FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2009 - 2010
EPIGENETISCHE VERANDERINGEN IN KANKER: NIEUWE TARGETS VOOR THERAPIE
Gertjan VAN STEENBERGHE
Promotor: dr. Ir. J. Hoebeeck
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUNDE
FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2009 - 2010
EPIGENETISCHE VERANDERINGEN IN KANKER: NIEUWE TARGETS VOOR THERAPIE
Gertjan VAN STEENBERGHE
Promotor: dr. Ir. J. Hoebeeck
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUNDE
“De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”
Datum
(handtekening student (en))
(handtekening promotor)
(Naam student)
(Naam promotor)
INHOUDSTAFEL
Inhoud I. ABSTRACT.................................................................................................................... 1 II. INLEIDING ..................................................................................................................... 2 III. METHODOLOGIE ...................................................................................................... 5 IV. RESULTATEN............................................................................................................ 6 1. Epigenetica.................................................................................................................... 6 1.1 Covalente mechanismen. .................................................................................... 6 1.1.1 DNA-methylatie: ........................................................................................... 6 1.1.2 Histonmodificaties: ....................................................................................... 8 1.2 Niet-covalente mechanismen. ........................................................................... 11 1.2.1 Nucleosoomhermodellering: ....................................................................... 11 2. Epigenetica, het milieu en ziekte-etiologie. .................................................................. 13 3. Concrete rol van epigenetica in specifieke ziektebeelden. ........................................... 16 4. Kankerepigenetica. ...................................................................................................... 18 4.1 Het epigenetisch kankermodel versus het genetisch kankermodel. ........................ 18 4.2 Epigenetische uitschakeling van genen (“gensilencing”). ....................................... 22 4.3 De kankerstamcelhypothese. ................................................................................. 24 5. MicroRNA’s en epigenetica: een geval apart. .............................................................. 28 6. De chemische regulatie van epigenetische modificaties: mogelijkheden tot ontwikkeling van nieuwe therapieën voor kanker. ................................................................................ 35 6.1 Algemeen. .............................................................................................................. 35 6.2 Covalente mechanismen. ....................................................................................... 36 6.2.1 DNA-methylatie: .............................................................................................. 36 6.2.2 Histon deacetylatie: ......................................................................................... 38 6.2.3 Histon acetylatie: ............................................................................................. 42 6.2.4 Histon (lysine/arginine) methylatie: .................................................................. 44 6.2.5 Histon (lysine/arginine) demethylatie: .............................................................. 47 6.2.6 Histon fosforylatie: ........................................................................................... 49 6.2.7 Histon defosforylatie: ....................................................................................... 50 6.2.8 Poly (ADP-ribosyl)atie en de-poly(ADP-ribosyl)atie: ........................................ 50 6.2.9 Ubiquitinylatie en sumoylatie: .......................................................................... 51 6.3 Niet-covalente mechanismen. ................................................................................ 52 6.3.1 Nucleosoomhermodellering: ............................................................................ 52 V. DISCUSSIE ................................................................................................................. 54 VI. REFERENTIELIJST ................................................................................................. 56
I. ABSTRACT Inleiding: Kanker is een kwaadaardige aandoening die wordt gekenmerkt door een ongecontroleerde celgroei, waarbij lokaal tumoren ontstaan, die in geval van maligniteit omliggende weefsels kunnen infiltreren en zich kunnen verspreiden over ons gehele lichaam. Met de ontdekking en de intensieve studie van epigenetische verschijnselen werd de afgelopen jaren een nieuwe deur geopend voor het vervaardigen van nieuwe therapeutische technieken die als aanvulling (of naar de toekomst toe misschien
zelfs
als
vervanging)
kunnen
dienen
bij
de
tegenwoordige
conventionele
behandelingsmodaliteiten. Methodologie: Uitgaande van twee reviews met algemene informatie betreffende epigenetica, werden na raadpleging van hun referentielijsten extra artikels bekomen. Verder werd ook gebruik gemaakt van de database PubMed en (weliswaar in mindere mate) van Web of Science. Promotor J. Hoebeeck stelde eveneens verschillende artikels ter beschikking. Resultaten: Na een uiteenzetting over algemeen geldende epigenetische principes werd dieper ingegaan op de functionele rol die epigenetische wijzigingen spelen in het kankerproces. Epigenetische modificaties dragen samen met genetische wijzigingen bij tot carcinogenese, waarbij zij een fundamentele rol spelen in kankerinitiatie en kankerprogressie. Het epigenetisch kankermodel stelt dat een genmutatie is vereist voor kankerinitiatie, maar dat de kans dat een kanker zich verder ontwikkelt afhangt van de aanwezigheid van epigenetische wijzingen. Doorgedreven analyse van de modificatiepatronen blijkt een veelbelovend middel om in de toekomst kankers (eventueel vroegtijdig) te diagnosticeren en eveneens hun prognose in te schatten. Gedetailleerde beschrijvingen van
de
niet-covalente
(nucleosoomhermodellering)
en
covalente
(DNA-methylatie
en
histonmodificatie) mechanismen van epigenetische veranderingen laten duidelijk zien dat er heel wat potentieel zit vervat in de ontwikkeling van epigenetische farmaca voor de strijd tegen kanker. Deze farmaca werken immers veel gerichter en specifieker in op hun doelwit, waardoor er de impact ervan op het menselijk lichaam ook heel wat minder intens is dan bij cytostatica en bestralingen. Discussie: Het farmaco-epigenomisch veld is vooral in de laatste jaren fel verbeterd en uitgebreid. Oude medicijnen werden herontdekt voor nieuwe toepassingen en nieuwe moleculen gericht op epigenetische enzymen werden ontwikkeld. Met de ontwikkeling van dergelijk nieuwe epigenetische medicijnen die steeds specifieker worden, blijkt epigenetische therapie steeds meer en meer een effectieve en waardevolle aanvulling te zijn op chemotherapie en chemopreventie. Het is echter van belang op te merken dat we ons nog maar in een heel vroeg stadium bevinden. Met uitzondering van enkele geneesmiddelen reeds goedgekeurd voor gebruik door de Amerikaanse Food and Drug Administration, bevinden overige epigenetische farmaca zich nog in het pre-klinisch bewijsniveau. Het immense potentieel ervan kan en mag echter niet miskend worden.
1
II. INLEIDING Op 14 april 2003 werd het persbericht de wereld ingestuurd dat het “Menselijk Genoomproject” (HGP; Human Genome Project) zijn doelstelling bereikt had: 99% van het menselijk genoom was, met een nauwkeurigheid van 99,99%, berekend. De oorspronkelijke doelstelling van het project bestond erin op een zo nauwkeurig mogelijke manier circa alle 3 miljard basenparen in het menselijk genoom te bepalen, alsook alle genen in deze sequenties te identificeren. Lang werd gedacht dat met de kennis van de volledige sequencing van het humaan genoom de moleculaire gebeurtenissen geassocieerd aan het ontstaan van ziektes makkelijk zouden worden ontrafeld. Ondertussen is echter duidelijk dat de etiologie van vele menselijke pathologieën (waaronder kanker) niet volledig kan worden begrepen door simpelweg op zoek te gaan naar allerlei genetische varianten in de menselijke DNA-sequentie.
Eén enkel humaan genoom codeert ongeveer 30 000 genen, waarmee het moet in staat zijn om gen expressie patronen te programmeren voor meer dan 200 verschillende celtypes en voor verschillende ontwikkelingsstadia ervan. Na jarenlang wetenschappelijk onderzoek kwam en onderzoekers tot het inzicht dat er nog een bijkomende laag informatie vervat zit in de genoomsequentie. Meer bepaald, een laag informatie die verder rijkt dan de kennis vervat in de vier basen adenine, thymine, guanine en cytosine (de bouwstenen van het DNA). Als illustratie hiervan kunnen we iets vanzelfsprekend als het aangezicht bekijken. Huid, ogen en tanden zien er allemaal heel anders uit, maar bevatten exact dezelfde genetische informatie. Hieruit leiden we af dat deze extra laag informatie dus in staat is de genfunctie significant te wijzigen en zij blijkt dan ook noodzakelijk voor een correcte genexpressie. Deze bijkomende genetische wijzigingen worden bereikt door middel van zogenaamde epigenetische modificaties, die samen het “menselijk epigenoom” constitueren. Op het einde van de 19e eeuw kwam August Weissmann tot het inzicht dat onze genetische informatie opgeslagen ligt in de kern van een cel. Hij geloofde dat alle cellen starten met dezelfde informatie, waarna ze materiaal verliezen bij hun deling en specialisatie. Hans Spemann ging hier grotendeels mee akkoord maar beweerde dat cellen geen informatie verliezen, maar die alleen maar uitschakelen. Reeds in 1942, nog een tiental jaar voor de beschrijving van de DNA-structuur door Watson en Crick, introduceerde Conrad Waddington de termen epigenetica en “epigenetisch landschap”. (Zie figuur 1)
Hij beschouwde ontwikkeling en erfelijkheid als een wisselwerking tussen de genetische
informatie en de omgeving waarin het individu leeft. Met zijn omschrijving van epigenetica bedoelde hij het fenotype, als resultante van de interactie tussen het genotype en de omgeving. Waddingtons definitie verwijst naar wat we vandaag “ontwikkelingsbiologie” noemen.
2
Het is pas echter vanaf de jaren ’90 dat men ten volle beseft dat niet alleen onze DNA sequentie bepalend is voor onze biologische verschijning (het fenotype). Vanaf dat moment werd er intensief aandacht geschonken aan epigenetische verschijnselen en epigenetisch onderzoek.Hierbij ontstaat dan ook de moderne definitie van epigenetica zoals we die vandaag kennen: “De studie van erfelijke veranderingen in de werking van het genoom, die plaatsvinden zonder wijzigingen in de DNA reeks.” (Definitie volgens het Epigenome Network of Excellence.)
Figuur 1: Voorstelling van het “epigenetisch landschap” volgens Waddington. Deze visuele metafoor stelt de menselijke ontwikkeling voor, waarbij een cel (voorgesteld door een balletje) verschillende toegelaten paden kan volgen, met op het einde verschillende mogelijk eindtoestanden. Bron: Goldberg et al., 2007.
Epigenetische modificaties zijn erfelijk en kunnen naar dochtercellen overgebracht worden tijdens de celdelingen. Belangrijker is echter het feit dat ze de mogelijkheid geven om cellen te herprogrammeren, wat cruciaal is in de context van ontwikkeling en differentiatie. Karakteristiek voor deze epigenetische veranderingen is dat ze de chromatine structuur wijzigen zonder ook maar iets aan de DNA-sequentie zelf te veranderen.Toch stelt dit hen in staat om op een doorslaggevende manier de genexpressie te beïnvloeden. Belangrijk op te merken is ook dat deze modificaties omkeerbaar zijn, wat meteen de basis vormt van diverse therapeutische ontwikkelingen. Dit relatief jong luik in de genetica (men heeft het eerder “herontdekt”) heeft sterke implicaties inzake het begrijpen van pathologie en dan vooral op het domein van kanker en tumorigenese, waar deze epigenetische veranderingen de laatste jaren immense belangstelling hebben verkregen. Zoals vele biologische processen kunnen epigenetische wijzigingen immers ook ten prooi vallen aan foute regulatie, waardoor een waaier aan verschillende pathologieën kunnen ontstaan. Aangezien epigenetische processen mitotisch overerfbaar zijn, kunnen ze dezelfde (oorzakelijke) rol spelen als de genetische wijzingen bij de ontwikkeling van ziektes zoals bijvoorbeeld kanker.
3
Deze scriptie focust zich op het domein van de epigenetica en de implicaties die de epigenetica heeft ten aanzien van kanker. Meer bepaald: hoe zij de basisinzichten van de ontwikkeling van tumoren heeft gewijzigd, welke concrete rol zij speelt in die ontwikkeling en hoe deze epigenetische modificaties ook een totaal nieuwe deur hebben geopend voor
het vervaardigen van nieuwe
therapeutische technieken die als aanvulling (of naar de toekomst toe misschien zelfs als vervanging) kunnen dienen bij de tegenwoordige conventionele behandelingsmodaliteiten.
De basisconcepten van evolutionaire mutaties op niveau van het genoom zijn eveneens geldig voor epigenetische events. (Namelijk dat de meeste kiemlijnmutaties onbelangrijke deleties zijn en dat mutaties aanleiding kunnen geven tot uitselectie van specifiek eigenschappen die een evolutief voordeel bieden.) In vergelijking met de mutaties in somatische cellen komen epigenetische modificaties echter veel meer voor. Wijzigingen in genexpressie geïnduceerd door epigenetische aanpassingen die zorgen voor bijvoorbeeld een cellulair groeivoordeel, kunnen dan ook uitgeselecteerd worden. Dit kan leiden tot een progressieve oncontroleerbare (tumorale) groei. Kortom, als gevolg van hun mitotische overerfbaarheid kunnen epigenetische veranderingen “samenwerken” met genetische wijzingen om zo een kanker verder te laten groeien
4
III.
METHODOLOGIE
Als uitgangspunt bij de zoektocht naar literatuur werd allereerst gebruik gemaakt van twee reviewartikels die mij door dr. Ir. J. Hoebeeck ter beschikking werden gesteld (Bernstein et al., 2007; Jones en Baylin, 2007). Op basis van de referentielijsten van beide artikels werd interessante literatuur teruggevonden met betrekking tot de kernconcepten van de (kanker)epigenetica.
De meeste overige artikels werden bekomen door gebruik te maken van van de database PubMed. De eerste zoektochten waren gebaseerd op termen zoals mammal, epigenetics, epigenome. Door de hierbij gevonden artikels te limiteren tot de reviews, kwam hier een vrij mooie selectie naar voor die de geschiedenis en de functionele rol van de epigenetica bij de mens bondig illustreerden.
Door combinaties van extra termen in te geven zoals cancer epigenomics, DNA methylation, histon modification en nucleosome remodeling, microRNA and cancer in te geven, kwamen artikels naar voor die in meer detail de epigenetische processen illustreerden, waarbij ook af en toe artikels die onderdeel waren van een nog lopend onderzoek. Extra zoektermen werden ook gehaald uit de reeds gevonden artikels zelf, waardoor meer informatie kon worden gevonden over de onderwerpen cancer stem cells, epigenetics and diseases, epigenetics and the environment. Voor het bekomen van informatie omtrent de therapeutische mogelijkheden werden naast de reeds verkregen informatie uit de eerder bekomen artikels extra artikels gevonden door combinaties in te geven van volgende zoektermen: epigenetic therapies, cancer therapies, future epigenetic medication. Verder werd op PubMed ook regelmatig gebruik gemaakt van de functie “Related citations”, waarbij steeds een reeks artikels verwant aan de oorspronkelijke keuze worden getoond.
De uiteindelijke verwerking en ordening van de referenties werd voltooid met behulp van het programma “EndNote”.
Tot slot werden ook enkele websites geraadpleegd, waar algemene informatie en informatie omtrent de
ontdekkingsgeschiedenis
van
het
epigenetica
domein
kon
worden
teruggevonden:
http://epigenome.eu/ en http://www.epigeneticsnews.com/.
5
IV.
RESULTATEN
1. Epigenetica.
Epigenetische modificaties vallen te herleiden tot 3 grote categorieën: DNA-methylatie, Histonmodificatie en nucleosoomhermodellering.
1.1 Covalente mechanismen.
1.1.1 DNA-methylatie: DNA-methylatie is de enzymatische covalente additie van een methylgroep aan een cytosine. Bij zoogdieren gebeurt DNA-methylatie bijna exclusief in CpG dinucleotiden (Smith et al., 2007). CpG dinucleotiden vindt men verspreid over het genoom als afzonderlijke dinucleotide sequenties maar men vindt ze ook samengeclusterd in zogenaamde “CpG eilanden”. De meeste CpGs in het humane genoom zijn gemethyleerd (ongeveer 70-80% op het totaal van 2.8 x 107) (Goll en Bestor, 2005). Paradoxaal genoeg zijn de CpG rijke eilanden (die dikwijls geassocieerd zijn met promotorsequenties) hoofdzakelijk niet gemethyleerd (Bird, A.P., 1986). Methylatie in andere dinucleotiden dan CpG (nl. CG en CNN) heeft een functionele rol in planten, maar of dit ook een functionele rol speelt in het menselijk genoom is momenteel nog onduidelijk (Chan et al., 2005).
De methylatie reactie wordt gemedieerd door DNA-methyltransferases (DNMTs) waarbij de methylgroep afkomstig is van de donor S-adenosylmethionine (SAM) . De reactie resulteert uiteindelijk in 5-methylcytosine (5-meC). De novo methylatie (methylatie van sequenties die voordien geen enkele methylgroep bezaten) wordt gekatalyseerd door DNMT3a en DNMT3b (Smith et al., 2007). Zij zorgen voor DNA-methylatie tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, terwijl zogenaamde onderhoudsmethylatie gebeurt door DNMT1. Dit enzyme kopieert tijdens de celdeling de methylatie patronen van de parentale DNA-streng naar nieuwgesynthetiseerd dochter DNA waarbij de parentale streng DNA dus eigenlijk fungeert als de methylatie sjabloon (Smith et al., 2007). DNMT1 heeft een zekere specificiteit die gericht is op hemi-gemethyleerde CpG dinucleotiden (DNA waarvan slechts 1 streng gemethyleerd is). Cytosine methylatie patronen worden dus zonder enige twijfel doorgegeven via dit enzyme tijdens de DNA-replicatie fase van de celdeling (Bernstein et al., 2007).
6
Methylatiepatronen worden vastgelegd in de vroege embryonale periode waarbij de eerste methylaties van het DNA reeds gebeuren in de eerste paar celdelingen na de bevruchting. Hierna volgt de novo methylatie van specifieke CpG sites door DNMT3a en DNMT3b tot de blastocyt zich implant (Holliday en Pugh, 1975). Interactie tussen de novo methylatie en demethylatie bij elke daaropvolgende celdeling resulteert in een heterogeen methylatie patroon per molecule (Warnecke en Clark, 1999). Falen van de onderhoudsmethylatie is echter mogelijk en gebeurt per celdeling in ongeveer 5% van de CpG sites (Riggs et al., 1998). Vreemd genoeg worden de CpG eiland en allelspecifieke methylaties ook in afwezigheid van DNMT1 onderhouden (Rhee et al., 2000). De oorsprong van deze DNA-methylatie patronen is echter nog steeds een raadsel. Heel eigenaardig is ook het feit dat ondanks de hoge expressie van DNMT3a en 3b in vroeg embryonale cellen, (wanneer met andere woorden de meeste de novo methylatie plaatsvindt), vele CpG eilanden steeds ongemethyleerd blijven, ondanks hun rijkdom aan target sites (Clark, 2007). Ofwel is het merendeel van het genoom standaard gemethyleerd en worden Cpg eilanden strategisch weerhouden van methylatie, ofwel wordt globale methylatie gedirigeerd door bijkomende factoren zoals aan chromatine gassocieerde proteïnen (Bird, 2002; Zhu et al., 2006). DNA-methylatie op zich onderdrukt of activeert niet rechtstreeks de transcriptie. Het stuurt echter wel de manier waarop verschillende proteïnen worden samengebracht bij de vorming van chromatine. Het is dan weer de toestand van het chromatine dat de functionele status van een gen bepaalt (Clark, 2007).
Chromatine wordt gevormd door nucleosomen. Een nucleosoom is eigenlijk de oplossing die onze cellen in de loop der evolutie hebben gevonden op het praktische organisatieprobleem om een groot genoom te laten passen in een kleine nucleus en tegelijkertijd het DNA voldoende te toegankelijk te houden voor regulerende factoren. Er moet immers bijna twee meter DNA in elke nucleus verpakt worden. Elk nucleoseoom is opgebouwd uit korte segmenten DNA van 147 baseparen die rond een octameer van proteïnen, de zogenaamde histonen, gewikkeld zijn, (twee van elk: H2A, H2B, H3, H4). Nucleosomen worden onderling van elkaar gescheiden door korte stukjes linker-DNA. Deze herhalingen van nucleosomen worden uiteindelijk in chromatine georganiseerd. Chromatine van transcriptioneel inactief DNA (“heterochromatine”) kent een heel dense conformatie samen met een strakke histonbinding en is geassocieerd met genomische regio’s die slechts laatijdig gerepliceerd worden tijdens de S-fase van de celcyclus. Transcriptioneel actief DNA wordt gekenmerkt door chromatine in een open conformatie (“euchromatine”) met een zwakkere histonbinding en zal vroeg in de S-fase worden gerepliceerd. Deze dynamisch wisselende structuur van chromatine wordt gecontroleerd door reversibele epigenetische patronen waaronder o.a. DNA-methylatie (Jenuwein en Allis, 2001; Turner, 2002).
7
In het algemeen zijn lage methylatie niveaus (hypomethylatie) geassocieerd zijn met hoge genactiviteit en zullen hoge methylatie niveaus zorgen voor genuitschakeling. CpG-eilanden zijn zoals reeds gezegd normaal ongemethyleerd en vormen doelwitten voor de proteïnen die ongemethyleerde CpGs binden en zo gentranscriptie initiëren. De open structuur van chromatine rondom ongemethyleerde CpG-eiland promotersequenties faciliteert de toegang van andere proteïnen die transcriptie bespoedigen. Wanneer dergelijke CpG-eilanden echter gemethyleerd zijn, is het chromatine dicht op elkaar gepakt en verhindert zijn structuur zo genexpressie. Gemethyleerde CpGs zijn dus geassocieerd met inactief DNA en zorgen voor een stabiel, overerfbaar stilleggen van de transcriptie.
1.1.2 Histonmodificaties: De structuur van het chromatine wordt naast methylatie ook bepaald door posttranslationele covalente modificaties. Combinaties van deze modificaties zijn ook mogelijk en dit resulteert uiteindelijk in de zogenaamde “histoncode”. De posttranslationele histonmodificaties beslaan een uitgebreid aanbod aan mogelijkheden (meer dan 100): acetylatie, methylatie, fosforylatie, ubiquinatie,… Deze vinden hoofdzakelijk plaats op specifieke posities binnenin de amino-terminale histonstaarten, die net genoeg uit de compacte eenheid uitsteken om contact te kunnen maken met DNA, andere histonen of proteïnen (Bernstein et al., 2007). Deze modificaties zorgen ervoor dat de toegankelijkheid van het DNA voor transcriptiefactoren wordt gewijzigd en zetten de deur open voor proteïne-interacties die mee de uiteindelijke structuur van het chromatine zullen bepalen (Rodenhiser en Mann, 2006). Algemeen kunnen we zeggen dat acetylatie van een histonstaart geassocieerd is met actieve genen en ongemethyleerde CpG eilanden terwijl deacetylatie van een histonstaart geassocieerd is met zogenaamde “silent genes” (uitgeschakelde genen) en gemethyleerde CpG eilanden (Clark, 2007). Zo verkeert heterochromatine (de inactieve vorm) meestal in hypogeacetyleerde toestand en is deze geassocieerd met heterochromatine proteïne 1 (HP1), terwijl euchromatine (de actieve vorm) veelal geacetyleerd is (Cheung en Lau, 2005). De acetylgroep is negatief geladen en balanceert zo de basische natuur van de histonstaarten. Hierdoor binden zij minder sterk aan het DNA en wordt chromatine toegankelijker tijdens de transcriptie (Gilbert et al., 2004). Het staat alleszins vast dat kleine wijzigingen grote gevolgen kunnen hebben in transcriptionele activiteit.
