Endothelin gén expresszió vizsgálata endothel- és szívizomsejteken Doktori értekezés
Dr. Keltai Katalin Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Program: Szív- és érrendszeri betegségek élettana és klinikuma
Témavezetők:
Dr. Merkely Béla egyetemi tanár, az MTA doktora és Dr. Cervenak László tudományos főmunkatárs, Ph.D.
Hivatalos bírálók: Dr. Tóvári József tudományos osztályvezető, Ph.D. Dr. Kempler Péter egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Somogyi Anikó egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Lőrincz István tanszékvezető egyetemi docens, Ph.D. Dr. Mózes Miklós egyetemi adjunktus, Ph.D.
Budapest 2012
TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
4
1. BEVEZETÉS
5
1.1. Az endothelinek
5
1.1.1. Az endothelin-1 szintézise
6
1.1.2. Az endothelin receptorok
9
1.1.3. Az endothelinek élettani és sejtélettani hatása
10
1.1.4. Az endothelin-1 kardiovaszkuláris hatásai
13
1.2. Cardiomyocyták
14
1.2.1. Ischaemia/reperfúzió
16
1.3. Endothelium
17
1.3.1. Endothel diszfunkció
18
1.3.2. Az endothel diszfunkció vizsgálata
19
1.4. Anthracyclin toxicitás
20
1.4.1. Endothelin-1 és anthracyclin kezelés
22
2. CÉLKITŰZÉSEK
24
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
26
3.1. Kutyaszív ischaemia/reperfúziós modell
26
3.1.1. Kísérleti felépítés
26
3.1.2. Biokémiai vizsgálatok
27
3.2. Endothelsejtkultúrán végzett kísérletek
28
3.2.1. HUVEC izolálás és sejtkultúra
28
3.2.2. Citotoxicitás vizsgálatok
29
3.2.3. SuperArray vizsgálat
29
3.2.4. Real-time qPCR vizsgálat
30
3.2.5. Microarray vizsgálatok
31
3.2.5.1.Agilent GE microarray
31
3.2.5.2.Affymetrix DNS chip
32
3.2.6. Endothelin-1 ELISA
34
3.3. Statisztikai módszerek
34
4. EREDMÉNYEK
35
4.1. Kutyaszív ischaemia/reperfúzió modell
2
35
4.2. Endothelsejtkultúra
38
4.2.1. A doxorubicin toxicitása endothelsejteken
38
4.2.2. Doxorubicin hatása az endothelsejtek mRNS expressziós mintázatára
39
4.2.3. Endothelin-1 mRNS expresszió doxorubicinnal kezelt endothelsejteken
40
4.2.4. A doxorubicin kezelés hatása az endothelin-1 expresszióra fehérjeszinten
42
4.2.5. Doxorubicin kezelés hatása az endothelsejt genomjára - Microarray eredmények kiértékelése
43
5. MEGBESZÉLÉS
49
6. KÖVETKEZTETÉSEK
54
7. ÖSSZEFOGLALÁS
55
8. IRODALOMJEGYZÉK
57
9. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
68
10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
74
3
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE (alfabetikus sorrendben) ACE ANP Chk-1 CNP COX DXR ECE EGF ELISA ET GM-CSF HeLa HUVEC ICAM-1 IL LAD LD50 LDL MCP-1 NEP NO NOS NYHA PAI PDGF PKC qPCR ROS RT-PCR SA SAPK/JNK SEM SEP SOD TGF TNF VCAM-1
– angiotenzin konvertáló enzim – atrial natriuretic peptide / pitvari nátriuretikus peptid – checkpoint kináz-1 – C-type natriuretic peptide / C-típusú natriuretikus peptid – ciklooxigenáz – doxorubicin – endothelin convertising enzyme / endothelin konvertáló enzim – epidermal growth factor / epidermális növekedési faktor – Enzyme-linked immunosorbent assay – endothelin – Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor / granulocitamakrofág kolónia stimuláló faktor – humán méhnyakrák sejtvonal – humán umbilikális véna endothelsejt – Inter-Cellular Adhesion Molecule 1 – interleukin – left anterior descendent / bal elülső leszálló koronáriaág – félletális dózis – low density lipoprotein / alacsony denzitású lipoprotein – monocyte chemotactic protein-1 / monocita kemotaktikus fehérje-1 – neutrális endopeptidáz – nitrogén monoxid – nitric oxide synthase / nitrogén monoxid szintetizáló enzim – New York Heart Association – plazminogén aktivátor inhibitor – platelet-derived growth factor – protein kinase C / protein kináz C – quantitatív PCR – reactive oxygen species – real time polymerase chain reaction / valós idejű polimeráz láncreakció – Superarray – stressz-aktivált protein kináz/c-Jun-Nterminal kináz – standard error – szolubilis endopeptidáz – superoxide dismutase – transforming growth factor – tumornecrosis faktor – vascular cell adhesion molecule 1
4
1. BEVEZETÉS
1.1 Az endothelinek Yanagisawa és munkatársai 1988-ban írták le az endothelium által termelt vazokonstriktor peptidet, melyet endothelinnek neveztek el.1 További kutatások hamarosan tisztázták, hogy nem egyetlen peptidről van szó, hanem egy fehérje családról, aminek eddigi ismereteink szerint három tagja van: az endothelin-1 (ET-1), az endothelin-2 (ET-2) és az endothelin-3 (ET-3).2 Az endothelinek fiziológiás és patológiás szerepe kiterjedt kutatások tárgya, de még nem minden részletében tisztázott. A szervezet számos szervében és szövetében képződnek; autokrin, parakrin és endokrin hatással rendelkeznek. Az endothelinek bioszintézisének legfontosabb helye a vaszkuláris endothelium. ET-1-et termelnek még a szív, a veseglomerulus mesangialis és epithel sejtjei, az agy, a gerincvelő és az aorta simaizomsejtjei is. A szív és az agy sejtjei szintetizálnak ET-2-t is, míg az ET-3 képzésében leginkább az endokrin rendszer, a gastrointestinalis rendszer és a központi idegrendszer vesz részt.3, 4 A három - eddig izolált - endothelin közül bizonyítottan a legkifejezettebb kardiovaszkuláris hatással az ET-1 rendelkezik. Az ET-1 egy 21 aminosavból álló peptid, két intramolekuláris diszulfid híddal. Az ET2-t és az ET-3-t, bár szerkezetileg hasonlóak az ET-1-hez, külön gének kódolják.5,
6
Ezen túlmenően mindhárom endothelin típus jelentős strukturális és funkcionális hasonlóságot mutat a sarafotoxin izopeptid családdal, amelyet az izraeli ásóvipera (Atractaspis engaddensis) kígyómérgéből izoláltak2, 4 (1. ábra).
5
1. ábra. Az endothelin izoformok és a sarafotoxin S6b szerkezete. 7 1.1.1. Az endothelin-1 szintézise A humán ET-1 génje a 6-os kromoszómán, az aktív fehérjerészt a második exon kódolja. Az ET-2 gén az 1-es, az ET-3 gén pedig a 20-as kromoszómán található. Az ET-1 gén promoter régiója tipikus CAAT és TATA szekvenciákat tartalmaz, valamint GATA-2 transzkripciós proteinkötő helyet, a proteinkináz-C aktiválta (PKC) c-fos, cjun kötő AP-1 helyet és számos egyéb, transzkripciót szabályozó szekvenciát, melyek által különböző növekedési faktorok, vazoaktív peptidek képesek modulálni az ET képződését.8 Az ET-1 gén átírását az angiotenzin II, a katekolaminok, a növekedési faktorok, az inzulin, a thrombin, az oxidált LDL vagy a hypoxia serkentik pl. PKC-n
6
keresztül, míg az atrialis natriuretikus peptid (ANP), az ET-3 és a prosztanoidok a peptid szintézisére gátlóan hatnak (cGMP-szint növelés következtében kialakuló intracelluláris Ca2+-szint csökkenés által).9,
10 11 12
Az ET-1 erős vazokonstriktorként
hat a simaizomsejteken, míg az endothelsejtekben az NO termelődés fokozása révén a vazodilatációt segíti elő.13 Különböző stimulusok, mint például az oxidatív stressz, a hypoxia, az ischaemia, a nyíróerők indukálják a peptid messenger-RNS (mRNS)-ének transzkripcióját, ezzel percek alatt szintetizálódik és szekretálódik az ET-1. Az mRNS féléletideje 15-20 perc, a peptid féléletideje a plazmában 4-7 perc. Így az endothelsejtek gyors, azonnali hatást képesek közvetíteni. Az érett endothelin képzés létrejöhet intracellulárisan, pl. a Golgi apparátusban, valamint sejtmembrán szinten, pl. a simaizomsejtek felszínén, vagy az endothelsejtek felszínén, intravascularis szinten. Az endothelin génből egy 209 aminosavból álló preproendothelin íródik át, melyről a szignálszekvencia
lehasadásával
proendothelin
lesz.
A
proendothelinből
intracellulárisan egy furin-szerű enzim hasítása által 38 aminosavas big-endothelin keletkezik. Ezt a molekulát hasítja egy metalloproteáz, az endothelin konvertáló enzim (ECE), és keletkezik az aktív endothelin (2. ábra). Az ECE cinkiont tartalmazó metalloproteáz enzim, mely a neutrális endopeptidáz család (NEP) tagja. Több izoformját írták le: ECE-1, ECE-2, melyeknek még külön legalább négy, illetve két alizoformjáról tudunk. Az ECE egyaránt elhelyezkedhet intracelluláris granulumokban, ahonnan szecernálódni képes, és a sejtfelszínen. Az ECE-1 nagyon specifikus enzime az endothelin képződésnek, két transzmembrán glikoprotein dimerje van, melyek két diszulfid híddal kapcsolódnak egymáshoz. Az ECE-1a és ECE-1b izoformok azonos gén által kódoltak. A gén az 1-es kromoszómán helyezkedik el és 19 exont tartalmaz. Az ECE-1a promoter régió többek között nyíróerő reszponzív elemeket, az ECE-1b promotere glükokortikoid és akut-fázis fehérje kötő szekvenciákat is magába foglal. A két izoform expressziójának szabályozása egymástól eltér: az 1a izoform konstitutívan, alapszinten is expresszálódik, míg az 1b izoform expressziója különböző stimulusok válaszreakciójaként indukálódik. Lokalizáció szempontjából az 1a izoform az endothelsejtekre és a sejtmembrán felszínre jellemző, míg az 1b izoformot inkább a simaizomsejtek termelik, és a transz-Golgi-készülékekben
7
jelenik meg. Az ECE-2 egy másik gén terméke, körülbelül 50 %-os homológiát mutat az ECE-1-gyel. Jelenléte az agy szöveteire jellemző, egyéb szövetekben kisebb mértékben jelenik meg, mint az ECE-1. A membránhoz kötött ECE kizárólagos szerepét megkérdőjelezi az a tény, hogy ECE-1 és ECE-2 hiányos (knock-out) egerekben csak 60 %-kal csökken a plazma ET-1 szint. A big-ET-1 hasításában más enzimek is részt vehetnek, mint például a KELL antigén, a szekretált egyéb neutrális endopeptidázok, az emberi hízósejt kimázok, az erek simaizom kimáza és a szolubilis endopeptidáz (SEP) is.14 A hízósejtekben a big ET-1-ből ECE-től függetlenül, egy szerin-proteáz enzim, a kimáz enzim hatására nem csak a 21 aminósavból álló ET-1 keletkezhet, hanem egy a közelmúltban leírt 31 aminósavas ET-1(1-31) is. Az enzim az angiotenzin-II termelődésében is szerepet játszik.15 Az ET-1(1-31) ETAR receptoron keresztül fejti ki hatását, pl. vazokonstrikciót, simaizomproliferációt.16 Klinikai jelentősége még nem ismert, szabályozó szerepet feltételeznek a peptidnek az adrenokortikális működésben is.17
2. ábra. Az endothelin-1 képződése és elsődleges peptid szerkezete18
8
Az ET-1 és ET-2 esetében a hidrolízis az N-terminális huszonegyedik triptofán és huszonkettedik valin között, az ET-3 esetében a huszonegyedik triptofán és huszonkettedik izoleucin között jön létre (2. ábra).18 Az aktív endothelin képzés létrejöhet intracellulárisan, pl. a Golgi apparátusban, valamint sejtmembrán szinten, pl. a simaizomsejtek vagy az endothelsejtek felszínén. A keletkezett ET-1 több mint 75 %a abluminálisan szecernálódik, ahol könnyen eléri a vaszkuláris media simaizomsejtjein található receptorait, tehát inkább tartható parakrin hatásúnak, mint endokrin hormonnak.19-21 Azt is megfigyelték, hogy a kismértékű nyíróerők ET-1 szintézis növekedést, míg a nagymértékű áramláskor keletkező nyíróerők NO szintézist indukálnak. Az endothelin szekréció összefügg a celluláris skeletalis elemekkel is, a csökkent F-aktin produkció csökkent ET-1 képzéssel jár.19 Az endothelin géntranszkripciós sejtválasz integratív jellegű, ezáltal mindig az aktuális keringési státuszhoz alkalmazkodik.
1.1.2. Endothelin receptorok Jelenleg két emlős ET receptort ismerünk. Az ET(A) és ET(B) receptorok 45-50 kDa nagyságú molekulák, 50 % körüli homológiát mutatnak egymással. A jól konzervált szekvenciák a transzmembrán szakaszok és az intracelluláris hélix hurkok. A receptorok különböző erősséggel kötik meg az endothelineket. Az ET(A) affinitásának sorrendje: ET-1 > ET-2 >> ET-3, az ET(B) receptorhoz viszont egyforma erősséggel kötődik az endothelin család minden tagja.22-24Az endothelinek nagy affinitással kötődnek (nM-os koncentráció tartományban) transzmembrán receptoraikhoz. Az ET receptor telítődés gyorsan eléri steady-state állapotát (10-20 perc alatt 37oC-on), de a receptorról való disszociálás nagyon lassú. A szinte irreverzibilis receptor kötődésnek tulajdonítható a hosszú tartamú simaizom-kontrakció. A receptorok eloszlása szövet- és sejtspecifikus. Az ET(A) receptorok nagy számban vannak jelen az erek simaizomsejtjein, a szívizomsejteken, a szív fibroblasztjaiban, az endothelsejteken
azonban
nem
találhatók
meg.
Döntően
a
vazokonstrikció
kialakulásában játszik szerepet. Az ET(B) receptorok inkább az endothelsejteket dominálják, és innen továbbítják az endothelin hatás negatív visszacsatolását.
9
Fiziológiás esetben kisebb mértékben simaizomsejteken és a szíven is expresszálódnak, de jelentőségük és jelenlétük inkább patológiás állapotokban nő meg ezeken a helyeken, vazospazmust idézve elő. Atherosclerosisban és ischaemiás állapotokban mutattak ki kontrakciót közvetítő megnövekedett ET(B) szintet az erek falában és a szíven.22 A két receptor génátíródásának mértéke szervszintű mintázatot mutat. Northern-blot technikával az ET(A) receptor mRNS számottevő jelenlétét mutatták ki az erek falában, a szívben, az agyban és a tüdőben, az ET(B) receptor mRNS jelenléte pedig inkább a tüdőre és a vesére jellemző. A tüdő ET(B) receptorainak feladata az ET-1 clearence biztosítása. Ezen kívül az angiotenzin II, PDGF, TGF és forbol-észterek (PKC stimuláló szerek) csökkenteni képesek, az EGF és az ösztrogén indukálják az ET(A) receptor átírását. A katekolaminok csökkentik, míg a CNP, angiotenzin II növelik az ET(B) expressziót.19 Az ET(A) receptornak fontos szerepe van az ET-1 lebontásában, az endothelin konvertáló enzim gátlásában és az endothelsejtek túlélésében. Az endothelialis és a simaizomsejtekben előforduló ET(B) receptorok ugyan molekulárisan azonosak, de farmakológiailag különbséget lehet tenni közöttük. Ezért külön jelölést is kaptak, ET(B1) receptor (endotheliumban) és ET(B2) receptor (simaizomban).22 Az ET receptorok jellemzően G-fehérje kötő transzmembrán receptorok. A két receptor extracelluláris N-terminális és intracelluláris C-terminális szekvenciái különböző szerkezetet mutatnak. A kötött G-fehérjék között vannak pertussis-toxin szenzitív és inszenzitív fehérjék is. Ilyen módon egy receptor több jelátviteli utat is képes elindítani. 1.1.3 Az endothelinek élettani és sejtélettani hatásai Az endothelinek komplex, magasan szabályozott sejten belüli jelátviteli rendszereket aktiválnak. Következményként rövid távú hatások, mint például a simaizomsejtkontrakció vagy vazoaktív anyagok elválasztását serkentő hatás, illetve hosszú távon kialakuló hatások, mint például a proliferáció és migráció alakulnak ki. Az ET-1 a ma ismert egyik legerősebb vazokonstriktor. Mind a három endothelin egy átmeneti, endothelium-függő vazodilatációt okoz, még a vazokonstriktív hatás kifejlődése előtt. Ez az ET-3 esetében a legkifejezettebb. A vazokonstrikciót az ET-1-
10
nek a simaizomsejtek ET(A) receptoraihoz való kötődése okozza. Az ET(B) receptorok aktivációja indirekt módon, vazoaktív anyagok (pl. NO) felszabadulása által hozza létre dilatatív hatását. Emellett egyre több bizonyíték támasztja alá azt a feltételezést, hogy az ET(B) receptoroknak is van vazokonstriktív hatásuk3 (3. ábra).
