CINtec Histology Kit. Használati utasítás

Használati utasítás

CINtec® Histology Kit

A CINtec® Histology Kit egy immunhisztokémiai assay, amely a p16 INK4a antigén kvalitatív detektálására szolgál a méhnyakból származó, formalinnal fixált és paraffinba ágyazott szövetmetszetekben. Használata H&E-nal megfestett, ugyanabból a méhnyaki szövetmintából elkészített metszetek esetén ajánlott, amely hasznos eszközként szolgálhat a diagnosztikus pontosság és az értékelők közötti egyetértési index növelésében magas grádusú cervicalis intraepithelialis neoplasia és méhnyakrák esetén.

9511 Roche mtm laboratories AG Sandhofer Straße 116 D-68305 Mannheim Germany www.cintec.info

50 2 – 8 °C

Tartalomjegyzék I. Terméknév .................................................................................................. 2 II. Alkalmazási terület....................................................................................... 2 III. Összegzés és az eszköz leírása .................................................................. 2 Összefoglalás és magyarázat .............................................................................. 2 Klinikai jelentőség ................................................................................................ 3 Az eljárás elve ..................................................................................................... 4 IV. Reagensek .................................................................................................. 4 Biztosított anyagok............................................................................................... 4 Tárolás ................................................................................................................. 6 Szükséges, de nem biztosított anyagok és reagensek ......................................... 6 Szükséges kellékek ............................................................................................. 6 V. Figyelmeztetések és óvintézkedések ........................................................... 7 Figyelmeztetés ..................................................................................................... 7 Figyelem .............................................................................................................. 7 VI. Folyamat...................................................................................................... 9 A minta előkészítése ............................................................................................ 9 Paraffinba ágyazott szövetminták ........................................................................ 9 Heat-Induced Epitope Retrieval ........................................................................... 9 Festési eljárás .................................................................................................... 10 1. A reagens előkészítése............................................................................... 10 1.1 Epitope Retrieval Solution .................................................................... 10 1.2. Wash Buffer (mosópuffer) ................................................................... 10 1.3 Substrate-Chromogen Solution (DAB) ................................................. 10 1.4. Kontrasztfestés ................................................................................... 11 1.5. Rögzítő közeg ..................................................................................... 11 2. Autostainer műszerekre vonatkozó festési eljárás ...................................... 11 2.1. Paraffinmentesítés és rehidráció ......................................................... 11 2.2. Autostainer műszerekre vonatkozó festési protokoll ........................... 12 3. Festési eljárás manuális használat esetén .................................................. 15 3.1. Paraffinmentesítés és rehidráció ......................................................... 15 3.2. Manuális használatra vonatkozó festési protokoll ............................... 15 VII. Minőség-ellenőrzés.................................................................................... 17 VIII. Az eredmények értelmezése ..................................................................... 18 IX. Korlátozások .............................................................................................. 19 X. Teljesítményjellemzők ............................................................................... 20 XI. Hibaelhárítás ............................................................................................. 25 XII. Jelek .......................................................................................................... 28 XIII. Gyártó........................................................................................................ 28 XIV. Átdolgozás állapota ................................................................................... 28 XV. Jogi nyilatkozat .......................................................................................... 28 1. melléklet: Szakirodalom ......................................................................... 29 2. melléklet ................................................................................................ 31

REF: 9511

1 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

I. Terméknév CINtec® Histology Kit

II. Alkalmazási terület In vitro diagnosztikus használatra. A CINtec® Histology Kit egy immunhisztokémiai assay, amely a p16INK4a antigén kvalitatív detektálására szolgál a méhnyakból származó, formalinnal fixált és paraffinba ágyazott szövetmetszetekben. Használata H&E-nal megfestett, ugyanabból a méhnyaki szövetmintából elkészített metszetek esetén ajánlott, amely hasznos eszközként szolgálhat a diagnosztikus pontosság és az értékelők közötti egyetértési index növelésében magas grádusú cervicalis intraepithelialis neoplasia és méhnyakrák esetén.

III. Összegzés és az eszköz leírása Összefoglalás és magyarázat A CINtec® Histology Kit egy egér monoklonális antitesten alapul (clone E6H4®), amely a humán p16INK4a protein ellen irányul. A p16INK4a fehérje egy ciklin-dependens kináz gátló, amely fontos szerepet játszik az eukarióta sejtciklus szabályozási mechanizmusában. Ez a retinoblasztóma fehérje (pRb) által közvetített G1–S-fázis átmenet része, és a sejtciklus leállítását váltja ki a sejtdifferenciálódási folyamat során. A véglegesen differenciálódott epithelialis sejtekben olyan szintű a p16INK4a expressziója, hogy az immunocitokémiával jellemzően nem mutatható ki. Különböző típusú tumorokban kimutatták a p16INK4a gén génmutáció és promóter hipermetiláció által kiváltott funkcionális inaktiválását. A p16INK4a tumorszupresszor gén ezen inaktiválódásával kapcsolatban kimutatták, hogy az hozzájárul a sejtcikluszavar kialakulásához és a sejtproliferáció feletti irányítás elvesztéséhez. Ugyanakkor replikációt folytató cervicalis epithelialis sejtekben, amelyekben a magas rizikójú humán papillomavírus (HR-HPV) onkoproteinjei indították el a sejtátalakulás folyamatát, a p16INK4a felgyorsult expressziója mutatkozott [1; 2]. A p16INK4a ezen túlzottan intenzív kifejeződése szoros összefüggést mutat a HR-HPV E7 onkoproteinjének molekuláris aktivitásával. A p16INK4a túlságos expressziója rámutatott a funkcionális komplex E7 onkoprotein által közvetített inaktiválására a pRB és az E2F transzkripciós faktor között, ami a HR-HPV által indukált sejtátalakulás egyik legfontosabb mozzanata [3]. A megjelent irodalomban számtalan tanulmány számolt be arról, hogy a p16INK4a protein túlzott expresszióját figyelték meg immunhisztokémiai módszerekkel a magas grádusú precancerosus cervicalis dysplasiát (azaz a CIN2 léziók 80 – 100%-a, és gyakorlatilag minden CIN3 lézió) és az invazív rákot mutató esetek igen magas arányában. Alacsony grádusú cervicalis intraepithelialis léziók (CIN1) változó értékeket mutattak a p16INK4a túlzott expressziójának tekintetében, jellemzően a 30–60%-os tartományon belül [1; 2; 4-16].

REF: 9511

2 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

Az eredmények értelmezése során figyelembe kell venni annak a tényét, hogy a p16INK4a egy celluláris protein, amely érzékelhető szinten expresszálódhat magas grádusú méhnyaki dysplasiás léziókban és méhnyakrákban, valamint cervicalis dysplasiához nem köthető kórképekben, habár a kifejeződés mértéke és mintázata eltéréseket mutat. A szövettani készítményeknek érintetlen a szöveti morfológiájuk, ezáltal segítve a p16INK4a pozitivitást méhnyaki elváltozásokban. A p16INK4a túlzott expressziójának pozitív teszt eredményeként egy diffúz festődési mintázatot tekintenek, ami a basalis és a parabasalis sejtrétegek folytonos festődését mutatja a superficialis sejtrétegek festődésével vagy anélkül. Ez a festődési mintázat mutatta a legmagasabb szenzitivitási és specificitási értéket magas grádusú CIN esetében [1; 4; 5]. Ezzel szemben, a gócos festődési mintázatot (izolált sejtek vagy kis sejtklaszterek festődése, azaz nem folytonos festődés, különös tekintettel a basalis és a parabasalis sejtekre), valamint az immunreaktivitás hiányát tekintik negatív teszteredménynek a p16INK4a túlzott expressziójára vonatkozóan [1; 4; 5]. A p16INK4a festett metszetek CINtec® Histology Kit használatával való értelmezését az ugyanabból a méhnyaki szövetmintából előállított H&E-festett metszetek interpretációjával együtt kell elvégezni. A CINtec® festett metszetek által szolgáltatott kiegészítő információt a végső diagnózis felállítása érdekében össze kell vetni a H&E-festett metszetek alapján felállított, morfológián alapuló diagnózissal.