Veel van deze modificaties blijven echter nog steeeds niet goed begrepen, maar de lysine-acetylatie en -methylatie zijn de laatste jaren het best bestudeerd. Lysine-acetylatie correleert bijna altijd met toegankelijk chromatine en transcriptionele activiteit terwijl lysinemethylatie verschillende effecten kan hebben, afhankelijk van welk residu wordt gemodificeerd. Deze modificatie kan zowel zorgen voor transcriptionele activatie als repressie (Bernstein et al., 2007).
8
Histonmodificaties kunnen elkaar ook beïnvloeden en interageren met DNA-methylatie aan de hand van proteïnecomplexen die binden aan gemodificeerde histonen of gemethyleerde cytosines. Histonmodificaties kunnen er ook voor zorgen dat andere proteïnen (enzymes) naar specifieke regionen in het genoom aangetrokken worden. Zo worden geacetyliseerde lysines herkend door “bromodomeinen” binnenin de nucleosoomhermodelleringscomplexen en zullen proteïnen met chromodomeinen binden aan gemethyleerde lysine residu’s (Sims et al., 2005). Lysine kan tot 3 methylgroepen bezitten. Deze “methyl-status” kan een invloed hebben op de binding van een chromodomein. Deze zogenaamde histongeassocieerde proteïnen zijn eveneens betrokken bij de regulatie van gentranscriptie (Fischle et al., 2003).
Een subset van deze histonmodificaties worden ook epigenetisch overgeërfd. Dit bleek onder andere het geval bij gisten, waar ondanks de afwezigheid van DNA-methylatie, interacties tussen H3K9, gemethyleerde histonen en het Swi6 chromodomein hun heterochromatische status behielden na de celdeling. Blijkbaar gebeurt dit aan de hand van een positief feedbackmechanisme (Grewal en Moazed, 2003).
Histonen segregeren willekeurig tijdens de celdeling, waardoor ieder dochterchromosoom normaal gezien dezelfde gewijzigde histonen zal overerven. Deze gemodificeerde status zal zich dan lokaal verspreiden naar nieuw gevormde histonen. Verschillende multiproteïnecomplexen van chromatine hebben complementaire bindings –en modificatie activiteit waardoor ze bijdragen tot het epigenetische onderhoud van de modificatiepatronen (Groth et al., 2007; Bernstein et al., 2007).
CpG proteïnen echter dissociëren van de chromosomen tijdens de mitose. Hoe deze dan na de celdeling terug naar hun target sites gebracht worden is nog niet volledig duidelijk. Eén hypothese veronderstelt dat een fysieke interactie tussen CpG-complexen en gemethyleerde histonen binnenin het chromatine hiervoor zorgt, maar helemaal zeker is dit niet (Bernstein et al., 2007; Henikoff et al., 2004).
9
Figuur 2: Bron: Rodenhiser en Mann, 2006. Deel A: Schematische voorstelling van de epigenetische modificaties. DNA strengen worden rond een octameer van histonen gewonden, met vorming van een nucleosoom. Deze nucleosomen worden vervolgend georganiseerd in chromatine. Vervolgens ondergaat dit chromatine modificaties ter hoogte van de histonen en methylatie van het DNA. Gecombineerd vormen deze wijzigingen een uniek epigenetisch patroon dat de organisatie van de chromatine en expressie van de genen reguleert.
Deel B: Schematische voorstelling van de reversibele wijzigingen in chromatine-organisatie die de genexpressie beïnvloeden: transcriptie is mogelijk wanneer de chromatine zich in een open confirmatie (“switched on”) bevindt en de transcriptie wordt belemmerd wanneer het chromatine gecodenseerd is
(“switched off”). De witte cirkeltjes stellen
ongemethyleerde cytosines voor, de rode cirkeltjes zijn dan weer gemethyleerde cytosines.
10
1.2 Niet-covalente mechanismen.
1.2.1 Nucleosoomhermodellering: Naast bovenvermelde covalente mechanismen (DNA-methylatie en histonmodificaties) bestaan er ook niet-covalente mechanismen zoals nucleosoomhermodellering die een extra dimensie geven aan de variabiliteit van de chromatinestructuur.
Zogenaamde chromatinehermodelleringsfactoren wijzigen de interacties tussen DNA en de histonen waardoor nucleosomaal DNA een stuk toegankelijker wordt voor interacties met andere proteïnen. Ze zorgen voor een verplaatsing, verwijdering of herstructurering van een nucleosoom (Becker en Hörz, 2002). Nucleosoomhermodelleringsfactoren zijn eiwitcomplexen die twee tot twaalf verschillende subeenheden kunnen bezitten. Een fundamenteel kenmerk van deze complexen is dat ze de energie, nodig voor de hermodellering, halen uit de hydrolyse van ATP. In zoogdieren zijn er ongeveer 30 genen die coderen voor die ATPase subeenheid. De onderliggende mechanismen van het ATPase proces blijven echter nog steeds een obscuur gegeven (Goldberg et al., 2006). Er bestaan momenteel vier verschillende families van hermodelleringscomplexen. Alle vier hebben ze, door aanwezigheid van unieke geassocieerde subeenheden en unieke domeinen binnen hun katalyische eenheid, gespecialiseerde doelstellingen. Alle hermodelleringscomplexen delen wel vijf basiseigenschappen: Ten eerste bezitten ze een grote affiniteit voor het nucleosoom die verder gaat dan het DNA, als tweede bevatten ze domeinen die covalente histonmodificaties herkennen, ten derde beschikken ze over een gelijkaardig DNA-afhankelijk ATPase-domein alsook over proteïnen die dit ATPase-domein reguleren en tot slot hebben ze ook domeinen of proteïnen waarmee ze met bijvoorbeeld transcriptiefactoren een interactie aangaan (Clapier en Cairns, 2009).
De eerste is de SWI/SNF familie van hermodelleringscomplexen. Ze werden oorspronkelijk gezuiverd uit Saccharomyces cerevisiae en bestaan uit 8 tot 14 subeenheden. Deze familie kent vele activiteiten maar heeft geen rol in de opbouw van chromatine (Mohrmann en Verrijzer, 2005). De ISWI familie van hermodelleringscomplexen werd oorspronkelijk gezuiverd uit Drosophila melanogaster en de complexen bezitten 4 tot 8 subeenheden. De meerderheid van deze complexen promoot chromatine opbouw en onderdrukt transcriptie, maar bepaalde complexen kunnen ook net het omgekeerde doen. Dit hangt af van de aanwezige subeenheden (Corona en Tamkun, 2004). Als derde is er de NuRD/Mi2/CHD familie van hermodelleringscomplexen, die voor het eerst gezuiverd werd uit Xenopus laevis en opgebouwd is uit 1 tot 10 subeenheden. Sommige complexen uit deze familie stimuleren transcriptie terwijl andere eerder repressief optreden. Deze variabiliteit vloeit voort uit de diversiteit aan chromodomeinen (Marfella en Imbalzano, 2007).
11
De INO80 familie van hermodelleringscomplexen vormt de vierde familie. Zij werden voor het eerst gezuiverd uit S. Cerevisiae en bezitten meer dan 10 subeenheden. De functies zijn velerlij. Zo promoten zij onder andere transcriptie en DNA-herstel (Bao en Shen, 2007). De chromatine hermodelleringscomplexen heffen de inhibitie op die een nucleosoom uitoefent op transcriptie, DNAherstel etc. door een structuurverandering in de nucleosomen te veroorzaken (Goldberg et al., 2007). Het resultaat zorgt voor een soort van vloeiende staat van het chromatine, waarbij de globale DNA organisatie wordt behouden, maar waarbij individuele DNA-segmenten voorbijgaand kunnen blootgesteld worden aan interagerende factoren (Becker en Hörz, 2002).
In de meest rudimentaire omschrijving van nucleosoomhermodellering wordt deze activiteit dus gedefinieerd als een proces dat de interacties tussen histonen en DNA binnen een nucleosoom wijzigt op een ATP-afhankelijke wijze. Normaal gezien zal hierbij de toegankelijkheid van nucleosomaal DNA verhogen zodat proteïnen kunnen interageren met DNA-sequenties die voorheen niet beschikbaar waren. Op deze manier kunnen processen zoals DNA-replicatie, DNA-herstel en DNArecombinatie
correct
uitgevoerd
worden
(Clapier
en
Cairns,
2009).
ATP-afhankelijke
chromatinehermodellering is natuurlijk slechts één van de vele aspecten van DNA-regulatie. Associatie met de posttranslationele histonmodificaties zorgt voor een geïntegreerd en complex mechanisme van genactivatie en genuitschakeling.
12
2. Epigenetica, het milieu en ziekte-etiologie.
DNA-methylatiepatronen kennen een heel grote variatie en kunnen wijzigen na
nutritionele
veranderingen en blootstelling aan milieugebonden factoren. Zo kan een lage inname van methionine en folaat de methioninesignaaltransductieweg, die zorgt voor de transfer van methylgroepen naar het DNA, grondig verstoren met hypomethylatie van het genoom en verregaande klinische effecten tot gevolg (Ulrey et al., 2005). Folaatdeficientië is bijvoorbeeld geassocieerd met kanker, atherosclerose en defecten van de neurale buis bij foetussen (Waterland en Jirtle, 2004; Zaina et al., 2005). Hier past echter de opmerking
dat een dergelijke hypogemethyleerde status reversibel is en dat
folaatsubstitutietherapie in staat is om de DNA-methylatie terug te brengen naar normale niveaus (Ingrosso et al., 2003). Tegenwoordig zal men zwangere vrouwen dan ook preventief folaatsupplementen toedienen om ieder riscico op intra-uteriene complicaties in de kiem te smoren (Persad et al., 2002).
Schadelijke stoffen aanwezig in het milieu zoals metalen (cadmium, lood, nikkel) of aromatische koolwaterstoffen kunnen ook het genoom destabiliseren en kunnen zelfs het cellulair metabolisme wijzigen of eventueel beide doen. Veelal zijn deze contaminanten te vinden in besmet drinkwater, sigarettenrook of komen mensen ermee in contact op hun werk. Het epigenoom is vooral vatbaar voor dysregulatie door deze externe factoren tijdens de gestatieperiode, bij de neonatale ontwikkeling, in de puberteit en op hoge leeftijd (Rodenhiser en Mann, 2006). Hoewel wijzigingen van het epigenoom dus eender wanneer kunnen optreden, situeert de meest delicate periode zich echter tijdens de embryogenese. Tijdens dit proces is het tempo van DNA-synthese namelijk heel hoog en worden de gedetailleerde DNA-methylatiepatronen die nodig zijn voor een normale weefselontwikkeling vastgelegd (Weidman et al., 2007). Als concreet en historisch relevant voorbeeld beschouwen we de stof diethylstilbestrol (DES). Deze stof werd heel erg berucht nadat ze van 1946 tot 1974 werd voorgeschreven aan zwangere vrouwen om de kans op herhaling van een miskraam te verkleinen. Studies verricht met het DES op in utero muizen onthulden hypomethylatie in de oestrogeenresponsieve lactoferrinepromotor. Uit humane epidemiologische gegevens blijkt dat individuen die tijdens de eerste 3 maanden van de zwangerschap in utero blootgesteld werden aan DES een hogere incidentie vertoonden van reproductieve stoornissen en een zeldzame kanker van de vagina (clear cell adenocarcinoma). Verhoogde incidentie van verschillende ziekten bleek ook op te duiken bij de kleindochters en kleinzonen van vrouwen blootgesteld aan deze stof, wat meteen suggestief is voor epigenetische transgenerationele overerving (Newbold et al., 2006; Prins, 2008).
13
Niet iedereen reageert echter op een gelijkaardige manier op wijzigingen in hun dieet of contact met contaminanten. De mate waarin deze factoren een doorslaggevende rol kunnen spelen in de algemene gezondheid, hangt af van voorafbestaande genetische variaties die de gevoeligheid van mensen ten aanzien van zulke externe invloeden bepalen. Op deze manier kunnen bepaalde personen een genetische predispositie bezitten voor epigenetische veranderingen en hun effecten (Ergul et al., 2003; Semenza et al., 2003).
Het is echter belangrijk in gedachten te houden dat we hier te maken hebben met een zeer complexe interactie tussen epigenetica, het milieu en genetische individialiteit die kan zorgen voor een verhoogd risico op epigenetisch gedetermineerde ziekten, maar dit niet per definitie altijd zal doen. Het geheel van de interactie kan ook voor heel wat andere effecten zorgen en strikte eenduidigheid bestaat hier niet. Zo zou het 677CT -polymorfisme van het methyleentetrahydrofolaat (MTHFR) zorgen voor een verhoogde prevalentie van borstkanker en colorectale kanker na wijzigingen in dieet en alcoholconsumptie. Andere studies suggereren dat het 677TT-genotype dan weer zorgt voor een risicodaling van 40% voor borstkanker bij postmenopausale vrouwen die hormoonvervangende therapie gebruiken. Dit ter illustratie van de complexiteit van het gegeven (Le Marchand et al., 2004).
Een speciale vermelding waard, is de rol die epigenetica speelt bij ouder worden. Ouder worden betekent een aanpassing van het epigenoom en het proces is geassocieerd met zowel DNA-methylatie als DNA-demethylatie (Richardson, 2003). Fraga en Esteller (2007) kwamen tot de vaststelling dat het verouderingsproces karakteristiek gepaard gepaard gaat met een daling in globale CpG-methylatie gecombineerd met hypermethylatie van specifieke regionen (meestal promotorregionen). Gezien dergelijke epigenetische veranderingen zouden zorgen voor een gewijzigde genexpressie wordt er actueel gezocht naar potentieel functionele relaties tussen specifieke epigenetische veranderingen en de pathologie van veelvoorkomende ouderdomsziekten
Het is al geweten dat leeftijdsgebonden stijgingen van DNA-promotormethylaties zich voordoen in genen die een rol spelen bij kanker zoals bijvoorbeeld IGF2, Versican en PAX (Issa, 2000). Deze leeftijdsgebonden epigenetische verschillen worden het best geïllustreerd door onderzoek van het epigenoom bij monozygotische tweelingen. In een onderzoek naar de globale -en genspecifieke verschillen in DNA-methylatie en histonacetylatie van 50 monozygotische tweelingen kwam men tot de conclusie dat deze tweelingen op jonge leeftijd epigenetisch heel sterk op elkaar geleken, maar dat zij op oudere leeftijd significante verschillen in DNA-methylatie vertoonden. Deze verschillen bleken ook meer uitgesproken te zijn bij tweelingen die een totaal andere levensstijl hadden gekend (Fraga et al., 2005). Dit benadrukt nogmaals de rol die omgevingsfactoren spelen in de vormgeving van het epigenoom en toont ook aan dat onze epigenetische handtekening een heel dynamische entiteit is.
14
Het is dan ook geen verassing dat een verstoring van de delicate epigenetische balans door externe stimuli een factor is die bijdraagt tot de ontwikkeling van velerlei ziekten zoals kanker, autoimmuniteits -en inflammatoire stoornissen (Wilson, 2008).
15
3. Concrete rol van epigenetica in specifieke ziektebeelden.
Storingen in de DNA-methylatie patronen en histonmodificaties kunnen leiden tot congenitale aandoeningen en systemische syndromen maar zij kunnen ook leiden tot een predispositie voor het verwerven van kankers of neurodegeneratieve ziekten. Alvorens toe te spitsen op de ziekte die centraal staat in deze scriptie, lijkt het me gepast om het principe te illustreren aan de hand van enkele andere ziekten die kunnen ontstaan onder de invloed van epigenetische defecten.
Allereerst zijn er stoornissen van de genomische imprinting. Onder normale omstandigheden wordt de meerderheid van de automosomale biallelische genen gelijkwaardig tot expressie gebracht uit zowel het materneel als paterneel allel. Er zijn echter verschillende humane biallelische genen gekend waarin de expressie van één parentaal allel (dat van de moeder of dat van de vader) wordt onderdrukt in sommige cellen. Dit proces noemt men allelische exclusie. De sequenties van beide parentale allelen zijn echter volkomen normaal. Veelal is deze repressie willekeurig, maar soms is ze dat niet. Zo wordt in sommige gevallen steeds het paterneel overgeërfd allel onderdrukt en in andere steeds het materneel allel. Dit proces staat gekend als imprinting. Genomische imprinting zorgt er voor dat genen zich “herinneren” of zij van de moeder of de vader overgeërfd werden om vervolgens slechts 1 van beide allelen uit te drukken (Waggoner, 2007). Genomische imprinting kan dus gedefinieerd worden als de ouderspecifieke, monoallelische expressie van een gen. Sleutelprocessen in de regulatie van imprinting zijn allel-specifieke DNA-methylatie en histonmodificaties. Wijzigingen hierin kunnen voor een waaier aan pedriatische aandoeningen en ontwikkelingsstoornissen zorgen waarbij een abnormaal fenotype ontstaat ten gevolge van de afwezigheid van de paternele of maternele kopie of ten gevolge van de deregulatie van zo’n gen . Dit komt bijvoorbeeld voor bij het syndroom van Angelman, Prader-Willi en Beckwith-Wiedemann (BWS) (Egger et al., 2004)
Veranderingen in acetylatie en methylatie zijn nodig om DNA-recombinatie, dat nodig is om een aangepaste immuunrespons teweeg te brengen tegen een specifiek antigen, door te laten gaan (Wilson et al., 2005). Verlies van epigenetische controle over dit proces draagt bij tot de ontwikkeling van immuungerelateerde ziekten zoals bijvoorbeeld lupus erythemathosus (Richardson, 2003; Oelke en Richardson, 2004).
Epigenetische fouten hebben eveneens een oorzakelijke rol in het ontstaan van psychiatrische, autistische en neurodegeneratieve stoornissen. Zo wordt er gespeculeerd dat DNA-wijzigingen in de DNMT genen een rol spelen in schizofrenie en gemoedsstoornissen: DNMT1 wordt immers selectief tot overexpressie gebracht in de GABA interneuronen van een schizofreen brein (Abdolmaleky et al., 2004; Rodenheiser en Mann, 2006).
16
Ook in onze inflammatoire responsen speelt epigenetische regulatie een grote rol en kan er dus heel wat fout lopen. Macrofagen reageren op de aanwezigheid van lipopolysacchariden (LPS) maar bij persisterende aanwezigheid van LPS worden de macrofagen kortstondig hyporesponsief. Tijdens deze hyporesponsieve toestand ontstaan twee patronen van macrofagaire chromatinemodificatie: één groep genen die verantwoordelijk is voor de productie van inflammatoire molecules (TNF, IL-6) wordt tijdelijk inactief. Een tweede groep genen, die verschillende antimicrobiële effectoren bevat, blijft klaar voor activatie. Deze status wordt gereguleerd door modificaties in de histonen die respectievelijk geassocieerd zijn met deze twee functionele groepen van genen. Het praktische nut hiervan is dat de tijdelijke inactivatie van de eerste groep genen ervoor zorgt dat er geen bijkomende pathologie ontstaat ten gevolge van een overmatig inflammatoir antwoord terwijl de tweede groep actieve genen nog steeds in staat is een antimicrobiële werking uit te voeren en zo het menselijk lichaam te beschermen tegen infectie (Foster et al., 2007; Wilson, 2008). In zulke dynamische en complexe regulatie kan een verstoring van de onderliggende epigenetische mechanismen leiden tot het ontstaan van stoornissen in onze inflammatoire respons.
Eigenaardig genoeg resulteren vele van de epigenetische abnormaliteiten in chromosomale wijzigingen en leerstoornissen. Zo zorgen mutaties in het ATRX gen voor wijzigingen in het methylatiepatroon van ribosomaal DNA en Y-specifieke repeats, resulterend in het ATR-X syndroom (X-gebonden alfa-thalassemie-mentale-retardatie). Fragiel X syndroom ontstaat wanneer een bepaalde CGG repeat uitbreidt en de novo gemethyleerd wordt, waardoor het gen in zijn geheel uitgeschakeld wordt. Dit zorgt voor een zichtbaar “fragiele” site op het X chromosoon (Tufarelli et al., 2003). Het ICF-syndroom (Immunodeficiency, centromeric region instability and facial anomalies) wordt veroorzaakt door mutaties in het DNMT3b gen, dat, zoals reeds eerder vermeld, codeert voor een enzym met een essentiële functie in het tot stand brengen van DNA-methylatie patronen (Okano et al., 1999; Egger et al., 2004). Patiënten sterven doorgaans ten gevolge van recurrente respiratoire en gastro-intestinale infecties.
Het feit dat alle bovenvermelde ziekten grootschalige chromosomale anomalieën vertonen, is een aanwijzing dat epigenetische mechanismen een centrale rol vertolken in de architectuur van chromosomen.
17
4. Kankerepigenetica.
4.1 Het epigenetisch kankermodel versus het genetisch kankermodel.
Om een bredere duiding te geven aan de relatie die mogelijks bestaat tussen de epigenetica van kanker en de etiologie van kanker (met andere woorden of de epigenetische veranderingen die detecteerbaar zijn bij kanker ook verantwoordelijk zijn voor het onstaan ervan) wordt best een definiërende omschrijving uiteengezet van wat epigenetische wijzigingen nu exact inhouden. Hieronder worden de eigenschappen die alle epigenetische wijzigingen met elkaar gemeenschappelijk hebben even op een rijtje gezet (Feinberg, 2004):
1) Integenstelling tot genetische mutaties zijn ze mogelijks reversibel. 2) Ze kunnen een effect uitoefenen op genen vanop afstand, waarbij de grootte van het effect afneemt naarmate de afstand van het gen tot de epigenetische wijzigingspunt. 3) Ze kunnen een effect uitoefenen op groepen van genen die dicht bij elkaar liggen. 4) Ze komen in grote aantallen voor. 5) Ze kunnen op hun beurt gewijzigd worden onder invloed van het milieu.
Het mechanisme van al deze eigenschappen is gebaseerd op chromatinewijzigingen met o.a. histon modificaties, methylatie van cytosine in het DNA, de (her)schikking van de nucleosomen,... Het is reeds duidelijk dat epigenetische wijzigingen (zowel overgeërfd, spontaan als geïnduceerd door milieufactoren) significante moleculaire wijzigingen zijn die voorafgaan aan de vorming van neoplasmata. (Zie figuur 3) Meer nog, deze epigenetische veranderingen kunnen potentieel meer schade aanrichten dan nucleotide mutaties aangezien hun effect op regionale chromatine zich kan verspreiden en zodoende meerdere genetische loci kan aantasten. Hypomethylatie over het gehele genoom is één van de eerste gebeurtenissen die zich afspeelt bij de ontwikkeling van kanker (Grønbæk et al., 2007).
Het epigenetisch model van kanker spreekt het genetisch model niet tegen, maar zij vullen elkaar aan. Om evenwel de nuances tussen elk van beide duidelijk te maken plaatsen we ze even naast elkaar. Het genetisch model van kanker stelt dat de ziekte veroorzaakt wordt door mutaties in genen. De verklaring voor kankermechanismen wordt hierbij dan ook gezocht in mutaties, deleties, genamplificatie,... Dit verklaart de meeste familiale syndromen van neoplasie, alsook het principe van kankerinitiatie.
18
Echter, slechts weinig genmutaties blijken verantwoordelijk voor de progressie van kanker. Het is moeilijk om bijvoorbeeld een specifiek “metastatisch gen” te identificeren, waarbij dit gen gemuteerd is in de metastasen, maar niet in de primaire tumor. Het genetisch model stelt ons wel in staat om te screenen op vroege maligniteiten door middel van bloedonderzoek ed.
