COBAS® TaqMan® HBV Test For Use With The High Pure System IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. COBAS® TaqMan® HBV Test High Pure System Viral Nucleic Acid Kit
HBV HPS
48 Tests 48 Tests
P/N: 03500756 190 P/N: 03502295 001
FELHASZNÁLÁS MÓDJA A COBAS® TaqMan® HBV Test For Use With The High Pure System (HPS) egy in vitro nukleinsavamplifikációs vizsgálat a hepatitis B vírus (HBV) DNS mennyiségi meghatározására humán szérumban vagy plazmában. A vizsgálat a manuális minta előkészítésre High Pure System Viral Nucleic Acid Kit-et, az automatizált amplifikálásra és detektálásra COBAS® TaqMan® 48 Analizátort használ. A COBAS® TaqMan® HBV Test nem való vér vagy vérkészítményekben HBV jelenlétének szűrésére, illetve diagnosztikus vizsgálatként HBV-fertőzés jelenlétének megerősítésére. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA A hepatitis B vírus (HBV) a vírushepatitist okozó számos ismert vírus egyike. Több mint kétmilliárd HBVfertőzött ember van a világon, közülük több mint 350 millió krónikusan fertőzött hordozó1. A krónikus hordozók magas kockázatúak a fertőzés olyan hosszú távú szövődményeire nézve, mint a krónikus hepatitis, a cirrhosis és a hepatocelluláris karcinóma2,3,4. Az akut és krónikus HBV-fertőzés diagnosztikus és/vagy prognosztikus indikátoraiként szerológiai markerek használatosak. A HBV-fertőzés legközönségesebb markere a HBV felületi antigén (HBsAg) jelenléte. Bár a hordozókban eltűnhet a HBsAg és HBsAg-ellenes antitest lehet jelen, úgy tűnik, hogy ők továbbra is magas kockázatúak a későbbi élet során megjelenő májszövődményekre nézve5,6. A HBV e antigén (HBeAg) általánosan használatos, mint másodlagos marker a progresszív májbetegséggel összefüggő aktív HBV-replikáció kimutatására. A HBeAg eltűnésének elmaradása úgy tűnik, hogy növeli a végstádiumú májbetegség kockázatát7,8. A HBV különböző törzsei vagy termelnek ugyan HBeAg-t, de az nem mutatható ki a szérumban, vagy elveszthetik a HBeAg-termelő képességüket, még akkor is, amikor aktív fertőzés van jelen9. Ezért ennek a markernek a használata a betegség progressziójának monitorozására korlátozott haszonnal bír10. Irodalmi adatok szerint a HBV DNS kimutatása a szérumban prognosztikus értékű az akut és krónikus HBV-fertőzések kimenetelét tekintve11,12,13,14. A módszer lehetővé teszi a HBV DNS kimutatását a HBsAg eltűnését követően15, illetve a szerológiai marker hiányos HBV kimutatását16. Mindazonáltal a szerológiai markerek és a HBV DNSszintek közti kapcsolat még nem ismert. A HBV-fertőzött betegek kezelésére alkalmazott antivirális terápia hatékonysága ugyancsak értékelhető szerológiai markerek, illetve májenzimfunkciók mérése révén. Ugyanakkor úgy gondolják, hogy a virális replikáció legközvetlenebb és legmegbízhatóbb mérése a HBV DNS szérumban, illetve plazmában való mennyiségi meghatározása13,17,18,19. Az alfa-interferon, lamivudin vagy ganciclovir kezelésben részesülő betegekben észlelt HBV DNS-szintek gyors és tartós eséséről kimutatták, hogy prediktív értékű a kedvező kezelési kimenetelre nézve10,20,21,22,23,24. A HBV DNS-szintek monitorozása alapján megjósolható lehet a lamivudin-rezisztencia kialakulása25. Emiatt a HBV DNS mérésének mennyiségi vizsgálata egy értékes eszköz, amely más szerológiai markerekkel együtt használható a HBV-fertőzés gondozása során. AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A COBAS® TaqMan® HBV Test két fő lépésből épül fel: 1) manuális minta-előkészítés a HBV DNS izolálására; (2) a target DNS automatikus PCR-amplifikálása HBV specifikus komplementer primerek segítségével és a hasított, kettősen jelölt oligonukleotid próbák kimutatása, amely lehetővé teszi a HBV target amplifikált termék (amplikon) és a (mintával egyidejűleg feldolgozott, amplifikált és detektált) HBV belső kontroll DNS mennyiségi meghatározását. A master mix reagens a HBV DNS-re és a HBV mennyiségi standard DNS-re egyaránt specifikus primer párokat és próbákat tartalmaz. A master mixet HBV A-G genotípusok ekvivalens mennyiségi meghatározásának biztosítására fejlesztették ki. Az amplifikált DNS kimutatása targetspecifikus és mennyiségi standard-specifikus kettős-jelölt oligonukleotid próbák segítségével történik, amelyek lehetővé teszik a HBV amplikon és a HBV mennyiségi standard amplikon független azonosítását. A HBV DNS mennyiségi meghatározása során HBV mennyiségi standardot kell használni. A HBV mennyiségi standard egy nem fertőző linearizált plazmid, amely a HBV DNS targethez és egy, a HBV mennyiségi standard amplikon és a HBV target amplikon megkülönböztetését lehetővé tevő egyedi próbához kötődő régióval identikus primer kötő helyeket tartalmaz. A HBV mennyiségi standard minden egyes mintához és kontrollhoz
A Dokumentum verzióinformációi rész a dokumentum végén található. 1 03584933044-07HU
Doc Rev. 13.0
ismert kópiaszámban hozzáadásra kerül, majd a HBV targettel együtt a minta-előkészítési, PCR-amplifikációs és kimutatási lépéseken keresztül megy. A COBAS® TaqMan® 48 Analizátor a vizsgálati mintákban levő HBV DNS-titert a HBV-szignálnak a HBV mennyiségi standard szignállal való összehasonlításával számolja ki minden egyes minta és kontroll esetén. A HBV mennyiségi standard kompenzálja a gátló hatásokat, és az előkészítési és amplifikációs folyamatok szabályozásával lehetővé teszi a HBV DNS pontos mennyiségi meghatározását valamennyi mintában. Minta előkészítése A COBAS® TaqMan® HBV Test plazma- és szérummintákat dolgoz fel, és HBV DNS-t izolál egy üvegszálakhoz való nukleinsav kötődésen alapuló generikus manuális minta-előkészítés révén. A HBVvíruspartikulumokat magas hőmérsékleten való inkubálás során lizálják egy proteáz és egy olyan chaotrop lízis/kötő puffer segítségével, amely szabaddá teszi a nukleinsavakat, és megvédi a szabaddá tett HBV DNS-t a plazmában és a szérumban lévő DNázoktól. A HBV mennyiségi standard DNS molekulák ismert száma kerül a lízisreagenssel együtt hozzáadásra valamennyi mintához. Ezt követően izopropanol lesz a líziskeverékhez adva, majd egy üvegszálas szűrőbetétes oszlopon az egész lecentrifugálásra kerül. A centrifugálás során a HBV DNS és HBV mennyiségi standard DNS az üvegszálas szűrő felületéhez kötődik. A nem kötődött anyagok, mint sók, fehérjék és egyéb sejt eredetű szennyezések a centrifugálás révén eltávolításra kerülnek. Az adszorbeált nukleinsavak mosása és eluálása egy vizes oldattal történik. Az egyszer használatos eszközök 12 minta, illetve ismétlés párhuzamos feldolgozását teszik lehetővé. A HBV DNS-t és HBV mennyiségi standard DNS-t tartalmazó feldolgozott minták az amplifikációs/ kimutatási keverékhez kerülnek hozzáadásra. A HBV target DNS és a HBV mennyiségi standard DNS amplifikálását és kimutatását azután a COBAS® TaqMan® 48 Analizátor végzi el a teszt készletben biztosított amplifikálási és kimutatási reagensek segítségével. PCR-amplifikáció A targetszekvencia kiválasztása A target DNS-szekvencia kiválasztása valamennyi HBV-genotípus genomban a maximálisan konzervált régiók azonosításán múlik. Következésképpen a primerek és a próba megfelelő kiválasztása kritikus ahhoz, hogy a vizsgálat valamennyi klinikailag releváns HBV-genotípust detektálni tudja. A genotípusok között a részben egyszálú, cirkuláris HBV-genom egy régiója a legnagyobb fokban konzervált DNS-szekvencia. A COBAS® TaqMan® HBV Test a HBV-genom nagyfokban konzervált pre-core/core régiójában lévő szekvenciáknak megfelelő PCR-amplifikációs primereket használ. Targetamplifikáció A mintákat az amplifikációs csövekben (K-csövekben) lévő amplifikációs keverékhez adják, itt megy végbe a PCR-amplifikáció. A COBAS® TaqMan® 48 Analizátorban lévő PCR-készülék felhevíti a reakcióelegyet, hogy denaturálja a kettős szálú DNS-t, és hozzáférhetővé tegye a specifikus primer szekvenciákat a HBV cirkuláris DNS genomon és a HBV mennyiségi standard DNS-en. A keverék kihűlésével a primerek a target DNS-hez kapcsolódnak. A hőstabil Thermus species Z05 DNS-polimeráz (Z05) Mn2+ és dezoxinukleozid-trifoszfátok (dNTPs), azaz dezoxiadenozin-, dezoxiguanozin-, dezoxicitidin-, dezoxiuridin (timidin helyett)-trifoszfátok feleslegének jelenlétében a kapcsolódott primerhez a target templátnak megfelelően kettős szálú DNS molekulát szintetizál, amelyet amplikonnak neveznek. A COBAS® TaqMan® 48 analizátor a folyamatot adott számú cikluson keresztül automatikusan ismétli, ahol az amplikon DNS-mennyisége ciklusonként megduplázódik. A szükséges ciklusok számát a COBAS® TaqMan® 48 analizátor programja tartalmazza. Az amplifikálás a HBVgenomnak csak a primerek közötti régiójában zajlik; a teljes HBV-genom nem amplifikálódik. Szelektív amplifikálás A COBAS® TaqMan® HBV Test a target-nukleinsav szelektív amplifikálását a mintából AmpErase (uracil-Nglikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dUTP) használatával éri el. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak26, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonban mindig megtalálható, miután a master mix reagens a dNTP-k egyikeként dezoxiuridin-trifoszfátot használ; tehát csak az amplikon tartalmaz dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. Továbbá bármilyen nem specifikus terméket, amely a master mix kezdeti mangán okozta aktiválódása után képződik, az AmpErase enzim lebont, javítva ezáltal a specificitást és az érzékenységet. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin-csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribózlánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 °C felett, azaz a hevítési lépések során inaktív, azaz nem bontja le az amplifikálás során képződött targetamplikont. A PCR-termékek kimutatása COBAS® TaqMan® Test során A COBAS® TaqMan® HBV Test valós idejű27,28 PCR-technológiát alkalmaz. A kettősen jelölt fluoreszcens próbák használata biztosítja a PCR-termék halmozódásának valós idejű detektálását az amplifikálási folyamat során felszabaduló fluoreszcens jelzőfestékek emissziós intenzitásának monitorozása révén. A HBV-re és 03584933044-07HU
2
Doc Rev. 13.0
a HBV mennyiségi standardra specifikus oligonukleotidokból álló próbák egy jelző- és egy blokkolófestékkel jelöltek. A COBAS® TaqMan® HBV Test során a HBV és HBV mennyiségi standard próbák különböző fluoreszcens jelzőfestékkel vannak jelölve. Amíg a fluoreszcens festékkel kettősen jelölt próbák érintetlenek, a jelzőfesték fluoreszcenciája a Förster-féle energiatranszfer jelenség révén a blokkolófesték közelsége miatt gátolt. PCR során a próba hibridizál egy target szekvenciával, és az 5' → 3' nukleáz aktivitású hőstabil Z05 DNS polimeráz hasítja. Ha egyszer a jelző- és blokkolófestékek felszabadulnak és különválnak, megszűnik a blokkolás, és a jelzőfesték fluoreszcens aktivitása megnő. A HBV DNS és a HBV mennyiségi standard DNS amplifikációja egymástól függetlenül, különböző hullámhosszokon van mérve. Ez a folyamat adott számú cikluson keresztül ismétlődik, minden egyes ciklusban jelentősen növekedve az adott jelzőfestékek emissziós intenzitása, ezáltal lehetővé téve a HBV DNS és HBV mennyiségi standard DNS független azonosítását. A szignálok intenzitása a PCR kezdetekor jelenlévő kiindulási anyag mennyiségével mutat összefüggést. A COBAS® TaqMan® HBV Test mennyiségi meghatározás alapjai A COBAS® TaqMan® HBV Test pontos kvantitatív eredményeket nyújt egy nagyon széles dinamikus tartományon, mivel az amplikon monitorozása az amplifikáció exponenciális fázisa során történik. Minél magasabb a minta HBV-titere, annál korábban emelkedik a HBV próba jelző festékének fluoreszcenciája az alap fluoreszcenciaszint fölé (lásd 1. ábra). Mivel a HBV mennyiségi standard (QS) DNS mennyisége állandó valamennyi mintában, a HBV QS próba jelzőfestékének fluoreszcenciája valamennyi minta esetén ugyanazon ciklus során kell megjelenjen (lásd 2. ábra). Azokban az esetekben, ahol a QS amplifikálását és kimutatását gátlás vagy rossz mintavisszanyerés befolyásolja, a fluoreszcencia később jelenik meg, ezáltal lehetővé válik a HBV target DNS számított titerének megfelelő módosítása. A specifikus fluoreszcens szignál megjelenését kritikus küszöbértéknek (Ct) nevezik. A kritikus küszöbérték definíció szerint az a tört alakú ciklus szám, amelynél a jelző festék fluoreszcenciája meghalad egy előre meghatározott küszöbértéket (a kijelölt fluoreszcencia szintet), és megkezdődik ezen szignál exponenciális növekedési fázisa (lásd 3. ábra). Egy magasabb kritikus küszöbérték a kiindulási HBV target DNS egy alacsonyabb titerét jelzi. Egy 2-szeres titeremelkedés a target HBV DNS kritikus küszöbértékének 1-gyel való csökkenésével korrelál, míg egy 10-szeres titeremelkedés a kritikus küszöbérték 3,3-del való csökkenésével korrelál. Az 1. ábra egy vírus hígítási sor target növekedési görbéit ábrázolja az 5-log10 tartományon. Ahogy a víruskoncentráció nő, a növekedési görbék korábbi ciklusokra tolódnak. Emiatt a legbaloldalibb növekedési görbe a legmagasabb vírustiterszinthez tartozik, a legjobboldalibb növekedési görbe pedig a legalacsonyabb vírustiterszinthez tartozik.