3. ábra. Az endothelin vaszkuláris tónust szabályzó funkciója3 Az ET-1-et a bigET-1-ből az ECE ( endothelin konvertáló enzim) hasítja le. Döntően a simaizomsejtek ET(A) receptorain hatva alakul ki a vazokonstrikció. Az endothelsejtek ET(B) receptoraihoz kapcsolódva NO (nitrogén monoxid) termelődik, ami a simaizomsejteken vazodilatációt hoz létre. Állatkísérletek bizonyítják, hogy az ET-1 növeli a vérnyomást in vivo beadást követően egy órán belül és fiziológiás szerepet játszik az erek bazális tónusának fenntartásában és a fiziológiás vérnyomás beállításában.25 Az emberi szervezetben a szív mellett a vese erei a legérzékenyebbek az endothelin vazokonstriktív hatására. Az ET-1 az ET(B)
11
receptorokon keresztül befolyásolja a víz- és a nátriumforgalmat a nefron terminális részében, azaz csökkenti a nátrium kiválasztását, csökkenti a glomerulus filtrációs rátát és növeli az efferens veseartéria vazokonstrikcióját. Ezáltal nő az intravaszkuláris volumen, mely a veseerek szintén fokozott proliferációjával együtt hypertonia kialakulását idézi elő.26 A mezenteriális ereken, illetve a vázizom erein ez a hatás kevésbé érvényesül. Proliferációt serkentő, mitogén hatása van az érfal media simaizomsejtjein és szívizomsejteken valamint a vese glomeruláris mesangialis sejtjein. A kardiális fibroblasztok kollagéntermelését és Ca2+-raktározását is elősegíti. A c-fos és a c-myc, e két növekedést serkentő protoonkogén mRNS szintézisét növeli.27 Az endothelin
hatásosan
serkenti
a
monocyták
migrációját,
fagocitózisát
és
citokintermelését (TNF, IL, GM-CSF), ami a makrofágok aktiválásán keresztül gyulladásos sejtválaszt vált ki.28, 29 Hatása van egyéb keringést szabályozó faktorok, rendszerek működésére, mint például a renin–angiotenzin–aldoszteron rendszerre, a szimpatikus rendszerre, a vazopresszinre, a natriuretikus peptidek aktivitására.30 Az ET-1 gátolja a renin felszabadulását és serkenti az endothelialis angiotenzin konvertáló enzim (ACE) aktivitást. Az angiotenzin II viszont növeli az ET-1 szintet és az endothelin konvertáló enzim aktivitást. Az ET-1 fokozza továbbá az aldoszteron és az adrenalin felszabadulását. Az ANP-nek viszont nemcsak a felszabadulását, de már a termelését is serkenti, így befolyásolja a vérvolument, a vérnyomást, a véráramlást és a vérviszkozitást. Az endothelineknek a fentieken túl patogenetikai szerepet tulajdonítanak a csontmetasztázis-képzésben, az angiogenezisben, az apoptózis szabályozásában és az oxigéngyökök termelődésében.3, 4, 18 Az ET-1 szerepet játszik ezen kívül mind a centrális, mind a perifériás idegrendszer szabályozásában. Hatása van az agyi neurotranszmisszióra, a vérnyomás emelését a központi szimpatikus kiáramlás révén is növeli.4 A
fentieken
kívül
hatása
van
a
pajzsmirigyre,
a
mellékpajzsmirigyre,
a
csontmetabolizmusra, a bélrendszerben vazoaktív intesztinális konstriktor fehérje, és szerepe van a köldökérben a vena umbilica zárásában, valamint a menstruáció szabályozásában.31
12
1.1.4. Az endothelin-1 kardiovaszkuláris hatásai
Kardiovaszkuláris hatásai közül fontos a bazális koronáriatónus beállítása, melyben egyéb, keringő ágensek, pl. katekolaminok és lokális idegi hatások is befolyással bírnak. A koronária véráramlása annak a dinamikus egyensúlynak az eredménye, amit az endogén vazodilatátorok (NO, prosztaciklin) és vazokonstriktorok (endothelin) hatásának együttese alakít ki. Az ET-1 a koronária ereket szűkíti, aminek következménye lehet miokardiális ischaemia vagy fatális aritmia (kamrafibrilláció).32 Alacsony dózisú ET-1 infúziót követően, a súlyos kamrai ritmuszavarok megjelenése megelőzi a miokardium ischaemiás jeleit, az akciós potenciál jellemzően megnyúlik, ami növeli a korai utódepolarizáció kialakulásának esélyét.33 Mivel ez a folyamat Ca2+antagonistákkal
részlegesen
gátolható,
valószínűsíthető
az
intracelluláris
kálciumnövekedés kóroki szerepe.34 Az endothelin receptorok hatással vannak a sejtmembránban elhelyezkedő ioncsatornákra, így azokon keresztül okoznak például sejten belüli
kálciumszint-emelkedést.
Megjelenési
formáit
és
kialakulásának
időrendiségét figyelembe véve, a súlyos szívelégtelenségben szenvedő betegek életét kioltó ritmuszavarok nagy része meglepő hasonlóságot mutat az ET-1-gyel előidézhető kísérleti aritmiákkal.33, 35 Az endothelinnek in vitro direkt pozitív inotróp és ritkábban kronotróp hatása is van.36 A pozitív inotróp hatás a PKC-n és a Na+/H+ cserélő ioncsatornán keresztül valósul meg, melynek következtében a myofilamentumok Ca2+ érzékenysége megnő.20 In vivo hatása kettős; kis dózisban pozitív inotróp, nagyobb dózisnál csökkenti a perctérfogatot, esetleg kamrai aritmiát vagy ischaemiát idéz elő.37 Humán vizsgálatokban a fiziológiás endothelin mennyiség csökkentette a perctérfogatot. A pontos mechanizmus nem ismert, de szerepet játszhat benne a baroreceptor mediálta szívfrekvencia-csökkenés vagy az utóterhelés-növekedés. Számos adat bizonyítja, hogy az ET-1 komoly szerepet játszik az atheroscleroticus lézió kialakulásában és progrediálásában is.29, 38-40 Az ET-1 mitotikus hatását valószínűleg az ET(A) receptoron keresztül fejti ki, a receptor blokkolása az atherosclerotikus lézió csökkenését eredményezi.41 Humán vizsgálatok azt igazolják, hogy a magas endothelin szint gyorsítja a koronáriák atheroscleroticus elváltozását. Az atherosclerosisos
13
léziókban magasabb szöveti endothelin szintet lehet mérni, mint a normál koronáriákban. Az ET-1 nemcsak növeli az atherosclerosisos erekben az értónust, de felerősíti az egyéb hatásokra kialakuló vazospazmust is.
Így megmagyarázható az
instabil anginában tapasztalható szegmentális koronária hiperreaktivitás is.42 Az emelkedett koleszterinszint nemcsak a keringő endothelinszintet emeli, de a szöveti ET1 és az ECE aktivitását is fokozza. Adatok vannak arra is, hogy statin kezelés a koleszterinszint ill. az atherosclerotikus elváltozások mértékének csökkentése mellett az ET-1 és a gyulladásos markerek szintjét is csökkenti43. Az endothelin vazokonstriktív szerepe mellett hat a monocitákra, a vérlemezkékre, a fibroblaszt sejtekre, a simaizomsejtekre és az endothelsejtekre. Az ET(B) receptoron keresztül kemotaktikus hatása van, a gyulladásos sejtek aktiválásán keresztül gyorsítja az atherosclerosis folyamatát. Az ET-1-nek szerepe van az érfal kalcifikálódásában is, elősegíti a kálcium lerakódását az érfalba.44 Primer pulmonális hypertoniában az ET-1 mitotikus és vazokonstriktor hatása egyértelműen hozzájárul a pulmonális hypertensio létrejöttéhez. A pulmonális erek endotheliuma több ET-1-et termel, mint amennyi a keringésből kivonható, ezért az ET-1 plazmaszintje a primer pulmonalis hypertoniásokban lényegesen magasabb, mint egészségesekben.45 A normálisnál kétszer magasabb ET-1 plazmaszint mérhető szekunder pulmonális hypertoniában is.46 Hipoxia hatására egerekben hatszoros ET-1 génexpresszió fokozódást figyeltek meg a pulmonális erekben.47 1.2. Cardiomyocyták Az ET-1 hatására a szívizomsejtek hipertrofizálnak.48 Patkány szívizomsejteken terhelés hatására az ET-1 gén expressziójának fokozódását mutatták ki, melynek így szerepe lehet a terhelés ill. tréning hatására létrejövő adaptív hipertrófia kialakulásában.49 Az ET1 cardiomyocyta hipertrófiát okozó hatása az ET(A) receptoron keresztül valósul meg, és mértéke attól függ, hogy milyen az endothelin receptorok megoszlása. A fiziológiás arány a különböző szívbetegségek következtében megváltozik. Különböző elváltozásokban, mint ischaemia-reperfúzió esetén, krónikus szívelégtelenségben, magas vérnyomásban vagy atherosclerosisban ez az egyensúly megbomlik a vazokonstriktorok javára, az endothelin termelés és lebontás között aránytalanság lép
14
fel. Az ET-1 az ET(A) receptorokhoz kapcsolódva a PKC rendszert aktiválja, fokozza a c-jun transzkripciós faktor gén expresszióját, a c-Jun fehérje mennyiségét és foszforilációját. A c-Jun expresszió és foszforiláció igen fontos számos egyéb gén átírásának szabályozásában50 (4. ábra).
4. ábra. Endothelin-1 hatás intracelluláris szignáltranszdukciós útja szívizomsejtekben. A fokozott kontraktilitás és a hipertófiás válasz kialakulásában szerepet játszó folyamatok. AC, adenylyl cyclase; DAG, diacylglycerol; IP3, inositol-1,4,5triphosphate; MAP kinase, mitogen activated protein kinase; NCX, Na+-Ca2+ exchanger; NHE, Na+-H+ exchanger; PKA, protein kinase A; PKC , protein kinase C; PLC, phospholipase C.50, 51(From Sugden PH, Clerk A. Endothelin signalling in the cardiac myocyte and its pathophysiological relevance. Curr Vasc Pharmacol 2005;3:343-51.) Kísérleti körülmények között, az eNOS termelésre képtelen egerekben diastolés diszfunkció alakult ki, melyet a fokozott ET-1 termelődés képes volt kivédeni. Az ET-1 túltermelődés hatására az oxidatív stresszért felelős gének fokozott expressziója is megfigyelhető volt, melyek tartós hatását a bal kamra funkcióra azonban már nem vizsgálták.52 Újszülött patkányszíven tartós ET-1 hatásra az intracelluláris kálcium áram csökkenését tapasztalták, mely a kardiális funkció csökkenésével járt. A hatás az ET(A) receptoron keresztül valósult meg, a receptor blokkolásával kivédhető volt.53 Egér
15
szívizomsejt (HL-1) protein expressziójának és szignál transzdukciós útjainak vizsgálatakor azt találták, hogy az ET-1 döntően a mitogén-aktivált protein kináz és a phosphatidylinositol-3-kináz/AKT útvonalon aktiválja a sejteket.54 Cardiomyocyták és fibroblasztok közös sejttenyészetében azt figyelték meg, hogy a lokálisan termelődött ET-1 autokrin stimulátora volt a fibroblaszt proliferációnak ill. hogy a környező myocyták által termelt ANP parakrin módon gátolta ezt a proliferációt. Ez utóbbi hatás a GATA4 foszforiláció csökkenése útján valósult meg.55
1.2.1 Ischaemia/reperfúzió Az ET-1 szerepe miokardiális infarktusban kettős, egyrészt oki szerepe lehet az infarktus kialakulásában az atherosclerosis, endothel diszfunkció útján, másrészt az infarktus
bekövetkeztével
stabilizáló
hatása
van,
elősegíti
a
hegképződést.
Kemotaktikus hatására neutrofil sejtek és makrofágok jelennek meg. Miokardiális infarktus után az ET-1 hatására fokozódik a fibroblaszt proliferáció, az adhéziós molekulák expressziója és az extracelluláris mátrix depozíció, melyek összessége a miokardium fibrózisát okozza, a posztinfarktusos remodelling és hegképződés részeként. Ugyanakkor az ET-1 magas szintje kedvezőtlen a koronária keringésre, mert direkt vazokonstrikciót, növekedési faktorok aktiválásával simaizomsejt proliferációt okoz, stimulálja a trombociták aggregációját, intima hiperpláziát, fokozott kollagén-1 szintézist idéz elő. Az ET-1 koncentráció növekedésének ütemével megegyezően súlyosbodnak az anginás panaszok, az instabil angina előfordulása nő.56 Az ET-1 miokardiális infarktusban az egy éves túlélés prognosztikai faktora, posztinfarktusos betegekben minél nagyobb az ET-1 szint, annál gyakoribb a halálozás.57-59 Mind klinikai, mind kísérletes acut ischaemiás vizsgálatok során kimutatták, hogy az ET-1 szerepet játszhat a szívizomkárosodás, a bal kamrai remodelling kialakulásában és a malignus kamrai ritmuszavarok előfordulásában.32, 60-62 Emelkedett plazma ET-1 szintet mutattak ki akut miokardiális infarktus korai szakaszában, mely a csúcsot kb. 6 óra után éri el és 24 óra után visszatér a kiindulási értékre.63 Szövődményes esetekben, szívelégtelenség, kardiogén shock kialakulása esetén az ET-1 plazma szint tartósan magas marad.64, 65
16
Az akut miokardiális infarktus korai szakaszában minél rövidebb idő alatt sikerül elérni a reperfúziót, annál nagyobb mértékben csökken a sejt és szövetszintű károsodás. Sok esetben azonban az infarktusért felelős artéria korai és megfelelő megnyitása ellenére sem megfelelő a reperfúzió, hatékonyságát csökkenti a mikrovaszkuláris keringés csökkenése és az elvileg életképes endothel és szívizomsejtek reperfúziós károsodása.66 Ennek az ún. no-reflow jelenségnek a kialakulásában az ET-1 patogenetikai szerepét valószínűsítik.67, 68 Kutyákon végzett kísérlet során a bal koronária 90 perces lekötését követően az intrakoronáriásan adott ET-A antagonista hatására a no-reflow jelenség kiterjedése harmadára, a tényleges infarktus terület a felére csökkent.67 Nem teljesen tisztázott azonban, hogy a tapasztalt ET-1 plazmaszint emelkedés az ischaemiás miokardium fokozott termelésének következménye-e. Kutya modellben Miyauchi és munkatársai nem találtak jelentős ET-1 plazmaszint változást az ischaemia alatt.69 Patkányszív modellen a prepro-ET-1 mRNS fokozott expressziója mutatható ki szívizomsejtekben, mely stimulált lokális produkcióra utal. Egy másik kísérletben az ischaemia alatt megemelkedett plazma ET-1 szint a reperfúzió során tovább nőtt, ami a reperfúzió
kiváltotta
kimosási
jelenségnek
tudható
be.70
Szintén
patkány
szívizomsejteken mutatták ki hipoxia ill. acidózis hatására mind az ET-1, mind a receptorok expressziójának növekedését. A jelenség NO adásával részben gátolható volt.71 Kutyaszív ischaemia/reperfúziós modelleken a sinus coronariusból vett mintákból az ET-1 fokozott kibocsátását mutatták ki reperfúzió alatt.68 Egy másik kutyákon végzett vizsgálatban viszont nem sikerült ET-1 emelkedést kimutatni ischaemia/reperfúzió során.69, 72 Bizonyítást nyert, hogy perkután transzlumináris koronáriaplasztikát követően megnő az endothelin plazmaszintje.73 Vizsgálatokkal igazolták, hogy ez nem az ischaemia hatására jön létre, hanem az endothelium sérülése váltja ki a peptid szintjének emelkedését.74 A sérült endotheliumnak magasabb az ET-1, az ET-3, az ECE és az ET(A) receptor expressziója. Ez a sérülést követő 14 napon keresztül áll fenn, létrehozva ezzel az ET-1 elnyújtott és aktív hiperpláziás hatását.75
1.3 Endothelium
17
Az ereket az egy sejtsor vastagságú vaszkuláris endothelium béleli. Fizikai barrier funkciója mellett aktív hemodinamikai és biokémiai feladatai vannak. Ide tartozik a vaszkuláris tónus és struktúra fenntartása76, a vaszkuláris sejtek növekedésének, a trombotikus és a fibrinolítikus folyamatoknak, a gyulladásos és immunfolyamatoknak, a fehérvérsejtek és a trombociták adhéziójának, a vaszkuláris permeabilitásnak, az oxidációs - redukciós folyamatoknak a szabályozása, a lipidoxidáció befolyásolása. Mivel a keringő vérrel direkt kapcsolata van, az endothelium károsodhat az intravénásan adott anyagok, pl. kemoterápiás szerek által. Az endothel károsodás ebben az esetben kétélű: egyrészt elősegíti a tumorellenes kezelést a daganat ereinek károsítása és hipoxia kialakítása révén, másrészt az egészséges szövetekben létrejövő endothelkárosodás következtében kialakuló, akár súlyos endothel diszfunkció miatt nemkívánatos kardiovaszkuláris mellékhatások jelentkeznek.77-79 Az endotheliumnak kiemelt szerepe van a vaszkuláris homeosztázis szabályozásában. Az endothelt érintő hatások, az érfal és az endothel funkciójának károsodásán keresztül kardiovaszkuláris betegségek, pl. atherosclerosis, hypertonia kialakulásához vezetnek. Mivel ez utóbbi számos kardiovaszkuláris
betegségben
megfigyelhető,
nem
meglepő,
hogy
számos
daganatellenes szernek van kardiovaszkuláris mellékhatása. Az endothelsejtek parakrin úton szabályozzák a környezetükben levő sejtek működését, tartják fenn az érfal tónusát. Ezért az utóbbi évek kutatásainak fő célpontja az endothelium által elválasztott anyagok – többek között az ET-1 - és ezek szerepe különböző patofiziológiai állapotokban.76
1.3.1. Endothel diszfunkció A különböző kémiai és fizikai változásokra az endothelium vazoaktív anyagok és szignáltranszdukciós molekulák - nitrogén-monoxid, prosztaciklinek, endothelinek, interleukinok, adhéziós molekulák és fibrinolitikus faktorok - szintézisével és kibocsátásával reagál.80 Az endothelium biokémiai vagy mechanikai sérülése a különböző hatású molekulák egyensúlyának felborulásához vezet. Megszűnik az egyensúly a relaxáló és a vazokonstriktor faktorok között, az anti- és a prokoaguláns tényezők és a növekedést serkentő és gátló anyagok között. Funkcionális megközelítésben azt az állapotot nevezik endothel diszfunkciónak, amikor egy adott
18
noxára nem a fiziológiás válaszreakció vagy nem a fiziológiás mértékű válaszreakció jön létre.81 Mára elterjedt az a nézet, hogy számos kardiovaszkuláris rizikótényező, mint például az
oxidatív stresszt
okozó dohányzás,
cukorbetegség vagy elhízás
tulajdonképpen az endothelium diszfunkcióját előidézve fejti ki kártékony hatását.82 Patológiás állapotokban a szabadgyök-képződés is jelentősen megnő. Az emelkedett szabadgyök-koncentráció önmagában is felelőssé tehető az endothel diszfunkcióért, mivel a szuperoxid szabadgyökök az endotheliumhoz közvetlenül kapcsolódva, direkt módon képesek azt károsítani.83,
84
Jelentősen növekvő számú publikáció bizonyítja,
hogy az ET-1 részt vesz a daganatos megbetegedések patogenezisében is.2,
85
A
kardiovaszkuláris és az onkológiai betegségekben gyakran kimutatható endothel diszfunkció. A különböző daganatokban
86-88
és kardiovaszkuláris betegségekben, mint
pl. krónikus szívelégtelenség, ischemiás szívbetegség, hypertonia, atherosclerosis és pulmonális hypertonia2 kimutatható emelkedett ET-1 szint feltehetően az endothel diszfunkció következménye. Másrészről az ET-1-nek szerepe lehet az endothel diszfunkció kialakulásában, mivel parakrin és autokrin hatása van az endothelsejtekre.2, 13, 89
Salani és munkatársai90 megfigyelték, hogy exogén ET-1 angiogenezist indukált
HUVEC-en. Knowles és munkatársai91 közlése szerint az ET-1-nek direkt angiogenikus hatása van az endothelsejtekre és indirekt módon fokozza az angiogenezist a fibroblasztok és a tumorsejtek pro-angiogenikus faktorainak termelésén keresztül.