Het epigenetisch model stelt dat epigenetische genwijzigingen bijdragen tot carcinogenese en tumorgroei. Hierbij gaat men ter verklaring van de mechanismen van kanker op zoek naar methylaties, chromatinemodificaties en imprinting fouten die allen verband houden met veranderingen in de expressie van genen. Familiale kankersyndromen, met uitzondering van het Beckwith-Wiedemann syndroom, worden niet geassocieerd met epigenetische wijzigingen. Naast hun bijdrage tot de carcinogenese, bestaan er ook epigenetische wijzigingen die specifiek geassocieerd zijn met het activeren of uitschakelen van genen die tumorinvasie en tumormetastase bevorderen. Zo bevordert hypomethylatie van CA9 kanker van de niercel (Cho et al., 2001) en draagt hypermethylatie van de tumorsupressorgenen RB, P16 en VHL bij tot het ontstaan van o.a. longkanker (Herman et al., 1994; Merlo et al., 1995; Luo et al., 1998). Samengevat kan men de epigenetica van kanker beschouwen als een vorm van dysregulatie. De wijzigingen die kunnen optreden zijn onder andere globale en individuele hypomethylatie en hypermethylatie, chromatinemodificaties en een gewijzigde genomische imprinting.
Epigenetische wijzigingen kunnen fundamenteel een rol spelen in 2 processen: kankerinitiatie en kankerprogressie. Wat hun rol bij kankerinitiatie betreft is het mogelijk dat epigenetische en genetische veranderingen op elkaar inwerken op een manier zodat het effect van genetische mutaties bepaald kan worden door voorafgaande epigenetische fouten. Zo zouden genetische en epigenetische modificaties een complementaire rol spelen in de ontwikkeling van kanker. De voorafgaande epigenetische wijzingen potentiëren als het ware de mutaties in de genen (Christofori et al., 1995; Harrington et al., 1994; Feinberg, 2004). Dit model verklaart ook de leefdtijdsafhankelijke risicostijging van bepaalde kankers. Zoals reeds geweten stapelen we bij het ouder worden, steeds meer mutaties op in ons lichaam, als gevolg van onze “blootstelling” aan de externe wereld. Dit principe wordt de leeftijdsafhankelijkheid van cumulatieve mutaties genoemd (DePinho en Wong, 2003). Dit zou echter een onvolledige visie kunnen zijn. Ter illustratie: APC of adenomatosis polyposis coli staat geclassificeerd als een tumorsuppressorgen. Mutaties van dit APC-gen worden teruggevonden in bijna alle colonadenoma’s. Dit is een heel sterk argument voor een causaal verband tussen dergelijke mutatie en het ontstaan van colonadenoma’s. Echter, bij afwezigheid van een epigenetische bijdrage is de frequentie van voorkomen van deze colorectale tumor enorm laag.
19
Waarschijnlijk hebben de epigenetische wijzingen een modulerende functie waarbij het effect van de genmutatie volledig afhangt van de voorafgaande epigenetische veranderingen of waarbij zij zorgen voor een uitbreiding van het aantal doelwitcellen voor de genmutatie, met een stijging van het risico op nog meer APC-inactivatie in het colon tot gevolg (Feinberg, 2003). Hieruit volgt een belangrijk punt: een genmutatie is vereist voor kankerinitiatie, maar de probabiliteit dat een kanker zich ontwikkelt hangt af van de aanwezigheid van epigenetische wijzingen. (Zie tabel 1)
Epigenetische wijziging
Mutatie
Kankerprobabiliteit
Ja
Ja
Hoog
Ja
Neen
Geen
Nee
Ja
Laag
Neen
Neen
Geen
Tabel 1: De hypothetische (en vereenvoudigde) interactie tussen epigenetica en genetica bij normale kankerincidentie.
Dit belangrijke element van het model helpt de leeftijdsafhankelijkheid van kanker op een meer complete manier verklaren. Naarmate we ouder worden, neemt het aantal epigenetische fouten toe, waardoor de probabiliteit op progressie van de kanker na een initiele genmutatie eveneens groter wordt.
Ter conclusie kunnen we stellen dat het epigenetisch model van kanker complementair is aan het genetisch model en dat het helpt om een verklaring te bieden aan tumorprogressie en het effect van milieugebonden carcinogenen. Het concept van epigenetische dysregulatie helpt ons de activatie van genen die tumorinitiatie en invasie promoten alsook de activatie van latente virale oncogenen en de uitschakeling van tumorsuppressorgenen beter te begrijpen.
20
Figuur 3: Schematische voorstelling van de pathogenese van humane kankers. Genetische of epigenetische veranderingen op zich kunnen de vorming van een tumor initiëren. Sporadische kankers (ongeveer 90-95% van het totaal aantal kankers) vertonen bijna altijd zowel genetische als epigenetische defecten, waarbij deze mechanismen eveneens met elkaar interageren. Epigenetische wijzigingen kunnen genetische defecten veroorzaken en omgekeerd. Afhankelijk van het tumortype zal elk mechanisme het meest actief zijn in de vroege of late ontwikkeling van de tumor of eventueel zelfs een continue activiteit kennen. Bron: Brena en Costello, 2007.
21
4.2 Epigenetische uitschakeling van genen (“gensilencing”).
Figuur 4: Genuitschakeling in normale cellen, met een wisselwerking tussen nucleosoomhermodellering, DNA-methylatie en histonmodificaties en hun benodigde enzymes. Fysiologisch gezien is genuitschakeling van vitaal belang bij ontwikkeling en differentiatie. Bron: Jones en Baylin, 2007.
Recente vorderingen inzake de studie van kankerepigenetica leidde tot de realisatie dat silencing (genuitschakeling) een onderdeel vormt van globale epigenomische wijzigingen in kanker. Genuitschakeling speelt zowel een rol in bijvoorbeeld het normale verouderingsproces (Zie figuur 4) als bij de ontwikkeling van ziekten ten gevolge van de dysregulatie van het proces. Een sleuteleigenschap van silencing is de mogelijkheid om zich progressief te verspreiden over genomische regio’s. Aangezien epigenetische uitschakeling mitotisch overerfbaar is, kunnen zij dezelfde rol spelen en dezelfde selectieve veranderingen ondergaan als genmutaties in de ontwikkeling van kanker. Dezelfde concepten die gelden voor kiemlijnmutaties (namelijk dat mutaties kunnen zorgen voor een specifiek voordeel ten aanzien van een evoluerende populatie) gelden eveneens voor epigenetische veranderingen. Wijzigingen in genexpressie (ten gevolge van epigenetische wijzigingen) die zorgen voor een cellulair groeivoordeel, worden uitgeselecteerd met progressieve ongecontroleerde tumorgroei tot gevolg (Feinberg et al., 2006; Jones en Baylin, 2007).
Zoals reeds eerder vermeld betekent dit dat epigenetische veranderingen kunnen samenwerken met genetische veranderingen om zo de evolutie van een kanker te bewerkstelligen. De oorzaak hiervan vinden we terug in hun mitotische overerfbaarheid. De hoge mate van stabiliteit van de mitotische overerving gecombineerd met de progressieve manier waarop silencing gebeurt, zorgen ervoor dat pathologisch uitschakeling van genen die celgroei controleren een essentieel onderdeel vormt van het ontstaan en de ontwikkeling van een humane kanker (Jones en Baylin, 2007).
22
Vele honderden genen kunnen permanent geïnactiveerd worden door de methylatie van promotor cytosines in CpG eilanden. Dit proces kan zowel pathologisch zijn als fysiologisch. Histonmodificaties zoals histondeacetylatie en -methylatie van lysineresidues alsook nucleosomale hermodellering spelen eveneens een rol in het uitschakelen van genen. De 3 vermelde processen (DNA-cytosinemethylatie, histonmodificatie en nucleosomale hermodellering) zijn onderling verbonden met elkaar en wijzigingen hierin kunnen aanleiding geven tot permanente uitschakeling van genen met mogelijks tumorgroei tot gevolg.. Gezien de onderlinge band tussen deze processen, is het niet verwonderlijk dat dergelijke wijzigingen kunnen optreden op het niveau van het globaal genoom. Wijdverspreide wijzigingen in de structuur van het epigenoom kunnen leiden tot instabiliteit van het genoom, het nummer één kenmerk van kanker. Vermoedelijk is het hele epigenoom fundamenteel verstoord bij de ontwikkeling van tumoren (Cadieux et al., 2006).Om een idee te krijgen van welke rol pathologische silencing speelt bij kanker, beschouwen we deze best in de context van het tijdstip wanneer zij optreden tijdens de progressie van kanker. Abnormale genuitschakeling kan de vroege afwijkende klonale celexpansie een duwtje in de rug geven, waardoor de kans op toekomstige (epi)genetische wijzigingen in het voordeel van de tumorgroei toeneemt.
Er bestaat een reeks genen die allen DNA-hypermethylatie vertonen in de preïnvasieve stadia van verschillende kankers, maar die zelden gemuteerd zijn. Deze genen worden “epigenetische gatekeepers” genoemd. De normale epigenetische modulatie van deze genen belet de immortalisering van precursorcellen. De foutieve uitschakeling van deze genen blokkeert hun activatie en laat zo abnormale overleving en klonale expansie toe en hindert de celdifferentiatie. Het reeds vermelde APC-gen is een voorbeeld van zo’n gatekeeper gen voor colonkanker (Baylin en Ohm, 2006).
Inactivatie van het tumorsuppressorgen P16INK4A is één van de vroegste en meest voorkomende epigenetisch gemedieerde functieuitschakeling bij kankers zoals borst, long -en colonkanker (Belinsky et al., 1998). Het gen faciliteert waarschijnlijk vroege abnormale clonale expansie van cellen die op het punt staan te ontaarden. Verlies van dit gen zet per definitie de deur wagenwijd open voor de ontwikkeling van genomische instabiliteit en nieuwe epigenetische gensilencing (Reynolds et al., 2006).
23
Integenstelling tot mutaties, kunnen epigenetische wijzigingen meerdere keren plaatsvinden binnen de pathway van éénzelfde cel. Deze veranderingen kunnen dan fungeren als een soort van netwerken waarbij genen aangetast zijn voor één bepaalde pathway, maar tegelijkertijd ook (eventueel epigenetische) veranderingen kunnen veroorzaken in andere signaalpathways. Dit illustreert dat epigenetische veranderingen, in vergelijking met genmutaties, een genuanceerdere, meer geïntegreerde vorm van pathway-dysregulatie hanteren bij tumorigenese. Eén van de meest complexe reeks gebeurtenisen voor dergelijk netwerk van epigenetische abnormaliteiten omvat het functieverlies van HIC1 tumorsuppressorgen dat codeert voor het “Hypermethylated in cancer 1” proteïne. Reeds in de eerste stadia van neoplastische ontwikkeling kunnen epigenetische wijzingen, net zoals genetische, belangrijke pathways verstoren op een manier die uiteindelijke het risico op het ontstaan en de evolutie van een kanker vergroot (Jones en Baylin, 2007).
4.3 De kankerstamcelhypothese.
Door recent onderzoek naar DNA-hypermethylatie in kanker is gebleken dat het aantal epigenetisch uitgeschakelde genen in een individuele tumor kan oplopen tot enkele honderden (Jones en Baylin, 2007). Een stochastisch model kan in principe hiervoor een verklaring bieden, maar het is heel onwaarschijnlijk dat al deze abnormaliteiten willekeurig ontstaan en vervolgens gaan domineren door klonale selectie. Dergelijk stochastisch model zegt immers dat tumortransformatie resulteert uit volledig willekeurige mutatie en daaropvolgende klonale selectie. In zo’n model kan elke cel dus het doelwit worden van carcinogenese (Wicha et al., 2006). Een andere theorie legt de oorzaak daarvoor bij het foutlopen van de controle (op het niveau van de chromatine) van de expressie van bepaalde genengroepen, dewelke essentieel was voor het behoud van cellen in een stamcelstatus (Baylin en Ohm, 2006). Hier introduceren we het concept van “kankerstamcel”. Dit omvat een populatie van cellen die uiteindelijk verantwoordelijk is voor het ontstaan en verder bestaan van een tumor. Deze cellen hebben vele eigenschappen gemeenschappelijk met “gewone” stamcellen, maar hun exacte oorsprong blijft controversieel (Bjerkvig et al., 2005). De visie die vandaag het meest courant gehanteerd wordt, stelt dat een verschillende soorten celgroepen uit een normale levenscyclus het potentieel hebben om een focaal transformatiepunt te vormen voor verschillende individuele kankers (Jones en Baylin, 2007). Dit zou mogelijks kunnen verklaren waarom er van kankers zoals borst-en longkanker zoveel verschillende subtypes bestaan.
24
Alle weefsels in ons lichaam zijn ontstaan uit orgaanspecifieke stamcellen die de capaciteit hebben om zichzelf steeds opnieuw te kunnen vernieuwen en om uit te groeien tot de specifieke celtypes die men in elk orgaan terugvindt (differentiatie). Deze weefselspecifieke stamcellen worden onderscheiden van embryotische stamcellen omdat hun differentiatie-opties hoofdzakelijk beperkt zijn tot de celtypes van een specifiek orgaan. Door nieuwe ontwikkelingen in de stamcelbiologie duiken er steeds meer en meer bewijzen op die de kankerstamcelhypothese onderbouwen. De ontwikkeling van nieuwe dierenmodellen die op een efficiëntere manier zelfvernieuwing kunnen meten zorgen er voor dat de validiteit van deze hypothese op een meer directe manier kan getoetst worden (Wicha et al., 2006).
Per definitie zullen stamcellen, gezien hun lange levensduur, heel wat kankerinducerende mutaties ondergaan. Bijkomend bewijs dat stamcellen een rol zouden spelen in carcinogenese volgt uit de observatie dat normale stamcellen en kankercellen bepaalde gemeenschappelijke eigenschappen bezitten:
Ze bezitten de capaciteit om zichzelf te vernieuwen.
Ze bezitten de mogelijkheid tot differentiatie.
Ze vertonen actieve expressie van het telomerase enzyme.
Ze zorgen voor activatie van anti-apoptotische signaaltransductiewegen.
Ze vertonen een verhoogde activiteit van membraantransporters.
Ze hebben de mogelijkheid om te migreren en metastaseren.
Eigenschappen zoals de capaciteit tot migratie en metastasering, tot voor kort beschouwd als karakteristiek
voor
getransformeerde
cellen,
zijn
dus
eveneens
aanwezig
in
normale
weefselstamcellen (Dontu et al., 2003).
De kankerstamcelhypothese omvat twee afzonderlijke maar met elkaar verwante componenten. De eerste component betreft de cellulaire oorsprong van tumoren en het feit dat tumoren ofwel in stamcellen van weefsels of in hun onmiddellijke omgeving ontstaan ten gevolge van dysregulatie van het zelfvernieuwingsproces en zijn pathways. De tweede component stelt dat tumoren cellulaire subcomponenten bezitten die bepaalde eigenschappen van stamcellen vertonen zoals de capaciteit tot zelfvernieuwing en differentiatie. Deze cellulaire componenten zouden de drijvende kracht achter de tumor vormen. Eén van de vroege sleutelprocessen in maligne transformatie zou de dysregulatie van het zelfvernieuwingsproces zijn, waardoor een uitbreiding van de klonale stamcelpopulatie ontstaat.
25
Tijdens de normale ontwikkeling (waarbij door zelfvernieuwing een stamcel ontstaat naast een differentiërende dochtercel) wordt dit proces gereguleerd door middel van signalen afkomstig uit de omringende stamcelniche met de Wnt, Notch en Hedgehog signaalstransductiewegen als regulerende elementen. Dysregulatie van deze pathways wordt gezien in pancreas, gastrische, prostaat, huid -en borstkankers (Liu et al., 2005; Dontu et al., 2004; Karhadkar et al., 2004; Olsen et al., 2004). Het concept dat tumoren cellulaire componenten met stamcel eigenschappen bezitten en erdoor aangedreven worden, wint aan terrein door de ontwikkeling van dierenmodellen die een rechtstreekse waarneming toelaten van de stamceleigenschappen van dergelijke tumorcel subpopulaties. Deze toonden aan dat deze subpopulaties aan zelfvernieuwing en differentiatie doen. Zelfvernieuwing stuwt tumorigenese terwijl differentiatie bijdraagt tot de heterogeniciteit van het tumoraal fenotype (Wicha et al., 2006). Uit studies uitgevoerd door Dick et al. (1997), Ponti et al. (2005) en Wicha et al. (2006) blijkt eveneens dat kanker stamcellen uit verschillende tumortypes verschillende moleculaire celmerkers (CD44, α6 integrine, β1 integrine en CD133 (prominine)) gemeenschappelijk hebben. Dit gegeven ondersteunt het tweede concept.
Figuur 5: Model van de kankerstamcel voor wat betreft borstkanker. Zowel normale als maligne borststamcellen kunnen aan zelfvernieuwing doen en progenitorcellen vormen. Normale borststamcellen en progenitorcellen zijn multipotent, met vorming van ductale epitheliale, acinaire epitheliale en myoepitheliale cellen. De kankerstamcel en progenitorcel zijn daarentegen enkel in staat (epitheliale) kankercellen te vormen. De grote pijl indiceert cellen waarin een maligne transformatie mogelijks kan optreden. Dit is echter nog zuivere speculatie. Bron: Tan BT et al., 2007.
26
Als we in het geheel van bovenstaande context ervan uitgaan dat epigenetische uitschakeling inderdaad begint in een kankerstamcel, dan betekent dit dat vele van deze veranderingen vroege gebeurtenissen vormen bij tumorprogressie en dat de moleculaire oorsprong van deze wijzigingen gelinkt zou kunnen zijn aan de karakteristieken van een stamcelpopulatie (Jones en Baylin., 2007). Deze hypothese heeft verstrekkende gevolgen wat betreft de risico inschatting, vroege detectie, moleculaire profilering en preventie van kanker, maar ook de therapeutische implicaties zijn niet te onderschatten. Tumor respons wordt klinisch voornamelijk gedefinieerd als het inkrimpen van de tumor met minstens 50%. Echter, als kanker stamcellen inherent resistent zijn aan therapeutische agentia en als deze cellen slechts een minderheid vormen van de turmorcelpopulatie, dan zou de inkrimping van de tumor vooral een reflectie zijn van het effect van deze agentia op de gedifferentieerde tumorcellen en niet zozeer van het effect op de stamcelcomponent. Dit kan eveneens verklaren waarom in klinische trials met vergevorderde kankers tumorregressie zich vaak niet vertaald in een klinisch significante verhoging van de patiëntenoverleving (Richardson et al., 2005). Bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën om deze kanker stamcellen aan te pakken, vormen epigenetische therapeutica dan ook een belangrijke te exploreren piste!
27
5. MicroRNA’s en epigenetica: een geval apart.
In het kader van genregulatie werd lange tijd gedacht dat RNA slechts één traditionele hoofdfunctie vervulde: fungeren als een intermediar tussen DNA en proteïnen. Genen zorgen immers voor de codering van proteïnen via een messenger-RNA (mRNA) tussenstap. Recent werd echter aangetoond dat RNA’s die niet coderen voor proteïnen (ncRNA’s) eveneens een groot deel uitmaken van de genomische output. Het aandeel aan genoomregio’s die niet coderen voor eiwitten is in eukaryotische genomen in de loop der evolutie enorm toegenomen. Daarentegen is het aantal genen dat wel voor proteïnen codeert relatief stabiel gebleven. Dit staat in contrast met de oorspronkelijke opvatting dat complexere organismen een groter aantal genen zouden bezitten. Het staat vandaag de dag vast dat mensen evenveel proteïnecoderende genen bezitten als bijvoorbeeld een muis of een microscopische ringworm (Taft et al., 2010) en dat multicellulaire organismen minder proteïnecoderende genen bevatten dan sommige ééncellige eukaryoten (Taft RJ et al., 2007). Een verklaring voor deze paradox vloeit voort uit twee bevindingen. Ten eerste dat biologische complexiteit correleert met dat aandeel van het genoom dat niet codeert voor proteïnen. Ten tweede hebben recente studies aangetoond dat de meerderheid van deze niet-coderende regionen actief transcriptie ondergaan (Core LJ et al., 2008; Carninci et al., 2006). Een groot deel van deze transcripten wordt dan verder verwerkt en zorgt voor het ontstaan van de reeds vermelde regulerende non-coding RNA’s. Deze bevindingen staan in direct contrast met het traditionele beeld van RNA als eenvoudig intermediair tussen DNA en proteïnen. Dit impliceert dat het overgrote deel van ons genoom dat vroeger als bijkomstig werd beschouwd, codeert voor RNA dat functioneel gezien een belangrijke rol speelt in de ontwikkeling van complexe organismen (Mattick, 2007). Historisch gezien werden niet-coderende RNA’s dus heel lang als onbelangrijk beschouwd. Het is pas de laatste 10 jaar dat de rol die zij spelen beetje bij beetje wordt verhelderd. Zij ondersteunen de ontwikkeling en cellulaire homeostase en kunnen op verschillende manieren genexpressie reguleren door bijvoorbeeld een invloed uit te oefenen op transcriptie, mRNA turnover, translatie en chromatine-architectuur, DNA methylatie, RNA structuur etc. (Taft et al., 2010). Bij zoogdieren zouden ze een sleutelfunctie kunnen vervullen bij het richten van histonmodificaties en DNA methylaties naar specifieke loci waardoor een vorm van overerfbare en stabiele genuitschakeling kan ontstaan. MicroRNA’s (miRNA) zijn een klasse van kleine (20-25 neocleotiden lang) niet-coderende RNA’s die posttranscriptioneel de genexpressie doorgaans op een negatieve manier beïnvloeden. Ofwel interfereren ze met de translatie waardoor die onderdrukt wordt ofwel ondermijnen ze de stabiliteit van hun doelwit RNA’s en induceren ze de degradatie ervan (Beezhold et al., 2010). (Zie figuur 6)
28
De graad van complimentariteit tussen de 3’-niet-getranslateerde regio (UTR regio) van het doelwit mRNA en de zogenaamde “seed region” van het miRNA is bepalend voor het gebruikte regulatiemechanisme. Bij voldoende complementariteit tussen de sequenties zal het RISC complex (RNA-induced silencing complex) het doelwit mRNA knippen. Dit proces noemt men RNA interferentie. Indien er sprake is van onvoldoende complementariteit (veelal het geval bij zoogdieren), dan wordt de translatie onderdrukt (Lynam-Lennon et al., 2009). Cannell et al. (2008) concludeerden op basis van hun studies dat er twee manieren bestaan waarop miRNA’s de translatie onderdrukken. Beide methodes omvatten, zij het in verschillende mate, processen van deadenylatie en mRNA destabilisatie. Het gebruikte mechanisme is afhankelijk van de promotor waarvan het doelwit mRNA is afgeschreven. Bij de ene methode wordt mRNA onderdrukt ter hoogte van de initiatie van de translatie, bij de andere methode worden mRNA’s onderdrukt op een punt na initiatie van de translatie. Er moet echter in gedachten gehouden worden dat het goed mogelijk is dat er meer dan twee mechanismen bestaan of zelfs één, maar dan volledig misbegrepen regulatiemechanisme.
Figuur 6: Regulatie van genen door miRNA’s. De graad van complimentariteit tussen de 3’-UTR regio van het doelwit mRNA en de zogenaamde “seed region” van het miRNA is bepalend voor het gebruikte regulatiemechanisme. Bij voldoende complimentariteit gebeurt de regulatie door middel van RNA interferentie. Hierbij zal het RNA-induced silencing complex (RISC) het doelwit mRNA knippen. In geval van onvoldoende complementariteit zal de regulatie gebeuren door een onderdrukking van de translatie, wat zowel voor of na de initiatie kan optreden. Bron: Lynam-Lennon et al., 2009.