1. ábra
9,00 8,00
Normalizált fluoreszcencia
7,00 6,00 5,00 4,00 Legmagasabb titer
3,00 2,00
Legalacsonyabb titer
1,00 0,00 -1,00 0
10
20
30
40
50
60
Ciklusszám
03584933044-07HU
3
Doc Rev. 13.0
A 2. ábra egy vírushígítási sorból származó minták mennyiségi standard növekedési görbéit ábrázolja az 5-log10 tartományon. A mintákhoz adott mennyiségi standard mennyisége állandó minden egyes reakcióban. A mennyiségi standard kritikus küszöbértéke a vírustitertől függetlenül hasonló.
2. ábra 35,00 Legalacsonyabb titer
30,00
Normalizált fluoreszcencia
25,00 20,00 15,00 10,00 Legmagasabb titer
5,00 0,00 -5,00 0
10
20
30
40
50
60
Ciklusszám
A 3. ábra egy példát mutat be arra, hogyan történik az egyes növekedési görbék összes ciklusban mért fluoreszcencia értékeinek normalizálása. A tört alakú ciklusszámot (Ct) abból határozzák meg, hogy hol keresztezi a fluorszcens szignál a kijelölt fluoreszcenciaszintet.
3. ábra 1 0,9
Normalizált fluoreszcencia
0,8
Ct-érték = 27,1
Rögzített fluoreszcenciaszint
0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 -0,1 19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
Ciklusszám
A HBV DNS mennyiségi meghatározása A COBAS® TaqMan® HBV Test a HBV vírus DNS mennyiségét egy második targetszekvencia (HBV mennyiségi standard) segítségével határozza meg, amely minden egyes mintához ismert koncentrációban hozzá van adva. A HBV mennyiségi standard egy nem fertőző olyan HBV-szekvenciadarabokat tartalmazó linearizált plazmid DNS konstrukció, amelyek a HBV-targetszekvencia kötő régióival identikus primer kötő régiókat tartalmaznak. A HBV mennyiségi standard szintén előállít egy, a HBV target DNS-sel azonos hosszúságú és bázisösszetételű amplifikációs terméket. A HBV mennyiségi standard amplikon kimutatási próbakötő régióját úgy módosították, hogy a HBV mennyiségi standard amplikon különbözzön a HBVtargetamplikontól.
03584933044-07HU
4
Doc Rev. 13.0
A COBAS® TaqMan® 48 Analizátorban a PCR annealing fázisa során a mintákat szűrt fénnyel világítják meg és gerjesztik, és minden egyes minta szűrt emissziójú fluoreszcens adatait gyűjtik. Ezután a műszer ingadozásai miatt minden egyes minta leolvasási értéke korrigálva lesz. Ezeket a fluoreszcencia leolvasási adatokat a készülék az AMPLILINK szoftverre küldi, és eltárolja egy adatbázisban. Előellenőrzések történnek annak meghatározására, hogy a HBV DNS és HBV mennyiségi standard DNS adatok érvényes sorokat mutatnak-e, és az előre megadott határokon kívülre eső adatok jelzőket kapnak. Valamennyi előellenőrzés befejezése után a készülék a fluoreszcens leolvasásokat feldolgozza, és kritikus küszöbértékeket hoz létre a HBV DNS és a HBV mennyiségi standard DNS számára. A COBAS® TaqMan® HBV Test mellé biztosított tételspecifikus kalibrációs állandókat használja a készülék a minták és kontrollok titerértékeinek kiszámításához a HBV DNS és HBV mennyiségi standard DNS kritikus küszöbértékek alapján. A COBAS® TaqMan® HBV Test standardizálása nukleinsav-amplifikációs technikákra (NAT) vonatkozó WHO HBV nemzetközi standarddal (97/74629) történt, és a titereredmények nemzetközi egység [International Unit (IU)]/ml-ben vannak kifejezve. REAGENSEK High Pure System Viral Nucleic Acid Kit High Pure System vírusnukleinsav kit (P/N: 03502295 001) LYS (lízis-/kötőpuffer)
48 teszt
2 x 25 ml
trisz 50% (w/w) guanidin-HCl < 1% urea 19% (w/w) Triton X-100 CAR (RNS, liofilizált) PK (proteináz K, liofilizált) ≥ 64% (w/w) proteináz K, liofilizált
2 x 2 mg 2 x 100 mg
IRB (inhibitor eltávolító puffer) trisz 65% guanidin-HCl (adjon hozzá 20 ml etanolt)
1 x 33 ml
WASH (mosópuffer) trisz NaCl (adjon hozzá 80 ml etanolt) ELB (eluáló puffer) RS (High Pure System vírusnukleinsav állvány szett)
1 x 20 ml
1 x 30 ml 4 x mindegyikből
lízisállvány szűrőcsőállvány rögzített hulladék állvánnyal eluáló állvány állványfedél WR (High Pure System vírusnukleinsav hulladék állvány)
03584933044-07HU
5
8 x mindegyikből
Doc Rev. 13.0
COBAS® TaqMan® HBV Test (P/N: 03500756 190)
HBV HPS
48 teszt
Mintaelőkészítő és kontroll reagensek HBV QS (COBAS® TaqMan® HBV mennyiségi standard) trisz-HCl puffer EDTA < 0,001% linearizált, duplaszálú, inzertet tartalmazó plazmid DNS. A DNS inzert HBV primerkötő szekvenciákat és egy egyedi próbakötő régiót tartalmaz. amarántvörös festék < 0,005% poli-rA RNS (szintetikus) 0,05% nátrium-azid
2 x 1,0 ml
HBV H(+)C [HBV magas (+) kontroll] < 0,001% linearizált, duplaszálú, HBV szekvenciákat tartalmazó plazmid DNS Negatív humán plazma, US FDA engedélyezett tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR technikával nem mutatható ki 0,1% ProClin® 300 tartósítószer
2 x 1,0 ml
HBV L(+)C [HBV alacsony (+) kontroll] < 0,001% linearizált, duplaszálú, HBV szekvenciákat tartalmazó plazmid DNS Negatív humán plazma, US FDA engedélyezett tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR technikával nem mutatható ki 0,1% ProClin® 300 tartósítószer
2 x 1,0 ml
CTM (–) C [COBAS® TaqMan® negatív kontroll (humán plazma)] Negatív humán plazma, US FDA engedélyezett tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR technikával nem mutatható ki 0,1% ProClin® 300 tartósítószer
4 x 1,0 ml
Amplifikációs és kimutatási reagensek HBV MMX (COBAS® TaqMan® HBV master mix) tricin puffer kálium-hidroxid kálium-acetát glicerin < 0,001% dATP, dCTP, dGTP, dUTP < 0,001% upstream és downstream primerek a HBV Pre-Core/Core régiójához < 0,001% fluoreszcensen jelölt oligonukleotid próba, specifikus HBV-re és a HBV mennyiségi standardra < 0,001% oligonukleotid aptamer < 0,05% Z05 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,1% AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzim (mikrobiális) 0,09% nátrium-azid
2 x 24 teszt 2 x 1,4 ml
CTM Mn2+ (COBAS® TaqMan® mangánoldat) < 1,2% mangán-acetát jégecet 0,09% nátrium-azid
2 x 24 teszt 2 x 1,0 ml
03584933044-07HU
6
Doc Rev. 13.0
FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. A. B.
Csak humán EDTA-s plazmamintákhoz és humán szérumhoz alkalmazható.
C.
Ne pipettázzon szájjal.
D.
Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen egyszer használatos védőkesztyűt, laboratóriumi köpenyt és szemvédőt a minták és tesztreagensek kezelése közben. A minták és tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet.
E.
A reagensflakonokból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális és ribonukleáz-szennyezését.
F.
Steril, egyszer használatos pipetták és DNáz-mentes pipettahegyek használata javasolt.
G.
Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó reagenseket.
H.
Ne keverje a különböző kitekből származó reagenseket.
I.
A fel nem használt reagensek, hulladék és minták kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal.
J.
A kitet ne használja a lejárati ideje után.
K.
A biztonsági adatlapok (SDS) igény esetén hozzáférhetőek a helyi Roche irodában.
L.
A mintákat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories30 és a CLSI Dokumentum M29-A331 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet.
MEGJEGYZÉS: A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. Az 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5% nátriumhipoklorit oldatnak. M.
FIGYELEM: A CTM (–) C, HBV L(+)C és HBV H(+)C emberi vérből származó humán plazmát tartalmaz. A forrásanyag US FDA által hitelesített tesztekkel vizsgálva nem bizonyult reaktívnak Hepatitis B felületi antigénre (HBsAg), HIV-1/2 és HCV antitestekre, valamint HIV p24 antigénre. A negatív humán plazma PCR-technikával történő vizsgálata során HIV-1 RNS, HCV RNS vagy HBV DNS nem volt kimutatható. Egyetlen vizsgálati módszer sem nyújthat teljes garanciát arra, hogy a humán vérkészítményekben nincs jelen fertőző anyag. Emiatt minden humán eredetű anyagot potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni. A CTM (–) C, HBV L(+)C és HBV H(+)C fertőzőként kezelendő a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories30 és a CLSI Dokumentum M29-A331 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet.
