, 161 (3): 799-804.

136.

Dales JP, Garcia S, Bonnier P, Duffaud F, Meunier-Carpentier S, Andrac-Meyer L, Lavaut MN, Allasia C, Charpin C. (2003) Tie2/Tek expression in breast carcinoma: correlations of immunohistochemical assays and long-term followup in a series of 909 patients. Int J Oncol, 22: 391-7. Hawighorst T, Skobe M, Streit M, Hong YK, Velasco P, Brown LF, Riccardi L,

137. 20H

203H

204H

205H

206H

207H

208H

Lange-Asschenfeldt B, Detmar M. (2002) Activation of the tie2 receptor by 209H

210H

angiopoietin-1 enhances tumor vessel maturation and impairs squamous cell carcinoma growth. Am J Pathol, 160: 1381-92. 21H

138.

Ergun S, Tilki D, Oliveira-Ferrer L, Schuch G, Kilic N. (2006) Significance of 21H

213H

214H

215H

216H

vascular stabilization for tumor growth and metastasis. Cancer Lett. 238: 180-7. 217H

139.

Tilki D, Kilic N, Sevinc S, Zywietz F, Stief CG, Ergun S. (2007) Zone-specific remodeling of tumor blood vessels affects tumor growth. Cancer 110: 2347-62.

95


Szarvas Tibor

XI. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE XI.1. Az értekezés témájában megjelent nemzetközi közlemények 1.

Szarvas T, Kovalszky I, Bedi K, Szendrői A, Majoros A, Riesz P, Füle T, László V, Kiss A, Romics I. (2007) Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol Rep, 18 (2): 405-9.

2.

IF: 1.597

Riesz P, Lotz G, Páska C, Szendrôi A, Majoros A, Németh Z, Törzsök P, Szarvas T, Kovalszky I, Schaff Z, Romics I, Kiss A. (2007) Detection of bladder cancer from the urine using fluorescence in situ hybridization technique. Pathol Oncol Res, 13 (3): 187-94.

3.

IF: 1.272

Szarvas T, Jäger T, Tötsch M, vom Dorp F, Kempkensteffen C, Kovalszky I, Romics I, Ergün S, Rübben H. Angiogenetic switch of angiopoietins-Tie2system and its prognostic value in bladder cancer. Clin Canc Res, (in press)

4.

IF: 6.250

Szarvas T, Jäger T, Droste F, Becker M, Kovalszky I, Romics I, Ergün S, Rübben H. Serum levels of angiogenic factors and their prognostic relevance in bladder cancer. Pathol Oncol Res, 2008 Sep 20. DOI 10.1007/s12253-008-9107-z

IF: 1.272

XI.2. Az értekezés témájában megjelent magyar nyelvű közlemények 1.

Szarvas T, Kovalszky I, Majoros A, Szendrői A, Romics I. (2002) A hólyagtumorok szűrésének és nyomonkövetésének lehetősége multiplex mikroszatellita vizsgálattal. Magyar Urológia 14 (4): 321-25.

96

Szarvas Tibor


XI.3. Egyéb témában megjelent közlemények 1.

Füle T, Máthé M, Suba Z, Csapó Z, Szarvas T, Tátrai P, Paku S, Kovalszky I. (2006) The presence of human papillomavirus 16 in neural structures and vascular endothelial cells. Virology, 348 (2): 289-96.

2.

IF: 3.525

Jäger T, Szarvas T, vom Dorp F, Börgermann C, Schenck M, Schmid KW, Rübben H. (2007) Use of silicon chip technology to detect protein-based tumor markers in bladder cancer. Urologe A, 46 (9): 1152-6.

3.

IF: 0.414

Schenck M, Szarvas T, Ruebben H, Jaeger T. (2008) The revival of "uroscopy": an easy way to evaluate the anastomotic region after radical retropubic prostatectomy. Urologe A, 47 (3): 331-6.

IF: 0.414

XI.4. Idézhető absztraktok 1.