1.3.2. Az endothel diszfunkció vizsgálata Az endothel diszfunkció komplex folyamat, különböző aspektusainak megítélésére többféle vizsgálómódszer áll rendelkezésre. A módszerek egy része a keringő vazoaktív anyagok (például az ET-1, von Willebrand faktor, adhéziós molekulák) meghatározásán alapul, de léteznek egyéb, az endothelium működését vizsgáló invazív, szemi-invazív és non-invazív vizsgálatok is.79, 82 Az invazív eljárások közé tartozik a kvantitatív koronarográfia, amikor az epikardiális erekbe adott vazoaktív anyag (acetilkolin) határára a normális koronáriaerekben a fokozott NO-elválasztás révén vazodilatáció lép fel. Endothel diszfunkció esetén paradox vazokonstrikció látható.
19
A legelterjedtebben alkalmazott non-invazív vizsgálat az artéria brachialis ultrahang vizsgálata, az áramlás-mediált vazodilatáció regisztrálása. Ebben az esetben a shearstress
(falfeszülés)
hatására
kialakuló
endothel-függő
vazodilatációt
és
áramlásfokozódást mérik. A dilatáció mértéke arányos az endothel nitrogén-monoxid termelésével, és korrelál a koronáriaerek endothel-dependens vazodilatációjával. Az endothel funkciójának vizsgálatára használják még a carotis intima-média távolság mérését, a pulzushullám terjedési sebesség meghatározását ill. újabban a koronária erek MRI vizsgálatát is. 92, 93
1.4. Anthracyclin toxicitás Az anthracyclinek (doxorubicin (DXR)) kardiovaszkuláris toxikus hatása széles körben ismert.
A
szívet
érintik
a
szer
alkalmazása
után
közvetlenül
jelentkező
szupraventrikuláris, ventrikuláris tachikardiák, az extraszisztolék, a miokarditisz, perikarditisz. Ezek klinikailag jól befolyásolhatók. Veszélyesebb és súlyosabb problémát jelentő következmény a fokozatosan kialakuló kardiomiopátia, melynek talaján krónikus szívelégtelenség alakulhat ki.94 Kevés ismerettel rendelkezünk az anthracyclinek vaszkuláris károsodást, endothel diszfunkciót okozó hatásáról, melyek részben akutan, részben krónikusan jelentkeznek. Az anthracyclinek toxicitásának pontos mechanizmusa teljes részletességében még nem tisztázott, mai ismereteink szerint valószínűleg multifaktoriális. Részben direkt DNS-károsító hatása (interkaláció, alkylálás, cross linking), részben direkt membránhatások, részben szabadgyök-képződés ill. apoptózis indukció ismertek.95-98 A tumorellenes hatás a DNS-kötődés mértékével és a következményes DNS-károsodással függ össze99. A doxorubicin quinon formájából a citokróm P450 hatására semiquinon szabadgyök képződik (5. ábra), mely oxidáció útján vissza tud alakulni az eredeti molekulává, miközben szuperoxid anion keletkezik. A szuperoxid lipidperoxidáción keresztül az endoplazmás reticulum, a mitokondrium és a nukleinsav károsodását okozza. A DXR-nak a Ca2+-csatornákra gyakorolt hatása miatt nő az intracelluláris Ca2+-szint, a sarcoplasmás reticulumból kiürül a Ca2+-raktár.
20
5. ábra. A doxorubicin szerkezete és biokémiai átalakulása100 A szuperoxidok redukcióját a szuperoxid-dizmutáz nevű enzim végzi. A keletkezett hidrogén-peroxid másik két enzim segítségével alakul tovább. A kataláz egyenlő mennyiségben bontja a hidrogén-peroxidot vízzé és oxigénné, a glutation-peroxidáz pedig vízzé és oxidált glutationná konvertálja a képződött szabadgyököket. A miokardium nem tartalmaz katalázt, így ez a szövet különösen szenzitív a DXR károsító hatására, hiszen a kialakuló reaktív oxigénvegyületeket csak egyetlen, gyorsan kimerülő enzimrendszerrel képes eliminálni.99 Vaszkuláris endothelsejtekben kimutatták, hogy a DXR triggerelte a reaktív oxigén vegyületek termelődését, melynek eredményeként oxidatív DNS károsodások (pl. DNS törések) jöttek létre. A DXR növelte a p53 expresszióját, fokozta a checkpoint kináz (Chk-1) és a stressz-aktivált protein kináz/cJun-Nterminal
kináz
(SAPK/JNK)
aktivitását
is
humán
véna
umbilikális
endothelsejtekben (HUVEC).101, 102 Az oxidatív stressz mellett a DXR-nak számos más hatása is van az endothelre, melyeknek szerepe lehet a káros kardiovaszkuláris
21
hatásokban. Például DXR kezelésnek kitett endothelsejtekben az endothel felszínéhez kötött protein C-nek mind a mennyisége, mind az expressziója csökkent, és annak ellenére, hogy ezzel párhuzamosan a thrombomodulin expressziója nőtt, a két antikoagulációt szabályozó fehérje arányának megváltozása még így is a trombózis kockázatának növekedését eredményezte.103 A keringő proinflammatorikus citokineknek szintén szerepük lehet a toxicitás kialakításában. A doxorubicin növeli a makrofágok hisztamin és tumornecrosis faktor-α (TNF-α) elválasztását és a monociták interleukin-2 képzését.28 Ezen citokinek a szívizomsejten elhelyezkedő saját receptoraikon keresztül okozhatnak dilatatív kardiomiopátiát, az endothelen pedig endothel diszfunkciót.104 1.4.1. ET-1 és anthracyclin kezelés Csak néhány közlemény foglalkozik az ET-1 szintjével anthracyclin kezelés kapcsán. Ezek többségében az anthracyclin akut hatását vizsgálták emlőkarcinómás betegekben.105 Kevés olyan közleményt találtunk, melyekben az anthracyclin krónikus hatását (a kezelés után egy évvel is) vizsgálták volna az ET-1 szintre. Azokban a betegekben, akikben progresszív szívelégtelenség alakult ki, emelkedett ET-1 szint volt észlelhető, mely az állatkísérletes modellek szerint a szívizomsejtek károsodása következtében kialakuló kompenzáló reakciónak tudható be.106 Ezekkel a megfigyelésekkel szemben, munkacsoportunk DXR-rel kezelt limfómás betegek vizsgálata során eltérő eredményre jutott.107 Az anthracyclin kezelést követően az ET-1 plazma szint szignifikáns csökkenését találtuk. Az ET-1 szint csökkenés az anthracyclin direkt citotoxikus hatásának következménye lehet, részben az endothelialis m-RNS szintézis gátlása, részben az endothel diszfunkciót okozó szuperoxid ágensek keletkezése révén. Az anthracyclinek ezen hatása független terápiás hatásuktól. Az ET-1 szint emelkedésének hiányában szerepet játszhat az is, hogy betegeink közül csak néhány beteg volt NYHA II. illetve III stádiumban, klinikailag jelentős szívelégtelenség pedig csak 1 esetben fordult elő. Irodalmi adatok szerint az ET-1 plazmaszint emelkedés döntően csak a NYHA III.-IV. stádiumban figyelhető
22
meg.108, 109 Az ET-1 szint csökkenése következtében az ET-1 esetleges citoprotektív hatása is eliminálódik, így az anthracyclin kardiotoxikus hatása könnyebben kifejlődik.110 Az eredmények alapján munkacsoportunk in vitro vizsgálatokat tervezett az anthracyclinek direkt citotoxikus hatásának vizsgálatára az ET-1 szintézisére.
23
2. CÉLKITŰZÉSEK
Mint a bevezetőben részletezettek mutatják, az ET-1 patogenetikai szerepét a kardiovaszkuláris betegségekben széleskörben tanulmányozták. A következtetéseket állatkísérletes modellekből illetve humán plazmaszint meghatározásokból vonták le. A plazmában mérhető értékek a peptid gyors lebomlása ill. abluminalis szekréciója miatt nem minden esetben tükrözik a valós helyzetet. Vizsgálataink során munkacsoportunk korábbi, DXR-rel kezelt limfómás betegekből származó eredményei nyomán az ET-1 szerepét kívántuk direkt módon vizsgálni szívizomsejteken. Ehhez először kutyában kialakított ischaemia/reperfúzió modellt használtunk. Az ET-1-ről ismert, hogy mértékével arányos az infarktus nagysága és az ischaemia indukálta kamrai aritmiák előfordulása, de a cardiomyocyták apoptózisának gátlásával szerepe van a szöveti regenerációban is.111 A kutya modellt az emberhez igen hasonló koronáriarendszer miatt választottuk. Az alábbi célokat tűztük ki: 1. Pontos és érzékeny RT-PCR módszer kidolgozása az ET-1 mRNS képződés detektálására. 2. A plazma ET-1 és big ET-1 szintjének változásának vizsgálata ischaemia ill. reperfúzió hatására. 3. A szívizomsejtek ET-1 mRNS szint változásának vizsgálata ischaemia ill. reperfúzió hatására. Második kísérleti rendszerünkben DXR-rel kezelt limfómás betegpopuláción kapott eredmények alapján a DXR direkt hatását vizsgáltuk az ET-1 és egyéb, a kardiovaszkuláris betegségekben érintett gének expressziójára endothelsejtekben. Az endothelsejteket, mint a toxikus károsító hatással első vonalban találkozó sejteket választottuk ki.
24
Az alábbi célokat tűztük ki: 1. DXR
citotoxicitásának
meghatározása
endothelsejteken
különböző
időpontokban, a DXR direkt hatásának vizsgálatára alkalmas kezelési idő és koncentráció kiválasztására 2. Az endothelsejtek DXR-indukálta, a kardiovaszkuláris rendszerre jellemző, számos kardiovaszkuláris betegség által befolyásolt génjeinek expressziós mintázatának meghatározása cDNS array segítségével. 3. ET-1 mRNS expresszió vizsgálata DXR-rel kezelt endothelsejteken qPCR módszerrel. 4. A metodika validálása ugyanolyan körülmények között DXR-rel kezelt HeLa sejtek vizsgálatával. 5. A DXR endothelsejtekre kifejtett hatásának szélesebb körű vizsgálatára Microarray rendszerrel a teljes genetikai állomány expressziós profiljának meghatározása. Az ET-1-gyel kapcsolatban álló, DXR kezelésre hasonló változást mutató gének feltérképezése. 6. Az eredmények validálása a hatásért végeredményben felelős termék, a bigET-1 fehérje változásának meghatározásával DXR-rel kezelt endothelsejtekben.
25
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Kutyaszív ischaemia/reperfúziós modell 3.1.1.Kísérleti felépítés Az állatkísérleteket a Semmelweis Egyetem Ér- és Szívsebészeti Klinika (jelenleg SE Kardiológiai Központ) Kísérleti és Kutató Laboratóriumában, a Semmelweis Egyetem állatvédelmi szabályzatában foglaltak betartásával és a Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (US NIH Publication No. 86-23, revised 1996) laboratóriumi állatok tartására vonatkozó nemzetközi szabályoknak megfelelően végeztük. A vizsgálatot 9, mindkét nembeli keverék kutyán végeztük. (súly: 22,7±1,9 kg). Az általános anesztéziát Na-pentobarbitállal (30 mg/kg iv.) hoztuk létre és szükség szerint további anesztetikumot adagoltunk. Endotrachealis intubálást követően az állatokat szobalevegőn lélegeztettük. Thoracotomiát végeztünk a bal V. bordaközben és megnyitottuk a perikardiumot. Izoláltuk a bal elülső leszálló artériát (LAD). A LAD II. diagonális ága alá egy hurkot helyeztünk el a későbbi lefogáshoz. Az artériás vérnyomást, a koronária áramlást és az EKG-t folyamatosan regisztráltuk. A LAD 30 perces lefogása után további 90 perces reperfúziós időszakot figyeltünk meg. Vér- és szívizommintát vettünk a LAD lefogása előtt, közvetlenül a felengedés után és a reperfúzió 90. percében. Az ET-1 és big-ET plazmaszintek meghatározásához az a. femoralisba és a sinus coronariusba katétereket vezettünk be, és mintát vettünk a következő időpontokban: kontroll, ischaemia 30. perc, reperfúzió 90. perc. A miokardium biopsziát az ischaemiás terület epikardiális felszínéről vettük Johnson és Johnson biopsziás eszközzel. Az endocardialis mintavétel bonyolultabb metodikát igényelt volna és a komplex kísérlet egyéb vizsgálandó paramétereit, nevezetesen a kamrai
ritmuszavarok
spontán
előfordulását
ischaemia/reperfúzió
során
az
intraventricularis manipuláció zavarta volna, ezért történt a mintavétel az epicardialis felszínről.
26
3.1.2. Biokémiai vizsgálatok Az ET-1 és big-ET-1 szintek meghatározása az Országos Onkológiai Intézet Pathogenetikai Osztályán történt.
Az
ET-1-t
és
big-ET-1-t
a
plazmából
immunprecipitációval
tisztítottuk,
a
plazmaszinteket Western blot módszerrel határoztuk meg. 50 µl EDTA-s plazmát az elsődleges ellenanyaggal inkubáltuk, majd Protein A-Agarose segítségével kicsaptuk. A precipitátumot glicerin és merkaptoetanol tartalmú loading pufferrel denaturáltuk és 15%-os SDS-PAGE (Biorad Protean II xi Cell készüléken) technikával molekulasúly szerint szeparáltuk. Az elválasztott fehérjéket Nova blot készüléken PVDF membránra vittük át. A membránhoz kötött fehérjék identifikálására anti-ET-1, anti-big ET-1 és szekunderként alkalikus foszfatáz konjugált anti-nyúl antitesteket (Biomedica GmBH, Vienna, Austria) használtunk, majd NBT-BCIP előhívó rendszerrel festettük meg. Denzitometriát Fluorochem 8900 (Alpha Innotec) készülékkel és annak szofverével végeztük. Az ET-1 mRNS szöveti szintjének meghatározása RT-PCR-ral történt. Az ischaemiás szívizomszövetből biopsziával nyert anyagból TRI reagens (Sigma, Steinheim, Germany) és kloroform segítségével izoláltuk az RNS-t. A vizes fázisban az mRNScDNS átírást oligodT23 és Enhanced Avian HS RT-PCR kittel végeztük. A cDNS mennyiségi meghatározásához specifikus primereket és Light Cycler FastStartDNA Master SYBR Green I kit (Roche, Mannheim, Germany) kitet használtunk Light Cycler készüléken. Az alkalmazott primereket Primer 3 Design szoftver segítségével online terveztük. A PCR termék azonosítását először molekulasúly alapján 0,8%-os horizontális
agaróz
gél
elektroforézissel
végeztük,
hogy
meggyőződjünk
a
specificitásról, majd szekvenálással ellenőriztük (ABI 310 készülék, Applied Biosystems, Lincoln CA, USA).
27
3.2. Endothelsejtkultúrán végzett kísérletek 3.2.1. HUVEC izolálás és sejtkultúra Az endothelsejtek preparálását és tenyésztését munkacsoportunk által korábban leírt módszer
szerint
végeztük
a
SE
III.
sz.
