FARMASAINS Vol 2 No. 4, Oktober 2014
AMPLIFIKASI GEN PENYANDI PROTEIN NON-STRUKTURAL 1 (NS1) VIRUS DENGUE SEROTIPE 4 STRAIN INDONESIA DARI SERUM PASIEN DENGUE HAEMORRAGHIC FEVER (DHF) IDS 96/10 Full-Length Amplification of Non-Structural 1 (NS1) Encoding Gene of Dengue Virus Serotype 4 Strain Indonesia Full-Length Amplification from Dengue Haemorraghic Fever (DHF) Patient Sera IDS 96/10 Wahyu Hidayati1*, Andi Yasmon2, Mirawati Tjahjani Sudiro2, Beti Ernawati Dewi2 Fakultas Farmasi dan Sains UHAMKA. Jakarta Departemen Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia 1
2
Naskah diterima tanggal 2 Oktober 2014
ABSTRACT Dengue infection in Indonesia has a high rate of case infection and mortality. A good health management is important to save patient lives. There are several methods included in health management of dengue, but the most important is development of dengue vaccine and early diagnostic kit. These reseach aim was to obtain a full-length of NS1 encoding gene of Dengue virus serotype 4 strain Indonesia from DHF patient sera IDS96/10. We extracted the viral RNA from sera and constructed a complementary DNA of DENV-4 by reverse-complement PCR (RT-PCR). Full-length of DENV-4 strain Indonesia were amplified from cDNA using of specific NS1 encoding gene primers. Amplification product, then analyzed their DNA sequence and followed by bioinformatics analysis to find the similarities of its sequence with other sequences in GeneBank. We got that our amplification product was Indonesia strain after compare to several DENV-4 from Asia. Keywords : Dengue, DHF, NS1, amplification, reverse-transcription PCR. ABSTRAK Angka kejadian infeksi dengue dan tingkat kematian pasien dengue yang tinggi di Indonesia menyebabkan pentingnya suatu manajemen kesehatan yang baik untuk pasien dengue. Pengembangan vaksin dan pendeteksian dini dengue penting untuk menyelamatkan pasien dengue. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan gen penyandi protein NS1 virus dengue serotipe 4 (DENV-4) strain Indonesia secara utuh yang berasal dari serum pasien DHF IDS96/10. Metode yang dilakukan adalah dengan mengisolasi RNA virus dengue dari serum pasien IDS96/10, dilanjutkan dengan konstruksi cDNA virus dengan teknik reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) menggunakan random primer. Molekul cDNA digunakan sebagai cetakan untuk mendapatkan gen penyandi protein NS1 melalui proses amplifikasi PCR dengan primer spesifik. Hasil amplifikasi dibaca urutan basanya melalui proses sekuensing dan kemudian dipastikan kebenarannya melalui program blastn pada GenBank. Gen penyandi protein NS1 DENV-4 strain Indonesia berhasil diperoleh secara utuh pada penelitian ini. Analsis sekuens memperlihatkan bahwa gen tersebut adalah isolat Indonesia. Hasil amplifikasi dapat digunakan pada penelitian pengembangan vaksin berbasis protein subunit maupun pengembangan kit diagnostik dengue.