Klinikai jelentőség A méhnyaki biopsziával nyert, H&E-festett metszetek együttes értékelése ugyanazon szövetmintából származó, egymást követő p16INK4a immunfestett metszetekkel, a diagnosztikus pontosság és a minták értékelését végzők közötti konszenzus elérésének javulását mutatta magas grádusú cervicalis intraepithelialis neoplasia (CIN2+) diagnózisában. A H&E-festett méhnyaki szövetmetszetek alapján felállított diagnózis határozza meg a további kezeléssel kapcsolatos döntések alapját. Következésképpen, egy pontatlan diagnózis jelentős hatással bírhat. A pontatlan diagnózis a páciens nem megfelelő kezeléséhez vezethet, azaz a lényegében egészséges nők túlkezelése, vagy a fennálló magas grádusú dysplasiás lézióval rendelkező nők alulkezelése következhet be. A H&E-festett szövetmetszetek értelmezése az alapja a patológusok körében tapasztalható eltérő eredmények magas arányának. Számos kiadvány beszámolt a méhnyaki szövetmintákat értékelők közötti egyetértési indexének alacsony értékeiről [17-20]. Egy nagy multicentrikus vizsgálat keretein belül az USA-ban méhnyaki szövettani minták értelmezését vizsgálták (2237 kolposzkópos biopszia, illetve 535 LEEP konizációs biopszia révén nyert minta) számos magasan képzett patológus bevonásával; a szövettani minták értelmezésének reprodukálhatósága csupán mérsékelt eredményt mutatott (kappa=0,46 punch-biopszia, ill. kappa=0,49 LEEPbiopszia által vett minták esetében) [17]. Felhasználva a WHO és egy módosított Bethesda osztályozási rendszert, a hat patológus által felállított, 125 kolposzkópiás biopszia mintát vizsgáló értékelők közötti egyetértési index mindkét osztályozás esetében alacsony értékeket mutatott. [18]. Hasonlóképpen, egy Egyesült Királyságban végzett, nyolc hisztopatológus szakember bevonásával és 100 kolposzkópos biopszia minta értékelésével készült tanulmány az értékelők közötti egyetértési index alacsony értékét mutatta (súlyozatlan kappa-érték: 0,358) [19]. REF: 9511

3 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

A CINtec® Histology Kit által festett metszetek hozzáadása a diagnózis felállítására használt, hagyományos H&E-festett metszetekhez javította ezen hisztomorfológiai diagnosztikus eljárás általános pontosságát.

Az eljárás elve A CINtec® Histology Kit a p16INK4a antigén immuncitokémiai kimutatását szolgáló reagensek sorát tartalmazza. A kit a méhnyakból vett, formalinnal fixált és paraffinba ágyazott szövettani minta két lépésből álló immunhisztokémiai festési eljárásának elvégzésére szolgál. Az antigének kimutatására egy elsődleges, monoklonális, a p16INK4a proteinre irányuló E6H4® egérantitestklónt alkalmaznak. Használatra kész vizualizációs reagensek kerülnek alkalmazásra, amelyek torma peroxidázhoz és kecske anti-egér Fab’ antitest fragmentumhoz konjugált polimer reagenst tartalmaznak. A Visualization Reagent szilárd fázisú abszorpcióra lett kialakítva a humán immunglobulinnal való keresztreakciók kiküszöbölése érdekében. A kromogén reakció alapját a DAB (diaminobenzidin-tetrahidroklorid) kromogén torma peroxidáz által közvetített, látható reakciótermékké való átalakulása képezi, ami az antigén-kötőhelyen történik. Kontrasztfestést követően fedőlemezzel fedjük a mintákat, majd eredményeket fénymikroszkópos megfigyeléssel értékelhetjük.

IV. Reagensek

Biztosított anyagok Az alább felsorolt anyagokat minden kit tartalmazza, mennyiségük 50 teszt és 50 negatív kontroll reakció elvégzésére elegendő. A tesztek száma tárgylemezenként 200 µl mennyiségű reagensben értendő.

1 Peroxidase Blocking Reagent Peroxidase Blocking Reagent 2 x 11,5 ml, használatra kész állapotban. 3%-os hidrogén-peroxid, 15 mmol/l nátrium-azidot tartalmaz (NaN3). Kérésre anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk.

2 Mouse anti-Human p16INK4a Antibody Mouse anti-Human p16INK4a Antibody 11,5 ml, használatra kész állapotban. Monoklonális egér antihumán p16INK4a antitest, Clone E6H4®, 50 mmol/l Tris pufferes kiszerelésben, pH 7,2, tartalmaz 15 mmol/l nátrium-azidot (NaN3) és stabilizáló proteint.

REF: 9511

4 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

3 Visualization Reagent Visualization Reagent 2 x 11,5 ml, használatra kész állapotban. Torma peroxidázhoz és affinitás-tisztított kecske anti-egér Fab’ antitest fragmentumokhoz konjugált polimer reagensek, tartósítószert és stabilizáló proteint tartalmazó stabilizáló oldatban tárolva. 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxánt tartalmaz, amely allergiás reakciót válthat ki. Kérésre anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk.

4 Negative Reagent Control Negative Reagent Control 11,5 ml, használatra kész állapotban. Monoklonális egér anti-patkány oxitocinkapcsolt neurofizin antitest, 50 mmol/l Tris puffer pH 7,2 kiszerelésben, 15 mmol/l nátrium-azidot (NaN3) és stabilizáló proteint tartalmaz. A festődés specificitásának igazolása érdekében. A patkány oxitocinkapcsolt neurofizin nem található meg az emberi szövetekben.

5 DAB Buffered Substrate DAB Buffered Substrate 31 ml Szubsztrát-puffer oldat, pH 7,5, < 0,1%-os hidrogén-peroxidot, stabilizáló anyagokat, enhancer elemeket és antimicrobialis hatóanyagokat tartalmaz.

6 DAB Chromogen DAB Chromogen 0,85 ml, 3,3’-diaminobenzidin kromogén oldat. A DAB ártalmas. Olvassa végig a veszélyekre/kockázatokra (R-mondatok) és a biztonságos használatra (S-mondatok) utaló mondatokat: R40 A rákkeltő hatás korlátozott mértékben bizonyított. R43 Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat (szenzibilizáló hatású lehet). R68 Maradandó egészségkárosodást okozhat. S35 Az anyagot és edényzetét megfelelő módon ártalmatlanítani kell. S36/37 Megfelelő védőruházatot és védőkesztyűt kell viselni. MEGJEGYZÉS: Bár a diamino-benzidin a benzidinhez hasonló szerkezettel rendelkezik, a diamino-benzidin karciogenitása nem bizonyított. Ártalmatlanítás során a szövetségi, az állami és a helyi előírásoknak megfelelően járjon el. Kérésre anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk.

REF: 9511

5 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

7 Epitope Retrieval Solution 10 x Epitope Retrieval Solution 10 x 500 ml, 100 mmol/l Tris puffer pH 9, 10 mmol/l EDTA-t és 15 mmol/l nátriumazidot (NaN3) tartalmaz.

Tárolás 2–8 °C-on tárolandó. Ne használja a lejárati időn túl. A fent említett értékektől eltérő körülmények között nem határozták meg a reagensek tárolására vonatkozó adatokat. A csomagolás eltávolítását követően a kit alkotórészei 6 hónapon keresztül stabil állapotban maradnak, amennyiben tárolásuk 2–8 °C-on történik. Amennyiben az oldat zavaros, meg kell semmisíteni. A Diluted Wash Buffer és a hígított Epitope Retrieval Solution 1 hónapon keresztül stabil állapotban marad, amennyiben tárolásuk 2–8 °C-on történik. Amennyiben az oldat zavaros, használata szigorúan tilos.

Szükséges, de nem biztosított anyagok és reagensek Wash Buffer (10 x) használandó a 8550-es katalógusszám alatt a Roche mtm laboratories AG-tól megrendelhető CINtec® Histology Kittel, de a kit nem tartalmazza. Megrendeléssel kapcsolatos információkat a www.cintec.info oldalon talál. Abszorbens törlők; Kontrasztfestés (hematoxylin); Desztillált vagy ionmentesített víz (mosóvíz); Etanol, 95% és 70%; Rögzítő közeg; Pozitív és negatív szövetek folyamat kontrollként való felhasználása; Tárgylemezek (SuperFrost® Plus vagy egyenértékű); Xilén; Fedőlemezek.

Szükséges kellékek Kemence, amely maximum 60 °C fenntartására képes; Nedves kamra (opcionális); Fénymikroszkóp (4–40x nagyítású objektív); Festőedények vagy -kádak; Mosóüvegek; Stopper (2–60 perces intervallumokat lehet beállítani); REF: 9511

6 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

Fedeles vízfürdő (képes fenntartani az Epitope Retrieval Solutiont 95–99 °C-on);

V. Figyelmeztetések és óvintézkedések

Figyelmeztetés 1.

Vigyázat! A kit egyes reagensei veszélyes vegyi anyagokat tartalmaznak. A kit tartalmának használata során tartsa be a veszélyes laboratóriumi reagensekre vonatkozó biztonsági óvintézkedéseket.

2.

A termék 1., 2., 4. és 7. komponense nátrium-azidot tartalmaz (NaN3), ami vegytiszta formában erősen mérgező. Bár nem minősítették veszélyesnek, de normális koncentrációs értékeken a nátrium-azid az ólom- és rézcsövekkel reakcióba léphet, és potenciálisan robbanékony fém-azidokat hozhat létre. Megsemmisítéskor, megelőzendő az azidok vízvezetékekben történő lerakódását, nagy mennyiségű vízzel kell leöblíteni.

3.

A 2., 3. és 4. jelölésű komponensek állati eredetű anyagot tartalmaznak. Tartsa be a biológiai eredetű termékek használatára vonatkozó megfelelő előírásokat.