Belgyógyászati
Klinika
Kutatólaboratóriumában.112 A kísérletek tervezésekor fontos szempont volt számunkra, hogy humán sejteken vizsgálódjunk ill. hogy a vizsgált sejtek ún. „primer” sejtek legyenek, vagyis ne egy immortalizált sejtvonalból származzanak. Technikai okokból (hozzáférhetőség, mennyiségi igény) is a HUVEC alkalmazása volt a megfelelő választás, de azon okból is, hogy a humán endothelsejtekre vonatkozó vizsgálatok döntő hányada ezen a sejtvonalon történt. Az endothelsejteket humán köldökzsinór vénából kollagenáz (1 mg ml−1, Gibco/Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) segítségével emésztettük. A sejteket 0,5% zselatinnal (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) fedett sejttenyésztő flaskába helyeztük M199 (Gibco/Invitrogen) médiumban, és 10% magzati borjú szérummal (FCS) (Gibco/Invitrogen), 100 IU/ml penicillinnel (Sigma), 100 μg/ml streptomycinnel (Sigma), 7.5 IU/ml heparinnal (Sigma), 2 ng/ml epidermalis növekedési faktorral (EGF) (R&D, Abington, UK) és 250 pg/ml β-endothelsejt növekedési faktorral (β-ECGF) (BioSource, Camarillo, USA) kezeltük. A sejteket 2-4 alkalommal passzáltuk. A sejtkultúra minőségét rendszeresen ellenőriztük morfológiai szempontok (utcakő rajzolat) és a von Willebrand faktor pozitivitás alapján. A SuperArray és a real-time PCR (RT-PCR) kísérletekhez a sejteket 80 cm2-es szövetkultúrákban ill. 24-lyukú lemezen (mindkettő Corning Inc. Life Sciences, Lowell, MA, USA) tenyésztettük és akkor használtuk fel, ha a konfluencia 90%-ot elérte. A HeLa sejteket DMEM médiumon (Gibco/Invitrogen) tenyésztettük, melyet 10% FCSsel (Gibco/Invitrogen), 100 IU/ml penicillinnel (Sigma), 100 μg/ml streptomycinnel (Sigma) egészítettünk ki. 3.2.2. Citotoxicitás vizsgálatok Jelentős, nem specifikus mRNS lebomlás figyelhető meg mind apoptózis, mind nekrózis során, mely a gén expresszió változásának téves értelmezését vonhatja maga
28
után. Ennek elkerülése érdekében szükségesnek tartottuk a DXR citotoxicitásának meghatározását különböző időpontokban. Az endothelialis citotoxicitást Herczenik és munkatársai által leírt módszer szerint értékeltük.77 A sejteket 96-lyukú lemezre helyeztük és 24 órás inkubációt követően DXR-t (Teva) adtunk 5 párhuzamos mintába különböző koncentrációkban (20 000 - 39 ng/ml, 1:2 sorozatos higítás). További 2, 6, 24 és 48 h inkubációt követően a citotoxicitást (mind a nekrózis, mind az apoptózis jeleit figyelembe véve) a morfológia pontozásával (gyakorlott vizsgáló által meghatározott értékek 4-től 0-ig terjedtek, ahol a 4-es érték megfelel a 100%-os konfluenciának, a 0-s az élő sejtek hiányának, az ezek közé eső értékek a konfluenciától és a sejtek morfológiájától függően 1-2-3), valamint SYBRGreen (Molecular Probes/Invitrogen) magfluoreszcenciával értékeltük. Ennél a módszernél a DXR kezelést követően a sejteket mostuk, aceton-metanollal fixáltuk és Sybr-Green nukleinsav festékkel festettük. Az élő sejtek számával arányos fluoreszcencia kontrollhoz viszonyított arányát vetettük össze a DXR koncentrációval. Az endothelsejtek igen magas apoptózis aránya miatt 48 h-nál hosszabb ideig nem tudtuk a DXR kezelést folytatni. A daganatos sejtvonal, a HeLa sokkal kevésbé volt érzékeny és hosszabb DXR kezelés is kivitelezhető volt. Megjegyzendő továbbá, hogy a DXR elhanyagolhatóan alacsony fluoreszcens jelet bocsát ki a detektálásra használt 485 nm gerjesztési és 535 nm emissziós hullámhosszon-en, ezért nem befolyásolta a SYBRGreen vizsgálatot. A fél halálos dózist (LD50) a két értékelés összevetéséből számítottuk ki, a kezeletlen sejtek koncentráció grádiensének (10 000 – 1000 sejt) standard görbéje segítségével. 3.2.3. SuperArray vizsgálat
A SuperArray teszthez (SABiosciences, Frederick, MD, USA, GEArray Q Series, Human Cardiovascular Diseases I: HS037 kit) a sejteket TRI® reagensben (Sigma) homogenizáltuk és tároltuk. Kloroformos extrakció után a teljes RNS tartalmú vizes fázist NucleoSpin® RNAII (Macherey-Nagel GmbH, Düren, Germany) rendszerrel tisztítottuk. 4 μg totál RNS-ből kiindulva oligo d(T)23 primer hozzáadásával és Biotin16-dUTP (Roche, Mannheim, Germany, Cat. No. 1-093-070) beépítésével az mRNS szálakat jelölt komplementerekké szintetizáltattuk M-MLV reverz transzkriptáz
29
enzimmel (Promega, Madison, USA). A jelzett cDNS-t egy éjszakán át hibridizáltuk 60 °C-on, folyamatos keverés mellett (5-10 rpm, Roller-Blot Hybridiser-en) HB-3D (TECHNEInc., Burlington NJ, USA) GEArray® Q Series Human Cardiovascular Disease I: Biomarkers (Cat.: HS-037) membránon. A hibridizálódott, jelölt molekulákat mosásokat követően dt-reptanidin-alkalikus foszfatáz konjugátummal felismertettük, majd az enzimatikus vég segítségével kemilumineszcens jeleket generáltattunk. A kemilumineszcenciát ChemiImager 8900 (Alpha Innotech, San Leandro CA, USA) készülékkel detektáltuk. A kemilumineszcens adatokat Genesis 1.5.0 szoftver (TUG, Graz, Austria) segítségével elemeztük. Az mRNS szinteket a belső standardként használt GAPDH gén kifejeződésének arányában fejeztük ki. A használt SuperArray technikát TNFα-val kezelt HUVEC sejteken teszteltük, és az irodalmi adatoknak megfelelően az IL-8, ICAM-1, VCAM-1, MCP-1 és E-Selectin mRNS-k szignifikáns emelkedését találtuk.113 3.2.4. Real-time qPCR vizsgálat Mivel korábbi vizsgálataink során kutyán bizonyítottuk, hogy az ET-1 fehérje szintje jól korrelál az ET-1 mRNS expressziójával, ebben a kísérletsorozatban elsődlegesen az ET1 mRNS expresszióját vizsgáltuk és fehérjemeghatározást csak kontrollként alkalmaztunk. A LightCycler analízishez az RNS-t a fent leírt módon izoláltuk. Az RNS–cDNS transzkripcióhoz M-MLV Reverse Transcriptase-t (Promega. Madison, USA) használtunk. A cDNS quantifikációjához LightCycler FastStartDNA Master SYBR Green I kitet (Roche) alkalmaztunk LightCycler® 1.5 (Roche) készüléken. A βactin és a GAPDH gén specifikus primereket a publikált cDNS szekvenciák alapján szintetizáltattuk.114, 115 Az alábbi szekvenciákat használtuk: β-actin: 5′-ggcatcctcaccctgaagta-3′, 5′-ggggtgttgaaggtctcaaa-3′ gapdh: 5′-tgaaccatgagaagtatgacaaca-3′, 5′-agtccttccacgataccaaa-3′ et-1: 5′-gagaaacccactcccagtcc-3′, 5′-gatgtccaggtggcagaagt-3′ A GAPDH-val párhuzamosan a β-actin mRNS expresszióját is meghatároztuk. A βactin és a GAPDH expresszió hányadosa minden mintában állandó volt, ezért mindkettő
30
alkalmas volt belső standardnak. Mi a GAPDH-t választottuk housekeeping génnek, hogy a mérések összevethetőek legyenek a SA mérésekkel, ahol a gyártó által alkalmazott rendszerek is ezt a gént használják. Az általunk alkalmazott qPCR metodika további validálására pozitív kontrollként HeLa sejteket alkalmaztunk, mivel ezen sejtek ismerten fokozott ET-1 mRNS expresszióval válaszolnak a DXR hatásra.116 3.2.5. Microarray vizsgálatok A DXR endothelsejtekre kifejtett hatásának szélesebb körű vizsgálatára microarray technikával a teljes genetikai állomány expressziós profilját határoztuk meg.
3.2.5.1. Agilent GE microarray 200 ng teljes RNS-hez hozzáadtuk a megfelelően higított és a majdani jelöléssel kompatibilis Spike oldatot. T7 promoter primer segítségével cRNS-t készítettünk, cDNS Master Mix hozzáadásával, 40 C-on 2 órán keresztül temperáltuk. A két óra elteltével 15 percre 70 C-ra melegítettük az oldatot, hogy inaktiváljuk az enzimet. A visszahűtött oldathoz Transcription Master Mixet adva 2 órán keresztül 40 C-on megjelöltük a keletkező cRNS szakaszokat Cy-3 és Cy-5 fluoreszcens festékekkel. A maradék festék eltávolítására Qiagen’s Rneasy mini spin rendszerét használtuk. A tisztított és jelölt mintánk cRNS tartalmát Nanodrop készülékkel mértük. Ha a jelölés mértéke és a reakciók kitermelése elégséges, akkor a G4858A Human V1 8x60K arrayre szükséges 600 ng jelölt cRNS-t 60 C-on 30 percig fragmentáltuk, majd hűtés után 1:1 arányban elegyítettük a 2x-es töménységű GEx Hybridization Buffer HI-RPM oldattal. 40-40 mikroliter elegyet pipettáztunk a lemez megfelelő részeibe és a lemezt 65 C-on 17 órán keresztül 10 fordulat/perc sebességgel forgattuk. Másnap 0,005% Triton X-102 tartalmú mosó folyadékban 37 C-on kétszer egy percig mostuk, majd a megszáradt lemezt az Agilent C Scannerben az AgilentHD_GX_2Color profillal letapogattattuk (7. ábra). A kapott képfile-t az Agilent Feature Extraction program segítségével adatfile-ra konvertáltattuk, majd az Agilent GeneSpring GX 11.5.1 program segítségével statisztikai és ortologiai kiértékelést hajtottunk végre.
31
7. ábra Agilent GE Microarray technika folyamatának sematikus ábrázolása (Agilent GE Microarray használati utasítás)
3.2.5.2. Affymetrix DNS chip A jelölt aRNS oldat készítéséhez GeneAtlas 3’ IVT Express Kit-et használtunk. 500 ng totál RNS-hez hozzáadtuk a poly-A-RNS kontrol oldatot. T7 promoter primer segítségével cRNS-t készítettünk. 42 C-on 2 órán keresztül temperáltuk. A visszahűtött oldathoz
32
Second-strand Master Mixet adva 1 órán keresztül inkubáltuk 16 C-on, hogy kétszálú cDNSt kapjunk. IVT Master Mix segítségével Biotin jelölt aRNS készítettünk 4 órai inkubálással 40 C-on. A Kit tartalmazta RNS kötő mágneses gyöngyök segítségével a jelölt aRNS szálakat kitisztítottuk. Nanodrop készülékkel mértük. 10µg Biotin jelölt aRNS-t 94 C-on 35 percig fragmentáltuk, majd hűtés után 7,5 µg aRNS-nek megfelelő fragmentált jelölt anyagot elegyítettünk hybridizációs koktéllal. 150-150 µl elegyet pipettáztunk a lemeztartó megfelelő részeibe és az Affymetrix® Human Genome U133 Array Strip chipeket 45 C-on 16 órán keresztül inkubáltuk. Másnap a GeneAtlas™ Fluidics Station segítségével a chipeket megtisztítottuk a felesleges nem hibridizált anyagoktól, majd a chipeken a biotin molekulákhoz kapcsoltunk lumineszcens jelet adó enzimet (8. ábra). A GeneAtlas™ Imaging station detektáló rendszerrel képet készíttettünk a lumineszcens chip felszínről. A képfile-t a Partek program alakította adatfile-á. A kapott adatfile-on az Agilent GeneSpring GX 11.5.1 program segítségével statisztikai és ortologiai kiértékelést hajtottunk végre.
8. ábra. Affymetrix DNS chip technika folyamatának sematikus ábrázolása (Affymetrix GeneAtlas használati utasítás)
33
3.2.6. ET-1 ELISA Az mRNS eredmények (SA és qPCR) kontrolljaként az ET-1 termelődését kereskedelmi forgalomban kapható big-ET-1 sandwich ELISA (Biomedica Group GmbH, Vienna, Austria) technikával ellenőriztük. (A big ET-1 koncentrációja arányos az ET-1-gyel, bár a big-ET-1 életideje hosszabb.) A big ET-1 ELISA keresztreaktivitása a humán ET-1/2/3-mal ill. a big ET-2-vel kisebb, mint 1%. A sejteket az LD50-nél kisebb DXR dózisokkal kezeltük 24 h-n át. Ahhoz, hogy detektálható mennyiségű ET-1 termelődjön, a sejteknek hosszabb időre van szükségük, ezért választottuk a 24 h-s kezelési időtartamot. Az ilyen időtartamban alkalmazott magasabb (600, 1000 ng/ml) DXR dózisok viszont a sejtek teljes pusztulását eredményezték volna, ezért kellett a fehérje vizsgálatához
alacsonyabb
DXR
dózisokat
alkalmazni.
A felülúszót
begyűjtöttük és azonnal lefagyasztottuk −80 °C-ra. Az ELISA vizsgálatot a gyártó utasításainak megfelelően végeztük.
3.3. Statisztikai módszerek
Az eredményeket átlag ± SEM formátumban tüntettük fel, kivéve az ET-1 mRNS szöveti szinteket, melyeket a megfelelő kontroll arányában fejeztük ki. A statisztikai analízishez a GraphPad Prism 4.02 (GraphPad Software Inc., www.graphpad.com) szoftver segítségével Student's t teszt ill. ANOVA módszereket alkalmaztunk (lináris trend poszt-tesztet alkalmazva dózisfüggés esetén). A különbségeket p<0,05 esetén tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.
34
4. EREDMÉNYEK
4.1. Kutyaszív ischaemia/reperfúzió modell Az állatok vérnyomása kiinduláskor 111,5 ± 11 Hgmm, a kísérlet végén 99 ± 11 Hgmm volt (p=ns). A bal kamrai ischaemiás és az összizomtömeg aránya 28 ±6,6 % volt. Az általunk vizsgált kutyákban nem fordult elő ritmuszavar, de a MAPD90 (monofázisos akcióspotenciál időtartama 90%-os repolarizációnál) az ischaemia alatt rövidült, a reperfúzió során pedig megnyúlt.61 A 9-11. ábrán ugyanazon kutyából származó mintákból végzett RT-PCR, immunprecipitáció és Western blot vizsgálatok eredményeit mutatjuk be. A 9. ábrán a miokardiális ET-1 mRNS mennyiségi meghatározása látható.
9. ábra. Miokardiális preproendothelin-1 mRNS mennyiségi meghatározása RT-PCR módszerrel. CP érték meghatározás Light Cycler készüléken. A CP értékből számolható a termék mennyisége a belső standard százalékában. A vízszintes tengelyen a PCR reakció ciklusszáma, a függőleges tengelyen a fluoreszcencia mértéke került feltüntetésre. 0: kiindulási érték, 30: 30 perc ischaemia után, 120: 30 perc ischaemia + 90 perc reperfúzió után, Gapdh: belső standard.
35
A PCR termék olvadáspont görbéje adja a mérés ellenőrzését (10A ábra), míg az agaróz gél elektroforézissel molekulasúly alapján tudjuk azonosítani a terméket (10B ábra). Az azonosítás szekvenálással is megtörtént.
10. ábra. A) A PCR termék azonosítása olvadáspont görbe (melting curve) felvételével. (Az egyes termékek olvadáspontja specifikus, az ábrán jól látszik, hogy az összes endothelin mRNS azonos hőmérsékleten mutatja a csúcsot, és ez különbözik a Gapdhtól.) B) A PCR termék igazolása agaróz gél elektroforézissel. (A futtatás során a PCR termékek molekulatömeg szerint válnak szét és ennek alapján azonosíthatók.) Gapdh= belső standard A plazma ET-1 és big ET-1 szintek meghatározására használt immunprecipitáció és -blot módszer segítségével a meghatározni kívánt termék jól és pontosan azonosítható (11. ábra).
11. ábra. Sinus coronarius plazma ET-1 és bigET-1 immunoblot (0 min = kiindulás, 30 min = 30 perc ischaemia után, 120 minrc = 30 perc ischaemia + 90 perc reperfúzió után) Ischaemia alatt a plazma ET-1 és big ET-1 szint nem változott szignifikáns mértékben. Az ET-1 gén expresszió a szívizomban ischaemia során 57,8 %-kal csökkent a
36
kiindulási értékhez képest. Reperfúzió alatt szignifikáns emelkedést észleltünk a plazma ET-1 értékekben mind a kiinduláshoz, mind a 30 perces ischaemiához képest. A big ET1 is hasonlóan változott. A fentiekkel párhuzamosan az ET-1 mRNS szint növekedését is észleltük (az ischaemiás érték 322 %-ára, ill. a kiindulási érték 244 %-ára) (12-13. ábra).
†
30 *
**
*
fmol/l
25 Plasma ET-1
20
big ET-1
15 10 0
30 idő (min)
120
*p<0,01; **p<0,05; †p<0,0004
12. ábra. Sinus coronarius plazma ET-1 és big ET-1 koncentrációk a LAD lekötése előtt (0), 30 perc ischaemia után (30) és 90 perc reperfúziót követően (120) (ANOVA statisztikai módszer, posztteszt analízissel)
37
400 350 300 250 200 150 100 50 0 0
30
120
13. ábra. ProET-1mRNS szint a LAD lekötése előtt (0), 30 perc ischaemia után (30) és 90 perc reperfúziót követően (120) A proET-1 mRNS változása a belső standard Gapdhhoz viszonyítva. 4.2. Endothelsejtkultúra 4.2.1. A DXR toxicitása endothelsejteken A DXR citotoxicitásának meghatározásakor kétféle módszert alkalmaztunk. A morfológiai módszer során minden mintát gyakorlott vizsgáló értékelt és az átlagos túlélési score-t (0 - 4) vetettük össze a DXR koncentrációval. A másik módszer során az élő sejtek számával arányos fluoreszcenciát mértük és a viabilitást sejtszám kalibráció segítségével számoltuk. A félmaximális citotoxikus koncentráció (LD50) az endothelsejtek esetében 150 ng/ml volt 48 h, 300 ng/ml volt 24 h és több mint 10000 ng/ml volt 6 h kezelés során (14. ábra). Tekintettel arra, hogy az onkológiai betegek kezelési protokolljában nagy intravénás dózisokat alkalmaznak, és a DXR csúcs plazma koncentrációja rövid időre az 1000 ng/ml koncentrációt is eléri,117 kísérleteink során az endothelsejteket 6 h-án át 1000 ng/ml DXR-rel kezeltük.
38
14. ábra. A doxorubicin (DXR) citotoxikus hatása endothelsejteken. 3 azonos, független mérés egy-egy jellegzetes eredményét tüntettük fel. Vízszintes tengelyen a DXR koncentrációk, függőleges tengelyen A) a túlélési pontszám (survival score), B) az élő sejtek számával arányos fluoreszcencia a kontroll százalékában.