29
Oorspronkelijk werden de allereerste leden van de groep (let-7 en lin-4) voor het eerst geïdentificeerd in 1993 als kleine niet-coderende RNA’s die de capaciteit hadden genen te reguleren bij de ontwikkeling van larven (Lee et al., 1993). Sinds deze initiële ontdekking is echter duidelijk geworden dat miRNA’s regulatoren zijn van belangrijke biologische functies zoals cellulaire ontwikkeling, apoptose en metabolisme. Eén enkel miRNA kan de functie moduleren van wel 1000 genen en daarbij kunnen zij het niveau van genexpressie op een heel snelle en reversibele manier verfijnen. Er wordt geschat dat miRNA’s de expressie regelen van ongeveer 30% van het menselijke genoom. Vandaar dan ook hun uitgebreide invloed op vele biologische processen (Davalos en Esteller, 2010). Biogenese van de microRNA’s omvat drie processen waarbij achtereenvolgens primaire miRNA’s (pri-miRNA) en precursor miRNA’s (pre-miRNA) in de nuclei en mature miRNA’s in het cytoplasma ontstaan (Mestdagh et al., 2008). Vandaag de dag zijn meer dan 900 menselijke miRNA’s geregistreerd (miRBase, juli 2010). Waarschijnlijk moet een groot deel van de miRNA’s zelfs nog geïdentificeerd worden. Gezien zij een invloed kunnen uitoefenen op vele signaalstransductiewegen, is het vrij logisch dat ze, wanneer ze ontregeld raken, dan ook een prominente rol kunnen spelen in allerlei pathologische processen, met name bij kanker (Croce CM, 2009). Men vindt miRNA’s vaak terug in chromosomale regio’s, die fragiel zijn en zodoende vatbaar voor deleties, herschikkingen, en amplificaties. Meer dan 50% van de miRNA genen kunnen gelokaliseerd worden in genomische regio’s die met kanker geassocieerd zijn (Zhang et al., 2006).
Ondanks het vrij beperkt arsenaal aan technieken die kunnen gebruikt worden om de functies te onderzoeken van genen die coderen voor miRNA’s, zijn er heel wat bewijzen opgedoken dat deze miRNA’s een belangrijke rol spelen bij maligne transformatie van cellen. Het allereerste bewijs dat miRNA betrokken is bij menselijke kanker kwam er door een studie over de 13q14 deletie, uitgevoerd door Calin et al. (2002). In die studie werd aan miR-15a en miR-16-1 een rol als tumorsuppressorgenen toegekend. Verdere studies door Calin et al. en door Cimmmino et al., beiden in 2005 gepubliceerd, ondersteunden deze hypothese. Costinean et al. (2006) leverden direct bewijs dat miR-155 oncogene activiteit bezit. Studies uitgevoerd op de MiR-17-92 familie suggereerden dat deze cluster zich kan gedragen als een oncogen (Tanzer en Stadler, 2004). Takamizawa et al. (2004) kwamen tot het besluit dat let-7 mogelijks een significante rol in de pathogenese van longkanker zou spelen. In zowel in vivo als in vitro studies omtrent longkanker bleek het expressieniveau van let-7 sterk gedaald en kon geobserveerd worden dat deze daling geassocieerd was aan een verkorte postoperatieve overleving, ongeacht het stadium van de ziekte.
30
Integenstelling tot bij let-7, is expressie van de miRNA cluster miR-17-92 opmerkelijk gestegen in kleincellige longtumoren (Hayashita et al., 2005) en bespoedigde deze stijging de groei van de longtumor. Wat borstkanker betreft, bestaan er sterke verschillen in expressie van miRNA tussen normaal en neoplastisch borstweefsel. Heel wat miRNA’s (miR-125b, miR-145,…) zijn significant onderdrukt. Daarnaast bestaat er ook een correlatie tussen de expressie van miRNA’s en bepaalde biopathologische kenmerken van borstkanker zoals het tumorstadium, de proliferatie index en het niveau van vasculaire invasie (Iorio et al., 2005). Andere kankers waarvoor reeds bewijs van associatie geleverd is met miRNA’s zijn neuroblastoom, colorectale kanker (Michael et al., 2003), Glioblastoma multiforme (een zeer agressieve en praktisch ongeneeslijke hersenkanker) (Ciafre et al., 2005), lymfomen (Eis et al., 2005), papillair thyroïd carcinoom (He et al., 2005), testiculaire kanker (Voorhoeve et al., 2006), hepatocellulair carcinoom (Murakami et al., 2006) en tot slot melanomen (Zhang et al., 2006). De ontregeling van miRNA’s in kanker heeft hoofdzakelijk te maken met een gewijzigd expressieniveau. Een veranderd expressieniveau ontstaat op zijn beurt dan weer door activatie van oncogene transcriptiefactoren of genomische wijzigingen zoals chromosomale deleties, puntmutaties en foutieve methylatie van een promotorregio (Calin et al., 2005; Saito et al., 2006). Zo zijn de miR143 en miR-145 genen sterk neergereguleerd in colonkanker en blijkt miR-155 overdreven tot expressie gebracht in de Hodgkin –en Burkitt lymfomen (Eis et al., 2005; van den Berg et al., 2003). Epigenetische veranderingen en de activiteit van miRNA’s zijn duidelijk met elkaar verweven. Epigenetica kan verantwoordelijk zijn voor foutieve expressie van miRNA’s in verschillende maligniteiten. Saito et al. (2006) toonde aan dat na behandeling van een blaascarcinoom met een DNA-demethylerend agens in combinatie met een HDAC-inhibitor, de expressie van 5% van de menselijke miRNA’s significant steeg. Deze fractie zal nu uiteraard hoger liggen, gezien het aantal nieuwe miRNA’s dat steeds wordt geïdentificeerd. Eén van deze miRNA’s is miR-27. Hiervoor steeg de expressie echter alleen wanneer beide farmaca tegelijk werden gebruikt, wat suggereert dat het niveau van miR-27 geregeld wordt door een combinatie van epigenetische processen. Dit miRNA wordt in kanker cellijnen epigenetisch uitgeschakeld door hypermethylatie van de promoter en modificatie van de histonen in kankercellen. Eén van de doelwitten van dit miRNA is het oncogen BCL6. Epigenetische uitschakeling van miR-27, zoals gebeurt bij kanker, zorgt voor een expressie van het oncogen en draagt dus bij tot de carcinogenese van blaaskanker. Reactivatie van miR-27 onder invloed van de vermelde farmaca leidt logischerwijs tot een daling in expressie van het BCL6 oncogen.
31
Recenter kwamen Ando et al. (2009) tot de vaststelling dat hypermethylatie van de miR-124apromotor geassocieerd is aan het ontstaan van een premaligne toestand die de voorbode blijkt van maagkanker. Deze toestand wordt geïnduceerd wordt door infectie met Helicobacter Pylori en het is tevens de infectie zelf die verantwoordelijk is voor de accumulatie van abnormale DNA-methylaties. Epigenetisch gecontroleerde hypermethylatie van de miR-124a promotor is dus een heel vroege gebeurtenis in de carcinogenese van maagkanker. Aan de andere kant kunnen epigenetische wijzigingen ook protectief werken ten aanzien van miRNA’s met een oncogene functie. Er werd gerapporteerd dat de promotorregio van het miRNA let-7a-3 gehypermethyleerd is in epitheliale ovariumkanker, wat overeenstemt met een lage expressie van het polypeptide IGF-II. Aangezien dit geassocieerd is met een gunstige prognose, zou de methylatie van DNA hier mogelijks een protectieve taak vervullen door oncogene miRNA’s uit te schakelen (Lu et al., 2007). Daarnaast hebben verschillende onderzoeken aangetoond dat miRNA’s invloed uitoefenen op de metastase van kanker waarbij ook heel wat van deze miRNA’s onderheven blijken te zijn aan epigenetische regulering (Huang et al., 2008; Lujambio et al., 2008). Bovenstaande studies illustreren het feit dat miRNA’s onderheven zijn aan epigenetische regulatie, net zoals proteïnecoderende genen. Epigenetische wijzigingen kunnen niet alleen controle uitoefenen over menselijke carcinogenese door hun direct effect op de expressie van oncogenen en tumorsuppressorgenen, maar ook door hun invloed op miRNA’s betrokken in het carcinogenese proces. In dit opzicht vormen miRNA’s een indirect mechanisme dat het epigenoom hanteert om zijn invloed uit te oefenen op tumorsuppressorgenen, oncogenen en dus carcinogenese in zijn geheel. Onlangs werd ontdekt dat er een subset bestaat binnen de miRNA’s die zich direct of indirect richten op de effectoren van de epigenetische machinerie De zogenaamde epi-miRNA’s creëren op deze manier een vrij complex feedback mechanisme in de wisselwerking tussen miRNA en epigenetica. Fabbri et al. (2007) presenteerden het eerste bewijs omtrent het bestaan van deze epi-miRNA’s. Zij kwamen tot de conclusie dat de miR-29 familie in longkanker een directe inwerking had op de enzymen
DNMT3a
en
DNMT3b,
alsook
een
indirecte
werking
op
DNMT1.
De introductie van miR-29s in longcarcinomen induceerde een verstoring van de DNA methylatie met globale DNA hypomethylatie van de kankercellen tot gevolg. Dit resulteerde in heractivatie van eerder uitgeschakelde tumorsuppressorgenen, wat verder leidde tot apoptose van de kankercellen en inhibitie van de tumorale groei. Er bestaan eveneens epi-miRNA’s die de enzymes verantwoordelijk voor de acetylatie van histonen reguleren. MiR-1 en miR-140 oefenen een direct effect uit op HDAC4, terwijl HDAC1 op een directe wijze gereguleerd wordt door miR-449a. HDAC1 kent een verhoogde expressie in verschillende soorten kanker en de introductie van miR-449a in prostaatkankercellen induceert een daling van het gehalte aan HDAC1 met als gevolg een stopzetting van de celcyclus en apoptose (Noonan et al., 2009).
32
Tot slot is het de moeite om te vermelden dat microRNA’s ook kunnen gebruikt worden door virussen om controle te verwerven over de epigenetische werktuigen van hun gastheercel (Lu et al., 2010). De centrale vaststelling dat de ncRNA’s (waaronder de microRNA’s) krachtige genetische regulatoren zijn, doet de vraag rijzen welk bijdrage zij kunnen leveren bij klinische toepassingen. MiRNA’s zijn een stuk stabieler dan mRNA’s, wat klinisch gezien een groot voordeel is. Het zorgt ervoor dat ze op efficiënte wijze kunnen geïsoleerd worden uit speeksel, plasma en serum. In combinatie met de relatief grote specificiteit en sensitiviteit die ze bezitten bij het maken van een onderscheid tussen verschillende soorten kankers, maakt deze eigenschap van hen goede kandidaten voor gebruik als biomerkers bij vroege detectie van tumoren. Op deze manier zou bijvoorbeeld een classificatie opgesteld kunnen worden die vroege detectie toelaat van die tumoren bij dewelke dit tot op heden heel moeilijk verloopt.
Bepaling van de globale miRNA expressieniveaus toont aan dat tumorale weefsels gewijzigde hoeveelheden miRNA’s bezitten ten opzichte van normaal weefsel (Davalos en Esteller, 2010). Deze foutieve expressie maakt van miRNA’s meteen een handig hulpmiddel tijdens de verdere ziekteevolutie. Ze kunnen een potentiële rol spelen bij diagnose van tumoren (Lu et al., 2005) , helpen met een voorspelling van de therapeutische respons (Takamizawa et al., 2004) en men kan ze gebruiken om de oorsprong van slecht gedifferentieerde tumoren of metastasen te bepalen (Rosenfeld et al., 2008). Aangezien de aanwezigheid van bepaalde miRNA’s in bijvoorbeeld borstkanker of longkanker eveneens geassocieerd is met de prognose ervan, zou hun identificering wel eens een prominent onderdeel in het takenpakket van de anatomopatholoog kunnen worden. Taft et al. (2010) zijn ervan overtuigd dat snelle en persoonlijke genomische onderzoeken in de nabije toekomst realiteit zullen worden.
Gezien de sterke capaciteit van één individueel miRNA om gigantische netwerken van genen te reguleren, zouden ze effectief kunnen zijn als therapeutisch middel tegen o.a. kanker. Men kan hierbij zowel de miRNA’s zelf gebruiken als therapeutisch agens of farmaca ontwikkelen zich net richten op de miRNA’s. De eerste successen zijn op dit gebied bereikt met het gebruik van antagomirs, complementaire anti-sense RNA’s (Taft et al., 2010). Met betrekking tot kanker voert men vooral onderzoek naar nieuwe manieren om specifieke miRNA’s die in bepaalde tumoren onderdrukt zijn exogeen tot expressie te brengen. De rol van miRNA’s als coördinatoren van de epigenetische machinerie en de repressie van verschillende miRNA’s door DNA methylatie of histonmodificaties in acht genomen, leidt tot het besluit dat het gebruik van miRNA’s bij epigenetische therapie van kanker een niet te onderschatten nieuwe manier van aanpakken vormt.
33
De verdere ontwikkeling van dergelijke medicatie kent echter verschillende hindernissen.Vooraleer men de mogelijke voordelen van miRNA’s bij de behandeling van kanker ten volle kan benutten, moet er een betrouwbare toedingsmethode ontwikkeld worden, moeten correcte farmacokinetische en farmacodynamische profielen bepaald worden en moet men op zoek naar manieren om ongewenste bijwerkingen op te vangen of te verhinderen (Grimm et al., 2006; Kleinman et al., 2008).
Figuur 7: Illustratie van de potentiële klinische toepassingen van microRNA’s bij kanker. Bron: Davalos en Esteller, 2010.
34
6. De chemische regulatie van epigenetische modificaties: mogelijkheden tot ontwikkeling van nieuwe therapieën voor kanker.
6.1 Algemeen. In het kader van genexpressie beïnvloedt de structuur van chromatine de mate waarin RNApolymerasen en transcriptieregulerende eiwitten zich kunnen binden aan specifieke promotors om zo de transcriptie te starten. Zowel epigenetische als genetische factoren hebben een invloed op de hermodellering van chromatine. Zoals reeds vermeld omvat het spectrum van de mogelijke epigenetische chromatinemodificaties heel wat verschillende reacties: DNA-methylatie, posttranslationele modificatie van histonen, RNA-silencing, ATP-dependente chromatine hermodellering etc. Epigenetische factoren vormen dus een extra regulerende laag van de genexpressie en dit op moleculair niveau. De afgelopen jaren hebben wetenschappers ontdekt dat deze epigenetische veranderingen belangrijke moleculaire merkers zijn van kanker en dat de enzymes die deze wijzigingen katalyseren dan ook potentiële doelwitten vormen voor (nieuwe) therapieën . Een belangrijk hulpmiddel bij het onderzoek naar dergelijke medicatie (maar ook bij het onderzoek van gen en eiwitfuncties in het algemeen) zijn de zogenaamde “cell-permeable small-molecule modulators”. Dankzij deze regulatoren (zowel activatoren als inhibitoren) van enzymes die de epigenetische modificaties katalyseren, zijn wetenschappers in staat om uit te pluizen wat de biologische gevolgen zijn van chromatinewijzigingen in verschillende contexten. Hierbij bestaat het voordeel dat deze stoffen snel te werk gaan, en dosisafhankelijk alsook reversibel zijn
Hierna volgt een overzicht van de stoffen, de laatste jaren ontdekt of gesynthetiseerd, die in staat zijn om de activiteit van de belangrijkste DNA en histon wijzigende enzymes te reguleren. Niet alle stoffen die ooit zijn ontdekt worden hier vermeld, maar wel deze die veelbelovend zijn om te gebruiken als therapeutisch middel in de therapie van kanker.
35
6.2 Covalente mechanismen.
6.2.1 DNA-methylatie: DNA methylatie is een fysiologisch mechanisme van epigenetische regulatie van genexpressie. Dit proces wordt in menselijke cellen gemedieerd door een familie van DNA cytosine-5 methyltransferasen oftewel DNMTs. Dit enzym zorgt voor de overdracht van een methylgroep, afkomstig van de cofactor S-adenosyl methionine (SAM), naar de C-5 positie van cytosine. Momenteel zijn er 5 verwante DNMT’s gekend: DNMT1, 2, 3a, 3b en 3L (Bjornsson et al., 2004). Zoals in de inleiding vermeld, is DNMT1 functioneel het zogenaamde onderhoudsmethyltransferase dat preferentieel bindt aan hemigemethyleerd DNA en zijn DNMT3a en 3b de de novo methyltransferasen, die zowel binden aan hemigemethyleerd DNA als aan ongemethyleerde CpG sites. DNMT2 en DNMT3L hebben geen van beiden een belangrijke activiteit. DNMT2 is een RNAmethyltransferase (i.p.v. DNA) en DNMT3 heeft de capaciteit tot het methyleren van DNA niet, aangezien dit enzym gewoonweg geen katalytisch domein bezit (Goll et al., 2005; Goll et al., 2006).
Figuur 8: Schematische voorstelling van DNA cytosine-5 methylatie, gekatalyseerd door een DNMT-enzyme. De enzymes voor de omgekeerde reactie werden nog niet geïdentificeerd. Bron: Zheng et al., 2008.
Verschillende studies hebben reeds aangetoond dat DNA-methylatie rechtstreeks gecorreleerd is met neoplasie. In normale cellen zijn de meeste CpG-eilanden ongemethyleerd en geassocieerd met actieve genen of genen die in staat zijn tot transcriptie (Zheng et al., 2008). In kankercellen echter, is hypermethylatie van promotorregio’s van CpG-eilanden in tumorsuppressorgenen veelvoorkomend, met foutieve onderdrukking van deze genen tot gevolg. Hypermethylatie van deze CpG-eilanden leidt namelijk tot uitschakeling van de genen. Daarnaast verkeert het overige DNA van kankercellen doorgaans in een hypogemethyleerde toestand, wat vermoedelijk zorgt voor genetische instabiliteit (Esteller, 2005).
36
De ontwikkelde DNA methylatie inhibitoren (DNMTi’s) kunnen ondergedeeld worden in 2 klassen: de nucleoside analogen en de niet-nucleoside analogen. De nucleoside analogen bezitten een gemodifieerde cytosine ring en worden gemetaboliseerd door kinasen die de nucleosiden omzetten in nucleotiden om ze daarna te incorporeren in DNA of RNA. De allereerste ontwikkelde waren twee cytidine analogen: 5’ azacytidine (5-AZA-CR) en 5-aza-2’-deoxycitidine (5-ZA-CdR/ decitabine) (Mai en Altucci, 2009). Deze agentia hebben een antiproliferatieve werking op verschillende types van kankercellen en zij worden reeds gebruikt bij de klinische behandeling van acute myeloïde leukemie (AML) en myelodysplasie (MDS). Deze producten hebben echter ook te kampen met enkele nadelen. Ze zijn chemisch onstabiel in water, bezitten een korte halfwaardetijd en ze hebben toxische eigenschappen, die hun biologische beschikbaarheid nogal beperken (Lin et al., 1981). Ondertussen zijn drie nieuwe cytidine analogen ontwikkeld, die stabiel blijven in een waterige oplossing, een langere halfwaardetijd bezitten en minimale toxiciteit vertonen: 5,6-dihydro-5-azacytidine (DHAC), 5-fluoro-2’-deoxycytidine (FCDR) en zebularine. Deze worden momenteel getest in klinische trials met het oog op het behandelen van haematologische maligniteiten en solide tumoren (Holleran et al., 2005; Mai en Altucci, 2009). Al deze cytidine analogen zijn competitieve inhibitoren die zich incorporeren in het DNA, daarna een covalente binding vormen met het cysteïne residue in de actieve site van DNMTs en daar vervolgens worden omgezet tot een irreversibele inhibitor van het enzyme. Het resultaat is een covalent DNA-enzymcomplex (Suzuki en Miyata, 2006). De resultaten uit de klinische trials suggereren dat de demethylatie geïnduceerd door deze azanucleoside drugs globaal heel nuttig kan zijn voor het bestrijden en omkeren van de epigenetische wijzigingen die optreden in kanker (Silverman et al., 2002; Wijermans et al., 2008). De niet-nucleoside DNMTi’s zijn kleine moleculen die de DNA-methylatie verhinderen door zich rechtstreeks te binden aan de katalytische site van het DNMT-enzym, zonder zich te incorporeren in het DNA. De inhibitor RG108 werd ontwikkeld door Lyko et al. (2005). Deze molecule verhindert de werking van de DNMTs in vitro. Lage micromolaire concentraties van deze stof induceren significante demethylatie van genomisch DNA zonder enige detecteerbare vorm van toxiciteit, terwijl deze
inhibitor
tegelijk
een
verhoogde
specificiteit
vertoont
voor
hypergemethyleerde
tumorsuppressorgenen. De enige beperking voor gebruik op grotere schaal is het sterk hydrofobe karakter van RG108 (Breuckner et al., 2005). De productie van meer oplosbare derivaten van dit product zal duidelijk maken of het middel praktisch potentieel heeft in de strijd tegen kanker. Daarnaast is er ook procaïnamide, een derivaat van het lokaal anestheticum procaïne, dat DNA demethyleert en zijn antiproliferatieve activiteit via binding aan GC rijke DNA -sequenties uitoefent.. De stof zou volgens Lee et al. ook de affiniteit van DNMT1 voor DNA en SAM verminderen. Procaïnamide is door de Amerikaanse FDA (Food and Drug Administration) reeds goedgekeurd voor een andere toepassing nl. de behandeling van cardiale aritmieën (Zheng et al., 2008).
37
Een studie door Fang et al. (2003) heeft aangetoond dat epigarllocatechin-3-gallaat (EGCG), de fenolcomponent aanwezig in groene thee, zorgt voor een volledige inhibitie van de DNAmethyltransferase activiteit met tegelijk een reactivatie van verschillende epigenetisch uitgeschakelde tumorsuppressorgenen zoals P16INH4A en hMLH1. Het EGCG is ook een sterk oxiderend agens, dus het zou kunnen dat deze effecten echter op een indirecte manier plaatsvinden (Mai en Altucci, 2009). Tot slot blijkt ook hydralazine, een bekend antihypertensivum, een inhibitor te zijn van DNA methylatie (Segura-Pacheco et al., 2003).
6.2.2 Histon deacetylatie: Histon deacetylasen (HDACs) katalyseren de verwijdering van het acetyl gedeelte van de ε-amino groepen van histon lysine residues. Deze enzymes zijn vooral geassocieerd met gecondenseerde chromatine en onderdrukking van transcriptie, maar in enkele zeldzame gevallen zoals de IFN signaaltransductieweg zorgen zij ook voor genactivatie (Guo et al., 2006). HDACs werken samen met histon-acetyltransferasen (HATs) en reguleren de acetylatie status van histonen en andere structuurproteïnen (Vogelstein et al., 2000). Tot op heden zijn er 18 HDACs ontdekt en op basis van fylogenetisch onderzoek werden zij onderverdeeld in 4 klassen. Klasse I en klasse II zijn zinkafhankelijke enzymes. Klasse III is NAD+ -afhankelijk (nicotinamide adenine dinucleotide) en klasse IV is een nieuwe klasse bestaande uit het unieke HDAC11 (Smith et al., 2002; Gao et al., 2002). HDACs spelen een kritische rol bij hermodellering van chromatine en zijn betrokken bij tal van andere biologische processen zoals transcriptie, celdifferentiatie etc. (Gallinari et al., 2007). Overexpressie of defecten in HDACs zouden een mogelijke oorzaak kunnen zijn van carcinogenese. In verschillende kankers zoals leukemie en lymfomen worden HDACs foutief gerekruteerd, wat bijdraagt tot de gewijzigde genexpressie die men in deze ziekten terugvindt. Een algemeen kenmerk van menselijke kankers is een deacetylatie op Lys16 van histon H4 (Zheng et al., 2008). Deze gegevens suggereren dat HDACs een potentieel nuttig doelwit vormen voor nieuwe therapeutische strategieën tegen kanker.
