Doktori értekezés
Bazális előagyi neuropeptidek szerepe az agykérgi aktivációban
Eötvös Loránd Tudományegyetem Biológia Doktori Iskola Vezetője: Dr. Erdei Anna, D.Sc. Idegtudomány és Humánbiológia Doktori Program Programvezető: Dr. Détári László, D.Sc. ELTE Élettani és Neurobiológiai Tanszék 2008
Témavezető: Dr. Détári László, D.Sc. Készítette: Tóth Attila
TARTALOMJEGYZÉK 1. Irodalmi áttekintés ……………………………………………………………………7 1.1. Az agykéreg elektromos aktivitása – EEG………………………………………7 1.2. Az agykérgi és a magatartási aktiváció kapcsolata................................................8 1.3. Az alvás-ébrenléti ciklus szakaszai és EEG mintázatai.......................................10 1.3.1. Ébrenlét........................................................................................................10 1.3.2. Lassú hullámú alvás.....................................................................................11 1.3.3. Paradox (REM) alvás...................................................................................12 1.4. EEG mintázatok uretán narkózisban....................................................................13 1.5. Az alvás funkciója................................................................................................15 1.6. Az alvás szabályozása..........................................................................................16 1.6.1. Homeosztatikus szabályozás........................................................................16 1.6.2. Alvásdepriváció............................................................................................17 1.6.3. Cirkadián szabályozás..................................................................................18 1.6.4. Two process modell.....................................................................................19 1.7. A kérgi aktiváció szabályozásában részt vevő rendszerek..................................20 1.7.1. A talamokortikális rendszer.........................................................................20 1.7.2. A hisztaminerg rendszer...............................................................................21 1.7.3. Noradrenerg rendszer...................................................................................23 1.7.4. A dopaminerg rendszer…………………..………………………………..24 1.7.5. A szerotoninerg rendszer……………………….……………….…………25 1.7.6. Az agytörzsi kolinerg magvak……………………………………………..26 1.7.7. Alvásközpontok……………………………………………………………27 1.7.8. A bazális előagy…………………………………………...………………28 1.7.8.1. A bazális előagy kapcsolatrendszere………………..………………..29 1.7.8.1.1. Bemenetek……………………...……………………………….29 1.7.8.1.2. Kimenetek……………………………………………………….30 1.7.8.1.2.1. Az agykérgi vetület…...……………………………………30 1.7.8.1.2.1.1. A kolinerg vetület…………………….……………….30 1.7.8.1.2.1.2. A GABA-erg vetület………………………...………..32 1.7.8.1.2.1.3. A glutamáterg/peptiderg vetület……………..……….32 1.7.8.1.2.2. A talamikus vetület…………….…………………………..32 1.7.8.2. A BF különböző sejttípusai…….…………………………………….33 2
1.7.8.2.1. Kolinerg sejtek…………………………………………………..33 1.7.8.2.2. GABA-erg sejtek………………………………………………..33 1.7.8.2.3. Glutamáterg sejtek……………………………………………....34 1.7.8.3. A bazális előagy szerepe a kérgi aktivációban ……………………....35 1.8. A neuropeptidek és jelentőségük az alvásban…………………………….….…38 1.8.1. A szomatotrop tengely peptidjei és az alvás………………………………39 1.8.2. Orexin…………………………………………………………………...…40 1.8.3. Neuropeptid Y……………………………………………………………..42 1.8.3.1. A neuropeptid Y hatása az ébresztő rendszerekre…………………....45 1.8.4. Szomatosztatin………………………………………………………….