De plaats van Next Generation Sequencing - technieken bij de diagnostiek van genetische, nietsyndroomgebonden

Academiejaar 2013 - 2014

De plaats van ‘Next Generation Sequencing’technieken bij de diagnostiek van genetische, nietsyndroomgebonden cardiomyopathieën

Charlotte Dujardin

Promotor: Prof. Dr. Paul Coucke

Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding

MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

Academiejaar 2013 - 2014

De plaats van ‘Next Generation Sequencing’technieken bij de diagnostiek van genetische, nietsyndroomgebonden cardiomyopathieën.

Charlotte Dujardin

Promotor: Prof. Dr. Paul Coucke

Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding

MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

Voorwoord

Bij deze wil ik graag mijn promotor, Professor Coucke, bedanken voor de intensieve begeleiding bij dit werk gedurende de voorbije twee jaar. Hij hielp me in eerste instantie bij de introductie tot de genetische technieken. Daarnaast voorzag hij de geschreven tekst waar nodig van kritische opmerkingen. Ik wil hem verder ook bedanken voor zijn flexibiliteit inzake beschikbaarheid en voor de vlotte samenwerking de afgelopen periode. Verder zou ik mijn familie, vrienden en enkele medestudenten willen bedanken voor de keren dat zij een luisterend oor boden, voor hun opmerkingen bij de tekst en de hulp bij de lay-out.

Inhoudsopgave 1. Abstract ............................................................................................................................................... 1 2. Methodologie ...................................................................................................................................... 2 3. Inleiding ............................................................................................................................................... 3 3.1. Context, epidemiologie en definitie ............................................................................................. 3 3.2. De verschillende soorten cardiomyopathieën ............................................................................. 7 3.2.1. Hypertrofe cardiomyopathie (HCM)..................................................................................... 8 3.2.2. Gedilateerde cardiomyopathie (DCM) ................................................................................ 10 3.3. De diagnostische methoden: van Sanger tot NGS ..................................................................... 12 3.4. Klinische relevantie van genetische diagnostiek en genetische counseling. ............................. 16 4. Resultaten.......................................................................................................................................... 18 4.1. Overzicht getroffen genen per ziektebeeld................................................................................ 18 4.1.1. HCM ..................................................................................................................................... 19 4.1.1.1. Familiale casus met stamboom .................................................................................... 22 4.1.2. DCM ..................................................................................................................................... 23 4.2. Genetische testing van cardiomyopathieën voor het NGS tijdperk ........................................... 29 4.2.1. Sanger-gebaseerde genetische testing ............................................................................... 29 4.2.1.1. Niet-gerichte Sanger sequenering. ............................................................................... 29 4.2.1.2. Gerichte Sanger sequenering ....................................................................................... 30 4.2.1.3. Toepassing van gerichte sequenering voor de cardiomyopathieën ............................ 30 4.2.2. Andere technieken .............................................................................................................. 34 4.3. Aanpak van genetische testing mits gebruik van NGS technieken ............................................ 34 4.3.1. Voor-en Nadelen van NGS ................................................................................................... 34 4.3.2. Gerichte sequenering, WES en WGS ................................................................................... 35 4.4.Optimalisatie van de NGS technieken specifiek voor HCM en DCM ........................................... 37 4.5. Ethische beschouwingen ............................................................................................................ 40 4.5.1. Algemeen............................................................................................................................. 40 4.5.2. Psychologische belasting ..................................................................................................... 41 4.5.3. Genetische counseling......................................................................................................... 41 4.5.4. ‘Incidental findings’ en ‘VUS’ ............................................................................................... 41 5. Discussie ............................................................................................................................................ 43 6. Referenties ........................................................................................................................................ 45 Bijlage 1 ................................................................................................................................................. 48 Bijlage 2 ................................................................................................................................................. 49

1. Abstract Inleiding: Cardiomyopathieën zijn een groep ziekten die het hart zowel structureel als functioneel kunnen aantasten en zo aanleiding geven tot hartfalen. Ze zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. De oorzaken hiervan zijn erg uiteenlopend: van verworven aard, iatrogeen, genetisch tot idiopathisch. In een aantal gevallen kunnen de ziekten dus een familiale basis hebben, maar ook bij de sporadische, zogenaamd idiopathische vormen, kan een genetische oorzaak aan de basis liggen. Er bestaan verschillende vormen van cardiomyopathieën, maar ze kunnen alle onder een gezamenlijke noemer geplaatst worden, aangezien een sterke heterogeniteit kenmerkend is, zowel klinisch als genetisch. De gevolgen kunnen ernstig zijn, daar vaak aritmieën, acuut hartfalen en zelfs plotse dood soms de eerste manifestaties zijn. Diagnostiek van een dergelijke mogelijks genetische oorzaak gebeurt op vandaag meestal aan de hand van Sanger sequenering, een techniek die tijdrovend en behoorlijk duur is. Bovendien heeft deze techniek als nadeel dat slechts een beperkt aantal genen kan worden onderzocht. Door de komst van nieuwe ‘high troughput’ technieken om DNA te sequeneren, kan de diagnostiek van cardiomyopathieën efficiënter worden aangepakt. Deze nieuwe methoden voor het bepalen van de DNA sequentie, de zogeheten ‘Next Generation Sequencing’ technieken, worden reeds toegepast in andere domeinen, bijvoorbeeld in de oncologische genetica. Doelstelling: Het doel van dit eindwerk bestaat erin om na te gaan in welke mate ‘Next Generation Sequencing’ technieken een plaats kunnen hebben bij de diagnostiek van genetisch bepaalde cardiomyopathieën. Binnen het bestek van deze thesis vallen vooral de hypertrofe en gedilateerde cardiomyopathieën. Methodologie: Voor deze literatuurstudie werd gebruik gemaakt van artikels gevonden via voornamelijk Pubmed en google Scholar. Ook werden referenties van reeds gevonden artikels geraadpleegd. Resultaten: De resultaten van deze literatuurstudie tonen aan dat er op dit ogenblik veel belangstelling is om dergelijke ‘Next Generation Sequencing’ technieken te appliqueren voor de cardiomyopathieën. De voordelen hiervan blijken legio en bovendien is de accuraatheid vergelijkbaar met die van Sanger. Belangrijke dilemma’s die hierbij echter rijzen zijn 1

voornamelijk van ethische aard. Bovendien is het ook voor de bio-informatica een uitdaging om deze grote hoeveelheid data te kunnen verwerken, analyseren en hanteren op een efficiënte manier.

2. Methodologie Voor deze literatuurstudie werden allereerst de nodige opzoekingen gedaan op Google om zo mijn kennis van de genetica en genetische technieken opnieuw wat op punt te stellen. Vervolgens werd literatuur geconsulteerd omtrent de pathologische entiteit van de Cardiomyopathieën. Deze literatuur werd steeds in het Engels bekeken. Er werd gezocht via Pubmed met als zoektermen: “genetic cardiomyopahties”, “cardiomyopathy genes”, “familial cardiomyopathies”. Dit leverde respectievelijk 4228, 3705, 3638 zoekresultaten. Vervolgens werd hetzelfde gedaan voor de ‘Next Generation Sequencing’ technieken. Dit verschafte wat meer informatie op via de gebruikte termen: “Next Generation Sequencing techniques”, “Next Generation Sequencing diagnostics”, “Next Generation Sequencing clinic” en “Next Generation Sequencing clinical diagnostics”. Dit leverde respectievelijk 5527, 284, 149, 157 zoekresultaten. Nadien werden ook gecombineerde zoektermen ingevoerd, zoals: “cardiomyopathies Next Generation Sequencing”. Dit leverde 40 zoekresultaten. Verder werd er ook geselecteerd op datum om het aantal artikels te reduceren, met name vooral artikels van na het jaar 2000 en vooral dan na 2009 werden weerhouden. Gezien de technieken van de ‘Next Generation’ nog maar sinds 2009 echt in volle ontwikkeling kwamen, heb ik hier dus naar zeer recente gegevens teruggegrepen. In Pubmed kon hiervoor gebruik gemaakt worden van de functieknop “Limits” die op ‘laatste 10 jaar’ werd gezet. Door de functieknop “Limits” uit te zetten en manueel enkele artikels te doorlopen, konden ook iets oudere artikels worden bekeken. Via het doorklikken met behulp van de optie “Related articles” konden eveneens enkele nuttige artikels worden teruggevonden. Wat de aard van de literatuur betreft, ging de keuze vooral uit naar “review articles”, maar ook enkele “case-reports” en nog niet- gereviewde studies werden gebruikt.

2

3. Inleiding 3.1. Context, epidemiologie en definitie Cardiovasculaire aandoeningen zijn nog steeds de nummer één doodsoorzaak in vele geïndustrialiseerde landen. Deze ziekten zijn hoofdzakelijk verworven en worden in grote mate mee door de levensstijl (i.e. roken, dieet, weinig beweging…) bepaald. Een veel beperkter, doch niet onbelangrijk deel van de hartziekten zijn niet verworven, maar wel congenitaal, met al dan niet een genetische basis. Nog andere hartziekten zijn dan weer zuiver genetisch bepaald en kunnen zich op verschillende leeftijden manifesteren. We onderscheiden bij de niet-verworven hartziekten enerzijds deze die kaderen in een syndroom en anderzijds de niet-syndroomgebonden afwijkingen die op zichzelf een klinisch beeld uitmaken. De groep hartziekten waarvoor geen oorzaak gevonden kan worden, noemt men idiopathisch.

3

Figuur 1. Wereldwijde oorzaken van sterfte en de verdeling van ziektecontributie binnen de sterftes ten gevolge van cardiovasculaire ziektes. Met ‘other cardiovascular diseases’ worden bedoeld: afwijkingen van de hartspier (bijvoorbeeld cardiomyopathieën), stoornissen in de elektrische conductie van het hart (bijvoorbeeld aritmieën) en ziekten van de hartkleppen.

De cardiomyopathieën zelf zijn een zeer heterogene groep van aandoeningen van het myocard die gepaard gaan met een vorm van mechanisch of elektrisch malfunctioneren en waarbij meestal een ventriculaire hypertrofie of dilatatie gezien wordt. Vaak resulteert deze aantasting in hartfalen. De oorzaken zijn erg uiteenlopend, doch dikwijls kan een genetische basis worden vastgesteld. [1] In een andere gangbare definitie wordt cardiomyopathie beschreven als een aandoening van het myocard, waarbij de hartspier structureel of functioneel abnormaal is, in afwezigheid van coronair lijden, hypertensie, kleplijden of congenitale hartaandoeningen, ernstig genoeg om de geobserveerde mycordafwijking te veroorzaken. [2] De classificatie van cardiomyopathieën is in de literatuur niet geheel eenduidig. In artikels van de ‘American Heart Association’ (AHA), vindt men de opdeling in primaire en secundaire cardiomyopathieën. Hierbij beschouwt men de aandoeningen die louter het hart treffen als primair, terwijl men de cardiomyopathieën die het gevolg zijn van systemische afwijkingen als secundair beschrijft. [1] 4

Figuur 2. Classificatie der cardiomyopathieën volgens de American Heart Association. Primaire cardiomyopathieën waarvan de klinische relevante ziekteprocessen uitsluitend of voornamelijk het myocard betreffen. De aandoendingen werden opgedeeld volgens genetische of niet-genetische etiologie. * Voornamelijk niet-genetisch; familiale ziekte met een genetische oorzaak komt voor in een minderheid van gevallen. [1]

Aangezien deze indeling niet goed klinisch werkbaar is, weerhoudt de ‘European Society of Cardiology’ (ESC) volgens de richtlijnen van 2007 een andere classificatie. Deze is meer klinisch georiënteerd en vertrekt vanuit de symptomatologie. [2] Men let hierbij op de morfologie en functie van de ventrikels zoals die uit onderzoek naar voor komen. Op die manier worden de cardiomyopathieën gegroepeerd in morfologische en functionele fenotypes, die elk nog worden onderverdeeld in familiaal of niet-familiaal voorkomend. [2] Onder familiaal verstaat men het in minstens één familielid voorkomen van een zelfde afwijking of van een fenotype dat zou kunnen veroorzaakt worden door dezelfde genetische mutatie en niet te wijten is aan een verworven cardiale of systemische ziekte waarbij het klinisch fenotype beïnvloed wordt door een genetisch polymorfisme. Patiënten 5

met een

aangetoonde de novo mutatie worden eveneens onder de groep familiaal geplaatst, aangezien zij mogelijks het kenmerk kunnen hebben doorgegeven. [2] Niet-familiale cardiomyopathieën worden gedefinieerd als de aanwezigheid van de aandoening bij de indexpatiënt en afwezigheid van de ziekte bij andere familieleden(waarvoor stamboomonderzoek werd uitgevoerd). Zij worden dan verder opgedeeld in idiopathisch (als geen causale factor kan worden aangetoond) en verworven (als de ventrikelaantasting eerder een gevolg is van een bestaande afwijking dan een intrinsiek kenmerk van de ziekte). [2]

Figuur 3. Classificatie der cardiomyopathieën volgens de European Society of Cardiology. Samenvatting van het voorgestelde classificatiesysteem. ARVC, aritmogene rechter ventrikel cardiomyopathie; DCM, gedilateerde cardiomyopathie; HCM, hypertrofe cardiomyopathie; RCM, restrictieve cardiomyopathie. (* zie tabel bijlage 1). [2]

De prevalentie van niet-syndroomgebonden cardiomyopathieën bedraagt ongeveer 1/500 1 in de totale populatie.[3,4,5] Het is echter zo dat de cardiomyopathieën zich frequent voordoen bij jonge volwassenen en zelfs bij neonaten, kinderen en adolescenten. De maatschappelijke gevolgen zijn daarom ook reëel. Eind de jaren tachtig werd voor de hypertrofe cardiomyopathie (HCM) een genetische aanwijzing gevonden.[5,6,7] Vrij snel bleek deze cardiomyopathie genetisch bijzonder heterogeen te zijn, want men vond meerdere mutaties in verschillende genen. Tot op heden zijn zo reeds meer dan 50 verschillende genen, met elk tientallen tot honderden mutaties, beschreven. Ook voor de andere soorten cardiomyopathieën is het genetisch onderzoek nog steeds aan de gang.

