Ellenanyag reagensek II. 2016 március 1. Prechl József
poliklonális
savó v. aszcitesz
monoklonális lép v. nyirokcsomó
+
Egér hibridóma technika hátrányai – kísérletes munkában, diagnosztikában • Antigén toxikus vagy lebomlik a szervezetben, nem immunogén – nem lehet megfelelő moAb-t előállítani • A monoklonális ellenanyag esetenként nem fragmentálható, kicsi az affinitása, keresztreakciót mutat • nem megfelelő gyorsaságú/áteresztőképességű/specificitású a hibridóma technika
Egér monoklonális ellenanyagok hátrányai – emberi terápiában
• HAMA (human anti-mouse antibodies) – ellenanyagok jelennek meg a beadott egér ellenanyagok ellen > neutralizácó, allergia • Más/jobb effektor funkciókra lenne szükség – az egér moAb nem vált ki megfelelő ADCC-t /komplement aktivációt
Rekombináns ellenanyagok • Molekuláris genetikai módszerekkel létrehozott fehérjék • Aminosavszintű manipuláció lehetséges • Heterológ fehérjeexpresszió
gének
• Orvosi célokra is alkalmas
VDJ/VJ
fehérjetermelés
CH/CL
Rekombináns ellenanyagok előállítása
Antigén kötődése
CDR hurkok
C1, MBL FcR kötődés
Az antigéndeterminánsokkal kapcsolódó könnyű és nehézlánc szakaszok
Mindkét lánc, de főként a nehézlánc CDR3 régiójának kitüntetett szerepe a variablitiás fokozásában
Mire van szükségünk egy adott specificitású rekombináns emberi ellenanyag előállításához? • Variábilis régió gén: VH, VL szekvencia ismeretlen • Konstans régió gén: CH, CL az emberi Ig konstans szekvenciák ismertek
Megoldások emberi ellenanyagok előállítására • Humanizált és kiméra ellenanyagok - egér monoklonális ea-ok rekombináns módosítása (1) • Teljesen emberi ea-ok - hibridóma technológia (2A) - ellenanyag könyvtárak (2B) - transzgenikus állatok (2C)
Emberi hibridóma fág könyvtárak TG egerek
Egér hibridóma alapján
1
2A 2B 2C
Egér
kiméra
humanizált
teljesen emberi
gének
Géntechnológia V régió klónozás CDR grafting Eukarióta expresszió
Természetes génkészlet: emberi emberi/egér testi sejtek B-sejtek Csíravonal szekvencia (nincs VH/VL átrendeződés)
2A
1
Mesterséges génkészlet: ellenanyag [fág] könyvtárak 2C
VDJ/VJ
fehérjetermelés
Transzgenikus állatok 2B
egér
hibridóma
Emberi ellenanyagok előállítása
Megoldások emberi ellenanyagok előállítására • Humanizált és kiméra ellenanyagok - egér monoklonális ea-ok rekombináns módosítása (1) • Teljesen emberi ea-ok - hibridóma technológia (2A) - ellenanyag könyvtárak (2B) - transzgenikus állatok (2C)
A monoklonális ellenanyag előállítás menete
Rekombináns ellenanyagok előállítása
Naív repertoár Immun repertoár
antigén
lépsejtek
mielómasejtek
Szelekció ellenanyag szelekció klónozás
klónok felnövesztése
termelés
VL,VH klónozása + CH, CL, stb hozzáadása Termelés megfelelő expressziós rendszerben
RT-PCR módszer az Ig variábilis régió gének izolálásához kappa
L V J
gamma
C
L
V
DJ
C
mRNA
RT mRNAcDNA
PCR dsDNA
Megoldások emberi ellenanyagok előállítására • Humanizált és kiméra ellenanyagok - egér monoklonális ea-ok rekombináns módosítása (1) • Teljesen emberi ea-ok - hibridóma technológia (2A) - ellenanyag könyvtárak (2B) - transzgenikus állatok (2C)
Humán monoklonális Ea előállítása • Hibridóma technológiával: immortalizált, emberi Ig-t termelő B-sejthez kell jutnunk, amely az adott antigént nagy affinitással felismerő ellenanyagot termel : – In vivo immunizálás – In vitro immunizálás (gyenge hatékonyság)
In vivo immunizálás • Ritkán: oltás az antigénnel
Gyakrabban: • Például tumort ellátó nyirokcsomókból izolálni sejteket
• Vagy vírussal fertőzött egyén véréből izolálni limfocitákat
További gondok • Immortalizáció: Nehéz stabil emberi hibridómát előállítani - CpG oligonukleotidok + EBV (Epstein-Barr vírus) felhasználásával kivitelezhető