Figuur 9: Schematische voorstelling van histon deacetylatie, gekatalyseerd door het HAT-enzyme. Bron: Zheng et al., 2008.
38
Het werkingsmechanisme van histondeacetylase- inhibitoren (HDACi’s) bestaat uit een interactie met het katalytisch domein van de HDACs waardoor deze enzymen de mogelijkheid verliezen om hun substraat te herkennen. Dit zorgt normaal voor een herstel van de genexpressie (Finnin et al., 2001). De belangrijkste biologische effecten van HDACi’s zijn het onderbreken van de celcyclus, de inhibitie van tumorale groei en angiogenese, de inductie van differentiatie of apoptose in tumorcellen en tot slot zijn HDACi’s in staat om kankers vatbaarder te maken voor chemotherapie (Gent et al., 2006; Nebbioso et al., 2005). De reeds gekende HDACi’s bezitten zo’n variabele origine en structuur, dat de vraag zich stelt en of er ook verschillende werkingsmechanismen in het spel zijn. Tot op heden hebben onderzoekers daar echter nog geen uitsluitsel over kunnen geven Op basis van hun chemische structuur kunnen de inhibitoren van HDAC enzymes klassen I en II onderverdeeld worden in vier groepen:
korte-keten-vetzuren,
benzamiden,
cyclische
tetrapeptiden
en
N-hydroxylamides
(hydroxamzuren) (Lin et al., 2006).
Korte-keten-vetzuren zoals natrium n-butyraat (NaB), dat aanwezig is in onze darmen door bacteriële fermentatie van vezels, zijn niet zo geschikt voor klinische toepassingen. Hun beperkte biologische beschikbaarheid en de benodigde concentraties, in de grootteorde van millimolair, zorgen ervoor dat ze vrij zwakke HDAC inhibitoren zijn. De gekendste HDAC inhiboren uit deze klasse zijn butyraat en valproïnezuur. Zij zijn in staat om zowel in een in vitro als in een in vivo setting tumorale groei te remmen en apoptose van de kankercellen te induceren (Yang et al., 2005). Zo rapporteerden onder andere Gilbert et al. (2001) en Carducci et al. (2001) dat butyraten de groei inhiberen van colonkanker, prostaatkanker en van endometriale en cervicale tumoren. Natrium-valproaat (VPA) verschilt enigszins van de andere korte-keten vetzuren gezien de merkelijk hogere efficiëntie ervan bij het induceren van differentiatie in kankercellen bij patiënten met acute myeloïde leukemie. VPA lijkt wel minder actief te zijn ten opzichte van klasse IIb HDACs (Mai en Altucci, 2009). Het werkingsmechanisme van deze korte-keten-vetzuren als HDACi is echter nog niet volledig opgehelderd.
In cellen behandeld met het hydroxamzuur trichostatine A (TSA) bleken de histonen een extreem hoog niveau van acetylatie verkregen te hebben. Yoshida en collega’s ontdekten vrijwel toevallig dat deze hyperacetylatie niet ontstond door een effectieve verhoging van de acetylering maar wel door daling van de deacetylatie van de histonen. De hydroxamzuren binden karakteristiek aan een zink ion in het katalytisch domein van de klasse I en II HDACs en verhinderen op deze manier de deacetylatie van histonen.
39
TSA bezit een breed spectrum aan anti-kanker effecten (onderbreking van de celcyclus, inductie van differentiatie, anti-HDAC activiteit en de
inhibitie van telomerase) maar kent ook heel wat
neveneffecten (Yoshida et al., 1990), waardoor het nog niet in klinische trials wordt gebruikt (Mai en Altucci, 2009).
Suberoylanilide hydroxamine zuur (SAHA) is het prototype van de tweede generatie HPCs of hybrid polar compounds. Het is een synthetische HDACi en reeds bij lage micromolaire concentraties is het een krachtige inductor van differentiatie en/of apoptose in kankercellen. De chemische structuur van SAHA lijkt op die van TSA, wat voor Richon et al. in 1998 de aanleiding was om SAHA te testen als HDACi. SAHA bleek een sterke inhibitor van de HDAC-activiteit. Net zoals TSA inhibeert SAHA de enzymes HDAC1,-2,-3,-4,-6,-7,-9 en heeft het een zwakkere werking op HDAC8 (Khan et al., 2008). SAHA werd in oktober 2006 door het Amerikaanse FDA goedgekeurd voor de behandeling van huidmanifestaties in patiënten met cutaneuze T-cel lymfoma (CTCL) die af te rekenen hebben met progressieve, persistente of recurrente vormen van de ziekte. Het werd op de markt gebracht onder de naam Vorinostat. Voorbeelden van bijkomende agentia die een hydroxamzuur bevatten en zowel een antiproliferatieve als HDAC-inhibitorische activiteit bezitten zijn: m-carboxycinnamic zuur bishydroxamide (CBHA), oxamflatin, , pyroxamide hydroxamic zuur (PAHA), panobinostat PDX101 en LAQ824. Al deze producten worden momenteel gebruikt in preklinische of klinische trials (Monneret, 2005). Panobinostat zit momenteel in fase II/III klinische trials voor chronische myeloïde leukemie, refractair CTCL en multiple myeloma (MM/ziekte van Kahler) (Qian et al., 2008).
Wat de benzamiden betreft zijn MS-275
en MGCD-0103 twee van de bekendste synthetische
HDACi’s. Na orale toediening inhibeert MS-275 sterk de tumorale groei, alsook zijn er reeds onderzoeken gepubliceerd die aantonen dat MS-275 apoptose induceert in prostaatkankercellen, acute myeloïde –en B-chronische lymfocytische leukemische cellen en in Jurkat lymfoblastische T-cellen (Lucas et al., 2004; Qian et al., 2007). MGCD-0103 is een recenter ontwikkelde benzamide. Het agens doorloopt momenteel fase II klinische trials voor de behandeling van hematologische maligniteiten en fase I/II trials voor solide tumoren (Fournel et al., 2008).
De groep van de cyclische tetrapeptiden zijn structureel de meest complexe HDAC-inhibitoren van de vier en inhiberen HDAC reeds bij nanomolaire concentraties (Itoh et al., 2008). Het cyclisch peptide romidepsine (FK-228) oefent zijn werking uit via een gereduceerde vorm (redFK) en is eigenlijk een natuurlijke en stabiele pro-drug, die door cellulaire reductie wordt geactiveerd (Furumai et al., 2002). Romidepsine induceert een onderbreking van de celcyclus en apoptose in heel wat verschillende kankers. Bovendien is het in staat om, wanneer men te maken heeft met hormoonrefractair prostaatcarcinoom, het effect van gemcitabine (een veelgebruikt chemotherapeuticum) te versterken.
40
Momenteel lopen er voor romidepsine klinische trials met betrekking tot chronische myeloïde leukemie, acute myeloïde leukemie en cutaneuze T-cel lymfoma (Byrd et al., 2005; Piekarz et al., 2006).
Integenstelling tot HDAC-inhibitoren voor HDAC klassen I, II en IV zijn de inhibitoren van klasse III HDACs veel minder farmacologisch ontwikkeld. Klasse III HDACs of sirtuïnes spelen o.a. een rol in genuitschakeling en reguleren transcriptiefactoren zoals tumorproteïne 53 (P53), tumorproteïne 73 (p73) en BCL-6 (Lamming et al., 2004). De deacetylatie van p53 en p73 onder invloed van Sirtuine-1 (gecodeerd door het SIRT-1 gen) onderdrukt de expressie van apoptose-inducerende genen en deacetylatie van het BCL-6 proteïne doet de oncogene activiteit ervan stijgen (Bradbury et al., 2005). Deze gegevens, gecombineerd met het feit dat SIRT1 opgereguleerd is in longkanker, prostaatkanker en leukemie benadrukken het potentiële nut van SIRT-inhibitoren als kankermedicatie. Er bestaat een handvol molecules die de enzymatische activiteit van de klasse III HDACs (de sirtuïnes) moduleert. Voorbeelden hiervan zijn sirtinol, splitomicine en nicotinamide. Van sirtinol werd aangetoond dat het de groei stopzet van MCF-7 borstkanker -en H1299 longkankercellen (Ota et al., 2006). Voor het overige moeten de therapeutische mogelijkheden van deze inhibitoren nog sterk worden onderzocht. Het merendeel van de tot nu toe ontwikkelde HDAC-inhibitoren (vb. SAHA) zijn pan-HDACinhibitoren, wat betekent ze geen specificiteit bezitten voor één individueel HDAC enzym, maar meteen alle HDACs van klasse I en II inhiberen. De ontwikkeling van HDAC-inhibitoren die isovorm specifiek zijn en het bepalen of dergelijke selectieve inhibitie van een HDAC enig therapeutisch voordeel biedt, zijn hoofdzakelijk toekomstmuziek (Zheng et al., 2008). De moeilijkheid ligt hem in het gedeelde katalytisch mechanisme en de hoge graad van homologie die er heerst tussen de katalytische domeinen van klasse I en klasse II HDACs (Lin et al., 2006). Het exacte mechanisme dat de HDAC inhibitoren gebruiken om hun antitumorale activiteit uit te oefenen is nog steeds niet helemaal duidelijk. Eén mogelijkheid is dat hyperacetylatie van de histonen, geïnduceerd door de inhibitoren, leidt tot instabiliteit van het genoom, wat op zijn beurt de cel aanzet om over te gaan tot apoptose (Yoo en Jones, 2006).
Heel wat aandacht van het kankeronderzoek richt zich tevens op het synergistisch effect dat verkregen wordt wanneer men HDAC-inhibitoren en chemotherapie gecombineerd gebruikt. Cruciaal in het slagen van dergelijke trials is een beter begrip verwerven over het actiemechanisme dat de HDACinhibitoren hierbij hanteren. Op basis van preklinische data rijst het vermoeden dat decondensatie van chromatine, door HDAC-inhibitoren gemedieerd, de gevoeligheid voor chemotherapeutica verhoogt (Mai en Altucci, 2009). Of deze aanpak uiteindelijk zal leiden naar superieure therapieën met een sterkere antitumorale activiteit en selectiviteit is een vraag die waarschijnlijk de komende jaren zal worden beantwoord.
41
6.2.3 Histon acetylatie: Histon acetyltransferasen (HATs) katalyseren de acetylatie van histonen, waarbij ze een acetylgroep afkomstig van acetyl-CoA overzetten naar de lysineresidues aanwezig in histonen. Deze lysineacetylatie destabiliseert de structuur van het nucleosoom en zorgt ervoor dat de chromatine terechtkomt in een transcriptioneel actieve status (Luo et al., 2006). HATs kunnen onderverdeeld worden in verschillende families zoals de GNAT superfamilie, de MYST familie, de TFIIIC familie en de P300/CBP familie (Vetting et al., 2005). Welke rol HATs nu precies spelen bij de ontwikkeling van kanker kan niet veralgemeend worden. Afhankelijk van het type tumor en in welk ontwikkelingsstadium deze zich bevindt, kan een HAT zowel als een tumoractivator of als een tumorsuppressor functioneren.
Figuur 10: Schematische voorstelling van histon acetylatie, gekatalyseerd door het HDAC-enzyme. Bron: Zheng et al., 2008.
Een globaal verlies aan acetylatie van het gen H4K16 wordt geassocieerd met tumorigenese. MOF (males-absent on the first), een HAT behorend tot de MYST familie en aanwezig in het MSL (malespecific lethal) complex, is verantwoordelijk voor de meerderheid van de genoomwijd verspreide acetylatie van H4K16 (Lee en Workman, 2007).
De HATs CBP en P300 zijn vermoedelijk
tumorsuppressors. Suggestief hiervoor is de associatie van CBP en P300 mutaties met heel wat verschillende kankers en ziekten (Ohta et al., 2007). Verschillende HATs zoals P300, PCAF en TIP60 zijn in staat de transcriptionele activiteit van het TP53 tumorsuppressorgen te wijzigen (opregulatie). Echter, misregulatie van HAT activiteit wordt gelinkt aan de ontwikkeling en progressie van leukemieën (Cairns, 2001).
42
Chromosomale translocatie van de genen die coderen voor CBP of P300 met genen die coderen voor andere HAT proteïnen zoals MOZ (monocytische leukemie zink vinger) of MOZ-gerelateerde factor (MORF) induceren leukemieën via de vorming van MOZ- en MORF- P300/CBP fusie proteïnen. Dergelijke fusie proteïnen kunnen zorgen voor zowel een toename als afname in functie bij genexpressie (gain-of-function en loss-of-function) (Inche en La Thangue, 2006). Hoe dan ook is het finale resultaat een verstoorde regulatie van de celcyclus, wat uiteindelijk zorgt voor de ontwikkeling van kanker. Mutatie in CBP is eveneens de genetische basis van het Rubinstein-Taybi syndroom, een complexe stoornis die gekend staat om zijn hoge incidentie van neoplasieën (Mai en Altucci, 2009). Deze klinische observaties tonen nog eens extra aan dat HAT enzymes een belangrijk doelwit vormen met betrekking tot kankertherapie.
De afgelopen jaren zijn er heel wat pogingen geweest om synthetische HAT-inhibitoren te ontwikkelen. De eerste HAT-inhibitoren waren twee bisubstraat analogen: Lys-CoA en H3-CoA-20. De nadelen van deze inhibitoren zoals hun lage cellulaire permeabiliteit en metabolische instabiliteit zorgen ervoor dat ze niet zo geschikt zijn voor in vivo onderzoek, maar zij zijn talrijk gebruikt bij in vitro studies (Costanzo et al., 2000). Daarna identificeerden Balasubramanyam en medewerkers (2003) drie natuurlijke substanties die een inhiberende werking bleken te hebben op HAT enzymes. Anacardisch zuur, een derivaat van salicylzuur, inhibeert op een niet-speficieke manier zowel P300 als PCAF, maar kent een zeer slechte celdoorlaatbaarheid. Garcinol, een benzofenon derivaat, inhibeert P300 en PCAF zowel in vitro als in vivo en kent dus een goede celpermeabiliteit. Het agens is in staat om apoptose te induceren in HeLa cellen (een onsterfelijke cellijn afgeleid van cervixkankercellen). Curcumine is een P300/CBP specifieke inhibitor en kan de HAT activiteit van PCAF niet beïnvloeden. Het heeft een anti-kanker activiteit, maar de gehanteerde moleculaire mechanismen om celgroei te inhiberen en apoptose te induceren worden nog steeds niet helemaal begrepen.
Shankar en Srivastava hebben recentelijk (2007) aangetoond dat curcumine apoptose induceert in prostaatkanker via de activatie van verschillende signaaltransductiewegen met enerzijds geïnduceerde expressie van pro-aoptotische proteïnen (Pax, Bak, PUMA, Noxa) en anderzijds een geinhibeerde expressie van anti-apoptotische proteïnen (Bcl-2, Bcl-xL). Naast deze natuurlijke stoffen zijn er ook een aantal kleine moleculen beschreven als HAT-inhibitor. De groep van Giannis en collega’s ontwikkelde MB-3, een γ-butyrolactone, dat fungeert als een kleine, celpermeabele inhibitor van het menselijke Gen5. Het vertoont slechts een zwakke inhibitie van CBP en GCN5, maar zou wel eens kunnen dienen als hoofdstructuur, waarvan krachtigere GCN5 inhibitoren kunnen worden afgeleid (Biel et al., 2004).
43
Een reeks isothiazoles bleek de activiteit van P300 en PCAF tegen te gaan en vertoonde eveneens antiproliferatieve activiteit tegen verschillende colontumor –en ovariatumor cellijnen (Stimson et al., 2005). Tot slot bestaat er een groep quinolone-derivaten die eveneens HAT-inhibitorische activiteit bezitten en tegen U937 leukemische cellen een effect vertonen op de celcyclus en apoptose (Smith et al., 2007).
In tegenstelling tot de beschikbare kennis over de antikanker effecten van HDAC-inhibitoren, werden de antitumorale effecten van HAT-inhibitoren tot nu slechts met mondjesmaat bestudeerd. Vermoedelijk komt dit doordat HAT-inhibitoren nog steeds stukken minder efficiënt zijn dan HDACinhibitoren. De twee meest veelbelovende agentia zijn curcumine en anacardisch zuur. Wat betreft curcumine bestaan de centrale antikanker activiteiten uit een onderdrukking van cycline D1, activatie van CASP 8, suppressie van de NF-κB activiteit en vertoont de stof chemopreventieve en therapeutische activiteit tegen heel wat tumortypes (Shishodia et al., 2007). Anacardisch zuur zou kankercellen sensitizeren voor ionizerende straling en zou antioxiderende effecten vertonen, eveneens van sterk nut in de strijd tegen kanker (Trevisan et al., 2006; Sun et al., 2006).
6.2.4 Histon (lysine/arginine) methylatie: Ook de methylatie van histonen speelt een belangrijke rol als epigenetisch regulatiemechanisme. Dit proces brengt namelijk stabiele genexpressiepatronen tot stand. Methylatie van histonen kan op twee verschillende manieren gebeuren. Het proces kan gebeuren via de methylatie van een lysine (K) of via methylatie van een arginine (R) residu. De processen worden gakatalyseerd door respectievelijk lysine-methyltransferases (HKMTs) en door proteïne argininemethyltransferases (PRMTs) (Lee et al., 2005). Net zoals bij de DNA methylatie is het AdoMet die de methylgroep levert maar het uiteindelijke resultaat van deze epigenetische modificatie is niet éénduidig en varieert van transcriptionele activatie tot genuitschakeling
De verantwoordelijke voor de lysinemethylatie is het zogenaamde SET-domein. Dit evolutionair geconserveerde domein is aanwezig in alle HKMTs behalve Dot1 en Dot1L (Jenuwein, 2001). De methylatietoestand van het lysineresidu (mono, -di –of trigemethyleerd) zorgt voor functionele diversiteit.
44
Figuur 11: Schematische voorstelling van histon-lysinemethylatie en -demethylatie. De methylatie wordt gekatalyseerd door een HKMT-enzyme en de demethylatie wordt gekatalyseerd door één van de demethylasen. Bron: Zheng et al., 2008.
Verschillende HKMTs spelen in rol in de pathogenese van ziektes en vooral dan in deze van kanker. Zo is een overexpressie van het EZH2 geassocieerd met maligniteiten zoals borstkanker, prostaatkanker, multiple myeloma en lymfomen en kunnen herschikkingen van het MLL gen (met vorming van fusieproteïnen) in verband gebracht worden met agressieve acute leukemieën (Hwang et al., 2008). Verder kunnen in kankercellen, ter hoogte van de promotorregio van foutief uitgeschakelde tumorsuppressorgenen, repressief gemethyleerde histonen (lysines) gevonden worden (Baylin en Ohm, 2006). Dergelijke respressieve histonlysinemethylatie en de HKMT enzymes ervoor verantwoordelijk vormen eveneens potentiële doelwitten voor de ontwikkeling van kankermedicatie. Vooral het gedimethyleerd histon H3 lysine 9 (H3K9me2) is van cruciaal belang. Het is namelijk deze merker die verwijderd blijkt te zijn uit te promotorregio’s van gereactiveerde tumorsuppressorgenen na een behandeling met DNMT –en HDAC-inhibitoren (McGarvey et al., 2006).
Tot op de dag van vandaag zijn er echter nog maar drie agentia beschreven die interageren met specifieke HKMTs. Het waren Imhof en collega’s die in 2005 rapporteerden dat chaetocine een inhibitorische activiteit uitoefende op de SUV39 familie van de HKMTs (SUV39, G9a en DIM5) waarbij dit chaetocine zich als een competitieve inhibitor van AdoMet gedraagt (Greiner et al., 2005). De stof bleek hierdoor anti-kankereigenschappen te vertonen tegen multiple myeloma. Integenstelling tot chaetocine inhibeert BIX-01294 het methyltransferase G9a, zowel in vivo als in vitro, op een nietcompetitieve manier, door waarschijnlijk enkel te binden met het enzym-cofactorcomplex van Adomet (en niet met het vrije enzym) (Kubicek et al., 2007). Hoewel het enzyme G9a niet rechtstreeks gecorreleerd is met tumorigenese is het (zoals reeds eerder vermeld) wel zijn product (H3K9me2) dat verwijderd blijkt te zijn uit de promotors van verschillende tumorsuppresorgenen na een behandeling van kankercellen met DNMT –en HDAC-inhibitoren (McGarvey et al., 2006).
45
Gezien deze verwijdering overeenstemt met een transcriptionele stimulatie en reactivatie van de tumorsuppressorgenen zou een specificieke G9a-inhibitor wel bruikbaar zijn voor het hele onderzoeksgebied rond kanker. Tot slot hebben we de S-adenosylhomocysteïne hydrolase inhibitor 3deazaneplanocin A (DZNep), die via de depletie van PRC2-proteïnen en selectieve inhibitie van H3K27-methylatie, apoptose induceert in borstkanker MCF-7 –en colorectale HCT116-cellen (Tan et al., 2007). BIX-01338 is dan weer een niet-specifieke inhibitor die competitief is met Adomet en de methylatie-activiteit van bijna alle HKMTs beïnvloed. Dit agens zou gebruikt kunnen worden als paninhibitor van de HKMTs (Zheng et al., 2008).
Zoals eerder aangegeven kunnen de methylgroepen ook gekoppeld worden aan arginine residues. Totnogtoe zijn er acht PRMT-enzymes (PRMT 1-8) geïdentificeerd en deze worden opgedeeld in twee klassen nl. type I enzymes (PRMT 1,3,4,6,8) en type II enzymes (PRMT 5 en 7) (Zhang et al., 2001). Type I PRMTs katalyseren de overdracht van de methylgroep afkomstig van AdoMet naar de arginine
residues
met
vorming
van
monomethylarginines
(MMA)
en
asymmetrische
dimethylargininestaarten (aDMA). Type II PRMT’s katalyseren de vorming van MMA en symmetrische dimethylargininestaarten (sDMA). Vele van deze PRMTs zijn heel substraatspecifiek en methylatie van het uiteindelijke doelwitsubstraat kan uiteindelijk gepaard gaan met genactivatie, maar ook met genrepressie (Bedford en Richard, 2005).
Figuur 12: Schematische voorstelling van histon arginine methylatie. De reactie wordt gekatalyseerd door een PRMT enzyme. Tot op heden zijn er nog geen histon arginine demethylasen (HRDM) geïdentificeerd. Bron: Zheng et al., 2008.
46
Tot zover zijn er in tumorcellen geen mutaties ontdekt van de PRMT-enzymes. Echter, in vergevorderde borsttumoren en hormoonafhankelijke prostaattumoren valt er wel een overexpressie te bespeuren van het coactivator geassocieerde arginine methyltransferase (CARM 1/PRMT4) (El Messaoudi et al., 2006). Inhibitoren van PRMTs zouden dus wel degelijk een klinische rol kunnen spelen bij de behandeling van kanker. Een bijkomende aanwijzing hiervoor is het feit dat PRMT 5 een rol speelt in de regulatie van de expressie van tumorsuppressorgenen (Pal et al., 2004). Heel veel PRMT-inhibitoren werden er nog niet gerapporteerd. Het merendeel van deze inhibitoren zijn analogen van AdoMet (bijv. Sinefungin, S-adenosylhomocysteïne/SAH, methylthioadenosine (MTA)) (Huang, 2002). Dit betekent dat deze stoffen zorgen voor een niet-specifiek inhibitiorisch effect, aangezien AdoMet ook door heel wat andere methyltransferasen (DNMT, HKMT,...) als cofactor wordt gebruikt (Mowen et al., 2004). In een studie uitgevoerd in 2004 ontdekten Bedford et al. ook een specifieke inhibitor van proteïne arginine methyltransferasen: AMI-1. AMI-1 vertoont geen inhibitorische invloed op de activiteit van lysine methyltransferasen, gaat niet in competitie voor de AdoMet bindigssite op een PRMT en werkt selectief in op PRMT-1.