1

Dit is voor de HCM

6

Efficiënte genetische testing en adequate analyse en gegevensmanagement bleken essentieel om de veelheid aan informatie die hierbij bekomen werd, te kunnen verwerken. Dit stelde uitdagingen voor de moleculaire diagnostiek en de bio-informatica. Zowel wat genetische testmethoden zelf betreft, als de informatieverwerking, werden verschillende systemen op de markt gebracht. Inzake het testen, was ‘Sanger Sequencing’ gedurende drie decaden de gouden standaard, totdat omstreeks 2006 nieuwe sequeneringsmethoden in gebruik kwamen. Het principe van deze ‘Next Generation Sequencing’-technieken, is geheel verschillend van dat van de Sanger methode. Ze kunnen aan een veel hoger tempo en tegen een lagere prijs genetische screening uitvoeren. Men geeft zelfs aan dat het met NGS binnen enkele jaren zal mogelijk zijn om voor iedereen die dit wenst zijn genetische afdruk te laten maken en dit amper voor ongeveer 1000 dollar. In een tijdperk waar de geneeskunde steeds meer afstevent op “personal medicine”, is dit dus een onderwerp dat zeker en vast niet links mag blijven liggen. Het doel van deze scriptie is daarom een overzicht te geven van de huidige stand van zaken betreffende de moleculaire diagnostiek van cardiomyopathieën en hierbij de plaats van ‘Next Generation Sequencing’ te belichten. 3.2. De verschillende soorten cardiomyopathieën

Het mag reeds duidelijk zijn dat een cardiomyopathie zich in uiteenlopende fenotypische vormen kan presenteren en zeker ook binnen elke subvorm is er een belangrijke variatie in klinische presentatie. Dit beslaat de klinische heterogeniteit van de ziekte. Aan de hand van de wijzigingen in het myocard onderscheiden we volgende varianten: hypertrofe cardiomyopathie (HCM), gedilateerde cardiomyopathie (DCM), restrictieve cardiomyopathie (RCM), aritmogene rechter ventriculaire dysplasie/cardiomyopathie (ARVD/C), linker ventrikel non-compactie (LVNC) en mitochondriale cardiomyopathie. Uit de verkennende literatuur en de Europese classificatie indachtig, leek naar voor te komen dat hypertrofe en gedilateerde cardiomyopathie de meest frequente vormen zijn. Daarom werd besloten de scriptie vooral toe te spitsen op deze twee types cardiomyopathieën. De andere vormen laten we hier buiten beschouwing.

7

Figuur 4. Overzicht klinische categorieën van de erfelijke cardiomyopathieën en hun genetische basis. De klinische entiteiten hypertrofe en gedilateerde cardiomyopathie hebben enkele ziekteveroorzakende genen gemeenschappelijk met elkaar, maar ook met restrictieve cardiomyopathie en linker ventrikel noncompactie. Deze laatste twee zijn minder frequent. Aritmogene rechter ventrikel cardiomyopathie blijkt eerder een genetisch aparte categorie te zijn, doch het fenotype kan niet steeds makkelijk van gedilateerde cardiomyopathie worden onderscheiden. AMPK wijst op het AMP-geactiveerd proteïne kinase, GLA op het α-galactosidase A, LAMP2 op het lysosomaal-geassocieerd membraan proteïne 2 en TEM43 op het transmembraan proteïne 43. De (klassen) genen in het rood vermeld, stellen de meest voorkomende oorzaak van ziekte voor binnen elke categorie. [6]

Naast belangrijke verschillen in klinische presentatie, verschillen de cardiomyopathieën evenzeer qua genetische oorzaken, zowel tussen als binnen de verschillende subvormen. Hieronder valt dan de genetische heterogeniteit van de ziekte. In onderstaande belichten we heel kort de ziektebeelden afzonderlijk.

3.2.1. Hypertrofe cardiomyopathie (HCM) Genetisch aspect HCM is door de band een monogene aandoening en wordt in de grote meerderheid van de gevallen autosomaal dominant overgeërfd.[8,9] In eerder zeldzame gevallen kunnen twee of meer causale genen of mutaties worden teruggevonden. Dit gaat dan evenwel gepaard met een meer fulminant verloop van de ziekte, met name manifestatie op jongere leeftijd (kinderleeftijd) en een hogere mortaliteit en morbiditeit.[8,9,10,11]

8

HCM wordt in de literatuur vooral beschreven als zijnde een ziekte van het sarcomeer. Immers bijna alle causale mutaties bevinden zich in genen die coderen voor één van de elementen van het sarcomeer. Sarcomerische mutaties kunnen teruggevonden worden in ongeveer in 50 procent van de patiënten die doorgestuurd worden voor genetische testing.[12,13] Bovendien zou bij circa 60 procent van de volwassenen en kinderen met een familiale anamnese van HCM, een mutatie in genen van het Sarcomeer kunnen worden gedetecteerd. [12] Echter bij 30 tot 40 procent van de patiënten met klinische HCM, kunnen tot nog toe geen sarcomerische mutaties worden teruggevonden.[3] Het is dus goed mogelijk dat er nog andere verantwoordelijke pathways zijn en, in deze context, zouden nog nieuwe genen kunnen worden gevonden. De mutaties hebben eerder een lage penetrantie2 en als ze tot uiting komen is het vaker op latere leeftijd. Naast de eigenlijke causale mutaties, zijn er ook een hele range “modifier genes” die van invloed zijn op het fenotype en dus ook op de prognose. Histologisch aspect Op coupe manifesteert de ziekte zich als verdikking van de myocyten en “myocyte disarray”. Dit is een onordelijke rangschikking van de hartspiercellen. Het gevolg van deze histologische veranderingen is dat er concentrische hypertrofie optreedt. Deze hypertrofie kan zowel het linker als rechter ventrikel treffen, doch meest frequent het linker ventrikel. Bovendien gaat het vaak over een asymmetrische hypertrofie waarbij het interventriculair septum klassiek is aangetast. [6,9,14]

Figuur 6. ‘Myocyte disarray’. [16]

Figuur 5. Normaal myocardweefsel. [15] 2

Dit wil zeggen de mate waarin de aanwezigheid van een mutatie zich effectief uit in het ontwikkelen van het kenmerk, in casu de hypertrofie.

9

Klinisch aspect De klinsche diagnose van HCM berust op anamnese, lichamelijk onderzoek, ECG en echocardiografie. [4,17,18] De patiënten kunnen klachtenvrij zijn of volgende symptomen vertonen: pijn op de borst, kortademigheid, bewustzijnsverlies, hartfalen van het type HFpEF (diastolisch hartfalen) en plotse cardiale dood.[9,18] Deze plotse cardiale dood3 is in sommige gevallen de eerste en enige manifestatie van de ziekte en kent dus een bijzonder fatale afloop. De geschatte jaarlijkse incidentie ervan bedraagt 0,7 procent bij volwassenen en 1-2 procent bij kinderen.[9,18] Plotse cardiale dood in de familiale anamnese is daarom een reden om genetisch onderzoek aan te vragen. De belangrijkste oorzaken van sterfte tengevolge van HCM zijn progressief hartfalen, thrombo-embolische complicaties en plotse cardiale dood.[1,3,4,9,13] Het hartfalen is een zeer invaliderende aandoening, die de levenskwaliteit erg aantast en uiteindelijk vrij snel fataal kan worden. Prevalentie: De prevalentie van hypertrofe cardiomyopathie bedraagt 1/500 personen (cijfers voor europa). Dit is dus toch vrij frequent. [1,3,4,9,14]

3.2.2. Gedilateerde cardiomyopathie (DCM) Genetisch aspect In tegenstelling tot HCM, is DCM in veel mindere mate een ziekte van het sarcomeer, ook al worden mutaties in enkele van deze genen wel teruggevonden. [16] Er zijn echter een groot aantal andere elementen en pathways, waarbij mutaties ervan aanleiding kunnen geven tot DCM (bijvoorbeeld betreffende de kernenvelop, het contractiel apparaat, het krachttransductie apparaat (nl. Z-schijf), gen transcriptie en splicing machinerie en de Ca- huishouding). [1,2,3,6,19] De uitdagingen zijn hier veel groter dan bij HCM, aangezien nog slechts relatief weinig causale genen gevonden werden en elk van de causale genen slechts een beperkte bijdrage heeft tot de totale incidentie. [20]

3

Een voorbeeld hiervan is de plotse cardiale dood van jonge atleten.

10

De ziekte is eveneens meestal monogeen van aard,

maar zeker evenzeer genetisch

heterogeen. Nog een verschilpunt met HCM, zit hem in de aard van overerving. DCM wordt immers vaak autosomaal dominant overgeërfd, maar ook autosomaal recessieve, X-gebonden overerving en mitochondriale overerving worden regelmatig beschreven. [1,3,6,19,21,22]. De ziekte heeft eerder een hoge penetrantie, doch er werden individuen beschreven die het fenotype niet ontwikkelden. De penetrantie is ook hier opnieuw leeftijdsafhankelijk. [3,6,19,20,21] Daarnaast wordt DCM soms overgeërfd samen met andere kenmerken, zowel cardiaal (bv. geleidingsstoornissen) als niet cardiaal gerelateerd (bv neurosensorieel gehoorverlies). [6,21,22] Histologisch aspect Histologisch noteren we hier het afsterven van de myocyten en daaropvolgend fibrotische omvorming, waardoor het ventrikel dilateert.[6]

Figuur 7. Viabele myocyten met ertussen fibrotische omvormingen. [6]

Klinisch aspect Klinisch manifesteert de ziekte zich als een excentrische hypertrofie, wat aanleiding geeft tot een sterk gedilateerd hart. De patiënt gaat uiteindelijk ook in hartfalen, met name van het type HFrEF of dus systolisch hartfalen.[3,6,23] Meer frequent dan bij HCM is plotse cardiale dood de eerste manifestatie van het hartlijden. DCM is ook fentoypisch zeer heterogeen. Klinische diagnostiek gebeurt eveneens aan de hand van een suggestieve familiale anamnese, een echocardiografisch onderzoek en met behulp van ECG. [21]

11

Prevalentie Omtrent de prevalentie van DCM zijn relatief weinig eenduidige cijfergegevens beschikbaar. Men vermoedt echter dat zo’n 30 tot 50 procent van alle gevallen familiaal en dus genetisch overerfbaar zijn. [1,19,20,21,23,24] In de USA komt dit overeen met een prevalentie van 36/100000 personen die de ziekte hebben of dus ongeveer 1/2500 personen.[1,19,25] 3.3. De diagnostische methoden: van Sanger tot NGS

De eerste methode die ons toeliet om relevante hoeveelheden DNA te sequeneren, was de ‘Direct Sequencing’ of

dus de ‘Sanger Sequencing’ methode in 1977 ontwikkeld door

Sanger. [26] Deze eerste generatie sequeneringsmethode heeft ruim ongeveer 30 jaar het veld beheerst. De geautomatiseerde Sanger sequeneringsmethode, die de laatste twintig jaar de vooraanstaande methode was, heeft dan ook een enorme bijdrage gehad in het praktisch mogelijk maken van genetisch onderzoek en werd gebruikt om de eerste DNA sequentie van een menselijk genoom op te stellen. Het principe van Sanger berust op de selectieve incorporatie van terminerende dideoxynucleotiden.[26] Dit zijn nucleotiden die twee hydroxylgroepen bevatten, waardoor de binding met het volgende nucleotide in de sequentie niet mogelijk is. Op die manier wordt de polymeer van nucleotiden -wat neer komt op een stuk enkelstrengige DNA-molecule- op die specifieke plaats afgebroken. Men vertrekt dus van het enkelstrengig gemaakte te onderzoeken DNA, met toevoeging van een voldoende hoeveelheid van de vier deoxynucleotiden (A, G, C, T), geschikte primers, het DNA-polymerase enzym en een voldoende hoeveelheid fluorescent gemerkt terminerend dideoxynucleotide. Vervolgens laat men de reactie verlopen, en ziet men dat er DNAsequenties worden gevormd van elke mogelijke lengte. Immers het DNA-polymerase zal op willekeurige plaatsen de terminerende nucleotide inbouwen. De bekomen enkelstrengige DNA fragmenten worden hierop volgend in een capillaire gelelectroforese gebracht, waarin ze migreren volgens lengte. Door dit te doen voor de vier verschillende terminerende nucleotiden, kan aldus de DNA sequentie van kort naar lang, nucleotide voor nucleotide worden afgelezen. Zimmerman kwam in 1988 met het concept om dit hele proces volledig geautomatiseerd te laten verlopen, de zogenaamde ‘automated Sanger Sequencing” ontstond hierbij. [27] 12