Firneisz G, Dudas J, Saile B, Szarvas T, Lengyel G, Tulassay Z, Felter J, 218H

219H

20H

21H

2H

23H

24H

Kovalszky I, Ramadori G. (2005) TGFB1 and decorin induced extracellular 25H

26H

27H

matrix protein production of hepatic stellate cells and myofibroblasts. Gastroenterology, 128 (4): 669 2.

IF: 12.386

Firneisz G.; Dudás J., Szarvas T., Sári E., Ramadori G., Kovalszky I. (2005) Different 28H

transforming growth factor-B1 induces extracellular matrix production in rat hepatic stellate cells versus hepatic myofibroblasts, but decorin inhibits both. Z. Gastroenterol, 43 (5): 26

3.

IF: 0.800

Firneisz G, Dudas J, Szarvas T, Lengyel G, Tulassay Z, Feher J, Ramadori G, Kovalszky I. (2005) Different response of hepatic stellate cells and hepatic myofibroblasta to TGFB1 exposure. GUT, 54 (Supp VII)

4.

IF: 7.692

Firneisz G. Dudás J, Szarvas T, Sári E, Ramadori G, Kovalszky I. Different 29H

transforming growth factor-B1 induces extracellular matrix production in rat hepatic stellate cells versus hepatic myofibroblasts, but decorin inhibits both. Z. Gastroenterol, 44 (5)

IF: 0.800

97

Szarvas Tibor


XI.5. Előadások, poszterek 1.

Szarvas T, Majoros A, Szendrői A, Romics I, Bedi K, Kovalszky I. Mikroszatellita-allélvesztés (LOH) vizsgálat a hólyagrákok szűrésére (előadás) Magyar Onkológusok Társaságának Kongresszusa, Szeged, 2003. november

2.

Adleff V, Szarvas T, Budai B, Gazdag A, Hitre E, Kovács T, Kovalszky I, Kralovánszky

J.

Heterozigótaság-vesztés

jelentősége

a

timidilát-szintáz

génlókusz környezetében (18q11.32) kolorektális daganatos szövetekben. (előadás) Magyar Onkológusok Társaságának Kongresszusa, Szeged, 2003. november. Magyar Onkológia 2003, 47:235

3.

Szarvas T, Bedi K, Majoros A, Szendrői A, Romics I, Kovalszky I.: Mikroszatellita vizsgálat alkalmazási lehetőségei tumorok kimutatásában. (előadás) Szekvenáló és Fragment Analízis Szeminárium (Applied Biosystems), Budapest, 2004. február

4.

Adleff V, Szarvas T, Budai B, Gazdag A, Hitre E, Kovács T, Kovalszky I, Kralovánszky

J.

Mikroszatellita

markerek

vizsgálatának

módszertani

tanulmánya makrodisszektált tumorszövetek DNS mintáinak TS genotípus meghatározásában.

(előadás)

Magyar

Kemoterápiás

Társaság

XVIII.

Kongresszusa, Budapest, 2004. január

5.

Szarvas T, Bedi K, Majoros A, Szendrői A, Romics I, Kovalszky I. Microsatellite analysis – a non-invasive molecular detection of bladder cancer (előadás) International DNA days, Semmelweis University, Budapest, 2004. február

6.

Garami M, Hauser P, Szarvas T, Kovalszky I, Fekete G. New Approach in the Diagnosis and Treatment of Paediatric brain Tumours. (előadás) International DNA days, Semmelweis University, Budapest, 2004. február

98

Szarvas Tibor


7.

Adleff V, Szarvas T, Budai B., Gazdag A, Hitre E, Kovács T, Kovalszky I, Kralovánszky J. Role of allelic imbalance at the thymidylate synthase gene locus in CRC patients (előadás) European Association of Cancer Research, Innsbruck Austria, 2004. július 3-6.

8.

Szarvas T, Bedi K, Majoros A, Szendrői A, Kovalszky I, Romics I, Mikroszatellita-vizsgálat húgyhólyagdaganatok kimutatására (előadás) – I. díj, 63. Patológus Kongresszus, Siófok , 2004. szeptember 23-26.

9.