PENDAHULUAN Infeksi dengue menyebabkan penyakit dengue dengan beragam gejala yaitu ringan (demam dengue/DD) hingga berat (demam berdarah dengue) bahkan dapat menyebabkan kematian. Penyakit ini menjadi penyakit endemis di berbagai negara baik tropis maupun subtropis. Tingginya angka kematian pada negara-negara tesebut akibat infeksi dengue menyebabkan penyakit akibat infeksi dengue menjadi salah satu penyakit utama yang menjadi perhatian
Organisasi Kesehatan Dunia atau World Health Organization/WHO (WHO, 2009). Penyakit Dengue mulai terdeteksi di Indonesia pada tahun 1973 di kota Surabaya (Soedarmo, 1993). Hingga saat ini penyakit dengue telah tersebar secara merata di seluruh propinsi di Indonesia dengan tingkat kejadian (Infection Rate/ IR) dan kematian (Case fatality Rate/CFR) yang beragam (Setiati, et al., 2006). Penyakit Dengue disebabkan oleh virus dengue yang merupakan virus RNA dengan ukuran genom 11 kpb. Genom tersebut menyandikan sepuluh protein baik protein struktural maupun non-struktural (NS). Protein
Alamat korespondensi: Jl. Delima II/IV Perumnas Klender, Jakarta Timur, 13460 email :
[email protected]
186
Amplifikasi Gen Penyandi Protein ..... (Wahyu Hidayati, dkk)
struktural yang dikodekan meliputi : protein capsid (C), membran (prM), dan envelope (E). Sedangkan protein non-struktral (NS) adalah NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, dan NS5. Protein nonstruktural 1 (NS1) merupakan suatu glikoprotein berukuran 42- 50 kDa dengan asam amino berjumlah 353-354 aa. Protein NS1 berperan sebagai pengarah pada proses pematangan virion atau morfogenesis virus. Selain itu, protein NS1 yang terekspresi pada permukaan membran sel akan menyebabkan sel yang terinfeksi menjadi target sel imun untuk proses sitolisis (Beasley dan Barrett, 2008; Chang, 1997). Virus dengue memiliki empat serotipe, yaitu serotipe 1 (DENV-1), 2 (DENV-2), 3 (DENV-3), dan 4 (DENV-4). Keempat serotipe ini telah menjadi penyebab penyakit Dengue di Indonesia. Infeksi virus dengue menyebabkan tingkat keparahan infeksi yang beragam dari gejala ringan (Demam dengue/DD) hingga parah (demam dengue dengan manifestasi perdarahan/DHF; demam dengue disertai syok/ DSS). Tingkat keparahan infeksi disebabkan oleh perbedaan serotipe saat infeksi primer dengan infeksi sekunder (Farrar, 2008). Di Jakarta, antara tahun 2009 hingga 2010 kejadian infeksi Dengue dengan gejala parah sebanyak 5% disebabkan oleh virus Dengue serotipe 4 (Dewi dan Sudiro, 2010). Tingginya angka kematian akibat infeksi dengue menyebabkan perlu adanya manajemen kesehatan yang baik untuk menangani pasien. Ada dua hal yang dapat dijadikan sebagai manajemen kesehatan dengue, yaitu pendeteksian dini dan pemberian vaksin dengue. Pendeteksian dengue dapat dilakukan dengan beberapa metode, salah satunya adalah pendeteksian antigen maupun pendeteksian antibodi pada serum pasien (Shu et al., 2004; Tripathi et al, 2011). Vaksin dengue yang dapat diberikan dapat berupa protein subunit maupun vaksin DNA (Coller et al., 2011). Protein NS1 dapat dimanfaatkan pada pengembangan kedua metode manajemen kesehatan dengue. Penelitian ini merupakan penelitian awal dari suatu proyek pengembangan pendeteksian dini dengue dan vaksin dengue subunit. Penelitian ini bertujuan mendapatkan gen penyandi protein NS1 virus dengue serotipe 4 strain Indonesia yang berasal dari serum pasien terinfeksi virus DEN-4. METODOLOGI Alat Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah mesin Thermal Cycler (Applied Biosystem), laminar air flow BSL2 (ESCO), minisentrifuge, perlengkapan elektroforesis (MUPID), Gel Documentation (BIO-RAD), microwave, mikropipet, tips beragam ukuran (0,1-1000 µl), dan peralatan gelas yang biasa digunakan di laboratorium. Bahan Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah QIAamp Viral RNA Kit (QIAGEN), enzim SSRT (Invitrogen), RNAse inhibitor (Invitrogen), enzim Platinum 187