4.

Kérésre a kitre vonatkozó anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk.

5.

Szövettani minták használata és ártalmatlanítása során, beleértve minden mintát a fixációt megelőzően, illetve követően, valamint a mintáknak kitett anyagokat, tartsa be a potenciálisan fertőzésveszélyes anyagokra vonatkozó biztonsági óvintézkedéseket, illetve a hulladékkezeléssel kapcsolatos előírásokat.

6.

Soha ne pipettázzon szájjal! Kerülje a bőr és a nyálkahártyák reagenssel, illetve mintával való érintkezését! Ha a reagens bőrfelületre vagy nyálkahártyára kerül, bő vízzel mossa le.

7.

A Visualization Reagent-t és a DAB Chromogent káros hatások érhetik, amennyiben túlságosan erős fénynek vannak kitéve. Ne tárolja erős fényben a kit komponenseit, valamint ne végezzen festést erős fényben, pl. közvetlen napfényben.

8.

Viseljen megfelelő védőfelszerelést, hogy a CINtec® Histology Kit részét képező vagy azzal együtt alkalmazandó komponensek használata közben elkerülje azok szemmel vagy bőrrel való érintkezését. További információkat lásd a termék biztonsági adatlapján (MSDS).

Figyelem 1.

In vitro diagnosztikus használatra.

2.

Csak professzionális használatra.

3.

Kerülje a reagensek mikrobiális szennyezését, hogy megelőzze a nem specifikus festést.

4.

A meghatározott inkubációs időktől, hőmérsékletektől és eljárásoktól való eltérés téves eredményekhez vezethet.

5.

A komponensek csomagolásának sérülése esetén ne használja a kit tartalmát! A csomagolás vagy a csomag tartalmának sérülése esetén haladéktalanul vegye fel a kapcsolatot a gyártóval.

REF: 9511

7 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

6.

A hulladékanyagok ártalmatlanításának a helyi irányelvek és előírások szerint kell történnie.

REF: 9511

8 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

7.

Minden reagens kifejezetten erre a tesztre való használatra lett kifejlesztve. A teszt specifikusságából kifolyólag a reagensek helyettesítése, cseréje nem megengedett.

8.

Nem várt, laboratóriumi hibával nem magyarázható festés megjelenése esetén, illetve a CINtec® Histology Kit kapcsán felmerülő probléma gyanúja során, további információkért és technikai segítségért haladéktalanul látogasson el a www.cintec.info oldalra.

9.

A termék kezelési problémákból vagy instabilitásból adódó hibás működése nem mutatkozik meg egyértelmű jelek formájában. Ezért, mint minőségellenőrzési intézkedés, pozitív és negatív kontroll egyidejű futtatása szükséges páciensekből vett mintákon.

VI. Folyamat A minta előkészítése A CINtec® Histology Kit immunhisztokémiai eljárások során alkalmazott szövetmintákkal való felhasználásra tervezték. Minden mintát a szövetfeldolgozás standard módszerei szerint kell előkészíteni. Pozitívan töltött tárgylemezek (mint például a SuperFrost® Plus tárgylemezek) használata ajánlott az optimális teljesítmény érdekében.

Paraffinba ágyazott szövetminták Semlegesen pufferelt, formalinnal fixált és paraffinba ágyazott szövetminták használata megfelelő ezen kitre vonatkozóan. Amennyiben a minták egy más prezervációs módszerrel lettek előkészítve, a módszer alkalmasságának igazolása szükséges. Javasolt a szövetminták 18–24 órán át történő, semlegesre pufferelt formalinban való fixálása és 3-4 mm-es vastagságú tömbökre vágása. A szövettömbök dehidrálása alkohol és xilén sorozatban történjék, amelyet olvasztott paraffinnal való átszivárogtatás követ legfeljebb 60 °C-on. Az egyes szövettömbökből hisztopatológiai laboratóriumban 4-5 µm vastagságú metszeteket kell készíteni és SuperFrost® Plus tárgylemezekre rögzíteni.

Heat-Induced Epitope Retrieval Hő által indukált epitóp visszanyerése esetén, a tárgylemezen rögzített szövetmetszetek felmelegítését a Epitope Retrieval Solutionbe való merítése által kell elérni egy olyan kalibrált vízfürdő segítségével, amely képes a Epitope Retrieval Solutiont 95–99 °C-os hőmérsékleten tartani. Magasabb elhelyezkedésű laboratóriumok esetében a legkézenfekvőbb módszert kell alkalmazni a vízfürdő kívánt hőméréskletének eléréséhez. A gyártó nem javasolja az itt leírt eljárástól való bármilyen eltérést. Hő által indukált epitóp-visszanyerést követően, a szövetmetszetet 20 percig szobahőmérsékleten kell tartani. Csak ezt követően kezdhetjük meg a minta további feldolgozását. Ezután a szövetmetszet festését haladéktalanul el kell végezni.

REF: 9511

9 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

Festési eljárás 1. A reagens előkészítése Az immunfestési eljárás előtt minden reagens vegye fel a környezet hőmérsékletét (20–25 °C). Hasonlóképpen, minden lépést környezeti hőmérsékleten végezzen el. Az immunfestési eljárás során ügyelni kell a minta száradásának megelőzésére, mivel a száradás festődési műtermékek képződéséhez vezethet. A festési eljárás megkezdése előtt az alábbi reagensek előkészítése javasolt:

1.1 Epitope Retrieval Solution Készítse elő a Epitope Retrieval Solution festési eljáráshoz elegendő mennyiségét, ami a 7. üvegcse (Epitope Retrieval Solution 10 x) tartalmának 1:10 arányú, desztillált vagy ionmentesített vízben történő hígításával készül. Hígítás után, a Epitope Retrieval Solution 2–8 °C-on tárolandó legfeljebb egy hónapon át. Amennyiben az oldat zavaros, meg kell semmisíteni. MEGJEGYZÉS: Magas iontartalmú víz használata az epitope retrieval solution

hígítása során jelentősen csökkentheti a teszt festési teljesítményét. Kérjük, győződjön meg arról, hogy a felhasznált víz megfelelően desztillált és ionmentesített (vagyis az ionmentesített víz előállítására szolgáló ioncserélő oszlop átesett-e a rutin karbantartási vizsgálaton). Ne használjon csapvizet!

1.2. Wash Buffer (mosópuffer) Használjon Wash Buffer (10 x),-t, katalógusszám: 8550, amelyet a Roche mtm laboratories AG biztosít a CINtec® Histology Kit termékkel együtt. Megrendeléssel kapcsolatos információkat a www.cintec.info oldalon talál. Készítse elő a Wash Buffer mosás lépéseihez elegendő mennyiségét, ami a Wash Buffer (10 x), (katalógusszám: 8550) tartalmának 1:10 arányú, desztillált vagy ionmentesített vízben történő hígításával készül. Hígítás után, a Wash Buffer 2–8 °C-on tárolandó legfeljebb egy hónapon át. Amennyiben az oldat zavaros, meg kell semmisíteni.

1.3 Substrate-Chromogen Solution (DAB) A Substrate-Chromogen Solution előkészítéséhez, adjon egy csepp DAB Chromogent 2 ml DAB Buffered Substrate-hoz. Az alábbiak szerint járjon el: i) töltsön 2 ml DAB Buffered Substrate-et az 5. üvegcséből egy kémcsőbe; ii) adjon egy csepp (25–30 µl) DAB Chromogent a 6. üvegcséből. 2 ml Substrate-Chromogen Solution (DAB) a fenti útmutató alapján előkészítve általában öt szövetmetszet megfestésére elegendő, beleértve a megfelelő kontroll mintákat. MEGJEGYZÉS: Az előkészített Substrate-Chromogen Solutiont (DAB) egy napon

belül használja fel. MEGJEGYZÉS: Túl nagy mennyiségű DAB Chromogen adása a DAB Buffered

Substrate-hoz a pozitív jel romlását eredményezi.

REF: 9511

10 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

1.4. Kontrasztfestés A DAB festési reakció vízben nem oldódó, színes végterméket képez. Kontrasztfestésre alkohol- vagy vízbázisú hematoxylint használhatunk. Amennyiben mégis ilyen hematoxylint használ, kontrasztfestés során tartsa be a hematoxylin forgalmazójának utasításait.

1.5. Rögzítő közeg A minták festést követő rögzítése során egy nem vízbázisú, tartós rögzítő közeg használata ajánlott. Mindazonáltal, vízbázisú rögzítő közeg használata is elfogadható. Az Eukitt Mounting Medium nem vízbázisú rögzítéshez ajánlott. Az Aquatex Merck vízbázisú rögzítéshez ajánlott.

2. Autostainer műszerekre vonatkozó festési eljárás A CINtec® Histology Kit hitelesített Autostainer műszerekkel (pl., a Lab Vision Autostainer 480 vagy a Dako Autostainer Plus) való használatra az alább található minta szerint. Az Autostainer műszerrel való festés előtt a mintákat és a reagenseket az 1.1.-1.5., illetve a 2.1. pontokban leírt módon kell előkészíteni.