László V, Szarvas T, Füle T, Szendrői A, Romics I, Kovalszky I, High risk HPV

altípusok

előfordulása

hólyagtumorban

(előadás)

63.

Patológus

Kongresszus, Siófok, 2004. szeptember 23-26.

10.

Szarvas T, Bedi K, Majoros A, Szendrői A, Kovalszky I, Romics I, Microsatellite analysis - a non-invasive molecular detection of bladder cancer (poszter) 4th Central European Meeting of European Association of Urology, Bucharest, Romania, 2004. október 21-22. Firneisz G, Dudas J, Saile B, Szarvas T, Lengyel G, Tulassay Z, Felter J,

11. 230H

231H

23H

23H

234H

235H

236H

Kovalszky I, Ramadori G. TGFB1 and decorin induced extracellular matrix 237H

238H

239H

protein production of hepatic stellate cells and myofibroblasts. (poszter) Digestive Disease Week and the 106th Annual Meeting of the American Gastroenterological Association, Chicago, 2005. május 14-19.

12.

Firneisz G, Dudás J, Saile B, Szarvas T, Lengyel G, Tulassay Z, Fehér J, Kovalszky I, Ramadori G. TGFB1 and decorin induced extracellular matrix 240H

protein production of hepatic stellate cells and myofibroblasts (poszter) Magyar Gasztroenterológiai Társaság 47. Nagygyűlése, Balatonaliga, 2005. június 7-11.

99

Szarvas Tibor


13.

Kovalszky I, Bedi K, Szarvas T, DNS alapú tumor marker (microsatellita) vizsgálatok szerepe a daganatok korai kimutatásában és monitorizálásában (előadás) 64. Pathologus Kongresszus Budapest, 2005. szeptember 23-25.

14.

Kovalszky I., Szarvas T., Romics I. DNS alapú tumormarker (mikrosatellita) vizsgálatok hólyagtumorok korai kimutatásában és monitorozásában (előadás) 64. Pathologus Kongresszus Budapest, 2005. szeptember 23-25.

15.

Firneisz G, Dudas J, Szarvas T, Lengyel G, Tulassay Zs, Feher J, Ramadori G, Kovalszky I, TGFB1 and decorin induced extracellular matrix protein production of hepatic stellate cells and myofibroblasts (poszter) GastroConference (Falk Symposium) Berlin, 2005. október 3-4.

16.

Firneisz G, Dudas J, Szarvas T, Lengyel G, Tulassay Z, Feher J, Ramadori G, Kovalszky I. Different response of hepatic stellate cells and hepatic myofibroblasta

to

TGFB1

exposure

(poszter)

13th

United

European

Gastroenterology Week, Copenhagen, Denmark, 2005. október 15-19.

17.

Firneisz G. Dudás J, SzarvasT, Sári E, Ramadori G, Kovalszky I. Different 241H

transforming growth factor-B1 induces extracellular matrix production in rat hepatic stellate cells versus hepatic myofibroblasts, but decorin inhibits both Magyar Gasztroenterológiai Társaság 47. Nagygyűlése, Balatonaliga, 2005. június 7-11. 18.

Firneisz G.; Dudás J., Szarvas T., Lengyel G., Fehér J., Ramadori G., Kovalszky I. Different transforming growth factor-B1 signaling in rat hepatic stellate cells compared to heptic myofibroblasts (poszter) 14th United European Gastroenterology Week, Berlin, Germany, 2006. október 21-25.

100

Szarvas Tibor


XII. KÖZLEMÉNYEK IDÉZETTSÉGE A közlemények idézettsége a Web of Science adatbázis alapján. Szarvas T, Kovalszky I, Bedi K, Szendrői A, Majoros A, Riesz P, Füle T, László V, Kiss A, Romics I. (2007) Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol Rep, 18 (2): 405-9. Idézetek száma: 3

Független idézet: 3

1. Goebell PJ, Groshen SL, Schmitz-Drager BJ. (2008) Guidelines for development of 24H

diagnostic markers in bladder cancer World J Urol, 26 (1): 5-11. 2. Crawford JM. (2008) The origins of bladder cancer. Lab Invest, 88 (7): 686-93. 3. Shirodkar SP, Lokeshwar VB. (2008) Bladder tumor markers: from hematuria to 243H