Figuur 8. Principe van ‘chain termination’. [28]

Figuur 9. Capillaire gel electroforese met aflezen van de DNA-sequentie. [29]

Door de enorme kennisexplosie inzake genetica en de intrede van genetisch onderzoek in de klinische praktijk, was er nood aan snellere en goedkopere methoden voor het bepalen van de DNA-sequentie. Verscheidene technieken werden uitgeprobeerd, maar niets dat de Sanger methode wist te overtreffen. Althans niet tot de ‘Next Generation Sequencing’-methoden (NGS) werden geïntroduceerd. Hiermee kunnen massief gegevens worden geproduceerd, aan een redelijke prijs en binnen een werkbare tijd. Er zijn momenteel verscheidene gangbare NGS methodes, maar algemeen volgen ze alle hetzelfde basisprincipe: bereiding van een template, sequencing met beeldvorming en ten slotte alignering aan het genoom of assemblage van de bekomen sequenties. [30,31] a) Bereiding van de template Er wordt vertrokken van het DNA van de testpersoon dat at random enzymatisch in stukken wordt geknipt. Zo bekomt men een DNA fragment dat de basis vormt voor een template. Een template bestaat immers telkens uit een universele adaptor aan beide zijden van een target DNA-segment. Men kan nu via twee verschillende manieren met deze bekomen templates verder gaan. Enerzijds kan men de templates clonaal amplificeren. Hierbij wordt gebruik gemaakt van emulsie-PCR of ‘solid phase’-amplificatie om van elke template 13

duizenden kopieën te maken. Deze zijn dan dus gefixeerd ofwel op een bolletje ofwel op een vaste plaat met vorming van clusters. Er zijn zo van elk target duizenden templates in elkaars omgeving. Anderzijds kan men ervoor kiezen om direct tot de sequeneringsreactie over te gaan, zonder voorafgaande amplificatie van het target DNA. Men werkt dan via zogenaamde ‘Single Molecule’-templates, waarbij van elk targetfragmentje slechts één template is in plaats van vele duizenden kopies. Hierbij kan ofwel de primer ofwel de template zelf ofwel het polymerase op de plaat worden bevestigd ter fixatie. b) Sequenering en beeldvorming Het sequeneren kan gebeuren aan de hand van cyclisch reversiebele terminatie, sequenering door ligatie en door ‘single nucleotide’ additie (‘pyrosequencing’), elk met hun specifieke beeldvormingstechnieken. De beeldvorming is telkens ook in zekere zin gebaseerd op het aflezen van fluorescentiesignalen. Met een CCDcamera kan de volledige draagplaat dan worden afgescand om zo voor elke streng (of cloon van strengen) de toegevoegde base in de sequentie af te lezen. Er zijn verschillende firma’s die ieder werken volgens één van bovenstaande principes. Zo werkt het Roche 454 toestel via pyrosequencing. Het SOLiD toestel via sequencing door ligatie. Het Illumina/Solexa en het Helicos Biosciences toestel via cyclisch reversiebele sequencing. c) Alignering aan het genoom of assemblage van de bekomen sequenties Resultaat van de sequeneringsreactie en beeldvorming is een ‘read’, dit is dus de genetische sequentie van het targetfragment met opnieuw beiderzijds adaptors. Nadat alle strengen werden uitgelezen, moeten de bekomen ‘reads’ nog ten opzichte van elkaar gerangschikt worden, om zo de volledige opeenvolging van basen in de gesequeneerde regio of in het hele genoom te bekomen. Dit gebeurt volgens overlap van reads, die immers delen van nabijgelegen regio’s omvatten. Men heeft hier ook weer twee mogelijkheden. Enerzijds is er het aligneren van alle reads en vergelijken ten opzichte van een referentie genoomsequentie, genaamd ‘resequencing’. Anderzijds kan men ook enkel werken met de ‘reads’, zonder deze te linken aan een referentiegenoom. In dit geval spreekt men van ‘de novo sequencing’.

[30,31]

14

Figuur 10. Algemeen principe van sequenering volgens NGS. Verschillende stappen in het proces van NGS voor platforms die werken via clonaal geamplificeerde ‘templates’ (Roche 454, Illumina en Life Technologies). Het DNA waarvan men vertrekt, wordt geconverteerd tot een ‘sequencing library’ via fragmentatie, ‘end repair’ en ligatie aan platformspecifieke oligonucleotide-adapters. Individuele ‘library’-fragmenten worden clonaal geamplificeerd via ofwel (1) water in olie ‘bead’-gebaseerde emulsie-PCR (Roche 454 en Life Technologies) ofwel (2) ‘bridge’-amplificatie op een vast oppervlak (Illumina). ‘Flow cell’ sequenering van de clonale ‘templates’ genereert een luminescent of fluorescent signaal. Deze signalen worden vervolgens met behulp van algoritmes verwerkt tot ‘reads’. [31]

Een van de grootste verschillen met Sanger bestaat dus in het feit dat na elke cyclus voor iedere ‘template’ (of cloon van ‘templates’) de toegevoegde base wordt afgelezen. Bij Sanger gebeurt het uitlezen pas op het einde door de bekomen getermineerde strengen te rangschikken volgens lengte met behulp van gelelectroforese. Bovendien zijn de huidige toestellen dermate geavanceerd dat niet alleen test-DNA van één proefpersoon, maar zelfs van meerdere proefpersonen tegelijk kan gesequeneerd worden. Dit volgens het ‘Multiplexed Sample’ principe. Hierbij maakt men onder meer gebruik van barcodes om het DNA, afkomstig van verschillende stalen, te kunnen onderscheiden. 15

Praktisch worden twee begrippen vaak gebruikt als eigenschappen van de toegepaste sequeneringsmethode. Deze zijn de ‘read’-lengte en de ‘coverage’. De ‘read’-lengte wordt helemaal in het begin van het proces bepaald door de lengte van de fragmenten tot dewelke men het DNA verknipt. De ‘coverage’ is het aantal keer dat elke base van de volledige sequentie door een ‘read’ omvat wordt. Een ‘coverage’ van zestien keer bijvoorbeeld, betekent dat elke base van de sequentie door minimum zestien ‘reads’ overlapt/gecoverd wordt. Door de lengte van de ‘reads’ en de ‘coverage’ te laten variëren, kan men de sensitiviteit en specificiteit beïnvloeden. Dankzij deze NGS-technieken zal onze benadering van het genetisch onderzoek in de toekomst nog veranderen. Zo zal het binnen enkele jaren wellicht mogelijk zijn om voor de prijs van 1000 dollar een volledig genoom te sequeneren (‘Whole Genome Sequencing’ of WGS). Dit zal ons toelaten om genen en exonen in het grotere geheel van een individueel genoom te kunnen plaatsen en zal ons meer informatie verschaffen over de waarde van alteraties, bijvoorbeeld SNV’s, die zo teruggevonden worden en over hun invloed op het fenotype. Zover is het op heden nog niet, maar concreet is ‘Whole Exome Sequencing’ (WES) iets voor de meer nabije toekomst. Dit zal zelfs ook toepasbaar zijn op de detectie van causale genen van cardiomyopathieën. Momenteel maakt men voor de detectie van mutaties bij cardiomyopathieën gebruik van ‘targeted Sanger Sequencing’, waarbij slechts een selectie van genen gericht gesequeneerd wordt. [32] Meestal omvat deze selectie de meest frequente causale genen die onder de vorm van een ‘panel’ voor de specifieke ziekte, worden op de markt gebracht. De meeste commerciële ‘panels’ bestrijken zo slechts een deel van de causale genen en mutaties kunnen vaak gemist worden. Dankzij NGS technieken beschikt men nu over de mogelijkheid om panels uit te breiden met meer genen. Ook ‘Exome Sequencing’ biedt veel perspectieven. Dit alles vergroot zodoende de kans om meer causale mutaties terug te vinden. 3.4. Klinische relevantie van genetische diagnostiek en genetische counseling.

Cardiomyopathieën verlopen vaak lange tijd zonder symptomen en zijn daardoor een typisch latente aandoening. Wanneer deze aandoening lang genoeg bestaat, kan ze dan ook plots 16

fataal zijn. Daarom is het naar preventie van een dergelijke dodelijke afloop belangrijk om het risico te kunnen bepalen dat iemand heeft op het ontwikkelen van een cardiomyopathie. Uiteraard is screening van de gehele populatie niet kosteneffectief noch zinvol. Wel zinvol is het om de screening te verfijnen tot die mensen met gekende familiale anamnese van een hartaandoening, die kan congrueren met een erfelijke cardiomyopathie. Een typisch voorbeeld zijn families waar plotse cardiale dood bij één of meerdere verwanten voorkomt. Genetisch onderzoek kan dan de eventuele aanwezigheid van een mutatie blootleggen en zo bepalen welke andere familieleden at risk zijn. Na klinisch onderzoek is het mogelijk om voor deze patiënten dan een geschikte behandeling en opvolgingsplan op te stellen. De andere familieleden die geen verhoogd risico lopen kunnen worden gerustgesteld. Louter klinisch screenen van alle familieleden is eveneens niet erg efficiënt omdat ongeveer de helft van de familieleden waarschijnlijk nooit de cardiomyopathie zal ontwikkelen. Het is daarom meer praktisch om aan de hand van genetisch onderzoek eerst te bepalen wie wel ‘at risk’ is. Men kan zich dan klinisch meer ten gronde toeleggen op deze laatste groep. Bovendien zegt de aard van de mutatie en het getroffen gen soms al iets meer over de kenmerken en het verloop van de aandoening in die patiënten. Niet alleen puur medisch, maar ook op psychologisch vlak, biedt genetische screening voordelen. Na genetisch onderzoek weet de persoon in kwestie met relatieve zekerheid of het risico al dan niet bestaat om de ziekte te ontwikkelen. Dit brengt dan gemoedsrust voor zij die niet at risk zijn, maar evengoed voor de personen bij wie wel de mutatie werd vastgesteld. Immers, zij weten dan dat medische opvolging gegarandeerd is en dat men adequaat met therapie zal trachten tussen te komen wanneer nodig of zo mogelijk zelfs zal anticiperen. Tenslotte stelt genetisch onderzoek patiënten ook in staat om reproductieve keuzes te maken. Kortom: het hoofddoel van genetische screening is detectie van carriers en daarna risicostratificatie van deze patiënten. Deze risicoscore bepaalt dan mee de verdere opvolging en het klinisch handelen. Het geeft ook een idee over de prognose en kan meespelen in de keuze voor preventie, bijvoorbeeld typisch het al of niet kiezen voor implantatie van een ICD (‘implantable cardioverter defibrillator’) om plotse cardiale dood te voorkomen. [3] Naast de voordelen, moet er echter op gewezen worden dat genetische screening met enige omzichtigheid moet worden toegepast. De patiënten die in deze context zitten, zijn vaak heel kwetsbaar. Mogelijks hebben ze al enkele naaste familieleden verloren en vrezen ze om 17

hetzelfde eventueel te zullen meemaken. Daarenboven kunnen ze zich schuldig voelen omwille van het feit dat zij het causale gen hebben doorgegeven. Of net omgekeerd kunnen ze het zichzelf verwijten dat zij gespaard bleven, terwijl een familielid dat niet was. Daarom is het essentieel om de patiënten niet louter genetische informatie te geven, maar hen een veel ruimer pakket aan te bieden, met een uitgebreide psychologische ondersteuning. Dergelijke counseling biedt de patiënten op elk moment de mogelijkheid om te praten en helpt omtrent het maken van keuzes rond hun gezondheid.

4. Resultaten 4.1. Overzicht getroffen genen per ziektebeeld

Het onderstaande diagram geeft beknopt een overzicht van de belangrijkste subvormen van cardiomyopathieën met daarbij telkens per vorm de meest frequent gemuteerde genen. We zien hier dat het grootste aantal genen bij HCM en DCM terug te vinden is.