N.
A HBV MMX, HBV QS és CTM Mn2+ nátrium-azidot tartalmaz. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatokat önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót.
O.
Viseljen szemvédőt, védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt bármely reagens kezelése közben. Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyával való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal öblítse le bő vízzel. Ellenkező esetben égető érzés jelentkezhet. Ezen reagenseket kiömlés esetén szárazra törlésük előtt vízzel hígítsa.
03584933044-07HU
7
Doc Rev. 13.0
TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK Mintaelőkészítő reagensek A.
Tárolja a High Pure System vírusnukleinsav reagenseket 15–25 °C-on a megérkezést követően.
B.
Tárolja az eluáló puffert (ELB) és a lízis/kötő puffert (LYS) 15–25 °C-on. Felbontást követően tartsa az ELB és LYS puffereket 15–25 °C-on. A felbontott ELB és LYS puffereket 30 napon belül vagy a lejárati dátumig fel kell használni, amelyik előbb következik.
C.
Miután a hordozó RNS-hez és a proteináz K-hoz hozzáadta az eluáló puffert (ELB), a fel nem használt feloldott hordozó RNS-t (CAR) és a fel nem használt feloldott proteináz K-t (PK) tárolja -15 °C és -25 °C között. Feloldást követően a hordozó RNS-t és a proteináz K-t 30 napon belül vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik, fel kell használni.
D.
Az etanol hozzáadását követően az inhibitor eltávolító puffert (IRB) és a mosópuffert (WASH) 15–25 °C-on tárolja. Ezek a munkaoldatok 30 napig vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik, stabilak.
E.
A roncsoló/kötő munkaoldatot [roncsoló/kötő puffer plusz hordozó RNS, proteináz K és HBV QS] elkészítést követően azonnal fel kell használni. A maradékot ki kell dobni.
Amplifikációs és kimutatási reagensek A. A reagenseket és kontrollokat ne fagyassza le. B.
A HBV MMX, CTM (–) C, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS és CTM Mn2+ 2–8 °C-on tárolandók. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati időn belül stabilak. Egy 12 mintát tartalmazó tételhez való mennyiség eltávolítása miatt felnyitott alábbi oldatok maradéka 2–8 °C-on tárolandó: HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS és CTM Mn2+. Felbontást követően a HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS és CTM Mn2+ 2–8 °C-on 30 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. Felbontást követően a fel nem használt CTM (–) C kontrollt ki kell dobni.
C.
A master mix munkareagenst CTM Mn2+-t HBV MMX-hez hozzáadva készül) 2–8 °C-on sötétben kell tárolni. Az előkészített mintákat és kontrollokat a master mix munkareagenshez annak elkészítésétől számított 2 órán belül hozzá kell adni.
D.
A feldolgozott minták és kontrollok 20–30 °C-on legfeljebb 3 óráig, 2–8 °C-on legfeljebb 24 óráig, illetve -20 °C-ra fagyasztva legfeljebb 1 hétig stabilak.
E.
Az amplifikálást a mintáknak és kontrolloknak a master mix munkareagenshez adásától számított 3 órán belül meg kell kezdeni.
A KÉSZLET TARTALMA Mintaelőkészítő reagensek A. High Pure System Viral Nucleic Acid Kit High Pure System vírusnukleinsav kit (P/N: 03502295 001) LYS (lízis-/kötőpuffer) CAR (hordozó RNS) PK (proteináz K) IRB (inhibitor eltávolító puffer) WASH (mosópuffer) ELB (eluáló puffer) RS (High Pure System vírusnukleinsav állvány szett) WR (High Pure System vírusnukleinsav hulladék állvány)
03584933044-07HU
8
Doc Rev. 13.0
Amplifikációs és kimutatási reagensek B. COBAS® TaqMan® HBV Test (P/N: 03500756 190) HBV QS (COBAS® TaqMan® HBV mennyiségi standard) HBV H(+)C [HBV magas (+) kontroll] HBV L(+)C [HBV alacsony (+) kontroll] CTM (–) C [COBAS® TaqMan® negatív kontroll (humán plazma)] HBV MMX (COBAS® TaqMan® HBV master mix) CTM Mn2+ (COBAS® TaqMan® mangánoldat)
HBV HPS
SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Műszerezettség és szoftver • COBAS® TaqMan® 48 Analizátor • AMPLILINK szoftver, 3.3-as vagy 3.4-es verzió • AMPLILINK szoftver Vezérlőegysége • Készülék és szoftver kézikönyvek: -
-
COBAS® TaqMan® 48 analizátorkészülék kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.3-as és 3.4-es verziójával való használatra AMPLILINK szoftver 3.3-as verziójának alkalmazási kézikönyve a COBAS® AmpliPrep készülékkel, COBAS® TaqMan® analizátorral, COBAS® TaqMan® 48 analizátorral, COBAS® AMPLICOR® analizátorral, valamint a cobas p 630 készülékkel való használatra vagy AMPLILINK szoftver, 3.4-es verzió alkalmazási kézikönyve
•
Vizsgálatdefiníciós fájl (Test Definition File, TDF). A TDF neve és verziója a készlethez mellékelt termékinformációs kártyán található. • K-cső kupakrögzítő (P/N:03516539001) • K-tálca kupakozó eszköz (P/N: 03339904001) • COBAS® TaqMan® 48 Analizátor K-hordozó (P/N: 28150397001) • K-hordozó szállító (P/N: 03341488001) • K-hordozó tartó (P/N: 03287696001) • K-hordozó transzporter (P/N: 03517519001) Egyszer használatos anyagok • K-cső doboz,12 x 96 db-os (P/N: 03137082001) • K-tálca doboz, 24 db-os (P/N: 03343146001) Centrifuga követelmények • Sigma 4-15C asztali centrifuga vagy ezzel ekvivalens mikrotiter lemezcentrifuga, amely képes 4600 × g centrifugális erő biztosítására • Sigma kilendülő fejes centrifugarotor P/N: 11118 (2 edénnyel P/N: 13218 és 2 lemeztartóval P/N: 17978), vagy ekvivalens
03584933044-07HU
9
Doc Rev. 13.0
EGYÉB • • • • • • • • • • • • • *
SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK izopropanol (> 99%) – az ACS feltételeknek megfelelő, vagy jobb etanol (96–100%) – az ACS feltételeknek megfelelő, vagy jobb állítható pipetták*: (250 μl és 1000 μl kapacitású), aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos DNáz mentes hegyekkel pipetta segédeszköz: Drummond (P/N: 4-000-100), vagy ekvivalens vízfürdő 50 °C (± 2 °C)-os száraz fűtőblokk 70 °C (± 2 °C)-os steril, egyszer használatos szerológiai pipetták: 5, 10 és 25 ml steril, polipropilén kúpos csövek; 15 ml és 50 ml: Corning (P/N: 430052 és P/N: 430290), vagy ekvivalens steril, 2,0 ml mikrocentrifuga csövek: Sarstedt (P/N: 72.693.005), vagy ekvivalens vortex keverő csőállványok egyszer használatos kesztyűk, púdermentes kalibrált hőmérők vízfürdőhöz és száraz fűtőblokkhoz
A pipetták pontossága a megadott térfogathoz képest 3%-on belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos DNázmentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta és az amplikon keresztszennyeződését.
A MINTA LEVÉTELE, TRANSZPORTJA ÉS TÁROLÁSA MEGJEGYZÉS: Valamennyi mintát és kontrollt fertőzések átvitelére alkalmasként kell kezelni. A. A minta levétele A COBAS® TaqMan® HBV Test szérum vagy plazma mintákkal való használatra alkalmas. A BD SST szérumvételező csövekbe vagy EDTA (levendulakék kupak) véralvadásgátlót tartalmazó csövekbe kell levenni. A vért ne hagyja 2–25 °C-on 1 napnál tovább. EDTA-s plazma vagy szérum használata megközelítőleg ekvivalens vizsgálati eredményeket fog adni. Az 4. ábra mutatja a mátrix típusának hatását a betegminták HBV DNS eredményeire. 4. ábra EDTA-s plazma és szérum mintatípusok összehasonlítása
10
Plazmaminták Átlagos eredmény (Log HBV DNS IU/ml, n = 2)
12,00
10,00
8,00
6,00
y = 1,0139x - 0,0703 2 R = 0,9984 4,00
2,00
0,00 0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
Szérumminták Átlagos eredmény (Log 10 HBV DNS IU/ml, n = 2)
03584933044-07HU
10
Doc Rev. 13.0
A szérumot vagy a plazmát a levételtől számított 1 napon belül szeparálja el a teljes vérből centrifugálással (800–1600 × g, 20 perc, szobahőmérséklet). Vigye át a szérumot vagy a plazmát egy steril polipropilén csőben. Az 5. ábra ilyen minta levételi vizsgálatokból származó adatokat mutat.
5. ábra HBV stabilitása EDTA véralvadásgátlóval levett teljes vérben vagy szérumvételező csőben plazma-, illetve szérumszeparálás előtt
Átlagos HBV DNS-eredmény (Log10 HBV DNS IU/ml, n = 2)
4,5
< 1 óra 25-30 °C 6 óra 25-30 °C 24 óra 25-30 °C 48 óra 25-30 °C 72 óra 25-30 °C < 1 óra 2-8 °C 6 óra 2-8 °C 24 óra 2-8 °C 48 óra 2-8 °C 72 óra 2-8 °C
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0 Plazma-1
Plazma-2
Plazma-3
Plazma-4
Plazma-5
Szérum-1
Szérum-2
Mintaazonosító
B.
A minta transzportja
A teljes vér, szérum vagy plazma transzportja meg kell feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásoknak32. A teljes vér 2–25 °C-on transzportálandó, és a levételtől számított 1 napon belül fel kell dolgozni. A plazma, illetve szérum 2–8 °C-on vagy -20 – -80 °C-ra fagyasztva transzportálandó. C.
A minta tárolása
A szérum- vagy plazmaminták szobahőmérsékleten 3 napig, 2–8 °C-on 7 napig, illetve -20 – -80 °C-ra fagyasztva legalább hat hétig tárolhatóak. A minták tárolása 800–900 μl részletekben 2,0 ml-es polipropilén csavarókupakos csövekben javasolt (pl. Sarstedt P/N: 72.694.006). Az 6. ábra ilyen minta tárolási vizsgálatokból származó adatokat mutat.
6. ábra A HBV stabilitása EDTA-s plazmában vagy szérumban 4,5
Átlagos HBV DNS-eredmény (Log10 HBV DNS IU/ml, n = 2)
Idő 0 1 nap szobahőm.
4,0
3 nap szobahőm. 5 nap szobahőm.
3,5
7 nap szobahőm. 1 nap 2-8 °C
3,0
3 nap 2-8 °C 5 nap 2-8 °C
2,5
7 nap 2-8 °C 2,0
6 hét -80 °C Plazma-1
Plazma-2
Plazma-3
Plazma-4
Plazma-5
Szérum-1
Szérum-2
Mintaazonosító
A szérum- és plazmaminták legfeljebb öt alkalommal olvaszthatók és fagyaszthatók HBV DNS-veszteség nélkül. A 7. ábra ilyen fagyasztás/olvasztás vizsgálatok adatait mutatja.