6.2.5 Histon (lysine/arginine) demethylatie: Bij het proces van histondemethylatie worden methylgroepen verwijderd van specifieke lysineresidues. Aangezien het allereerste lysine demethylase (LSD1) pas gerapporteerd werd in 2004, kunnen we de ontdekking van histonlysinedemethylasen als een recent gegeven beschouwen (Shi et al., 2004).
LSD1 of het lysine-specifiek demethylase 1 kan specifiek het H3K4me 1/2 demethyleren en wordt geassocieerd met onderdrukking van transcriptie, maar heeft geen effect op getrimethyleerd H3K4 (H3K4me3). Het enzyme is FAD-afhankelijk en stelt bij de reactie formaldehyde en waterstofperoxide vrij. De activiteit van LSD1 kan beïnvloed worden door bijkomende modificaties op ditzelfde H3 substraat. Zo zal de acetylatie van H3K9 de katalytische activiteit van LSD1 verhogen, terwijl fosforylatie van Ser10 de activiteit inhibeert. In normaal prostaatweefsel, maar ook in een prostaattumor co-localiseert LSD1 met de androgeenreceptor (AR), een nucleaire receptor en transcriptiefactor. Zowel in vivo als in vitro interageert LSD1 met deze androgeen receptor en stimuleert zo de transcriptie van AR-afhankelijke genen zoals PSA en kallikreïne 2. Om dit mogelijk te maken, wijzigt de AR blijkbaar de specificiteit van LSD1 van H3K4 naar H3K9. Logischerwijs zou een inhibitor van dit LSD1 dan ook de androgeen geïnduceerde transcriptie en activatie tegenwerken, wat nieuwe mogelijkheden biedt bij therapie van prostaatkanker (Forneris et al., 2005; Metzger et al., 2005).
47
In 2006 werd gerapporteerd dat verschillende proteïnen van de JmjC familie (proteïnen die een Jumonji domein bevatten) histondemethylatie activiteiten vertoonden. Allen gebruiken ze Fe (II) en αketoglutaraat als cofactoren. JmjC domein-bevattend histon demethylase 2A (JHDM2A) demethyleert H3K91/2, interageert eveneens met de androgeenreceptor en draagt zo bij tot AR-gemedieerde genactivatie. Aangezien deze familie van proteïnen vrij groot is (reeds meer dan 100 enzymen werden reeds geïdentificeerd) is de kans groot dat er meer en meer histondemethylasen zullen opduiken die zich richten naar verschillende specfieke lysine residues (Tsukada et al., 2006).
Histon lysine demethylasen spelen zeker een rol bij kankers. Verlies van de trimethylatie op Lys20 en van de acetylatie op Lys 16 van histon H4 is een veelgezien hoofdkenmerk van tumorale processen (Fraga et al., 2005). Volgens een recent raport zou LSD1 zelfs dienst kunnen doen als een nieuwe biomarker die voorspellend zou zijn voor agressieve prostaatkanker (Kahl et al., 2006). Daarnaast is het JMJDC2 ewit van de JmjC familie geassocieerd met oesofagaal squameus cel carcinoma en zorgt een neerregulatie van dit eiwit voor een inhibitie van celproliferatie (Cloos et al., 2006). Dit alles wijst erop dat inhibitoren van histonlysinedemethylasen gebruikspotentieel hebben bij de behandeling van kanker. Structureel lijkt LSD1 heel erg op monoamine oxidase (MAO). Het is daarom ook geen verrassing dat pargyline, een bekende inhibitor van MAO, de demethylatie van H3K9 door LSD1 en meteen dan ook de daaropvolgende AR-afhankelijke transcriptie, blokkeert (Zheng et al., 2008). Tot slot hebben we de biguanide –en bisguanidine polyamine analogen die in coloncarcinomen krachtige inhibitoren zijn van LSD1 en die de herexpressie beïnvloeden van meerdere foutief onderdrukte genen, die belangrijk zijn bij de ontwikkeling van colonkanker (Huang et al., 2007). Ontwikkeling van nieuwe modulatoren van histondemethylasen wordt dan ook sterk aanbevolen!
Alle bovenstaande informatie en uitdieping handelt echter alleen over demethylatie van lysine residues. Het is nog steeds niet helemaal zeker of arginine methylatie reversibel is en of er eigenlijk wel een argininedemethylase bestaat. De deïminatie van gemethyleerde arginines door peptidyl arginine deiminasen 4 (PADI4, PAD4) werd wel reeds gerapporteerd (Cuthbert et al., 2004). Deïminatie of citrullinatie is de term die gebruikt wordt voor de post-translationele modificatie van arginine naar het aminozuur citrulline. Deze reactie heeft echter niets te maken met de vorming van citrillune als vrij aminozuur, een proces dat onderdeel is van de normale ureumcyclus. De PAD familie bestaat uit vijf types, met PAD4 als de enige onder hen die zich in de nucleus bevindt. De deiminatie door PAD4 is een calciumafhankelijk hydrolytisch proces (Nakashima et al., 2002). PAD4 converteert niet-gemethyleerde of monogemethyleerde arginine residues van R2, R8, R17 en R26 in de H3 en H4 staarten en reguleert zo mee oestrogeenafhankelijke gentranscriptie. PAD4 antagoneert de arginine methylatie uitgevoerd door PRMT4 en is ook in staat geninductie die gemedieerd wordt via hormoonreceptoren te onderdrukken (Hagiwara et al., 2005).
48
De deiminatie van monogemethyleerde arginines tot citrulline door PAD4 is een irreversibel proces omdat citrulline geen standaard aminozuur is en daarom ook niet op een directe manier kan uitgewisseld worden met arginine. Citrulline zou dan eerst gerecycleerd moeten worden door een soort aminotransferase (Denman, 2005). Inhibitoren van PAD4 zijn bijvoorbeeld F- Amidine, Benzoyl, -mono –en dimethyl-arginine (Bz-ADMA).
6.2.6 Histon fosforylatie: Fosforylatie is een proces dat alle histonen ondergaan en het speelt belangrijke rollen bij controle van de celcyclus en transcriptie. De mitotische fosforylatie van H3 wordt gekatalyseerd door Aurora kinasen (Aurora A, B, C) en de fosforylatie van H2AT119, eveneens tijdens mitose, door nucleosomaal histon kinase-1 (NHK-1). Het zijn vooral Aurora A en B die in heel wat verschillende maligne tumoren tot overexpressie worden gebracht. Aurora B fosforyleert serines op H3 en gedraagt zich in humane kankers als een oncogen (Sakakura et al., 2001; Nowak et al., 2004). Om deze redenen vormen de Aurora-kinasen een nieuw potentieel doelwit bij de ontwikkeling van medicatie. Ditchfield et al. (2003) rapporteerden dat ZM447439 selectief de enzymatische activiteit van aurora A en B inhibeert. Het merendeel van de andere proteïnekinasen worden er echter niet door beïnvloed. Daarenboven is de stof in staat om condensatie van chromosomen tegen te houden en blokkeert ze de assemblage en integratie van de mitotische spoelfiguur. Een andere inhibitor, VX-680, oefent zijn inhiberende werking uit op alle aurora-kinasen en kan de progressie van de celcyclus blokkeren, apoptose in kankercellijnen induceren en tumorgroei vertragen (dit laatste element werd nog maar enkel aangetoond in xenograft modellen) (Harrington et al., 2004). Het agens bevindt zich momenteel in fase II van de klinische trials. Deze inhibitoren van aurora kinasen kunnen selectieve toxiciteit vertonen tegenover proliferende tumorcellen, wat op zich heel wat nieuwe deuren opent in het onderzoek naar nieuwe medicijnen.
Figuur 13: Schematische voorstelling van histon fosforylatie en defosforylatie. De fosforylatie wordt gekatalyseerd door een kinase, de defosforylatie door een fosfatase enzym. Bron: Zheng et al., 2008.
49
6.2.7 Histon defosforylatie: De defosforylatie reactie wordt gekatalyseerd door fosfatasen. Het serine/threonine proteïne fosfatase PP1 en PP2A zijn geassocieerd met de defosforylatie van H2A en H3 (Nowak et al., 2003). Er zijn zowel natuurlijke als synthetische inhibitoren van deze enzymen beschikbaar. Velen ervan werken specifiek in op PP1 en PP2A. Zo inhiberen okadaïsch zuur en fostriecine PP1 en PP2A. Belangrijker is echter het feit dat verschillende fosfatase-inhibitoren zoals okadaïsch zuur, fostriecine en calyculine A sterke anti-tumorale eigenschappen bezitten voor heel wat verschillende tumorale cellijnen (Leopold et al., 1984; Kato et al., 1986; Sakurada et al., 1992).
6.2.8 Poly (ADP-ribosyl)atie en de-poly(ADP-ribosyl)atie: Poly(ADP-ribose) (PAR) merkers worden door het poly(ADP-ribose)polymerase enzymen (PARPs) op histonen aangebracht. De PARP-familie telt meer dan 18 leden, met PARP-1 als het meest intensief bestudeerde lid. PARP-1 katalyseert de splitsing van NAD+ in nicotinamide en ADP-ribose. Vervolgens polymeriseert het enzym dit ADP-ribose met acceptorproteïnen (bijvoorbeeld de histonen) (Klenova et al., 2005). Dit is een dynamisch en omkeerbaar proces. PAR wordt gekatabolyseerd door het afbraakenzym PARG en en ADP-ribosyl proteïne lyase. PARG is onmisbaar voor normale cellulaire groei en functie en tot op heden zijn er nog steeds geen PARG homologen ontdekt (Zheng et al., 2008). Poly(ADP)-ribosylatie van histonen heeft een bevorderend effect op transcriptie en maakt genen meer toegankelijk voor de transcriptionele machinerie (Decker et al., 2002). Deficiënties van de PARP enzymen onderdrukken de expressie van heel wat genproducten zoals TNF-α (tumor necrose factor α), INF γ (interferon gamma), intercellulaire adhesie molecule-1 en P-selectine. Dysfunctie van het PARP-1 is gecorreleerd met carcinogenese en PARP-1 wordt eigenlijk beschouwd een tumorsuppressor. Daarentegen wordt er in orale tumoren wel een verhoogde Poly(ADP)-ribosylatie gevonden (Masutani et al., 2003).
Voor zowel PARP als PARG bestaan er inhibitoren. Derivaten van tannine kunnen reeds al in heel kleine hoeveelheden PARG inhiberen. De beschikbare PARP-inhibitoren kunnen gegroepeerd worden in drie categorieën. Klasse I bevat de monoarylamides zoals nicotinamide en 3-aminobenzamide (3AB). De stoffen in klasse II, de isoquinolines, zijn iets potenter dan 3-AB. Klasse III bevat nieuwe, variabele structuren. Klasse I en klasse II functioneren als competitieve inhibitoren die de binding van NAD+ aan het katalytisch domein van het PARP enzyme blokkeren. De derde klasse gedraagt zich als niet-competitieve inhibitoren (Jagtap en Szabo, 2005). Aangezien PARP-1 belangrijk is bij herstel van DNA zal inhibitie ervan de DNA-repair onderdrukken en apoptose van tumorcellen bevorderen.
50
Daarenboven zijn PARP-inhibitoren in staat om het cytotoxische effect van van DNA-methylerende agentia te potentiëren en versterken ze het anti-tumorale effect van straling (Chalmers et al., 2004; Yung et al., 2004; Calabrese et al., 2004). Verschillende inhibitoren (3-AB, PJ-34, tricyclisch benzimidazole, etc.) doorlopen momenteel verschillende stages van klinische en preklinische trials betreffende de therapie van inflammatie, cardiovasculaire ziekten en kanker (Woon en Threadgill, 2005).
6.2.9 Ubiquitinylatie en sumoylatie: Dit zijn twee posttranslationele modificaties die verwant zijn met elkaar. Ubiquitinylatie wordt gekatalyseerd door een reeks van verschillende enzymen: ubiquitine activerend enzyme Uba1 (E1), ubiquitine-conjugerend enzyme (Ubc/E2) en ubiquitine ligase (E3). De reversibele reactie verloopt met behulp van de-ubiquitinylerende enzymen (DUBs). Ub-H2A is een epigenetische merker geassocieerd met genrepressie (Osley et al., 2006). Een SUMOylatie verloopt in zoogdieren met behulp van sentrine-specifiek protease (SENP) en is reversibel. SUMO wordt door Ulp/SENP van substraten verwijderd (Yeh et al., 2000). In de meeste gevallen correleert SUMOylatie van histonen met onderdrukking van transcriptie waarbij SUMO de functie van transcriptiefactoren wijzigt door co-repressoren zoals HDACs te recruteren en door de (sub)nucleaire localisatie te veranderen (Gill, 2005).
Het ubiquitine is betrokken bij de pathogenese van uiteenlopende ziekten, inclusief kanker, virale infecties, stoornissen van het centrale zenuwstelsel, en metabolische dysfuncties (Wong et al., 2003). Aangezien E3 ligase de primaire determinant is van substraatspecificiteit en het enzym een kritieke rol speelt in cellulaire processen die verband houden met celproliferatie en tumorigenese, is het logisch dat het enzym een belangrijk doelwit vormt voor modulatie. Voorbeelden van stoffen die de werking van het E3 ligase tegenwerken, zijn phenylarseenoxiden en Ro106-9920 (Pray et al., 2002).
51
6.3 Niet-covalente mechanismen.
6.3.1 Nucleosoomhermodellering: Zoals
reeds
vermeld
wijzigen
ATP-afhankelijke
chromatine
hermodelleringsenzymes
de
chromatinestructuur op een niet-covalente manier. Deze eiwitcomplexen reguleren heel wat cellulaire processen zoals bijvoorbeeld de regulatie van transcriptie, de respons op DNA-schade en de DNAreplicatie. Ontregeling van eender welke van deze processen kan dus uitmonden in neoplasie en tumorigenese. De laatste jaren zijn er meer en meer bewijzen opgedoken die de ontregeling van deze complexen duidelijk in verband brengen met de pathogenese van kankers.
SNF5 is één van de kern subeenheden van het SWI/SNF hermodelleringscomplex en volgens recente genetische studies is het eveneens een tumorsuppressor. In de sommige epitheloïde sarcomen en in de meerderheid van de maligne rhabdoïde tumoren (agressieve tumoren van de nieren, longen of hersenen bij kinderen) blijkt het SNF5 gen bi-allelisch verloren te zijn gegaan. Hoe SNF5 zijn tumorsuppressorfunctie uitoefent blijft echter nog een raadsel (Muntean en Hess, 2009). BRG1 en BRM, de ATPase subeenheden in de SWI/SNF complexen bevatten eveneens tumoronderdrukkende eigenschappen. Er wordt bi-allelisch verlies van het BRG1 gen teruggevonden in prostaatkanker, longkanker, borstkanker en pancreaskanker. Gelijktijdig verlies van zowel BRG1 als BRM wordt dan weer gezien in ongeveer 10% van de niet kleincellige longkankers. De hoeveelheid gegevens die een verband aanduiden tussen kanker en het SWI/SNF complex blijft aanzwellen, maar de onderliggende mechanismen van de kankerontwikkeling die in verband staan met de SWI/SNF gemedieerde chromatine hermodellering moeten nog bepaald worden (Cho et al., 2004; Keppler en Archer, 2008). Met betrekking tot het NuRD/Mi-2/CHD complex, hebben Bagchi en collega’s in 2007 aangetoond dat CHD5 (één van de ATPase subunits van het complex) op de locus 1p36, een tumorsuppressor gen is. Wijzigingen in de corresponderende locus bij muizen deed muizen ontstaan die heel vatbaar waren voor spontane ontwikkkeling van tumoren. Een ander onderdeel van dit hermodelleringscomplex zijn de zogenaamde MTA-proteïnen (metastase geassocieerd): MTA1 en zijn homologen MTA2 en MTA3. Overexpressie van MTA1 wordt waargenomen bij meer dan 30% van de primaire oesofagale, colorectale en maagcarcinomen en is heel sterk geassocieerd met invasief gedrag. De expressie van het eiwit MTA3 vertoont sterke correlatie met de expressie van oestrogeen recepteren in borstkanker. Daarenboven interageert MTA3 met het proto-oncogen BCL-6, het meest gemuteerde gen in nonHodgkin lymfomen (Fujita et al., 2004). Inhibitoren van deze interactie zouden dus best mogelijk een therapeutisch voordeel kunnen bieden. Desondanks is het niet duidelijk of chromatine hermodellering met behulp van het NuRD/Mi-2/CHD complex vereist is om aanleiding te geven tot de kankers die geassocieerd zijn met foutieve MTA3 expressie.
52
In gisten leidt de verstoring van de INO80 hermodelleringscomplexen tot overgevoeligheid aan DNA beschadigende agentia zoals UV licht en alkylatoren. Daarenboven vergroot INO80 gemedieerde chromatinehermodellering bij gisten de toegankelijkheid van DNA voor de herstelmachinerie en vergemakkelijkt ze tegelijk ook de vorming van enkelstrengig DNA (ssDNA). Momenteel worden de meeste functionele studies vooral uitgevoerd met gisten. Dit gebiedt ons de grootste voorzichtigheid te hanteren wanneer parallellen worden doorgetrokken naar zoogdieren (Czaja et al., 2010).
Desondanks
het
groeiende
bewijs
dat
er
een
verband
bestaat
tussen
chromatine
hermodelleringscomplexen en tumorigenese, is er nog geen direct bewijs beschikbaar dat dergelijke hermodellering een causale rol toebedeelt in de ontwikkeling van kankers. Zoals eerder vermeld, zijn mutaties in SNF5, BRG1 of BRM sterk geassocieerd met tumorigenese. Waarschijnlijk zorgen al deze mutaties voor een verstoring van de SWI/SNF complex gemedieerde chromatinehermodellering. Verlies van SNF5, BRG1 of BRM resulteert echter telkens in verschillende types van kanker met verschillende gradaties van ernst (Reisman et al., 2009). In het licht van deze context is het gerechtvaardigd de vraag te stellen of ATP-afhankelijke chromatinehermodellering werkelijk verband houdt met tumorigenese. Is er, gezien de verschillende kankertypes, misschien een weefselspecifieke expressie
van
verschillende
hermodelleringscomplexen?
Het
blijft
onduidelijk
of
chromatinehermodellering op zich verantwoordelijk kan zijn voor een kanker fenotype.
53
V. DISCUSSIE Een grote hoeveelheid gegevens toont aan en bewijst dat er een verband bestaat tussen epigenetische veranderingen en de pathogenese van verschillende ziekten. Het meest duidelijke voorbeeld is met name kanker. De basismechanismen waarmee epigenetische wijzigingen bijdragen tot tumorgroei zijn epigenetische activatie van oncogenen of epigenetische inactivatie van tumorsuppressorgenen. De sterke vooruitgang in de moleculaire biologie heeft geleid tot de uitvinding van talrijke nieuwe medicijnen tegen kanker en heeft tevens het aantal potentiële doelwitten voor de ontwikkeling van nieuwe medicijnen exponentieel doen toenemen. De potentiële omkeerbaarheid van epigenetische defecten maakt van hen perfecte doelwitten voor farmacologische ingrepen. Kortom gaat men proberen epigenetische defecten met behulp van farmaca te corrigeren. Het farmaco-epigenomisch veld is vooral in de laatste jaren fel verbeterd en uitgebreid. Oude medicijnen werden herontdekt voor nieuwe toepassingen en nieuwe moleculen gericht op epigenetische enzymen werden ontwikkeld. Met de ontwikkeling van dergelijk nieuwe epigenetische medicijnen die steeds specifieker worden, blijkt epigenetische therapie steeds meer en meer een effectieve en waardevolle aanvulling te zijn op chemotherapie en chemopreventie.
Desondanks de veelbelovende resultaten van allerhande trials is een grondige evaluatie van deze medicijnen nog steeds op zijn plaats, dit om mogelijke valkuilen op tijd te ontlopen. Zo kennen DNMT –en HDAC-inhibitoren één gemeenschappelijke beperking: ze zouden ten gevolge van hun gebrek aan specificiteit oncogenen kunnen activeren. Daarnaast kunnen gecorrigeerde epigenetische toestanden, net door hun reversibele aard ook weer overgaan naar de defecte toestand. Optimalisering van de behandeling met deze medicijnen mag gezien de moeilijke relatie tussen de toxiciteit en de faramacodynamiek alsook farmacokinetiek ervan eveneens niet uit het oog verloren worden. Hoe dan ook is het belangrijk om de doelmatigheid en ongewenste neveneffecten van kandidaat-medicijnen grondig te testen. Dit geldt uiteraard niet alleen voor wat betreft kanker.
Op basis van alle informatie die in dit werk naar voor is gekomen, valt het niet te ontkennen dat er in de nabije toekomst misschien wel een prominente rol is weggelegd voor epigenetische therapieën. Dit snel groeiende farmacologische deelgebied bevindt zich echter nog in zijn kinderschoenen en het besef dat we nog maar de oppervlakte aan het beroeren zijn, is heel belangrijk. Uitgezonderd de vier beschikbare en door de Amerikaanse Food and Drug Administration goedgekeurde epigenetische farmaca (5-azacytidine, decitabine, vorinostat en valproïnezuur), bevinden alle overige epigenetische medicijnen zich nog in preklinische of klinische trials.
54
Tot slot worden nog enkele onderwerpen meegegeven, die in de toekomst waarschijnlijk intenser bestudeerd zullen moeten worden (Zheng et al., 2008; Ma en Adjei, 2010):
Andere chromatinewijzigingen zoals de modificatie van histonen door biotine spelen een belangrijke rol in bijvoorbeeld herstel van dubbelstrenging DNA en de condensatie van chromatine. In vergelijking met acetylatie en methylatie is de reactie echter verre van intens bestudeerd. Dergelijke hiaten in onze kennis moeten worden weggewerkt.
Integenstelling tot de inhibitoren van chromatinemodificatie-enzymes worden activatoren ervan maar zelden gerapporteerd. Heractivatie van een enzymatische activ iteit zou nochtans de mogelijkheid van een cel om apoptose te induceren, kunnen herstellen. Dergelijke activatoren zouden nuttig kunnen zijn als kankertherapie. De ontwikkeling ervan is echter een grote uitdaging.
Het gecombineerd gebruik van epigenetische farmaca zou de tumorgroei sterker kunnen inhiberen doordat de medicijnen afkomstig zijn van verschillende klassen en zodoende andere werkingmechanismen hanteren en andere tussenstappen in de signaaltransductiewegen viseren. Daarenboven bezitten ze andere bijwerkingen en verschillende resistentieprofielen. Het onderzoek naar de synergistische of antisynergistische wisselwerking tussen epigenetische medicijnen onderling en tussen epigenetische farmaca en de klassieke chemotherapeutica vormt een belangrijk doel.
Het gebrek aan specificiteit is een probleem waar vele epigenetische farmaca momenteel mee kampen. Zo inhibeert de Vorinostat de activiteit van alle HDACs uit zowel klasse I als klasse II. Het is belangrijk om te bepalen of isovormspecifieke inhibitoren überhaupt kunnen ontwikkeld worden en of dergelijke selectieve inhibitie uiteindelijk enig therapeutisch voordeel biedt.