24H

molecular diagnostics - where do we stand? Expert Rev Anticancer Ther, 8 (7): 245H

1111-23

Riesz P, Lotz G, Páska C, Szendrôi A, Majoros A, Németh Z, Törzsök P, Szarvas T, Kovalszky I, Schaff Z, Romics I, Kiss A. (2007) Detection of bladder cancer from the urine using fluorescence in situ hybridization technique. Pathol Oncol Res, 13 (3): 18794. Idézetek száma: 1


1. Shirodkar SP, Lokeshwar VB. (2008) Bladder tumor markers: from hematuria to 246H

247H

molecular diagnostics - where do we stand? Expert Rev Anticancer Ther, 8 (7): 248H

1111-23

101

Szarvas Tibor


Füle T, Máthé M, Suba Z, Csapó Z, Szarvas T, Tátrai P, Paku S, Kovalszky I. (2006) The presence of human papillomavirus 16 in neural structures and vascular endothelial cells. Virology, 348 (2): 289-96. Idézetek száma: 1


1. Borzacchiello G, Russo V, Spoleto C, Roperto S, Balcos L, Rizzo C, Venuti A, 249H

250H

251H

25H

253H

254H

25H

Roperto F. (2007) Bovine papillomavirus type-2 DNA and expression of E5 and E7 256H

oncoproteins in vascular tumours of the urinary bladder in cattle. Cancer Lett, 250 257H

(1): 82-91.

102

Szarvas Tibor


XIII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Először is szeretném megköszönni Kovalszky Ilona egyetemi tanárnak, szakmai és emberi támogatását, amelyre mindig számíthattam. Köszönettel tartozom Kopper László és Matolcsy András egyetemi tanároknak, amiért munkám elvégzésének feltételeit biztosították és Jeney András

egyetemi tanárnak,

folyamatos támogatásáért. Köszönöm Romics Imre egyetemi tanárnak, az Urológiai Klinika igazgatójának, hogy a szakmai előrejutásomat önzetlenül és messzemenően támogatta. Köszönöm továbbá az Urológiai Klinika munkatársai közül Dr. Szendrői Attilának, Dr. Riesz Péternek és Dr. Majoros Attilának, hogy a vizsgálatainkhoz használt mintákat kitartóan gyűjtötték és, hogy klinikai kérdésekben mindig bizalommal fordulhattam hozzájuk. Köszönet Dr. Füle Tibornak és Dr. Bödör Csabának a szakmailag is értékes baráti beszélgetésekért, illetve Csabának a disszertáció aprólékos javításáért. Külön köszönet Bedi Katának aki sok munkával járult hozzá a disszertációban leírt eredmények megszületéséhez. Ezen kívül köszönet illeti a Molekuláris Diagnosztika laboratórium minden dolgozóját, azért a kellemes légkörért, amellyel nap, mint nap körülvettek. Hálás köszönettel tartozom a II. Patológiai Intézet munkatársainak; Dr. Kiss Andrásnak és Dr. Lotz Gábornak a FISH vizsgálatok elvégzéséért, a GenoID Kft. munkatársainak, főként Dr. Jeney Csabának és Dr. Szőke Melindának, hogy a mikroszatellita allélvesztés-vizsgálatot laboratóriumukba fogadták. Az értekezésben bemutatott eredmények egy része az Essen-Duisburgi Egyetem Urológiai

Klinikájának

kutatólaboratóriumában

született.

Köszönet

a

klinika

igazgatójának Herbert Rübben egytemi tanárnak, hogy figyelemmel kísérte munkámat, továbbá a laboratórium munkatársainak Jacqueline Wittschiernek és Stephanie Abrahamnak értékes segítségükért. Végül, de nem utolsó sorban szeretnék köszönetet mondani szüleimnek, akik türelmes, kitartó támogatásukkal segítették munkámat.

103

Húgyhólyagrákok molekuláris diagnosztikai és prognosztikai módszerei

Recommend Documents