Használati utasítás
CINtec® PLUS Kit
A CINtec® PLUS Kit egy immunhisztokémiai assay, amely a p16 INK4a és Ki-67 fehérjék egyidejű, kvalitatív detektálására szolgál a méhnyakból származó szövetmetszetekben. A rendeltetése, hogy segítségként használják a vizsgált női populáción belüli magas fokozatú méhnyaki intraepithelialis lézió azonosításában, illetve az ASC-US Pap citológiai eredményű (nem meghatározott jelentőségű atipikus laphámsejtű) vagy LSIL (alacsony fokozatú intraepithelialis laphám léziójú) betegek alcsoportjában, vagy a pozitív magas rizikójú HPV teszteredményű betegek esetében.
9531 Roche mtm laboratories AG Sandhofer Straße 116 D-68305 Mannheim Germany www.cintec.info
50 2–8 °C
Tartalomjegyzék I. Termék neve ............................................................................................... 2 II. Felhasználási terület ................................................................................... 2 III. Összegzés és az eszköz leírása ................................................................. 2 Háttér................................................................................................................... 2 Klinikai jelentőség ................................................................................................ 3 Az eljárás elve ..................................................................................................... 5 IV. Reagensek .................................................................................................. 6 Biztosított anyagok .............................................................................................. 6 Tárolás ................................................................................................................ 8 Szükséges, de nem biztosított anyagok és reagensek ......................................... 8 Szükséges felszerelések ..................................................................................... 9 V. Figyelmeztetések és óvintézkedések .......................................................... 9 Figyelmeztetés .................................................................................................... 9 Vigyázat! ............................................................................................................ 10 VI. Eljárások ................................................................................................... 10 A citológiai minta előkészítése ........................................................................... 10 A minták festés előtti, hő által indukált epitóp visszanyerési kezelése ............... 12 Metszetfestési eljárások..................................................................................... 12 1. A reagens előkészítése .............................................................................. 12 1.1 Epitope Retrieval Solution ................................................................... 12 1.2 Wash Buffer......................................................................................... 13 1.3. Szubsztrát-kromogén oldatok (DAB és Fast Red)............................... 13 1.4. Kontrasztfestés ................................................................................... 14 1.5 Rögzítő közeg ..................................................................................... 14 2. Festési eljárás ....................................................................................... 14 2.1. A minta rehidrációja ............................................................................ 14 2.2. Epitóp visszanyerés ............................................................................ 15 2.3. Festési protokollok.............................................................................. 16 2.3.1. Autostainer műszerekre vonatkozó festési protokoll (Dako, LabVision)............................................................................... 16 2.3.2. Javasolt festési protokoll a Shandon Coverplate™ System berendezés esetén............................................................................. 18 2.4. Hematoxilinnel történő kontrasztfestés ............................................... 19 2.5 Rögzítés .............................................................................................. 20 VII. Minőség-ellenőrzés ................................................................................... 21 Pozitív kontroll ................................................................................................... 21 Negatív kontroll .................................................................................................. 21 A módszer ellenőrzése ...................................................................................... 21 VIII. Az eredmények értelmezése ..................................................................... 21 IX. Korlátozások ............................................................................................. 22 X. Teljesítményjellemzők ............................................................................... 23 XI. Hibaelhárítás ............................................................................................. 29 XII. Jelek.......................................................................................................... 33 XIII. Gyártó ....................................................................................................... 33 XIV. Átdolgozás állapota ................................................................................... 33 XV. Jogi nyilatkozat .......................................................................................... 33 1. melléklet: Szakirodalom .................................................................................... 34 2. melléklet: Táblázatok ........................................................................................ 36
REF 9531
1 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
I. Termék neve CINtec® PLUS Kit
II. Felhasználási terület Kizárólag in vitro diagnosztikai használatra. A CINtec® PLUS Kit egy immunhisztokémiai assay, amely a p16 INK4a és Ki-67 fehérjék egyidejű, kvalitatív detektálására szolgál a méhnyakból származó szövetmetszetekben. A rendeltetése, hogy segítségként használják a vizsgált női populáción belüli magas fokozatú méhnyaki intraepithelialis lézió azonosításában, illetve az ASC-US Pap citológiai eredményű (nem meghatározott jelentőségű atipikus laphámsejtű) vagy LSIL (alacsony fokozatú intraepithelialis laphám léziójú) betegek alcsoportjában, vagy a pozitív magas rizikójú HPV teszteredményű betegek esetében. A készletet orvosi citológiai laboratóriumokban történő használatra tervezték. A vizsgálati eredmények értelmezését képzett szakorvosnak kell elvégeznie a beteg kórtörténetével és a további elvégzett diagnosztikai tesztekkel összhangban.
III. Összegzés és az eszköz leírása Háttér Az eukarióta sejtekben a sejtosztódási ciklus folyamatának irányítására a szabályozott expressziók és a poszttranszlációs módosítások (pl. foszforiláció) komplex mintája van hatással, mint például a sejtciklust szabályozó proteinek. A p16INK4a fehérje fontos szerepet játszik az eukarióta sejtciklus ezen szabályozási mechanizmusában. Ez a retinoblasztóma fehérje (pRb) által közvetített G 1-Sfázis átmenet része, és a sejtciklus leállítását váltja ki a sejtdifferenciálódási folyamat során. Így a p16INK4a egy antiproliferatív hatást biztosít, amikor a normál sejtciklus folyamán expresszálódik. A véglegesen differenciálódott epithelialis sejtekben a p16INK4a expressziója annyira le van fékezve, hogy az immuncitokémiával jellemzően nem mutatható ki [lásd a 31. és 35. hivatkozást]. A Ki-67 a proliferációhoz társuló fehérje, amelyet a nucleusban kizárólag proliferáló sejtekkel lehet észlelni. A részletes sejtciklus analízis megmutatta, hogy a Ki-67 antigén észlelhető szinten van jelen az összes fázisban és a mitózisban, viszont a G0-fázis nyugalomban lévő vagy inaktív sejtjei nem expresszálják az antigént [lásd a 3. és 26. hivatkozást]. Ahogyan a p16INK4a-t túlexpresszáló sejtek csak azt követően proliferálnak aktívan, miután a sejtciklust szabályozó mechanizmus károsodott, az azonos sejten belüli Ki-67 és p16INK4a proliferációs markereknek kölcsönösen ki kell zárniuk egymást a normál fiziológiai körülmények között. Ezért a Ki-67 és a p16INK4a együttes kifejeződése egyes sejtekben felhasználható a sejtciklus-szabályozás deregulációjának indikátoraként.
REF 9531
2 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
Cervicalis intraepithelialis neoplasiában kimutatták, hogy a p16INK4a erősen túlexpresszált a pRb (retinoblasztóma fehérje) inaktiválásának köszönhetően, amelyet a magas rizikójú humán papillomavírus (HR-HPV) szerotípusok E7 onkoproteinje közvetít [13;22]. Mivel HPV-asszociált prekancerózus és rákos elváltozások során a malignus fenotípus kialakulásához és fennmaradásához E7 szükséges, a p16INK4a fokozott kifejeződése közvetlen összefüggést mutat a különböző HR-HPV szerotípusok onkogenikus aktivitásával, ezért a p16INK4a helyettesítő markerként való alkalmazása javasolt transzformáló HPV fertőzések esetén [lásd a 6; 31; és 35. hivatkozást]. Számos tanulmány elemezte és demonstrálta a p16INK4a immunfestés klinikai felhasználhatóságát a méhnyak szövettanának [2;6;7;11-14;17;18;20-22;32] és a citológia [4-6;8-10;13;15;17;19;20;25;29;30;33;34;37] területén. A p16INK4a által megfestett és a CINtec Histology Kit (Roche mtm laboratories AG) felhasználásával készített metszetek konjunktív értelmezése számtalan tanulmányban kimutatta a megbízhatóság vizsgálótól független szignifikáns javulását, illetve a CIN2 és magasabb fokozatú elváltozások pontosabb diagnózisát [2;11;14]. Ráadásul a p16INK4a pozitív CIN1 elváltozások nagyobb valószínűséggel progrediálnak magas grádusú lézióvá mint a p16INK4a negatív CIN1 minták [7;18]. A méhnyak szövettanában a p16INK4a immunfestés hasznos kelléknek bizonyult a nem meghatározott jelentőségű atipikus laphámsejtű (ASC-US) vagy az alacsony fokozatú intraepithelialis laphám léziójú (LSIL) Pap-kenetek osztályozásában. A mögöttes CIN2 és magasabb fokozatú elváltozások kimutatásának szenzitivitása közel azonos a HPV-tesztek értékével, ugyanakkor a specificitásuk értéke magasabb [5;9;10;15;19;25;29;30;33;34;37]. Mindamellett a p16INK4a citológia kiegészítő markerként való alkalmazása javasolt a méhnyakrákszűrés során pozitív HR-HPV eredményt mutató nők esetében [4]. Gyakorlatilag az összes magas fokozatú cervicalis intraepithelialis elváltozásban (azaz CIN2, CIN3 vagy magasabb grádusú léziók) kimutatták a p16INK4a fokozott expresszióját [2;6;11;13;17;20;32]. Mivel CIN elváltozásokban az epithelialis sejtek nagy arányban mutatnak proliferációs aktivitást, a p16INK4a és Ki-67 proteineket egyidőben expresszáló cervicalis epithelialis sejtek kimutatása felhasználható az átalakult sejtek indikátoraként. Ezért a méhnyaki szövettani minták értékelése, illetve a pozitív p16INK4a és Ki-67 kettős festést mutató cervicalis epithelialis sejtek jelenléte alapján történő megközelítés lehetővé teszi a rákot megelőző és rákos elváltozások magas szenzitivitású és specificitású kimutatását.
Klinikai jelentőség A sejtciklust szabályozó p16INK4a protein és a Ki-67 proliferációs marker expressziójának immunfestett méhnyaki szövettani metszeten való egyidejű kimutatásának értelmezése segít a magas grádusú cervicalis intraepithelialis neoplasiában (HGCIN) szenvedő nők magas szenzitivitással és specificitással való felismerésében, amennyiben felhasználása: -
szűrt népességben történik a rutin Pap-tesztet kiegészítő eljárásként,
-
ASC-US vagy LSIL eredményt mutató Pap-teszttel diagnosztizált betegek alcsoportjában történik, vagy
-
negatív Pap-tesztet, ugyanakkor pozitív eredményű HPV-tesztet mutató betegek alcsoportjában történik.
REF 9531
3 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
A közegészségügy egyik legnagyobb kihívása, hogy a rutin méhnyakrákszűrés során hatékonyan felismerjék a HGCIN-ben szenvedő nőket. A magas fokozatú rákmegelőző állapotok alacsony prevalenciája miatt (jellemzően a nők kevesebb mint 1%-a tünetmentes a szűrt populációban) kulcsfontosságú azon szűrési módszerek elérhetősége, amelyek magas szenzitivitással és specificitással mutatják ki a fennálló HGCIN-t női páciensekben [24]. Azon országokban, ahol bevezették a szervezett lakossági méhnyakrákszűrést, a morfológiai elváltozások kimutatását szolgáló Pap-tesztnek köszönhetően sikeresen csökkent a méhnyakrák-asszociált morbiditás és mortalitás aránya az elmúlt évtizedekben. Ugyanakkor, összességében sikeresnek mondható mivolta ellenére egy Pap-teszt szenzitivitása nem éri el a kívánt értéket (jellemzően 50-70% körül mozog [16]), ami gyakori szűrést tesz szükségessé a citológia eredményének alacsony szenzitivitásának kompenzálása céljából. Ugyanakkor a Pap-teszt specificitása viszonylag magasnak mutatkozott, bár ez változhat az adott szűrt populáció jellegzetességeitől függően, beleértve az életkort, HPVprevalenciát, a Pap-teszt kivitelezésében való különbségeket (hagyományos kenet folyadékalapú citológiával szemben), technológiai különbségeket (manuális értékelés a számítógéppel támogatott citológiával és képalkotással szemben) és a vizsgáló szakmai tapasztalatát. A méhnyakrák és az azt megelőző léziók szűrését szolgáló Pap-teszt eredményességének javítása érdekében a HPV-teszt mint lehetséges megközelítés alkalmazása javasolt [24]. Habár a HPV kimutatása magas szenzitivitással bír a HGCIN-ben szenvedő nők felismerésében, a többnyire átmeneti, magas rizikójú HPV fertőzések magas prevalenciája összességében alacsony specificitást eredményez. Mivel a HPV prevalenciája az életkorral változik, a HPV kimutatás csak a Pap-kenet lehetséges kiegészítő eljárásaként javasolt 30 éves, illetve idősebb nők körében. [1] A hatékony elsődleges szűrési technológiák és algoritmusok optimális meghatározása mellett, a méhnyakrákszűrés egyéb területei is fokozott érdeklődést mutatnak, pl. a létező technológia tökéletesítése a HGCIN felismerési pontosságának optimalizálása érdekében, vagy olyan területek, amelyek jelenleg még nem rendelkeznek a szükséges kelléktárral. A nem egyértelmű (ASC-US, nem meghatározott jelentőségű atipikus laphámsejtek) vagy enyhén abnormális (LSIL, alacsony fokozatú intraepithelialis laphám lézió) Pap-teszt eredmények osztályozása tartozik ebbe a kategóriába, valamint az olyan 30 éves vagy idősebb nők kezelése, akik intraepithelialis léziókra vagy malignitásra vonatkozóan negatív Pap-/HPV-eredményt mutattak, de a magas kockázatú HPV-tesztjük pozitív lett. Az ASC-US citológiai abnormalitásainak osztályozása céljából kidolgoztak egy olyan osztályozási stratégiát, amely a mögöttes HGCIN kimutatása érdekében magába foglalja az ASC-US populáción belüli HPV kimutatást. Ugyanakkor a specificitás nem éri el az optimális értéket, és függ az életkortól [27;36]. Ráadásul, mivel az LSIL esetek túlnyomó többsége magas kockázatú HPV-szerotípusokra vonatkozóan pozitívnak mutatkozott [23], a HPV-pozitív LSIL esetek Paptesztjeinek osztályozása nem lenne túl hatékony.