Alhoewel de nadruk tegenwoordig vooral ligt op de zoektocht naar kleine moleculen die zich richten op de katalytische domeinen van de chromatinewijzigende enzymes, kan de modulatie ervan ook op andere manieren. Het aanpassen van de proteïne-proteïne interface is bijvoorbeeld een belangrijke nieuwe strategie bij de ontwikkeling van epigenetische medicatie. In combinatie met de klassieke katalytische inhibitie zou dit in de toekomst nieuwe kansen scheppen om nog effectievere therapeutische strategieën tegen kanker te ontwikkelen.
55
VI.
REFERENTIELIJST
1. Abdolmaleky HM, Smith CL, Faraone SV, Shafa R, Stone W, Glatt SJ, et al. Methylomics in psychiatry: Modulation of gene-environment interactions may be through DNA methylation. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2004 May 15;127B(1):51-9. 2. Ando T, Yoshida T, Enomoto S, Asada K, Tatematsu M, Ichinose M, et al. DNA methylation of microRNA genes in gastric mucosae of gastric cancer patients: its possible involvement in the formation of epigenetic field defect. Int J Cancer. 2009 May 15;124(10):2367-74. 3. Arita K, Shimizu T, Hashimoto H, Hidaka Y, Yamada M, Sato M. Structural basis for histone N-terminal recognition by human peptidylarginine deiminase 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Apr 4;103(14):5291-6. 4. Aslam MI, Taylor K, Pringle JH, Jameson JS. MicroRNAs are novel biomarkers of colorectal cancer. Br J Surg. 2009 Jul;96(7):702-10. 5. Baffa R, Fassan M, Volinia S, O'Hara B, Liu CG, Palazzo JP, et al. MicroRNA expression profiling of human metastatic cancers identifies cancer gene targets. J Pathol. 2009 Oct;219(2):21421. 6. Bagchi A, Papazoglu C, Wu Y, Capurso D, Brodt M, Francis D, et al. CHD5 is a tumor suppressor at human 1p36. Cell. 2007 Feb 9;128(3):459-75. 7. Bagchi A, Papazoglu C, Wu Y, Capurso D, Brodt M, Francis D, et al. CHD5 is a tumor suppressor at human 1p36. Cell. 2007 Feb 9;128(3):459-75. 8. Balasubramanyam K, Swaminathan V, Ranganathan A, Kundu TK. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. J Biol Chem. 2003 May 23;278(21):19134-40. 9. Balmain A, Gray J, Ponder B. The genetics and genomics of cancer. Nat Genet. 2003 Mar;33 Suppl:238-44. 10. Bao Y, Shen X. Chromatin remodeling in DNA double-strand break repair. Curr Opin Genet Dev. 2007 Apr;17(2):126-31. 11. Baylin SB, Ohm JE. Epigenetic gene silencing in cancer - a mechanism for early oncogenic pathway addiction? Nat Rev Cancer. 2006 Feb;6(2):107-16. 12. Baylin SB, Ohm JE. Epigenetic gene silencing in cancer - a mechanism for early oncogenic pathway addiction? Nat Rev Cancer. 2006 Feb;6(2):107-16. 13. Baylin SB, Ohm JE. Epigenetic gene silencing in cancer - a mechanism for early oncogenic pathway addiction? Nat Rev Cancer. 2006 Feb;6(2):107-16. 14. Becker PB, Horz W. ATP-dependent nucleosome remodeling. Annu Rev Biochem. 2002;71:247-73. 15. Bedford MT, Richard S. Arginine methylation an emerging regulator of protein function. Mol Cell. 2005 Apr 29;18(3):263-72. 16. Belinsky SA, Nikula KJ, Palmisano WA, Michels R, Saccomanno G, Gabrielson E, et al. Aberrant methylation of p16(INK4a) is an early event in lung cancer and a potential biomarker for early diagnosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Sep 29;95(20):11891-6. 17. Bernstein BE, Meissner A, Lander ES. The mammalian epigenome. Cell. 2007 Feb 23;128(4):669-81. 18. Biel M, Kretsovali A, Karatzali E, Papamatheakis J, Giannis A. Design, synthesis, and biological evaluation of a small-molecule inhibitor of the histone acetyltransferase Gcn5. Angew Chem Int Ed Engl. 2004 Jul 26;43(30):3974-6. 19. Biel M, Wascholowski V, Giannis A. Epigenetics--an epicenter of gene regulation: histones and histone-modifying enzymes. Angew Chem Int Ed Engl. 2005 May 20;44(21):3186-216. 20. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 2002 Jan 1;16(1):621. 21. Bird AP. CpG-rich islands and the function of DNA methylation. Nature. 1986 May 1521;321(6067):209-13. 22. Bjerkvig R, Tysnes BB, Aboody KS, Najbauer J, Terzis AJ. Opinion: the origin of the cancer stem cell: current controversies and new insights. Nat Rev Cancer. 2005 Nov;5(11):899-904. 23. Bjornsson HT, Cui H, Gius D, Fallin MD, Feinberg AP. The new field of epigenomics:
56
implications for cancer and other common disease research. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2004;69:447-56. 24. Bowen NJ, Fujita N, Kajita M, Wade PA. Mi-2/NuRD: multiple complexes for many purposes. Biochim Biophys Acta. 2004 Mar 15;1677(1-3):52-7. 25. Bradbury CA, Khanim FL, Hayden R, Bunce CM, White DA, Drayson MT, et al. Histone deacetylases in acute myeloid leukaemia show a distinctive pattern of expression that changes selectively in response to deacetylase inhibitors. Leukemia. 2005 Oct;19(10):1751-9. 26. Brueckner B, Garcia Boy R, Siedlecki P, Musch T, Kliem HC, Zielenkiewicz P, et al. Epigenetic reactivation of tumor suppressor genes by a novel small-molecule inhibitor of human DNA methyltransferases. Cancer Res. 2005 Jul 15;65(14):6305-11. 27. Brueckner B, Stresemann C, Kuner R, Mund C, Musch T, Meister M, et al. The human let-7a3 locus contains an epigenetically regulated microRNA gene with oncogenic function. Cancer Res. 2007 Feb 15;67(4):1419-23. 28. Byrd JC, Marcucci G, Parthun MR, Xiao JJ, Klisovic RB, Moran M, et al. A phase 1 and pharmacodynamic study of depsipeptide (FK228) in chronic lymphocytic leukemia and acute myeloid leukemia. Blood. 2005 Feb 1;105(3):959-67. 29. Cadieux B, Ching TT, VandenBerg SR, Costello JF. Genome-wide hypomethylation in human glioblastomas associated with specific copy number alteration, methylenetetrahydrofolate reductase allele status, and increased proliferation. Cancer Res. 2006 Sep 1;66(17):8469-76. 30. Cairns BR. Emerging roles for chromatin remodeling in cancer biology. Trends Cell Biol. 2001 Nov;11(11):S15-21. 31. Calabrese CR, Almassy R, Barton S, Batey MA, Calvert AH, Canan-Koch S, et al. Anticancer chemosensitization and radiosensitization by the novel poly(ADP-ribose) polymerase-1 inhibitor AG14361. J Natl Cancer Inst. 2004 Jan 7;96(1):56-67. 32. Carducci MA, Gilbert J, Bowling MK, Noe D, Eisenberger MA, Sinibaldi V, et al. A Phase I clinical and pharmacological evaluation of sodium phenylbutyrate on an 120-h infusion schedule. Clin Cancer Res. 2001 Oct;7(10):3047-55. 33. Chai B, Huang J, Cairns BR, Laurent BC. Distinct roles for the RSC and Swi/Snf ATPdependent chromatin remodelers in DNA double-strand break repair. Genes Dev. 2005 Jul 15;19(14):1656-61. 34. Chalmers AJ. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 and ionizing radiation: sensor, signaller and therapeutic target. Clin Oncol (R Coll Radiol). 2004 Feb;16(1):29-39. 35. Chan SW, Henderson IR, Jacobsen SE. Gardening the genome: DNA methylation in Arabidopsis thaliana. Nat Rev Genet. 2005 May;6(5):351-60. 36. Cheung P, Lau P. Epigenetic regulation by histone methylation and histone variants. Mol Endocrinol. 2005 Mar;19(3):563-73. 37. Cho KS, Elizondo LI, Boerkoel CF. Advances in chromatin remodeling and human disease. Curr Opin Genet Dev. 2004 Jun;14(3):308-15. 38. Cho M, Uemura H, Kim SC, Kawada Y, Yoshida K, Hirao Y, et al. Hypomethylation of the MN/CA9 promoter and upregulated MN/CA9 expression in human renal cell carcinoma. Br J Cancer. 2001 Aug 17;85(4):563-7. 39. Christofori G, Naik P, Hanahan D. Deregulation of both imprinted and expressed alleles of the insulin-like growth factor 2 gene during beta-cell tumorigenesis. Nat Genet. 1995 Jun;10(2):196201. 40. Clapier CR, Cairns BR. The biology of chromatin remodeling complexes. Annu Rev Biochem. 2009;78:273-304. 41. Clark SJ. Action at a distance: epigenetic silencing of large chromosomal regions in carcinogenesis. Hum Mol Genet. 2007 Apr 15;16 Spec No 1:R88-95. 42. Cloos PA, Christensen J, Agger K, Maiolica A, Rappsilber J, Antal T, et al. The putative oncogene GASC1 demethylates tri- and dimethylated lysine 9 on histone H3. Nature. 2006 Jul 20;442(7100):307-11. 43. Cortez MA, Calin GA. MicroRNA identification in plasma and serum: a new tool to diagnose and monitor diseases. Expert Opin Biol Ther. 2009 Jun;9(6):703-11. 44. Cosgrove MS, Wolberger C. How does the histone code work? Biochem Cell Biol. 2005
57
Aug;83(4):468-76. 45. Costanzo V, Robertson K, Ying CY, Kim E, Avvedimento E, Gottesman M, et al. Reconstitution of an ATM-dependent checkpoint that inhibits chromosomal DNA replication following DNA damage. Mol Cell. 2000 Sep;6(3):649-59. 46. Cuthbert GL, Daujat S, Snowden AW, Erdjument-Bromage H, Hagiwara T, Yamada M, et al. Histone deimination antagonizes arginine methylation. Cell. 2004 Sep 3;118(5):545-53. 47. Czaja W, Bespalov VA, Hinz JM, Smerdon MJ. Proficient repair in chromatin remodeling defective ino80 mutants of Saccharomyces cerevisiae highlights replication defects as the main contributor to DNA damage sensitivity. DNA Repair (Amst). 2010 Jul 29. 48. Davalos V, Esteller M. MicroRNAs and cancer epigenetics: a macrorevolution. Curr Opin Oncol. 2010 Jan;22(1):35-45. 49. Davidovic L, Vodenicharov M, Affar EB, Poirier GG. Importance of poly(ADP-ribose) glycohydrolase in the control of poly(ADP-ribose) metabolism. Exp Cell Res. 2001 Aug 1;268(1):713. 50. Decker P, Muller S. Modulating poly (ADP-ribose) polymerase activity: potential for the prevention and therapy of pathogenic situations involving DNA damage and oxidative stress. Curr Pharm Biotechnol. 2002 Sep;3(3):275-83. 51. Denman RB. PAD: the smoking gun behind arginine methylation signaling? Bioessays. 2005 Mar;27(3):242-6. 52. DePinho RA, Wong KK. The age of cancer: telomeres, checkpoints, and longevity. J Clin Invest. 2003 Apr;111(7):S9-14. 53. Ditchfield C, Johnson VL, Tighe A, Ellston R, Haworth C, Johnson T, et al. Aurora B couples chromosome alignment with anaphase by targeting BubR1, Mad2, and Cenp-E to kinetochores. J Cell Biol. 2003 Apr 28;161(2):267-80. 54. Dontu G, Abdallah WM, Foley JM, Jackson KW, Clarke MF, Kawamura MJ, et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 2003 May 15;17(10):1253-70. 55. Dontu G, Jackson KW, McNicholas E, Kawamura MJ, Abdallah WM, Wicha MS. Role of Notch signaling in cell-fate determination of human mammary stem/progenitor cells. Breast Cancer Res. 2004;6(6):R605-15. 56. Eberharter A, Becker PB. ATP-dependent nucleosome remodelling: factors and functions. J Cell Sci. 2004 Aug 1;117(Pt 17):3707-11. 57. Egger G, Liang G, Aparicio A, Jones PA. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 2004 May 27;429(6990):457-63. 58. El Messaoudi S, Fabbrizio E, Rodriguez C, Chuchana P, Fauquier L, Cheng D, et al. Coactivator-associated arginine methyltransferase 1 (CARM1) is a positive regulator of the Cyclin E1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Sep 5;103(36):13351-6. 59. Ergul E, Sazci A, Utkan Z, Canturk NZ. Polymorphisms in the MTHFR gene are associated with breast cancer. Tumour Biol. 2003 Nov-Dec;24(6):286-90. 60. Fabbri M, Croce CM, Calin GA. MicroRNAs in the ontogeny of leukemias and lymphomas. Leuk Lymphoma. 2009 Feb;50(2):160-70. 61. Feinberg AP. The epigenetics of cancer etiology. Semin Cancer Biol. 2004 Dec;14(6):427-32. 62. Feinberg AP. The epigenetics of cancer etiology. Semin Cancer Biol. 2004 Dec;14(6):427-32. 63. Feinberg AP. An epigenetic approach to cancer etiology. Cancer J. 2007 Jan-Feb;13(1):70-4. 64. Feinberg AP, Ohlsson R, Henikoff S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nat Rev Genet. 2006 Jan;7(1):21-33. 65. Finnin MS, Donigian JR, Pavletich NP. Structure of the histone deacetylase SIRT2. Nat Struct Biol. 2001 Jul;8(7):621-5. 66. Fischle W, Wang Y, Jacobs SA, Kim Y, Allis CD, Khorasanizadeh S. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes Dev. 2003 Aug 1;17(15):1870-81. 67. Forneris F, Binda C, Vanoni MA, Battaglioli E, Mattevi A. Human histone demethylase LSD1 reads the histone code. J Biol Chem. 2005 Dec 16;280(50):41360-5. 68. Foster SL, Hargreaves DC, Medzhitov R. Gene-specific control of inflammation by TLR-
58
induced chromatin modifications. Nature. 2007 Jun 21;447(7147):972-8. 69. Fournel M, Bonfils C, Hou Y, Yan PT, Trachy-Bourget MC, Kalita A, et al. MGCD0103, a novel isotype-selective histone deacetylase inhibitor, has broad spectrum antitumor activity in vitro and in vivo. Mol Cancer Ther. 2008 Apr;7(4):759-68. 70. Fraga MF, Ballestar E, Paz MF, Ropero S, Setien F, Ballestar ML, et al. Epigenetic differences arise during the lifetime of monozygotic twins. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jul 26;102(30):10604-9. 71. Fraga MF, Ballestar E, Villar-Garea A, Boix-Chornet M, Espada J, Schotta G, et al. Loss of acetylation at Lys16 and trimethylation at Lys20 of histone H4 is a common hallmark of human cancer. Nat Genet. 2005 Apr;37(4):391-400. 72. Fraga MF, Esteller M. Epigenetics and aging: the targets and the marks. Trends Genet. 2007 Aug;23(8):413-8. 73. Friedman JM, Liang G, Liu CC, Wolff EM, Tsai YC, Ye W, et al. The putative tumor suppressor microRNA-101 modulates the cancer epigenome by repressing the polycomb group protein EZH2. Cancer Res. 2009 Mar 15;69(6):2623-9. 74. Fujita N, Jaye DL, Geigerman C, Akyildiz A, Mooney MR, Boss JM, et al. MTA3 and the Mi-2/NuRD complex regulate cell fate during B lymphocyte differentiation. Cell. 2004 Oct 1;119(1):75-86. 75. Furumai R, Matsuyama A, Kobashi N, Lee KH, Nishiyama M, Nakajima H, et al. FK228 (depsipeptide) as a natural prodrug that inhibits class I histone deacetylases. Cancer Res. 2002 Sep 1;62(17):4916-21. 76. Gallinari P, Di Marco S, Jones P, Pallaoro M, Steinkuhler C. HDACs, histone deacetylation and gene transcription: from molecular biology to cancer therapeutics. Cell Res. 2007 Mar;17(3):195211. 77. Gary JD, Clarke S. RNA and protein interactions modulated by protein arginine methylation. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1998;61:65-131. 78. Garzon R, Liu S, Fabbri M, Liu Z, Heaphy CE, Callegari E, et al. MicroRNA-29b induces global DNA hypomethylation and tumor suppressor gene reexpression in acute myeloid leukemia by targeting directly DNMT3A and 3B and indirectly DNMT1. Blood. 2009 Jun 18;113(25):6411-8. 79. Gaur A, Jewell DA, Liang Y, Ridzon D, Moore JH, Chen C, et al. Characterization of microRNA expression levels and their biological correlates in human cancer cell lines. Cancer Res. 2007 Mar 15;67(6):2456-68. 80. Geng L, Cuneo KC, Fu A, Tu T, Atadja PW, Hallahan DE. Histone deacetylase (HDAC) inhibitor LBH589 increases duration of gamma-H2AX foci and confines HDAC4 to the cytoplasm in irradiated non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2006 Dec 1;66(23):11298-304. 81. Gilbert J, Baker SD, Bowling MK, Grochow L, Figg WD, Zabelina Y, et al. A phase I dose escalation and bioavailability study of oral sodium phenylbutyrate in patients with refractory solid tumor malignancies. Clin Cancer Res. 2001 Aug;7(8):2292-300. 82. Gilbert J, Gore SD, Herman JG, Carducci MA. The clinical application of targeting cancer through histone acetylation and hypomethylation. Clin Cancer Res. 2004 Jul 15;10(14):4589-96. 83. Gill G. Something about SUMO inhibits transcription. Curr Opin Genet Dev. 2005 Oct;15(5):536-41. 84. Giordano A, Avantaggiati ML. p300 and CBP: partners for life and death. J Cell Physiol. 1999 Nov;181(2):218-30. 85. Goldberg AD, Allis CD, Bernstein E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 2007 Feb 23;128(4):635-8. 86. Goll MG, Bestor TH. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annu Rev Biochem. 2005;74:481-514. 87. Goll MG, Bestor TH. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annu Rev Biochem. 2005;74:481-514. 88. Goll MG, Kirpekar F, Maggert KA, Yoder JA, Hsieh CL, Zhang X, et al. Methylation of tRNAAsp by the DNA methyltransferase homolog Dnmt2. Science. 2006 Jan 20;311(5759):395-8. 89. Gong F, Fahy D, Smerdon MJ. Rad4-Rad23 interaction with SWI/SNF links ATP-dependent chromatin remodeling with nucleotide excision repair. Nat Struct Mol Biol. 2006 Oct;13(10):902-7.
59
90. Greiner D, Bonaldi T, Eskeland R, Roemer E, Imhof A. Identification of a specific inhibitor of the histone methyltransferase SU(VAR)3-9. Nat Chem Biol. 2005 Aug;1(3):143-5. 91. Grewal SI, Moazed D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 2003 Aug 8;301(5634):798-802. 92. Grimm D, Streetz KL, Jopling CL, Storm TA, Pandey K, Davis CR, et al. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature. 2006 May 25;441(7092):537-41. 93. Gronbaek K, Hother C, Jones PA. Epigenetic changes in cancer. APMIS. 2007 Oct;115(10):1039-59. 94. Guidi CJ, Sands AT, Zambrowicz BP, Turner TK, Demers DA, Webster W, et al. Disruption of Ini1 leads to peri-implantation lethality and tumorigenesis in mice. Mol Cell Biol. 2001 May;21(10):3598-603. 95. Guo JJ, Li QL, Zhang J, Huang AL. Histone deacetylation is involved in activation of CXCL10 upon IFNgamma stimulation. Mol Cells. 2006 Oct 31;22(2):163-7. 96. Hagiwara T, Hidaka Y, Yamada M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL60 granulocytes. Biochemistry. 2005 Apr 19;44(15):5827-34. 97. Harrington EA, Bebbington D, Moore J, Rasmussen RK, Ajose-Adeogun AO, Nakayama T, et al. VX-680, a potent and selective small-molecule inhibitor of the Aurora kinases, suppresses tumor growth in vivo. Nat Med. 2004 Mar;10(3):262-7. 98. Harrington EA, Bennett MR, Fanidi A, Evan GI. c-Myc-induced apoptosis in fibroblasts is inhibited by specific cytokines. EMBO J. 1994 Jul 15;13(14):3286-95. 99. Henikoff S, Furuyama T, Ahmad K. Histone variants, nucleosome assembly and epigenetic inheritance. Trends Genet. 2004 Jul;20(7):320-6. 100. Herman JG, Latif F, Weng Y, Lerman MI, Zbar B, Liu S, et al. Silencing of the VHL tumorsuppressor gene by DNA methylation in renal carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Oct 11;91(21):9700-4. 101. Hope KJ, Jin L, Dick JE. Acute myeloid leukemia originates from a hierarchy of leukemic stem cell classes that differ in self-renewal capacity. Nat Immunol. 2004 Jul;5(7):738-43. 102. Huang S. Histone methyltransferases, diet nutrients and tumour suppressors. Nat Rev Cancer. 2002 Jun;2(6):469-76. 103. Huang Y, Greene E, Murray Stewart T, Goodwin AC, Baylin SB, Woster PM, et al. Inhibition of lysine-specific demethylase 1 by polyamine analogues results in reexpression of aberrantly silenced genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 May 8;104(19):8023-8. 104. Hwang C, Giri VN, Wilkinson JC, Wright CW, Wilkinson AS, Cooney KA, et al. EZH2 regulates the transcription of estrogen-responsive genes through association with REA, an estrogen receptor corepressor. Breast Cancer Res Treat. 2008 Jan;107(2):235-42. 105. Inche AG, La Thangue NB. Chromatin control and cancer-drug discovery: realizing the promise. Drug Discov Today. 2006 Feb;11(3-4):97-109. 106. Inche AG, La Thangue NB. Chromatin control and cancer-drug discovery: realizing the promise. Drug Discov Today. 2006 Feb;11(3-4):97-109. 107. Ingrosso D, Cimmino A, Perna AF, Masella L, De Santo NG, De Bonis ML, et al. Folate treatment and unbalanced methylation and changes of allelic expression induced by hyperhomocysteinaemia in patients with uraemia. Lancet. 2003 May 17;361(9370):1693-9. 108. Iorio MV, Piovan C, Croce CM. Interplay between microRNAs and the epigenetic machinery: An intricate network. Biochim Biophys Acta. 2010 May 20. 109. Isakoff MS, Sansam CG, Tamayo P, Subramanian A, Evans JA, Fillmore CM, et al. Inactivation of the Snf5 tumor suppressor stimulates cell cycle progression and cooperates with p53 loss in oncogenic transformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Dec 6;102(49):17745-50. 110. Issa JP. CpG-island methylation in aging and cancer. Curr Top Microbiol Immunol. 2000;249:101-18. 111. Itoh Y, Suzuki T, Miyata N. Isoform-selective histone deacetylase inhibitors. Curr Pharm Des. 2008;14(6):529-44. 112. Jagtap P, Szabo C. Poly(ADP-ribose) polymerase and the therapeutic effects of its inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 2005 May;4(5):421-40.