Figuur 11. Diagram meest frequent getroffen genen per ziektebeeld. [3]

18

4.1.1. HCM Op heden zijn reeds in meer dan 50 verschillende genen mutaties ontdekt die aan de basis van hypertrofe cardiomyopathie kunnen liggen. Veel van die genen zijn zo weinig aangedaan dat ze bijna specifiek zijn voor bepaalde families. Hierbinnen zijn het echter de volgende acht genen die het overgrote deel van de mutaties omvatten. Deze zijn: MYBPC, MYH7, TNNT2, TNNI3, ACTC, TPM1, MYL2 en MYL3. Zij coderen respectievelijk de volgende eiwitten in het sarcomeer: cardiaal myosinebindend proteine C, β-myosine heavy chain, cardiaal troponine T, cardiaal troponine I, cardiaal actine, α-tropomyosine, regulatoir myosine light chain en essentieel myosine light chain. [18] MYBPC mutaties komen voor in 15-50% van de families en MYH7 mutaties in 13-25% van de families.[18] De exacte cijfers verschillen naargelang de populatie, maar soms maken deze twee genen tot ongeveer 80% van de gevallen uit. [9] TNNT2 en TNNI3 zijn samen in 4-15% van de gevallen verantwoordelijk voor de ziekte. [18] Testen van de tien meest frequente genen resulteert in een postitieve ‘pick-up rate’ van 50-60 %. [8] De overerving van deze genen is over het algemeen autosomaal dominant, wat betekent dat nakomeling een kans van één op twee (dus 50%) hebben om drager te zijn van het gen. Naast en zelfs gecombineerd met overerving van een pathologische mutatie kunnen ook de novo mutaties ontstaan. De meeste cijfergegevens duiden aan dat in om en bij de 5% van de families meer dan één mutatie als oorzaak van de cardiomyopathie is vast te stellen. [8,9] Dit gaat dan gepaard met een ernstiger verloop en/of aanvang op jongere leeftijd. Ook zien we dat het aantal mutaties varieert binnen families. Bovendien is het zo dat een mutatie niet altijd effectief aanleiding geeft tot het ontwikkelen van het klinisch beeld, de zogenaamde partiële of onvolledige penetrantie van de causale mutaties. Dit gegeven, evenals de leeftijdsgebondenheid van het optreden van de ziekte, maakt dat het essentieel is en blijft om genetisch en klinisch onderzoek als aanvulling bij elkaar te blijven beschouwen. Indien met andere woorden, met behulp van genetische testing een mutatie wordt gevonden, zijn klinisch onderzoek en follow-up obligaat om vast te stellen of de cardiomyopathie al dan niet tot uiting komt en om de progressie ervan op te sporen.

19

Daarom is niet zozeer de genetische evidentie doorslaggevend in risicostratificatie voor bijvoorbeeld plotse cardiale dood of bij de verdere aanpak van de ziekte, dan wel de klinische gegevens. Met name de resultaten van het cardiologisch klinisch onderzoek, ECHO, ECG, Holter monitoring, inspanningstest en het anamnestisch verhaal, inclusief persoonlijke (bijvoorbeeld syncope) en familiale voorgeschiedenis, van de persoon in kwestie. [13] Onderstaande figuur toont de klinische en anamnestische factoren die mee het risico op plotse cardiale dood beïnvloeden. Deze factoren zijn immers onontbeerlijk bij het inschatten van dit risico. Men mag dus niet enkel voortgaan op het genetisch mutatiepatroon.

Figuur 12. Risicofactoren voor plotse cardiale dood. [3]

Uitsluiten van aanwezige mutaties geeft de patïënten echter wel een bijna 100% zekerheid om de ziekte niet te krijgen. Hierin ligt dan ook vooral het belang van de genetische screening. Het risico op cardiomyopathie is bij deze niet-carriers dan ook niet groter dan het risico in de algemene populatie. In sommige gevallen is de aard van de mutatie echter wel indicatief voor het klinisch verloop en daar wordt dan ook rekening mee gehouden naar follow-up toe en bij risicobepaling voor plotse cardiale dood. Bijvoorbeeld wordt algemeen genomen dat mutaties in MYBPC meestal pas aanleiding geven tot de klinische ziekte op latere (middelbare leeftijd) [17,18] terwijl bij MYH7 mutatiedragers de ziekte klinisch vroeger tot uiting komt. [4,17,18] 20

Andere studies hebben ook aangetoond dat bij subgroepen MYBPC mutatiecarriers toch een toegenomen percentage plotse cardiale dood kan aangetoond worden. De ziekteaanvang op latere leeftijd lijkt algemeen te zorgen voor een beter overleving, maar eenmaal klinisch tot uiting gekomen, zijn er toch een aantal cardiale complicaties gekend.[18] MYH7 mutaties zouden ook leiden tot meer ernstige hypertrofie en de aantasting van de globulaire kop van het βMHC eiwit zou gepaard gaan met een hoge penetrantiegraad. Verder worden heel specifieke mutaties (Arg403Gln en Arg453Cys) die het βMHC eiwit aantasten, geassocieerd met de hoogste aantallen plotse cardiale dood. Andere mutaties binnen hetzelfde eiwit, namelijk Val606Met mutaties, gaan dan typisch gepaard met een meer gematigd ziektebeeld. [4] Bij TNNT mutaties daarentegen ziet men vaker een mindere mate van hypertrofie en fibrose, maar toch meer plotse cardiale dood. [4,18] De TPM1 mutaties blijken dan weer een zeldzamere oorzaak van HCM. Desalniettemin ziet men bij bepaalde mutaties hierin opvallend meer ziekte in vergevorderde stadia. [4] Uit al het bovenstaande blijkt dat het niet eenvoudig is om gentoype-fenotype correlaties te maken. Dit samen met de grote range aan mogelijke presentatiebeelden, illustreert nogmaals de extreme heterogeniteit van de ziekte, zowel genotypisch als fenotypisch. Het is daarom waarschijnlijk dat er een rol weggelegd is voor epigenetische en milieu-afhankelijke beïnvloeding. [4] Verder vermoedt men tevens de invloed van nog niet volledig vastgelegde ‘modifier-genes’. [3,6] Deze pogingen tot risicostratificatie hebben ook een aantal mogelijke therapeutische implicaties. Bijvoorbeeld komen personen die meer “at risk” zijn voor plotse cardiale dood, in aanmerking komen voor de implantatie van een cardioverter-defibrillator( ‘ICD-device’ in de Engelstalige literatuur). Dit toestel heeft als voornaamste functie het opvangen en reconverteren van lethale ritmestoornissen die heel vaak de oorzaak van plotse cardiale dood zijn. Hoewel plotse cardiale dood niet zo’n frequente complicatie is van HCM- het zou voorkomen in 1-2% van de kinderen en adolescenten en in ongeveer 0.5-1% van de volwassen mutatiedragers [18]- is gezien de ernst ervan preventie waar mogelijk zeker aangewezen. Ook

21

worden patiënten geïnformeerd over hoe ze hun levensstijl kunnen aanpassen, bijvoorbeeld het vermijden van zware fysieke activiteiten. 4.1.1.1. Familiale casus met stamboom Hieronder wordt een casus gepresenteerd van een door HCM getroffen familie. [11] De casus schetst een situatie, waarbij een tweejarige jongen omwille van ontwikkelingsstoornissen klinisch werd onderzocht. Een zeer prominent cardiaal geruis was hierbij hoorbaar en op echo net als op ECG, vertoonde de jongen duidelijke tekenen van hypertrofie. Zodoende werd de diagnose van hypertrofe cardiomyopathie gesteld. Dit kwam niet geheel onverwacht, aangezien de moeder van het kind leed aan een symptomatische HCM. Bij verder onderzoek bleken de vader noch de andere zoon van tien jaar afwijkingen te vertonen. Beiden waren dus morfologisch niet aangetast en hadden ook geen klinische afwijkingen. De oudste zoon van dertien jaar was eveneens asymptomatisch, maar bij hem konden klinisch discrete hypertrofische afwijkingen worden vastgesteld.

Figuur 13. stamboom casus 4.1.1.1. [11]

1 Omdat jongste zoon een opvallend ernstiger klinisch beeld vertoonde dan de andere getroffen gezinsleden, werd een genetisch onderzoek uitgevoerd, gericht op het meest frequente HCM gen MYBPC3. De jongen vertoonde hierin twee pathogene mutaties. Bij verder onderzoek bleken deze beide mutaties ook bij de moeder aanwezig te zijn. De niet-aangetaste broer van tien jaar bleek ook drager te zijn van deze mutaties. De oudste broer, die wel reeds morfologisch lichte tekens van hypertrofie vertoonde, bleek geen drager van deze mutaties.

22

Dit alles deed de onderzoekers vermoeden dat er, bovenop de reeds gekende, nog één of meer mutaties aanwezig waren. Daarom incorporeerde men in de test nog twee andere belangrijke genen, TNNT2 en MYH7. Ook dit leverde echter geen verder resultaat op. Daarop werden nog dertien andere genen onderzocht en finaal vond men een ‘missense-mutatie’ in het PRKAG2 gen. Deze mutaties konden ook worden teruggevonden bij de aangetaste moeder en broer van dertien jaar. Als conclusie zien we dus dat er een ernstiger beeld optreedt bij combinatie van de beide MYBPC3 mutaties met de PRKAG2 mutatie en dat een variabel beeld toch nog steeds mogelijk is. Immers, de moeder en kind van twee jaar dragen beiden dezelfde mutaties, maar bij het jonge kind gaat dit gepaard met een veel ernstiger verloop. Vermoedelijk gaat het bij deze dragers om een klassieke HCM, gecombineerd met een glycogeenstapeling te wijten aan de PRKAG2 mutatie. Deze casus toont nogmaals de sterke heterogeniteit van HCM aan, zowel genetisch als klinisch. Bovendien is het een mooie illustratie van de nood om zoveel mogelijk genen bij het testen te includeren om zodoende de meest volledige analyse te bekomen. 4.1.2. DCM De algemene prevalentie van gedilateerde cardiomyopathieën wordt wereldwijd geraamd op 1 persoon per 2500. Van dit totaal aantal getroffen personen zou 20 à 35% [19,23,24] tot volgens andere bronnen zelfs wel 50% [6,21,22] familiaal zijn, dus op een genetische basis berustend. Meer dan bij HCM is DCM vaak één van de manifestatievormen van een syndroom. Dit betekent dat een groot deel van de patiënten niet zuiver de cardiomyopathie heeft, maar dat ze kadert

binnen het totaalbeeld van een genetische ziekte zoals bijvoorbeeld ziekte van

Steinert, Friedreich’s Ataxia, andere lidmaat dystrofieën, Emery-Dreifuss syndroom [3], stapelingsziekten… Een kleinere fractie van die 35% vormt dan de niet-syndromale, familiale DCM- gevallen. Naast de verworven en de familiale vormen (syndroomgebonden of niet) zijn er ook nog de idiopathische vormen van DCM. Deze laatste zijn klinisch vaak amper te onderscheiden van de niet-syndroomgebonden familiale vormen. [3] Het aantal genen dat bij DCM tot nog toe werd beschreven is iets lager dan wat voor HCM reeds gevonden werd, met name zou men volgens recente literatuur aan een veertigtal genen 23

komen.[3] Opnieuw met per gen talloze specifieke mutaties. De overervingsvorm is in ongeveer 90% procent van de gevallen autosomaal dominant en bij de overige 10 % vindt men zowel autosomaal recessieve als X-gebonden overervingsvormen.[22] Net zoals bij HCM, is het ook bij DCM zo dat de individuele mutaties typerend zijn voor specifieke families [33] en dat meerdere mutaties in een familie kunnen voorkomen. Dergelijke ‘private’ mutaties zouden zelfs nog vaker voorkomen bij DCM dan bij HCM. Bovendien vindt men ook bij DCM soms meerdere mutaties per familie. Men heeft gaandeweg ook ontdekt dat er, wat genetische oorzaken betreft, een zekere mate van overlap bestaat tussen de verschillende cardiomyopathievormen. Voor HCM en DCM in concreto, vindt men een link bij de sarcomeerproteïnen. Mutaties in genen zoals MYH7, de troponines T,I en C, werden immers ook bij gedilateerde cardiomyopathie als causaal bevonden. [3] De manier waarop de mutaties het functioneren van de proteïnen beïnvloeden, kan beduidend verschillen tussen HCM en DCM. De functie van de gemuteerde proteïnen zal dikwijls tegenovergesteld zijn [6]. Naast genen die coderen voor elementen van het sarcomeer, zijn ook diverse andere genen aangetast. Onder meer gaat het hier over genen voor: kernproteïnen, elementen van de Zschijf en het constameer, gen transcriptie en splicing elementen, elementen betrokken bij de regeling van het calciummetabolisme [6] en van het cytoskelet en het desmosoom. [3,33] De desbetreffende

cytoskeletale

proteïnen

zijn:

desmine,

δ-sarcoglycaan,

dystrophine,

desmoplakine en metavinculine. Tot de elementen van de Z-schijf behoren onder meer musculair LIM-proteïne, α-actinine-2 en Cypher/ZASP. De proteïnen van de kernenvelop zijn voornamelijk de laminines. Ook proteïnen die instaan voor de ionenconductie zijn betrokken

bij

DCM,

zoals

bijvoorbeeld

Natriumkanalen. [19]

24

phospholamban,

SUR2A

en

sommige

In onderstaande tabellen staat een uitgebreid overzicht van de verschillende genen betrokken bij DCM en de aard van het proteïne waarvoor ze coderen.