REF 9531
4 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
Mivel a kolposzkópia kivitelezése korlátozott, illetve ezen beavatkozás és az alacsony fokozatú elváltozások következményes kezelésének költségei meglehetősen magasak, az ASC-US és az LSIL osztályozását célzó, hatékonyabb mutatókkal bíró tesztek elérhetősége folyamatos érdeklődést mutat, különös tekintettel a specificitás értékére. Egy magas szenzitivitású és specificitású biomarker teszt bevezetése, amely képes a magas fokozatú méhnyaki elváltozás felismerésére, jótékony hatással lenne a nem egyértelmű és alacsony fokozatú citológiai elváltozásokkal diagnosztizált női páciensek kezelésére. Egy ilyen teszt egyrészt megkönnyítené a betegek ASC-US Pap-kenet eredményeinek besorolását, másrészt megteremtené az LSIL Pap-teszt eredmények hatékony osztályzásának a lehetőségét. Az LSIL Pap-tesztek eredményeihez hasonlóan, a Pap-tesztre negatív, ugyanakkor magas rizikójú HPV-re pozitív szűrési eredmények további osztályozására jelenleg nincs lehetőség. A Pap/HPV kettős szűrések megközelítőleg 5-7%-át reprezentálja az esetek azon növekedést mutató csoportja, amely teljes kolposzkópiakontrollt igényel, hogy kihasználjuk a HPV-teszt Pap-tesztnél magasabb detekciós rátáját. Mivel e szűrési eredmények csoportjában a fennálló magas grádusú kóros állapotok aránya viszonylag alacsony lehet, egy hatékony osztályozási módszer elérhetősége igencsak kívánatos a pozitív HPV eredményű, ugyanakkor normális Pap-tesztet produkáló nők hatékony kezelésében.
Az eljárás elve A CINtec® PLUS Kit a p16INK4a és a Ki-67 antigének immuncitokémiai kimutatását szolgáló reagensek készletét tartalmazza. A kit a méhnyakból vett citológiai minta két lépésből álló immuncitokémiai festési eljárásának elvégzésére szolgál. Az antigének kimutatására egy elsődleges, monoklonális, a p16INK4a proteinre irányuló E6H4™ egérantitestklónt, illetve egy szintén elsődleges, monoklonális, a humán Ki-67 protein ellen irányuló 274-11 AC3 nyúlantitestklónt alkalmaznak. Használatra kész vizualizációs reagensek kerülnek alkalmazásra, amelyek (I) torma peroxidázhoz és kecske anti-egér Fab’ antitest fragmentumhoz konjugált polimer reagenst, valamint (II) alkalikus foszfatázhoz és kecske anti-nyúl Fab’ antitest fragmentumhoz konjugált polimer reagenst tartalmaznak. A vizualizációs reagensek szilárd fázisú abszorpcióra lettek kialakítva a humán immunglobulinnal való keresztreakciók kiküszöbölésére. A kromogén reakciók alapját a DAB (diaminobenzidin-tetrahidroklorid) kromogén torma peroxidáz által közvetített, illetve a Fast Red kromogén alkalin foszfatáz által közvetített, a megfelelő antigénkötő helyen történő, látható reakciótermékké való átalakulása képezi. Kontrasztfestést követően egy két lépésből álló rögzítési protokoll szerint kell eljárni: első lépésben a minták vízbázisú ragasztóval való rögzítése szükséges (a vízbázisú ragasztót a kit tartalmazza). Ezt követően helyezzük a tárgylemezre a fedőlemezt pl. egy tartós rögzítő közeg alkalmazásával. Az eredményeket fénymikroszkópos megfigyeléssel értékelhetjük.
REF 9531
5 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
IV. Reagensek Biztosított anyagok Az alább felsorolt anyagokat minden kit tartalmazza, mennyiségük 50 teszt elvégzésére elegendő. A tesztek száma tárgylemezenként 200 µl mennyiségű reagensben értendő.
1
Peroxidase Blocking Reagent Peroxidase Blocking Reagent 11,5 ml, használatra kész állapotban. 3%-os hidrogén-peroxid, 15 mmol/l nátrium-azidot tartalmaz (NaN3). Kérésre anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk.
2
Primary Antibodies Solution Primary Antibodies Solution 11,5 ml, használatra kész állapotban. Monoclonal mouse anti-Human p16INK4a antibody, Clone E6H4™ és monoclonal rabbit anti-Human Ki-67 antibody Clone 274-11 AC3, 50 mM Tris puffer pH 7,2 kiszerelésben, 15 mmol/l nátrium-azidot (NaN3) és stabilizáló proteint tartalmaz.
3
Visualization Reagent HRP Visualization Reagent HRP 11,5 ml, használatra kész állapotban. Torma peroxidázhoz és affinitás-tisztított kecske anti-egér Fab’ antitest fragmentumokhoz konjugált polimer reagensek, tartósítószert és stabilizáló proteint tartalmazó stabilizáló oldatban tárolva. 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxánt tartalmaz, amely allergiás reakciót válthat ki. Kérésre anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk.
4
Visualization Reagent AP Visualization Reagent AP 11,5 ml, használatra kész állapotban. Alkalikus foszfatázhoz és affinitás-tisztított kecske anti-nyúl Fab’ antitest fragmentumokhoz konjugált polimer reagensek, tartósítószert és stabilizáló proteint tartalmazó stabilizáló oldatban tárolva. 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxánt tartalmaz, amely allergiás reakciót válthat ki. Kérésre anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk.
REF 9531
6 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
5
DAB Buffered Substrate DAB Buffered Substrate 16,0 ml, Szubsztrátpufferoldat, pH 7,5, < 0,1%-os hidrogén-peroxidot, stabilizáló anyagokat, enhancer elemeket és antimikrobiális hatóanyagokat tartalmaz.
6
DAB Chromogen DAB Chromogen 0,85 ml, 3,3’-diaminobenzidin kromogén oldat. A DAB ártalmas. Olvassa végig a veszélyekre/kockázatokra (R-mondatok) és a biztonságos használatra (S-mondatok) utaló mondatokat: R40 A rákkeltő hatás korlátozott mértékben bizonyított. R43 Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat (szenzibilizáló hatású lehet). R68 Maradandó egészségkárosodást okozhat. S35 Az anyagot és edényzetét megfelelő módon ártalmatlanítani kell. S36/37 Megfelelő védőruházatot és védőkesztyűt kell viselni. MEGJEGYZÉS: Bár a diaminobenzidin a benzidinhez hasonló szerkezettel rendelkezik, a diaminobenzidin karcinogenitása nem bizonyított. Ártalmatlanítás során a szövetségi, az állami és a helyi előírásoknak megfelelően járjon el. Kérésre anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk.
7
Naphthol Phosphate Substrate Naphthol Phosphate Substrate 25,0 ml, Szubsztrátpufferoldat, pH 9,2, naftol AS-TR foszfát szubsztrátot, stabilizáló anyagokat, enhancer elemeket és antimikrobiális hatóanyagokat tartalmaz.
8
Fast Red Chromogen Fast Red Chromogen 1,33 ml, Fast Red kromogén oldat.
9
Epitope Retrieval Solution 10 x Epitope Retrieval Solution 10 x 500 ml, 100 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 9,0, 15 mmol/l nátrium-azidot (NaN3) tartalmaz.
REF 9531
7 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
® 10 CINtec PLUS Mount
CINtec® PLUS Mount 18,0 ml, vízbázisú tartós rögzítőközeg. A tárgylemezen lévő minta tartós konzerválására peroxidáz és alkalikus foszfatázalapú vizualizációs rendszerek segítségével megfestve. 7,7 mmol/l nátrium-azidot tartalmaz (NaN3).
Tárolás 2–8 °C hőmérsékleten tárolandó. Ne használja a lejárati időn túl. A fent említett értékektől eltérő körülmények között nem határozták meg a reagensek tárolására vonatkozó adatokat. A csomagolás eltávolítását követően a kit alkotórészei 6 hónapon keresztül stabil állapotban maradnak, amennyiben tárolásuk 2–8 °C hőmérsékleten történik. Amennyiben az oldat zavaros, meg kell semmisíteni. A CINtec® PLUS Mount üvegcsét (10. üvegcse) a kit első felbontását követően el kell távolítani a dobozból, és a továbbiakban környezeti hőmérsékleten kell tárolni (2–30 °C). A Diluted Wash Buffer és a hígított Epitope Retrieval Solution 1 hónapon keresztül stabil állapotban marad, amennyiben tárolása 2–8 °C hőmérsékleten történik. Amennyiben az oldat zavaros, használata szigorúan tilos.
Szükséges, de nem biztosított anyagok és reagensek A CINtec® PLUS Kittel használandó Wash Buffer megrendelhető a 8550-es katalógusszám alatt a Roche mtm laboratories AG-től, de a kit nem tartalmazza. Megrendeléssel kapcsolatos információkat a www.cintec.info oldalon talál. Alkoholmentes hematoxilin kontrasztfestés céljából. Desztillált vagy ionmentesített víz. Etanol, 99% Xilénalapú rögzítő közeg az üveg fedőlemez felhelyezésére. Tárgylemezek: SuperFrost® PLUS, ThinPrep® Microscopy Slides; BD SurePath™ PreCoat tárgylemezek. Xilén; Üveg vagy film fedőlemezek; Feldolgozás ellenőrzés pl. ThinPrep® a reziduális minta üvegcséjéből készült tárgylemezek:
REF 9531
Pozitív ellenőrzés: ThinPrep® (összevont) mintá(k)ból származó tárgylemez magas fokozatú intraepithelialis laphám léziót (HSIL) igazoló Pap-teszt eredményével.
Negatív ellenőrzés: (összevont) mintá(k)ból származó ThinPrep® tárgylemez intraepithelialis laphám lézióra vagy malignitásra negatív (NILM) Pap-teszt eredményével.
8 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
Szükséges felszerelések Fénymikroszkóp (10–40x nagyítású objektív); Hőálló festőedények (műanyag); Mérőhengerek; Fecskendős üveg (mosó pufferrel kell feltölteni); Stopperóra (30 másodperces–60 perces intervallumokat lehet beállítani); Fedeles vízfürdő (képes az Epitope Retrieval Solutiont 95–99 °C-on tartani); Hőmérő.
V. Figyelmeztetések és óvintézkedések Figyelmeztetés 1.
Vigyázat! A kit egyes reagensei veszélyes vegyi anyagokat tartalmaznak. A kit tartalmának használata során tartsa be a veszélyes laboratóriumi reagensekre vonatkozó biztonsági óvintézkedéseket.
2.
A termék 1., 2., 9. és 10. komponense nátrium-azidot tartalmaz (NaN3), ami vegytiszta formában erősen mérgező. Bár nem minősítették veszélyesnek, de normális koncentrációs értékeken a nátrium-azid az ólom- és rézcsövekkel reakcióba léphet, és potenciálisan robbanékony fém-azidokat hozhat létre. Megsemmisítéskor, megelőzendő az azidok vízvezetékekben történő lerakódását, nagy mennyiségű vízzel kell leöblíteni.
3.
A 2., 3. és 4. jelölésű komponensek állati eredetű anyagot tartalmaznak. Tartsa be a biológiai eredetű termékek használatára vonatkozó megfelelő előírásokat.
4.
Kérésre a kitre vonatkozó anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk.
5.
Citológiai minták használata és ártalmatlanítása során, beleértve minden mintát a fixációt megelőzően, illetve követően, valamint a mintáknak kitett anyagokat, tartsa be a potenciálisan fertőzésveszélyes anyagokra vonatkozó biztonsági óvintézkedéseket, illetve a hulladékkezeléssel kapcsolatos előírásokat.
6.
Soha ne pipettázzon szájjal! Kerülje a bőr és a nyálkahártyák reagenssel, illetve mintával való érintkezését! Ha a reagens vagy minták bőrfelületre vagy nyálkahártyára kerülnek, bő vízzel mossa le.
7.
A vizualizációs reagenseket, a DAB Chromogent és a Fast Red Chromogent káros hatások érhetik, amennyiben túlságosan erős fénynek vannak kitéve. Ne tárolja erős fényben a kit komponenseit, valamint ne végezzen festést erős fényben, pl. közvetlen napfényben.
8.
Viseljen megfelelő védőfelszerelést, hogy a CINtec® PLUS Kit részét képező vagy azzal együtt alkalmazandó komponensek használata közben elkerülje azok szemmel vagy bőrrel való érintkezését. További információkat lásd a termék biztonsági adatlapján.
REF 9531
9 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
Vigyázat! 1.
Kizárólag in vitro diagnosztikai használatra.
2.
Kizárólag szakszerű használatra.
3.
Kerülje a reagensek mikrobiális szennyezését, hogy megelőzze a nem specifikus festést.
4.
A meghatározott inkubációs időktől, hőmérsékletektől és eljárásoktól való eltérés téves eredményekhez vezethet.
5.
A komponensek csomagolásának sérülése esetén ne használja a kit tartalmát! A csomagolás vagy a csomag tartalmának sérülése esetén haladéktalanul vegye fel a kapcsolatot a gyártóval.
6.
A hulladékanyagok ártalmatlanításának a helyi irányelvek és előírások szerint kell történnie.
7.
Minden reagens kifejezetten erre a tesztre való használatra lett kifejlesztve. Mivel a teszt specifikus, a reagensek helyettesítése, cseréje nem megengedett.
8.
Nem várt, laboratóriumi hibával nem magyarázható festés megjelenése esetén, illetve a CINtec® PLUS Kit kapcsán felmerülő probléma gyanúja során, további információkért és műszaki segítségért haladéktalanul látogasson el a www.cintec.info oldalra.
9.
A termék kezelési problémákból vagy instabilitásból adódó hibás működése nem mutatkozik meg egyértelmű jelek formájában. Ezért mint minőségellenőrzési intézkedés, pozitív és negatív kontroll egyidejű futtatása szükséges páciensekből vett mintákon.
VI. Eljárások A citológiai minta előkészítése A citológiai minták immuncitokémiai eljárásokra való megőrzéséhez a mintákat adekvát módon kell kezelni. Minden mintát a sejtfeldolgozás standard módszerei szerint kell felhasználni. ThinPrep® (Hologic™ Inc.) tárgylemezek ThinPrep® 2000 Processor (Hologic™ Inc.) segítségével készültek a gyártó protokollja alapján, BD SurePath™ (BD Diagnostics Tripath) a gyártó protokollja alapján készült tárgylemezek, illetve a manuálisan készült tárgylemezek (hagyományos kenetek) egyaránt alkalmasak a felhasználásra. Megjegyzések: 1. ThinPrep® a minta előkészítése: Kérjük, vegye figyelembe, hogy a ThinPrep® 3000 Processor használata nem ajánlatos, mivel a műszer által végzett spray fixációs eljárás jelentős sejtvesztéshez vezethet.