4.2.2. DXR hatása az endothelsejtek mRNS expressziós mintázatára Az endothelsejtek DXR indukálta gén expressziós mintázatát egy cDNS array-vel (SA) szűrtük, mely a kardiovaszkuláris rendszerre jellemző számos kardiovaszkuláris betegség által befolyásolt gént tartalmazott. A 96, az array-n szereplő reprezentatív kardiovaszkuláris gén közül csak az ET-1 mRNS expressziója változott meg szignifikáns módon a DXR kezelés hatására (15. ábra). Ugyanebben a kísérleti elrendezésben pozitív kontrollként használtuk a TNF -t, mely - ismert módon - számos adhéziós molekula és citokin mRNS expresszióját indukálta. (nem bemutatott adatok).
39
15. ábra DXR-rel kezelt endothelsejtek gén expressziós profilja. 96, a kardiovaszkuláris rendszerben ismerten szerepet játszó gén (HS037 SuperArray kit, Human Cardiovascular Diseases I) expressziós mintázatát mutatjuk 6 órás 1000 ng/ml DXR kezelést követően humán köldökvéna endothelsejteken (HUVEC). A gén expressziós értékeket a GAPDH expresszió arányában tüntettük fel. Három független mérés átlagát ± SEM ábrázoltuk. ** p<0,01 4.2.3. ET-1 mRNS expresszió DXR-rel kezelt endothelsejteken Az SA kísérlet során az ET-1 mRNS expresszió 6 órás DXR kezelést (1000 ng/ml) követően a kezeletlen kontroll endothelsejtek expressziójának 10,9%-a volt (p=0,0049). Azért választottuk ezt a relatíve rövid (6 h) inkubációs időt, hogy a DXR-nek az endothelsejtekre kifejtett direkt hatásait tudjuk vizsgálni. Az SA során kapott eredmények validálására egy következő kísérletben az endothelsejteket különböző dózisú DXR-rel (300, 600 és 1000 ng/ml) kezeltük és 6 h kezelést követően az ET-1 mRNS expresszióját real-time qPCR módszerrel határoztuk meg. Az ET-1 mRNS gén expresszió dózisfüggő és az SA során kapott eredményhez nagyon hasonló volt (16. ábra). Mindazonáltal, a qPCR-nek az SA-val szembeni nagyobb érzékenysége miatt az ET-1 mRNS sokkal jelentősebb szupresszióját találtuk: az 1000 ng/ml DXR-rel kezelt endothelsejtekben a kontrollhoz képest az ET-1 mRNS expressziója csak 2,41% volt (p=0,0022). Az ET-1 mRNS expressziója szignifikánsan és dózisfüggő módon csökkent DXR kezelés hatására (16. ábra).
40
16. ábra DXR-rel kezelt endothelsejtek ET-1 mRNS expressziója Az endothelsejteket különböző DXR dózisokkal kezeltük 6 órán keresztül. Superarray és qPCR vizsgálatokat végeztünk 0, 300, 600 és 1000 ng/ml koncentrációjú DXR kezelést követően. Relatív endothelin-1 (ET-1) mRNS expressziókat tüntettünk fel a kezeletlen minták százalékában. Három független mérés átlagát ± SEM ábrázoltuk.
Az irodalomban nem ismert, hogy az endothelsejtek ET-1 expressziója miként változik meg az LD50-nél kisebb DXR kezelés hatására. A mi eredményeinkkel ellentétben más sejttípusokat (humán HeLa, patkány szívizomsejt, egér HL-1) alkalmazó vizsgálatok dózis dependens ET-1 indukcióról számolnak be.116 Metodikánk validálásaként, ugyanolyan körülmények között HeLa sejteket kezeltünk DXR-rel. Az alkalmazott dózissal és a kezelési idővel arányos ET-1 mRNS indukciót találtunk (17. ábra).
41
35
***
Relatív ET-1 mRNS expresszió
30 25
***
20
6h 24h
15
48h
*
10 5 0 0
60
200
600
DXR (ng/ml)
17. ábra DXR-rel kezelt HeLa sejtek ET-1 mRNS expressziója A HeLa sejteket különböző DXR dózisokkal kezeltük 6, 24 és 48 órán keresztül. Az mRNS expressziót qPCR módszerrel határoztuk meg. Az ET-1 mRNS expresszió idő- és dózisfüggő változásait két utas ANOVA teszttel számítottuk ki. Három független mérés átlagát ± SEM ábrázoltuk. * p<0,05, *** p<0,001 4.2.4. A DXR kezelés hatása az ET-1 expresszióra fehérjeszinten Az ET-1 expresszióját quantitatívan és pontosan meg lehet határozni az mRNS szintjén. Az ET-1 esetében, a kutyán végzett kísérletünk alapján, az mRNS és a fehérjeszintű meghatározás korrelál, de a hatásért mégis a fehérje a felelős, ezért ennek vizsgálatát is elvégeztük a génszintű eredmények validálása érdekében. Kereskedelmi forgalomban kapható ELISA kit segítségével határoztuk meg a big ET-1 fehérje koncentrációkat. Az endothelsejteket az LD50-nél kisebb DXR dózisokkal (50 ill. 200 ng/ml) kezeltük, 24 óra inkubálást követően a felülúszót összegyűjtöttük és elvégeztük az ELISA meghatározást. A DXR kezelés szignifikánsan csökkentette a big ET-1 fehérje szekrécióját (p=0,0101) (18. ábra).
42
18. ábra Big endothelin-1 (big-ET-1) termelődés DXR-rel kezelt endothelsejtekben. Az endothelsejteket az LD50-nél kisebb DXR koncentrációjú DXR-rel kezeltük 24 órán keresztül. A felülúszó big-ET-1 koncentrációját ELISA módszerrel határoztuk meg. A kezeletlen kontroll és a DXR-rel kezelt minták közötti különbséget egy utas ANOVA teszttel értékeltük. Három független mérés átlagát ± SEM ábrázoltuk. * p<0,05 4.2.5. DXR kezelés hatása az endothelsejt genomjára - Microarray eredmények kiértékelése A fenti eredmények alapján már nem csak az ET-1-t magát, hanem az ET-1–t szabályozó valamint az ET-1 által szabályozott gének hálózatát, és ezen géneknek a DXR-re adott reakcióját kívántuk feltérképezni. Ennek érdekében a teljes genom expressziós mintázatát vizsgálni képes microarray módszert választottunk (Agilent). Az irodalomban a microarray-k validálására qPCR módszert használnak. A mi esetünkben többszáz gén expresszió változását figyeltük meg, mindegyik mRNS-re külön qPCR végzése nem volt lehetséges, ezért egy más technológiai bázisra épülő microarray-vel (Affymetrix) igazoltuk az eredményeinket. HUVEC sejteket 300, 600 ill. 1000 ng/mL DXR-rel kezeltük, majd 6 óra elteltével a sejtekből totál RNS-t preparáltunk, és az Agilent ill. Affimetrix gyári protokolljának
43
megfelelően megmértük a génexpresszió változást ~25000 gén esetében. Az adat fileokban kapott normalizált intenzitás értékekből a Genespring program segítségével leválogattattuk azokat, melyek a kontrollhoz képest bármely koncentrációjú DXR kezelés hatására legalább kétszeres expressziós szintváltozást mutattak. A fent említett legalább kétszeres expresszióváltozást mutató géneket tartalmazó adatbázison lefuttattunk egy pathway analízist, mely a jelenleg ismert irodalmi adatok alapján teremt kapcsolatot az egyes gének között (19. ábra).
19. ábra. A pathway analízis grafikai megjelenítése A főbb csomópontokat adó géneket és azok irodalmilag ismert kapcsolatainak számát az 1. táblázatban foglaltuk össze. Az ET-1 génkapcsolatai az ötödik legtöbb kapcsolattal rendelkező csomópontot rajzolták ki a rendszerben.
44
Gén FOS IL6 MYC VEGFA EDN1 FAS EGR1 CEBPA
Kapcsolatok 88 71 69 43 34 34 31 28
Gén MDM2 VCAM1 CEBPB F3 SSTR1 FOXO1 GATA2
Kapcsolatok 28 23 22 20 16 10 8
1. táblázat. A legtöbb kapcsolattal rendelkező csomóponti gének és kapcsolataik száma
A csomóponti analízis azonban nem veszi figyelembe a dózisfüggést, ezért a kétszeres expresszióváltozást mutató géneket tovább szelektáltuk és kiemeltük azokat, melyek a DXR kezelés hatására koncentrációfüggő változást mutattak. További kritériumként csak azokat a géneket vettük figyelembe, ahol a 300 és 600 illetve a 600 és 1000 g/ml kezelések közötti változás átlagosan legalább 50%-os volt mindkét array-ben (Agilent és Affimetrix). Ezt a háromlépéses szűkítést elvégezve 24 csökkenő és 24 emelkedő expressziójú gént találtunk (2A és 2B táblázat). A SA-vel kapott eredményekkel való összehasonlításban 5 olyan, a SA-n is szereplő gént találtunk (IL6, ITGA9, SELP, SELPLG, THBD), melyek mutatnak legalább kétszeres változást a microarray rendszerekben is. Azonban ezek egyike sem mutat koncentráció függést. Az IL6 (11%) és a SELP (8%) kivételével a jel intenzitásuk 5 GAPDH%
alatti
és
egyik
sem
mutatott
45
szignifikáns
változást
a
SA-n.
Agilent Csökkenés ADNP ANKRD50 BCL10 CYR61 DKK1 DNAJC14 EDN1 FOXO1 GRRP1 KIT KLF6 LPAR6 MOBKL2A NFKBIZ NLK NUDT4 PDE4B RHOB SLC38A2 TMCC3 VEZF1 ZBTB38 ZNF184 ZNF323
Affymetrix DXR konc* 300 600 1000 -1,917 -2,763 -4,964 -4,311 -5,426 -14,344 -2,636 -3,761 -7,699 -1,604 -3,627 -6,002 -1,225 -1,827 -3,562 -1,236 -2,154 -2,862 -1,995 -3,665 -6,404 -1,061 -2,068 -3,069 -1,293 -1,440 -2,753 -2,333 -5,334 -11,002 -2,337 -3,270 -6,544 -1,608 -1,787 -4,080 -1,115 -1,819 -2,583 -1,305 -3,924 -11,940 -1,354 -1,713 -3,138 -3,566 -4,981 -10,574 -1,394 -3,524 -6,621 -1,851 -2,721 -6,166 -3,206 -4,195 -11,020 -2,209 -3,789 -5,476 -1,077 -2,158 -3,742 -3,231 -3,268 -7,713 -2,029 -3,250 -8,694 -1,132 -2,039 -3,403
Csökkenés ADNP ANKRD50 BCL10 CYR61 DKK1 DNAJC14 EDN1 FOXO1 GRRP1 KIT KLF6 LPAR6 MOBKL2A NFKBIZ NLK NUDT4///NUDT4P1 PDE4B RHOB SLC38A2 TMCC3 VEZF1 ZBTB38 ZNF184 ZNF323
DXR konc* 300 600 1000 -1,578 -2,488 -4,640 -2,790 -3,366 -7,683 -1,603 -3,085 -5,667 -1,350 -2,394 -3,366 -1,069 -1,349 -2,379 -1,162 -1,984 -2,598 -1,530 -2,560 -3,952 -1,365 -2,189 -4,269 -1,076 -1,219 -2,890 -1,959 -4,461 -7,600 -1,718 -2,399 -4,288 -1,589 -1,779 -3,797 -1,154 -1,509 -3,008 -2,549 -2,856 -5,962 -1,522 -1,927 -3,395 -1,735 -3,009 -4,911 -1,522 -2,654 -4,537 -1,340 -1,921 -4,075 -2,542 -3,593 -6,060 -2,689 -4,707 -7,491 -1,660 -2,528 -4,340 -2,595 -3,244 -5,739 -1,577 -1,708 -3,453 -1,144 -1,433 -2,741
2A. táblázat DXR kezelés hatására kialakult legalább 50%-os koncentrációfüggő expressziócsökkenést mutató gének *Relatív gén expresszió változás, a kontroll és a kezelt minta belső sztenderdekre normalizált denzitásértékeinek aránya 300, 600 és 1000 g/ml koncentrációjú DXR-rel 6 h-át kezelt HUVEC sejtekben. A könnyebb érthetőség kedvéért negatív előjellel jelöltük a csökkenést.
46
Agilent ASF1B BAMBI CDKN2C CEBPA CEBPB EGR1 EGR2 FOS FZD7 HIST2H2AA4 ID2 MSX1 NANOS1 NPTX2 PDZRN3 PTHLH SDC4 SHISA2 SMAD5OS SSTR1 TMEM158 VASN VEGFA ZNF425
DXR konc* 300 600 2,002 2,877 2,190 3,162 1,265 2,293 6,742 10,859 1,727 2,692 1,490 2,292 3,187 7,370 3,223 4,679 1,481 2,336 1,936 3,036 2,515 6,626 1,639 3,372 2,777 8,552 2,158 2,735 1,556 3,152 1,637 2,526 2,760 3,804 1,223 2,437 3,131 5,506 2,284 3,642 1,871 3,201 2,484 4,318 1,494 2,800 2,484 4,916
Affymetrix 1000 4,804 5,260 3,692 21,350 4,221 5,175 28,234 12,324 10,672 6,149 14,287 5,629 16,659 5,201 8,161 4,789 7,680 5,785 12,459 6,123 4,796 10,870 4,194 11,441
DXR konc* 300 600 1000 ASF1B 1,452 2,200 3,531 BAMBI 2,847 3,363 6,893 CDKN2C 1,048 1,511 2,767 CEBPA 1,206 3,091 8,474 CEBPB 1,480 2,133 3,449 EGR1 1,449 1,705 4,441 EGR2 1,102 1,262 5,562 FOS 1,479 2,008 3,912 FZD7 1,481 2,250 5,515 HIST2H2AA3///HIST2H2AA4 1,641 2,658 4,408 ID2///ID2B 2,482 5,615 14,017 MSX1 1,724 2,796 4,738 NANOS1 1,259 2,059 4,402 NPTX2 1,187 1,393 2,577 PDZRN3 1,530 2,135 4,156 PTHLH 1,413 1,466 2,970 SDC4 1,616 2,756 5,085 SHISA2 2,139 2,808 5,027 SMAD5OS 1,353 2,129 4,329 SSTR1 1,832 2,509 4,159 TMEM158 2,212 3,005 5,225 VASN 1,121 1,724 3,517 VEGFA 1,085 1,366 2,513 ZNF425 1,950 2,967 7,145
2B. táblázat DXR kezelés hatására kialakult legalább 50%-os koncentrációfüggő expressziónövekedést mutató gének * Relatív gén expresszió változás, a kezelt és a kontroll minta belső sztenderdekre normalizált denzitásértékeinek aránya 300, 600 és 1000 g/ml koncentrációjú DXR-rel 6 h-át kezelt HUVEC sejtekben
47
A csomóponti analízisből az ET-1-gyel kapcsolatban álló géneket összegyűjtöttük. Az adott gének termékei és az ET-1 között irodalomban leírt interakciókat elemeztük a 3. táblázatban, pirossal kiemelve a kísérleteink során DXR kezelésre koncentrációfüggő változást mutató géneket (ld. 2A és 2B táblázat).
Kapcsolódó géntermékek EDN1 → PLAT EDN1 → ARF6 EDN1 → CTGF EDN1 → CXCR7 EDN1 → EGR1 EDN1 → FOS EDN1 → FOXO1 EDN1 → MYC EDN1 → POMC EDN1 → PTGS2 EDN1 → PTK2 EDN1 → SSTR1 EDN1 → SYT1 EDN1 → VEGFA EDN1 → BCAR3 EDN1 → CREB1 EDN1 → IL6 EDN1 → MYC EDN1 → RAG1AP1 EDN1 → VCAM1
hatás + + ± + ± + + + + + ± ± ± ± ±
Kapcsolódó géntermékek BCAR3 → DES → EGR1 → FGF2 → FOS → GATA2 → IL6 → MYC → NDC80 → PGF → POMC → PTHLH → SYT1 → VEGFA → VEZF1 →
EDN1 EDN1 EDN1 EDN1 EDN1 EDN1 EDN1 EDN1 EDN1 EDN1 EDN1 EDN1 EDN1 EDN1 EDN1
Hatás + + ± ± ± + ± ± + + ±
3. táblázat Az ET-1 gén ismert kapcsolatai közül a DXR kezelésre aktivitást mutató útvonalak *A nyilak a hatás irányát jelölik. +: termelődés növekedés; -: termelődés csökkenés; ±: mind növekedés, mind csökkenés előfordulhat. Pirossal jelöltük a DXR kezelésre koncentrációfüggő változást mutató géneket. Az ET-1 a vizsgált gének között az egyik legtöbb csomóponttal rendelkező gén, ami önmagában is arra utal, hogy az ET rendszer érintett a DXR által. Ezt tovább erősíti, hogy a vele hálózati kapcsolattal rendelkező gének közül 7 hasonló koncentrációfüggő expressziós változást mutatott, mint maga az ET-1.
