Faktory určující diverzitu arbuskulárních mykorhizních hub v lučních ekosystémech Zuzana Sýkorová (Oddělení mykorhizních symbióz BÚAVČR)

Faktory určující diverzitu arbuskulárních mykorhizních hub v lučních ekosystémech Zuzana Sýkorová (Oddělení mykorhizních symbióz BÚAVČR)

Struktura přednášky 1. Arbuskulární mykorhizní houby – jak a kde je najít a jejich význam pro rostliny 2. Metody studia diverzity AM hub: mikroskopicky nebo molekulárně 3. Faktory určující diverzitu AM hub v lučních ekosystémech


Struktury AM hub v půdě a kořenech

0,2 mm

Arbuskuly

Vesikuly

0,02 mm 0,05 mm

Spóra

1. AMH – jak a kde je najít a jejich funkce

Funkce arbuskulární mykorhizní symbiózy Rostlina

AM houba Cukry

Minerální živiny, ochrana před patogeny, suchem, … 1. AMH – jak a kde je najít a jejich funkce

200µm

Společné myceliální sítě – důležité pro fungování lučních ekosystémů • Jedna AM houba může kolonizovat více jedinců (téhož i různých druhů rostlin) • Jedna rostlina může být kolonizována více AM houbami → propojení rostlin mycéliem • Pohyb živin v rámci této společné myceliální sítě • Výhody pro uchycování semenáčků Obr. převzat z van der Heijden a Horton, 2009.


Diverzita AMH – důležitá pro udržování diverzity a produktivity lučních ekosystémů Výsledky nádobového pokusu: s rostoucí diverzitou AMH → ↑ diverzita rostlinného společenstva → ↑ růst a příjem živin 1. AMH – jak a kde je najít a jejich funkce

Obr. převzat z van der Heijden et al., 1998.

Vztah AMH a rostliny – po celé škále mezi mutualismem až k parasitismu • závisí na dostupnosti živin v půdě • závisí na druhu rostliny i houby (rostliny více či méně závislé na mykorhize; různé druhy i izoláty hub) • závisí na ontogenetickém stadiu dané rostliny (semenáček, dospělá rostlina, odumírající rostlina) → důležité vzít v úvahu při aplikacích mykorhizních inokul např. v zemědělství nebo zahradnictvíMykotrofní rostlina

jetel – rozdíl mezi mykorhizní a nemykorhizní variantou pokusu v substrátu chudém na živiny (Püschel et al. 2007)



Jak vyhodnotit diverzitu AMH na určitém stanovišti? AMH jsou obligátní symbionti - rostou pouze společně s jejich hostitelskými Záchytné kultury rostlinami ve skleníku – inertní substrát, „univerzální“ hostitelské rostliny jako je např. kukuřice

Půda, kořeny

Zkoumaná lokalita – např. druhově bohatá louka

Pravidelná kontrola pod binokulární lupou a mikroskopem

Čistá kultura AM houby

2. Metody studia diverzity AMH

Dnes již zastaralý systém Glomeromycot (http://invam.caf.wvu.edu/)

Tvorba spór: Klíčení spór: - spóry jednotlivé nebo ve sporokarpech nebo - klíční štítek klastrech - stěnou spóry - nálevkovité připojení hyfy nebo zaškrcená hyfa - místem připojení hyfy - pučením špičky hyfy nebo s pomocí sporogenních → rozlišení do čeledi, rodu váčků


Mikroskopické preparáty spór Klíčové znaky: - velikost spóry - počet a vlastnosti stěn spór → Rozlišení do druhu

http://invam.caf.wvu.edu/

Diagnostické znaky spór: - často sporné - záleží na ontogenetickém stadiu spóry → Problémy při určování http://invam.caf.wvu.edu/


Molekulárně biologické metody Jak určit druhovou diverzitu AM hub aktivně zapojených do symbiózy (v kořenech) na určitém stanovišti v přírodě? Jak určit druh AM houby, kde je to podle spór obtížné, nebo který nesporuluje? - PCR se specifickými primery pro jadernou rDNA (ITS, LSU, SSU) AM hub - klonování, DGGE, RFLP, sekvenování - t-RFLP


Genetika AM hub

• Klonální (asexuální rozmnožování) – spóry, fragmenty hyf • Coenotytické (nepřehrádkované) mycélium, mnohojaderné spóry (až několik tisíc jader v 1 spóře)

Glomus intraradices, mycélium se spórami. (Foto Radka Sudová)

Gigaspora decipiens spóra, obarvená DAPI. (Foto Dirk Redecker)


Variabilita sekvencí některých genů (např. rDNA) AM hub: - v rámci celého druhu - v rámci jednoho izolátu - v rámci jedné spóry AM houby

Variabilita sekvencí jaderné rDNA 1 izolátu Glomus intraradices = variabilita v rámci celého druhu (Jansa et al. 2002)!!