03584933044-07HU
11
Doc Rev. 13.0
Átlagos eredmény (Log10 HBV DNS IU/ml, n = 2)
7. ábra HBV-eredmények öt fagyasztás-olvasztás ciklus után 4,5
4,0
Kontroll 1 F-O
3,5
2 F-O 3 F-O
3,0
4 F-O 5 F-O
2,5
2,0 Plazma-1
Plazma-2
Plazma-3
Plazma-4
Szérum-1
Szérum-2
Mintaazonosító
HASZNÁLATI UTASÍTÁS MEGJEGYZÉS: A részletes üzemeltetési utasításokat, az eredmények nyomtatását, valamint a jelzők, megjegyzések és hibaüzenetek értelmezését a következő kézikönyvekben találja: (1) a COBAS® TaqMan® 48 analizátorkészülék kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.3-as és 3.4-es verziójával való használatra; (2) az AMPLILINK 3.3-as verziójú szoftver alkalmazási kézikönyve a COBAS® AmpliPrep készülékhez, COBAS® TaqMan® analizátorhoz, COBAS® TaqMan® 48 analizátorhoz, COBAS® AMPLICOR® analizátorhoz és cobas p 630 készülékhez, vagy (3) az AMPLILINK szoftver 3.4-es verziójú alkalmazási kézikönyve. MEGJEGYZÉS: Valamennyi amplifikációs és kimutatási reagensnek használat előtt környezeti hőmérsékletűnek kell lennie; legalább 30 perccel használat előtt vegye ki azokat a tárolási 2–8 °C-ról. MEGJEGYZÉS: A szérum és plazma mintákat 15–30 percig hagyni kell, hogy felhasználás előtt felvegyék a szobahőmérsékletet. MEGJEGYZÉS: Ahol előírt, használjon szűrős vagy pozitív kiszorításos hegyeket a pipettákhoz. A szennyeződés elkerülésének érdekében rendkívüli gondossággal járjon el. Futtatási mennyiség: Valamennyi készlet elegendő reagenst tartalmaz négy darab 12 mintás futtatáshoz, amelyek kivitelezhetőek külön-külön vagy párhuzamosan. Valamennyi, legfeljebb 24 mintát és kontrollt tartalmazó futtatásnak egy CTM (–) C, HBV L(+)C és HBV H(+)C kontrollt kell tartalmaznia (lásd „Minőség-ellenőrzés” rész). Az amplifikációs és kimutatási reagensek 24 tesztre elegendő, kétszer használatos palackokban vannak. A reagensek leghatékonyabb felhasználása céljából a mintákat és a kontrollokat a 12 többszörösének megfelelő tételekben kell feldolgozni.
Minta- és kontroll-előkészítés MEGJEGYZÉS: Fagyasztott szérum vagy plazma minták használatakor tegye a mintákat szobahőmérsékletre, amíg azok teljesen fel nem olvadnak, majd felhasználás előtt vortexelje őket 5–10 másodpercig. MEGJEGYZÉS: Felhasználás előtt hagyja a reagenseket, hogy elérjék a szobahőmérsékletet. A tisztítási reakciók megkezdése előtt fűtse fel a fűtőblokko(ka)t 70 °C (± 2 °C), és a vízfürdőt 50 °C (± 2 °C) hőmérsékletre.
03584933044-07HU
12
Doc Rev. 13.0
A. Reagens-előkészítés MEGJEGYZÉS: A lízis/kötő munkaoldatot csak azután készítse el, amikor valamennyi mintát és kontrollt 15–30 percig állni hagyta, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet. 1. Készítse el az inhibitor eltávolító puffert 20 ml 96–100% etanol inhibitor eltávolító pufferhez (IRB) pipettázásával. A cső 5–10-szeri döntögetésével keverje össze az oldatot. Ez a feloldott inhibitor eltávolító puffer 48 teszthez elegendő. 2. Készítse el a mosópuffert 80 ml 96–100% etanol mosópufferhez (WASH) pipettázásával. A cső 5–10-szeri döntögetésével keverje össze az oldatot. Ez elegendő feloldott mosópuffer 48 teszthez. 3. Melegítse elő az eluáló puffert (ELB) 70 °C (± 2 °C) hőmérsékleten egy 2,0 ml-es csavarkupakos centrifugacsőben. Több csövet is használhat. A mintánkénti eluáló térfogat 75 μl. Melegítse elő az alábbi táblázatban felsorolt, a vizsgálatok számának megfelelő térfogatot. Ismétlések száma
4.
Reagens
12
24
Eluáló puffer (ml)
2,0
4,0
Pipettázza az alábbi táblázatban felsorolt, a vizsgálatok számának megfelelő térfogatú izopropanolt egy tiszta steril csőbe. Ismétlések száma Reagens
12
24
Izopropanol (ml)
5,0
10,0
5.
Pipettázzon 0,5 ml eluáló puffert (ELB) a hordozó RNS-hez (CAR). Helyezze vissza a lezárót; fordítsa meg a csövet, majd vortexelje addig, amíg valamennyi hordozó RNS fel nem oldódik. A feloldott hordozó RNS 24 teszthez elegendő. A feloldott hordozó RNS fel nem használt térfogata -15 és -25 °C között legfeljebb 30 napig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik.
6.
Pipettázzon 5,0 ml eluáló puffert (ELB) a proteináz K-hoz (PK). Helyezze vissza a lezárót; fordítsa meg a csövet, majd vortexelje addig, amíg valamennyi proteináz K fel nem oldódik. A feloldott proteináz K 24 teszthez elegendő. A feloldott proteináz K fel nem használt térfogata -15 és -25 °C között legfeljebb 30 napig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik.
7.
Készítse el a lízis/kötő munkaoldatot az alábbiak szerint úgy, hogy a feldolgozandó minták és kontrollok számának megfelelően a következő táblázatban felsorolt térfogatokat pipettázza: Ismétlések száma Reagensek
12
24
Lízis/kötő puffer (ml)
7,0
14,0
Hordozó RNS (μl)
140
280
HBV QS (μl)
39
78
Proteináz K (ml)
1,4
2,8
MEGJEGYZÉS: A HBV QS térfogata meghatározott a COBAS® TaqMan® HBV Test vizsgálatra. MEGJEGYZÉS: A feloldva fagyasztott hordozó RNS vagy proteináz K használata esetén olvassza fel szobahőmérsékleten, és többször döntögesse át használat előtt. • Mérje a lízis/kötő puffer jelzett térfogatát egy tiszta steril 50 ml-es csőbe. • Adja a feloldott hordozó RNS jelzett térfogatát a lízis/kötő puffert tartalmazó csőhöz. • Vortexelje a HBV QS reagenst 3-5 másodpercig, és adja a HBV QS jelzett térfogatát a lízis/kötő puffert és a feloldott hordozó RNS-t tartalmazó csőhöz. • Csavarja rá a kupakot a csőre, majd 10–15-szöri döntögetéssel keverje össze. Vortexelni TILOS a vortexelés buborékképződést okoz az oldatban. • Adja a feloldott proteináz K jelzett térfogatát a lízis/kötő puffert tartalmazó csőhöz. • Csavarja rá a kupakot a csőre, majd 10–15-szöri döntögetéssel keverje össze. Vortexelni TILOS a vortexelés buborékképződést okoz az oldatban. A proteináz K-nak a lízis/kötő pufferhez való hozzáadását és elkeverését követően azonnal kezdje meg a lízis/kötő munkaoldat adagolását. A fel nem használt lízis/kötő puffer (LYS) 15–25 °C-on legfeljebb 30 napig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. A fel nem használt lízis/kötő munkaoldatot ki kell dobni. 03584933044-07HU
13
Doc Rev. 13.0
B. Minta- és kontroll-előkészítés MEGJEGYZÉS: Aeroszol-rezisztens hegyekkel ellátott állítható pipetták használata javasolt ehhez a művelethez. MEGJEGYZÉS: Az 1., 14., 16., 19. és 22. lépésekhez megfelelő méretű steril kombi-hegyekkel ellátott ismétlő pipetta használható. Mindamellett különös gondot kell fordítani a reagensek kiloccsanásának és a keresztszennyeződés elkerülésére. MEGJEGYZÉS: A teljes eljárás során kerülje el, hogy lízis/kötő munkaoldat, minta, kontroll és izopropanol kerüljön a lyukak karimájánál a lyuk és a fedél közti lezáró területre. MEGJEGYZÉS: A kesztyű pontosan illeszkedjen a felhasználó kezére. Többször is cseréljen kesztyűt, különösen a pozitív kontrollok kezelése, valamint a lízisállvány teli csöveinek felnyitása után. Soha ne érjen belülről a fedőkhöz (például a nyitás vagy zárás során). MEGJEGYZÉS: A kit kontrolljainak és a betegminták kezelése során először a negatív kontrollt töltse be, azután következzenek a pozitív kontrollok. 1. Pipettázzon 625 μl lízis/kötő munkaoldatot a lízisállvány minden egyes lyukába (I, átlátszó). Kerülje el, hogy cseppek kerüljenek a lyukak karimájánál a lyuk és a fedél közti lezáró területre. Óvatosan nyomja le a fedeleket fedő állásba. Ne rápattintós technikát alkalmazzon. 2. Egy alkalommal egy lyukat kinyitva pipettázzon körültekintően 500 μl mintát vagy kontrollt a megfelelő lyukba. Kerülje el, hogy cseppek kerüljenek a lyukak karimájánál a lyuk és a fedél közti lezáró területre. Minden minta vagy kontroll hozzáadása után a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a lyukat. 3. Valamennyi minta és kontroll bemérését követően mintegy 10 másodperces vortexeléssel keverje meg a feltöltött lízisállványt. Ne vortexeljen túl erőteljesen. Vizuálisan ellenőrizze, hogy a vortexelés során valamennyi lyuk jól meg lett keverve. 4. Óvatosan helyezze a lízisállványokat előmelegített 50 °C (± 2 °C)-os vízfürdőbe, kerülje el a fröccsenést. Inkubálja 10 percig a lízisállványt. Inkubáció alatt a lízisállvány bele kell, hogy merüljön a vízbe, de nem szabad lebegnie benne. Bizonyosodjon meg arról, hogy a lízisállvány tetejének felszíne a lyukak között szárazon marad az inkubáció alatt. Gondosan törölje szárazra a lízisállvány tetejét és alját is, miután a vízfürdőből eltávolította. 5. Centrifugálja a roncsoló állványt a mikro-titer lemezcentrifugában 10–20 másodpercig 4600 x g-re beállított. A centrifuga esetleg nem éri el a beállított sebességet. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 6. Egyszerre egy lyukat nyisson ki úgy, hogy a rápattintott fedő sarkára gyakorolt gyenge nyomással engedje fel azt, majd emelje fel a lyukról, és pipettázzon 250 μl izopropanolt minden egyes lyukba. Minden hozzáadás után a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a lyukat. MEGJEGYZÉS: Az izopropanol térfogata specifikus minden COBAS® TaqMan® Test vizsgálatra. 7. Szemmel ellenőrizze, hogy minden állvány szorosan le van zárva. Keverje össze a mintákat az állvány háromszori fordítgatásával, majd vortexelje az állványt mintegy 10 másodpercig. Ne vortexeljen túl erőteljesen. Vizuálisan ellenőrizze, hogy a vortexelés során valamennyi lyuk jól meg lett keverve. 8. Centrifugálja a roncsoló állványt a mikro-titer lemezcentrifugában 10–20 másodpercig 4600 x g-re beállított. A centrifuga esetleg nem éri el a beállított sebességet. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 9. Egyszerre egy lyukat nyisson ki úgy, hogy a rápattintott fedő sarkára gyakorolt gyenge nyomással engedje fel azt, majd emelje fel a lyukról, és pipettázzon 750 μl minta- vagy kontrollkeveréket a filtercsőállvány (II, sárga) rögzített hulladék állvánnyal (fehér) megfelelő lyukaiba. Minden minta vagy kontroll keverék hozzáadása után a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a lyukat. 10. Valamennyi minta és kontroll bemérését követően centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 2 percig 4600 × g-n a mikrotiter lemezcentrifugában. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 11. Egyszerre egy lyukat nyisson ki úgy, hogy a rápattintott fedő sarkára gyakorolt gyenge nyomással engedje fel azt, majd emelje fel a lyukról, és pipettázza a maradék minta- vagy kontrollkeveréket a filtercsőállvány megfelelő lyukaiba. Minden minta vagy kontroll keverék hozzáadása után a sarkánál kezdve óvatosan rányomva zárja le a lyuk fedelét, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és pattintsa rá a fedőt. Dobja ki megfelelő módon a lízisállványt. 03584933044-07HU
14
Doc Rev. 13.0
12.
Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 2 percig 4600 × g-n a mikrotiter lemezcentrifugában. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 13. A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el a szűrőcsőállványt a hulladék állványról. Dobja ki a hulladék állványt. Cserélje ki egy új hulladék állvánnyal, és pattintsa a szűrőcsőállványt a hulladék állványra. 14. Nyissa fel a szűrőcsőállvány valamennyi fedelét, és pipettázzon be 400 μl inhibitor eltávolító puffert (IRB) minden egyes lyuk oldala mentén. Ne érjen a lyukak oldalához. Miután valamennyi lyukhoz hozzáadta az inhibitor eltávolító puffert, a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a fedőt. 15. Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 2 percig 4600 × g-n a mikrotiter lemezcentrifugában. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 16. Nyissa fel a szűrőcsőállvány valamennyi fedelét, és pipettázzon be 700 μl mosópuffert (WASH) minden egyes lyuk oldala mentén. Ne érjen a lyukak oldalához. Miután valamennyi lyukhoz hozzáadta a mosó puffert, a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a fedőt. 17. Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 2 percig 4600 × g-n a mikrotiter lemezcentrifugában. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 18. A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el a szűrőcsőállványt a hulladék állványról. Dobja ki a hulladék állványt. Cserélje ki egy új hulladék állvánnyal, és pattintsa a szűrőcsőállványt a hulladék állványra. 19. Nyissa fel a szűrőcsőállvány valamennyi fedelét, és pipettázzon be 700 μl mosópuffert minden egyes lyuk oldala mentén. Ne érjen a lyukak oldalához. Miután valamennyi lyukhoz hozzáadta a mosó puffert, a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a fedőt. 20. Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 3 percig 4600 × g-n a mikrotiter lemezcentrifugában. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 21. A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el a szűrőcsőállványt a hulladék állványról. Helyezze a szűrőcsőállványt az eluáló állványra (IIIA, kék), és pattintsa a szűrőcsőállványt az eluáló állványra. Dobja ki megfelelő módon a hulladék állványt. 22. Nyissa fel valamennyi fedelet a szűrőcsőállványon, és pipettázzon 75 μl előmelegített eluáló puffert (ELB) minden egyes szűrő közepére anélkül, hogy a szűrőhöz érne. MEGJEGYZÉS: Ne az üreg oldala mentén adagolja az eluáló puffert. Miután valamennyi lyukhoz hozzáadta az eluáló puffert, a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a lyukat. 23. Inkubálja az eluáló állványt szobahőmérsékleten az eluáló puffernek az utolsó lyukhoz való hozzáadását követően legalább 3 percig, a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a lyukat. 24. Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 3 percig 4600 × g-n a mikrotiter lemezcentrifugában. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 25. A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el a szűrőcsőállványt az eluáló állványról. Dobja ki megfelelő módon a szűrőcsőállványt. 26. Helyezze az állvány fedelet (IIIB, kék) az eluáló állványra (IIIA, kék). Nyomja le határozottan, és pattintsa a kapcsokat az eluáló állványra. A sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le valamennyi fedőt. 27. A feldolgozott minták és kontrollok közvetlenül PCR-re kerülnek felhasználásra. A feldolgozott minták és kontrollok 50 μl-ét használja amplifikálásra. A minta- és kontroll-előkészítést követő 3 órán belül adja a feldolgozott mintákat és kontrollokat a master mix munkaoldathoz. Ha a feldolgozott minták és kontrollok nem kerülhetnek felhasználásra az előkészítésüktől számított 3 órán belül, akkor tárolhatja a feldolgozott mintákat és kontrollokat 2–8 °C-on legfeljebb 24 óra hosszat a lefedett eluáló állványban vagy -20 °C-ra fagyasztva legfeljebb 1 hétig steril 2,0 ml-es csavarókupakos csövekben (pl. Sarstedt P/N: 72.694.006). A minták és kontrollok master mix munkaoldathoz adását követő 3 órán belül amplifikálja a mintákat és kontrollokat. 03584933044-07HU
15
Doc Rev. 13.0
Amplifikálás és kimutatás MEGJEGYZÉS: A K-hordozókat/K-tálca hordozókat és a K-hordozó/K-tálca hrdozó tartót 70%-os izopropanol oldattal nedvesített, szálmentes ruhával le kell törölni. C. Reagens-előkészítés MEGJEGYZÉS: A COBAS® TaqMan® HBV master mix (HBV MMX), a „Master Mix munkareagens” (MMX munkareagens) és a master mix munkareagens plusz feldolgozott minták és kontrollok fényérzékenyek. Ezek a reagensek fénytől védve tartandók. MEGJEGYZÉS: A COBAS® TaqMan® HBV master mix (HBV MMX) és a COBAS® TaqMan® mangánoldat (CTM Mn2+) oldatokat legalább 30 percig hagyni kell, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet a master mix munkareagens elkészítése előtt. MEGJEGYZÉS: Az MMX munkareagenst a minta- és kontroll-előkészítés befejeztével készítse el. MEGJEGYZÉS: Az MMX munkareagenst az elkészítést követő 2 órán belül fel kell használni. MEGJEGYZÉS: Ha egyszer a feldolgozott mintákat és kontrollokat a master mix munkareagenshez mérte, akkor az amplifikálást 3 órán belül meg kell kezdeni. 1. Hagyjon egy fiola HBV MMX és egy fiola CTM Mn2+ oldatokat legalább 30 percig, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet. 2. Helyezzen egy K-hordozót/K-tálca hordozót egy K-hordozó/K-tálca hordozó tartóba. 3. Helyezzen új K-csöveket vagy egy új K-tálcát a K-hordozóba/K-tálca hordozóba úgy, hogy ne érjen hozzá a K-csövek falához. MEGJEGYZÉS: Ha 24 csőnél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. K-tálca használatakor nincs szükség a PCR-készülék kiegyensúlyozására. 4. Távolítsa el a K-csövek kupakját, ha rendelkezésre áll, a K-cső kupakrögzítő segítségével. Helyezze a kupakokat a K-cső tárolóhelyén a tartóba. 5. Készítse el az MMX munkareagenst a következők szerint: 24 teszt esetén mérjen 191 μl CTM Mn2+ oldatot egy fiola HBV MMX reagenshez. Csavarja rá a kupakot az üvegre, és 10-szeri átfordítással keverje jól össze. Az MMX munkareagenst ne vortexelje. A MMX munkareagens fénytől védve tartandó, és 2 órán belül fel kell használni. 12 teszt esetén vegyen ki 660 μl HBV MMX reagenst és tegye egy 2 ml-es csőbe. Mérjen 90 μl CTM Mn2+ oldatot a HBV MMX reagenst tartalmazó 2 ml-es csőbe, csavarja rá a kupakot, majd 10-szeri döntögetéssel keverje jól össze. A MMX munkareagens fénytől védve tartandó, és 2 órán belül fel kell használni. A HBV MMX és CTM Mn2+ oldatok maradéka az eredeti fiolákban 2–8 °C-on tárolható. Felbontást követően a HBV MMX és CTM Mn2+ 2–8 °C-on 30 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. MEGJEGYZÉS: A CTM Mn2+ térfogata specifikus a COBAS® TaqMan® HBV Test vizsgálatra. 6.
Pipettázzon 50 μl MMX munkareagenst minden K-csőbe, vagy a K-tálca lyukaiba.
MEGJEGYZÉS: Fagyasztva tárolt minták és kontrollok használatakor az amplifikálást megelőzően olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten mielőtt a 7. lépéssel folytatná. 7.
Mérjen szűrős vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott mikropipettával minden egyes feldolgozott mintából vagy kontrollból 50 μl-t a megfelelő, MMX munkareagenst tartalmazó K-csőbe vagy a K-tálca lyukaiba. Minden mintát és kontrollt mikropipetta segítségével háromszori fel-le pipettázással óvatosan keverjen össze anélkül, hogy buborékokat okozna.
8.
Ismételje meg a 7. lépést minden egyes feldolgozott minta és feldolgozott kontroll esetében, amíg az összeset át nem vitte a K-csövekbe vagy a K-tálca lyukaiba. Használjon új hegyet minden egyes mintához és kontrollhoz. Szemmel ellenőrizze, hogy nincsenek-e buborékok, és szükség esetén távolítsa el azokat. Zárja le a K-csöveket vagy K-tálcát egy K-cső kupakrögzítő/K-tálca kupakozó eszköz segítségével. Szemmel ellenőrizze, hogy valóban a megfelelő térfogatok lettek-e összemérve.
9.
Az amplifikálást a mintáknak és kontrolloknak az MMX munkareagenst tartalmazó K-csövekbe/ K-tálcába való bemérésétől számított 3 órán belül meg kell kezdeni.
D. 1.
A COBAS® TaqMan® 48 Analizátor betöltése és működtetése Kapcsolja be a számítógépes munkaállomást, majd jelentkezzen be a Microsoft Windows operációs rendszerbe a megfelelő felhasználónévvel és jelszóval.
2.
Kapcsolja be a COBAS® TaqMan® 48 Analizátort. Ellenőrizze, hogy a készülék inicializálódik-e és használatra kész-e. Ha az előző futtatás(ok)ból K-hordozók vagy K-tálca-hordozók maradtak bármelyik PCR-készülékben, távolítsa el azokat a K-hordozó szállító segítségével.
03584933044-07HU
16
Doc Rev. 13.0
3.
Indítsa el az AMPLILINK szoftvert a számítógépen. A megfelelő felhasználóazonosítóval és jelszóval jelentkezzen be.
4.
Hogy megadja a K-hordozó vagy K-tálca hordozó vizsgálandó mintáinak sorrendjét, kattintson az Orders ikonra. Válassza ki a Sample fület, majd kattintson az New gombra és a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével vigyen be egy mintasorszámot. Válassza ki a COBAS® TaqMan® HBV Test vizsgálatdefiníciós fájlját. A TDF-ek neve és verziója a készlethez mellékelt termékinformációs kártyán található. Ismételje meg ezt mindegyik minta esetében. Kattintson a Save gombra.