REF 9531
10 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
2. A BD SurePath™ minta előkészítése: Mivel egyes esetekben arról számoltak be, hogy a fennmaradó sejtanyag tárolása a vizes dúsítást követően káros hatással lehet az immuncitokémiai jel intenzitására, nyomatékosan ajánljuk az alábbi utasítások követését a tárgylemezek CINtec® PLUS vizsgálatra való előkészítése során, hogy megelőzzük a jelvesztést: a. Tárgylemez-előkészítés közvetlenül a Pap-kenet feldolgozását követően. i. Minden esetben előkészíthetünk egy második tárgylemezt közvetlenül a megfelelő SurePath™ tárgylemez Pap-festését követően. ii. Helyezzen egy másik készlet címkézett tárgylemezt a tárgylemeztartóba. iii. A PrepStain™-en az 1.1-es vagy az 1.2-es verziójú GYN-t futtatva, Slide Preparation, válassza a „Transfer only” programot. b. Tárgylemez előkészítés a dúsított sejtüledékből a Pap tárgylemez későbbi előkészítését követően. i. Távolítsa el a csőtartót a PrepStain™ Systemről és adagoljon megközelítőleg 2 ml SurePath™ Preservative Fluidot minden egyes csőbe. ii. Zárja le mindegyik csövet és tárolja 4 héten át szobahőmérsékleten vagy lehűtve (2–8 °C) legfeljebb 6 hónapig. iii. Ha a tárgylemezt CINtec® PLUS számára tárolt mintához kívánjuk felhasználni, engedjük, hogy a minta 1 óra leforgása alatt felvegye a szobahőmérsékletet. A GYN dúsítási folyamat második centrifugálási lépésével indítson és fejezze be a Prep folyamat hátralevő részét. c. Tárgylemez előkészítés a maradék mintaanyagból, amely az eredeti minta üvegcsében maradt meg (megközelítőleg 2 ml). i. Adjon 8 ml SurePath™ Preservative Fluidot a fennmaradó mintához a SurePath™ üvegcsébe (kb. 2 ml). ii. A hígított mintát dolgozza fel a PrepMate™ segítségével a standard módszert használva és a PrepStain™ segítségével az 1.1-es vagy az 1.2-es verziójú GYN-t futtatva, Slide Preparation, majd válassza a „Transfer only” programot. Közvetlenül az előkészítés után, a ThinPrep® vagy BD SurePath™ tárgylemezeket fixálja 99%-os etanolban 10 perctől 1 óráig terjedő ideig és szárítsa levegőn 20 perctől 16 óráig terjedő ideig (éjszaka). ThinPrep® vagy BD SurePath™ citológiai előkészítését tilos polietilén-glikol tartalmú citológiai spray fixációs reagenssel végezni (pl. Merckofix®, Merck). A hagyományos kenetek fixációját polietilén-glikol tartalmú citológiai spray fixációs reagenssel kell végezni (pl. Merckofix®, Merck) közvetlenül a mintavétel után. Az immunfestési eljárás megkezdése előtt rehidrálja az összes mintát a 2.1. pontban leírt specifikus protokoll szerint.
REF 9531
11 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
MEGJEGYZÉS: Minimális szennyezettségű etanol szükséges a ThinPrep® folyadékbázisú citológiai tárgylemezek fixációjához a háttérfestődés elkerülése érdekében. Az immunfestésre használatos ThinPrep® tárgylemezek előkészítése során cseréljen etanolfürdőt minden 25. ThinPrep® tárgylemez fixációja után. A minták festés előtti, hő által indukált epitóp visszanyerési kezelése Hő által indukált epitóp visszanyerés (HIER) a kit részét képező Epitope Retrieval Solutiont használva szükséges az optimális assay teljesítmény biztosításához. A leírt eljárástól való eltérés befolyásolhatja az eredményeket! Hő által indukált epitóp visszanyerés esetén, a citológiai minta felmelegítését az Epitope Retrieval Solutionbe való merítése által kell elérni egy olyan kalibrált vízfürdő segítségével, amely képes az Epitope Retrieval Solutiont 95–99 °C-os hőmérsékleten tartani. Magasabb elhelyezkedésű laboratóriumok esetében a legkézenfekvőbb módszert kell alkalmazni a vízfürdő kívánt hőmérsékletének eléréséhez. A gyártó nem javasolja az itt leírt eljárástól való bármilyen eltérést. Hő által indukált epitóp-visszanyerést követően, a citológiai mintát 20 percig vagy hosszabb ideig környezeti hőmérsékleten kell tartani, amíg a minta hőmérséklete nem csökkent le 50 °C-ig. Csak ezt követően kezdhetjük meg a minta további feldolgozását. Ezután a citológiai minta festését haladéktalanul el kell végezni.
Metszetfestési eljárások A kit 50 teszt elvégzésére elegendő reagensmennyiséget tartalmaz. A tesztek száma tárgylemezenként 200 µl mennyiségű reagensben értendő. Metszetenként 200 µl reagens ajánlott a ThinPrep® vagy BD SurePath™ tárgylemezek citológiai előkészítésére a Dako vagy a LabVision Autostainer műszerek használatával (metszetenként két, 100 µl-es cseppentési zóna), valamint a Shandon Coverplate™ System (Thermo Fisher Scientific Inc.) használatával. A Shandon Coverplate™ System használata során metszetenként 200 µl reagens ajánlott a hagyományos kenetek feldolgozására. Ugyanakkor a hagyományos kenetek teljes lefedettségének biztosítása érdekében a Dako vagy a LabVision Autostainer műszerek alkalmazása során metszetenként 300 µl reagens (100 µl mindhárom rendelkezésre álló cseppentési zónára) használata ajánlott.
1. A reagens előkészítése A festési eljárás megkezdése előtt, a Fast Red munkaoldatot leszámítva, az alábbi reagensek előkészítése javasolt. Immunfestés előtt legyen minden reagens szobahőmérsékletű (20–25 °C).
1.1 Epitope Retrieval Solution Készítse elő az Epitope Retrieval Solution festési eljáráshoz elegendő mennyiségét, ami a 9. üvegcse (Epitope Retrieval Solution 10 x) tartalmának 1:10 arányú, desztillált vagy ionmentesített vízben történő hígításával készül. Hígítás után az Epitope Retrieval Solution 2–8 °C hőmérsékleten tárolandó legfeljebb egy hónapon át. Amennyiben az oldat zavaros, meg kell semmisíteni.
REF 9531
12 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
MEGJEGYZÉS: Magas iontartalmú víz használata az epitope retrieval solution hígítása során jelentősen csökkentheti a teszt festési teljesítményét. Kérjük, győződjön meg arról, hogy a felhasznált víz megfelelően desztillált és ionmentesített (vagyis az ionmentesített víz előállítására szolgáló ioncserélő oszlop átesett-e a rutin karbantartási vizsgálaton). Ne használjon csapvizet!
1.2 Wash Buffer Használjon 8550-es katalógusszámú Wash Buffert (10 x), amelyet a Roche mtm laboratories AG biztosít a CINtec® PLUS Kit termékkel. Megrendeléssel kapcsolatos információkat a www.cintec.info oldalon talál. Készítse elő a Wash Buffer mosás lépéseihez elegendő mennyiségét, ami a Wash Buffer (10 x) tartalmának 1:10 arányú, desztillált vagy ionmentesített vízben történő hígításával készül. Hígítás után a Wash Buffer 2–8 °C hőmérsékleten tárolandó legfeljebb egy hónapon át. Amennyiben az oldat zavaros, meg kell semmisíteni.
1.3. Szubsztrát-kromogén oldatok (DAB és Fast Red) Győződjön meg arról, hogy mind a kromogének, mind a szubsztrátok hőmérséklete megegyezik a szobahőmérséklettel (20–25 °C). Túl nagy mennyiségű kromogén adása a szubsztráthoz a pozitív jel romlását eredményezi. A) A DAB munkaoldat előkészítése a festési folyamat előtt Előkészítést követően a DAB munkaoldat 8 órán keresztül marad stabil. A DAB munkaoldatot az alábbiak szerint készítse elő: i)
Töltsön 1 ml DAB Substrate Solutiont (5. üvegcse) egy tiszta kémcsőbe.
ii)
Adjon egy cseppet (25–30 µl) a DAB Chromogenből (6. üvegcse) és a cső megfordításával óvatosan keverje azt össze (ne rázza fel!).
iii) Az Autostainer használata során, a festési eljárást megelőzően töltsön DAB munkaoldatot az Autostainer reagens üvegcsébe, majd helyezze az Autostainer-tartó megfelelő pozíciójába. B) A Fast Red munkaoldat előkészítése közvetlenül használat előtt A Fast Red munkaoldatot közvetlenül használat előtt készítse elő, különben a festés intenzitásának csökkenése, és ezért a szenzitivitás elvesztése állhat elő. Ne rázza fel a Fast Red munkaoldatot, mivel ez csapadék képződéséhez vezethet. A Fast Red munkaoldatot az alábbiak szerint készítse elő: i)
Töltsön 1 ml Naphthol Phosphate Substrate Solutiont (7. üvegcse) egy tiszta kémcsőbe.
ii)
Adjon egy cseppet (40–45 µl) a Fast Red Chromogenből (8. üvegcse) és a cső megfordításával óvatosan keverje azt össze (ne rázza fel!).
iii) Az Autostainer használata során akkor készítse elő a Fast Red munkaoldatot, amikor ezt az Autostainer szoftver jelzi. Ezt követően töltse a munkaoldatot az Autostainer reagens üvegcsébe, majd helyezze az Autostainer-tartó megfelelő pozíciójába. Az Autostainer működtetése során kerülje a „substrate batch” lépés késleltetését a szárítási műtermékek képződésének minimalizálása érdekében. REF 9531
13 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
1.4. Kontrasztfestés A DAB és Fast Red festési reakciók vízben nem oldódó, színes végtermékeket képeznek (DAB: barna; Fast Red: piros). MEGJEGYZÉS: Kontrasztfestéshez alkoholmentes hematoxilint használjon, mert az alkohol használata negatívan befolyásolhatja vagy teljesen eltüntetheti a Fast Red által generált jelet. Amennyiben mégis ilyen hematoxilint használ, kontrasztfestés során tartsa be a hematoxilin forgalmazójának utasításait.
1.5 Rögzítő közeg A minták festést követő rögzítése során egy két lépésből álló rögzítési eljárás szerint járjon el az alábbiak szerint. Először CINtec® PLUS Mount (10. üvegcse), egy vízbázisú tartós rögzítő közeget alkalmazunk manuálisan vékony bevonattal, ami lehetővé teszi a száradást („a fedőlemez nedves felhelyezése”). Második lépésben egy üveg fedőlemezt helyezünk fel a vízbázisú rögzítő közeg megszáradt felszínére xilénbázisú rögzítő közeg felhasználásával. Használat előtt várja meg, amíg a CINtec® PLUS Mount felveszi a szobahőmérsékletet, és további felhasználás esetén azt szobahőmérsékleten tárolja.
2. Festési eljárás A CINtec® PLUS Kitet hitelesített Autostainer műszerekkel (pl., a LabVision Autostainer 480 vagy a Dako Autostainer PLUS) való használatra tervezték az alább látható minta szerint (lásd 2.3.1. pont), valamint a Shandon Coverplate™ Systemmel való használatra is hitelesítették (lásd 2.3.2. pont). Festés előtt a mintákat és a reagenseket az 1.1.-1.3., illetve 2.1. pontokban leírt módon kell előkészíteni. Az immunfestési eljárás előtt minden reagens vegye fel a környezet hőmérsékletét (20–25 °C). Hasonlóképpen, minden lépést környezeti hőmérsékleten végezzen el. Festési eljárás során kerülje a minták száradását. A szárított minta a nem specifikus festődés fokozódását eredményezheti. Hosszabb inkubáció esetén a mintákat helyezze nedves környezetbe.
2.1. A minta rehidrációja Minden citológiai minta esetén egy rehidrációs lépés szükséges a festési eljárás megkezdése előtt. Ezt a lépést környezeti hőmérsékleten (20– 25 °C) végezze el. A) ThinPrep® folyadékalapú citológiai metszetek és hagyományos kenetek
A metszeteket helyezze desztillált vagy ionmentesített vízbe, majd inkubálja 10 (±3) percen keresztül.
A festési eljárást a 2.2. pont első lépése szerint kezdje meg: Epitóp visszanyerés. B) BD SurePath™ citológiai tárgylemezek Alkohollal fixált BD SurePath™ citológiai metszeteknek egy speciális rehidrációs módszeren kell átesniük, hogy a speciális bevonatú üvegmetszetek kompatibilisek legyenek a fedőlemez folyékony közegével.
REF 9531
14 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
Győződjön meg arról, hogy a metszetek teljesen légszárazak.
Helyezze a metszeteket friss 100%-os xilén fürdőbe (xilénnek ellenálló edényeket használjon); mártsa be néhányszor, majd inkubálja a metszeteket 2 percig.
Helyezze a metszeteket friss 99%-os etanol fürdőbe, majd inkubálja azokat 2 percig.
Helyezze a metszeteket friss 70%-os etanol fürdőbe, majd inkubálja azokat 2 percig.
A metszeteket helyezze desztillált vagy ionmentesített vízbe, majd inkubálja azokat 2 percig.
Megjegyzés: 50 metszet feldolgozását követően, vagy kisebb számú metszetfelhasználás esetén hetente egyszer cserélje a dehidrációra szolgáló fürdő tartalmát.
2.2. Epitóp visszanyerés A) ThinPrep® kenetek:
folyadékalapú
citológiai
metszetek
és
hagyományos
A hőálló festőedényeket (műanyag) töltse meg hígított Epitope Retrieval Solutionnel (lásd Eljárás, 1.1. pont).
Helyezze vízfürdőbe az Epitope Retrieval Solutiont tartalmazó festőedényeket, majd hevítse fel a vízfürdőt és az Epitope Retrieval Solutiont 95–99 °C hőmérsékletre. A hőmérsékletet a festőedények belsejében kell mérni. Lényeges, hogy a vízfürdőben beállítsuk a víz szintjét biztosítva azt, hogy az edények 80%-a víz alá kerül. A hőmérséklet stabilizálása és a párolgás elkerülése érdekében zárja le fedéllel az edényeket.
95–99 °C-os hőmérséklet elérését követően a rehidrált citológiai metszeteket merítse a festőedényekben előmelegített Epitope Retrieval Solutionbe; ez a lépés általában 90 °C alá csökkenti az edények hőmérsékletét. A hőmérsékletérzékelőt hagyja az edényekben, majd a lehető leggondosabban zárja le az edények fedelét.
A vízfürdőt és az edényekben lévő Epitope Retrieval Solutiont melegítse fel újra 95–99 °C-os hőmérsékletre; ellenőrizze az edényekben lévő Epitope Retrieval Solution hőmérsékletét.
Inkubáljon 10 (±1) percig 95–99 °C hőmérsékleten; a visszaszámlálást csak az után kezdje meg, hogy az edényekben lévő Epitope Retrieval Solution hőmérséklete igazoltan elérte a 95–99 °C értéket.
Távolítsa el a vízfürdőből az egész edényt a metszetekkel együtt.
Távolítsa el a festőedények fedelét, és hűtse a metszeteket az Epitope Retrieval Solutionben 20 (±1) percen át környezeti hőmérsékleten, amíg a hőmérsékletük nem éri el az 50 °C értéket.