Sekvenční typ (fylotyp) - konzistentně separovaná monofyletická skupina - podobnost sekvencí (98%)

ARCH-2

→ Fylotyp nahrazuje pojem druhu v molekulárních studiích

2. Metody studia diverzity AMHjaderné rDNA NJ analýza

Popis nových druhů: kombinace mikroskopických a molekulárních metod: Acaulospora alpina

Oehl et al. (2006). Fylogenetický strom rodu Acaulospora spp. získaný pomocí maximum likelihood analýzy sekvencí 5.8S rDNA a ITS2.


Struktura přednášky 1. Arbuskulární mykorhizní houby – jak a kde je najít a jejich význam pro rostliny 2. Metody studia diverzity AM hub: mikroskopicky nebo molekulárně 3. Faktory určující diverzitu AM hub v lučních ekosystémech – druhy a diverzita hostitelských rostlin, sukcese

Diverzita AM hub v kořenech rostlin v různých ekosystémech na Zemi: Öpik et al. 2006: studie srovnávající výsledky 16 publikací zaměřených na molekulární analýzy AMH v kořenech celkem 52 druhů rostlin • diverzita AMH: tropické pralesy (18 druhů AMH/1 druh rostliny) ˃ luční ekosystémy (8) ˃ temperátní lesy (6) ˃ obdělávaná pole a narušené ekosystémy (5) • některé AMH jsou rozšířeny globálně (např. Glomus intraradices), kolem 50% druhů AMH bylo nalezeno pouze na jednom stanovišti • složení společenstev AMH závisí na typu ekosystému

3. Faktory určující diverzitu AMH

Komplikace při studiu diverzity AMH: - různé výzkumné týmy používají primery pro různé úseky DNA → nelze výsledky porovnat mezi sebou - nejednotnost ve vymezení druhu/fylotypu (variabilita sekvencí není stejná u všech druhů) - mnoho nových molekulárních fylotypů, kde není znám příslušný morfologický druh

Dosud popsáno necelých 200 druhů AM hub (http://www.lrzmuenchen.de/~schuessler/amphylo/)

– kolonizují téměř všechny vyšší rostliny → nízká hostitelská specifita?


2 druhově bohaté vysokohorské louky v Engadinu (Švýcarsko) - 1820 a 2010 m n.m., cca 600 m daleko od sebe - AM houby charakterizovány v kořenech Gentiana verna, Gentiana acaulis a 8 taxonů jejich doprovodných rostlin (např. Trifolium spp.) → hostitelská specificita/preference mezi AMH a rostlinami?

Gentiana verna


Gentiana acaulis

Vyhodnocování diverzity AM hub v kořenech Kořeny

Nested PCR s SSU rDNA a ITS, klonování

Fylogenetický DNA sekvence strom - definice fylotypů

DNA extrakce

Restrikční analýzy 3. Faktory určující diverzitu AMH

• detekováno 17 fylotypů: 10x GLOM A; 2x ARCH; 3x GLOM B; 2x ACAU • 77% fylotypů nemá morfologicky popsaný protějšek • 2 fylotypy zcela nové

Glomeromycota – NJ analýza 18S regionu jaderné rDNA


14

Počet detekovaných fylotypů

„Sampling effort“ křivky 12

10

G. verna G. verna G.G. acaulis acaulis Trifolium spp. Trifolium spp. Surrounding plants Okolní rostliny

8

6

4

2

0 0

2

4

6

8

10

12

14

Number of analyzed samples

Počet analyzovaných vzorků kořenů

• pro G. verna, G. acaulis a Trifolium spp. křivky dosahují saturace • společná křivka pro ostatní druhy rostlin strmě stoupá


Různé druhy hostitelských rostlin měly v kořenech různé druhy AM hub • Vliv hostitelské rostliny P=0.002 • GLOM A-1 společný pro všechny 3 rostlinné taxony

Kanonická korespondenční analýza (CCA)