MEGJEGYZÉS: Ha 24 csőnél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. 5. A minőség-ellenőrzési adatok beviteléhez kattintson az Orders ablakban a Quality Control fülre. Kattintson a New gombra, és a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével vigye be a készlet mellé biztosított COBAS® TaqMan® HBV Test kontroll értékkártyáról a vonatkozó adatokat. Adja meg a megfelelő mezőkbe a COBAS® TaqMan® HBV Test tételszámát, lejárati dátumát, az alacsony (+) és magas (+) kontroll tartományokat, valamint a tétel specifikus kalibrációs együtthatókat. Kattintson az “OK” gombra. 6. Az Orders ablakban a K-Carrier fülre kattintva rendeljen a futtatáshoz egy K-hordozó/K-tálca számot. A K-Carrier ablakban kattintson a New gombra. A K-Carrier ID jobb oldalán levő cellába a billentyűzet vagy vonalkódolvasó segítségével adja meg a K-hordozón/K-tálcán található vonalkódból a K-hordozó/K-tálca számát. Ha K-tálcát használ, jelölje ki a K-Tray négyzetet a K-Carrier ID mező alatt. Válassza ki a COBAS® TaqMan® HBV Test vizsgálatdefiníciós fájlját az ablak alsó részén lévő vizsgálati panelből. A TDF-ek neve és verziója a készlethez mellékelt termékinformációs kártyán található. MEGJEGYZÉS: Az ugyanezen K-hordozó azonosítóhoz rendelt korábbi futtatás eredményeit el kell fogadni. 7. A Worklist listában jelölje ki a Type (T) oszlop első sorát. Jelölje ki ezt a mezőt, majd a megjelenő legördülő listából válassza ki a kívánt kontrolltípust. Ezután kattintson kétszer a mintaazonosító mezőre ugyanabban a sorban. A LookUp Control ablak megjelenik valamennyi lehetséges kontrollt feltüntetve. Amikor a kontrollt kiválasztja, a megfelelő kalibrációs és kontroll értékek megjelennek a jobb alsó információs mezőben. Ismételje meg ezt a folyamatot valamennyi szükséges kontroll esetén. 8. Ha mintákat akar a Worklist munkalistához adni, kattintson kétszer az első pozícióra (sorra) a minta beviteléhez. Meg fog jelenni a hozzárendelt mintasorrendet tartalmazó Lookup Sample ablak. Egynél több sorszám kijelölését a Shift + Nyíl gombokkal végezheti el. Ellenőrizze, hogy minden sorszámhoz hozzárendelte-e a COBAS® TaqMan® HBV Test vizsgálatdefiníciós fájlt. A TDF-ek neve és verziója a készlethez mellékelt termékinformációs kártyán található. 9. A K-hordozóhoz/K-tálca hordozóhoz rendelt sorszámok mentéséhez kattintson a Save gombra. MEGJEGYZÉS: Ha 24 csőnél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. K-tálca használatakor nincs szükség a PCR-készülék kiegyensúlyozására. E. Amplifikálás és kimutatás 1. Válassza ki a System fül Systems ikonját; a PCR-készülék kinyitásához kattintson az Open gombra. Ha a PCR-készülék teteje teljesen kinyílott, és a Systems ablakban a “Ready to Load” felirat látható, emelje meg és nyissa ki a PCR-készülék fedelét. A K-hordozó/K-tálca hordozó transzporter segítségével vigye át a kupakkal lezárt, master mix munkareagenst és mintákat, illetve kontrollokat tartalmazó K-csövekkel/K-tálcával betöltött K-hordozót/K-tálca hordozót a PCR-készülékbe. Csukja le a készülék fedelét. 2.
A PCR-készülék tetejének zárásához és a futtatás elindításához kattintson a Start gombra a Systems ablakban a TC ikon alatt.
3.
A COBAS® TaqMan® 48 analizátor az amplifikálást és kimutatást automatikusan elvégzi.
03584933044-07HU
17
Doc Rev. 13.0
EREDMÉNYEK Eredmények kiszámítása A COBAS® TaqMan® 48 Analizátor automatikusan meghatározza a minta vagy a kontroll HBV DNS titerét. A HBV DNS titer nemzetközi egység [International Unit (IU)]/ml-ben vannak kifejezve. A HBV kópia/ml és a HBV nemzetközi egység (IU)/ml közti váltószám 5,82 kópia/IU a nukleinsav-amplifikációs technikákra (NAT) vonatkozó WHO HBV nemzetközi standardot (97/74629) alkalmazva. A COBAS® TaqMan® 48 Analizátor: •
Meghatározza a HBV DNS és a HBV mennyiségi standard DNS ciklus küszöbértékét (Ct).
•
Meghatározza a HBV DNS-titert a HBV DNS és HBV mennyiségi standard DNS küszöbértékek, valamint a tételspecifikus kalibrációs együtthatók alapján.
•
Meghatározza, hogy a számított HBV L(+)C és HBV H(+)C IU/ml titerek a megadott tartományba esnek-e.
Futtatás validálása – AMPLILINK 3.3-as és 3.4-es verzió Ellenőrizze az AMPLILINK szoftver eredmény ablakában vagy a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön futtatás érvényességéről. A futtatás akkor érvényes, ha a COBAS® TaqMan® HBV kontrollok egyike sem kap jelzőt. A futtatás nem érvényes, ha a COBAS® TaqMan® HBV kontrollok az alábbi jelzők bármelyikét kapják: Negatív kontroll: Jelző
Eredmény
NC_INVALID
Invalid
Magyarázat Érvénytelen eredmény vagy „érvényes” eredmény, amely nem volt negatív a HBV targetre
HBV alacsony pozitív kontroll: Jelző
Eredmény
LPCINVALID
Invalid
Magyarázat Érvénytelen eredmény vagy egy kontroll tartományon kívül esik
HBV magas pozitív kontroll: Jelző
Eredmény
HPCINVALID
Invalid
Magyarázat Érvénytelen eredmény vagy egy kontroll tartományon kívül esik
Ha a futtatás érvénytelen (invalid), ismételje meg a teljes futtatást, a minta- és kontroll-előkészítést, amplifikálást és kimutatást is beleértve. Az eredmények értékelése: Érvényes futtatáshoz ellenőrizzen minden mintát az eredménylapon, hogy kapott-e jelzőt vagy megjegyzést. Az alábbiak szerint értelmezze az eredményeket: ⇒
Egy érvényes futtatás mind érvényes, mind érvénytelen mintaeredményeket is tartalmazhat, az egyes mintákra vonatkozó jelzőktől és/vagy megjegyzésektől függően.
03584933044-07HU
18
Doc Rev. 13.0
A minta eredmények az alábbiak szerint értékelendőek: Titer eredmény
Magyarázat
Target Not Detected
A HBV kritikus küszöbérték meghaladja a vizsgálati korlátot, vagy nincs HBV küszöbérték. Adja ki az eredményt, mint „Nincs kimutatható HBV DNS”.
< 6.00E+00 IU/mL
A számított IU/ml a vizsgálat kimutatási határa alatt van. Adja ki az eredményeket, mint „HBV DNS kimutatható, kevesebb, mint 6 HBV DNS IU/ml”.
≥ 6.00E+00 IU/mL és < 2.90E+01 IU/mL
A számított IU/ml eredmények a vizsgálat lineáris tartományának alsó határa alatt vannak. Ezek az eredmények nagyfokú szórást mutatnak, és ezért nem véleményezhetőek pontosnak. Ezek az eredmények fokozott óvatossággal értékelendőek.
≥ 2.90E+01 IU/mL és ≤ 1.10E+08 IU/mL
A 29 IU/ml-nél nagyobb vagy egyenlő és 1,10E+08 IU/ml-nél kisebb vagy egyenlő számított eredmények belül esnek a vizsgálat lineáris tartományán.
> 1.10E+08 IU/mL
A számított IU/ml a vizsgálat mérési tartománya felett van. Adja ki az eredményeket, mint „nagyobb, mint 1,10E+08 HBV DNS IU/ml”. Amennyiben ilyen minták mennyiségi eredményeire van szükség, az eredeti mintából HBVnegatív humán plazmával vagy szérummal (az eredeti minta mátrixától függően) hígítást kell készíteni, és megismételni a vizsgálatot. Szorozza meg a mért eredményt a hígítási faktorral.
MEGJEGYZÉS: A vizsgálat mérési tartománya feletti minták, amelyek „QS_INVALID” jelzővel ellátott érvénytelen (Invalid) eredményt adnak, nem adhatók úgy ki, mint > 1,10E+08 IU/ml. Az eredeti mintát HBV-negatív humán plazmával vagy szérummal (az eredeti minta mátrixától függően) való hígítást követően újra kell tesztelni. Szorozza meg a mért eredményt a hígítási faktorral.
03584933044-07HU
19
Doc Rev. 13.0
MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS Valamennyi 24 mintából és kontrollból álló futtatásnak egy CTM (–) C, egy HBV L(+)C és egy HBV H(+)C kell tartalmaznia. Mint minden új laboratóriumi eljárás esetében, a vizsgálatot végző használjon további házon belüli kontrollokat minden alkalommal, amíg az eljárás kivitelezését nagyfokú megbízhatósággal nem képes elvégezni. Nincs előírás a kontrollok K-hordozóban/K-tálcában való elhelyezkedését illetően. Ellenőrizze a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön a futtatás érvényességéről. Negatív kontroll A CTM (–) C kontrollnak “Target Not Detected” eredményt kell adnia, azaz a HBV DNS kritikus küszöbérték meghaladta a vizsgálat korlátait, vagy nincs HBV DNS küszöbérték, ugyanakkor a HBV belső kontroll DNS érvényes küszöbértékkel rendelkezik. Ha a CTM (–) C kontroll nem felel meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás érvénytelen. A teljes eljárást (minta- és kontroll-előkészítés, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha a CTM (–) C kontroll következetesen nem érvényes, vegye fel a kapcsolatot a Roche helyi szervizével. Pozitív kontrollok A HBV L(+)C és HBV H(+)C kontrollokhoz tartozó kijelölt tartomány specifikus minden egyes tételre, és a kittel adott COBAS® TaqMan® HBV Test kontroll értékkártyán van feltüntetve. Ezek a tartományok felkerülnek az AMPLILINK szoftver Vezérlőegységére. A HBV L(+)C és HBV H(+)C kontrollok HBV DNS IU/ml értékeinek a készlettel adott COBAS® TaqMan® HBV Test kontroll értékkártyán feltüntetett tartományba kell esnie. Ha egyik vagy mindkettő pozitív kontroll nem felel meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás érvénytelen. A teljes eljárást (minta-és kontroll-előkészítés, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha egyik vagy mindkettő pozitív kontroll számított HBV DNS titere rendszeresen kívül esik a kijelölt tartományon, kérjen technikai segítséget a helyi Roche-irodától. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS ÓVINTÉZKEDÉSEK 1.
Mint minden vizsgálati eljárásnál, a helyes laboratóriumi technika alapvető a vizsgálat megfelelő kivitelezéséhez. A vizsgálat magas analitikai érzékenysége miatt rendkívüli gondossággal kell ügyelni a reagensek, illetve az amplifikálási elegyek tisztaságának megőrzésére. Minden reagens tisztaságát szigorúan ellenőrizni kell. Dobjon ki bármilyen gyanús reagenst.
ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS KORLÁTOZÁSOK 1.
A vizsgálatot humán szérum vagy EDTA véralvadásgátlóval gyűjtött humán plazma használatára validálták. Más típusú minták vizsgálata téves, álnegatív vagy álpozitív eredménnyel járhat.
2.
A megbízható eredmény a megfelelő mintalevételen, -transzporton, -tároláson és -feldolgozáson múlik.
3.
A COBAS® TaqMan® HBV master mixben jelen lévő AmpErase enzim csökkenti az amplikonszennyezés kockázatát. Ugyanakkor a HBV-pozitív kontrollokból vagy klinikai mintákból származó szennyeződés csak helyes laboratóriumi gyakorlattal és a Használati utasításban meghatározott eljárások gondos betartásával kerülhető el.
4.
A terméket csak a PCR-technikák terén képzett személy használhatja.
5.
Ez a termék csak COBAS® TaqMan® 48 Analizátorral használható.
6.
A HBV DNS kimutatása a mintában jelen lévő vírus partikulumok jelenlététől függ, ezért befolyásolhatják a mintalevételi módszerek és betegfaktorok (azaz kor, tünetek megléte és/vagy a fertőzés stádiuma).
7.
Ritkán bár, de előfordulhat, hogy a vizsgálat primerei és/vagy próbái által lefedett virális genom nagyfokban konzervált régióiban lévő mutációk következtében a vírusmennyiség kevesebbnek adódik, vagy a vírus kimutatása sikertelen lesz.
8.
A technológiák különbözősége miatt javasolt, hogy az egyik technológiáról a másikra való áttéréskor a felhasználók végezzenek korrelációs laboratóriumi vizsgálatokat, hogy a technológiák közötti különbség számszerűsíthető legyen.