A metszeteket helyezze egy Wash Bufferrel töltött festőedénybe (lásd Eljárás, 1.2. pont) és inkubáljon 5 (±1) percen át a metszetek Autostainer műszerre való elhelyezését megelőzően. A Shandon Coverplate™ System használata során, gyűjtse össze a metszeteket és a fedőlapokat a REF 2010-953-009EN protokoll szerint (elérhető: Roche mtm laboratories AG).
REF 9531
15 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
B) BD SurePath™ citológiai tárgylemezek
A hőálló festőedényeket (műanyag) töltse meg hígított Epitope Retrieval Solutionnel (lásd: Eljárás, 1.1. pont). Kérjük, vegye figyelembe, hogy nem hőálló műanyagból, hanem fémből vagy hőálló üvegből készült edények használata során az epitóp-visszanyerési idő egyénileg módosul.
A metszeteket merítse a hideg Epitope Retrieval Solutionbe; zárja le a festőedény fedelét.
Helyezze a festőedényt hideg vízfürdőbe és várjon, amíg a vízfürdő és az Epitope Retrieval Solution hőmérséklete el nem éri a 95–99 °C-ot, majd a hőmérséklet elérését követően inkubáljon 15 percig; kérjük, vegye figyelembe, hogy a 95–99 °C hőmérséklet elérése nem tarthat tovább 40 percnél.
Távolítsa el a vízfürdőből az egész edényt a metszetekkel együtt.
Távolítsa el a festőedények fedelét, és hűtse a metszeteket az Epitope Retrieval Solutionben 20 (±1) percen át környezeti hőmérsékleten, amíg a hőmérsékletük el nem éri az 50 °C értéket.
A metszeteket helyezze egy Wash Bufferrel töltött festőedénybe (lásd: Eljárás, 1.2. pont) és inkubáljon 5 (±1) percen át a metszetek Autostainer műszerre való elhelyezését megelőzően. A Shandon Coverplate™ System, használata során, gyűjtse össze a metszeteket és a fedőlapokat a REF 2010-953-009EN protokoll szerint (elérhető: Roche mtm laboratories AG).
MEGJEGYZÉS: Az Epitope Retrieval Solution egyszeri használatra van tervezve. Ne használja újra!
2.3. Festési protokollok 2.3.1. Autostainer műszerekre vonatkozó festési protokoll (Dako, LabVision) A CINtec® PLUS Kit Autostainer műszeren való első használata előtt, egy új minta beállítása szükséges, és a CINtec® PLUS Kit reagenseket hozzá kell adni az Autostainer reagens listájához („Reagenslista”). Kérjük, tanulmányozza át az adott Autostainerhez tartozó kezelői kézikönyvet. Metszetenként 200 µl reagens ajánlott a ThinPrep® vagy BD SurePath™ citológiai készítmények feldolgozásához. Hagyományos kenetek Dako vagy LabVision Autostainer műszereken való alkalmazása esetén metszetenként 300 µl reagens használata lehet szükséges.
REF 9531
16 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
Az alábbi táblázatban a programfutások vázlata látható: Program ThinPrep® citológiai Lépés készítmények és hagyományos kenetek öblítés* 1
BD Surepath™ citológiai készítmények öblítés*
Peroxidase-Blocking Reagent 5 perc öblítés*
Peroxidase-Blocking Reagent 5 perc öblítés*
Primary Antibodies Solution 30 perc öblítés*
Primary Antibodies Solution 30 perc öblítés*
7
Visualization Reagent HRP 15 perc öblítés*
Visualization Reagent HRP 15 perc öblítés*
8
öblítés*
öblítés*
9
öblítés*
öblítés*
10 11
Visualization Reagent AP 15 perc öblítés*
Visualization Reagent AP 15 perc öblítés*
12
öblítés*
öblítés*
13
öblítés*
öblítés*
14
kapcsol
kapcsol
„Szubsztrát” lépés: DAB 10 perc öblítés desztillált vagy ionmentesített vízzel öblítés*
„Szubsztrát” lépés: DAB 10 perc öblítés desztillált vagy ionmentesített vízzel öblítés*
19
„Substrate-batch” lépés: Fast Red 15 perc öblítés*
„Substrate-batch” lépés: Fast Red 15 perc öblítés*
20
---
21
----
LabVision Autostainer esetében: „Substrate-batch” lépés: Fast Red 15 perc Dako Autostainer esetében: „Substrate” lépés: Fast Red 15 perc öblítés*
22
öblítés desztillált vagy ionmentesített vízzel kapcsolás
öblítés desztillált vagy ionmentesített vízzel kapcsolás
2 3 4 5 6
15 16 17 18
23
*használjon Wash Buffert az adott öblítési lépésekben. REF 9531
17 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
MEGJEGYZÉS: Amennyiben a festési eljárásra használt Autostainer pufferrel öblíti a metszeteket, a metszeteket desztillált vagy ionmentesített vízzel kell leöblíteni az Autostainerből való eltávolításukat követően. A programozást követően az alábbiak szerint járjon el:
A kit részét képező üvegekben található reagenseket helyezze át az Autostainer reagens üvegcséibe. Használja az Autostainer által generált tájékoztató képernyőt a programidő és a reagens térfogat meghatározására.
Helyezze az Autostainer reagens üvegcséket az Autostainer reagens tartóba a „Reagent Layout Map” (reagens elrendezési kép) szerint.
Az Autostainert töltse meg metszetekkel a „Slide Layout Map” (metszet elrendezési kép) szerint és öblítse át a metszeteket Wash Bufferrel a minta kiszáradását megelőzendő.
2.3.2. Javasolt festési protokoll a Shandon Coverplate™ System berendezés esetén Egymást követően gyűjtse össze a metszeteket és a fedőlapokat a REF 2010-953009EN protokoll szerint (elérhető a Roche mtm laboratories AG), majd helyezze őket a metszettartóba függőleges helyzetben. A reagenstartály desztillált vagy ionmentesített vízzel (2 ml) való megtöltésével ellenőrizze, hogy a Shandon Coverplate™ System összeragasztása szakszerűen valósult-e meg, majd inkubáljon 5 percig biztosítva a víz teljes átfolyását a résen keresztül. A tárgylemez és a fedőlemez közötti résen való lassú vízátfolyás során az összeragasztott tárgylemez-fedőlemez rendszer teljesen szivárgásmentes. 1. Ekvilibráció (egyensúlyba hozás): A reagenstartályt töltse meg Wash Bufferrel (2 ml), majd inkubálja 5 percig biztosítva a víz teljes átfolyását a résen keresztül; ismételje meg ezt a lépést. 2. Használjon 200 µl Peroxidase Blocking Reagentet. Inkubáljon 5 percig. 3. A reagenstartályt töltse meg mosópufferrel (2 ml), majd inkubálja 5 percig biztosítva a Wash Buffer teljes átfolyását a résen keresztül. 4. Használjon 200 µl Primary Antibodies Solution (p16INK4a/Ki-67-t). Inkubáljon 30 percig. 5. A reagenstartályt töltse meg Wash Bufferrel (2 ml), majd inkubálja 5 percig biztosítva a Wash Buffer teljes átfolyását a résen keresztül. 6. Használjon 200 µl Visualization Reagent HRP-t. Inkubáljon 15 percig. 7. A reagenstartályt töltse meg Wash Bufferrel (2 ml), majd inkubálja 5 percig biztosítva a Wash Buffer teljes átfolyását a résen keresztül. Ismételje meg ezt a lépést kétszer. 8. Használjon 200 µl Visualization Reagent AP-t. Inkubáljon 15 percig.
REF 9531
18 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
9. A reagenstartályt töltse meg Wash Bufferrel (2 ml), majd inkubálja 5 percig biztosítva a wash buffer teljes átfolyását a résen keresztül. Ismételje meg ezt a lépést kétszer. 10. Használjon 200 µl DAB szubsztrát-kromogén munkaoldatot, amelynek előkészítése az 1.3. pontban korábban már leírt eljárás szerint történik. Inkubáljon 10 percig. 11. Töltse meg a reagenstartályt desztillált vagy ionmentesített vízzel (2 ml), majd inkubáljon 5 percig biztosítva a víz teljes átfolyását a résen keresztül. 12. A reagenstartályt töltse meg Wash Bufferrel (2 ml), majd inkubálja 5 percig biztosítva a wash buffer teljes átfolyását a résen keresztül. 13. Használjon 200 µl Fast Red szubsztrát-kromogén munkaoldatot, amelynek előkészítése az 1.3. pontban korábban már leírt eljárás szerint történik. Inkubáljon 15 percig. Megjegyzés: BD SurePath™ metszet előkészítés miatt ezt a lépést meg kell ismételni. 14. Töltse meg a reagenstartályt desztillált vagy ionmentesített vízzel (2 ml), majd inkubáljon 5 percig biztosítva a víz teljes átfolyását a résen keresztül. Ismételje meg ezt a lépést. Hüvelykujjával és mutatóujjával a tárgylemez hátsó részét megfogva óvatosan húzza ki a metszettartóból az egymáshoz ragasztott tárgylemezt és fedőlemezt, majd óvatosan válassza le a tárgylemezt a fedőlemezről. Ezt ideális esetben víz alá merítve végezzük. A metszeteket helyezze desztillált vagy ionmentesített vízbe, majd folytassa az eljárást a kontrasztfestés lépéseivel.
2.4. Hematoxilinnel történő kontrasztfestés
A metszeteket helyezze alkoholmentes hematoxilinfürdőbe. A használt alkoholmentes hematoxilin erejétől függően inkubáljon 2-10 percen keresztül.
MEGJEGYZÉS: Alkoholmentes hematoxilin használata feltétlenül kötelező.
Bluing céljából helyezze a metszeteket csapvíz fürdőbe vagy alkalikus oldatba, mint pl. gyenge ammónia oldat (NH4OH, 0,08% ionmentesített vízben) és inkubáljon 30 másodperctől 2 percig.
Hogy minden visszamaradó hematoxilint eltávolítson, az edényben lévő csapvizet több alkalommal (3–5x) friss csapvízzel cserélje, amíg nem látja visszamaradó festék jeleit.
Rövid ideig inkubálja a metszeteket desztillált vagy ionmentesített vizet tartalmazó fürdőben.
REF 9531
19 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
MEGJEGYZÉS: Az inkubáció hosszától és a használt hematoxilin potenciájától függően az utánfestés a sejtmagok halványtól sötétkékig terjedő színeződését eredményezi. A túlzott vagy nem teljes kontrasztfestés akadályozhatja az eredmények helyes értelmezését.
2.5 Rögzítés Az optimális szenzitivitás fenntartása és a Fast Red Chromogen elhalványodásának megelőzése érdekében egy két lépésből álló rögzítési eljárás szerint járjon el. Kontrasztfestést és kékre futtatást követően a metszetek egy két lépésből álló protokoll szerint kerülnek rögzítésre. Az A és B lépést egymás után kell elvégezni: A) A fedőlemez nedves felhelyezése. A metszeteket desztillált vagy deionizált vízben legalább 1 percen át inkubálja. Távolítsa el a metszeteket a desztillált vagy deionizált vízből, amelyeket nem kell tovább szárítani. Távolítsa el a felesleges folyadékot anélkül, hogy a minta megszáradna; a víz eltávolítása céljából papírtörlővel óvatosan törölje meg a metszetek alsó oldalát. LBC metszetenként 4 csepp, hagyományos kenetenként pedig 8 csepp CINtec® PLUS Mountot cseppentsen (1 csepp 35–40 µl vízalapú rögzítő közegnek felel meg). Kerülje a légbuborék képződést. Az apró buborékok képződésének megelőzése érdekében az első cseppet papírtörlőre lehet cseppenteni a CINtec® PLUS Mount mintán történő alkalmazása előtt. A rögzítő közeg vékony rétegének létrehozása és a minta teljes átfedése miatt óvatosan billentse meg és forgassa az üveg metszetet (még NE használja az üveg vagy film fedőlemezt!); megtekintéssel ellenőrizze a rögzítő közeg metszeten való eloszlását. Szárítás céljából a metszeteket vízszintes helyzetben helyezze el: a. Inkubálja a ThinPrep® vagy BD SurePath™ mintákat 1 órán át 37–60 °C-on, vagy éjszaka környezeti hőmérsékleten. b. Inkubálja a hagyományos keneteket 4 órán át 37 °C-on, 1 órán át 60 °C-on, vagy éjszaka környezeti hőmérsékleten. B) Üveg vagy film fedőlemezek felhelyezése Miután a rögzítő közeg teljesen megszáradt, inkubálja a metszeteket xilénben legalább 1 percen át, ill. legfeljebb 20 percig. Ezt követően a metszetekre helyezze fel a fedőlemezeket xilénalapú rögzítő közeg használatával. MEGJEGYZÉS: Az üveg vagy film fedőlemez felhelyezése előtt tilos dehidrálni a metszeteket fokozatosan emelt mennyiségű alkohol alkalmazásával. Várja meg, amíg szobahőmérsékleten.
a
xilénalapú
rögzítő
közeg
megszárad
MEGJEGYZÉS: Az elhalványodás elkerülése érdekében, a metszeteket védje a fénytől és szobahőmérsékleten tárolja (20–25 °C).
REF 9531
20 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
VII. Minőség-ellenőrzés A méhnyaki citológiai minta fixációjával és további feldolgozásával kapcsolatos ajánlott eljárásoktól való eltérés az eredmények lényeges módosulását eredményezheti, ami rendszeres belső ellenőrzéseket tesz szükségessé.
Pozitív kontroll Olyan mintákat használjon fel pozitív kontroll során, amelyek a betegek mintáival azonos módon kerültek feldolgozásra. A pozitív kontroll jelzi, hogy a minta előkészítése és a festési eljárás megfelelően lett-e elvégezve. Minden egyes festés során egy pozitív kontrollt kell elvégezni. Az ismert pozitív kontrollokat csak a feldolgozott szövetek és vizsgálati reagensek megfelelő teljesítményének követésére használhatják, és nem a páciensminták specifikus diagnózisainak meghatározásához. Ha a pozitív kontrollok nem mutatnak kellően pozitív festést, a vizsgálati minták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni.
Negatív kontroll Valamennyi festési menetben olyan negatív kontrollt kell használni, amelyről tudja, hogy a beteg mintájával/mintáival megegyező módon dolgozták fel, a festési eljárás specificitásáról való meggyőződés és a háttérfestődésre utaló jelek észlelése érdekében. Reprezentatív méhnyaki citológiai mintákban jelenlévő különböző sejttípusok, amelyekről ismert, hogy nem expresszálják a p16INK4a és Ki-67 antigéneket (mint pl. a superficialis sejtek), kiegészítő belső negatív kontrollként szolgálhatnak a háttérfestődés megállapításában (a felhasználó hitelesítése szükséges).