Shrnutí výsledků a závěry • Identita hostitelské rostliny měla signifikantní vliv na složení AM houbového společenstva v kořenech, zatímco stanoviště vliv nemělo • Společenstva AM hub G. verna, G. acaulis a Trifolium spp. se od sebe signifikantně lišila

Lokální hostitelské preference rostlin pro určité druhy AM hub (na relativně malém území s podobnými klimatickými podmínkami) Sýkorová et al. (2007) Applied and Environmental Microbiology 73 (17): 5426


Jak ovlivní způsob studia diverzity AMH výsledek? Ekologie a sukcese AMH 4 druhy rostlin: - z terénu – druhově bohatá vápenitá louka nedaleko Basileje (490 m n.m.) - z kompartmentových systémů ve skleníku - záchytné rostliny vysazené do terénu

Bromus erectus

Origanum vulgare

Medicago sativa


Inula salicina

Kompartmentové systémy • střední kompartment: půda z terénu a rostlina B. erectus přesazená z terénu jako inokulum • boční kompartmenty: sterilní půda, semenáčky cílových rostlin • nylonová síť mezi středním a bočními • 2 sklizně kompartmenty


Záchytné rostliny vysazené do terénu • nylonová síť ve dnu plastové lahve • rostliny předpěstovány 2 měsíce ve skleníku, pak přesazeny do terénu • 2 sklizně: po 3 a 10 měsících


• Detekováno 16 fylotypů: 9x GLOM A; 1x ARCH; 6x GLOM B • 69% fylotypů nemá morfologicky popsaný protějšek • 5 fylotypů zcela nových • pouze 4 fylotypy společné s loukami v Alpách

Glomeromycota – NJ analýza části 18S rDNA

„Sampling effort“ křivky 14

Počet detekovaných fylotypů

12 10

Kompartmenty Compartments Field Terén Bait plants rostliny Záchytné

8 6 4 2 0 0

5

10

15

20

25

30

35

Number of analyzed root samples

Počet analyzovaných vzorků kořenů

• pro kompartmentové systémy křivka dosáhla saturace • křivky vzorků z terénu a záchytných rostlin nejsou saturovány


Společenstva AM hub se signifikantně lišila mezi rostlinami z terénu, kompartmentů a záchytných kultur • GLOM A-1 byl jediný fylotyp běžný ve všech třech typech vzorků

Kanonická korespondenční analýza (CCA)

AM houby mohou mít různé ekologické strategie Morphologically described species

Glomus intraradices Glomus mosseae Glomus constrictum Glomus badium Sister to G. luteum Sister to G. etunicatum Archaeospora trappei

Sequence type

GLOM A-1 GLOM A-3 GLOM A-7b GLOM A-29 GLOM A-31 GLOM A-30 GLOM A-15 GLOM A-16 GLOM A-17 GLOM B-1 GLOM B-2 GLOM B-4 GLOM B-5 GLOM B-6 GLOM B-7 ARCH-2

Relative abundance in the compartment systems (% of samples) st 1 2nd harvest harvest 85 100 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 27 0 0 50 9 10 0 35 73 15 45 0 0 0 0 0 0

Relative abundance in the bait plants (% of samples) 1st harvest 30 30 0 0 0 0 10 20 20 10 40 30 0 0 0 10

2nd harvest 100 20 10 0 10 0 0 20 10 10 40 70 40 0 0 0

Relative abundance in the field (% of samples)

95 0 0 5 0 11 0 26 37 11 5 11 11 5 5 11

generalista r stratég

K stratég K stratég r stratég r stratég ? r stratég ? r stratég ?

r stratégové - houby typické také pro obdělávaná pole a záchytné kultury (pravidelná disturbance)


Shrnutí výsledků • Složení společenstva AM hub v kořenech bylo signifikantně ovlivněno způsobem kultivace • Různé druhy AM hub mohou mít různé ekologické strategie (K stratégové, r stratégové, generalisté) → AM houby s různými ekologickými strategiemi mají různé role při sukcesi společenstva AM hub • V nepřirozených systémech jako jsou skleníkové kultury anebo krátkodobé experimenty je nutné zohlednit sukcesi AM hub • Kultivace záchytných rostlin může být dobrou metodou, jak získat AM houby přítomné v terénu a vyhodnotit vliv různých ekologických faktorů na společenstvo AM hub přímo v terénu Sýkorová et al. (2007) Mycorrhiza 18 (1): 1