Tabel 1. Ontologie van de genen betrokken bij DCM. [33]

25

26

Tabel 2. Overzicht genen gerelateerd aan DCM. In deze tabel staat zowel de naam en symbool van elk gen, de MIM code , gerelateerde fenotypes (cardiaal en niet-cardiaal) en de functie binnen de cel (ontologie). DCM, gedilateerde cardiomyopathie; HCM, hypertrofe cardiomyopathie; RCM, restrictieve cardiomyopathie; ARVC, aritmogene rechter ventrikel cardiomyopathie; LVNC, linker ventrikel noncompactie; ASD, atriaal septumdefect; AF, atriumfibrilleren; SSS, sick sinus syndrome; VF, ventrikelfibrilleren. Extracardiale fenotypes: ziekte van Charcot-Marie-Tooth, type2B1; Emery-Dreifuss musculaire dystrofie, autosomaal dominant; Emery-Dreifuss musculaire dystrofie, autosomaal recessief; Hart-hand syndroom, Sloveens type; Hutchinson-Gilford progeria; Familale partiële lipodystrofie; Malouf syndroom; Mandibulo-acrale dysplasie; Musculaire dystrofie, congenitaal; lidmaat-gordel musculaire dystrofie type 1B; lethale restrictieve dermopathie. [22]

De manier waarop DCM zich manifesteert is in zekere mate gelijkaardig aan het scenario bij HCM. In die zin, dat plotse cardiale dood bij jonge personen eveneens voorkomt. De histologische afwijkingen zijn wel verschillend van die bij HCM, met name gaat het hier om afsterven van myocyten met fibrotische omvorming en de daaruit volgende dilatatie van het ventrikel. Voornamelijk deze fibrosering geeft op zich zeer frequent aanleiding tot ritme- en 27

geleidingsstoornissen met mogelijks fatale afloop (plotse cardiale dood). Een dermate gedilateerd hart als bij DCM noopt vaak tot transplantatie. Dit is dan ook een optie, maar vereist uiteraard wel dat de ziekte in eerste instantie adequaat gedetecteerd wordt. Het bepalen van een correlatie tussen genotype en fenotype is ook bij gedilateerde cardiomyopathie niet evident. Net zoals bij HCM zijn er wel enkele extrapolaties/assumpties die kunnen gemaakt worden en die zo kunnen bijdragen tot de opvolging en therapeutische strategie. Hieronder volgen enkele voorbeelden. De LMNA genen, die coderen voor de laminine A en C proteïnen van de kernenvelop [6], zouden vaker gepaard gaan met conductiepathologie. DCM in combinatie met mutaties in de sarcomeer genen zou gepaard gaan met ziektebegin op jongere leeftijd en uitgesproken aritmieën. [3] Patiënten die mutaties dragen in de desmosomale genen, lijken eveneens meer getroffen te worden door ventriculaire aritmieën, wat op zich dan weer de link legt met A(R)VC. Bij deze laatste waren gemuteerde desmosomale genen oorspronkelijk de meest gekende oorzaak. [3] Plotse cardiale dood komt meer frequent voor bij de LMNA mutaties en desmosomale mutaties, ondanks de meestal eerder milde klinisch meetbare dilatatie. [3] Plotse cardiale dood lijkt daarentegen minder frequent bij DCM op basis van de meeste sarcomeer mutaties en alle cytoskeletale mutaties. [3] Dit heeft opnieuw implicaties op de beslissing omtrent preventieve implantatie van een cardioverter/defibrillator (ICD-toestel). De frequenties van aantasting van de verschillende genen zijn over het algemeen vrij laag, bijvoorbeeld: LMNA 6%, MYH7 4%, MYBPC3 4%, TNNT2 3%, MYH6 3% en SCN5A 3%. Hierbij vormen de truncerende Titine-mutaties een uitschieter met frequenties van 25%, telkens voor de familiale DCM’s. [33] Bovendien heeft men gevonden dat de peripartum cardiomyopathie een specifiek subtype van de gedilateerde cardiomyopathieën zou zijn. Deze vorm komt voor bij sommige vrouwen in het derde trimester van de zwangerschap of de eerste vijf tot zes maanden postpartum. [2] Verder is het typerend voor DCM dat er ondanks het enorm diverse gamma aan getroffen proteïnen en celelementen, toch steeds afgestevend wordt op eenzelfde pahologisch beeld, namelijk een gedilateerd hart. Dit doet vermoeden dat er op een bepaald niveau toch een ‘common pathway’ moet zijn om uiteindelijk bij een gedilateerde cardiomyopathie terecht te komen. [34] Men neemt ook hier aan dat epigenetische modellering evenals beïnvloeding 28

vanuit het milieu een cruciale rol spelen bij het uiteindelijke fenotype dat ontstaat. Dit zou mogelijks een verklaring kunnen zijn voor de heterogeniteit. De exacte rol van de epigenetica zal de komende jaren ongetwijfeld nog verder uitgediept worden. 4.2. Genetische testing van cardiomyopathieën voor het NGS tijdperk. 4.2.1. Sanger-gebaseerde genetische testing Op het moment dat de NGS technieken tot ontwikkeling kwamen, was de (geautomatiseerde) Sanger-methode nog steeds de gouden standaard. Researchers en clinici waren echter reeds tot het besef gekomen dat de nadelen van de Sanger-techniek praktische problemen begonnen te stellen en dat de techniek geoptimaliseerd moest worden om te kunnen blijven voldoen aan de heersende noden en vragen. De grootste beperkingen van de ‘Chain termination method’ waren enerzijds de beperkte ‘throughput’ en anderzijds de grote arbeids- en tijdsintensiviteit. Sinds zijn ontstaan werd de Sanger-techniek uiteraard meerdere malen aangepast en verder verfijnd naargelang dat de technische evoluties dit konden ondersteunen. Voorbeelden zijn het gebruik van capillaire electroforese met steeds dunnere agarosegels, volledige automatisering van het proces, het gebruik van micro-arrays. Deze laatste adaptatie liet het toch in zekere mate toe om parallel te werken. 4.2.1.1. Niet-gerichte Sanger sequenering. Dat het met de Sanger methode mogelijk was om een volledig genoom te sequeneren, werd aangetoond met het ‘Human Genome Project’ dat in 2001 werd voltrokken. Dit proces duurde echter elf jaar en het mocht duidelijk zijn dat het screenen van volledige genomen geen werkbare manier was om pathogene mutaties op te sporen, bijvoorbeeld in het kader van de cardiomyopathieën. Dit is het tot op heden trouwens nog steeds niet. Het gebruik van de Sanger methode leent zich er diagnostisch dus niet toe om met nietgerichte samples te werken. Dit werd dan ook niet veel gedaan. Telkens was er een zekere vorm van voorselectie van het te testen materiaal. Men concentreerde zich dus steeds specifiek op bepaalde regio’s waar vermoedelijk een defect lag.

29

4.2.1.2. Gerichte Sanger sequenering Het gericht screenen van een aantal genen aan de hand van Sanger is, zoals reeds gezegd, wel een werkbare piste. Hierbij worden de genen of genfamilies, die meest frequent een oorzakelijke mutatie bevatten, gesequeneerd. Door de bekomen sequentie te vergelijken met referentiegegevens van een gezonde controle persoon, konden mutaties worden vastgesteld. Men gaat dus ‘targeted sequencing’ doen, maar het sequeneren gebeurt nog steeds aan de hand van Sanger. 4.2.1.3. Toepassing van gerichte sequenering voor de cardiomyopathieën Concreet voor de cardiomyopathieën bood deze manier van werken geen afdoende resultaat. Aangezien bleek dat de ziekte genetisch bijzonder heterogeen is, vond men bij vele families geen mutaties in de genen, waarvoor men met het beperkte panel testte. Uitbreiding van de testpanels met meerdere genen was hiervoor slechts gedeeltelijk een oplossing. Immers hoe groter de panels, hoe duurder en intensiever de screening werd. Bovendien zijn er binnen één gen tientallen tot honderden mutaties mogelijk en tot op heden is men er nog niet volledig in geslaagd om deze alle te identificeren. Vele mutaties, gelegen in genen waarvoor men screende, werden dus nog niet als pathogeen herkend. Dit komt omdat pathogene mutaties vaak uniek zijn voor één bepaalde familie. Tevens zijn de cardiomyopathieën multigene aandoeningen, waarbij het vinden van één mutatie nog niet voldoende bewijs is van pathogeniciteit. Een tweede of derde bijkomende mutatie kan ofwel eveneens zuiver pathogeen zijn ofwel een ziektemodifiërende invloed hebben. Zij kunnen bovendien anders segregeren in stamboomonderzoek, wat het bepalen of familieleden at risk zijn, mede bemoeilijkt. Men mag dus, om kosten te drukken, in principe nooit stoppen met sequeneren wanneer in één gen een mutatie wordt aangetroffen, maar idealiter zouden alle gekende genen moeten gescreend worden. Dit kostenplaatje is nu net het hekele punt van de Sanger-methode. Een ander nadeel van het testen met genenpanels is dat er telkens meer genen ontdekt worden, die vervolgens in de latere panels worden opgenomen. Hierdoor is het aan te raden om patiënten die vroeger reeds de test met een bepaald panel ondergingen, opnieuw te laten screenen met de geüpdate panels.

30

Daarenboven is het zo dat mutaties zich ook in de intronen van ons genoom kunnen situeren. Dergelijke intronische mutaties worden met panels niet echt geëxploreerd, waardoor zo het probleem bij bepaalde patiënten verborgen kan blijven. Ook grotere inserties of deleties kunnen met Sanger gemist worden. Deze kunnen dan een frameshift veroorzaken en zodoende ervoor zorgen dat een genetisch correcte sequentie toch verkeerd gelezen en getransscribeerd wordt. Dergelijke frameshiftmutaties kunnen de basis van de cardiomyopathie zijn. Copy number variants kunnen met panels eveneens niet worden gescreend. Specifiek voor HCM, bestaan er panels, die de tot nu toe meer dan 50 gekende genen omvatten. Het screenen ervan met de Sanger-techniek is hierbij reeds een zeer langdurig en duur proces. Het resultaat laat meestal enkele maanden op zich wachten. De kostprijs bedraagt verschillende duizenden euro’s. Om de kosten vooralsnog te drukken, wordt in de meeste centra veel aandacht geschonken aan stamboomonderzoek. Hierbij inventariseert men de bewezen cardiomyopathielijders en de mogelijke dragers van de mutatie. De genetische testing wordt dan meestal uitgevoerd voor de patiënt met het meest ernstige fenotype (de ‘proband’). De mutaties die men bij deze persoon aantreft, worden nadien ook opgezocht bij de overige familieleden. Indien bij een familielid geen van de gevonden mutaties wordt opgepikt, zal men ook die patiënt testen met het uitgebreide panel, om vooralsnog bijkomende causale mutaties op te sporen. Het voordeel van de Sanger-techniek bestaat erin dat het principe reeds vele jaren gekend is en dus overal courant in labo’s en genetische centra geïntegreerd is. Sanger heeft ook een betrekkelijk kleine foutenmarge op de gesequeneerde basen, dus er is een hoge sensitiviteit en specificiteit. Het is efficiënt wanneer de “region of interest” reeds vernauwd is tot een beperkt gebied. Daarom wordt het nog steeds vaak als controlemechanisme gebruikt voor met behulp van NGS gesequeneerde mutaties. Bijvoorbeeld Obler et al. en Parks et al. maakten nog gebruik van Sanger based technieken voor hun onderzoek.

31

Voorbeeld casus 1: Obler et al. gebruikten de ‘ABI prism sequencer’ voor het opsporen en detecteren van een dystrophyne mutatie bij een familie met presentatie van DCM op kinderleeftijd. De onderzoekers pasten hier de klassiek gebruikte strategie toe. Men start met het algemeen nakijken op deleties, duplicaties of mutaties vertrekkende van een perifeer bloedstaal. PCR amplificatie van de ‘region of interest’, hier het Duchenne/Becker musculair dystrofie gen, dat 79 exonen omvat, alles samen goed voor 11370 baseparen. Men onderzocht tevens tien basen in bepaalde intronen ter hoogte van splice juncties. Dit alles gebeurde via geautomatiseerde uniderectionele

DNA sequencing met controle van alle afwijkende varianten door

bidirectionele sequencing. Eenmaal potentiële mutaties gevonden, werd bloed van de andere familieleden hierop ook onderzocht via bidirectionele sequenering met de ‘ABI prism sequencer’. Analyse van de data gebeurde via de ‘Sequencher sequence analysis software’. De gevonden mutaties segregeerden als zoals in onderstaande figuur wordt weergegeven. [35]

Figuur 14. Co-segregatie van de gevonden mutatie in een familie met vier getroffen individuen. [35]

32

Voorbeeld casus 2:

In 2010 gebruikten Parks et al. voor een cohortestudie van 324 niet-verwante patiënten met idiopathische DCM, eveneens een Sanger-gebaseerde methode om de LMNA genen te onderzoeken op mutaties die de cardiomyopathie konden veroorzaken. Bovendien zochten zij naar een familiale link, dus het aantal patiënten met idiopathische DCM, die eigenlijk een familiale basis vertoonden. Om het genonderzoek te doen werd vertrokken van genomisch DNA uit vol bloed van de testpersonen en voor één overleden patiënt werd weefsel gepreleveerd uit geparaffineerd longweefsel. Elk exon, alsook enkele intronische nucleotiden van de LMNA genen werden met behulp van PCR geamplificeerd en vervolgens bidirectioneel gesequeneerd met een ‘BigDye v3.1’ toestel en na afloop geanalyseerd met capillaire electroforese via een ‘ABI 3100’ systeem. De gebruikte analytische software was het ‘Sequencher software pakket’. Varianten werden als potentieel pathogeen aanzien indien de mutatie effectief een aminozuurverandering teweegbracht en ze bovendien niet kon teruggevonden worden bij de controle populatie van 150 onverwante personen en niet als benigne polymorfisme vermeld werd in eerder gepubliceerde literatuur met betrekking tot de LMNA genen. Familieleden van de gedetecteerde mutatiedragers werden vervolgens eveneens getest voor de specifieke mutatie. Hierbij werd enkel het desbetreffende exon bidirectioneel gesequeneerd. Familieleden die klinisch DCM hadden, maar negatief testten voor de mutatie werden confer supra ook uitgebreider getest voor LMNA om bijkomende mutaties op te sporen. Alle mutaties die aanleiding gaven tot indels, splicing alteraties of onvolledige segregatie werden bevestigd via alternatieve moleculaire technieken. De zes verwanten die onvolledige segregatie van de familiale mutatie toonden, werden verder onderzocht. Meer bepaald werden bij hen alle exonen van zes andere genen en hun flankerende intronische regio’s getest om zo de causale mutaties te detecteren. [36]

Uit beide bovenstaande voorbeelden mag blijken dat het proces om tot de pathogene mutaties te komen langdurig en eerder inefficiënt is. Zeker wanneer het gaat om grotere groepen patiënten, wordt de procedure erg tijdrovend en verschaft ze niet steeds een eenduidig resultaat. Zelfs niet na opname en analyse van enkele andere genen dan deze die men origineel voor ogen had. ‘NGS’-technieken en bij uitbreiding ook ‘Whole Exome Sequencing’ vormen hier een interessant alternatief.