Taq Polymerase High Fidelity (Invitrogen), random primer, primer F-NS1-D4, primer R-NS1-D4, Isolasi RNA virus dengue serotipe 4 strain Indonesia dari serum pasien IDS96/10 Ekstraksi RNA menggunakan QIAamp Viral RNA Kit (QIAGEN) dilakukan sesuai dengan prosedur yang tersedia pada kit. Sebanyak 560 µl buffer AVL dan 140 µl serum dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml kemudian dihomogenkan selama 15 detik dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Sebanyak 560 µl ethanol jenuh ditambahkan ke dalam tabung tersebut dan segera homogenkan selama 15 detik dilanjutkan dengan pemindahan supernatan ke dalam QIAamp Mini column (yang telah terpasang pada tabung microsentrifuge kosong) dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan sebesar 8000 rpm selama 1 menit. QIAamp Mini column dipindahkan ke tabung microsentrifuge kosong baru dan dilak ukan pengulangan prosedur ini hingga seluruh supernatan pada tahap sebelumnya habis. Setelah itu ditambahkan 500 µl buffer AW1 dan disentrifugasi dengan kecepatan sebesar 8000 rpm selama 1 menit. Sebanyak 500 µl buffer AW2 ditambahkan ke dalam QIAamp Mini column setelah dipindahkan ke tabung microsentrifuge kosong dan disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit. QIAamp Mini column dipindahkan ke tabung microsentrifuge kosong kemudian ditambahkan 60 µl buffer AVE dan disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Konstruksi cDNA dari RNA virus Dengue pasien IDS96/10 Pembuatan cDNA dilakukan dengan teknik transkripsi balik (reverse transcription) menggunakan RNA hasil ekstraksi pada tahap sebelumnya. Proses pembuatan cDNA dilakukan dengan 2 reaksi, yaitu reaksi 1 yang terdiri atas campuran random primer, dNTPs, RNAse inhibitor, dan sampel RNA, sedangkan reaksi 2 terdiri atas 1x Buffer FS, DTT, RNAse inhibitor, enzim SSRT (Invitrogen). Proses RT-PCR dilakukan dengan suhu 65 oC selama 5 menit, 25 oC selama 5 menit, 50 oC selama 1 jam, dan reaksi dihentikan pada suhu 70 oC selama 15 detik. Reaksi 2 dimasukkan sebelum memasuki suhu 50 o C dengan cara menghentikan sebentar proses RT-PCR (pause). Setelah proses pembuatan cDNA selesai, cDNA yang diperoleh dianalisa hasilnya dengan melakukan amplifikasi menggunakan primer LanD1 (forward primer) dan LanD2 (reverse primer) dengan siklus sebagai berikut : pre-denaturasi 94 oC selama 5 menit, denaturasi 94 oC selama 25 menit, annealing 58 oC selama 30 menit, polimerisasi 72 oC selama 2 menit 30 detik, dan polimerasasi lanjutan 72 oC selama 7 menit. Amplifikasi gen penyandi protein NS1 virus dengue serotipe 4 strain Indonesia dari cDNA IDS96/10 Campuran reaksi yang digunakan untuk PCR gradien adalah: 10x High Fidelity PCR buffer, 10 mM dNTP mix, 50 mM MgSO4, 10 µM primer Forward, 10
FARMASAINS Vol 2 No. 4, Oktober 2014
µM primer Reverse, ddH2O, enzim Platinum Taq Polymerase High Fidelity (Invitrogen), dan cetakan cDNA IDS 96/10. Amplifikasi gen NS1 dilakukan menggunakan mesin Thermal Cycler (Applied Biosystem). Adapun tahapan-tahapan PCR gradien yang dilakukan yaitu denaturasi awal pada suhu 95 oC selama 5 menit, denaturasi pada 95 oC selama 1 menit, annealing pada suhu 58oC selama 1 menit, polimerisasi pada suhu 72 oC selama 1 menit, dan polimerisasi final pada 72 oC selama 7 menit. Proses denaturasi hingga polimerisasi dilakukan sebanyak 35 siklus. Amplikon DNA hasil PCR Gradien dan PCR yang dihasilkan dianalisis menggunakan elektroforesis jel agarosa 0.8% dilanjutkan dengan visualisasi menggunakan Etidium Bromida (EtBr). Analisis urutan basa gen NS1 hasil proses amplifikasi Fragmen hasil amplifikasi dibaca urutan basa nuk leotidanya melalui proses sekuensing menggunakan primer D4-2412s sebagai primer forward dan D4-3551c primer reverse yang telah didesain menggunakan program PRIMER dengan didasarkan pada informasi urutan basa nukleotida virus dengue serotipe 4 pada GenBank dengan accession number GQ398256. Proses sekuensing dilakukan di Lembaga Eijkmann, Jakarta dan kemudian dianalisis menggunakan perangkat lunak BIOEDIT dan GENEIOUS R8. HASIL DAN PEMBAHASAN Infeksi dengue telah tersebar merata di seluruh propinsi di Indonesia dengan persentase kasus dan angka kematian yang beragam pada setiap propinsi. Pengembangan vaksin dan pendeteksian dini dengue spesifik terhadap keempat serotipe dengue penting dilakukan sebagai upaya penyelamatan pasien dengue. Hal ini disebabkan keempat serotipe dengue menjadi penyebab penyakit dengue di Indonesia (Muhadir, 2013). Pada pengembangan vaksin dengue, ada beberapa metode pembuatan vaksin dengue yang telah dikembangk an diantaranya adalah vaksin