03584933044-07HU
20
Doc Rev. 13.0
ZAVARÁST OKOZÓ ANYAGOK A mintákban lévő lipidek, bilirubin, albumin és hemoglobin emelkedett szintjei nem zavarják a vizsgálat HBV DNS mennyiségi meghatározását. Az alábbi gyógyszerkomponensekről ugyancsak kimutatták, hogy nem zavarják a vizsgálat HBV DNS mennyiségi meghatározását. Nukleotid DNS-polimeráz inhibítorok Adefovir dipivoxil Tenofovir disoproxil fumarát
Nukleozid reverz transzkriptáz és DNS-polimeráz inhibitorok Lamivudin Zidovudin Zalcitabin Stavudin Abacavir
HIV-proteáz inhibitorok Indinavir Ritonavir Nelfinavir Saquinavir Amprenavir Lopinavir/Ritonavir
Non-nukleozid HIV reverz transzkriptáz inhibitorok Nevirapin Efavirenz
Immune modulátorok Interferon alfa-2a Interferon alfa-2b
HIV fúzió inhibitor Enfuvirtid
CMV terápiás vegyületek Ganciclovir Valganciclovir-hidroklorid Acyclovir Valacyclovir-hidroklorid
03584933044-07HU
21
Doc Rev. 13.0
NEM KLINIKAI ÉRTÉKELÉS Vizsgálat leírása A COBAS® TaqMan® HBV Test kimutatási határát klinikai HBV-minták (A és D genotípus) HBV-negatív humán EDTA-s plazmában és szérumban végzett hígítási sorainak vizsgálatával határozták meg. A COBAS® TaqMan® HBV Test pontosságát és linearitását klinikai HBV-minták (A és D genotípus) csak HBV-negatív humán EDTA-s plazmában végzett hígítási sorainak vizsgálatával határozták meg. A HBV kópia/ml koncentrációját a klinikai mintákban a COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR Test segítségével határozták meg a vizsgálati tartományba eső hígításokra, majd megszorozták a hígítási faktorral. A hígítások koncentrációját átváltották IU/ml-be a WHO Nemzetközi HBV DNS unit/ml és kópia/ml közötti konverziós faktor segítségével, amelyet a COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR Test és a COBAS® TaqMan® HBV Test használatával határoztak meg. A.
Kimutatási határ
Az alábbi vizsgálatok megmutatták, hogy a COBAS® TaqMan® HBV Test 95% feletti pozitivitási aránnyal már 5,9 IU/ml koncentrációban képes kimutatni HBV DNS-t EDTA-s plazmában és szérumban. Probit analízissel végzett meghatározás szerint a 95%-nál nagyobb pozitivitási aránnyal kimutatható HBV DNSkoncentráció EDTA-s plazmában és szérumban rendre 4,8 IU/ml és 6,7 IU/ml.
1. táblázat A COBAS® TaqMan® HBV Test kimutatási határa EDTA-s plazmában Névleges bevitel (HBV DNS IU/ml) 12,9
Ismétlések száma
Pozitívok száma
Pozitivitási arány
120
120
100%
8,6
120
118
98%
6,0
120
119
99%
3,4
120
105
88%
1,7
120
99
83%
0,9
120
67
56%
0,4
120
57
48%
Probit 95% találati arány
4,8 IU/ml [95%-os konfidenciaintervallum: 3,1 - 9,9 IU/ml]
2. táblázat A COBAS® TaqMan® HBV Test kimutatási határa szérumban Névleges bevitel (HBV DNS IU/ml)
Ismétlések száma
Pozitívok száma
Pozitivitási arány
12,9
120
120
100%
8,6
117
110
94%
6,0
114
111
97%
3,4
120
103
86%
1,7
114
73
64%
0,9
120
47
39%
0,4
120
28
23%
Probit 95% találati arány B.
6,7 IU/ml [95%-os konfidenciaintervallum: 4,7 - 11,1 IU/ml]
Pontosság
Egy adott futtatáson belüli, a futtatások közötti és a teljes pontosságot a CLSI EP5-A irányelvben („Klinikai kémiai eszközök pontosságának értékelése”) definiált módszerekkel összhangban értékelték.”33 Ez az eljárás lehetővé teszi mind az egy adott futtatáson belüli, mind a teljes pontosság meghatározását egyetlen több napon át több vizsgálóval végzett vizsgálat elvégzésével. Minden minta 3 ismétlését tartalmazó futtatást végeztek 15 napon keresztül naponta. Minden egyes minta keresztülment a teljes COBAS® TaqMan® HBV Test eljáráson (mintaelőkészítés, amplifikálás és detektálás). Ezért az itt közölt pontosság a vizsgálati eljárás valamennyi aspektusát reprezentálja. A vizsgálatot a COBAS® TaqMan® HBV Test három reagenstételével végezték, az összesített eredményeket a 3. táblázat (HBV DNS IU/ml) és a 4. táblázat (HBV DNS log10 IU/ml) mutatja.
03584933044-07HU
22
Doc Rev. 13.0
3. táblázat A COBAS® TaqMan® HBV Test pontossága (IU/ml) Minta
1
2
3
4
5
6
Átlagos HBV DNS 1,07E8 5,33E7 1,04E7 8,52E5 9,28E4 1,21E4 titer (IU/ml)
7
8
9
10
1200
111
49
14
Egy futtatáson belüli CV
19%
10%
12%
7%
14%
16%
14%
22%
27%
50%
Futtatások közötti CV
11%
14%
12%
14%
16%
18%
18%
26%
17%
22%
Teljes CV
23%
17%
17%
16%
22%
24%
22%
34%
32%
54%
Ismétlések teljes száma
132
134
134
135
135
134
135
135
135
135
8
9
10
Minta Átlagos HBV DNS titer (Log10 IU/ml)
4. táblázat A COBAS® TaqMan® HBV Test pontossága (log10 IU/ml) 1 2 3 4 5 6 7 8,02
7,72
7,01
5,92
4,94
4,06
3,07
2,03
1,67
1,05
Egy futtatáson belüli szórás
0,07
0,04
0,05
0,03
0,21
0,18
0,06
0,09
0,11
0,59
Futtatások közötti szórás
0,05
0,06
0,05
0,06
0,07
0,07
0,08
0,10
0,07
0,00
Teljes szórás
0,08
0,07
0,07
0,07
0,22
0,19
0,10
0,13
0,13
0,59
C.
Lineáris tartomány
Ahogy az a 8. ábrán látható, a COBAS® TaqMan® HBV Test eredményét lineárisnak találták 29 (Log10 = 1,46) HBV DNS IU/ml-től legalább 1,10E8 (Log10 = 8,04) HBV DNS IU/ml-ig. A vizsgálatot a COBAS® TaqMan® HBV Test három reagenstételével végezték, hígításonként 131-135 ismétléssel.
High Pure System Viral Nucleic Acid Kit / COBAS® TaqMan® HBV Test eredményei Log10 (HBV DNS IU/ml)
8. ábra A COBAS® TaqMan® HBV Test linearitása 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00
y = 1,0124x - 0,2358 2 R = 0,9989 Hibatartomány = 1 standard deviáció (szórás)
4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 -1,00 0,00
03584933044-07HU
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
Névleges koncentráció Log 10 (HBV DNS IU/ml)
23
Doc Rev. 13.0
D.
Inkluzivitás
Hét HBV genotípus kategóriát javasoltak a genom 8%-ot meghaladó nukleotid divergenciája alapján34,35. Ezek a genotípusok az ábécé nagybetűivel vannak jelölve A-tól G-ig. A HBV genotípusok jellemző földrajzi megoszlást mutatnak36. A COBAS® TaqMan® HBV Test HBV-genotípusokon való kivitelezését HBV A-G genotípusokból származó reprezentatív szekvencia inzerteket tartalmazó, 22 darab tisztított, linearizált és mennyiségileg meghatározott plazmid DNS-ek analízisével értékelték (5. táblázat). Ezen felül egy az 1896-os nukleotid pozícióban a szokásos G:A pre-core mutációt reprezentáló plazmidot is teszteltek. Az egyes plazmid DNSeket 15, 1500, 1,5E5 és 1,5E8 kópia/PCR koncentrációkra hígították. Minden egyes hígítást QS DNS-sel együtt amplifikáltak, és három párhuzamos mintaként vizsgáltak a COBAS® TaqMan® HBV Test segítségével. Valamennyi plazmid titerét összehasonlították kontroll plazmid DNS (pc) titerével. A COBAS® TaqMan® HBV Test ekvivalens eredményt adott mind a 23 plazmid DNS esetén (9. ábra); valamennyi genotípus és a pre-core mutáns kópiaszámai jól egyeztek egymással és a kontroll plazmid DNS-sel.
5. táblázat COBAS® TaqMan® HBV Test Inkluzivitás - Tipizált plazmid DNS vizsgálata Plazmid jelölése p8423-c1 p1115-c1 p3952-c1 p4199-c2 p1764-c1 p1767-c1 p3958-c1 p830-c1 p3982-c1 p1786-c1 p11549-1 p3872-c1 p1103-c1 p3953-c2 p18-c1 p30893-5 p4244-c1 p3217-c1 p3963-c2 p9203-c1 p479-c1 p1009-c1 p00042975-4 pIT1896
03584933044-07HU
Genotípus Eredeti minta származási helye A India A Burundi A Kamerun A Norvégia B Kína B Kína B Kelet-Ázsia B Társaság-szigetek B Vietnam C Kína C Banglades D Irán D Tunézia D Észak-Afrika D Svédország D Svédország D Dánia E Szenegál E Nigéria F Kolumbia F Venezuela F Spanyolország G Egyesült Államok Pre-core Olaszország
24
Doc Rev. 13.0
Átlagos Log
10
HBV DNS kópia/PCR (n=3)
9. ábra A COBAS® TaqMan® HBV Test teljesítménye HBV A-G genotípusokon és egy pre-core mutánson 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0
A
B
C
D
E
F
G
Kontroll
Plazmid Pre-core mutáns
E.
Klinikai specificitás
A COBAS® TaqMan® HBV Test klinikai specificitását véradókból származó HBV-negatív szérum és EDTAs plazma analízisével határozták meg. Összesen 220 (110 egyedi EDTA-s plazma és 110 szérum) mintát teszteltek, amelyek nem reaktívak voltak HBsAg-re és anti-HBc-re. Valamennyi minta negatív volt HBV DNS-re. Ezen eredmények alapján a COBAS® TaqMan® HBV Test klinikai specificitása 100%. F.
Analitikai specificitás
A COBAS® TaqMan® HBV Test analitikai specificitását víruskultúra HBV-negatív humán EDTA-s plazmához való hozzáadásával, vagy fertőzött betegekből származó minták analízisével tesztelték (6. táblázat). A vizsgált nem-HBV DNS vagy RNS vírusok egyike sem adott pozitív HBV DNS eredményt.
6. táblázat Analitikai specificitás minták Plazmához adott vírus Adenovírus 7-es típus Cytomegalovírus AD-169
Fertőzött betegből származó minta (n) Cytomegalovírus-fertőzött beteg (2) Epstein-Barr vírussal (EBV) fertőzött beteg (2)
Epstein-Barr vírus (RAJI Burkitt lymphoma sejtek) Hepatitis A vírus, PA 21 Herpes simplex vírus 1, MacIntyre Herpes simplex vírus 2, MS HTLV-1 sejtek Influenza A vírus, A/Hong Kong/8/68 Influenza B vírus, B/R75 Varicella-Zoster vírus, Ellen West Nile vírus
03584933044-07HU
Hepatitis A vírussal fertőzött beteg (2) Hepatitis C vírussal fertőzött beteg, 4-es genotípus (1) Hepatitis C vírussal fertőzött beteg, 6a genotípus (1) HIV-1 fertőzött beteg (2)
25
Doc Rev. 13.0
G.