A módszer ellenőrzése Egy antitest vagy festési rendszer diagnosztikában való első alkalmazását megelőzően, a felhasználó feladata, hogy igazolja az antitest specificitását a laboratóriumon belüli, ismert immuncitokémiai tulajdonságokkal rendelkező minták sorozatán, amelyek ismert pozitív és negatív mintákat reprezentálnak. Tanulmányozza a korábbi fejezetben taglalt minőség-ellenőrzési eljárásokat, valamint a CAP Certification Program for Immunocytochemistry („immuncitokémiai hitelesítési program”) és/vagy a CLSI (NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry („immuncitokémiai minőségbiztosítás”) jóváhagyott irányelveinek minőségellenőrzési követelményeit.
VIII. Az eredmények értelmezése A CINtec® PLUS eljárás két, eltérő színű reakcióterméket eredményez: barna színű csapadékot a p16INK4a antigénkötő helyen, és piros színű csapadékot a Ki-67 antigénkötő helyen. A sejtek barna festődése (citoplazma és/vagy sejtmagok) a p16INK4a túlzott expresszióját jelzi. A sejtek piros festődése (sejtmagok) a Ki-67 expresszióját jelzi. Mindkét antigénre festett sejtek barna citoplazma festődést mutatnak jellegzetesen kihangsúlyozott piros sejtmagokkal. Az eredmények értelmezése előtt egy immunhisztokémiai eljárásokban tapasztalt és a CINtec® PLUSszal festett metszetek értelmezésében jártas, képzett patológusnak/citológusnak kell értékelnie a pozitív és negatív kontrollokat. Az eredmények értékelését képzett szakembernek kell elkészítenie a beteg kórtörténetének és egyéb diagnosztikai vizsgálatainak ismeretében. A CINtec® PLUS Kit által festett méhnyaki citológiai metszetek értelmezése során tekintettel kell lenni azon méhnyaki epithelialis sejtek jelenlétére, amelyek a p16 és Ki-67 egyidejű expresszióját jelző barna citoplazma és piros sejtmag festődést mutatnak. REF 9531
21 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
Egy vagy több olyan cervicalis epithelialis sejt jelenléte, amely a citoplazma barna immunfestődését ÉS a sejtmag piros immunfestődését mutatja ugyanazon sejten belül, pozitív CINtec® PLUS vizsgálati eredménynek tekintendő. Amennyiben nincs olyan méhnyaki epithelialis sejt, amely a citoplazma barna immunfestődését ÉS a sejtmag piros immunfestődését egyszerre mutatja, a CINtec® PLUS vizsgálat eredménye negatívnak tekintendő. Kérjük, vegye figyelembe, hogy azon méhnyaki epithelialis sejtek jelenléte, amelyek csak az egyik markerre vonatkozóan mutatnak immunreaktivitást (mint pl. p16 esetében kizárólag barna festődés, vagy Ki-67 esetében kizárólag piros festődés), nem minősül a CINtec® PLUS Kit vizsgálat pozitív eredményének, még abban az esetben sem, ha ugyanazon metszetben kimutatható a két eltérő immunreaktivitást mutató méhnyaki sejttípus együttes jelenléte. Súlyos dyskaryosist mutató, de p16 és Ki-67 kettős festődést nem prezentáló sejtek esetében a morfológiai értelmezési kritériumokat nem szabad figyelmen kívül hagyni.
IX. Korlátozások
Kizárólag szakszerű használatra. Az immuncitokémiai elvégzéséhez speciális képesítés szükséges.
Bármilyen pozitív vagy negatív festődés klinikai interpretációját a klinikai kontextus és a citológiai kritériumok ismeretében kell elvégezni. A pozitív vagy negatív festődés klinikai értelmezését ki kell egészíteni morfológiai tanulmányokkal, megfelelő pozitív és negatív kontrollokkal, valamint egyéb diagnosztikai vizsgálatokkal. A festett preparátumok készítéséhez használt antitesteket, reagenseket és módszereket ismerő, képzett patológus/citológus felelőssége, hogy értelmezze az immuncitokémiai preparátum készítésének és értelmezésének minden lépését.
Az immuncitokémiai festés eredményeit erősen befolyásolja a festett sejtek minősége. Ennek megfelelően, a protokoll lépések betartása a metszetek fixációja, mosása, szárítása és melegítése során, valamint a baktériumokkal fertőződött reagensek használatának megelőzése jelentős mértékben befolyásolja a festési eljárás végső eredményét. A protokolltól való eltérés műtermékek képződéséhez, az antitestek kicsapódásához és álnegatív eredményekhez vezethet. Az összefüggéstelen eredmények a fixáció során vétett hibáknak vagy a nem megfelelő mintavételnek tudhatók be.
A túlzott vagy nem teljes kontrasztfestés veszélyeztetheti az eredmények helyes értelmezését.
A gyártó ezeket az optimálisan hígított állapotban használandó antitesteket/reagenseket az ebben a kiadványban található utasítások betartása esetén biztosítja, előkészített folyadékalapú citológiai (LBC) metszeteken való immuncitokémiai vizsgálatok, ill. hagyományos kenetek esetén való felhasználásra. A javasolt vizsgálati eljárástól való bármilyen eltérés érvénytelenné teheti a várt eredményeket; megfelelő kontrollokat kell alkalmazni, és ezeket dokumentálni kell. Azok a felhasználók, akik eltérnek az ajánlott tesztelési eljárásoktól, ilyen körülmények között felelősséget kell, hogy vállaljanak a betegeredmények értékeléséért.
REF 9531
22 / 46
eljárások
2009-9531-001HU Rev 2.2
A fehérjék vagy szubsztrát reakciótermékek nem immunológiai kötődése miatt hamis pozitív eredmények fordulhatnak elő. Okozhatja még pszeudoperoxidáz aktivitás (erythrocyták) és endogén peroxidáz aktivitás (pl. citokróm-C). Ne cserélje fel a kit reagenseit más gyári számmal jelzett reagensekkel vagy egyéb gyártóktól származó reagensekkel.
X. Teljesítményjellemzők Klinikai teljesítmény A CINtec PLUS Kit klinikai teljesítményét három különálló tanulmányban határozták meg: a. a PALMS vizsgálat – Primary ASC-US LSIL Marker Study („Elsődleges ASC-US LSIL marker tanulmány”) b. az EEMAPS vizsgálat – European Equivocal or Mildly Abnormal Pap Cytology Study („Európai nem egyértelmű vagy enyhén abnormális Papleleteket vizsgáló tanulmány”) c. a Wolfsburg vizsgálat – a Wolfsburg Pap/HPV co-testing projekt részét képező alvizsgálat A tanulmányok leírása: a. PALMS – Primary ASC-US LSIL Marker Study A PALMS vizsgálat prospektív, nemzetközi, multicentrikus, diagnosztikus klinikai tanulmányként folyt. A tanulmány célja az volt, hogy igazolja a CINtec PLUS Kit magas fokozatú cervicalis intraepithelialis neoplasia (CIN2 és magasabb grádus, CIN2+) felismerésében játszott szerepét (a) rutin méhnyakrákszűrésen áteső nők körében, (b) olyan betegek alcsoportjában, akiknél a Pap-vizsgálat ASC-US-t igazolt (nem meghatározott jelentőségű atipikus laphámsejtek), vagy (c) olyan betegek alcsoportjában, akiknél a Pap-vizsgálat LSIL-t igazolt (alacsony fokozatú intraepithelialis laphám lézió). A tanulmány elsődleges célkitűzései: 1. Meghatározni a CINtec PLUS Kit szenzitivitását és specificitását a magas fokozatú cervicalis intraepithelialis neoplasia (CIN2+) felismerésére vonatkozóan méhnyakrákszűrés elsődleges környezetében; olyan nők körében, akiknél a Pap-vizsgálat ASC-US-t igazolt; olyan nők körében, akiknél a Pap-vizsgálat LSIL-t igazolt. A CINtec PLUS Kit magas fokozatú cervicalis intraepithelialis neoplasia (CIN2+) felismerésének szenzitivitása és specificitása a Pap-vizsgálat (szűrés) és a HPV-tesztek (ASC-US és LSIL osztályozás) viszonylatában. A tanulmány 27 349, 5 európai országban (Belgium, Franciaország, Németország, Olaszország, Spanyolország) rutin méhnyakrákszűréseket látogató nőbeteg bevonásával készült, akik írásos beleegyezést követően lettek besorolva. A szűrési vizit során két méhnyakmintát vettek minden résztvevő női pácienstől: - Az első méhnyaki mintavétel egy kefeszerű műszer segítségével történt, amelyet Pap-vizsgálat elvégzésére használnak vagy üveg metszeten történő hagyományos Pap-kenet vizsgálat révén, vagy a méhnyaki anyag folyadékalapú citológiai gyűjtő üvegcsébe való átvitelével (ThinPrep® Pap Test, Hologic™, Marlborough, MA; vagy SurePath™, BD Diagnostics, Burlington, NC), ami metszet előkészítésre szolgál Pap-vizsgálat során. 2.
REF 9531
23 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
-
Minden mintából egy másik metszet is készült vagy a hagyományos Papkenet kezdeti előkészítésére szolgáló mintavételi gépről származó reziduális anyagból („split sample” technika), vagy a folyadékalapú citológiai üvegcséből származó reziduális anyagból, amelyet később felhasználtak a p16/Ki-67 kettős festésű citológiai vizsgálathoz. Minden egyes vizsgálati alanytól vettek egy második mintát a DNAPap Cervical Sampler ™ (Qiagen, Hilden, Germany) felhasználásával, ami egy kefeszerű mintavételi műszer speciálisan HPV vizsgálati minták gyűjtésére szolgáló kollekciós médiummal kombinálva. Ezeket a mintákat később felhasználták HR-HPV fertőzések kimutatására a digene HC2 High-Risk HPV DNA Test® (Qiagen) módszert felhasználva.
A Pap-vizsgálatokat helyben végezték összesen 16 európai laboratóriumban a Bethesda osztályozó rendszert [28] alkalmazva. A kettős festésű citológiai vizsgálatokat központilag végezték a CINtec® PLUS Kit (Roche mtm laboratories AG) használati utasításai és protokolljai szerint. Értelmezés céljából egy 8 citotechnológusból álló független csapat tagjai végezték a metszetek szűrését kettős festődésű méhnyaki sejtek után kutatva. A citotechnológusokat a vizsgálat idejére a metszetek értelmezésének feladatával voltak megbízva. Minden kettős festődésű citológiai eredmény felülvizsgálatát és megerősítését egy 5 európai patológusból álló csapat végezte. A HPV-teszteket összesen 6 független klinikai laboratórium végezte Franciaországban, Németországban és Olaszországban. Minden pozitív vizsgálati eredmény, azaz ASC-US-t vagy magasabb fokozatú (ASC-US+) eredményt mutató Pap-citológia és/vagy pozitív CINtec PLUS teszteredmény és/vagy a pozitív HR-HPV teszteredmény (30 éves vagy idősebb nők körében), kolposzkópiai beutalót vont maga után. Kolposzkópia során klinikai indikáció szerint vettek mintát. A szövettani diagnózist H&E-vel festett, formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszetek alapján állították fel. Minden helyileg végzett patológiai eredményt összehasonlítottak egy független európai, minőségellenőrzést végző felülvizsgáló patológus eredményeivel. Amennyiben diszkrepancia mutatkozott a helyileg végzett és az elsődleges QC felülvizsgálati eredmények között, valamint CIN2 vagy magasabb fokozatú (CIN2+) diagnózis esetén a mintákat továbbküldték teljes QC felülvizsgálat céljából egy európai patológusokból álló bizottságnak, akiknek a szakterületük a nőgyógyászati patológia. Azokban az esetekben, ahol nem sikerült többségi egyezségre jutni a diagnózist illetően, „háromból kettő” konszenzus vagy külön határozathozatal szerepelt mint aranystandard. Szövettani eredmények a p16 immunhisztokémiai festődési mintázatának független értékelése révén lettek megerősítve egymást követő metszetek CINtec® Histology Kittel történő festésével (Roche mtm laboratories AG, REF 9511). Kizárólag azokban az esetekben hozott H&E és p16 metszeteken alapuló, különálló határozatot 3 QC felülvizsgálati patológus, amelyekben a p16 festődési mintázata nem támasztotta alá a H&E metszetek alapján megállapított szövettani diagnózist. A PALMS vizsgálat minden adata statisztikai korrekció után került leközlésre, mert az utánkövetés alatt egyenlőtlenségek adódtak a kolposzkópia kivitelezésében, és ezért a betegségmegállapítás is pontatlanná vált a 3 vizsgálat, azaz a Papvizsgálat, a CINtec PLUS, és a HPV-teszt tekintetében. b. EEMAPS – European Equivocal or Mildly Abnormal Pap Cytology Study
REF 9531
24 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
Az EEMAPS-et nemzetközi, multicentrikus, esetkontroll klinikai vizsgálatként folytatták le visszamenőleg gyűjtött folyadékalapú méhnyaki citológiai minták felhasználásával (ThinPrep®, Hologic™). A tanulmányt azzal a céllal hívták életre, hogy bebizonyítsák a CINtec PLUS teszt kiegészítő eljáráskénti felhasználhatóságát CIN2+ nőbetegek felismerésében ASC-US vagy LSIL kategóriába sorolt Pap-teszt eredményt (Bethesda osztályozó rendszer szerint [28]) mutató betegek alcsoportjában. Visszamaradt reziduális anyag állt rendelkezésre a ThinPrep® folyadékalapú citológiai üvegcsében. Olyan eseteket választottak be a tanulmányba, amelyek megfelelő szövettani mintával tudtak szolgálni a diagnosztikus utánkövetés során a Pap-vizsgálat beutalót követő 6 hónapon belül. A szövetmintákat méhnyaki punch-biopszia, kúpbiopszia és endocervicalis curettage révén nyerték. A tanulmány elsődleges célkitűzései: 1.
Meghatározni a CINtec PLUS Kit szenzitivitását és specificitását a CIN2+ felismerésében ASC-US vagy LSIL eredményű Pap-vizsgálatot adó nők körében.
2.
A CINtec PLUS Kit szenzitivitását és specificitását a CIN2+ felismerésében összehasonlítani a HC2 High-Risk HPV DNA Test® (Qiagen digene) szenzitivitásával és specificitásával ASC-US vagy LSIL eredményű Papvizsgálatot adó nők körében.