33

4.2.2. Andere technieken Naast het effectief sequeneren van genen kunnen ook een aantal andere technieken aangewend worden om genetische informatie te bekomen. Deze kunnen gecombineerd gebruikt worden met Sanger, maar sommige staan ook op zichzelf. Door ‘linkage analysis’ bijvoorbeeld, kan worden nagegaan welke gen “gelinkt” is met het fentoype. Dit betekent dat de relatieve nabijheid van de genen ten opzichte de ziektelocus wordt bepaald en dit zegt iets meer over de kans dat een bepaald gen verantwoordelijk kan zijn voor het fenotype. Men kan zo dus nagaan welke genen in de buurt liggen van de gekende pathogene spot in het DNA. Deze genen gaat men dan onderzoeken, met het oog op identificatie van het verantwoordelijke gen. 4.3. Aanpak van genetische testing mits gebruik van NGS technieken

NGS

ofwel

‘Massively

Parallel

Sequencing’

is

de

verzamelnaam

voor

alle

sequeneringstechnieken die volgden op de Sanger-gebaseerde technieken om de tijdsduur en kost van deze laatste te drukken. Het gaat erom dat grote hoeveelheden DNA in parallel kunnen gesequeneerd worden. Vrij snel kwam er na deze tweede generatie ook een derde generatie technieken, de zogenaamde ‘Next Next Generation’. Zoals in de inleiding reeds uitvoerig beschreven werd, verschillen deze technieken qua aanpak fundamenteel van het principe dat bij Sanger wordt gebruikt. Immers, waar Sanger gestoeld is op de ‘chain termination’-methode, wordt bij NGS gebruikt gemaakt van nieuwere technieken zoals ‘cyclic reversible chain termination’, ‘sequencing by ligation’ en ‘single nucleotide addition: pyrosequencing’. Hieronder bekijken we nu meer in detail de eigenschappen en toepassing van dergelijke sequeneringstechnologieën voor diagnnostiek van cardiomyopathieën. 4.3.1. Voor-en Nadelen van NGS De belangrijkste voordelen van NGS zijn de enorme ‘throughput’ van gegevens en dit tegen een lage prijs. Deze ‘throughput’ maakt het mogelijk dat binnen het bestek van enkele uren tot dagen een volledig genoom kan worden gesequeneerd.

34

Dit biedt perspectieven naar de diagnostiek toe. Men zou hiermee immers op efficiënte wijze het volledige exoom kunnen screenen, in plaats van enkel losse genen. Dit kan meer inzicht geven in de pathogenetische mechanismen van ziekten. ‘Copy number variants’ kunnen eveneens via deze weg worden opgespoord. Verder kan NGS ook gebruikt worden voor het werken met transcriptomen en onderzoek naar epigenetica. Dankzij de groter wordende kennis van genetica, epigenetica en moleculaire biologie, wordt het ook mogelijk om eventueel therapeutische aanknopingspunten te vinden. Nadelen van de NGS, zijn onlosmakelijk verbonden aan een van zijn grootste voordelen. Zo zal deze enorme bron van informatie immers onze kennis vergroten, maar tegelijk ook meer vragen oproepen. Het screenen van volledige exomen zal bijvoorbeeld aanleiding geven tot toegenomen detectie van genetische varianten. De vraag zal zijn hoe men met die informatie moet omgaan. Hoe moeten de zogeheten ‘VUS’ (= ‘variants of unknown significance’), worden geïnterpreteerd: als pathologisch of eerder van banaal belang? [6] Naast detectie van ‘VUS’, zal men bij WES dan eveneens beschikken over de sequentie van talloze andere genen met een klinisch belang. Voorbeelden zijn genen voor borst-of darmkanker. Indirect kan men dus performante informatie bekomen over heel andere ziekten dan die waarvoor men initieel wilde genetische oorzaken opsporen. Daarenboven stelt deze grote hoeveelheid aan informatie belangrijke uitdagingen voor bioinformatica, namelijk in het vinden van computerprogramma’s die al deze info kunnen opslaan en efficiënt kunnen analyseren. Het gaat hier immers om enorme datasets, die toch moeten blijven functioneel zijn. 4.3.2. Gerichte sequenering, WES en WGS Whole genome sequencing tegen een prijs van 1000 dollar is voorlopig nog eerder verre toekomstmuziek, doch whole exomen sequencing (WES), is iets wat in de zeer nabije toekomst werkelijkheid zal worden. Experimenteel wordt WES al toegepast in de diagnostiek, maar helemaal op punt staat het nog niet. Wat wel al vrij goed in vele laboratoria en genetische centra is ingeburgerd is de ‘targeted sequencing’ met behulp van NGS. Hierbij gaat men zich specifiek richten op een aantal genregio’s, waarin vermoedelijk de mutatie zal gesitueerd zijn. Daartoe maakt men eveneens gebruik van ‘panels’, die de gewenste ‘regions of interest’ omvatten. Dit gericht sequeneren 35

drukt nog verder de prijs en is toch superieur boven het gebruik van Sanger voor dezelfde regio’s omdat het sneller gaat en goedkoper is. Men hoeft de ‘panels’ ook niet meer te beperken, maar men kan zoveel genen includeren als dat er gekend zijn. In het bijzonder voor de cardiomyopathieën betekent de komst van NGS absoluut een vooruitgang. Hierdoor kan het grote, steeds groeiend aantal gekende pathologische genen, worden gescreend tegen een tijd en prijs die haalbaar zijn voor een diagnostische genetische test. In plaats van een aantal genen te moeten selecteren en hiervoor te testen, met veel kans dat dit geen of althans geen volledig resultaat oplevert, kan men nu de volledige ‘work-up’ doen met dezelfde of zelfs lagere kostenbelasting. Van DCM weten we bijvoorbeeld dat ze typisch familaal en idopathisch kan voorkomen, maar dat het soms heel moeilijk is om beide van elkaar te differentiëren. Clinici stellen zich dus dikwijls de vraag of een patiënt met DCM nu een geïsoleerd “idiopathisch” geval is of als het toch eerder om een familiale variant zou gaan, waarbij de patiënt in kwestie voorlopige de enige is met een duidelijke manifestatie. In zo’n onzeker geval, komt het duur uit om alle familieleden met Sanger te testen. Met NGS is de totaalkost lager en kan men zich dit wel veroorloven. Bovendien weet men snel het resultaat. In de door Fatkin et al. in 2011 gereviewde ‘guidelines’ voor diagnose van familiale DCM, benadrukt men de rol van deze nieuwe ‘high throughput’ technieken bij de detectie van genetische oorzaken van familale DCM. Toch blijft men eerder omzichtig met het absolute belang van dergelijke gevonden genen bij de diagnostiek. Dit omdat een gevonden variant niet per se pathologisch is en omdat het wenselijk is de variant ook in andere aangetaste familieleden terug te vinden, want dit vergroot de kans op pathogeniciteit. [21] Men geeft in dit artikel weer dat de test slechts voor 30% van de onderzochte families relevante informatie weergeeft waar men bovendien klinisch iets aan heeft. De opbrengst van genetische testing kan volgens de auteurs groter zijn in meer specifieke subpopulaties patiënten, waarbij men mutaties kan linken aan een eenduidiger klinisch beeld. Bijvoorbeeld de LMNA mutatie groepen. Maar sowieso zien zij de NGS technieken als de meest werkbare tool mocht men tot diagnostiek overgaan.[21]

36

4.4.Optimalisatie van de NGS technieken specifiek voor HCM en DCM

Zoals reeds aangegeven is het principe van de ‘Next Genertation Sequencing’ technieken revolutionair, maar in de praktijk moet nog verder onderzocht worden welke de ideale parameters zijn om de resultaten te optimaliseren. De voornaamste parameters zijn de ‘read’ lengte en de vereiste ‘coverage’. Bovendien moet de vergelijking met Sanger worden gemaakt om de juistheid van de bekomen genetische info te controleren. Voorbeeld studie 1: Mook et al. deden in 2013 een studie naar de implementatie van ‘NGS’ in de diagnostiek, voor detectie van HCM en DCM. De vergelijking wordt gemaakt ten opzichte van ‘array based-Sanger sequencing’. De onderzoekers concludeerden dat het gebruik van ‘array based capturing’, gevolgd door NGS sequenering in een diagnostische setting haalbaar is bij HCM en DCM. Bovendien toonden ze aan hoe de ‘array based- NGS’ kon geoptimaliseerd worden tot een minstens even sensitieve test als de huidige standaard Sanger technieken en dat ‘multiplexing’ een belangrijke besparende factor in het proces is. Ze durven echter geen volledige extrapolatie van de haalbaarheid maken naar ‘Whole Exome Sequencing’ of toch zeker niet voor ziekten met een beperkt aantal oorzakelijke genen. De grootste problemen zijn hierbij volgens hen: relatief hoge kosten, variabele diepte van exon ‘coverage’, de uitgebreidheid van data-analyse en -opslag. Daarentegen zou ‘sequence capture based target enrichment’ voor een beperkt aantal genen gecombineerd met NGS logistiek en financieel wel haalbaar kunnen zijn. Ze benadrukken nogmaals de vrij grote variatie in exon ‘coverage’ (afhankelijk van het design) en de daaruit volgende lagere betrouwbaarheid van bepaalde varianten. Een gebalanceerde representatie van alle getargette exonen zou de gemiddelde ‘coverage’, vereist om met grote betrouwbaarheid varianten te kunnen detecteren, kunnen verminderen en zo de ‘false negative rate’ kunnen doen dalen. De bases die een lage ‘coverage’ tonen, situeren zich in GC-rijke gebieden, wat eerder door collega’s reeds als een probleem bij detectie werd weergegeven.

37

Ook bij de groep met negen HCM patiënten werden twee varianten niet teruggevonden met de GS-FLX Titanium. Het ging hier in beide gevallen om ‘single nucleotide’ inserties in regio’s met meerder homopolymeer ‘stretches’. Ook dit was in de literatuur reeds als een gekende valkuil beschreven. In deze studie werden deze regio’s dan opgevangen door ze met Sanger te analyseren. Echter, naast de twee gemiste varianten in deze patiëntengroep, werden een aantal nieuwe bijkomende varianten ontdekt, die Sanger nog niet aan het licht had kunnen brengen, waarvan er twee waarschijnlijk van klinisch belang zijn. Ook bij de DCM groep, kwamen nieuwe varianten aan het licht. Bij de evaluatie van 30 indexpatiënten werden zeventien varianten gevonden, waarvan elf in zich bevonden in genen die met Sanger gewoonlijk worden gescreend en nog eens zes varianten werden gevonden in genen die extra gescreend werden via de ‘GS-FLX’. Dit toont aan dat de klinische sensitiviteit kan worden vergroot door includeren van meer genen. Bovendien konden de onderzoekers direct de sensitiviteit van Sanger (99.4%) en van NGS ( 99.7%) met elkaar vergelijken, wat hen deed besluiten dat de ‘GS-FLX Titanium’ in een diagnostische setting Sanger sequenering kan vervangen. [37] Voorbeeld studie 2: Campbell et al. rapporteren het gebruik van WES voor identificatie van een pathogene nucleotide variant in een familie met multigenerationele DCM met aanvang op volwassen leeftijd. Ze gebruikten hierbij bio-informatische filtering van de gevonden varianten gecombineerd met testing voor ‘shared variants’ bij ver verwante familieleden om het aantal mogelijke causale mutaties te vernauwen. Zo vonden ze een single rare variant in TNNT2 die segregeerde met de DCM fenotypes bij alle aangetaste personen. Het DNA werd vrijgemaakt uit vol bloed van de proefpersonen volgens de standaard procedure. Dit bekomen DNA onderging achtereenvolgens: ‘shearing’, lengte selectie, ligatie aan sequencing adapters en PCR amplificatie voor target enrichment voor sequencing volgens de ‘Illumina TruSeq library preparation’. Deze post-PCR ‘library’ werd vervolgens onderworpen aan het ‘Agilent SureSelect 50Mb Exome Capture kit’ voor ‘exome capturing’. Daarna volgde sequencing met het ‘Illumina HiSeq 2000’ toestel. Een gemiddelde coverage van 100X werd nagestreefd. Met de ‘Illumina chastity filter’ werden de ‘reads’ naar kwaliteit gefilterd. Via het programma ANNOVAR,