menggunakan virus dengue yang dilemahkan, vaksin chimeric, vaksin dengan vektor virus, vaksin DNA dan antigen protein rekombinan (Coller et. al., 2011). Sedangkan pendeteksian infeksi dengue dapat dilakukan dengan isolasi virus, deteksi asam nukleat virus, deteksi antibodi atau antigen, bahkan kombinasi teknik pendeteksian (Shu et al., 2004; Tripathi et al., 2011) . Pendeteksian antigen dengan metode PCR mulai banyak diterapkan di beberapa rumah sakit di Indonesia. Akan tetapi hal ini terkendala pada mahalnya biaya pemeriksaan. Salah satu alternatif deteksi yang cepat dan murah adalah pendeteksian antigen NS1 dengue pada serum pasien (Hidayati dkk, 2014). Penelitian ini merupakan tahap awal dari serangkaian proses pengembangan vaksin dan pendeteksian dini dengue dengan memanfaatakn teknik rekayasa genetika. Di antara sepuluh protein yang diproduksi oleh virus dengue, protein NS1 menjadi target penelitian kami. Hal ini didasarkan pada peran protein ini pada perkembangan virus dan keberadaan protein ini dalam tubuh pasien. Protein NS1 berperan sebagai pengarah pada proses pematangan virion atau morfogenesis virus. Dalam tubuh pasien, protein NS1 ditemukan dalam dua bentuk, yaitu berasosiasi dengan membran sel dan disekresikan keluar sel. Protein NS1 yang tersekresi dalam jumlah besar hanya ditemukan pada sel mamalia, tidak pada sel nyamuk (Beasley dan Barrett, 2008; Chang, 1997). Gen NS1 DENV4 strain Indonesia berhasil diperoleh dalam bentuk utuh sebesar 1.162 pb melalui proses PCR pada suhu annealing 58 oC dengan menggunakan cDNA IDS96/10 sebagai cetakan (template) (gambar 2). Proses PCR merupakan proses replikasi DNA yang dilakukan secara in vitro. Sebagaimana proses replikasi pada sel, proses PCR terdiri atas tiga tahapan, yaitu pemisahan dua untai ganda DNA, penempelan primer, dan pemanjangan untai DNA baru (Watson et al., 2008; Sambrook dan Russel, 2001; Stansfield et al., 1996; Davis et al., 1994).
Gambar 1. Hasil amplifikasic DNAdengan primer LanD1 dan LanD2.Lajur1.DNA penandastandar 100 pb.Lajur 2. Produk PCR cDNA IDS96/10 188
Amplifikasi Gen Penyandi Protein ..... (Wahyu Hidayati, dkk)
Gambar 2. Hasil amplifikasi gen NS1 DENV4 dari cDNA IDS96/10. Lajur 1: Lambda/Hind III DNA ladder. Lajur 2: Gen NS1
Cetakan yang digunakan pada penelitian ini adalah cDNA yang berasal dari proses reversetranscription PCR. Molekul cDNA tidak dapat divisualisasi langsung menggunak an metode elektroforesis jel agarosa karena berupa untai tunggal yang berasal dari RNA (Davis etal., 1994). Keberhasilan pembuatan cDNA DENV4 dari RNA IDS96/10 diketahui dengan melakukan PCR terhadap cDNA DENV4 IDS 96/10 menggunakan primer LanD1 dan LanD2 (gambar 1). Setelah dilakukan analisa sekuens gen NS1 DENV4 hasil penelitian ini dengan membandingkannya
terhadap gen NS1 DENV4 strain Malaysia (JF262780.1), Singapura (JX024758.1), dan Thailand (AY618993.1) diketahui adanya perbedaaan basa antara sekuens gen NS1 DENV4 yang diperoleh dengan ketiga strain tersebut (gambar 3). Nilai perbedaan yang diperoleh dari analisa sekuens terhadap DENV4 strain Malaysia, Thailand, dan Singapura secara berurutan adalah 14%, 4%, dan 3%. Perbedaan tersebut menunjukkan bahwa gen NS1 DENV4 yang diperoleh dari serum IDS96/10 berasal dari virus asli Indonesia. Kemiripan (similarity) sekuens antar satu organisme dengan organisme lain dapat diketahui dengan melakukan analisa sekuens melalui proses