A HPV-tesztek feldolgozását központilag végezték egy Németországban akkreditált klinikai laboratóriumban a gyártó utasításai szerint. p16/Ki-67 kettős festésű citológia elvégzésére, ThinPrep® folyadékalapú citológiai üvegcsékből származó reziduális anyagot használtak fel, hogy friss metszeteket készítsenek T2000 ThinPrep® Processor (Hologic™) segítségével. Ezt a metszetek immunfestése követte a CINtec® PLUS Kit használati utasításai és protokolljai szerint. A metszetek szűrését egy citotechnológus végezte kettős festődésű méhnyaki sejtek után kutatva. Minden olyan eset, amely kapcsán a citotechnológus egy vagy több kettős festődésű sejtről számolt be, patológiai felülvizsgálat alá került végső kettős festődésű citológiai eredmények megerősítése céljából. A tanulmány során aranystandardként (diagnosztikus pontosság kritériuma) körülhatárolt szövetrészből származó mintákat használtak, amihez viszonyították a kettős festődésű citológia és a HPV-tesztek eredményeit. Minden esetben egy többségi konszenzuson alapuló diagnózis lett felállítva legalább 2 QC felülvizsgáló patológus által, akik egy öttagú csapatnak voltak a tagjai. A felülvizsgálatot végző patológusok nem ismerték a vizsgálati helyen végzett, elsődleges hisztopatológiai vizsgálatok eredményeit, sem egyéb vizsgálati eredményeket. Ebben a vizsgálatban egy kombinált felülvizsgálat volt lefolytatva H&E-nal festett metszetekkel és egymás után következő metszetek CINtec Histology Kittel (Roche mtm laboratories AG) való p16 festésével, amelyet egy QC felülvizsgáló patológus végzett. Az elemzéshez összesen 776 eset állt rendelkezésre, ebből 361 eset ASC-US, 415 eset pedig LSIL képét mutatta. c. A Wolfsburg vizsgálat – a Wolfsburg Pap/HPV co-testing projekt részét képező alvizsgálat
REF 9531
25 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
A vizsgálat alapvető célja az volt, hogy vizsgálják a CINtec® PLUS Kit mint szűrési teszt felhasználását, valamint a teszt Pap negatív és HPV pozitív teszteredményekhez való viszonyítása 30 éves vagy idősebb nők körében. A CINtec® PLUS Kit klinikai teljesítményének mutatóit értékelték magas fokozatú cervicalis intraepithelialis neoplasiában szenvedő nők diagnosztizálásának területén. A tanulmányt a Wolfsburg Pap/HPV co-testing projekt részét képező alvizsgálatként folytatták le. A tanulmány elsődleges célkitűzései: 1.
Meghatározni a kettős festésű citológia szenzitivitását és specificitását a HGCIN felismerésében méhnyakrákszűrés keretein belül.
2.
A HGCIN kettős festésű citológiával való felismerésének szenzitivitása és specificitása méhnyakrákszűrés keretein belül a folyadékalapú Pap-vizsgálat és a HPV-tesztek viszonylatában.
3.
A kettős festésű citológia diagnosztikus hatékonyságának értékelése Pap negatív, HPV pozitív teszteredmények szerint osztályozva.
A tanulmányt multicentrikus, retrospektív diagnosztikus tanulmányként folytatták le a tanulmányi minták prospektív gyűjtésével. 30 éves vagy idősebb nők vettek részt a Wolfsburg szűrési projektben írásos beleegyezés aláírását követően. A szűrési vizit során az első méhnyaki mintát vagy spatulával/kefével vagy egy kefeszerű műszer segítségével nyerték, amelyet egy ThinPrep® Pap test (Hologic™) mintavételi üvegcsébe helyeztek. Ezt követően egy második méhnyaki mintát vettek a DNAPap Cervical Sampler™ (Qiagen) használatával és a HPVtesztre szolgáló mintavételi üvegcsével a digene HC2 High-Risk HPV DNA Test® (Qiagen)-t alkalmazva. A Pap-vizsgálatokat (ThinPrep® Pap test) központilag végezték egy független laboratóriumban közvetlenül az első vizitet követően. Az első metszeten lévő mintát, amely folyadékalapú citológiai üvegcséből készült, Pap-vizsgálatra küldték. A HPV-teszteket egy központi klinikai laboratóriumban végezték Wolfsburgban. A nők beutalót kaptak kolposzkópiára kizárólag a Pap-vizsgálat és a HPV-teszt eredményeik alapján, Wolfsburg Pap/HPV-co-testing tanulmány algoritmusa szerint:
Az egyidejűleg Pap-vizsgálat pozitív (Pap IIw; a müncheni nomenklatúra szerint, majdnem megegyezik az ASC-US-sel) és HPV-teszt pozitív nőket azonnali hatállyal beutalták kolposzkópiára.
Azokat a nőbetegeket, akiknek vagy pozitív volt a Pap-vizsgálatuk, negatív HPV-teszttel, vagy negatív Pap-vizsgálatot és pozitív HPV-tesztet produkáltak, csak akkor utalták be kolposzkópiára, ha az egyik teszteredményük tartósan pozitív maradt az utánkövetés 6–12 hónapjában vagy ezt követően.
Akiknek mind a Pap-, mind a HPV-teszteredményük negatív lett, 5 éven keresztül nem kellett részt venniük ismételt méhnyakrákszűrésen.
A p16/Ki-67 kettős festésű citológiai vizsgálatokat retrospektíven végezték a ThinPrep® üvegcsék 1-2 éves tárolását követően. A metszetek előkészítése és az immunfestést központilag végezték a szponzor laboratóriumában. Egy 8 citotechnológusból álló független csapat tagjai végezték a metszetek szűrését kettős festődésű méhnyaki sejtek után kutatva. A citotechnológusok a PALMS és Wolfsburg vizsgálatok ideje alatt a metszetek értelmezésének feladatával voltak megbízva. Minden kettős festődésű citológiai eredmény felülvizsgálatát és megerősítését egy független patológus végezte. REF 9531
26 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
A szövettani mintavétel során nyert anyag alapján felállított szövettani diagnózis szolgált aranystandardként. Minden szövettani eredményt egy független, 6 európai patológusból álló QC felülvizsgálati bizottság hagyott jóvá, amelynek tagjai nem ismerték a vizsgálati helyekről származó elsődleges eredményeket. A QC felülvizsgálati folyamatot a PALMS vizsgálat során alkalmazott eljárás analógiájára folytatták le (lásd fent). A szűrt populáció keresztmetszeti elemzésére a Wolfsburg projekt keretein belül 4 246 30 éves vagy idősebb nőt választottak be összesen 7 976 nő közül 2007-ben és 2008-ban. A folyadékalapú citológiai üvegcsében elegendő mennyiségű sejtanyag maradt további feldolgozás céljából. A CINtec® PLUS felhasználhatóságának megítélése érdekében, az összes Pap negatív és HPV pozitív eredményű eset (n=427) részét képezte az analízisnek, akik összesen 7 976 nő közül lettek kiválasztva. Eredmények:
A táblázatokat és az 1. ábrát a 2. mellékletben találja! A CINtec® PLUS SZŰRÉSÉBEN
TESZT
KLINIKAI
TELJESÍTMÉNYE
MÉHNYAKRÁK
Amint azt az 1. táblázat mutatja, a CINtec® PLUS pozitív eredményeinek aránya összevethető szinten van a Pap-abnormalitások arányával (az ASC-US küszöbértéke vagy magasabb; ASC-US+), és a HR-HPV tesztek pozitivitási arányának kb. a felével, életkortól függetlenül. A 2. táblázatban a CINtec® PLUS teszt szenzitivitási és specificitási értékei szerepelnek szűrt populációban ahogy az a PALMS vizsgálatban szerepel. A CINtec® PLUS tesztelés szenzitivitása CIN2+-re minden életkor tekintetében 90,1% volt (95% konfidencia intervallum 85,3–93,5), szignifikánsan magasabb, mint a Pap-vizsgálat szenzitivitása (66,4%; 95% konfidencia intervallum 59,5–72,6; 36%os növekvés, p<0,0005). A HPV-teszt szenzitivitása CIN2+ felismerésére vonatkozóan 96,4% volt (95% konfidencia intervallum 93,1–98,3). A CINtec® PLUS teszt specificitása (95,3; 95% CI 95,0–95,6) hasonlóan magas volt, mint a Papvizsgálat specificitása (95,4%; 95% CI 95,2–95,7), míg a HPV-teszt specificitása 90,2% volt (95% CI 88,1–92,4), minden korosztályban. A specificitási arányban lévő különbségek a CINtec® PLUS vagy a Pap-vizsgálat vs. HPV-teszt között statisztikailag erősen szignifikánsak (p<0,0005), ahol a HPV-tesztek hamis pozitív eredményeinek aránya kétszer akkora minden korosztályban, valamint a <30 a ≥30 éves korosztályokkal szemben. A szenzitivitás és a specificitás értékelését mutató eredmények a CINtec® PLUS a Pap-vizsgálattal szemben és a HPV-teszt a Wolfsburg tanulmányban a 3. táblázatban látható. A CINtec® PLUS magas szintű szenzitivitása és specificitása a magas fokozatú CIN kimutatásában, amit a PALMS vizsgálatban igazoltak (lásd 2. táblázat) a független Wolfsburg tanulmányban megerősítettek a 30 éves és idősebb nők korosztályában. CINtec® PLUS TESZT KLINIKAI TELJESÍTMÉNYE AZ ASC-US EREDMÉNYŰ PAP-VIZSGÁLAT OSZTÁLYOZÁSÁBAN, A KOLPOSZKÓPIA SZÜKSÉGESSÉGÉNEK MEGÍTÉLÉSÉBEN A CINtec® PLUS szenzitivitása és specificitása a CIN2+ biopsziával megerősített kimutatásában a kolposzkópia idejében ASC-US citológiájú esetek osztályozásában, az összes korosztályban PALMS 94,6% (n=17/18) és 77,5%, (4. táblázat), illetve EEMAPS 92,2% (n=71/77) és 80,6% (5. táblázat). REF 9531
27 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
A HPV-teszt összehasonlítható szenzitivitás értékeket mutatott 100% (n=18/18) PALMS) és 90,9% (n=70/77) EEMAPS), de szignifikánsan alacsonyabb specificitási értékeket prezentált (60,7% PALMS és 36,3% EEMAPS). A javulás specificitás terén a fiatalabb korcsoportban még magasabb (pl. 30 évnél fiatalabb nők körében) amint azt az 5. táblázat is mutatja, valamint az idősebb korcsoportban (≥30 év) a CINtec® PLUS specificitása a HPV-teszt kétszerese (85,5% a 43,6%-kal szemben). Mivel a pozitivitási arány a CINtec® PLUS-ra vonatkozóan az ASC-US kategóriában a prospektív PALMS vizsgálatban 25,6% volt a 41,9%-kal szembeni HPV-teszttel, a CINtec® PLUS-szal való vizsgálat hatékonyabb ASC-US osztályzást tehet lehetővé, hasonló szenzitivitást nyújtva a magas fokozatú CIN esetében attól függetlenül, hogy kevesebb nőt utalnak be kolposzkópiára. CINtec® PLUS TESZT KLINIKAI TELJESÍTMÉNYE AZ LSIL EREDMÉNYŰ PAP-VIZSGÁLAT OSZTÁLYOZÁSÁBAN, A KOLPOSZKÓPIA SZÜKSÉGESSÉGÉNEK MEGÍTÉLÉSÉBEN A CINtec® PLUS vizsgálat pozitivitási arányait az LSIL kategóriájú citológiai esetekben a PALMS és az EEMAPS vizsgálatok szerint a 6. és a 7. táblázat ábrázolja összehasonlítva a HPV-teszt pozitivitási értékeivel. Az 52,4%-os pozitivitási érték (PALMS) és 52,3% (EEMAPS) a CINtec® PLUS vizsgálatra vonatkozóan LSIL-ben jelentősen alacsonyabb mint 83,9% (PALMS) és 86,2% (EEMAPS) a pozitív HR-HPV teszt eredmények esetében, rámutatva a CINtec® PLUS teszt potenciáljára mint az LSIL Pap-vizsgálat eredmények hatékony osztályozási eszközére. A CINtec® PLUS szenzitivitása és specificitása a CIN2+ biopsziával megerősített kimutatásában a kolposzkópia idejében LSIL citológiájú esetek osztályozásában, az összes korosztályban PALMS 85,4% (n=54/63) és 53,9%, (6. táblázat), illetve EEMAPS 94,2% (n= 129/137) és 68,0% (7. táblázat). A CINtec® PLUS TESZT KLINIKAI TELJESÍTMÉNYE A NEGATÍV PAP- ÉS POZITÍV HPV-TESZT EREDMÉNYT MUTATÓ NŐK OSZTÁLYOZÁSÁBAN, AZ AZONNALI KOLPOSZKÓPIA SZÜKSÉGESSÉGÉNEK MEGÍTÉLÉSÉBEN Az 1. ábra a CINtec® PLUS pozitivitási arányát mutatja a Pap negatív, de HR-HPV pozitív eredményű esetek osztályozásában. A Pap negatív, HPV pozitív esetek kb. negyede (n=109; 25,5%) mutatott p16 és Ki-67 kettős festődésű méhnyaki epithelialis sejteket, míg 318 a 427 esetből (74,5%) negatív eredményt hozott. A CINtec® PLUS pozitív esetek több mint 90%-ában igazolódott CIN2+ fennállása, azaz 37 biopsziából 34 volt bizonyítottan CIN2+, amelyek az utánkövetés során kerültek felismerésre (átlagos utánkövetési idő: 12,5 hónap).
REF 9531
28 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
XI. Hibaelhárítás Probléma
Valószínű ok
1. A metszetek nem festődnek
1a. A használati eltérés.
Javasolt teendő utasítástól
való 1a. Figyelmesen olvassa végig a használati utasítást és tartsa be az abban foglalt eljárások előírásait.
1b. A reagens üvegcsék a 1b. A reagens üvegcsék helyes reagenstartó állvány nem elrendezését a Reagent Map megfelelő helyeire lettek („reagens térkép”) segítségével elhelyezve. ellenőrizheti. 1c. Elégtelen mennyiségű reagens az 1c. A program indítása előtt győződjön üvegcsében. meg arról, hogy elegendő mennyiségű reagens van az üvegcsékbe töltve. A térfogatok megfelelő értékeit a Reagent Mapen találja. 1d. A LabVision vagy Dako 1d. Ellenőrizze, hogy a puffer mennyisége Autostainerekből hiányzik a Wash elegendő-e. Amennyiben nem, töltse Buffer. meg a tartályt pufferrel és töltse fel a pumpát. Ellenőrizze, hogy a fecskendő (a mozgó kar bal oldalán található) körüli tiszta műanyag cső tartalmaz-e légbuborékot – amennyiben igen, a buborék eltávolítása megoldhatja a problémát.
REF 9531
29 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
2. A metszetek gyenge festődése
2a. Nem megfelelő visszanyerés.
epitóp 2a. Használjon frissen előkészített Epitope Retrieval Solutiont és/vagy győződjön meg arról, hogy az Epitope Retrieval Solution eléri-e a 95-99 °C-ot 10 perc alatt, valamint 20 perc alatt lehűl-e az oldat. Biztosítsa, hogy az epitóp visszanyerési eljárás során nem löttyen víz a hőálló festőedényekbe. További ajánlásokat a 2.2. pontban talál.