werden

varianten

geclassificeerd, 38

waarbij

enkel

de

niet-synonieme

veranderingen, varianten die kunnen leiden tot een veranderde splice site en/of varianten die aanleiding geven tot een vervroegd stop codon, werden weerhouden voor verdere analyse. Bij de niet-synonieme veranderingen werden de indels allemaal als mogelijks causaal beschouwd, terwijl voor de SNP’s afgetoetst werd of ze aanleiding gaven tot verandering in de proteïnestructuur die al dan niet getolereerd wordt. Dit gebeurde via vier verschillende algoritmen: SIFT, Poly-Phen-2, LRT, Mutation Taster. De aldus bekomen finale lijst met varianten voor elk familielid, werd dan vergelijken met lijsten van andere familieleden om gemeenschappelijke mutaties te zoeken. Alle vermeende mutaties werden met Sanger gecontroleerd. Drie personen van familie AD-FDC1 en zes familieleden of AD-FDC27 ondergingen exome sequencing en bio-informatica filtering. In familie AD-FDC1 sequencing leverde een gemiddelde coverage van 40 X, 40 X en 44 X per base voor het hele exoom voor de respectievelijke stalen IV:4, IV:7, IV:14. Concreet voor familie AD-FDC1 werden exome sequencing en bio-informatica filtering gedaan, rekening houdend met de familiale segregatie van de mutaties. Dit leverde een lijst op met potentieel verantwoordelijke mutaties. Het bio-informatica filtersysteem lette vooral op zeldzame ‘missense’-, ‘nonsense’- en ‘splicing’-mutaties die het verwachte eiwitproduct zouden kunnen altereren. Initieel werden enkel twee familieleden onderzocht, namelijk IV:7 en IV:14, die 23 varianten gemeenschappelijk hadden van een gemiddelde van 136 voorspelde potentieel causale varianten. Door toevoegen van een derde familielid werd dit aantal gemeenschappelijke varianten teruggebracht van een gemiddeld 21 varianten per twee gerelateerde patiënten, naar acht. Voor deze resterende acht gemeenschappelijke varianten werd vervolgens Sanger uitgevoerd, waarbij twee varianten niet konden worden geconfirmeerd. Dit bracht het totaal op zes resterende varianten. Deze zes werden dan via stamboomonderzoek verder nagetrokken bij alle beschikbare aangetaste familieleden. Hierbij bleek dat slechts één variant segregeerde zoals het moest bij alle getroffen familieleden. Twaalf personen in totaal, onder wie zelfs enkele vierde graads verwanten, droegen deze mutatie, wat het pathogeen karakter van de mutatie sterk deed vermoeden. Bij onderzoek naar de gevonden mutatie bij een groep van 68 andere niet-verwante families, bleek nog één grote Italiaanse familie, AD-FDC27, deze variant te hebben, met bovendien in die familie ook co-segregatie. Aangezien in die familie geen andere causale mutatie kon

39

worden aangetoond, versterkte dit het vermoeden dat de gevonden variant wel degelijk pathogeen was en niet een benigne zeldzame variant. Om na te gaan of beide Italiaanse families toevallig verwant waren met elkaar, werd typering van de nabijgelegen ‘SNP’s’ gedaan om alzo het haplotype te kunnen vergelijken. Met toepassing van het ‘HapMap’ programma bleken de haplotypes in familie AD-FDC1 en ADFDC27 niet hetzelfde te zijn. Dit ontkracht de theorie dat beide families verwant zijn en dat er dus mogelijks zou sprake zijn van een founder-effect. [23] 4.5. Ethische beschouwingen 4.5.1. Algemeen Algemeen genomen, kan men enkele ethische kanttekeningen maken, zowel bij het toepassen van NGS technieken voor diagnostische doeleinden als bij het nalaten ervan. Enerzijds is het zo dat het niet toepassen van NGS, betekent dat patiënten minder uitgebreid getest zullen kunnen worden, wat de kans vergroot dat men voor de ziekte geen oorzaak kan aanduiden. Dit bemoeilijkt het tijdig opsporen van familieleden die potentieel ‘at risk’ zijn om eveneens de cardiomyopathie te ontwikkelen. Zo kan er voor die personen evenmin gericht preventief worden gehandeld. Dit is niet onbelangrijk aangezien het gaat over een ziekte die in de meerderheid van de gevallen heel snel en plots ernstige morbiditeit en mortaliteit kan veroorzaken. Het niet vinden van de genetische oorzaak heeft ook zijn implicaties op geboorteplanning. [5] Men kan dan immers niet identificeren of één van de ouders al dan niet het gen draagt en de ziekte dus kan doorgeven. Bovendien zou, bij keuze om toch zwanger te worden, eventueel ook kunnen worden geopteerd voor prenatale testing.

Hierbij kan men echter ook het

omgekeerde bedenken, namelijk dat testing aanleiding geeft tot genetische selectie. Deze overwegingen zijn veel meer ad rem bij NGS, aangezien de kans dat een causaal gen gevonden wordt simpelweg vele keren groter is dan bij Sanger. Dit veronderstelt dat men dus voor een veel groter aantal patiënten deze ethische overwegingen zal moeten maken. Geboorteplanning is bij heterogene ziekten zoals de cardiomyopathieën sowieso in geen geval eenvoudig. Dit is onder andere te wijten aan de onvolledige en/of leeftijdsgebonden penetrantie van de ziekten. Het uitgebreid testen met NGS en daaruitvolgend de grotere kans op detectie van een mutatie, is op zich niet voldoende om dergelijke beslissingen te nemen met betrekking tot geboorteplanning. Men blijft zo dus steeds achter met een vorm van 40

onzekerheid hieromtrent. Dergelijke beslissingen zijn bovendien hoogst individueel per koppel te maken. Verder onderzoek zal onze kennis omtrent penetrantie nog moeten vergroten om hier in de toekomst eventueel verdere hulp te kunnen bieden. In dit opzicht is het gebruik van NGS zeker aangewezen, omdat ze het uitbreiden van onze genetische kennis zullen ten goede komen. 4.5.2. Psychologische belasting Het uitgebreid kunnen opsporen van mutaties aan de hand van NGS, zorgt ervoor dat een groot aantal mutatiedragers nu zal kunnen worden geïdentificeerd. Hierbij moet men steeds denken aan de psychosociale impact die dergelijke genetische kennis met zich meebrengt. Voor sommige patiënten is het immers een opluchting om te weten of zij al dan niet drager zijn, voor anderen kan dit een bijzondere kwelling zijn en aanleiding geven tot ernstige psychologische problemen. Zo kan het voor patiënten erg moeilijk zijn om hun leven verder te zetten in de wetenschap dat ze ooit de ziekte zullen ontwikkelen, maar dat niemand kan voorspellen wanneer dit zal gebeuren. Ook het idee dat alle andere naaste familieleden getroffen zijn of drager zijn, kan voor de niet-aangetaste personen gevoelens van schuld oproepen. 4.5.3. Genetische counseling Al het bovenstaande in beschouwing genomen, moet men stellen dat genetische counseling absoluut onontbeerlijk is bij genetische diagnostiek binnen families. Ook professionele ondersteuning op psychologisch vlak zou steeds aan de personen in kwestie en hun naasten moeten kunnen aangeboden worden. Dus naast louter de informatieve kant met betrekking tot de genetische testing en eventuele voortplantingsmaatregelen, moet men steeds ook aandacht schenken aan de emotionele en psychosociale impact voor deze families. Dergelijke counseling gebeurt idealiter door een multidisciplinair en gespecialiseerd team met ervaring. [5,10, 20] 4.5.4. ‘Incidental findings’ en ‘VUS’ Wanneer men van WES of WGS gebruik maakt om bepaalde ziekteveroorzakende mutaties te vinden, moet men zich vergewissen van twee zeer pertinente ethische problemen die hierbij rijzen. Enerzijds gaat het om de ‘VUS’ en anderzijds om ‘incidental findings’.

41

Met de term ‘VUS’, ofwel ‘variants of unknown significance’, bedoelt men het vinden van genetische alteraties, waarvan het belang niet met zekerheid kan worden ingeschat. Immers deze varianten kunnen worden teruggevonden bij een deel van de populatie, maar het is nog niet zeker of zij gepaard gaan met een pathologisch fenotype of als het eerder om banale variaties gaat. Dankzij WES of WGS is het mogelijk dat men bij elk getest individu tal van dergelijke varianten vindt, zonder dat men de betekenis ervan kent. Men is er op heden nog steeds niet uit hoe men hiermee moet omgaan. Verder onderzoek zal onze kennis hieromtrent hopelijk uitbreiden, maar de uitdaging is enorm. [6] ‘Incidental findings’ vormen de andere grote uitdaging bij klinisch gebruik van exoom en genoom sequenering. Onder dit begrip verstaat men het vinden bepaalde mutaties die niet gerelateerd zijn aan de indicatie waarvoor men initieel de sequenering had aangevraagd, maar die desalniettemin toch van medisch belang of nut kunnen zijn voor de dokter en patiënt in kwestie. Het gaat hier dus over het ontdekken van mutaties in genen voor een compleet andere ziekte dan die waarnaar men op zoek was, maar die op lange of korte termijn (bijna) zeker morbiditeit of zelfs mortaliteit zullen veroorzaken. Men stelt zich hier nu bij de vraag in hoeverre dit aan patiënten moet worden meegedeeld. [38,39] In 2013 bracht de ‘American College of Medical Genetics en Genomics’ hieromtrent een richtlijn uit. Hierin haalden ze aan dat door de revolutie in sequeneringstechnieken ethische vraagstukken met betrekking tot ‘incidental findigs’ absoluut hoog op de agenda staan en dat er dit zeker onderwerp van controverse zal zijn. Toch hebben ze geprobeerd om een aanzet te geven over hoe men met deze ‘incidental findings’ moet omgaan. Zo kwam hun werkgroep tot een lijst van in totaal 57 genen, horende bij vierentwintig ziektebeelden, waarvoor zij het etisch achten om aan de arts en patiënt mee te geven. Voor deze lijst verwijzen we naar de bijlage 2. [38] Het gaat over ernstige ziekten, waarvan de morbiditeit of mortaliteit sterk kunnen verminderd of zelfs voorkomen kunnen worden, bij vroegtijdige interventie. Het college benadrukt evenwel dat er voor deze ziekten niet doelmatig moet worden gescreend. Het gaat erom dat men dus bij het zoeken naar andere mutaties, in het te onderzoeken materiaal deze mutaties tegenkomt. Ook hechten ze veel belang aan de manier waarop labo’s dergelijke ‘incidental findings’ rapporteren aan de arts en de manier waarop deze de boodschap overbrengt aan de patiënt. Het risico op ‘incidental findings’ moet steeds vooraf worden besproken met de patiënt in kwestie, dit valt immers onder genetische counseling. Ook moeten deze ‘incidental 42

findings’ worden meegedeeld, ongeacht de leeftijd van de patiënt en de leeftijd waarop de ziekte meestal tot uiting komt. Dit omwille van het potentieel nut dat dit kan hebben voor andere familieleden. Men acht dus dat dit belang voor andere familieleden primeert boven het beslissingsrecht van het kind om deze mutaties al dan niet te willen kennen. In de toekomst zal naar dit topic ongetwijfeld nog veel meer onderzoek worden gedaan, de meningen zijn hierover immers nog zeer verdeeld. [38,39]

5. Discussie Alles samen beschouwd, is NGS een techniek die effectief een revolutie betekent binnen de genetica. Het schept veel nieuwe mogelijkheden om het genoom meer uitgebreid in kaart te kunnen brengen en dit binnen een aanvaardbaar tijdsbestek en relatief aanvaardbare kost. De komende jaren zal sequenering aan de hand van NGS wellicht steeds minder gaan kosten, zodat het gebruik ervan steeds meer toegankelijk zal worden. Momenteel wordt gericht sequeneren mits NGS voor diagnostische doeleinden reeds vrij courant aangewend in vele laboratoria. Toch zal verdere op puntstelling door aanpassingen van de normen voor coverage en ‘read’-lengte de accuraatheid van detectie verder verfijnen. Momenteel gebruikt men vaak nog Sanger om de gevonden mutaties te controleren, maar vermoedelijk zal ook dit op termijn niet meer nodig zijn. De literatuur toont dat in casusbesprekingen van 2011 en zelfs 2012 nog vrij vaak Sanger gehanteerd werd als gouden standaard voor diagnostisch onderzoek. Vanaf dan zien we eerder pogingen tot overschakeling op NGS. WES is ook reeds in gebruik, maar WGS is iets wat nog niet voor direct is. De ambities voor WGS zijn evenwel groot, men zou zo immers willen komen tot de ultieme vorm van ‘personal medicine’, waarbij iedereen kan beschikken over zijn eigen genomische sequentie voor de prijs van ongeveer duizend dollar. Onontbeerlijk om tot dergelijke individugerichte diagnostiek en zorg te kunnen komen, zijn twee zaken: ten eerste een grondige kennis van het menselijke genoom/exoom en anderzijds de technieken die dergelijke grootschalige projecten aan de lopende band toelaten. NGS zal waarschijnlijk tot beide vereisten een bijdrage hebben. Enerzijds laat het researchers op heden toe om genen en hun varianten voor verschillende ziekten in kaart te brengen en aldus onze kennis over het genoom uit te breiden, anderzijds biedt de techniek zelf de mogelijkheid om dergelijke grootschalige projecten aan te kunnen.