60
113. Jenuwein T. Re-SET-ting heterochromatin by histone methyltransferases. Trends Cell Biol. 2001 Jun;11(6):266-73. 114. Jenuwein T, Allis CD. Translating the histone code. Science. 2001 Aug 10;293(5532):107480. 115. Jones PA, Baylin SB. The epigenomics of cancer. Cell. 2007 Feb 23;128(4):683-92. 116. Jones PA, Laird PW. Cancer epigenetics comes of age. Nat Genet. 1999 Feb;21(2):163-7. 117. Kahl P, Gullotti L, Heukamp LC, Wolf S, Friedrichs N, Vorreuther R, et al. Androgen receptor coactivators lysine-specific histone demethylase 1 and four and a half LIM domain protein 2 predict risk of prostate cancer recurrence. Cancer Res. 2006 Dec 1;66(23):11341-7. 118. Karhadkar SS, Bova GS, Abdallah N, Dhara S, Gardner D, Maitra A, et al. Hedgehog signalling in prostate regeneration, neoplasia and metastasis. Nature. 2004 Oct 7;431(7009):707-12. 119. Keppler BR, Archer TK. Chromatin-modifying enzymes as therapeutic targets--Part 2. Expert Opin Ther Targets. 2008 Nov;12(11):1457-67. 120. Keppler BR, Archer TK. Chromatin-modifying enzymes as therapeutic targets--Part 2. Expert Opin Ther Targets. 2008 Nov;12(11):1457-67. 121. Khan N, Jeffers M, Kumar S, Hackett C, Boldog F, Khramtsov N, et al. Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors. Biochem J. 2008 Jan 15;409(2):581-9. 122. Kleinman ME, Yamada K, Takeda A, Chandrasekaran V, Nozaki M, Baffi JZ, et al. Sequence- and target-independent angiogenesis suppression by siRNA via TLR3. Nature. 2008 Apr 3;452(7187):591-7. 123. Klenova E, Ohlsson R. Poly(ADP-ribosyl)ation and epigenetics. Is CTCF PARt of the plot? Cell Cycle. 2005 Jan;4(1):96-101. 124. Krutzfeldt J, Rajewsky N, Braich R, Rajeev KG, Tuschl T, Manoharan M, et al. Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature. 2005 Dec 1;438(7068):685-9. 125. Kubicek S, O'Sullivan RJ, August EM, Hickey ER, Zhang Q, Teodoro ML, et al. Reversal of H3K9me2 by a small-molecule inhibitor for the G9a histone methyltransferase. Mol Cell. 2007 Feb 9;25(3):473-81. 126. Lamming DW, Wood JG, Sinclair DA. Small molecules that regulate lifespan: evidence for xenohormesis. Mol Microbiol. 2004 Aug;53(4):1003-9. 127. Le Marchand L, Haiman CA, Wilkens LR, Kolonel LN, Henderson BE. MTHFR polymorphisms, diet, HRT, and breast cancer risk: the multiethnic cohort study. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004 Dec;13(12):2071-7. 128. Lee DY, Teyssier C, Strahl BD, Stallcup MR. Role of protein methylation in regulation of transcription. Endocr Rev. 2005 Apr;26(2):147-70. 129. Lee KK, Workman JL. Histone acetyltransferase complexes: one size doesn't fit all. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 Apr;8(4):284-95. 130. Leopold WR, Shillis JL, Mertus AE, Nelson JM, Roberts BJ, Jackson RC. Anticancer activity of the structurally novel antibiotic Cl-920 and its analogues. Cancer Res. 1984 May;44(5):1928-32. 131. Lin HY, Chen CS, Lin SP, Weng JR. Targeting histone deacetylase in cancer therapy. Med Res Rev. 2006 Jul;26(4):397-413. 132. Liu S, Dontu G, Wicha MS. Mammary stem cells, self-renewal pathways, and carcinogenesis. Breast Cancer Res. 2005;7(3):86-95. 133. Lorch Y, Maier-Davis B, Kornberg RD. Mechanism of chromatin remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Feb 23;107(8):3458-62. 134. Lu J, Getz G, Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Lamb J, Peck D, et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 2005 Jun 9;435(7043):834-8. 135. Lu L, Katsaros D, de la Longrais IA, Sochirca O, Yu H. Hypermethylation of let-7a-3 in epithelial ovarian cancer is associated with low insulin-like growth factor-II expression and favorable prognosis. Cancer Res. 2007 Nov 1;67(21):10117-22. 136. Lucas DM, Davis ME, Parthun MR, Mone AP, Kitada S, Cunningham KD, et al. The histone deacetylase inhibitor MS-275 induces caspase-dependent apoptosis in B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Leukemia. 2004 Jul;18(7):1207-14. 137. Luo RX, Postigo AA, Dean DC. Rb interacts with histone deacetylase to repress transcription.
61
Cell. 1998 Feb 20;92(4):463-73. 138. Luo Y, Knuckley B, Lee YH, Stallcup MR, Thompson PR. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J Am Chem Soc. 2006 Feb 1;128(4):1092-3. 139. Lynam-Lennon N, Maher SG, Reynolds JV. The roles of microRNA in cancer and apoptosis. Biol Rev Camb Philos Soc. 2009 Feb;84(1):55-71. 140. Ma WW, Adjei AA. Novel agents on the horizon for cancer therapy. CA Cancer J Clin. 2009 Mar-Apr;59(2):111-37. 141. Mai A, Altucci L. Epi-drugs to fight cancer: from chemistry to cancer treatment, the road ahead. Int J Biochem Cell Biol. 2009 Jan;41(1):199-213. 142. Masutani M, Nakagama H, Sugimura T. Poly(ADP-ribose) and carcinogenesis. Genes Chromosomes Cancer. 2003 Dec;38(4):339-48. 143. McGarvey KM, Fahrner JA, Greene E, Martens J, Jenuwein T, Baylin SB. Silenced tumor suppressor genes reactivated by DNA demethylation do not return to a fully euchromatic chromatin state. Cancer Res. 2006 Apr 1;66(7):3541-9. 144. Merlo A, Herman JG, Mao L, Lee DJ, Gabrielson E, Burger PC, et al. 5' CpG island methylation is associated with transcriptional silencing of the tumour suppressor p16/CDKN2/MTS1 in human cancers. Nat Med. 1995 Jul;1(7):686-92. 145. Metzger E, Wissmann M, Yin N, Muller JM, Schneider R, Peters AH, et al. LSD1 demethylates repressive histone marks to promote androgen-receptor-dependent transcription. Nature. 2005 Sep 15;437(7057):436-9. 146. Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, Fritz BR, Wyman SK, Pogosova-Agadjanyan EL, et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jul 29;105(30):10513-8. 147. Monneret C. Histone deacetylase inhibitors. Eur J Med Chem. 2005 Jan;40(1):1-13. 148. Mowen KA, Schurter BT, Fathman JW, David M, Glimcher LH. Arginine methylation of NIP45 modulates cytokine gene expression in effector T lymphocytes. Mol Cell. 2004 Aug 27;15(4):559-71. 149. Muntean AG, Hess JL. Epigenetic dysregulation in cancer. Am J Pathol. 2009 Oct;175(4):1353-61. 150. Muntean AG, Hess JL. Epigenetic dysregulation in cancer. Am J Pathol. 2009 Oct;175(4):1353-61. 151. Nakashima K, Hagiwara T, Yamada M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J Biol Chem. 2002 Dec 20;277(51):49562-8. 152. Nebbioso A, Clarke N, Voltz E, Germain E, Ambrosino C, Bontempo P, et al. Tumorselective action of HDAC inhibitors involves TRAIL induction in acute myeloid leukemia cells. Nat Med. 2005 Jan;11(1):77-84. 153. Negrini M, Ferracin M, Sabbioni S, Croce CM. MicroRNAs in human cancer: from research to therapy. J Cell Sci. 2007 Jun 1;120(Pt 11):1833-40. 154. Noonan EJ, Place RF, Pookot D, Basak S, Whitson JM, Hirata H, et al. miR-449a targets HDAC-1 and induces growth arrest in prostate cancer. Oncogene. 2009 Apr 9;28(14):1714-24. 155. Nowak SJ, Corces VG. Phosphorylation of histone H3: a balancing act between chromosome condensation and transcriptional activation. Trends Genet. 2004 Apr;20(4):214-20. 156. Nowak SJ, Pai CY, Corces VG. Protein phosphatase 2A activity affects histone H3 phosphorylation and transcription in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2003 Sep;23(17):612938. 157. Oelke K, Richardson B. Decreased T cell ERK pathway signaling may contribute to the development of lupus through effects on DNA methylation and gene expression. Int Rev Immunol. 2004 May-Aug;23(3-4):315-31. 158. Ohta K, Ohigashi M, Naganawa A, Ikeda H, Sakai M, Nishikawa J, et al. Histone acetyltransferase MOZ acts as a co-activator of Nrf2-MafK and induces tumour marker gene expression during hepatocarcinogenesis. Biochem J. 2007 Mar 15;402(3):559-66. 159. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 1999 Oct 29;99(3):247-57.
62
160. Olsen CL, Hsu PP, Glienke J, Rubanyi GM, Brooks AR. Hedgehog-interacting protein is highly expressed in endothelial cells but down-regulated during angiogenesis and in several human tumors. BMC Cancer. 2004 Aug 4;4:43. 161. Osley MA, Fleming AB, Kao CF. Histone ubiquitylation and the regulation of transcription. Results Probl Cell Differ. 2006;41:47-75. 162. Ota H, Tokunaga E, Chang K, Hikasa M, Iijima K, Eto M, et al. Sirt1 inhibitor, Sirtinol, induces senescence-like growth arrest with attenuated Ras-MAPK signaling in human cancer cells. Oncogene. 2006 Jan 12;25(2):176-85. 163. Pal S, Vishwanath SN, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Sif S. Human SWI/SNF-associated PRMT5 methylates histone H3 arginine 8 and negatively regulates expression of ST7 and NM23 tumor suppressor genes. Mol Cell Biol. 2004 Nov;24(21):9630-45. 164. Pang Y, Young CY, Yuan H. MicroRNAs and prostate cancer. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2010 Jun 15;42(6):363-9. 165. Persad VL, Van den Hof MC, Dube JM, Zimmer P. Incidence of open neural tube defects in Nova Scotia after folic acid fortification. CMAJ. 2002 Aug 6;167(3):241-5. 166. Piekarz RL, Frye AR, Wright JJ, Steinberg SM, Liewehr DJ, Rosing DR, et al. Cardiac studies in patients treated with depsipeptide, FK228, in a phase II trial for T-cell lymphoma. Clin Cancer Res. 2006 Jun 15;12(12):3762-73. 167. Ponti D, Costa A, Zaffaroni N, Pratesi G, Petrangolini G, Coradini D, et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 2005 Jul 1;65(13):5506-11. 168. Pray TR, Parlati F, Huang J, Wong BR, Payan DG, Bennett MK, et al. Cell cycle regulatory E3 ubiquitin ligases as anticancer targets. Drug Resist Updat. 2002 Dec;5(6):249-58. 169. Qian DZ, Wei YF, Wang X, Kato Y, Cheng L, Pili R. Antitumor activity of the histone deacetylase inhibitor MS-275 in prostate cancer models. Prostate. 2007 Aug 1;67(11):1182-93. 170. Qian X, Ara G, Mills E, LaRochelle WJ, Lichenstein HS, Jeffers M. Activity of the histone deacetylase inhibitor belinostat (PXD101) in preclinical models of prostate cancer. Int J Cancer. 2008 Mar 15;122(6):1400-10. 171. Reisman D, Glaros S, Thompson EA. The SWI/SNF complex and cancer. Oncogene. 2009 Apr 9;28(14):1653-68. 172. Reynolds PA, Sigaroudinia M, Zardo G, Wilson MB, Benton GM, Miller CJ, et al. Tumor suppressor p16INK4A regulates polycomb-mediated DNA hypermethylation in human mammary epithelial cells. J Biol Chem. 2006 Aug 25;281(34):24790-802. 173. Rhee I, Jair KW, Yen RW, Lengauer C, Herman JG, Kinzler KW, et al. CpG methylation is maintained in human cancer cells lacking DNMT1. Nature. 2000 Apr 27;404(6781):1003-7. 174. Richardson B. DNA methylation and autoimmune disease. Clin Immunol. 2003 Oct;109(1):72-9. 175. Richardson B. Impact of aging on DNA methylation. Ageing Res Rev. 2003 Jul;2(3):245-61. 176. Richardson PG, Sonneveld P, Schuster MW, Irwin D, Stadtmauer EA, Facon T, et al. Bortezomib or high-dose dexamethasone for relapsed multiple myeloma. N Engl J Med. 2005 Jun 16;352(24):2487-98. 177. Richon VM, Emiliani S, Verdin E, Webb Y, Breslow R, Rifkind RA, et al. A class of hybrid polar inducers of transformed cell differentiation inhibits histone deacetylases. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Mar 17;95(6):3003-7. 178. Richon VM, Webb Y, Merger R, Sheppard T, Jursic B, Ngo L, et al. Second generation hybrid polar compounds are potent inducers of transformed cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Jun 11;93(12):5705-8. 179. Riggs AD, Xiong Z, Wang L, LeBon JM. Methylation dynamics, epigenetic fidelity and X chromosome structure. Novartis Found Symp. 1998;214:214-25; discussion 25-32. 180. Roberts CW, Orkin SH. The SWI/SNF complex--chromatin and cancer. Nat Rev Cancer. 2004 Feb;4(2):133-42. 181. Rodenhiser D, Mann M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 2006 Jan 31;174(3):341-8. 182. Rosenfeld N, Aharonov R, Meiri E, Rosenwald S, Spector Y, Zepeniuk M, et al. MicroRNAs
63
accurately identify cancer tissue origin. Nat Biotechnol. 2008 Apr;26(4):462-9. 183. Rossman TG. Mechanism of arsenic carcinogenesis: an integrated approach. Mutat Res. 2003 Dec 10;533(1-2):37-65. 184. Saito Y, Friedman JM, Chihara Y, Egger G, Chuang JC, Liang G. Epigenetic therapy upregulates the tumor suppressor microRNA-126 and its host gene EGFL7 in human cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 2009 Feb 13;379(3):726-31. 185. Sakakura C, Hagiwara A, Yasuoka R, Fujita Y, Nakanishi M, Masuda K, et al. Tumouramplified kinase BTAK is amplified and overexpressed in gastric cancers with possible involvement in aneuploid formation. Br J Cancer. 2001 Mar 23;84(6):824-31. 186. Sakurada K, Zheng B, Kuo JF. Comparative effects of protein phosphatase inhibitors (okadaic acid and calyculin A) on human leukemia HL60, HL60/ADR and K562 cells. Biochem Biophys Res Commun. 1992 Aug 31;187(1):488-92. 187. Semenza JC, Delfino RJ, Ziogas A, Anton-Culver H. Breast cancer risk and methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism. Breast Cancer Res Treat. 2003 Feb;77(3):217-23. 188. Shankar S, Srivastava RK. Involvement of Bcl-2 family members, phosphatidylinositol 3'kinase/AKT and mitochondrial p53 in curcumin (diferulolylmethane)-induced apoptosis in prostate cancer. Int J Oncol. 2007 Apr;30(4):905-18. 189. Shi Y, Lan F, Matson C, Mulligan P, Whetstine JR, Cole PA, et al. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 2004 Dec 29;119(7):941-53. 190. Shishodia S, Chaturvedi MM, Aggarwal BB. Role of curcumin in cancer therapy. Curr Probl Cancer. 2007 Jul-Aug;31(4):243-305. 191. Sims RJ, 3rd, Chen CF, Santos-Rosa H, Kouzarides T, Patel SS, Reinberg D. Human but not yeast CHD1 binds directly and selectively to histone H3 methylated at lysine 4 via its tandem chromodomains. J Biol Chem. 2005 Dec 23;280(51):41789-92. 192. Singleton MR, Dillingham MS, Wigley DB. Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases. Annu Rev Biochem. 2007;76:23-50. 193. Smith AT, Livingston MR, Mai A, Filetici P, Queener SF, Sullivan WJ, Jr. Quinoline derivative MC1626, a putative GCN5 histone acetyltransferase (HAT) inhibitor, exhibits HATindependent activity against Toxoplasma gondii. Antimicrob Agents Chemother. 2007 Mar;51(3):1109-11. 194. Smith LT, Otterson GA, Plass C. Unraveling the epigenetic code of cancer for therapy. Trends Genet. 2007 Sep;23(9):449-56. 195. Stimson L, Rowlands MG, Newbatt YM, Smith NF, Raynaud FI, Rogers P, et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Mol Cancer Ther. 2005 Oct;4(10):1521-32. 196. Sun Y, Jiang X, Chen S, Price BD. Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation. FEBS Lett. 2006 Aug 7;580(18):4353-6. 197. Suzuki T, Miyata N. Epigenetic control using natural products and synthetic molecules. Curr Med Chem. 2006;13(8):935-58. 198. Swanton C, Caldas C. Molecular classification of solid tumours: towards pathway-driven therapeutics. Br J Cancer. 2009 May 19;100(10):1517-22. 199. Taft RJ, Pang KC, Mercer TR, Dinger M, Mattick JS. Non-coding RNAs: regulators of disease. J Pathol. 2010 Jan;220(2):126-39. 200. Takamizawa J, Konishi H, Yanagisawa K, Tomida S, Osada H, Endoh H, et al. Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res. 2004 Jun 1;64(11):3753-6. 201. Tan J, Yang X, Zhuang L, Jiang X, Chen W, Lee PL, et al. Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells. Genes Dev. 2007 May 1;21(9):1050-63. 202. Tanaka M, Oikawa K, Takanashi M, Kudo M, Ohyashiki J, Ohyashiki K, et al. Downregulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patients. PLoS One. 2009;4(5):e5532. 203. Trevisan MT, Pfundstein B, Haubner R, Wurtele G, Spiegelhalder B, Bartsch H, et al. Characterization of alkyl phenols in cashew (Anacardium occidentale) products and assay of their
64
antioxidant capacity. Food Chem Toxicol. 2006 Feb;44(2):188-97. 204. Tsukada Y, Fang J, Erdjument-Bromage H, Warren ME, Borchers CH, Tempst P, et al. Histone demethylation by a family of JmjC domain-containing proteins. Nature. 2006 Feb 16;439(7078):811-6. 205. Tsukuda T, Trujillo KM, Martini E, Osley MA. Analysis of chromatin remodeling during formation of a DNA double-strand break at the yeast mating type locus. Methods. 2009 May;48(1):40-5. 206. Tufarelli C, Stanley JA, Garrick D, Sharpe JA, Ayyub H, Wood WG, et al. Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease. Nat Genet. 2003 Jun;34(2):157-65. 207. Turner BM. Cellular memory and the histone code. Cell. 2002 Nov 1;111(3):285-91. 208. Ulrey CL, Liu L, Andrews LG, Tollefsbol TO. The impact of metabolism on DNA methylation. Hum Mol Genet. 2005 Apr 15;14 Spec No 1:R139-47. 209. Valeri N, Vannini I, Fanini F, Calore F, Adair B, Fabbri M. Epigenetics, miRNAs, and human cancer: a new chapter in human gene regulation. Mamm Genome. 2009 Sep-Oct;20(9-10):573-80. 210. van Attikum H, Fritsch O, Hohn B, Gasser SM. Recruitment of the INO80 complex by H2A phosphorylation links ATP-dependent chromatin remodeling with DNA double-strand break repair. Cell. 2004 Dec 17;119(6):777-88. 211. Veldic M, Guidotti A, Maloku E, Davis JM, Costa E. In psychosis, cortical interneurons overexpress DNA-methyltransferase 1. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Feb 8;102(6):2152-7. 212. Vetting MW, LP SdC, Yu M, Hegde SS, Magnet S, Roderick SL, et al. Structure and functions of the GNAT superfamily of acetyltransferases. Arch Biochem Biophys. 2005 Jan 1;433(1):212-26. 213. Waggoner D. Mechanisms of disease: epigenesis. Semin Pediatr Neurol. 2007 Mar;14(1):714. 214. Wang GG, Allis CD, Chi P. Chromatin remodeling and cancer, Part II: ATP-dependent chromatin remodeling. Trends Mol Med. 2007 Sep;13(9):373-80. 215. Wang V, Wu W. MicroRNA-based therapeutics for cancer. BioDrugs. 2009;23(1):15-23. 216. Warnecke PM, Clark SJ. DNA methylation profile of the mouse skeletal alpha-actin promoter during development and differentiation. Mol Cell Biol. 1999 Jan;19(1):164-72. 217. Waterland RA, Jirtle RL. Early nutrition, epigenetic changes at transposons and imprinted genes, and enhanced susceptibility to adult chronic diseases. Nutrition. 2004 Jan;20(1):63-8. 218. Weidman JR, Dolinoy DC, Murphy SK, Jirtle RL. Cancer susceptibility: epigenetic manifestation of environmental exposures. Cancer J. 2007 Jan-Feb;13(1):9-16. 219. Whitehead KA, Langer R, Anderson DG. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 2009 Feb;8(2):129-38. 220. Wicha MS, Liu S, Dontu G. Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift. Cancer Res. 2006 Feb 15;66(4):1883-90; discussion 95-6. 221. Wilson AG. Epigenetic regulation of gene expression in the inflammatory response and relevance to common diseases. J Periodontol. 2008 Aug;79(8 Suppl):1514-9. 222. Wilson CB, Makar KW, Shnyreva M, Fitzpatrick DR. DNA methylation and the expanding epigenetics of T cell lineage commitment. Semin Immunol. 2005 Apr;17(2):105-19. 223. Wong BR, Parlati F, Qu K, Demo S, Pray T, Huang J, et al. Drug discovery in the ubiquitin regulatory pathway. Drug Discov Today. 2003 Aug 15;8(16):746-54. 224. Xie Y, Todd NW, Liu Z, Zhan M, Fang H, Peng H, et al. Altered miRNA expression in sputum for diagnosis of non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 2010 Feb;67(2):170-6. 225. Yang H, Hoshino K, Sanchez-Gonzalez B, Kantarjian H, Garcia-Manero G. Antileukemia activity of the combination of 5-aza-2'-deoxycytidine with valproic acid. Leuk Res. 2005 Jul;29(7):739-48. 226. Yang N, Coukos G, Zhang L. MicroRNA epigenetic alterations in human cancer: one step forward in diagnosis and treatment. Int J Cancer. 2008 Mar 1;122(5):963-8. 227. Yeh ET, Gong L, Kamitani T. Ubiquitin-like proteins: new wines in new bottles. Gene. 2000 May 2;248(1-2):1-14. 228. Yoshida M, Hoshikawa Y, Koseki K, Mori K, Beppu T. Structural specificity for biological
65
activity of trichostatin A, a specific inhibitor of mammalian cell cycle with potent differentiationinducing activity in Friend leukemia cells. J Antibiot (Tokyo). 1990 Sep;43(9):1101-6. 229. Yung TM, Sato S, Satoh MS. Poly(ADP-ribosyl)ation as a DNA damage-induced posttranslational modification regulating poly(ADP-ribose) polymerase-1-topoisomerase I interaction. J Biol Chem. 2004 Sep 17;279(38):39686-96. 230. Zaina S, Lindholm MW, Lund G. Nutrition and aberrant DNA methylation patterns in atherosclerosis: more than just hyperhomocysteinemia? J Nutr. 2005 Jan;135(1):5-8. 231. Zhang B, Pan X, Cobb GP, Anderson TA. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Dev Biol. 2007 Feb 1;302(1):1-12. 232. Zhang Y, Reinberg D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 2001 Sep 15;15(18):2343-60. 233. Zheng YG, Wu J, Chen Z, Goodman M. Chemical regulation of epigenetic modifications: opportunities for new cancer therapy. Med Res Rev. 2008 Sep;28(5):645-87. 234. Zhu H, Geiman TM, Xi S, Jiang Q, Schmidtmann A, Chen T, et al. Lsh is involved in de novo methylation of DNA. EMBO J. 2006 Jan 25;25(2):335-45.
66