• In vitro nehéz izotípus váltást és affinitásérést kiváltani
Megoldások emberi ellenanyagok előállítására • Humanizált és kiméra ellenanyagok - egér monoklonális ea-ok rekombináns módosítása (1) • Teljesen emberi ea-ok - hibridóma technológia (2A) - ellenanyag könyvtárak (2B) - transzgenikus állatok (2C)
Fágkönyvtárak szűrése scFv 109-1012 Ismételt panning
g3p
Fehérje + gén
Kötődött klónok felszaporítása
Jó klónok (Kd < 10-7 M)
A fág szelekció és az immunválasz összehasonlítása ScFv fág könyvtár Diverzitás eredete Szintetikus / szemiszintetikus
B-sejt repertoire Genetikai – rekombinációs
Információhordozó DNS
DNS
Ag-kötő molekula ScFv-fág
Membrán Ig
Ea termelés
E. coli
B-sejt
Szelekció
Panning in vitro
Klonális szelekció
Affinitás érés
Mutátor E. coli törzsek Szomatikus tervezett módosítás
hipermutáció
Megoldások emberi ellenanyagok előállítására • Humanizált és kiméra ellenanyagok - egér monoklonális ea-ok rekombináns módosítása (1) • Teljesen emberi ea-ok - hibridóma technológia (2A) - ellenanyag könyvtárak (2B) - transzgenikus állatok (2C)
Emberi Ig locus
be
ki
Egér Ig locus
Emberi ellenanyagot termelő egerek
Emberi ellenanyagkönyvtár fágokon
Ismételt szelekciós ciklusok antigén B-sejtek izolálása
Fúziós partner hibridóma
szűrés
szűrés
gének
Klónozás, transzfektálás
Természetes génkészlet: emberi emberi/egér Testi sejtek B-sejtek Csíravonal szekvencia (nincs VH/VL átrendeződés)
2A
1
Mesterséges génkészlet: ellenanyag [fág] könyvtárak 2C
VDJ/VJ
+ CH, CL
fehérjetermelés
Transzgenikus állatok 2B
egér
hibridóma
Emberi ellenanyagok előállítása
Konstans domének beépítése • Cél szerint választható izotípus – itt tudjuk meghatározni milyen effektor funkciókat szeretnénk adni ellenanyagunknak
Emberi Ig izotípusok/receptoraik
IgG – FcγR IgA – FcαR IgM – FcμR IgE – FcεR
Poly-IgR – IgM, IgA
Az ellenanyagok általános funkciói
Konstans domének beépítése • felhasználás szerint választható izotípus IgG1 : ADCC, CDC IgG4 : neutralizálás
Rekombináns ellenanyag formátumok • • • • • •
Teljes ellenanyag F(ab’)2 Fab Fc scFv sd Ab
nem kell emészteni!
Az egyláncú antitestek(scFv) felépítése IgG
Csak molekuláris genetikai úton hozható létre scFv
VLVH
CLCH1
CH2
CH3
Molekulasúly FcR kötõdés C1q kötés Szénhidrát csoport Diszulfid híd Ag kötõhelyek
IgG kb 150 kD + + + láncon belüli, láncok közti 2
scFv kb 30 kD csak láncon belüli 1
Single-domain ellenanyagok
Expressziós rendszerek • • • • • • •
in vitro transzláció Escherichia coli : scFv, Fab Pichia pastoris : scFv, Fab Rovarsejtek: scFv, Fab Emlőssejtek (COS, CHO, BHK, Sp2) : Ig transzgenikus növények : sIgA transzgenikus állatok(kecske) : tejbe kiválasztódó Ig
Rekombináns gének bejuttatása a termelő sejtekbe
Transzgenikus állatok esetén: -ivarsejtek -megtermékenyített petesejt -embrionális őssejt -embrió
Sejtkultúra esetén -E.coli -Pichia pastoris -Rovarsejtek -Emlőssejtek -Növényi sejtek
gének
Természetes génkészlet: Testi sejtek
Mesterséges génkészlet: ellenanyag [fág] könyvtárak)
B-sejtek
Csíravonal szekvencia (nincs VH/VL átrendeződés)
VDJ/VJ + CH, CL
fehérjetermelés
Transzgenikus állatok
Tehén, nyúl
egér
Poliklonális ellenanyag
Transzgenikus élőlények (növények, állatok)
Sejttenyészetek (E.coli, Pichia, rovarsejt, emlőss.), in vitro transzláció
hibridóma
Monoklonális ellenanyag
Emberi ellenanyagok előállítása
Összefoglalás • Rekombináns technológiával előállíthatók - emberi ellenanyagok - ellenanyag fragmentumok - aminosav szintű tervezhető módosítások - fúziós fehérjék - transzgenikus, tervezett ellenanyagokat előállító élőlények