48
5. MEGBESZÉLÉS
Az endothelinek az 1988-as első leírás óta hatalmas karriert futottak be, nagy tudományos érdeklődést keltettek mind az alapkutatásban, mind a klinikumban. A legtöbbet vizsgált peptid, az ET-1 több mint 20000 tudományos közlemény tárgya volt. Az ET-1 története egyedülálló, hiszen a fehérje szekvencia első leírását követően 4 éven belül a receptorok szekvenciái és már ezek antagonistái is ismertek voltak. Mára az ET1 receptor blokkoló kezelés pl. pulmonális hypertoniában világszerte rendelkezésre áll. Klinikai vizsgálatok vannak folyamatban rezisztens hypertonia, proteinuriával járó vesebetegségek, daganatos betegségek és immunbetegségek területén.118 Ennek az igen erős vazokonstriktor peptidnek kezdetektől fogva keresték a szerepét a különböző kardiovaszkuláris kórfolyamatokban. Munkánk első részében egy kísérletes ischaemia/reperfúziós modellen vizsgáltuk az ET-1 gén expresszióját és termelődését. Kifejlesztettünk egy RT-PCR módszert az ET-1 mRNS termelődés pontos meghatározására. Specifikus primereket terveztünk, a módszert a PCR termék méretének és olvadáspontjának azonosításával, valamint szekvencia analízissel igazoltuk. Vizsgálataink során kimutattuk, hogy az ET-1 és big ET-1 szintek ischaemia során kismértékben, reperfúzió során szignifikánsan növekedtek. Az ET-1 mRNS gén expresszió ischaemia alatt csökkent, reperfúzió során pedig növekedett. Miokardiális infarktusban és más ischaemiás kórképekben, mint pl. postischaemiás veseelégtelenségben vagy ischaemiás stroke-ban a plazma ET-1 szint emelkedését mutatták ki.119-121A plazma ET-1 szint emelkedését írták le patkány és kutya miokardiális
ischaemia/reperfúziós
modellekben
is.68,
122
Ischaemia
során
a
szívizomsejtek fokozott ET-1 termelését írták le, míg hasonló reakció nem volt tapasztalható az ischaemiának kitett vaszkuláris endothel és simaizomsejtekben, sertésen végzett kísérletekben.122 Az emelkedett ET-1 szint kedvezőtlen a koronária keringésre a vazokontriktor, sejtproliferatív hatása miatt. Az ET-1 szintek gyors emelkedése a reperfúzió kezdetén arra utal, hogy a mért ET-1 és big ET-1 nem származhat csak fokozott gén expresszió hatására létrejövő új szintézisből. Ezt támasztja alá a gén expresszió alacsony szintje is. Egyes feltevések szerint ischaemia alatt a sejtekből ET-1 szabadul ki, de ezt csak reperfúzió alatt, a
49
kimosás hatására észleljük. A plazma ET-1 és big ET-1 szintek növekedése a szekréciónak az intraluminális oldal felé való áttevődéséből is adódhat. A kibocsátási arányok változása válasz lehet az ismert ischaemiás endothelkárosodásra. Az ET-1-nek szerepet tulajdonítanak a miokardiális infarktus akut szakában a károsodás stabilizálásában és a hegképződés elősegítésében. Ez az eredendően pozitív és a gyógyulást segítő folyamat azonban az ischaemia kiváltotta egyéb változások (angiotenzin II emelkedés, oxidatív stressz) miatt túlzottá, károssá válhat és a tartósan magas ET-1 szint szerepet játszhat az ischaemiás cardiomyopathia kialakulásában. Másik kísérletsorozatunkban korábbi humán vizsgálatainkból kiindulva a DXR direkt hatását vizsgáltuk az ET-1 és egyéb, a kardiovaszkuláris betegségekben érintett gének expressziójára endothelsejtekben. A DXR szívizomsejtekre gyakorolt káros hatását széleskörben
tanulmányozták.97
Kísérletsorozatunkban
azért
alkalmaztunk
endothelsejteket, mert ez a hatalmas felületű “szerv” találkozik először a daganatos betegségek kemoterápiája során intravénásan alkalmazott DXR-rel. Egyre növekvő számú adat áll rendelkezésre az endothelialis cytotoxicitásra vonatkozóan, melyekhez jól illeszkednek a mi eredményeink is.101,
123, 124
A vaszkuláris endothelium toxikus
károsodása egyre nagyobb érdeklődésre tart számot, hiszen a legújabb kutatások szerint a tumor sejteknek is ép endothelre van szükségük a növekedéshez és proliferációhoz.98 Elsőként a DXR LD50 értékét határoztuk meg endothelsejteken. Megállapítottuk, hogy alacsony
koncentrációjú
(a
betegekben
általában
előforduló
csúcs
plazma
koncentrációnál alacsonyabb) DXR is jelentős citotoxicitást okozott. Kilencvenhat kardiovaszkuláris betegségekhez kapcsolható gén expressziójának változását vizsgáltuk meg subletalis dózisú DXR kezelést követően. A 96 vizsgált gén közül csak az ET-1 mRNS expressziója változott szignifikáns mértékben. Az ET-1 gén expressziójának csökkenését qPCR módszerrel is igazoltuk. Azt is kimutattuk, hogy a változás endothelsejt specifikus, mivel az ugyanolyan kísérleti felállásban kezelt HeLa sejtekben a DXR kezelés hatására az ET-1 mRNS expresszió fokozódott. Ez utóbbi eredményünk egyezést mutat más szerzők eredményeivel és pozitív módszertani kontrollnak tekinthető.116 Az mRNS szint változása mellett szignifikáns bigET-1 fehérje szintézis csökkenést is kimutattunk.
50
A Human Cardiovascular Diseases I SuperArray-ben olyan gének szerepelnek, melyekről ismert, hogy az endothelsejtek szabályozó folyamataiban vesznek részt (pl. gyulladásos, proliferatív, pro- vagy antithrombotikus). Számos citokin és adhéziós molekula könnyen indukálható gyulladást fokozó faktorokkal, pl. a TNF
val. A
metalloproteázoknak, extracellularis mátrixfehérjéknek és növekedési faktoroknak jelentős szerepük van az atherosclerosis folyamatában. A thrombospondin, a PAI-1, a PSelectin
és
a
COX-1/2
mind
fontos
szabályozói
a
véralvadásnak
és
thrombusképződésnek, míg a SOD1/2 –et az oxidatív stressz szabályozójaként ismerjük. Az értónus fenntartásában van szerepe az ET-1/2/3, a NOS és a COX-1/2 fehérjéknek. Érdekes módon a fenti gének expressziója – az ET-1 kivételével – nem mutatott koncentrációfüggő változást a kísérletünkben, ami a DXR-nek a speciálisan az endothelialis ET-1-re kifejtett hatását hangsúlyozza. A DXR-nek a vizsgált 96 génre kifejtett hatásai kevéssé ismertek. Abou El Hassan és munkatársai az E-Selectin és a VCAM-1 expressziójának indukcióját találták endothelsejtek DXR kezelésekor.125 A fenti fehérjék meghatározása 24 h kezelést követően történt, ez azonban nincs ellentmondásban a mi vizsgálatainkkal, melynek során rövidebb behatás után, de az mRNS szinten vizsgáltuk a DXR hatását. Azért használtunk rövid kezelési időket, hogy elkerüljük a gén expressziót befolyásoló másodlagos hatásokat (pl. ROS képződés). Az ET-1 stimulálja a sejtek migrációját, az inváziós képességet, a neovaszkularizációt és elősegíti a tumor proliferációt.85 Emellett számos vizsgálat beszámolt az ET-1 antiapoptotikus hatásáról szívizomsejtekben126, fibroblasztokon
127
és endothel sejeken.128
Az ET-1 szint akut esése csökkentheti az anti-apoptotikus hatást. Endothelsejteken végzett saját vizsgálataink során kimutattuk, hogy rövid ideig tartó DXR kezelés dózisfüggő módon gátolja az ET-1 mRNS expresszióját. Mostafa és munkatársai129 patkány érmodellen alkalmazott relatíve alacsony DXR dózis mellett szintén kimutatták az ET-1 mRNS szupresszióját. Mindazonáltal számos vizsgálatban mutattak ki emelkedett ET-1 mRNS expressziót DXR-rel hosszan kezelt állati (patkány, egér) szívizomsejteken.116,
130, 131
Fiziológiás körülmények között az ET-1 fő forrása az
endothelium, de kisebb mértékben a szívizomsejtek is termelnek ET-1-et, ami a két sejttípus eltérő szabályozó mechanizmusaira enged következtetni. Ezen kívül, különbségként kell megjegyezni, hogy a fent idézett kísérletekben a szívizomsejteket
51
24-48 órán át kezelték, amikor a DXR másodlagos hatásai már nem elhanyagolhatóak. Másik lehetséges magyarázat a különbségekre a sejttípusban keresendő; mi humán endothelsejtekkel dolgoztunk, míg a többi kísérletben patkány ill. egér szívizomsejteket alkalmaztak. A DXR-rel kezelt patkányok ill. egerek plazma ET-1 szintje is emelkedett volt116,
132, 133
, míg a humán vizsgálatokban a plazmaszint vagy csökkent vagy nem
változott, ami az ET-1 expressziójának eltérő szabályozására utal a különböző fajokban. Kísérleteink során a DXR eltérő ET-1 gén expresszióra kifejtett hatásait tapasztaltuk endothelsejteken és a HeLa sejtvonalon. Eredményeinkhez hasonlóan, Bien és munkatársai is az ET-1 mRNS fokozott expresszióját találták a HeLa sejtekben.116 Bár mind az endothel, mind a HeLa sejtek termelnek ET-1-et, a transzkripció szabályozása eltérő lehet. Az endothelsejtek általában a GATA-2 transzkripciós faktort használják az ET-1 promoter helyének A régiójában és az AP-1-et a B régióban.134,
135
A HeLa
sejtekben az ET-1 transzkripció szabályozásáról kevés információ áll rendelkezésre. Az azonban ismert, hogy a HeLa sejtek elsősorban a GATA-6 faktort használják és sokkal kevésbé a GATA-2-t és a GATA-3-t.136 Az aktív ET-1 fehérje létrejöttéhez a sejtben számos szabályozó folyamatra van szükség, úgymint a transzkripció, mRNS stabilizáció, transzláció, kibocsájtás (folyamatos kibocsátás és kibocsátás a Weibel-Palade testekből) és a big ET-1-ből való hasítás.13, 137 Az első, kutyákon végzett kísérletsorozatunkban összefüggést mutattunk ki az ET-1 transzlációja és kibocsátása között.
138
Ezzel összhangban az endothelsejteken
végzett kísérletekben is mind az mRNS, mind a fehérje szinten azonos irányú változásokat tapasztaltunk. A DXR szignifikánsan csökkentette a bigET-1 szintet, bár a változás nem volt olyan kifejezett, mint mRNS szinten. Ezt az ET-1 fehérje szintézisének fent említett komplex szabályozása vagy intracellularis raktár jelenléte magyarázhatja. Az előzőekben részletezett eredmények alapján a DXR-nak az endothelsejt teljes genomjára kifejtett hatását vizsgáltuk microarray technikával. A több ezer génről szerzett adatokból kiszűrtük azokat, melyek jelentős, koncentrációfüggő változást mutattak a DXR kezelésre. Az ET-1 mRNS ezen mérések során is szignifikáns
52
koncentrációfüggő csökkenést mutatott. A genom analízis során nemcsak az ET-1, de a vele kapcsolatban álló gének hálózatát is feltérképeztük. A DXR kezelés hatására expresszióváltozást mutató gének közül az ET-1 az egyik legtöbb kapcsolattal rendelkezik, mely alapján feltételezhető, hogy az ET-1 rendszernek (az ET-1-t szabályozó és az ET-1 által szabályozott fehérjéknek) központi szerepe van az endothelsejteknek a DXR kezelésre adott válaszában. Kísérleteink nem adnak választ a DXR hatás pontos pathomechanizmusára, azonban a feltérképezett kapcsolatok további in vitro vizsgálata segíthet ennek jobb megértésében.
53
6. KÖVETKEZTETÉSEK Kutya ischaemia/reperfúziós modellben kifejlesztettünk egy RT-PCR módszert az ET-1 mRNS termelődés pontos meghatározására. A párhuzamosan elvégzett ET-1 és big ET1 meghatározások az ischaemia ill. a reperfúzió során végbemenő folyamatok jobb megismerésére adtak lehetőséget. Az ischaemiás szívizomszövet ET-1 mRNS gén expressziója csökkent, ami a lebomlás és a hipoxiás sejtek csökkent anyagcseréjének következménye lehet. Az észlelt kismértékű ET-1 és big ET-1 plazmaszint növekedés az ép sejtekből származhat. A gén expresszió fokozódása az ischemiát követő reperfúzió után gyors fehérjeszintézisre utal, amely részben hozzájárul a reperfúzió során észlelt big ET-1 és ET-1 plazmaszintek növekedéséhez. Ez utóbbi összefüggésben lehet a reperfúziós aritmiák kialakulásával, illetve az akut miokardiális infarktus egyéb szövődményeivel.
Az
endothelsejteken
végzett
kísérletekben
kilencvenhat,
kardiovaszkuláris
betegségekhez kapcsolható gén expressziójának változását vizsgáltuk meg subletalis dózisú DXR kezelést követően. Kimutattuk, hogy rövid ideig tartó DXR kezelés dózisfüggő módon gátolja az ET-1 mRNS expresszióját. A 96 vizsgált gén közül csak az ET-1 mRNS expressziója változott dózisfüggően és szignifikáns mértékben. Az endothelsejtben az ET-1-et szabályozó valamint az ET-1 által szabályozott gének hálózatát és ezen géneknek a DXR kezelésre adott reakcióját is feltérképeztük a teljes genom expressziós mintázatát vizsgálni képes micoarray módszer segítségével. A DXR kezelés hatására expresszióváltozást mutató gének közül az ET-1 az egyik legtöbb kapcsolattal rendelkezik, mely alapján feltételezhető, hogy az ET-1 rendszernek központi szerepe van az endothelsejteknek a DXR kezelésre adott válaszában. A kemoterápia során alkalmazott magas DXR koncentráció direkt kardiotoxikus hatását tovább növelheti a DXR hatására bekövetkező kezdeti ET-1 termelés csökkenés, ami apoptózisra való nagyobb fogékonyságot jelent. Kísérleteink során az ET-1 rendszer központi szerepét igazoltuk mind a kutya szívizomsejtek ischaemiára adott válaszában, mind a humán endothelsejtek DXR kezelésre adott reakciójában.
54
7. ÖSSZEFOGLALÁS Vizsgálataink során munkacsoportunk korábbi, DXR-rel kezelt limfómás betegekből származó eredményei nyomán az ET-1 szerepét kívántuk direkt módon vizsgálni szívizomsejteken. Ehhez kutyában kialakított ischaemia/reperfúzió modellt használtunk. Kidolgoztunk
egy
RT-PCR
módszert
az
ET-1
mRNS
termelődés
pontos
meghatározására. Az ischaemiás szívizomszövet ET-1 mRNS gén expressziója csökkent (57,8 %-kal a kiindulási értékhez képest), ami a lebomlás és a hipoxiás sejtek csökkent anyagcseréjének következménye lehet. A reperfúzió végén tapasztalt génexpresszió fokozódás (az ischaemiás érték 322 %-ára, ill. a kiindulási érték 244 %-ára) gyors fehérjeszintézisre utal, amely részben hozzájárul a reperfúzió során észlelt big ET-1 és ET-1 plazmaszintek növekedéséhez. Ez utóbbi összefüggésben lehet a reperfúziós aritmiák kialakulásával, illetve az akut miokardiális infarktus egyéb szövődményeivel. A DXR kardiovaszkuláris hatásainak további vizsgálatára endothelsejteken (HUVEC) végeztünk kísérleteket.
96 kardiovaszkuláris betegségekhez kapcsolható gén
expressziójának változását vizsgáltuk meg subletalis dózisú DXR kezelést követően. Kimutattuk, hogy rövid ideig tartó DXR kezelés dózisfüggő módon gátolja az ET-1 mRNS expresszióját. A vizsgált gének közül csak az ET-1 mRNS expressziója változott dózisfüggően és szignifikáns mértékben. Mind az mRNS, mind a fehérjeszinten azonos irányú változásokat tapasztaltunk. A DXR szignifikánsan csökkentette a bigET-1 szintet. Az endothelsejtben az ET-1–t szabályozó valamint az ET-1 által szabályozott gének hálózatát és ezen géneknek a DXR kezelésre adott reakcióját is feltérképeztük a teljes genom expressziós mintázatát vizsgálni képes micoarray módszer segítségével. A DXR kezelés hatására expresszióváltozást mutató gének közül az ET-1 az egyik legtöbb kapcsolattal rendelkezik. Az előbbiek alapján feltételezhető, hogy az ET-1 rendszernek központi szerepe van az endothelsejteknek a DXR kezelésre adott válaszában, és a kutya modellben tapasztaltak alapján a szívizomsejtek ischaemiára adott reakciójában is. A fentiek vizsgálatára részletesebb, a patomehanizmust érintő kísérletek elvégzése lenne szükséges az ET-1-gyel kapcsolatban, mely által érthetővé válna az ET-1 kardiovaszkuláris rendszerben betöltött, a vérnyomás szabályozásán túlmutató szabályozó szerepe is, valamint lehetőség nyílna az endothelin-rendszer gátlásának kifinomultabb alkalmazására.
55
SUMMARY
Upon our previous results from lymphoma patients treated with DXR we wanted to investigate the role of ET-1 on cardiomyocytes. We used an in vivo canine heart ischaemia/reperfusion model. We developed a RT-PCR protocol for quantification of the ET-1 mRNA. The decrease of ET-1 mRNA during ischaemia (57,8 % of the baseline) may be due to degradation and decreased metabolism in the hypoxic cells locally. The elevation of the ET-1 mRNA level during reperfusion (322 % of the ischaemic and 244 % of the baseline) indicates rapid big ET-1 synthesis. This was confirmed by the increases in big ET-1 and ET-1 plasma levels. This latter can be associated with the generation of reperfusion arrhythmias or other complications of acute myocardial infarction. For further investigation of the cardiovascular effects of DXR we conducted in vitro experiments on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Expression of 96 representative genes of cardiovascular importance were assayed by qPCR and Superarray techniques after short sublethal DXR treatment. It was shown that DXR supresses the ET-1 gene expression in a dose dependent manner. Out of the 96 genes only ET-1 gene expression has changed significantly. In the experiments on HUVEC ET-1 mRNA and protein changes were concordant; DXR treatment decreased bigET-1 protein level, too. Network of genes regulating ET-1 and genes regulated by ET-1 were mapped in endothelial cells by microarray technique, which can scan the expression pattern of the whole genome. Out of the genes showing expression changes for DXR treatment, ET-1 is one of those which has the most relations with other genes. Presumably the ET-1 system plays a central role in the reaction to DXR treatment in HUVEC and upon the canine experiments results, in the reaction to ischaemia in cardiomyocytes. For detailed investigation of the pathomechanism further experiments are needed with ET-1, which would clarify the role of ET-1 in the cardiovascular system beyond blood pressure regulation and would help to tailor the blockade of the endothelin system.
56
8. IRODALOMJEGYZÉK
1.
Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature 1988;332:411-5.
2.
Masaki T. Historical review: Endothelin. Trends Pharmacol Sci 2004;25:219-24.
3.
Haynes WG, Webb DJ. Endothelin as a regulator of cardiovascular function in health and disease. J Hypertens 1998;16:1081-98.