2b. A reagensek inkubációs ideje nem 2b. Tanulmányozza a 2.3.1./ 2.3.2. megfelelő. pontban található Festési eljárással kapcsolatos ajánlásokat. 2c. Helytelen fixációs módszer.
2c. Ügyeljen arra, hogy a citológiai preparátumok fixációja a VII. pontban leírtak szerint történt, és alternatív rögzítőszer nem került felhasználásra.
2d. Az epitope-retrieval solution 2d. Győződjön meg arról, hogy az hígítására használt víznek túl ionmentesített víz előállítására magas az ionkoncentrációja. szolgáló ioncserélő oszlop átesett-e a rutin karbantartási vizsgálaton. 2e. A Dako vagy LabVision 2e. Ismertetve Autostainerekből hiányzik a Wash pontjában. Buffer.
a
Hibaelhárítás
1d.
2f. A Shandon Coverplate System; kit 2f. Várjon 5 percet, miután Wash buffert komponenseinek mosó pufferrel töltött a Shandon Coverplate System való felhígulása a mosási tölcsérébe, és ellenőrizze, hogy nem lépéseket követő helytelen maradt-e vissza Wash Buffer a várakozási idő miatt. tölcsérben, ami a következő reagens hígulását okozhatja. 3. Gyenge festődés (piros) vagy a festődés hiánya pozitív kontroll metszeteken
3a. Hematoxilintartalmú használata (pl. Harris’).
alkohol 3a. A Fast Red oldódik EtOH-ban, ezért alkoholmentes Hematoxilin használata kötelező a Fast Red festék (Ki67-jel) elhalványodását megelőzendő.
3b. Az üveg vagy film fedőlemez 3b. Kövesse a 2 lépésből álló rögzítési felhelyezése előtt dehidrálódtak a protokollt használata során, amit a metszetek fokozatosan emelt tartós üveg vagy film fedőlemez felhelyezése követ; CINtec PLUS mennyiségű alkohol használata miatt. Mount. További ajánlásokat a 2.5 pontban talál. 3c. A Fast Red munkaoldat nem az 3c. A Fast Red munkaoldatot közvetlenül ajánlások szerint lett előkészítve. használat előtt készítse elő; az oldatot 15 percen belül alkalmazza a metszeten, máskülönben a jel intenzitásának és a vizsgálat szenzitivitásának csökkenése léphet fel.
REF 9531
30 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
4. A metszetek túlságos háttérfestődése
4a. Hagyományos kenetek használata 4a. Az eljárást a 2.1. pont szerint végezze. során spray fixációs reagens (polietilén-glikol) tökéletlen eltávolítása. 4b. A metszetek elégtelen öblítése.
4b. A pufferfürdőkben és mosóüvegekben friss oldatot használjon. Győződjön meg arról, hogy az Autostainer műszer futtatása előtt a műszer megfelelően lett-e beindítva, illetve elegendő mennyiségű-e a felhasznált puffer; friss puffer és reagens oldatokat használjon.
4c. A minta száradása a festési eljárás 4c. Az Autostainer műszer használata során. során győződjön meg arról, hogy elegendő mennyiségű reagenst használt-e fel, illetve futtatás során a műszer megfelelően le van-e zárva; Ne tegye ki a metszeteket magas hőmérsékletnek vagy száraz környezetnek. Ellenőrizze, hogy a programozott reagens térfogat és a cseppentési zóna kellőképp lefedik-e a metszet sejtanyagot tartalmazó részeit. Ellenőrizze, hogy a puffer mennyisége elegendő-e. Amennyiben nem, töltse meg a tartályt pufferrel és töltse fel a pumpát. Ellenőrizze, hogy a fecskendő (a mozgó kar bal oldalán található) körüli tiszta műanyag cső tartalmaz-e légbuborékot – amennyiben igen, a buborék eltávolítása megoldhatja a problémát. Az Autostainer működtetése során kerülje a Fast Red munkaoldat inkubáció késleltetését a szárítási műtermékek képződésének minimalizálása érdekében.
REF 9531
31 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
4d. Helytelen fixációs módszer.
4d. Kizárólag az itt leírt rögzítőszereket használja. A rosszul fixálódó sejtek túlzott háttérfestődést mutathatnak.
4e. A reagensek nem specifikusan 4e. Ellenőrizze a mintára kötődnek a sejtekhez. fixációs módszert.
vonatkozó
4f. A minta száradása az Autostainer 4f. A futtatás megkezdése során a műszer beállítása közben. mintákat vonja be reagenssel (pufferrel). 4g. A minták száradása a Shandon 4g. Töltsön meg egy lapos edényt Coverplate system ragasztása desztillált vagy ionmentesített vízzel. közben. Vegyen ki egy metszetet az Epitope Retrieval Solutionből, majd illessze össze a metszetet és a fedőlapot az edénybe merítve (víz alatt). 5. Túlzottan erős specifikus festődés
5a. Helytelen fixációs módszer.
5a. Biztosítsa a megfelelő rögzítőszert és fixációs módszert.
5b. A reagensek meghosszabbodott 5b. Tanulmányozza és tartsa be a fenti inkubációs ideje. 2.3.1./2.3.2. pontokban leírt festési protokollt. 5c. Nem megfelelő a mosóoldat.
5c. Használjon Wash (katalógusszám 8550).
Buffert
6. Kettős immunreaktív sejtek értékelése nem lehetséges
6a. Túl erős kontrasztfestés.
7. Üveg vagy film fedőlemezek felhelyezése nem megfelelő
7a. Üveg vagy film fedőlemezt nem 7a. Kerülje a légbuborékok képződését ® CINtec PLUS Mount (vízbázisú lehet rendesen felhelyezni. fedőlemez) alkalmazása során.
8. Foltos vagy szórványos festődési minta Shandon Coverplate System használata után
8a. A tárgylemez és a fedőlemez közé 8a. A tárgylemez és a fedőlemez légbuborékok kerültek. ragasztása a Protocol REF 2010953-009EN protokoll szerint végzendő (elérhető: Roche mtm laboratories AG).
9. Xilénbázisú rögzítő közeggel való metszetrögzíté s után repedés alakul ki
9a. A elégtelen szárítása a metszetek xilén bázisú rögzítő közeggel való ® rögzítése előtt; CINtec PLUS Mount.
REF 9531
Hematoxilin- 6a. Csökkentse a hematoxilin inkubációs idejét és/vagy a csapvízben vagy szalmiákszeszben végzett bluing eljárást.
Tartsa be az ajánlott szárítási időt folyékony fedőlemez esetén.
A tárgylemezen lévő légbuborékokat ragasztás előtt el kell távolítani.
32 / 46
®
9a. A CINtec PLUS Mounttal bevont metszeteket éjszaka szobahőmérsékleten szárítsa vagy legalább 4 órán át 37 °C-on. A ® CINtec PLUS Mountnak teljesen meg kell száradnia.
2009-9531-001HU Rev 2.2
XII.
Jelek Jel:
Magyarázat: Katalógusszám Tételkód In vitro diagnosztikai orvostechnikai eszköz Gyártó Elegendő mennyiséget tartalmaz
vizsgálathoz Olvassa el a használati útmutatót Felhasználható Hőmérséklet korlátozás
XIII. Gyártó Gyártja:
Roche mtm laboratories AG Sandhofer Straße 116 D-68305 Mannheim Germany www.cintec.info
XIV. Átdolgozás állapota A jelenlegi használati útmutató a 2013 januárban kiadott 2.2-es verziónak felel meg.
XV. Jogi nyilatkozat A szövegben említett SuperFrost®, Eukitt, Merckofix®, Autostainer, SurePath™, ThinPrep®, Shandon Coverplate™ és Hologic™ védjegyek az azokat illető védjegyjogosultak tulajdonába tartoznak. Ezen védjegyjogosultak közül egyik sem áll kapcsolatban a Roche mtm laboratories AG-val. A CINtec®, mtm laboratories és E6H4™ védjegyek a Roche mtm laboratories AG kizárólagos tulajdonát képezik és nem használhatók fel előzetes írásos belegyezés nélkül Roche mtm laboratories AG. A CINtec® PLUS Kit a Roche mtm laboratories AG által szabadalmazott technológián alapul országos és nemzetközi szellemi tulajdonjogok által védve, beleértve az European Patent EP 1 092 155 (incl. DE, UK, FR, ES, IT), EP 1 416 278 (beleértve DE, UK, FR, ES, IT), EP 0 665 886, U.S. Patent US 6,709,832, US 7,425,617, US 7,691,632 és US Patent application US 2009/0176204; és további országos szabadalmakat.
REF 9531
33 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
1. melléklet: Szakirodalom 1. 2.
3. 4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Arbyn M, Sasieni P, Meijer CLJM, et al. Clinical applications of HPV testing: a summary of meta-analyses. Vaccine 2006;24(Suppl 3):S78-89. INK4a Bergeron C, Ordi J, Schmidt D, Trunk MJ, Keller T, Ridder R. Conjunctive p16 testing significantly increases accuracy in diagnosing high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Am J Clin Pathol. 2010;133:395-406. Brown DC, Gatter KC. Ki-67 protein: the immaculate deception? Histopathology 2002;40:2-11. Carozzi F, Confortini M, Dalla Palma P, et al. Use of p16INK4a over-expression to increase the specificity of human papillomavirus testing: a nested substudy of the NTCC randomised controlled trial. Lancet Oncol. 2008;9:937-45. Chen SF, Yang SF, Chu TY, et al. Which test is a better strategy to determine the outcome of atypical glandular cell-categorized Pap smears? Immunocytochemical INK4a p16 expression or human papillomavirus test a retrospective cohort study. Gynecol Oncol. 2005;99:578-84. Cuschieri K, Wentzensen N. Human papillomavirus mRNA and p16 detection as biomarkers for the improved diagnosis of cervical neoplasia. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008;17:2536-45. INK4a Del Pino M, Garcia S, Fusté V, et al. Value of p16 as a marker of progression/ regression in cervical intraepithelial neoplasia grade 1. Am J Obstet Gynecol. 2009;201. Denton K, Bergeron C, Klement P, et al. The sensitivity and specificity of p16INK4a Cytology versus HPV Testing for Detecting High-Grade Cervical Disease in the Triage of ASC-US and LSIL Pap Cytology Results. Am J Clin Pathol. 2010;134:12-21. INK4a Guo M, Hu L, Baliga M, et al. The predictive value of p16 and hybrid capture 2 human papillomavirus testing for high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Am J Clin Pathol. 2004;122:894-901. INK4a Holladay EB, Logan S, Arnold J, et al. A comparison of the clinical utility of p16 immunolocalization with the presence of human papillomavirus by hybrid capture 2 for the detection of cervical dysplasia/neoplasia. Cancer Cytopathol. 2006;108:451-61. INK4a Horn LC, Reichert A, Oster A, et al. Immunostaining for p16 used as a conjunctive tool improves interobserver agreement of the histological diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia. Am J Surg Pathol. 2008;32:502-12. INK4a Ishikawa M, Fujii T, Saito M, et al. Overexpression of p16 as an indicator for human papillomavirus oncogenic activity in cervical squamous neoplasia. Int J Gynecol Cancer 2006;16:347-53. INK4a Klaes R, Friedrich T, Spitkovsky D, et al. Overexpression of p16 as a specific marker for dysplasia and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri. Int J Cancer 2001;92:276-84. INK4a Klaes R, Benner A, Friedrich T, et al. p16 immunohistochemistry improves interobserver agreement in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia. Am J Surg Pathol. 2002; 26:1389-99. INK4a Meyer JL, Hanlon DW, Andersen BT, et al. Evaluation of p16 expression in INK4a ThinPrep cervical specimens with the CINtec p16 assay. Cancer Cytopathol. 2007;111:83-92. Nanda K, McCrory DC, Myers ER, et al. Accuracy of the Papanicolaou test in screening for and follow-up of cervical cytologic abnormalities: a systematic review. Ann Intern Med. 2000;132:810-9. INK4a Negri G, Egarter-Vigl E, Kasal A, et al. p16 is a useful marker for the diagnosis of adenocarcinoma of the cervix uteri and its precursors: an immunohistochemical study with immuncytochemical correlations. Am J Surg Pathol. 2003; 27:187-93. INK4a Negri G, Vittadello F, Romano F, et al. p16 expression and progression risk of lowgrade intraepithelial neoplasia of the cervix uteri. Virchows Arch. 2004;445:616-20.
REF 9531
34 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
19.
20. 21.
22.
23. 24. 25.
26. 27.
28. 29.
30. 31.
32.
33.
34.
35. 36.
37.
INK4a
Nieh S, Chen SF, Chu TY, et al. Is p16 expression more useful than human papillomavirus test to determine the outcome of atypical squamous cells of undertemined significance-categorized Pap smears? A comparative analysis using abnormal cervical smears with follow-up biopsies. Gynecol Oncol. 2005;97:35-40. INK4a Ordi J, Garcia S, del Pino M, et al. p16 immunostaining identifies occult CIN lesions in HPV-positive women. Int J Gynecol Pathol. 2008;28:90-7. INK4a Redman R, Rufforny I, Liu C, et al. The utility of p16 in discriminating between cervical intraepithelial neoplasia 1 and nonneoplastic equivocal lesions of the cervix. Arch Pathol Lab Med. 2008;132:795-9. Sano T, Oyama T, Kashiwabara K, et al. Expression status of p16 protein is associated with human papillomavirus oncogenic potential in cervical and genital lesions. Am J Pathol. 1998 ;153:1741-8. Schiffman M, Solomon D. Findings to date from the ASCUS-LSIL Triage Study (ALTS). Arch Pathol Lab Med. 2003 Aug;127(8):946-9. Schiffman M, Castle PE, Jeronimo J, et al. Human papillomavirus and cervical cancer. Lancet 2007;370:890-907. Schlederman D, Andersen BT, Bisgaard K, et al. Are adjunctive markers useful in INK4a routine cervical cancer screening? Application of p16 and HPV-PCR on ThinPrep samples with histological follow-up. Diagn Cytopathol. 2008;36:453-9. Scholzen T, Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 2000;182:311-22. Solomon D, Schiffman M, Tarone R. Comparison of three management strategies for patients with atypical squamous cells of undetermined significance: baseline results from a randomized trial. J Natl Cancer Inst. 2001;93:293-9. Solomon D, Davey D, Kurman R, et al. The 2001 Bethesda system. Terminology for reporting results of cervical cytology. JAMA. 2002;287:2114-9. Szarewski A, Ambroisine L, Cadman L, et al. Comparison of predictors for high-grade cervical intraepithelial neoplasia in women with abnormal smears. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008;17:3033-42. Trunk MJ, Dallenbach-Hellweg G, Ridder R, et al. Morphologic characteristics of INK4a p16 -positive cells in cervical cytology samples. Acta Cytol. 2004;48:771-82. von Knebel Doeberitz M. New markers for cervical dysplasia to visualise the genomic chaos created by aberrant oncogenic papillomavirus infections. Eur J Cancer. 2002; 38:2229-42. INK4a Wang SS, Trunk M, Schiffman M, et al. Validation of p16 as a marker of oncogenic human papillomavirus infection in cervical biopsies from a population-based cohort in Costa Rica. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004;13:1355-60. INK4a Wentzensen N, Bergeron C, Cas F, et al. Evaluation of a nuclear score for p16 – stained cervical squamous cells in liquid-based cytology samples. Cancer Cytopathol. 2005;105:461-7. Wentzensen N, Bergeron C, Cas F, et al. Triage of women with ASCUS and LSIL INK4a cytology. Use of qualitative assessment of p16 positive cells to identify patients with high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Cancer Cytopathol. 2007;111:58-66. Wentzensen N, von Knebel Doeberitz M. Biomarkers in cervical cancer screening. Dis Markers. 2007;23:315-30. Wright JD, Rader JS, Davila R, et al. Human papillomavirus triage for young women with atypical squamous cells of undetermined significance. Obstet Gynecol. 2006;107:822-9. Yoshida T, Fukuda T, Sano T, et al. Usefulness of liquid-based cytology specimens for the immunocytochemical study of p16 expression and human papillomavirus testing: a comparative study using simultaneously sampled histology materials. Cancer Cytopathol. 2004;102:100-8.