2.1. Paraffinmentesítés és rehidráció Paraffinmentesítés előtt, helyezze a metszeteket szárítószekrénybe legfeljebb 60 °C-os hőmérsékleten legalább 20 percig és legfeljebb 1 órán keresztül a víz kvantitatív eltávolítása és a paraffin megolvasztásához, ezáltal javítva a szövetnek a tárgylemezhez való tapadását („sütés”). A szövetmetszet deparaffinálása szükséges a beágyazó közeg eltávolításához, majd a festési eljárás megkezdése előtt el kell végezni a rehidrálást. Nagyon fontos, hogy a paraffin teljesen el legyen távolítva, ugyanis a visszamaradó beágyazó közeg a nem specifikus festődés növekedését eredményezheti. Inkubálja a metszeteket környezeti hőmérsékleten (20–25 °C) az alábbi lépések szerint. 

5 (±1) perc xilolfürdő;



ismételje meg ezt a lépést egy friss fürdőben;



távolítsa el a fölösleges folyadékot;



3 (±1) perc 95% etanolban;



ismételje meg ezt a lépést egy friss fürdőben;



távolítsa el a fölösleges folyadékot;



3 (±1) perc 70% etanolban;



ismételje meg ezt a lépést egy friss fürdőben;



távolítsa el a fölösleges folyadékot;

 legalább 30 másodperc desztillált vagy ionmentesített vízben. A festési eljárást a 2.2. pont 1. lépése szerint kezdje meg: Epitóp-visszanyerés. Xilol és alkohol oldatok legfeljebb 40 metszet esetén használhatóak.

REF: 9511

11 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

MEGJEGYZÉS: A felhasználónak érdemes odafigyelni arra, hogy a berendezés hőmérsékletében vagy a preanalitikus minta-előkészítés expozíciós idejében bekövetkező eltérések a szövetmetszetekben a paraffin tökéletlen eltávolításához vezethetnek. A visszamaradó paraffin tökéletlen festődéshez vezethet bármely szövettani festék esetében, beleértve a CINtec® szövettani festéket. Kórszövettani laboratóriumok berendezéseinek rendszeres ellenőrzése szükséges a festést megelőző minta-előkészítés eltéréseinek csökkentése érdekében. Az immunreaktív szövetterületen belül megfigyelhető éles határok vagy egyéb inkonzisztenciák egy adott metszeten utalhatnak a minta nem megfelelő vagy tökéletlen preanalitikus feldolgozására, bármely immunhisztokémiai festék esetében. Amennyiben összefüggéstelen festődés figyelhető meg, a felhasználó kötelessége a berendezés és a minta-előkészítési módszerek ellenőrzése.

2.2. Autostainer műszerekre vonatkozó festési protokoll 1. lépés: Epitóp-visszanyerés 

a festőedényeket (pl. műanyag Coplin-edények) töltse meg hígított Epitope Retrieval Solutionnel (lásd Eljárás, 1.1. pont);



helyezze vízfürdőbe az Epitope Retrieval Solutiont tartalmazó festőedényeket, majd hevítse fel a vízfürdőt és az Epitope Retrieval Solutiont 95–99 °C hőmérsékletre. Lényeges, hogy a vízfürdőben beállítsuk a víz szintjét biztosítva azt, hogy az edények 80%-a víz alá kerül. A hőmérséklet stabilizálása és a párolgás elkerülése érdekében zárja fedéllel az edényeket;



a deparaffinált metszeteket merítse a festőedényekben előmelegített Epitope Retrieval Solution-ba; ez a lépés általában 90 °C alá csökkenti az edények hőmérsékletét;



a vízfürdőzés az edényekben lévő Epitope Retrieval Solutiont melegítse fel újra 95–99 °C-os hőmérsékletre; ellenőrizze az edényekben lévő Epitope Retrieval Solution hőmérsékletét;



inkubáljon 10 (±1) percig 95–99 °C hőmérsékleten; a visszaszámlálást csak az után kezdje meg, hogy az edényekben lévő Epitope Retrieval Solution hőmérséklete igazoltan elérte a 95–99 °C értéket;



távolítsa el a vízfürdőből az egész edényt a metszetekkel együtt;



hűtse a metszeteket az Epitope Retrieval Solutionben 20 (±1) percen át szobahőmérsékleten;



öntse le az Epitope Retrieval Solutiont és öblítse a metszeteket Wash Bufferben (lásd Eljárás, 1.2. pont);



az optimális teljesítőképesség érdekében, az epitóp-visszanyerést követően és a festést megelőzően 5 percen át áztassa be a metszeteket Wash Bufferben;

MEGJEGYZÉS: Az Epitope Retrieval Solution egyszeri használatra van tervezve. Ne használja újra.

REF: 9511

12 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

2. lépés: A műszer programozása A CINtec® Histology Kit Autostainer műszeren való első használata előtt, egy új minta beállítása szükséges. Kérjük, tanulmányozza át az adott Autostainer műszerhez tartozó kezelői kézikönyvet.

3. lépés: Autostainer eljárás 

a kit részét képező üvegekben található reagenseket helyezze át az Autostainer mércés reagens üvegcséibe. Használja az Autostainer által generált tájékoztató képernyőt a programidő és a reagens térfogat meghatározására (a különböző programidőket és reagens térfogatokat lásd a 4. pontban);



helyezze az Autostainer reagens üvegcséket az Autostainer reagens tartóba a számítógép által generált „Reagent Layout Map” (reagens elrendezési kép) szerint;



az Autostainert töltse meg metszetekkel a számítógép által generált „Slide Layout Map” (metszet elrendezési kép) szerint;



a száradás megelőzése érdekében a mintákat mosópufferrel az Autostainerre helyezést követően;



az alábbi táblázatban a programfutások vázlata látható: o öblítés*; o 200 µl Peroxidase-Blocking Reagent – 5 perc; o öblítés*; o 200 µl Primary p16INK4a antibody vagy Negative Reagent Control – 30 perc; o öblítés*; o 200 µl Visualization Reagent – 30 perc; o öblítés*; o öblítés*; o öblítés*; o váltás; o 200 µl Substrate-Chromogen Solution (DAB) – 10 perc; o öblítés*; o a szubsztrátkromogén lépést követően öblítse a metszeteket ionmentesített vízben;

fecskendezze

le

*használjon Wash Buffert az adott öblítési lépésekben.

MEGJEGYZÉS: Amennyiben az Autostainer pufferben öblíti a metszeteket, a metszeteket ionmentesített vízzel kell leöblíteni az Autostainerből való eltávolításukat követően.

REF: 9511

13 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

4. lépés: Kontrasztfestés (hematoxylinre vonatkozó utasítások) 

a metszeteket helyezze hematoxylin fürdőbe. A használt hematoxylin erejétől függően inkubáljon 2–5 percen keresztül;



a metszeteket helyezze csapvízfürdőbe és óvatosan öblítse azokat folyó csapvízben. Győződjön meg arról, hogy minden visszamaradó hematoxylin eltávolításra került;



rövid ideig öblítse óvatosan a metszeteket desztillált vagy ionmentesített vizet tartalmazó fürdőben;



A kontrasztfestés közvetlenül az Autostainer műszeren is elvégezhető.

MEGJEGYZÉS: Az inkubáció hosszától és a használt hematoxylin erősségétől függően a kontrasztfestés a sejtmagok halvány- vagy sötétkék színeződését eredményezi. A túlzott vagy nem teljes kontrasztfestés veszélyeztetheti az eredmények helyes értelmezését.

5. lépés: Rögzítés Nem vízbázisú, tartós rögzítő közeg használata ajánlott. Egyébként vízbázisú rögzítő közeg használata is elfogadható. Tartsa be a rögzítő közeg forgalmazójának használati utasításait. MEGJEGYZÉS: Az elhalványodás elkerülése érdekében, a metszeteket védje a fénytől és tárolja környezeti hőmérsékleten (20–25 °C).

REF: 9511

14 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

3. Festési eljárás manuális használat esetén MEGJEGYZÉS: A festési eljárás során kerülje a szövetmetszetek száradását. A megszáradt szövetmetszetek a nem specifikus festődés növekedését eredményezhetik. Hosszabb inkubáció esetén a mintákat helyezze nedves környezetbe. Tartsa be a manuális immunhisztokémiai festés standard eljárásait a CINtec® Histology Kit manuális festéssel való felhasználása során.