…46 1.8.5. Neuropeptidek a bazális előagyban………………………………………..47 1.8.5.1. Neurotenzin…………………………………………………………..47 1.8.5.2. Substance P…………………………………………………………..48 1.8.5.3. Neurokinin B………………………………………………………....48 1.8.5.4. Galanin……………………………………………………………….49 1.8.5.5. Orexin………………………………………………………………...50 2. Kérdésfelvetés………………………………………………………………………..51 3. Anyag és módszer…………………………………………………………………....52 3.1. Akut kísérletek………………………………………………………………….52 3.1.1. Műtét………………………………………………………………………52 3.1.2. Anyagbeadások…………………………………………………………....52 3.1.3. Elektrofiziológiai mérések……………………………………………...…53 3.1.4. Adatelemzés…………………………………………………………….…53 3.2. Szövettan………………………………………………………………………..54 3.2.1. Nissl-festés………………………………………………………………...54 3.2.2. Tormaperoxidáz beadás és kimutatás…………………………………...…54 3.2.3. ChAT immunhisztokémia…………………………………………………55 3.2.4. A szövettani adatok feldolgozása……………….…………………………55 3.3. Krónikus kísérletek…………………………….……………………………….56 3.3.1. Műtét………………………………………………………………………56 3.3.2. Elektrofiziológiai mérések……………..………………………………….56 3.3.3. Viselkedési felvételek………………………………………..……………57 3.3.4. Kezelések………………………………………………………………….57 3.3.5. Adatelemzés……………………………………………………………….58 3
3.3.6. Statisztikai elemzés………………………………………………………..59 4. Eredmények………….………………………………………………………………60 4.1. A bazális előagyba adott neuropeptid Y és oktreotid hatásai az EEG-re altatott patkányokban……..…………………………...……………..60 4.1.1. A neuropeptid Y hatásai az EEG-re…….…………………………………61 4.1.2. Az oktreotid hatásai az EEG-re………..…………………………………..61 4.1.3. A neuropeptid Y és az oktreotid hatása a fájdalmas ingerrel kiváltott kérgi aktivációra……………………………………..….62 4.2. Neuropeptid Y beadás a bazális előagyba krónikus patkányokban………….…62 4.2.1. Viselkedési változások…………………………………………………….62 4.2.2. Alvási változások………………………………………………………….63 4.3. Szövettani eredmények…………………………………………………………64 4.4. Ábrák……………………………………………………………………………66 5. Megvitatás……………………………………………………………………………74 5.1. Technikai megfontolások…………………………………………………...…..74 5.2. A neuropeptid Y és az oktreotid hatásai az EEG-re altatott patkányokban…….75 5.3. A neuropeptid Y viselkedési hatásai szabadon mozgó patkányokban………….78 5.4. A neuropeptid Y alvási hatásai szabadon mozgó patkányokban.........................80 6. Összefoglalás...............................................................................................................83 7. Köszönetnyilvánítás.....................................................................................................86 8. Irodalomjegyzék..........................................................................................................87 9. Publikációs lista.........................................................................................................116 Magyar nyelvű összefoglaló..........................................................................................117 Angol nyelvű összefoglaló............................................................................................118
4
RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK 5-HT - szerotonin ACh – acetilkolin ACTH - adrenokortikotrop hormon BDNF – brain derived neurotrophic factor BF - bazális előagy BST – bed nucleus of stria terminalis ChAT – kolin-acetiltranszferáz CRF - corticotropin releasing factor DA – dopamin EEG - elektroencephalogram EMG - elektromiogram EPSP - excitatorikus posztszinaptikus potenciál GAL - galanin GP- globus pallidus HA – hisztamin HC - hippocampus HRP – tormaperoxidáz (horseradish peroxidase) I.c.v. – intracerebroventricularis I.p. - intraperitonealis IL-1 – interleukin 1 IPSP - inhibitoros posztszinaptikus potenciál LC - locus coeruleus LDT - nucleus laterodorsalis tegmentalis LH – laterális hipotalamusz LVFA – low voltage fast activity MCPO – magnocelluláris preoptikus area MD – nucleus mediodorsalis thalami MSDB – medial septum diagonal band NA – noradrenalin NBM – nucleus basalis Meynert NGF – nerve growth factor