REF 9531
35 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
2. melléklet: Táblázatok A táblázatok és az 1. ábra szójegyzéke
Xx–xx éves nő: Frauen im Alter von xx–xx Jahren/Femmes agées de xx-xx ans/Donne di età compresa tra xx e xx anni/Mujeres de xx-xx años Pap-vizsgálat: Pap-Zytologie/Frottis/Pap-test/Citología Pap ASC-US vagy magasabb fokozatú: ASC-US oder höher/ASC-US ou grade supérieur/ASC-US o superiore/ASCUS o superior Szenzitivitás: Sensitivität/Sensibilité/Sensibilità/Sensibilidad Specificitás: Spezifität/Spécificité/Specificità/Especificidad Konfidenciaintervallum: Confidence Interval/Konfidenzintervall/Intervalle de Confiance/Intervallo di Confidenza/Intervalo de Confianza Kolposzkópiai beutaló: Überweisung zur Kolposkopie/Orientation vers une colposcopie/Richiesta di colposcopia/Derivación a colposcopia Magas fokozatú cervicalis intraepithelialis neoplasia: High-grade cervical intraepithelial neoplasia/Hochgradige zervikale intraepitheliale Läsionen/Lésions cervicales intraépithéliales de haut grade/Lesioni intraepiteliali cervicali di alto grado accertate/Lesiones cervicales intraepiteliales de alto grado
REF 9531
36 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
1. táblázat: PALMS vizsgálat: Pozitív CINtec® PLUS tesztek aránya a szűrt populációban, a Pap-vizsgálat (ASC-US vagy magasabb) és a HC2 magas rizikójú HPV DNS-teszt viszonylatában.
Pap vizsgálat, ASC-US vagy magasabb
18–65 éves nők
®
CINtec PLUS pozitív
HR-HPV pozitív
n
%
n
%
n
%
1,407
5,2%
1,462
5,4%
2,918
10,7%
563
8,3%
605
8,9%
1,376
20,2%
844
4,1%
857
4,2%
1,542
7,5%
n= 27 248
18–29 éves nők n= 6 798
30–65 éves nők n= 20 450
REF 9531
37 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
2. táblázat: PALMS vizsgálat: A CINtec® PLUS szenzitivitási és specificitási arányai szűrt populációban. Pap-vizsgálat és HC2 magas rizikójú HPV DNS-teszt eredményei összehasonlítás céljából.
CIN2+ Szenzitivitás % (95% konfidencia intervallum)
CIN2+ Specificitás % (95% konfidencia intervallum)
CIN3+ Szenzitivitás % (95% konfidencia intervallum)
18–65 éves nők (n= 25 577; 205 CIN 2+, 111 CIN 3+) Pap-vizsgálat ®
CINtec PLUS
66,4
95,4
(59,5–72,6)
(95,2–95,7)
90,1
95,3
(85,3–93,5)
HR-HPV
(95,0–95,6)
96,4
90,2
(93,1–98,3)
(88,1–92,4)
71,3 (61,9–79,1)
90,4 (83,5–94,6)
98,9 (94,8–99,7)
18–29 éves nők (n= 6 372; 82 CIN 2+, 41 CIN 3+) Pap-vizsgálat ®
CINtec PLUS
HR-HPV
67,7
92,8
74,4
(56,5–77,2)
(92,1–93,4)
(58,2–85,9)
93,3
92,3
93,2
(85,8–96,9)
(91,6–93,0)
(80,8–97,8)
97,4
81,4
97,1
(91,3–99,5)
(77,3–85,7)
(86,6–99,4)
64,9
96,3
69,1
(56,0–72,9)
(96,0–96,6)
(57,1–78,9)
30–65 éves nők (n= 19 205; 123 CIN 2+, 70 CIN 3+) Pap-vizsgálat ®
CINtec PLUS
HR-HPV
REF 9531
87,8
96,3
88,5
(80,8–92,5)
(96,0–96,6)
(78,7–94,1)
95,6
93,1
100
(89,0–98,3)
(92,7–93,5)
(94,9–100)
38 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
3. táblázat: Wolfsburg tanulmány: A CINtec® PLUS szenzitivitási és specificitási arányai 30 éves vagy idősebb nők szűrt populációjában. Pap-vizsgálat és HC2 magas rizikójú HPV DNS-teszt eredményei összehasonlítás céljából.
CIN2+ Szenzitivitás
CIN2+ Specificitás
CIN3+ Szenzitivitás
CIN3+ Specificitás
% (95% konfidencia intervallum)
% (95% konfidencia intervallum)
% (95% konfidencia intervallum)
% (95% konfidencia intervallum)
30 éves vagy idősebb nők (n=4 246; 40 CIN2+, 28 CIN3+) Pap-vizsgálat ®
CINtec PLUS HR-HPV
REF 9531
65,0
98,7
67,9
98,5
(48,3–79,4)
(98,3–99,0)
(47,6–84,1)
(98,1–98,9)
92,5
97,5
100
97,3
(79,6–98,4)
(97,0–97,9)
(87,7–100)
(96,7–97,7)
100
94,1
100
93,8
(91,2–100)
(93,3–94,8)
(87,7–100)
(93,0–94,5)
39 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
4. táblázat: PALMS vizsgálat: Teszt pozitivitási (kolposzkópiai beutalók aránya), szenzitivitási és specificitási arányok a CINtec® PLUS-ra vonatkozóan az ASC-US Pap-vizsgálat eredmények szerint osztályozva. HC2 magas rizikójú HPV DNS-teszt eredményei összehasonlítás céljából.
Kolposzkópiai beutaló % (n)
CIN2+ Szenzitivitás
CIN2+ Specificitás
CIN3+ Szenzitivitás
% (95% konfidencia intervallum)
% (95% konfidencia intervallum)
% (95% konfidencia intervallum)
18–65 éves nők, ASC-US (n=575; 18 CIN 2+, 14 CIN 3+) ®
CINtec PLUS HR-HPV
25,6
94,6
77,5
100
(147)
(70,2–99,2)
(73,7–80,9)
(76,8–100)
41,9
100
60,7
100
(241)
(81,5–100)
(56,5–64,7)
(76,8–100)
18–29 éves nők, ASC-US (n=219; 10 CIN 2+, 8 CIN 3+) ®
CINtec PLUS HR-HPV
32,0
100
73,0
100
(70)
(69,2–100)
(66,2–78,8)
(63,1–100)
57,5
100
45,5
100
(126)
(69,2–100)
(38,8–52,5)
(63,1–100)
30–65 éves nők, ASC-US (n=356; 8 CIN 2+, 6 CIN 3+) ®
CINtec PLUS HR-HPV
REF 9531
21,6
87,2
80,3
100
(77)
(45,7–98,2)
(75,6–84,2)
(54,1–100)
32,3
100
69,7
100
(115)
(63,1–100)
(64,6–74,3)
(54,1–100)
40 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
5. táblázat: EEMAPS vizsgálat: Teszt pozitivitási (kolposzkópiai beutalók aránya), szenzitivitási és specificitási arányok a CINtec® PLUS-ra vonatkozóan az ASC-US Pap-vizsgálati eredmények szerint osztályozva. HC2 magas rizikójú HPV DNS-teszt eredményei összehasonlítás céljából.
Kolposzkópiai beutaló %
CIN2+ Szenzitivitás
CIN2+ Specificitás
CIN3+ Szenzitivitás
% (95% konfidencia intervallum)
% (95% konfidencia intervallum)
% (95% konfidencia intervallum)
18–65 éves nők, Pap-vizsgálat ASC-US (n= 361; 77 CIN2+, 51 CIN3+) ®
CINtec PLUS HR-HPV
34,8 69,6
92,2
80,6
92,2
(83,8–97,1)
(75,6–85,1)
(81,1–97,8)
90,9
36,3
90,2
(82,2–96,3)
(30,7–42,2)
(78,6–96,7)
18–29 éves nők, Pap-vizsgálat ASC-US (n= 136; 31 CIN2+, 20 CIN3+) ®
CINtec PLUS HR-HPV
43,1 81,8
96,8
72,4
100
(83,3–99,9)
(62,8–80,7)
(83,2–100)
100
23,8
100
(88,8–100)
(16,0–33,1)
(83,2–100)
30–65 éves nők, Pap-vizsgálat ASC-US (n= 225; 46 CIN2+, 31 CIN3+) ®
CINtec PLUS HR-HPV
REF 9531
29,8 62,2
89,1
85,5
87,1
(76,4–96,4)
(79,4–90,3)
(70,2–96,4)
84,8
43,6
83,9
(71,1–93,7)
(36,2–51,2)
(66,3–94,5)
41 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
6. táblázat: PALMS vizsgálat: Teszt pozitivitási (kolposzkópiai beutalók aránya), szenzitivitási és specificitási arányok a CINtec® PLUS-ra vonatkozóan az LSIL Pap-vizsgálati eredmények szerint osztályozva. HC2 magas rizikójú HPV DNS-teszt eredményei összehasonlítás céljából.
Kolposzkópi ai beutaló % (n)
CIN2+ Szenzitivitás
CIN2+ Specificitás
CIN3+ Szenzitivitás
% (95% konfidencia intervallum)
% (95% konfidencia intervallum)
% (95% konfidencia intervallum)
18–65 éves nők, LSIL (n= 529; 63 CIN 2+, 25 CIN 3+) ®
CINtec PLUS HR-HPV
52,4
85,4
53,9
88,0
(277)
(74,5–92,2)
(49,1–58,6)
(68,7–96,0)
83,9
98,1
18,8
100
(444)
(87,9–99,7)
(15,4–22,7)
(86,3–100)
18–29 éves nők, LSIL (n= 250; 26 CIN 2+, 8 CIN 3+) ®
CINtec PLUS HR-HPV
54,8
84,2
50,5
87,9
(137)
(65,1–93,9)
(43,6–57,3)
(47,4–98,3)
88,0
95,3
13,3
100
(220)
(73,7–99,3)
(9,3–18,7)
(63,1–100)
30–65 éves nők, LSIL (n= 279; 37 CIN 2+, 17 CIN 3+) ®
CINtec PLUS HR-HPV
REF 9531
50,2
86,0
56,9
87,8
(140)
(70,7–94,0)
(50,2–63,3)
(62,4–96,9)
80,3
100
23,6
100
(224)
(90,5–100)
(18,5–29,5)
(80,5–100)
42 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
7. táblázat: EEMAPS vizsgálat: Teszt pozitivitási (kolposzkópiai beutalók aránya), szenzitivitási és specificitási arányok a CINtec® PLUS-ra vonatkozóan az LSIL Pap-vizsgálati eredmények szerint osztályozva. HC2 magas rizikójú HPV DNS-teszt eredményei összehasonlítás céljából.
Kolposzkópiai beutaló %
CIN2+ Szenzitivitás
CIN2+ Specificitás
CIN3+ Szenzitivitás
% (95% konfidencia intervallum)
% (95% konfidencia intervallum)
% (95% konfidencia intervallum)
18–65 éves nők, Pap-vizsgálat LSIL (n=415; 137 CIN2+, 72 CIN3+) ®
CINtec PLUS HR-HPV
52,3 86,2
94,2
68,0
95,8
(88,8–97,4)
(62,2–73,4)
(88,3–99,1)
96,4
19,1
95,8
(91,7–98,8)
(14,6–24,2)
(88,3–99,1)
18–29 éves nők, Pap-vizsgálat LSIL (n=142; 55 CIN2+, 32 CIN3+) ®
CINtec PLUS HR-HPV
60,6 87,3
96,4
62,1
96,9
(87,5–99,6)
(51,0–72,3)
(83,8–99,9)
94,5
17,2
93,8
(84,9–98,9)
(10,0–26,8)
(79,2–99,2)
30–65 éves nők, Pap-vizsgálat LSIL (n=273; 82 CIN2+, 40 CIN3+) ®
CINtec PLUS HR-HPV
REF 9531
48,4 85,3
92,7
70,7
95,0
(84,8–97,3)
(63,7–77,0)
(83,1–99,4)
97,6
19,9
97,5
(91,5–99,7)
(14,5–26,3)
(86,8–99,9)
43 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
1. ábra: Wolfsburg tanulmány: Folyamatábra, ami bemutatja a biopsziával megerősített CIN2+ 30 éves és idősebb nők (Pap-teszt negatív, HPV-pozitív) eseteinek eloszlását a CINtec® PLUS pozitív és negatív csoportokon belül.
74,5%
25,5%
68,8%
REF 9531
31,2%
99,1%
44 / 46
0,9%
2009-9531-001HU Rev 2.2
8. táblázat: Wolfsburg tanulmány: A CINtec® PLUS szenzitivitási és specificitási arányai (biopsziával megerősített CIN2+ esetében) Pap negatív, HPV pozitív teszteredmények szerint osztályozva. A számok 147 kolposzkópiás biopszia kiértékelése alapján lettek meghatározva, amelyeket átlagosan 12,5 hónapos utánkövetés alatt végeztek el.
CIN2+ Szenzitivitás
CIN2+ Specificitás
CIN3+ Szenzitivitás
CIN3+ Specificitás
% (95% konfidencia intervallum)
% (95% konfidencia intervallum)
% (95% konfidencia intervallum)
% (95% konfidencia intervallum)
30 éves vagy idősebb nők, normális Pap-vizsgálat, pozitív HPV-teszt (n=147, 37 CIN2+, 28 CIN3+) ®
CINtec PLUS
REF 9531
91,9
84,5
96,4
79,8
(78,1–98,3)
(76,4–90,7)
(81,7–99,9)
(71,5–86,6)
45 / 46
2009-9531-001HU Rev 2.2