3.1. Paraffinmentesítés és rehidráció Paraffinmentesítés előtt, helyezze a metszeteket szárítószekrénybe legfeljebb 60 °C-os hőmérsékleten legalább 20 percig és legfeljebb 1 órán keresztül a víz kvantitatív eltávolítása és a paraffin megolvasztása végett, ezáltal javítva a szövetnek a tárgylemezhez való tapadását („sütés”). A szövetmetszet deparaffinálása szükséges a beágyazó közeg eltávolítása végett, majd a festési eljárás megkezdése előtt el kell végezni a rehidrálást. Nagyon fontos, hogy a paraffin teljesen el legyen távolítva, ugyanis a visszamaradó beágyazó közeg a nem specifikus festődés növekedését eredményezheti. Inkubálja a metszeteket környezeti hőmérsékleten (20–25 °C) az alábbi lépések szerint.  5 (±1) perc xilolfürdő;  Ismételje meg ezt a lépést egy friss fürdőben;  Távolítsa el a fölösleges folyadékot;  3 (±1) perc 95% etanolban;  Ismételje meg ezt a lépést egy friss fürdőben;  Távolítsa el a fölösleges folyadékot;  3 (±1) perc 70% etanolban;  Ismételje meg ezt a lépést egy friss fürdőben;  Távolítsa el a fölösleges folyadékot;  Legalább 30 másodperc desztillált vagy ionmentesített vízben. A festési eljárást a 3.2. pont 1. lépése szerint kezdje meg: Epitóp-visszanyerés. Xilol és alkohol oldatok legfeljebb 40 metszet esetén használhatóak.

3.2. Manuális használatra vonatkozó festési protokoll

1. lépés: Epitóp-visszanyerés 

a festőedényeket (pl. műanyag Coplin-edények) töltse meg hígított Epitope Retrieval Solution-nal (lásd Eljárás, 1.1. pont);



helyezze vízfürdőbe az Epitope Retrieval Solution-t tartalmazó festő edényeket, majd hevítse fel a vízfürdőt és az Epitope Retrieval Solutiont 95–99 °C hőmérsékletre. Lényeges, hogy a vízfürdőben beállítsuk a víz szintjét biztosítva azt, hogy az edények 80%-a víz alá kerül. A hőmérséklet stabilizálása és a párolgás elkerülése érdekében zárja fedéllel az edényeket;

REF: 9511

15 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5



A deparaffinált metszeteket merítse a festőedényekben előmelegített Epitope Retrieval Solutionbe; ez a lépés általában 90 °C alá csökkenti az edények hőmérsékletét;



a vízfürdőzés az edényekben lévő Epitope Retrieval Solutiont melegítse fel újra 95–99 °C-os hőmérsékletre; ellenőrizze az edényekben lévő Epitope Retrieval Solution hőmérsékletét;



inkubáljon 10 (±1) percig 95–99 °C hőmérsékleten; a visszaszámlálást csak az után kezdje meg, hogy az edényekben lévő Epitope Retrieval Solution hőmérséklete igazoltan elérte a 95–99 °C értéket;



távolítsa el a vízfürdőből az egész edényt a metszetekkel együtt;



hűtse a metszeteket az Epitope Retrieval Solutionben 20 (±1) percen át szobahőmérsékleten;



öntse le az Epitope Retrieval Solutiont és öblítse a metszeteket hígított mosópufferben (lásd Eljárás, 1.2. pont);



az optimális teljesítőképesség érdekében, az epitóp-visszanyerést követően és a festést megelőzően 5 (±1) percen át áztassa be a metszeteket Wash Buffer-ben.

MEGJEGYZÉS: Az Epitope Retrieval Solution egyszeri használatra van tervezve. Ne használja újra.

2. lépés: Peroxidase-Blocking Reagent 

használjon 200 µl Peroxidase-Blocking Reagent-t a minta fedésére.



inkubáljon 5 (±1) percig;



távolítsa el a felesleges folyadékot, majd helyezze a metszeteket friss Wash Buffer fürdőbe 5 (±1) percig.

3. lépés: Primary Antibody vagy Negative Reagent Control 

távolítsa el a fölösleges puffert;



a mintát vonja be 200 µl elsődleges antitesttel (Mouse Anti-Human p16INK4a vagy Negative Reagent Control);



inkubáljon 30 (±1) percig;



távolítsa el a felesleges folyadékot, majd helyezze a metszeteket friss Wash Buffer fürdőbe 5 (±1) percig.

4. lépés: Visualization Reagent 

távolítsa el a fölösleges puffert;



vonja be a mintát 200 µl Visualization Reagent-nel;



inkubáljon 30 (±1) percig;



távolítsa el a felesleges folyadékot, majd helyezze a metszeteket friss pufferfürdőbe 5 (±1) percig;

REF: 9511

16 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5



ismételje meg ezt a lépést kétszer egy friss Wash Buffer fürdőben.

5. lépés: Substrate-Chromogen Solution (DAB) 

vonja be a mintát 200 µl Substrate-Chromogen Solutionnel (DAB), amelynek előkészítése az 1.3. pontban korábban már leírt eljárás szerint történik.



inkubáljon 10 (±1) percig;



távolítsa el a felesleges folyadékot és óvatosan öblítsen desztillált vagy ionmentesített vízzel.

A Substrate-Chromogen Solution (DAB) hulladékot a megfelelő ártalmatlanítás érdekében a veszélyes anyag tárolására szolgáló tartályba gyűjtse.

6. lépés: Kontrasztfestés (hematoxylinre vonatkozó utasítások) 

a metszeteket helyezze hematoxylinfürdőbe. A használt hematoxylin erejétől függően inkubáljon 2–5 percen keresztül;



a metszeteket helyezze csapvíz fürdőbe és óvatosan öblítse azokat folyó csapvízben. Győződjön meg arról, hogy minden visszamaradó hematoxylin eltávolításra került;



rövid ideig öblítse óvatosan a metszeteket desztillált vagy ionmentesített vizet tartalmazó fürdőben;

MEGJEGYZÉS: Az inkubáció hosszától és a használt hematoxylin erősségétől függően a kontrasztfestés a sejtmagok halvány- vagy sötétkék színeződését eredményezi. A túlzott vagy nem teljes kontrasztfestés veszélyeztetheti az eredmények helyes értelmezését.

7. lépés: Rögzítés Nem vízbázisú, tartós rögzítő közeg használata ajánlott. Xilolbázisú tartós rögzítő közeg esetén dehidrációs eljárás elvégzése szükséges, pl. 

desztillált vagy ionmentesített víz



3 perc 70% etanol



3 perc 70% etanol



3 perc 96% etanol



3 perc 99% etanol



5 perc xilol



5 perc xilol

Vízbázisú rögzítő közeg használata is elfogadható. Tartsa be a rögzítő közeg forgalmazójának használati utasításait. MEGJEGYZÉS: Az elhalványodás elkerülése érdekében, a metszeteket védje a fénytől és tárolja környezeti hőmérsékleten (20–25 °C).

VII. Minőség-ellenőrzés A minta fixációjával és feldolgozásával kapcsolatos ajánlott eljárásoktól való eltérés REF: 9511

17 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

a felhasználó laboratóriumában az eredmények jelentős módosulását eredményezheti, ami rendszeres belső ellenőrzéseket tesz szükségessé. Pozitív szövetkontroll Külső pozitív kontroll anyagoknak friss boncolási/mintavételi/sebészeti mintáknak kell lenniük, amelyek fixációját, feldolgozását és beágyazását a lehető legkorábban el kell végezni ugyanúgy, mint ahogy a betegek mintái kerültek feldolgozásra. A pozitív szövetkontroll jelzi, hogy a szövetminta előkészítése és a festési eljárás megfelelően lett-e elvégezve. Minden egyes festés során egy pozitív külső szövetkontrollt kell elvégezni minden egyes tesztkörülményre vonatkozóan. A külső pozitív kontrollanyagként használt szöveteket ismert p16INK4a pozitív festődésű páciens mintákból kell kiválasztani. Ha a pozitív kontrollok nem mutatnak kellően pozitív festést, a vizsgálati minták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. Negatív szövetkontroll A legtöbb szövetmetszetben előforduló, ismerten p16INK4a negatív sejttípusokat is felhasználhat a laboráns, mint belső negatív kontrollt, hogy meggyőződjön az IHC teljesítményjellemzőiről. Ha specifikus festődés (álpozitív festődés) van jelen a negatív szövetkontroll helyein, akkor a páciensminták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. Nem specifikus negatív reagenskontroll Primer antitest helyett használja a nem specifikus Negative Reagent Controlt minden egyes páciens mintából származó metszettel a nem specifikus festődés értékeléséhez és a specifikus festődés pontosabb interpretációjához az antigén helyén. Ha specifikus festődés (álpozitív festődés) jelentkezik nem specifikus Negative Reagent Control, eredményekkel, akkor a páciensminták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni.