#Alignment of 2 sequences: DENV-4 Malaysia, NS1 DENV4 IDS96/10 Score = 3528.284, Identities = 989/1149 (86%), Positives = 989/1149 (86%), Gaps = 18/1149 (1%) #Alignment of 2 sequences: DENV-4 Thailand, NS1 DENV4 IDS96/10 Score = 5186.032, Identities = 1104/1141 (96%), Positives = 1104/1141 (96%), Gaps = 0/1141 (0%) #Alignment of 2 sequences: DENV-4 Singapura, NS1 DENV4IDS96/10 Score = 5256.163, Identities = 1109/1141 (97%), Positives = 1109/1141 (97%), Gaps = 0/1141 (0%)
Gambar 3. Hasil analisa perbandingan gen NS1 DENV-4 IDS 96/10 dengan gen NS1 DENV-4 strain Malaysia, Thailand, Singapura
189
FARMASAINS Vol 2 No. 4, Oktober 2014
allignment. Kemiripan yang muncul dapat dijadikan sebagai dasar hubungan kekerabatan di antara keduanya, hal ini dapat dilihat dari semakin kecilnya persentase gaps yang muncul dan semakin tingginya persentase nilai positives pada hasil allignment (Atwood dan Parry-Smith, 1999). Gen NS1 DENV-4 strain Indonesia yang diperoleh pada penelitian ini dapat digunakan sebagai komponen pengembangan vaksin dan pendeteksian dini infeksi dengue di Indonesia. KESIMPULAN Gen penyandi protein NS1 DENV-4 strain Indonesia berhasil diperoleh secara utuh dangan ukuran sebesar 1.162 pb melalui proses amplifikasi dan hasil homologi sekuens menunjukkan gen NS1 DENV4 yang diperoleh dari serum IDS96/10 berasal dari virus asli Indonesia. DAFTAR PUSTAKA Beasley DWC, Barrett ADT. The Infectious Agent, dalam Halstead SB (Ed). Dengue Tropical Medicine: Science and Practice (Vol. 5). 2008. London: Imperial College Press. 29-73 Chang GJ. Molecular Biology of Dengue Viruses, dalam Gubler DJ, Kuno G (Ed).Dengue and Dengue Haemoraghic Hever. 1997. Cambridge: CAB international. Coller BAG, Clement DE, Bett AJ, Sagar SL, ter Meulen JH. The development of recombinant subunit envelope-based vaccines to protect against dengue virus induced disease. Vaccine. 2011; 29(42): 7267-7275. Davis L, Kuehl M, Battey J. Basic Methods in Molecular Biology (2nd Ed). 1994. Amerika: Appleton & Lange. P 135 Dewi BE, Sudiro MT. Epidemiologi dengue di Jakarta pada tahun 2010. Unpublished. Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia. Farrar J. Clinical Features of Dengue, dalam Halstead SB (Ed). Dengue. 2008. London: Imperial College Press.
Gupta P, Khare V, Tripathi S, Nag VL, Kumar R, Khan MY, Dhole TKNC. 2010. Assessment of World Health Organizataion Definition of Dengue Hemorraghic Fever in North India. Jornal of Infectious Diseases Development Countries. 2010; 4(3):150-5. Guzman MG, Halstead SB, Artsob H, Buchy P, Farrar J, Gubler DJ, et al. Dengue: A Continuing Global Threat. Nature Review Microbiology. 2010: s7s16. Hidayati W, Yasmon A, Sudiro MT, Dewi BE. Construction And Identification Of Yeast Shuttle Vectors Containing Non Structural 1 (NS1) Dengue Serotype 4 Strain Indonesia Gene. International Symposium on Drug and Vaccine Development in Post MDGs Era. Yogyakarta, 20-21 Juni 2014. Muhadir A. Epidemiology of dengue in Indonesia. Dengue Vaccine Meeting. Brazil, 9-11 April 2013. Sambrook J, Russel DW. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Vol. 3). 2001. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Setiati TE, Wagenaar JFP, de Krui MD, Mairuhu ATA, van Gorp ECM, Soemantri A. Changing Epidemiology Of Dengue Haemoraghic Fever In Indonesia. Dengue Bulletin. 2006; 30: 1-14. Shu PY, Huang JH. Current Advances in Dengue Diagnosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2004; 11(4):642-50 Soedarmo SP. The Epidemiology, Control, And Prevention Of Dengue Haemoraghic Fever In Indonesia. Journal of Tropical Medicine. 1993; 35(4): 161-72. Stansfield W D, Jaime S Colome, Raul J Cano. Schaum’s Outlines Molecular and Cell Biology. 1996. New York: McGraw-Hill Tripathi NK, Shrivastava A, Dash PK, Jana AM. Detection Of Dengue Virus. Methods of Molecular Biology. 2011; 665:51-64. Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M, Losick R. Molecular Biologi of The Gene, 6th ed. 2008. Cold Spring Harbor Laboratory Press. World Health Organization. Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and controlNew edition. 2009. Jenewa: WHO Press.
190