4.
Rubanyi GM, Polokoff MA. Endothelins: molecular biology, biochemistry, pharmacology, physiology, and pathophysiology. Pharmacol Rev 1994;46:325-415.
5.
Inoue A, Yanagisawa M, Takuwa Y, Mitsui Y, Kobayashi M, Masaki T. The human preproendothelin-1 gene. Complete nucleotide sequence and regulation of expression. J Biol Chem 1989;264:14954-9.
6.
Inoue A, Yanagisawa M, Kimura S, et al. The human endothelin family: three structurally and pharmacologically distinct isopeptides predicted by three separate genes. Proc Natl Acad Sci U S A 1989;86:2863-7.
7.
Fagan KA, McMurtry IF, Rodman DM. Role of endothelin-1 in lung disease. Respir Res 2001;2:90-101.
8.
Stow LR, Jacobs ME, Wingo CS, Cain BD. Endothelin-1 gene regulation. FASEB J 2011;25:16-28.
9.
Levin ER. Endothelins. N Engl J Med 1995;333:356-63.
10.
Yamashita K, Discher DJ, Hu J, Bishopric NH, Webster KA. Molecular regulation of the endothelin-1 gene by hypoxia. Contributions of hypoxiainducible factor-1, activator protein-1, GATA-2, AND p300/CBP. J Biol Chem 2001;276:12645-53.
11.
Luscher TF, Boulanger CM, Dohi Y, Yang ZH. Endothelium-derived contracting factors. Hypertension 1992;19:117-30.
12.
Boulanger C, Luscher TF. Release of endothelin from the porcine aorta. Inhibition by endothelium-derived nitric oxide. J Clin Invest 1990;85:587-90.
13.
Davenport A, Maguire J. Endothelin. In: Handbook of Experimental Pharmacology; 2006:295-329.
57
14.
Bohnemeier H, Pinto YM, Horkay F, et al. Endothelin-converting enzyme-1 mRNA expression in human cardiovascular disease. J Cardiovasc Pharmacol 1998;31 Suppl 1:S52-4.
15.
D'Orleans-Juste P, Houde M, Rae GA, Bkaily G, Carrier E, Simard E. Endothelin-1 (1-31): from chymase-dependent synthesis to cardiovascular pathologies. Vascul Pharmacol 2008;49:51-62.
16.
Tirapelli CR, Fecteau MH, Honore JC, Legros E, Gobeil F, D'Orleans-Juste P. Enzymatic pathways involved in the generation of endothelin-1(1-31) from exogenous big endothelin-1 in the rabbit aorta. Br J Pharmacol 2006;148:527-35.
17.
Rossi GP. Aldosterone breakthrough during RAS blockade: a role for endothelins and their antagonists? Curr Hypertens Rep 2006;8:262-8.
18.
Masaki T. The endothelin family: an overview. J Cardiovasc Pharmacol 2000;35:S3-5.
19.
Schiffrin EL, Touyz RM. Vascular biology of endothelin. J Cardiovasc Pharmacol 1998;32 Suppl 3:S2-13.
20.
Russell FD, Molenaar P. The human heart endothelin system: ET-1 synthesis, storage, release and effect. Trends Pharmacol Sci 2000;21:353-9.
21.
Shah AM. Paracrine modulation of heart cell function by endothelial cells. Cardiovasc Res 1996;31:847-67.
22.
Schneider MP, Boesen EI, Pollock DM. Contrasting actions of endothelin ET(A) and ET(B) receptors in cardiovascular disease. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2007;47:731-59.
23.
Arai H, Hori S, Aramori I, Ohkubo H, Nakanishi S. Cloning and expression of a cDNA encoding an endothelin receptor. Nature 1990;348:730-2.
24.
Sakurai T, Yanagisawa M, Takuwa Y, et al. Cloning of a cDNA encoding a nonisopeptide-selective subtype of the endothelin receptor. Nature 1990;348:732-5.
25.
Kohan DE. Endothelin-1 and hypertension: from bench to bedside. Curr Hypertens Rep 2008;10:65-9.
26.
Maguire JJ, Kuc RE, O'Reilly G, Davenport AP. Vasoconstrictor endothelin receptors characterized in human renal artery and vein in vitro. Br J Pharmacol 1994;113:49-54.
58
27.
Komuro I, Kurihara H, Sugiyama T, Yoshizumi M, Takaku F, Yazaki Y. Endothelin stimulates c-fos and c-myc expression and proliferation of vascular smooth muscle cells. FEBS Lett 1988;238:249-52.
28.
Cunningham ME, Huribal M, Bala RJ, McMillen MA. Endothelin-1 and endothelin-4 stimulate monocyte production of cytokines. Crit Care Med 1997;25:958-64.
29.
Babaei S, Picard P, Ravandi A, et al. Blockade of endothelin receptors markedly reduces atherosclerosis in LDL receptor deficient mice: role of endothelin in macrophage foam cell formation. Cardiovasc Res 2000;48:158-67.
30.
Miyauchi T, Masaki T. Pathophysiology of endothelin in the cardiovascular system. Annu Rev Physiol 1999;61:391-415.
31.
Salamonsen LA, Marsh MM, Findlay JK. Endometrial endothelin: regulator of uterine bleeding and endometrial repair. Clin Exp Pharmacol Physiol 1999;26:154-7.
32.
Merkely B, Geller L, Toth M, et al. Mechanism of endothelin-induced malignant ventricular arrhythmias in dogs. J Cardiovasc Pharmacol 1998;31 Suppl 1:S437-9.
33.
Geller L, Szabo T, Kiss O, Solti F, Juhasz-Nagy A, Merkely B. Fundamental electrophysiological differences between low-dose intracoronary endothelin-1 infusion and myocardial ischemia revealed by multiple monophasic action potential recording. J Cardiovasc Pharmacol 2000;36:S167-71.
34.
Hof RP, Hof A, Takiguchi Y. Attenuation of endothelin-induced regional vasoconstriction by isradipine: a nonspecific antivasoconstrictor effect. J Cardiovasc Pharmacol 1990;15 Suppl 1:S48-54.
35.
Merkely B, Kiss O, Vago H, Zima E, Szabo T, Geller L. Arrhythmogenic action of endothelin-1. Cardiovasc Res 2000;48:357-8.
36.
Ishikawa T, Yanagisawa M, Kimura S, Goto K, Masaki T. Positive inotropic action of novel vasoconstrictor peptide endothelin on guinea pig atria. Am J Physiol 1988;255:H970-3.
37.
Chu L, Endoh M. Biphasic inotropic response to endothelin-1 in the presence of various concentrations of norepinephrine in dog ventricular myocardium. J Cardiovasc Pharmacol 2000;36 Suppl 2:S9-14.
59
38.
Kowala MC. The role of endothelin in the pathogenesis of atherosclerosis. Adv Pharmacol 1997;37:299-318.
39.
Yildiz L, Akcay F, Kaynar H, Bakan N. Increased plasma endothelin-1 in heavy and light smokers. Clin Chem 1996;42:483-4.
40.
Boulanger CM, Tanner FC, Bea ML, Hahn AW, Werner A, Luscher TF. Oxidized low density lipoproteins induce mRNA expression and release of endothelin from human and porcine endothelium. Circ Res 1992;70:1191-7.
41.
Kowala MC, Rose PM, Stein PD, et al. Selective blockade of the endothelin subtype A receptor decreases early atherosclerosis in hamsters fed cholesterol. Am J Pathol 1995;146:819-26.
42.
Zeiher AM, Goebel H, Schachinger V, Ihling C. Tissue endothelin-1 immunoreactivity in the active coronary atherosclerotic plaque. A clue to the mechanism of increased vasoreactivity of the culprit lesion in unstable angina. Circulation 1995;91:941-7.
43.
Tesfamariam B. The effects of HMG-CoA reductase inhibitors on endothelial function. Am J Cardiovasc Drugs 2006;6:115-20.
44.
Wu SY, Zhang BH, Pan CS, et al. Endothelin-1 is a potent regulator in vivo in vascular calcification and in vitro in calcification of vascular smooth muscle cells. Peptides 2003;24:1149-56.
45.
Giaid A, Yanagisawa M, Langleben D, et al. Expression of endothelin-1 in the lungs of patients with pulmonary hypertension. N Engl J Med 1993;328:1732-9.
46.
Simonneau G, Robbins IM, Beghetti M, et al. Updated clinical classification of pulmonary hypertension. J Am Coll Cardiol 2009;54:S43-54.
47.
Aversa CR, Oparil S, Caro J, et al. Hypoxia stimulates human preproendothelin1 promoter activity in transgenic mice. Am J Physiol 1997;273:L848-55.
48.
Skvorak JP, Nazian SJ, Dietz JR. Endothelin acts as a paracrine regulator of stretch-induced atrial natriuretic peptide release. Am J Physiol 1995;269:R1093-8.
49.
Iemitsu M, Miyauchi T, Maeda S, Matsuda M, Goto K, Yamaguchi I. Time course alteration of endothelin-1 gene expression in the heart during exercise and recovery from post-exercise periods in rats. J Cardiovasc Pharmacol 2004;44 Suppl 1:S447-50.
60
50.
Sugden PH, Clerk A. Endothelin signalling in the cardiac myocyte and its pathophysiological relevance. Curr Vasc Pharmacol 2005;3:343-51.
51.
Ballard C, Schaffer S. Stimulation of the Na+/Ca2+ exchanger by phenylephrine, angiotensin II and endothelin 1. J Mol Cell Cardiol 1996;28:11-7.
52.
Vignon-Zellweger N, Relle K, Kienlen E, et al. Endothelin-1 overexpression restores diastolic function in eNOS knockout mice. J Hypertens 2011;29:961-70.
53.
Uehara Y, Azuma Y, Minai K, Yoshida H, Yoshimura M, Shimizu M. Endothelin-1 prolongs intracellular calcium transient decay in neonatal rat cardiac myocytes. Heart Vessels 2011.
54.
Hong HM, Song EJ, Oh E, Kabir MH, Lee C, Yoo YS. Endothelin-1- and isoproterenol-induced differential protein expression and signaling pathway in HL-1 cardiomyocytes. Proteomics 2011;11:283-97.
55.
Glenn DJ, Rahmutula D, Nishimoto M, Liang F, Gardner DG. Atrial natriuretic peptide suppresses endothelin gene expression and proliferation in cardiac fibroblasts
through
a
GATA4-dependent
mechanism.
Cardiovasc
Res
2009;84:209-17. 56.
Berger R, Pacher R. The role of the endothelin system in myocardial infarction-new therapeutic targets? Eur Heart J 2003;24:294-6.
57.
Battistini B, Kingma JG. Changes in plasma levels of ET-1 and its precursor, big ET-1, in the arterial and venous circulation following double myocardial ischemia-reperfusion injury in dogs. J Cardiovasc Pharmacol 2000;36:S215-20.
58.
Noori A, Kabbani S. Endothelins and coronary vascular biology. Coron Artery Dis 2003;14:491-4.
59.
Omland T, Lie RT, Aakvaag A, Aarsland T, Dickstein K. Plasma endothelin determination as a prognostic indicator of 1-year mortality after acute myocardial infarction. Circulation 1994;89:1573-9.
60.
Vago H, Soos P, Zima E, et al. The ET(A) receptor antagonist LU 135252 has no
electrophysiological
or
anti-arrhythmic
effects
during
myocardial
ischaemia/reperfusion in dogs. Clin Sci (Lond) 2002;103 Suppl 48:223S-7S.
61
61.
Vago H, Soos P, Zima E, et al. Changes of endothelin-1 and big endothelin-1 levels and action potential duration during myocardial ischemia-reperfusion in dogs with and without ventricular fibrillation. J Cardiovasc Pharmacol 2004;44 Suppl 1:S376-9.
62.
Cernacek P, Stewart DJ, Monge JC, Rouleau JL. The endothelin system and its role in acute myocardial infarction. Can J Physiol Pharmacol 2003;81:598-606.
63.
Stewart DJ, Kubac G, Costello KB, Cernacek P. Increased plasma endothelin-1 in the early hours of acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol 1991;18:38-43.
64.
Khan IA. Role of endothelin-1 in acute myocardial infarction. Chest 2005;127:1474-6.
65.
Pernow J, Wang QD. Endothelin in myocardial ischaemia and reperfusion. Cardiovasc Res 1997;33:518-26.
66.
Matsumura K, Jeremy RW, Schaper J, Becker LC. Progression of myocardial necrosis during reperfusion of ischemic myocardium. Circulation 1998;97:795-804.
67.
Galiuto L, DeMaria AN, del Balzo U, et al. Ischemia-reperfusion injury at the microvascular level: treatment by endothelin A-selective antagonist and evaluation
by
myocardial
contrast
echocardiography.
Circulation
2000;102:3111-6. 68.
Velasco CE, Turner M, Inagami T, et al. Reperfusion enhances the local release of endothelin after regional myocardial ischemia. Am Heart J 1994;128:441-51.
69.
Miyauchi T, Doi T, Suzuki N, et al. Plasma endothelin-1 concentrations in the coronary sinus in dogs with artificially induced myocardial infarction. Peptides 1992;13:1013-5.
70.
Watanabe T, Suzuki N, Shimamoto N, Fujino M, Imada A. Contribution of endogenous endothelin to the extension of myocardial infarct size in rats. Circ Res 1991;69:370-7.
71.
Gan XT, Chakrabarti S, Karmazyn M. Increased endothelin-1 and endothelin receptor expression in myocytes of ischemic and reperfused rat hearts and ventricular myocytes exposed to ischemic conditions and its inhibition by nitric oxide generation. Can J Physiol Pharmacol 2003;81:105-13.
62
72.
Duda M, Czarnowska E, Kurzelewski M, Konior A, Beresewicz A. Ischemic preconditioning prevents endothelial dysfunction, P-selectin expression, and neutrophil adhesion by preventing endothelin and O2- generation in the postischemic guinea-pig heart. J Physiol Pharmacol 2006;57:553-69.
73.
Tahara A, Kohno M, Yanagi S, et al. Circulating immunoreactive endothelin in patients
undergoing
percutaneous
transluminal
coronary
angioplasty.
Metabolism 1991;40:1235-7. 74.
Douglas SA, Louden C, Vickery-Clark LM, et al. A role for endogenous endothelin-1 in neointimal formation after rat carotid artery balloon angioplasty. Protective effects of the novel nonpeptide endothelin receptor antagonist SB 209670. Circ Res 1994;75:190-7.
75.
Barolet AW, Babaei S, Robinson R, et al. Administration of exogenous endothelin-1 following vascular balloon injury: early and late effects on intimal hyperplasia. Cardiovasc Res 2001;52:468-76.
76.
Kisanuki YY, Emoto N, Ohuchi T, et al. Low blood pressure in endothelial cellspecific endothelin 1 knockout mice. Hypertension 2010;56:121-8.
77.
Herczenik E, Varga Z, Eros D, et al. Protein kinase inhibitor-induced endothelial cell cytotoxicity and its prediction based on calculated molecular descriptors. J Recept Signal Transduct Res 2009;29:75-83.
78.
Cosse JP, Michiels C. Tumour hypoxia affects the responsiveness of cancer cells to chemotherapy and promotes cancer progression. Anticancer Agents Med Chem 2008;8:790-7.
79.
Thorin E, Webb DJ. Endothelium-derived endothelin-1. Pflugers Arch 2010;459:951-8.
80.
Callera G, Tostes R, Savoia C, Muscara MN, Touyz RM. Vasoactive peptides in cardiovascular (patho)physiology. Expert Rev Cardiovasc Ther 2007;5:531-52.
81.
Balakumar P, Kaur T, Singh M. Potential target sites to modulate vascular endothelial dysfunction: current perspectives and future directions. Toxicology 2008;245:49-64.
82.
Raitakari OT, Celermajer DS. Testing for endothelial dysfunction. Ann Med 2000;32:293-304.
63
83.
Otani H. Oxidative Stress as Pathogenesis of Cardiovascular Risk Associated with Metabolic Syndrome. Antioxid Redox Signal 2010.
84.
Talukder MA, Johnson WM, Varadharaj S, et al. Chronic cigarette smoking causes hypertension, increased oxidative stress, impaired NO bioavailability, endothelial dysfunction, and cardiac remodeling in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2011;300:H388-96.
85.
Bagnato A, Spinella F, Rosano L. Emerging role of the endothelin axis in ovarian tumor progression. Endocr Relat Cancer 2005;12:761-72.
86.
Smollich M, Wulfing P. The endothelin axis: a novel target for pharmacotherapy of female malignancies. Curr Vasc Pharmacol 2007;5:239-48.
87.
Herrmann E, Bogemann M, Bierer S, Eltze E, Hertle L, Wulfing C. The endothelin axis in urologic tumors: mechanisms of tumor biology and therapeutic implications. Expert Rev Anticancer Ther 2006;6:73-81.
88.
Guise TA, Kozlow WM, Heras-Herzig A, Padalecki SS, Yin JJ, Chirgwin JM. Molecular mechanisms of breast cancer metastases to bone. Clin Breast Cancer 2005;5 Suppl:S46-53.
89.
Agapitov AV, Haynes WG. Role of endothelin in cardiovascular disease. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst 2002;3:1-15.
90.
Salani D, Taraboletti G, Rosano L, et al. Endothelin-1 induces an angiogenic phenotype in cultured endothelial cells and stimulates neovascularization in vivo. Am J Pathol 2000;157:1703-11.
91.
Knowles J, Loizidou M, Taylor I. Endothelin-1 and angiogenesis in cancer. Curr Vasc Pharmacol 2005;3:309-14.
92.
Lane HA, Smith JC, Davies JS. Noninvasive assessment of preclinical atherosclerosis. Vasc Health Risk Manag 2006;2:19-30.
93.
Hays AG, Hirsch GA, Kelle S, Gerstenblith G, Weiss RG, Stuber M. Noninvasive visualization of coronary artery endothelial function in healthy subjects and in patients with coronary artery disease. J Am Coll Cardiol 2010;56:1657-65.
94.
Singal PK, Iliskovic N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med 1998;339:900-5.
64
95.