VIII. Az eredmények értelmezése A Negative Reagent Controllal mint elsődleges reagenssel megfestett kontroll minták nem mutathatnak specifikus festődést. A monoclonal mouse anti-Human p16INK4a antibody, Clone E6H4® alkalmazásával történő pozitív festődést a Negative Reagent Control nem specifikus háttérfestésének összefüggésében értékelje. Mint bármely immunhisztokémiai vizsgálat esetében, a negatív eredmény azt jelenti, hogy az antigén nem mutatható ki, és nem azt, hogy az antigén nincs jelen a vizsgált sejtekben vagy szövetekben. Az eredmények értelmezése során figyelembe kell venni annak a tényét, hogy a p16INK4a egy celluláris protein, amely érzékelhető szinten expresszálódhat magas grádusú méhnyaki dysplasiás léziókban és méhnyakrákban, valamint cervicalis dysplasiához nem köthető kórképekben, habár a kifejeződés mértéke és mintázata eltéréseket mutat. A megfestett metszet minták értékelését egy bináris osztályozási rendszer szerint végezzük, amely „pozitív” és „negatív” értékekből tevődik össze. „Pozitív” eredményről akkor beszélünk, ha a p16INK4a festett metszet minta a méhnyaki laphám epithelium basalis és parabasalis sejtrétegeinek folytonos festődését mutatja a superficialis sejtrétegek festődésével vagy anélkül („diffúz festődési mintázat”). „Pozitívnak” („diffúz festődési mintázat”) értékelt metszetre látható egy példa a 2. melléklet 1. ábráján. REF: 9511

18 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

„Negatív” eredményről akkor beszélünk, ha a p16INK4a festett metszet minta a méhnyaki laphám epithelium negatív festődési reakcióját („negatív festődési mintázat”), illetve izolált sejtek vagy kis sejtklaszterek festődését mutatja; azaz nem folytonos festődést, különös tekintettel a basalis és a parabasalis sejtekre („gócos festődési mintázat”). „Negatívnak” („gócos festődési mintázat”) értékelt metszetre látható egy példa a 2. melléklet 2. ábráján. A p16INK4a festett metszetek CINtec® Histology Kit használatával való értelmezését az ugyanabból a méhnyaki szövetmintából előállított H&E-festett metszetek interpretációjával együtt kell elvégezni. A CINtec® festett metszetek által szolgáltatott kiegészítő információt a végső diagnózis felállítása érdekében össze kell vetni a H&E-festett metszetek alapján felállított, morfológián alapuló diagnózissal.

IX. Korlátozások 

Csak professzionális használatra. Az immuncitokémiai elvégzéséhez speciális képesítés szükséges.



Bármilyen pozitív vagy negatív festődés klinikai interpretációját a klinikai kórtörténet, morfológia és egyéb hisztopatológiai kritériumok ismeretében kell elvégezni. A pozitív vagy negatív festődés klinikai értelmezését ki kell egészíteni morfológiai tanulmányokkal, megfelelő pozitív és negatív belső/külső kontrollokkal, valamint egyéb diagnosztikai vizsgálatokkal. A festett preparátumok készítéséhez használt antitesteket, reagenseket és módszereket ismerő, képzett patológus felelőssége, hogy értelmezze az immunhisztokémiai preparátum készítésének és értelmezésének minden lépését.



Az immunhisztokémiai festés eredményeit erősen befolyásolja a festett szövet minősége. Ennek megfelelően, a metszetek fixációja, mosása, szárítása, melegítése, szekcionálása vagy egyéb szövetekkel való szennyeződése jelentős mértékben befolyásolja a festési eljárás végső eredményét; és műtermékek képződéséhez, az antitestek kicsapódásához és álnegatív eredményekhez vezethet. Inkonzisztens eredmények a fixálási és beágyazási módszerek eltéréseiből vagy a szöveten belüli jellemzők szabálytalanságaiból adódhatnak.



A túlzott vagy nem teljes kontrasztfestés veszélyeztetheti az eredmények helyes értelmezését.



A gyártó ezeket az optimálisan hígított állapotban használandó antitesteket/reagenseket az ebben a kiadványban található utasítások betartása esetén biztosítja, előkészített szövetmetszeteken végzett immunhisztokémiai vizsgálatokra. A javasolt vizsgálati eljárástól való bármilyen eltérés érvénytelenné teheti a várt eredményeket; megfelelő kontrollokat kell alkalmazni, és ezeket dokumentálni kell. Azok a felhasználók, akik eltérnek az ajánlott tesztelési eljárásoktól, ilyen körülmények között felelősséget kell, hogy vállaljanak a betegeredmények értékeléséért.



A fehérjék vagy szubsztrát-reakciótermékek nem immunológiai kötődése miatt hamis pozitív eredmények fordulhatnak elő. Okozhatja még pszeudoperoxidáz aktivitás (erythrocyták) és endogén peroxidáz aktivitás (citokróm-C).

REF: 9511

19 / 29

eljárások

2007-9511-001HU Rev 2.5





Korábban nem vizsgált szövetekben a reagensek nem várt reakciókat mutathatnak. A nem várt reakciók lehetősége még a vizsgált szövetcsoportokban sem zárható ki teljesen, a daganatokban vagy egyéb patológiás szövetekben bekövetkező antigén-expresszió biológiai változatossága miatt. Vegye fel a kapcsolatot a Roche mtm laboratories AGval dokumentált, nem várt reakció(k) esetében. Technikai segítséggel kapcsolatos információkat a www.cintec.info oldalon talál. Ne cserélje fel a kit reagenseit más gyári számmal jelzett reagensekkel vagy egyéb gyártóktól származó reagensekkel.

X. Teljesítményjellemzők Klinikai teljesítmény A CINtec® Histology Kit klinikai teljesítményét egy formalinnal fixált, paraffinba ágyazott méhnyaki szövetmintákat felhasználó kontrollált klinikai tanulmány során határozták meg [21]. A tanulmány célja az volt, hogy igazolja a CINtec® Histology Kit használatának jogosságát a diagnosztikus pontosság és az értékelők közötti egyetértési index növelésében magas grádusú cervicalis intraepithelialis neoplasia esetén (CIN2+). A klinikai vizsgálat retrospektív cervicalis punch- és konizációs biopsziamintákkal készült. Összesen 500 méhnyaki mintát nyertek két különböző európai patológiai laboratóriumból, amelyeket magas grádusú dysplasiára dúsítottak az eredeti diagnózisuk alapján. Ezekből a mintákból H&E-festett metszeteket és konszekutív CINtec® Histology Kit festett metszeteket készítettek a gyártó utasításai szerint. Minden esetben három egymástól független európai nőgyógyász-patológus állította fel a diagnózist H&E-festett metszetek alapján. Eltérő eredményeket mutató eseteket egy együttes második vizsgálatnak vetettek alá egy megítélési találkozó során, és aranystandard diagnózisként a többségi diagnózisok („háromból kettő” konszenzus diagnózis) szolgáltak. Négy európai országból származó (Franciaország, Olaszország, Spanyolország, Németország) 12 vizsgálatvezető (méhnyaki patológiát rendszeresen értékelő szakképzett patológusok) vett részt a tanulmányban mint panel patológus. A metszetértelmezés első körében minden panel patológus felállította a saját diagnózisát adott esetre vonatkozóan kizárólag H&E-festett metszetek alapján. A patológusok számára nem volt ismert sem az eredeti diagnózis, sem az aranystandard diagnózis. Több mint 4 hetes kimosási időszakot követően, a tizenkét panel patológus újra elvégezte ugyanannak (az újracímkézett) H&E-festett metszetsorozatnak az értékelését CINtec® Histology Kit festett metszetek értékelésével együtt. A CINtec®-festett metszetek diagnosztikus pontosságot javító értékének meghatározására, a két módszer eredményeinek együttes feldolgozását hasonlították a kizárólag H&E-festésen alapuló eredményekhez. Minden egyes panel patológus által feljegyzett (mindkét módszer értékeit tartalmazó) eredmény összehasonlításra került a három nőgyógyász-patológus által felállított konszenzus diagnózisokkal.

REF: 9511

20 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

Eredmények: Az adatelemzés összesen 482, a patológusok által felállított teljes diagnózist mutató esetet tartalmazott. A három nőgyógyász-patológus szakember által felállított konszenzus diagnózisok alapján a különböző diagnosztikus kategóriák gyakorisága negatív volt dysplasia (n=194), CIN1 (n=96), CIN2 (69), valamint CIN3 (n=123) esetében. CIN2+ kimutatás diagnosztikus pontossága A CIN2+ azonosítás teljes szenzitivitása 1787-ről (H&E) 2018 (H&E plusz CINtec®) valós pozitív CIN2+ eredményre emelkedett, a teljes specificitás enyhe csökkenésével: 3088-ról (H&E) 3051 (H&E plusz CINtec®) valós negatív CIN1 eredmény. 1. táblázat A diagnosztikus pontosság javulása magas grádusú CIN esetében H&E plusz CINtec®-festett metszetek a kizárólag H&E-festett metszetekkel szemben; a valós pozitív és valós negatív eredmények, illetve az álnegatív és álpozitív eredmények számának összehasonlítása a patológus szakemberek által felállított konszenzus diagnózisokkal (Megjegyzés: a patológus szakemberek által felállított konszenzus diagnózisok teljes egyezése 2304 valós pozitív eredményt (192 CIN2+ eset, x 12 panel patológus) eredményezett volna).