Teljesítmény a COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR Test vizsgálattal összehasonlítva
A COBAS® TaqMan® HBV Test teljesítményét a COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR Test vizsgálattal hasonlították össze HBV-fertőzött alanyokból származó szérum- és plazmaminták analízise révén. A minták származási helye a Teragenix (Fort Lauderdale, FL) és a Serologicals Corporation (Norcross, GA) volt. Összesen 65 mintát vizsgáltak két-két ismétléssel mindkét teszt segítségével, és összehasonlították az átlageredményeket. Azokat a mintákat, amelyek a lineáris tartomány fölé eső eredményt adtak, felhígították az analízis előtt, és az eredeti minta titerét úgy kapták meg, hogy az eredményt megszorozták a hígítási faktorral. A COBAS® TaqMan® HBV Test IU/ml-ben nyert titer eredményeit az 5,82 HBV DNS kópia/IU konverziós faktorral szorozva átváltották kópia/ml-re. Azokon a mintákon, amelyek mindkét teszttel legalább 500 kópia/ml-t tartalmaztak, lineáris regressziós analízist végeztek. A COBAS® TaqMan® HBV Test és a COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR Test vizsgálatokkal nyert eredmények nagyfokú korrelációt mutattak, ahogy azt a 10. ábra szemlélteti.
10. ábra A COBAS® TaqMan® HBV Test és a COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR Test közötti korreláció HBV-fertőzött betegekből származó plazma- és szérummintákon 10,0
y = 0,9327x + 0,4855 2 R = 0,977
8,0
Átlagos Log 10 HBV DNS kópia/ml
High Pure System Viral Nucleic Acid Kit / COBAS® TaqMan® HBV Test
9,0
7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR Test Átlagos Log 10 HBV DNS kópia/ml
03584933044-07HU
26
Doc Rev. 13.0
HIVATKOZÁSOK 1.
Lee. W. 1997. Hepatitis B Virus Infection. New England Journal of Medicine. 337:1733-1745.
2.
Beasley, R.P. 1988. Hepatitis B virus - the major etiology of hepatocellular carcinoma. Cancer. 61:1942-1956.
3.
Wong, D.H.K., Cheung, A.M., Orourke, K., et al. 1993. Effect of alpha-interferon treatment in patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B: a meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 119:312-323.
4.
Zuckerman, A.J. and Lavanchy, D. 1999. Treatment options for chronic hepatitis: antivirals look promising. British Medical Journal. 319:799-800.
5.
McMahon, B.J. 1998. Chronic carriers of Hepatitis B Virus who clear hepatitis B surface antigen: Are they really "off the hook"? Hepatology. 28:265-267.
6.
Huo, T., Wu, J., Lee, P., et al. 1998. Sero-clearance of hepatitis b surface antigen in chronic carriers does not necessarily imply a good prognosis. Hepatology 28:231-236.
7.
Niederau, C., Heintges, T., Lange, S., et al. 1996. Long-term follow-up of HBeAg-positive patients treated with interferon alfa for chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 334:1422-1427.
8.
Fattovich, G., Giustina, G., Realdi, G., et al. 1997. Long term outcome of hepatitis B e antigenpositive patients with compensated cirrhosis treated with interferon alfa. Hepatology. 26:1338-1342.
9.
Brown, J.L., Carman, W.F. and Thomas, H.C. 1992. The clinical significance of molecular variation within the hepatitis B virus genome. Hepatology. 15:144-148.
10.
Hoofnagle, J.H. 1990. Alfa-interferon therapy of chronic hepatitis B. recommendations. Hepatology. 11:S100-S107.
11.
Krogsgaard, K., Kryger, P., Aldershvile, J., et al. 1985. Hepatitis B virus DNA in serum from patients with acute hepatitis B. Hepatology. 5:10-13.
12.
Jardi, R., Buti, M., Rodriguez-Frias, F., et al. 1996. The value of quantitative detection of HBV-DNA amplified by PCR in the study of hepatitis B infection. Journal of Hepatology. 24:680-685.
13.
Niitsuma, H., Ishii, M., Miura, M., et. al. 1997. Low-level hepatitis B viremia detected by polymerase chain reaction accompanies the absence of HBe antigenemia and hepatitis in hepatitis B virus carriers. American Journal of Gastroenterology. 92:119-123.
14.
Ranki, M., Schatzl, H.M., Zachoval, R., et al. 1995. Quantification of hepatitis B virus DNA over a wide range from serum for studying viral replicative activity in response to treatment and in recurrent infection. Hepatology. 21:1492-1499.
15.
Mason, A.L., Xu, L., Guo, L., et al. 1998. Molecular basis for persistent hepatitis B virus infection in the liver after clearance of serum hepatitis B surface antigen. Hepatology. 27:1736-1742.
16.
Saito, T., Shinzawa, H., Uchida, T., et al. 1999. Quantitative DNA analysis of low-level hepatitis B viremia in two patients with serologically negative chronic hepatitis B. Journal of Medical Virology. 58:325-331.
17.
Brunetto, M.R., Oliveri, F., Rocca, G., et al. 1989. Natural course and response to interferon of chronic hepatitis B accompanied by antibody to hepatitis B e antigen. Hepatology. 10:198-202.
18.
Saracco, G., Mazella, G., Rosina, F., et al. 1989. A controlled trial of human lymphoblastoid interferon in chronic hepatitis B in Italy. Hepatology. 10:336-341.
19.
Perillo, R., Schiff, R., Davis, G., et al. 1990. A randomized controlled trial of interferon alpha-2b alone and after prednisone withdrawal for the treatment of chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 323:295-301.
20.
Perez, V., Tanno, H., Villamil, F., et al. 1990. Recombinant interferon alfa-2b following prednisone withdrawal in the treatment of chronic type B hepatitis. Hepatology. 11:S113-S117.
21.
Lai, C.-L., Ching, C.-K., Tung, S.K.-M., et al. 1997. Lamivudine is effective in suppressing Hepatitis B Virus DNA in Chinese Hepatitis B surface antigen carriers: A placebo-controlled trial. Hepatology. 25:241-244.
22.
Nagata, I., Colucci, G., Gregorio, G.V., et al. 1999. The role of HBV DNA quantitative PCR in monitoring the response to interferon treatment in chronic hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology. 30:965-969.
23.
Hadziyannis, S.J., Manesis, E.K. and Papakonstantinou, A. 1999. Oral ganciclovir treatment in chronic hepatitis B virus infection: a pilot study. Journal of Hepatology. 31:210-214.
03584933044-07HU
27
Current status and
Doc Rev. 13.0
24.
Marcellin, P., Chang, T.-T., Lim, S.G., et al. 2003. Adefovir dipivoxil for the treatment of Hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 348:808-816.
25.
Puchhammer-Stöckl, E., Mandl, C.W., Kletzmayr, J., et al. 2000. Monitoring the virus load can predict the emergence of drug-resistant hepatitis B virus strains in renal transplant patients during lamivudine therapy. Journal of Infectious Diseases. 181:2063-2066.
26.
Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carryover contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128.
27.
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S. and Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Bio/Technology 10:413-417.
28.
Heid, C.A., Stevens, J., Livak, J.K. and Williams, P.M. 1996. Real time quantitative PCR. Genome Research 6:986-994.
29.
Saldanha, J., Gerlich, W., Lelie, N., Dawson, P., Heermann, K., Heath, A. and the WHO Collaborative Study Group. 2001. An international collaborative study to establish a World Health Organization international standard for hepatitis B virus DNA nucleic acid amplification techniques. Vox Sanguinis 80:63-71.
30.
Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
31.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2005.
32.
International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.
33.
CLSI. Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guidelines. CLSI Document EP5-A Wayne, PA:CLSI, 1999.
34.
Okamoto, H., Tsuda, F., Sakugawa, H., Sastrosowignjo, R.I., Imai, M., Miyakawa, Y. and Mayumi, M. 1988. Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes. Journal of General Virology 69:2575-2583.
35.
Norder, H., Hammas, B., Löfdahl, S., Couroucé, A.M. and Magnius, L.O. 1992. Comparison of the amino acid sequences of hepatitis B surface antigen and genomic classification of the corresponding hepatitis B virus strains. Journal of General Virology 73:1201-1208.
36.
Norder, H., Hammas, B., Lee, S.-D., Bile, K., Couroucé, A.M., Mushahwar, I.K. and Magnius, L.O. 1993. Genetic relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin and natural variations in the primary structure of the surface antigen. Journal of General Virology 74:1341-1348.
03584933044-07HU
28
Doc Rev. 13.0
Dokumentum verzióinformációi Doc Rev. 11.0 06/2014
A hagyományos R és S mondatos veszélyre való figyelmeztetés elhelyezve. A „Minden jog fenntartva” felirat eltávolítva a szerzői jogi nyilatkozatból. A használati utasítás végén frissítve lettek a harmonizált szimbólumoldal leírásai. A védjegyekre vonatkozó megjegyzésekből a „ROCHE” törölve. Esetleges kérdésével forduljon a Roche helyi képviselőjéhez.
Doc Rev. 12.0 03/2015
Eltávolítottuk a veszély szimbólumokat, kulcsszavakat és kódokat a REAGENSEK részből. GTIN szimbólum és leírás hozzáadása a harmonizált szimbólumoldalon. A védjegyeket és szabadalmakat tartalmazó részt frissítettük, most már csak internetes hivatkozást tartalmaz. Esetleges kérdésével forduljon a Roche helyi képviselőjéhez.
Doc Rev. 13.0 06/2015
03584933044-07HU
Frissített AMPLILINK verziók, kézikönyvek, terminológia és operációs rendszer. Esetleges kérdésével forduljon a Roche helyi képviselőjéhez.
29
Doc Rev. 13.0
"
High Pure System Viral Nucleic Acid Kit gyártva: Roche Molecular Systems, Inc. 1080 US Highway 202 South Branchburg, NJ 08876 USA COBAS® TaqMan® HBV Test gyártója: Roche Molecular Systems, Inc. 1080 US Highway 202 South Branchburg, NJ 08876 USA
Distributed by
Roche Diagnostics (Schweiz) AG Industriestrasse 7 6343 Rotkreuz, Switzerland Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 68305 Mannheim, Germany Roche Diagnostics, SL Avda. Generalitat, 171-173 E-08174 Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Roche Diagnostics 201, boulevard Armand-Frappier H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877-273-3433)
Roche Diagnostics 2, Avenue du Vercors 38240 Meylan, France Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Viale G. B. Stucchi 110 20052 Monza, Milano, Italy Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, 249-1 2720-413 Amadora, Portugal Roche Diagnostica Brasil Ltda. Av. Engenheiro Billings, 1729 Jaguaré, Building 10 05321-010 São Paulo, SP Brazil
Védjegyek és szabadalmak Lásd: http://www.roche-diagnostics.us/patents
©2015 Roche Molecular Systems, Inc. 06/2015
(03584933001-15ENGL)
Doc Rev. 13.0
03584933044-07HU
03584933044-07
30
Doc Rev. 13.0
A következĘ szimbólumok használatosak a Roche PCR diagnosztikai termékek jelölésére.
Segédszoftver
In vitro diagnosztikai felhasználásra
Meghatalmazott képviselĘ az Európai Közösségben
Megadott tartomány alsó határa
Vonalkód adatlap
Gyártó
Lotszám
Sötétben tárolandó
Biológiai veszély
Tartalma
vizsgálathoz elegendĘ
Katalógusszám
Tárolási hĘmérséklet
SW
Olvassa el a használati útmutatót
Vizsgálatdefiníciós fájl TDF
Készlet összetevĘi
Megadott tartomány felsĘ határa
TerjesztĘ
Lejárati dátum
Csak IVD teljesítmény értékelésre
Globális kereskedelmi cikkszám
Ez a termék teljesíti az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökrĘl szóló 98/79/EK irányelv elĘírásait. Felhasználói technikai segítségnyújtás az Egyesült Államokban 1-800-526-1247
03584933044-07HU
31
Doc Rev. 13.0