Chen XP, Xun KL, Wu Q, Zhang TT, Shi JS, Du GH. Oxidized low density lipoprotein receptor-1 mediates oxidized low density lipoprotein-induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells: role of reactive oxygen species. Vascul Pharmacol 2007;47:1-9.
96.
Spallarossa P, Fabbi P, Manca V, et al. Doxorubicin-induced expression of LOX-1 in H9c2 cardiac muscle cells and its role in apoptosis. Biochem Biophys Res Commun 2005;335:188-96.
97.
Takemura G, Fujiwara H. Doxorubicin-induced cardiomyopathy from the cardiotoxic mechanisms to management. Prog Cardiovasc Dis 2007;49:330-52.
98.
Wolf MB, Baynes JW. The anti-cancer drug, doxorubicin, causes oxidant stressinduced endothelial dysfunction. Biochim Biophys Acta 2006;1760:267-71.
99.
Myers C. The role of iron in doxorubicin-induced cardiomyopathy. Semin Oncol 1998;25:10-4.
100.
Deres P, Halmosi R, Toth A, et al. Prevention of doxorubicin-induced acute cardiotoxicity by an experimental antioxidant compound. J Cardiovasc Pharmacol 2005;45:36-43.
101.
Damrot J, Nubel T, Epe B, Roos WP, Kaina B, Fritz G. Lovastatin protects human endothelial cells from the genotoxic and cytotoxic effects of the anticancer drugs doxorubicin and etoposide. Br J Pharmacol 2006;149:988-97.
102.
Kim CS, Jung SB, Naqvi A, et al. p53 impairs endothelium-dependent vasomotor function through transcriptional upregulation of p66shc. Circ Res 2008;103:1441-50.
103.
Woodley-Cook J, Shin LY, Swystun L, Caruso S, Beaudin S, Liaw PC. Effects of the chemotherapeutic agent doxorubicin on the protein C anticoagulant pathway. Mol Cancer Ther 2006;5:3303-11.
104.
Pober JS, Min W. Endothelial cell dysfunction, injury and death. Handb Exp Pharmacol 2006:135-56.
105.
Yamashita J, Ogawa M, Shirakusa T. Plasma endothelin-1 as a marker for doxorubicin cardiotoxicity. Int J Cancer 1995;62:542-7.
65
106.
Sakai S, Miyauchi T, Sakurai T, et al. Endogenous endothelin-1 participates in the maintenance of cardiac function in rats with congestive heart failure. Marked increase in endothelin-1 production in the failing heart. Circulation 1996;93:1214-22.
107.
Zsary A, Szucs S, Keltai K, et al. Endothelin-1 and cardiac function in anthracycline-treated patients: a 1-year follow-up. J Cardiovasc Pharmacol 2004;44 Suppl 1:S372-5.
108.
Margulies KB, Hildebrand FL, Jr., Lerman A, Perrella MA, Burnett JC, Jr. Increased endothelin in experimental heart failure. Circulation 1990;82:2226-30.
109.
Selvais PL, Robert A, Ahn S, et al. Direct comparison between endothelin-1, Nterminal proatrial natriuretic factor, and brain natriuretic peptide as prognostic markers of survival in congestive heart failure. J Card Fail 2000;6:201-7.
110.
Suzuki T, Miyauchi T. A novel pharmacological action of ET-1 to prevent the cytotoxicity of doxorubicin in cardiomyocytes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2001;280:R1399-406.
111.
Wainwright CL, McCabe C, Kane KA. Endothelin and the ischaemic heart. Curr Vasc Pharmacol 2005;3:333-41.
112.
Oroszlan M, Herczenik E, Rugonfalvi-Kiss S, et al. Proinflammatory changes in human umbilical cord vein endothelial cells can be induced neither by native nor by modified CRP. Int Immunol 2006;18:871-8.
113.
Zhao B, Stavchansky SA, Bowden RA, Bowman PD. Effect of interleukin-1beta and tumor necrosis factor-alpha on gene expression in human endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol 2003;284:C1577-83.
114.
Kreuzer KA, Lass U, Landt O, et al. Highly sensitive and specific fluorescence reverse transcription-PCR assay for the pseudogene-free detection of beta-actin transcripts as quantitative reference. Clin Chem 1999;45:297-300.
115.
Didier N, Banks WA, Creminon C, Dereuddre-Bosquet N, Mabondzo A. HIV-1induced production of endothelin-1 in an in vitro model of the human bloodbrain barrier. Neuroreport 2002;13:1179-83.
116.
Bien S, Riad A, Ritter CA, et al. The endothelin receptor blocker bosentan inhibits doxorubicin-induced cardiomyopathy. Cancer Res 2007;67:10428-35.
66
117.
Rahman A, Carmichael D, Harris M, Roh JK. Comparative pharmacokinetics of free doxorubicin and doxorubicin entrapped in cardiolipin liposomes. Cancer Res 1986;46:2295-9.
118.
Barton M, Yanagisawa M. Endothelin: 20 years from discovery to therapy. Can J Physiol Pharmacol 2008;86:485-98.
119.
Chan L, Chittinandana A, Shapiro JI, Shanley PF, Schrier RW. Effect of an endothelin-receptor antagonist on ischemic acute renal failure. Am J Physiol 1994;266:F135-8.
120.
Ritthaler T, Gopfert T, Firth JD, Ratcliffe PJ, Kramer BK, Kurtz A. Influence of hypoxia on hepatic and renal endothelin gene expression. Pflugers Arch 1996;431:587-93.
121.
Ziv I, Fleminger G, Djaldetti R, Achiron A, Melamed E, Sokolovsky M. Increased plasma endothelin-1 in acute ischemic stroke. Stroke 1992;23:1014-6.
122.
Tsuji S, Sawamura A, Watanabe H, Takihara K, Park SE, Azuma J. Plasma endothelin levels during myocardial ischemia and reperfusion. Life Sci 1991;48:1745-9.
123.
Aroui S, Brahim S, Kenani A. Cytotoxicity, intracellular distribution and uptake of doxorubicin and doxorubicin coupled to cell penetrating peptides in different cell lines: a comparative Study. Biochem Biophys Res Commun 2009.
124.
Kaushal V, Kaushal GP, Mehta P. Differential toxicity of anthracyclines on cultured endothelial cells. Endothelium 2004;11:253-8.
125.
Abou El Hassan MA, Verheul HM, Jorna AS, et al. The new cardioprotector Monohydroxyethylrutoside protects against doxorubicin-induced inflammatory effects in vitro. Br J Cancer 2003;89:357-62.
126.
Ogata Y, Takahashi M, Ueno S, et al. Antiapoptotic effect of endothelin-1 in rat cardiomyocytes in vitro. Hypertension 2003;41:1156-63.
127.
Shichiri M, Sedivy JM, Marumo F, Hirata Y. Endothelin-1 is a potent survival factor for c-Myc-dependent apoptosis. Mol Endocrinol 1998;12:172-80.
128.
Dong F, Zhang X, Wold LE, Ren Q, Zhang Z, Ren J. Endothelin-1 enhances oxidative stress, cell proliferation and reduces apoptosis in human umbilical vein endothelial cells: role of ETB receptor, NADPH oxidase and caveolin-1. Br J Pharmacol 2005;145:323-33.
67
129.
Mostafa MG, Mima T, Taniguchi T, Mori K. Doxorubicin, an RNA synthesis inhibitor, prevents vasoconstriction and inhibits aberrant expression of endothelin-1 in the cerebral vasospasm model of the rat. Neurosci Lett 2000;283:197-200.
130.
Riad A, Bien S, Gratz M, et al. Toll-like receptor-4 deficiency attenuates doxorubicin-induced cardiomyopathy in mice. Eur J Heart Fail 2008;10:233-43.
131.
Ueno M, Kakinuma Y, Yuhki K, et al. Doxorubicin induces apoptosis by activation of caspase-3 in cultured cardiomyocytes in vitro and rat cardiac ventricles in vivo. J Pharmacol Sci 2006;101:151-8.
132.
Lovric-Bencic M, Sikiric P, Hanzevacki JS, et al. Doxorubicine-congestive heart failure-increased big endothelin-1 plasma concentration: reversal by amlodipine, losartan, and gastric pentadecapeptide BPC157 in rat and mouse. J Pharmacol Sci 2004;95:19-26.
133.
Sayed-Ahmed MM, Khattab MM, Gad MZ, Osman AM. Increased plasma endothelin-1
and
cardiac
nitric
oxide
during
doxorubicin-induced
cardiomyopathy. Pharmacol Toxicol 2001;89:140-4. 134.
Lee ME, Dhadly MS, Temizer DH, Clifford JA, Yoshizumi M, Quertermous T. Regulation of endothelin-1 gene expression by Fos and Jun. J Biol Chem 1991;266:19034-9.
135.
Dorfman DM, Wilson DB, Bruns GA, Orkin SH. Human transcription factor GATA-2. Evidence for regulation of preproendothelin-1 gene expression in endothelial cells. J Biol Chem 1992;267:1279-85.
136.
Layon ME, Ackley CJ, West RJ, Lowrey CH. Expression of GATA-1 in a nonhematopoietic cell line induces beta-globin locus control region chromatin structure remodeling and an erythroid pattern of gene expression. J Mol Biol 2007;366:737-44.
137.
Mawji IA, Marsden PA. RNA transfection is a versatile tool to investigate endothelin-1 posttranscriptional regulation. Exp Biol Med (Maywood) 2006;231:704-8.
138.
Keltai K, Vago H, Zsary A, et al. Endothelin Gene Expression During Ischemia and Reperfusion. J Cardiovasc Pharmacol 2004;44:S198-S201.
68
9. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Értekezés témájával kapcsolatos közlemények: Keltai K, Cervenak L, Makó V, Doleschall Z, Zsáry A, Karádi I. Doxorubicin selectively suppresses mRNA expression and production of endothelin-1 in endothelial cells. Vasc Pharmacol 2010;53: 209-214. Keltai K, Vágó H, Zsáry A, Karádi I, Kékesi V, Juhász-Nagy A, Merkely B. Endothelin Gene Expression During Ischaemia and Reperfusion. J Cardiovasc Pharmacol 2004;44(suppl):S198-201. Keltai K, Vágó H, Zsáry A, Karádi I, Kékesi V, Merkely B. Az endotelin gén expresszió miokardiális ischaemia/reperfúzió során. Magyar Belorvosi Archívum, 2007;60 (2): 160-164. Keltai K, Zsáry A, Pásztor E, Schneider T, Sármán P, Rosta A, Karádi I, Jánoskuti L. Pathogenesis and monitoring of anthracycline induced cardiomyopathy: Role of endothelin-1, brain natriuretic peptide and serial echocardiography. Eur J Heart Fail Suppl (2006) 5(Suppl): 162-163 Zsáry A, Szűcs S, Keltai K, Schneider T, Rosta A, Sármán P, Fenyvesi T, Karádi I. Anthracyclines induced cardiomyopathy and endothelins. Eur J Heart Failure, 2003; Suppl., Vol.2 No. 1. p.15. (110). Vágó H, Soós P, Zima E, Keltai K, Gellér L, Kékesi V, Juhász-Nagy A, Merkely B. Endothelin-A receptor antagonist LU 135 252 has no electrophysiological and antiarrhythmic effects during myocardial ischaemia-reperfusion in dogs. Eur Heart J 2002; 23 (Suppl S): 215.
69
A disszertációhoz közvetlenül nem kapcsolódó közlemények: Zsáry A, Szűcs S, Keltai K, Pásztor E, Schneider T, Rosta A, Sármán P, Jánoskuti L, Fenyvesi T, Karádi I. Endothelin-1 and cardiac function in antracycline treated patients: a one-year follow-up. J Cardiovasc Pharmacol 2004;44(suppl1):S372-375. Szűcs A, Róka A, Soós P, Szilágyi S, Vágó H, Keltai K, Dezsi AC, Gellér L, Merkely B. Effect of Incessant Ventricular Tachyarrhythmias on Serum Endothelin and Bigendothelin Levels. J Cardiovasc Pharmacol 2004;44(suppl1:S402-406). Vágó H, Soós P, Zima Z, Gellér L, Keltai K, Róka A, Kékesi V, Juhász.-Nagy A, Merkely B. Changes of endothelin-1 and big-endothelin-1 levels and action potential duration during myocardial ischaemia-reperfusion in dogs with and without ventricular fibrillation. J Cardiovasc Pharmacol 2004;44(suppl1):S376-379. Zsáry A, Szűcs S, Keltai K, Schneider T, Rosta A, Sármán P, Fenyvesi T, Karádi I. Endothelins: A possible mechanism of cytostatics-induced cardiomyopathy. Leukemia & Lymphoma, 2004;45, 351-355. Szűcs A, Keltai K, Zima E, Vágó H, Soós P, Róka A, Szabolcs Z, Gellér L, Merkely B. Effects of implantable cardioverter defibrillator implantation and shock application on serum endothelin-1 and big-endothelin levels. Clin Sci 2002;103:233S-236S. Keltai M. és Keltai K. Antikoaguláns kezelés pitvarfibrillációban Card Hung, 2011;41:278-286.
70
Keltai M, Keltai K, Új antikoagulánsok a vénás thromboembolia megelőzésében és kezelésében. Orv Hetil 2011;152(25):983-992.
Keltai K. Metabolikus szindróma és szívelégtelenség. Magyar Családorvosok Lapja 2011;6:15-19.
Keltai K. Hypertonia kezelés szempontjai az alapellátásban. Magyar Családorvosok Lapja 2011;4:31-34.
Keltai K. Angiotenzin receptor blokkolók és kombinációik a hypertonia terápiájában. Magyar Családorvosok Lapja 2010;5:36-38. Keltai K, Gera I, Gábris K, Orosz M. Az infektív endocarditis megelőzésének új irányelvei és fogászati-szájsebészeti vonatkozásai. Fogorvosi szemle 2010;103:115-118.
Keltai K. Új irányelvek az infektív endocarditis megelőzésében. Magyar Családorvosok Lapja 2010;4:9-11.
Keltai K. A dilatatív cardiomyopathia korszerű kezelése. Magyar Családorvosok Lapja 2009;7:10-18.
Keltai K. Antithromboticus kezelés pitvarfibrillációban. Magyar Családorvosok Lapja 2008;6:2-9.
71
Keltai K. A béta-blokkolók helye a hypertonia és a szívbetegségek kezelésében. Magyar Családorvosok Lapja 2008;9:36-38. Pozsonyi Z, Förhécz Zs, Jánoskúti L, Keltai K, Lengyel M, Prohászka Z. Alkalmas-e az NT-PROBNP a pitvarfibrilláció sikeres kardioverziója után a tartós sinus ritmus fennmaradásának előrejelzésére? Magy Belorv Arch 2007;60:523-529. Nagy E, Bodó I, Jánoskúti L, Förhécz Zs, Keltai K, Zsáry A, Prohászka Z, Karádi I, Lengyel M. Protrombotikus markerek változása pitvarfibrilláció elektromos kardioverziója után. Cardiol Hung 2007;37:166-170. Zsáry A, Pásztor E, Szücs Sz, Keltai K, Schneider T, Rosta A, Sármán P, Jánoskúti L, Fenyvesi T, Karádi I. Endotelin-1 szintjének változása és anthracyclin okozta cardiomyopathia. Magy Belorv Arc 2004;57:67-70. Zsáry A, Keltai K. Acut coronaria szindróma. A nem ST-elevációval járó akut coronaria szindróma kezelése. Családorvosi Fórum 2003;1:36-44.
Keltai K. ACE –gátlók helye a kardiovaszkuláris betegségek kezelésében. Háziorvos Továbbképző Szemle 2003;8:683-687.
Keltai K. Vitiumok diagnózisa és gondozása. Családorvosi Fórum 2002;8:10-16.
72
Kempler P, Littmannn L, Jánoskúti L, Keltai K, Szombathy T, László Z, Zsáry A, Sármán P, Fenyvesi T. A pitvarfibrilláció non-farmakológiai kezelésének újabb eredményei. Magy Belorv Arch 1999;52:413-418. László Z, Kempler P, Jánoskúti L, Keltai K, Szombathy T, Rössler A, HinghoferSzalkay H. Szimulált orthostasis. Cardiol Hung 1999;2:47-51. Jánoskúti L, Kempler P, László Z, Keltai K, Szombathy T, Fenyvesi T. A korai posztinfarktusos periódusban végzett nem invazív tesztek prognosztikai értéke. Lege Artis Medicinae 1998;8:860-864. Keltai K, Ökrös P, Kempler P, Jánoskúti L, László Z, Csaba K, Littmann L. A P- hullám hiánya az EKG-n. Magy Belorv Arch 1998;51:363-365. László Z, Kempler P, Jánoskúti L, Keltai K, Fenyvesi T. Kamrai ritmuszavarok, balkamrafunkció és kamrai utópotenciál összefüggése és követése myocardialis infarctus után. Lege Artis Medicinae 1994;4:242-246. Jánoskuti L, László Z, Keltai K. „Regularisan irregularis” tartós monomorf kamrai tachycardia. Cardiol Hung 1994;3:43-44.
73
10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton is szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik hozzásegítettek dolgozatom elkészítéséhez. Szeretném megköszönni témavezetőim, Dr. Cervenak László és Prof. Dr. Merkely Béla segítségét és útmutatásait. Külön köszönetet kívánok mondani főnökömnek, Prof. Dr. Karádi Istvánnak, aki nemcsak elvárta, de támogatta és lehetővé is tette számomra, hogy a tudományos kutatásban részt vegyek. A kutya szívmodellen végzett vizsgálatokkal kapcsolatban köszönettel tartozom Dr. Vágó Hajnalkának és a Semmelweis Egyetem Kardiológiai Központ Kísérleti Kutatólabor dolgozóinak szakmai segítségükért. Köszönöm Makó Veronikának és a Semmelweis Egyetem III. sz. Belgyógyászati Klinika
Kutatólaboratórium
Endotélsejt
munkacsoportjának,
hogy
az
endothelsejttenyészeten végzett kísérletsorozat kivitelezésében segítségemre voltak. Továbbá köszönöm Doleschall Zoltánnak (Országos Onkológiai Intézet), mindkét kísérletsorozatban a molekuláris biológiai vizsgálatok elvégzésében nyújtott segítségét. Köszönettel tartozom Varga Katalinnak a PhD dolgozat szövegének formai gondozásáért.
74