Összes H&E Összes H&E+CINtec

®

Valós pozitív

Álnegatív

Álpozitív

Valós negatív

1787

517

392

3088

2018

286

429

3051

Az ugróbicska álértékek kimutatásában használatos ANOVA-modell, ismertebb nevén Dorfman-Berbaum-Metz (DBM) módszert alkalmazták a CINtec® Histology teszt pontosságra való hatásainak vizsgálatára. A nullhipotézis, miszerint a H&E diagnosztikus pontossága megegyezik a H&E plusz CINtec®-festett metszetek diagnosztikus pontosságával CIN2+ esetében, elvetésre került p=0,0004 (AUC H&E esetében: 0,877; AUC H&E plusz CINtec® esetében: 0,925).

REF: 9511

21 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

2. táblázat A diagnosztikus szenzitivitás javulása magas grádusú CIN esetében H&E plusz CINtec®-festett metszetek a kizárólag H&E-festett metszetekkel szemben; a három nőgyógyász-patológus szakember által, H&E-festett metszetek alapján felállított konszenzus diagnózisokat használták aranystandardként. Diagnosztikus kategória

H&E szenzitivitás

H&E plusz ® szenzitivitás CINtec

Javulás

CIN2+

77%

87%

13%

Kizárólag CIN2

62%

75%

21%

Kizárólag CIN3

86%

95%

11%

A három nőgyógyász-patológus által felállított konszenzus diagnózisok referencia standardként való felhasználásával, a CIN2+ kimutatás szenzitivitása 13%-kal javult (H&E diagnózisok szenzitivitása 77%, ez az érték H&E plusz CINtec®-festett metszetek esetében 87%-ra emelkedett). A CIN2+ kimutatás diagnosztikus pontosságának emelkedése függetlenül bizonyított, statisztikai szignifikanciát mutatva a méhnyaki punch-biopsziás alcsoport (n=249; AUC H&E esetében: 0,895; AUC H&E plusz CINtec® esetében: esetében 0,929; p=0,0053) és a méhnyaki konizációs minták (n=233; AUC H&E esetében: 0,887; AUC H&E plusz p16INK4a esetében: 0,948; p=0,0009). Az értékelők közötti egyetértési index CIN2+ kimutatásában A panel patológusok közötti egyetértési index javulásának meghatározásában CIN2+ kimutatás esetén a Kappa-statisztika többszörös értékelési formája került felhasználásra H&E-festett metszeteken alapuló diagnózisok és H&E plusz CINtec®-festett méhnyaki metszeteken alapuló diagnózisok között. 3. táblázat Az értékelők közötti egyetértési index javulása CIN2+ kimutatás esetében H&E plusz CINtec®-festett metszetek vs. kizárólag H&E-festett metszetek együttes értékelése esetén. A kappa-értékek megadásra kerültek mint az egyetértés esélykorrekcióját mutató értékek.

REF: 9511

Diagnosztikus kategória

Kappa H&E

H&E plusz szenzitivitás ® CINtec

Statisztikai szignifikancia

CIN2+, minden eset

0,580

0,756

p<0,0001

CIN2+, kizárólag punchbiopsziák

0,598

0,748

p<0,0001

CIN2+, kizárólag konizációs biopsziák

0,548

0,765

p<0,0001

22 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

A kappa-statisztika mint a panel patológusok közötti egyetértés esélykorrekción átesett mérés CIN2+ kimutatás esetén szignifikáns javulást mutatott H&E plusz CINtec®-festett metszetek leolvasása során, versus kizárólag H&E-festett metszetek leolvasása (a kappa értékek emelkedése minden esetben 0,580-tól 0,756-ig; p<0,0001). A p16INK4a festődési mintázat értékelésének reprodukálhatósága Panel patológusok mérték a p16INK4a festődés mintázatának megbízhatóságát méhnyaki szövetmintákban diffúzan p16INK4a pozitív, gócosan p16INK4a pozitív vagy p16INK4a negatív minták esetében. Magas szintű reprodukálhatóság mutatkozott patológusok körében a p16INK4a festődési mintázat vagy pozitív (diffúz festődési mintázat), vagy negatív (gócos festődési mintázat, vagy az immunreaktivitás hiánya) eredményként való értékelésének tekintetében. Patológusok körében a p16INK4a festődési mintázat vagy pozitív (diffúz festődési mintázat), vagy negatív (gócos festődési mintázat, vagy az immunreaktivitás hiánya) eredményként való értékelésének tekintetében a kappa-érték (esélykorrekción átesett egyetértési mutató) reprodukálhatósága kitűnőnek mutatkozott (kappa átlag = 0,899; kappa medián = 0,903).

REF: 9511

23 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

Reprodukálhatóság Inter-Run reprodukálhatóság (mérések közötti reprodukálhatóság) Az Inter-Run reprodukálhatóság meghatározása CINtec® Histology Kittel történt 36 darab, CIN2+ szövetblokkokból előállított metszetek segítségével történt a manuális protokoll alapján. A dysplasticus területek minden metszeten hasonló intenzitással (+/- 0,5) festődtek minden egyes programfuttatás során. A tárgylemez normál részei nem mutattak specifikus festődést. Intra-Run reprodukálhatóság (mérésen belüli reprodukálhatóság) Az Intra-Run reprodukálhatóság meghatározása CINtec® Histology Kit-tel történt manuális protokoll alapján és az Autostainer műszer segítségével három különböző napon. Mindhárom szövetblokkban CIN2+-ként diagnosztizált metszetek szerepeltek. Minden egyes blokkból egy sorozat metszet készült minden nap. A dysplasticus területek az azonos blokkból származó metszeteken hasonló intenzitással (+/- 0,5) festődtek minden nap, mind manuális, mind automata üzemmódban. A tárgylemez normál részei nem mutattak specifikus festődést. Inter-Lot reprodukálhatóság Az Intra-Lot reprodukálhatóság meghatározására 3 különböző gyártási tételből származó CINtec® Histology Kits-ot használtak fel metszetfestésre CIN2+ esetekben. Manuális és automatizált festést végeztek a kezelési útmutatóban szereplő protokoll alapján. A dysplasticus területek az azonos blokkból származó metszeteken hasonló intenzitással (+/- 0,5) festődtek mindhárom gyártási tételből származó reagens esetében, mind manuális, mind automata üzemmódban. A tárgylemez normál részei nem mutattak specifikus festődést.

REF: 9511

24 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

XI. Hibaelhárítás Probléma

Valószínű ok

Javasolt teendő

1. A metszetek nem festődnek

1a. A használati eltérés;

2. A metszetek gyenge festődése

2a. Nem megfelelő visszanyerés;

utasítástól

való 1a. Figyelmesen olvassa végig a használati utasítást és tartsa be az abban foglalt eljárások előírásait; epitóp- 2a. Használjon frissen előkészített Epitope Retrieval Solution-t és/vagy győződjön meg arról, hogy az Epitope Retrieval Solution eléri-e a 95–99 °C-ot 10 perc alatt, valamint 20 perc alatt lehűl-e az oldat;

2b. A reagensek inkubációs ideje nem 2b. Tanulmányozza a 2.2./3.2. megfelelő; pontban található Festési eljárással kapcsolatos ajánlásokat; 2c. Helytelen fixációs módszer;

2c. Ügyeljen arra, hogy a páciens szövetminta ne legyen túlfixálva és alternatív rögzítőszer nem került felhasználásra;

2d. Az epitope-retrieval solution 2d. Győződjön meg arról, hogy az hígítására használt víznek túl ionmentesített víz előállítására magas a ion-koncentrációja; szolgáló ioncserélő oszlop átesett-e a rutin karbantartási vizsgálaton;

REF: 9511

25 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

2e.

2e. A felhasználónak érdemes odafigyelni arra, hogy a berendezés hőmérsékletében vagy a preanalitikus mintaelőkészítés expozíciós idejében bekövetkező eltérések a szövetmetszetekben a paraffin tökéletlen eltávolításához vezethetnek. A visszamaradó paraffin tökéletlen festődéshez vezethet bármely szövettani festék esetében, beleértve a ® CINtec Histology stain. szövettani festéket. Kórszövettani laboratóriumok berendezéseinek rendszeres ellenőrzése szükséges a festést megelőző mintaelőkészítés eltéréseinek csökkentése érdekében. Az immunreaktív szövetterületen belül megfigyelhető éles határok vagy egyéb inkonzisztenciák egy adott metszeten utalhatnak a minta nem megfelelő vagy tökéletlen preanalitikus feldolgozására, bármely immunhisztokémiai festék esetében. Amennyiben összefüggéstelen festődés figyelhető meg, a felhasználó kötelessége a berendezés és a minta-előkészítési módszerek ellenőrzése.