Společenstvo AM hub v kořenech může být ovlivněno: • Geografickou polohou – různé podmínky prostředí a rostlinná společenstva na různých stanovištích vedou k odlišným společenstvům AM hub • Hostitelskými preferencemi – v rámci malého území se stejnými podmínkami prostředí • Dynamikou společenstva AM hub – především v nepřirozených prostředích 3. Faktory určující diverzitu AMH

Nové molekulární markery v systematice a populační biologii AM hub Izolát AM houby= linie AM houby pěstovaná v květináči nebo ROC a získaná z 1 nebo více spór z určitého stanoviště v terénu

1) Mikrosatelity - specifické primery, pouze pro G. intraradices, testovány na spórách z ROCs nebo květináčů, na kořenech z květináčů (čisté kultury G. intraradices)

2) AFLP – pouze pro DNA z ROCs 3) Mitochondriální LSU rDNA - DNA z: ROCs, spór z květináčů, kořenů z terénu

Tyto markery jsou homogenní v rámci izolátu = umí izoláty odlišit → využití při studiu ekologie a populační biologie AM hub → využití při komerčních aplikacích AM hub - např. pro důkaz efektivity vnášení určitých izolátů do terénu

mtLSU rDNA (Raab et al. 2005, Börstler et al. 2008) - homogenita v rámci izolátu - funguje i pro vzorky z terénu - odliší izoláty na základě délky PCR produktu, sekvence nebo RFLP profilu - testování 16 izolátů odhalilo 12 haplotypů

(z Börstler et al. 2008)

mtLSU rDNA (Raab et al. 2005, Börstler et al. 2008) DNA z: in vitro kultur, spór z květináčů, kořenů z terénu

(z Raab et al. 2005)

• design primerů pro nested PCR specifických pro G. intraradices → PCR produkty o délce 1070 až 3280 bp, variabilita díky přítomnosti nebo absenci 3 intronů a díky rozdílům v exonech

Konfokální mikroskopie spóry AM houby Glomus diaphanum: Zelené tečky: jádra obarvená SytoGreen, Červené tečky: mitochondrie obarvené MitoTracker, (+ autofluorescence stěn spóry v zelené a červené). (Převzato z Lang and Hijri, 2009. Scale bar 10um)

Genetika AM hub •Vysoká variabilita jaderné rDNA v rámci jedné spóry:

Heterokaryotická hypotéza - geneticky různá jádra uvnitř jedné spóry (Hijri and Sanders 2005)

Homokaryotická hypotéza -vnitrojaderný polymorfismus rDNA (Pawlowska and Taylor 2004)

•Udržování genetické variability – anastomózy hyf téhož izolátu?

Kontakty hyf AM hub: (a) Perfektní fúze – umožňuje proudění cytoplazmy; (b) Žádná interakce; (c) Předfúzová inkompatibilita – zatažení cytoplasmy; (d) Nekompatibilní fůze – zatažení cytoplasmy, tvorba septa. Barvení pro sukcinát dehydrogenázu (a) a Trypanovou modří (b–d). Převzato z Croll et al. (2008).

Fůze hyf geneticky stejných i různých izolátů AM hub → výměna cytoplasmy → výměna genetické informace, rekombinace? (Croll et al. 2009)

Root organ cultures AM hub AM houby jsou obligátní symbionti = rostou pouze společně se svými hostitelskými rostlinami

In-vitro kultivace některých druhů AM hub (např. Glomus intraradices) na transformovaných kořenech mrkve, čekanky, apod. Root organ cultures (ROCs) umožňují získat čistou biomasu AM spór a hyf → vývoj nových molekulárních markerů

Převzato z Parniske (2008, modif. z Schuessler et al. 2002)

Rozvoj molekulárních markerů → neustálé popisy nových taxonů, rušení starých

Posun v porozumění genetice AM hub?

Homokaryotická (a) a heterokaryotická (b) hypotéza (z Young 2008)

Metapopulační koncept AM hub: - jádro je individuem pohybujícícm se myceliální sítí - dochází k anastomózám, a tak i k výměně jader - mitochondriální DNA - uniformní v rámci téhož izolátu (z Young 2009)

Faktory určující diverzitu arbuskulárních mykorhizních hub v lučních ekosystémech Zuzana Sýkorová (Oddělení mykorhizních symbióz BÚAVČR)

Recommend Documents