43

Genetisch onderzoek blijkt echter voornamelijk van belang te zijn voor ernstige, chronische pathologieën, waarbij men er alle baat bij heeft om deze vroegtijdig te detecteren, liefst zelfs in een preklinisch stadium. Door het bepalen van iemands predispositie om een dergelijke ziekte te ontwikkelen, kan men vroegtijdig op de ziekte anticiperen. Zo kan men enerzijds door gerichte follow-up en anderzijds door bepaalde interventies, de ziekte uitstellen, in een behandelbaar stadium detecteren of zelfs trachten te voorkomen. De cardiomyopathieën zijn hier slechts een voorbeeld van, maar ook binnen de oncologie biedt NGS grote opportuniteiten. Concreet voor de klinisch en genetisch bijzonder heterogene cardiomyopathieën, betekent NGS een onbetwistbare vooruitgang. Niet in die zin dat het nodig of zinvol is om op populatieniveau genetisch te gaan screenen voor cardiomyopathieën. Het grootste voordeel van NGS in geval van cardiomyopathieën bestaat er zoals gezegd wel in, dat men, voor families waarin een duidelijke predispositie bestaat, uitgebreid kan nagaan welke de oorzakelijke mutaties zijn. Bovendien kan men ook bepalen welke andere familieleden drager zijn van deze en/of andere (ziektemodifiërende) mutaties. Dit kan dankzij NGS zonder afhankelijk te zijn van een beperkt aantal genen. Dit bovendien aan een meer haalbare prijs en binnen kortere tijd. Dankzij deze uitgebreide testmogelijkheden zullen in de toekomst wellicht nog meer nieuwe causale mutaties ontdekt worden en zal men wellicht steeds verder raken in het maken van genotype-fenotype correlaties. Verder onderzoek op dit terrein is dan ook noodzakelijk. Ten slotte betekent het kunnen sequeneren van hele exomen en bij uitbreiding volledige genomen, tevens het verwerven van een enorme hoeveelheid gegevens. De bio-informatica zal daarom mee moeten evolueren door ontwikkeling van programma’s, die dergelijke datasets op efficiënte wijze zullen kunnen beheren en doelgericht zullen kunnen analyseren. Zo wordt het tevens één van de grote uitdagingen van de toekomst om, op een ethisch verantwoorde wijze, met al deze informatie om te kunnen gaan. Rapporteren van ‘incidental findings’ en interpretatie van ‘VUS’, zijn hiervan twee pertinente voorbeelden. Bovendien hecht men extreem veel waarde aan genetische counseling. Hierbij is het cruciaal om personen goed in te lichten over de mogelijkheden, maar ook over de potentiële gevolgen van de toegepaste genetische testen. Men mag ook niet vergeten voldoende aandacht te schenken aan de psychosociale impact op het leven van de getroffen families. Individuele benadering,

44

met respect voor de wensen van elke patiënt, is meer dan ooit mogelijk, maar evenzeer meer dan ooit noodzakelijk.

6. Referenties [1] Maron B.J., Towbin J.A., Thiene G., Antzelevitch C, Corrado D., Arnett D. et al. “Contemporary Definitions and Classification of the Cardiomyopathies: An American Heart Association Scientific Statement From the Council on Clinical Cardiology, Heart Failure and Transplantation Committee; Quality of Care and Outcomes Research and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Groups; and Council on Epidemiology and Prevention”. Circulation 2006, 113, 1807-1816. [2] Elliott P., Andersson B., Arbustini E., Bilinska Z., Cecchi F., Charron P., et al. “Classification of the cardiomyopathies: a postion statement from the European society of cardiology working group on myocardial and pericardial diseases”. European Heart Journal 2008, 29, 270-276. [3] Jacoby D., Mckenna W.J. “ Genetics of inherited cardiomyopathy”. European Heart Journal 2012, 33, 296304. [4] Michels M., Soliman O.I.I., Phefferkorn J., Hoedemaekers Y.M., Kofflard M.J., Dooijes D. et al. “Disease penetrance and risk stratification for sudden cardiac death in asymptomatic hypertrophic cardiomyopathy mutation carriers”. European Heart Journal 2009, 30, 2593-2598. [5] Maron B. J., Maron M.S., Semsarian C. “Genetics of Hypertrophic Cardiomyopathy After 20 Years”. Journal of the American College of Cardiology 2012, 60(8), 705-715. [6] Watkins H., Ashrafian H., Redwood C., “Review article: Inherited Cardiomyopathies”. The New England Journal of Medicine 2011, 364(17), 1643-1656. [7] Hengstenberg C., Schwartz K., “Molecular Genetics of Familial Hypertrophic Cardiomyopathy”. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 1994, 26, 3-10. [8] Semsarian C., FRACP, FAHA, FCSANZ, members of the CSANZ Cardiac Genetics Diseases Council Writing Group. “Review as other Guidelines: Guidelines for the Diagnosis and Management of Hypertrophic Cardiomyopathy”. Heart, Lung and Circulation 2011,20, 688-690. [9] Sen-Chowdhry S., Tomé Esteban M. T., McKenna W.J. “Insights and challenges in cardiomyopathy, 2012”. Herzchrittmachertherapie + Elektrophysiologie 2012, 23, 174-185.

hyperthrophic

[10] Demo E.M., Skrzynia C., Baxter S. “Genetic Counseling and Testing for Hypertrophic Cardiomyopathy: the Pediatric Perspective”. J. of Cardiovasc. Trans. Res. 2009,2, 500-507. [11] Scheffold T., Waldmüller S., Borisov K. “Letter to the editors: A case of familial hypertrophic cardiomyopathy emphasizes the importance of parallel screening of multiple disease genes”. Clin. Res. Cardiol. 2011, 100, 627-628. [12] Ho C.Y. “Genetic Considerations in Hypertrophic Cardiomyopathy”. Progress in Cardiovascular Diseases 2012, 54, 456-460.

[13] Christiaans I., Birnie E., Bonsel G.J., Mannens M.M.A.M., Michels M., Majoor-Krakauer D. et al. “Manifest disease, risk factors for sudden cardiac death, and cardiac events in a large nationwide cohort of

45

predictively tested hypertrophic cardiomyopathy mutation carriers: determining the best cardiological screening strategy”. European Heart Journal 2011, 32, 1161-1170. [14] Ommen S. R. “Hypertrophic Cardiomyopathy”. Curr. Probl. Caridiol. 2011, 36, 409-453. [15]Opgehaald uit: ‘Histology Image Bank’ (http://meded.ucsd.edu/hist-img-bank/index.htm) :Muscle Tissue and Cardiovascular System; slides 43,44, 45 –Human Cardiac Muscle; slide 43. Op 16 April 2013. [16] ten Cate F.J. Cardiomyopathieën. In: Van der Wall E.E.,Van de Werf F., Zijlstra F., redacteurs. Cardiologie. Tweede herziene druk. Houten: Bohn Stafleu van Loghum; 2008. p.379-387. [17] Havndrup O., Bundgaard H., Andersen P.S., Larsen L.A., Vuust J., Kjeldsen K. et al. “Outcome of clinical versus genetic family screening in hypertrophic cardiomyopathy with focus on cardiac β-myosin gene mutations”. Cardiovascular Research 2003, 57, 347-357. [18] Rodriguez J.E., McCudden C.R., Willis M.S. “Review:Familial hypertrophic cardiomyopathy: basic concepts and future molecular diagnostics”. Clinical Biochemistry 2009,42, 755-766.

[19] Vega MØller D., Skytt Andersen P., Hedley P., ErsbØll M.K., Bundgaard H., Moolman-Smook J., et al. “The role of sarcomere gene mutations in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy”. European Journal of Human Genetics 2009, 17, 1241-1249. [20] Hershberger R.E., Siegfried J.D. “Update 2011:Clinical an Genetic Issues in Familial Dilated Cardiomyopathy”. Journal of the American College of Cardiology 2011,57(16), 1641-1649. [21] Fatkin D., members of the CSANZ Cardiac Genetic Disease Council Writing Group. “ Guidelines for the Diagnosis and Management of Familial Dilated Cardiomyopathy”. Heart, Lung and Circulation 2011, 20, 691693. [22] Serio A., Narula N., Kodama T., Favalli V., Arbustini E. “ Familial dilated cardiomyopathy, Clinical and genetic characteristics”. Herz 2012, 37, 822-829. [23] Campbell N., Sinagra G., Jones K.L., Siavov D., Gowan K., Merlo M., et al. “Whole Exome Sequencing Identifies a Troponin T Mutation Hot Spot in Familial Dilated Cardiomyopathy”. PLoS ONE 2013, 8(10), 1-8. [24] Cattin M.-E., Muchir A., Bonne G. “ ‘State-of-the-heart’ of cardiac laminopathies”. Current Opin Cardiol 2013, 28(3), 297-304. [25] Raju H., Alberg C., Sagoo G.S., Burton H., Behr E. R. “Inherited cardiomyopathies”. Britisch Medical Journal 2011,343, 1-7. [26] Sanger F., Nicklen S., Coulson R. “DNA sequencing with chain-terminating inhibitors”. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 1977, 74(12), 5463-5467. [27] Zimmerman J., Voss H., Schwager C., Stegemann J., Ansorge W. “Automated Sanger dideoxy sequencing reaction protocol”. Febs Letters 1988,233(2), 432-436. [28] Opgehaald uit : http://www.eisenlab.org/FunFly/?page_id=24 : Next-gen sequencing. Op 16 April 2013.

46

[29] Opgehaald uit: http://en.wikipedia.org/wiki/Sanger_sequencing . Op 16 April 2013. [30] Metzker M.L. “Sequencing technologies-the next generation”. Nature reviews 2010, 11, 31-46. [31] Voelkerding K.V., Dames S., Durtschi J.D. “Next Generation Sequencing for Clinical DiagnosticsPrinciples and Application to Targeted Resequencing for Hypertrophic Cardiomyopathy”. Journal of Molecular Diagnostics 2010, 12(5), 539-551. [32] Sikkema-Raddatz B., Johansson L.F., de Boer E.N., Almomani R., Boven L.G.,van den Berg M.P. et al. “Targeted Next-Generation Sequencing can Replace Sanger Sequencing in Clinical Diagnostics”. Human Mutation, 00(0), 1-8. [33] Piran S., Liu P., Morales A., Hershberger R.E. “Where Genome Meets Phenome: Rationale for Integrating Genetic and Protein Biomarkers in the Diagnosis and Management of Dilated Cardiomyopathy and Heart Failure”. Journal of the American College of Cardiology 2012, 60(4), 283-289. [34] Hershberger R.E., Morales A., Siegfried J.D. “Clinical and genetic issues in dilated cardiomyopathy: A review for genetics professionals”. Genetics in Medicine 2010, 12(11), 655-667. [35] Obler D., Wu B., Lip V., Estrella E., Keck S., Haggan C. et al. “Familial Dilated Cardiomyopathy Secondary to Dystrophin Splice Site Mutation”. Journal of Cardiac Failure 2010, 16(3), 194-199. [36] Parks S.B., Kushner J.D., Nauman D., Burgess D., Ludwigsen S., Peterson A. et al. “Lamin A/C mutation analysis in a cohort of 324 unrelated patients with idiopathic or familial dilated cardiomyopathy”. American Heart Journal 2008, 156(1), 161-169. [37] Mook O.R.F., Haagmans M.A., Soucy J.F., van de Meerakker J.B.A., Baas F., Jakobs M.E. et al. “Targeted sequence capture and GS-FLX Titanium sequencing of 23 hypertrophic and dilated cardiomyopathy genes: implementation into diagnostics”. Journal of Medical Genetics 2013, 50, 614-626. [38] Green R.C., Berg J.S., Grody W.W., Kalia S.S., Korf B.R., Martin C.L. et al. “ACMG recommendations for reporting of incidental findings in clinical exome and genome sequencing”. Genetics in Medicine 2013, 15(7), 565-574. [39] American College of Medical Genetics and Genomics. “Incidental findings in clinical genomics: a clarification”. Genetics in Medicine 2013, 15(8), 664-666.

47

Bijlage 1: Tabel met ziektebeelden per subtype cardiomyopathie, horende bij figuur 3. [2]

48

Bijlage 2: Tabel met ziektes waarvoor ‘incidental findings’ zouden moeten gerapporteerd worden. [38]

49

50