REF: 9511

26 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

3. A metszetek túlságos háttérfestődése

3a. A paraffin tökéletlen eltávolítása;

3a. Használjon friss xilol fürdőt, és az eljárást a 2.1./3.1. pont szerint végezze;

3b. A metszetek tárgylemezhez való 3b. A metszetek rögzítésében rögzítése keményítő-adalékanyag használt keményítőhasználatával; adalékanyagok gátolhatják az immunreaktivitást, ezért használatuk kerülendő; 3c. A metszetek elégtelen öblítése;

3c. Pufferfürdőkben és mosó üvegekben használjon friss oldatot;

3d. A minta száradása festési eljárás 3d. Használjon nedves kamrát. során; Egyszerre töröljön meg 3-4 metszetet a reagens alkalmazása előtt; 3e. Helytelen fixációs módszer;

3e. Csak az itt leírt rögzítőszert használja. A rosszul fixálódó szövet túlzott háttérfestődést mutathat;

3f. A reagensek nem specifikusan 3f. Ellenőrizze a mintára vonatkozó kötődnek a szövethez; fixációs módszert és nekrózis jelenlétét; 4. A szövet leválik a metszetről

4a. Helytelen tárgylemez használata;

4a. Tartsa be az itt leírt ajánlásokat ® és használjon SuperFrost Plus tárgylemezeket;

5. Túlzottan erős specifikus festődés

5a. Helytelen fixációs módszer;

5a. Biztosítsa rögzítőszert módszert;

a és

megfelelő fixációs

5b. A reagensek meghosszabbodott 5b. Tanulmányozza és tartsa be a inkubációs ideje; 2.2./3.2. pontokban leírt festési protokollt; 5c. Nem megfelelő mosóoldat;

REF: 9511

27 / 29

5c. Használja a Wash Buffer (10 x) (katalógusszám 8550);

2007-9511-001HU Rev 2.5

XII. Jelek Jel:

Magyarázat: Katalógusszám Gyártási tételszám In vitro diagnosztikus orvosi eszköz Gyártó Elegendő mennyiséget tartalmaz vizsgálathoz Nézze át a kezelési útmutatót Lejárat Hőmérséklet korlátozás

XIII. Gyártó Gyártja:

Roche mtm laboratories AG Sandhofer Straße 116 D-68305 Mannheim Germany www.cintec.info

XIV. Átdolgozás állapota A jelenlegi kezelési útmutató a 2013 januárban kiadott 2.5-es verziónak felel meg.

XV. Jogi nyilatkozat A szövegben említett SuperFrost®, Eukitt, Aquatex, Merck és Autostainer védjegyek az azokat illető védjegyjogosultak tulajdonába tartoznak. E védjegyjogosultak közül egyik sem áll kapcsolatban a Roche mtm laboratories AG-val. A CINtec®, mtm laboratories és E6H4® védjegyek a Roche mtm laboratories AG kizárólagos tulajdonát képezik és nem használhatók fel a Roche mtm laboratories AG előzetes írásos belegyezése nélkül. A CINtec® Histology Kit a Roche mtm laboratories AG által szabadalmazott technológián alapul országos és nemzetközi szellemi tulajdonjogok által védve, beleértve az European Patent EP 1 092 155 (DE, UK, FR, ES, IT), EP 0 665 886; U.S. Patent US 6,709,832, US 7,425,617 és US 7,691,632 és további országos szabadalmakat.

REF: 9511

28 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

1. melléklet: Szakirodalom 1.

Klaes R, Friedrich T, Spitkovsky D, Ridder R, Rudy W, Petry U, DallenbachHellweg G, Schmidt D, and von Knebel Doeberitz M. Overexpression of p 16INK4a as a specific marker for dysplasia and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri. Int J Cancer 2001, 92:276-84 2. Sano T, Oyama T, Kashiwabara K, Fukuda T, and Nakajima T. Expression status of p16 protein is associated with human papillomavirus oncogenic potential in cervical and genital lesions. Am J Pathol 1998, 153:1741-8 3. von Knebel Doeberitz M. New markers for cervical dysplasia to visualise the genomic chaos created by aberrant oncogenic papillomavirus infections. Eur J Cancer 2002, 38:2229-42 4. Klaes R, Benner A, Friedrich T, Ridder R, Herrington S, Jenkins D, Kurman RJ, Schmidt D, Stoler M, and von Knebel Doeberitz M. p16INK4a immunohistochemistry improves interobserver agreement in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia. Am J Surgical Pathol 2002, 26:1389-99 5. Wang SS, Trunk M, Schiffman M, Herrero R, Sherman ME, Burk RD Hildesheim A, Concepcion Bratti M, Wright TC, Rodriguez AC, Chen S, Reichert A, von Knebel Doeberitz C, Ridder R, and von Knebel Doeberitz M. Validation of p16INK4a as a marker of oncogenic human papillomavirus infection in cervical biopsies from a population-based cohort in Costa Rica. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004, 13:1355-60 6. Agoff SN, Lin P, Morihara J, Mao C, Kiviat NB, and Koutsky LA. p16INK4a expression correlates with degree of cervical neoplasia: a comparison with Ki-67 expression and detection of high-risk HPV types. Modern Pathol 2003, 16:66573 7. Negri G, Egarter-Vigl E, Kasal A, Romano F, Haitel A, and Mian C. p16 INK4a is a useful marker for the diagnosis of adenocarcinoma of the cervix uteri and its precursors: an immunohistochemical study with immuncytochemical correlations. Am J Surg Pathol 2003, 27:187-93 8. Negri G, Vittadello F, Romano F, Kasal A, Rivasi F, Girlando S, Mian C, and Egarter-Vigl E. p16INK4a expression and progression risk of low-grade intraepithelial neoplasia of the cervix uteri. Virchows Arch 2004, 445:616-20 9. Schorge JO, Lea JS, Elias KJ, Rajanbabu R, Coleman RL, Miller DS, and Ashfaq R. p16INK4a as molecular biomarker of cervical adenocarcinoma. Am J Obstet Gynecol 2004, 190:668-73 10. Christal L, and Valente T. The utility of p16 immunohistochemistry in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia. Pathology Case Reviews 2006, 11 no.3:117

REF: 9511

29 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

11. Kong CS, Balzer BL, Troxell ML, Patterson BK, and Longacre TA. p16INK4A Immunohistochemistry is Superior to HPV In Situ Hybridization for the Detection of High-risk HPV in Atypical Squamous Metaplasia. Am J Surg Pathol 2007, 31:33-43 12. Nucci MR, and Crum CP. Redefining Early Cervical Neoplasia: Recent Progress. Adv Anat Pathol 2007, 14:1-10 13. Ishikawa M, Fujii T, Saito M, Nindl I, Ono A, Kubushiro K, Tsukazaki K, Mukai M, and Nozawa S. Overexpression of p16INK4a as an indicator for human papillomavirus oncogenic activity in cervical squamous neoplasia. Int J Gynecol Cancer 2006, 16: 347-353 14. Kalof AN, Evans MF, Simmons-Arnold L, Beatty BG, and Cooper K. p16INK4a Immunoexpression and HPV In Situ Hybridization Signal Patterns Potential Markers of High-Grade Cervical Intraepithelial Neoplasia. Am J Surg Pathol 2005, 29: 674-679 15. Ansari-Lari MA, Staebler A, Zaino RJ, Shah KV, and Ronnett BM. Distinction of Endocervical and Endometrial Adenocarcinomas: Immunohistochemical p16 Expression Correlated With HumanPapillomavirus (HPV) DNA Detection. Am J Surg Pathol 2004, 28: 160-167 16. Regauer S, and Reich O. CK17 and p16 expression patterns distinguish (atypical) immature squamous metaplasia from high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN III). Histopathology 2007, 50: 629-635 17. Stoler MH, and Schiffman M. Interobserver reproducibility of cervical cytologic and histologic interpretations. JAMA 2001, 285:1500-5 18. McCluggage WG, Walsh MY, Thornton CM, Hamilton PW, Date A, Caughley LM, and Bharucha H. Inter- and intra-observer variation in the histopathological reporting of intraepithelial lesions using a modified Bethesda grading system. Br J Obstet Gynaecol 1998, 105:206-10 19. Ismail SM, Colclough AB; Dinnen JS, Eakins D, Evans DMD, Gradwell E, O´Sullivan JPO, Summerell JM, and Newcombe R. Reporting cervical intraepithelial neoplasia (CIN): intra- and interpathologist variation and factors associated with disagreement. Histopathology 1990, 16:371-6 20. De Vet HCW, Knipschild PG, Schouten HJA, Koudstaal J, Kwee W-S, Willebrand D, Sturmans F, and Arends JW. Interobserver variation in histopathological grading of cervical dysplasia. J Clin Epidemiol 1990, 43:1395-8 21. Bergeron C, Ordi J, Schmidt D, Trunk MJ, Keller T, and Ridder R, for the CINtec Histology Study Group. Conjunctive p16INK4a testing significantly increases accuracy in diagnosing high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Am J Clin Pathol, in press

REF: 9511

30 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5

2. melléklet

Példa diffúz festődési mintázatra:

1. ábra: CIN 3

Példa gócos festődési mintázatra:

2. ábra: Laphám metaplasia, érett

REF: 9511

31 / 29

2007-9511-001HU Rev 2.5