5
NK – neuromedin K (receptor) NKB – neurokinin B NPS – neuropeptide S NPY - neuropeptid Y NT – neurotenzin OKTR - oktreotid ORX - orexin PA – paradox (REM) alvás PCPA - para-kloro-fenialanin POA – preoptikus area PPT – nucleus pedunculopontinus tegmentalis PVN – nucleus paraventricularis hypothalami RE – nucleus reticularis thalami S.c. - subcutan SCN - nucleus suprachiasmaticus SCR – slow cortical rhythm (lassú kérgi ritmus) SI - substantia innominata SN – substantia nigra SNpc – substantia nigra, pars compacta SOM – szomatosztatin SP – substance P SPT – nucleus subpeduncularis tegmentalis SWA – slow wave activity TMN – nucleus tuberomamillaris TNF – tumor nekrózis faktor VLPO - ventrolaterális propotikus area VP – ventralis pallidum VTA – ventralis tegmentalis area
6
1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS Az alvás és az ébrenlét váltakozása mindennapos tapasztalatunk. Az alvás és az álom jelensége már a legősibb civilizációkban élő embereket is foglalkoztatta (Barbera 2008). Hamar felismerték, hogy az alvás számos élettani változással jár együtt. Az alvás mélyebb megértését szolgáló kutatások azonban csak az agykérgi elektromos aktivitás felfedezése és később az elektrofiziológiai módszerek elterjedése után kezdődhettek meg. A dolgozatban a bazális előagyban (BF) előforduló neuropeptidek alvásébrenléti hatásait vizsgáltuk. A téma megértését elősegítendő ebben a fejezetben összefoglaljuk az alvással, illetve annak szabályozásával kapcsolatos ismereteket. Szólunk az EEG geneziséről, a különböző alvásszakaszokról, az alvás-ébrenlét szabályozásával és funkciójával kapcsolatos adatokról (alváselméletek, agyi szabályozó területek) és a neuropeptidek szerepéről ezekben a folyamatokban. Nagyobb részletességgel szólunk a BF-ről, mivel a későbbiekben reszletezett kísérleteink szempontjából ez az a terület, amely a legfontosabb a kérgi aktiváció szabályozásában. 1.1 Az agykéreg elektromos aktivitása – EEG Az idegsejtek populációs aktivitásának jellemzése és kvantifikálása az ún. mezőpotenciálok segítségével történhet. Ezek alapja az, hogy a szinkron működő neuronok membránáramai keresztülfolynak a sejtközötti téren és a potenciálváltozások megfelelő elektródokkal mérhetőek. A leggyakrabban vizsgált mezőpotenciál az elektroencephalogram (EEG), amely részletes vizsgálata az 1930-as évektől vált lehetővé. Az agykéregről különböző frekvenciájú potenciál-hullámok regisztrálhatók a fejbőrre vagy a kéreg felszínére helyezett elektródokkal. A néhányszor 10 mV-os makropotenciál-hullámok elsősorban a dendritek és a sejttest lassú potenciálváltozásai miatt keletkeznek. A szinaptikus aktivitás során a dendrit zónában pozitív, azaz a sejt belseje felé irányuló áram keletkezik (active sink). Az ellentétes irányú, negatív áram a sejttesten jön létre (passive source). A kettő együtt dipólust alkot, az áramkör pedig a sejtközötti téren keresztül záródik. Az EEG-jel fő forrásai a lassú szinaptikus potenciálváltozások (EPSP-k és IPSP-k) és az olyan, nem-szinaptikus áramok, mint a burst-kiváltott utóhiperpolarizációk. Az akciós potenciálok rendszerint nem játszanak fontos szerepet az EEG létrejöttében, mivel rövid időtartamuk (<2 ms) miatt nehezen összegződnek és keletkezésükben csak kis membránterületek vesznek részt. Lényeges 7
szempont, hogy az idegszövet sejtközötti tere a nagyfrekvenciájú elektromos hullámokat nem vezeti jól, ami megakadályozza a nagyfrekvenciájú jelek térbeli összeadódását. Az EEG kialakulásában a neuronok geometriája is lényeges. Az olyan sejt, amelynek dendritjei koncentrikusan helyezkednek el, nem kelt makropotenciálváltozást, mert a különböző irányú dipólusok kioltják egymást. A hosszú, elnyújtott alakú sejteket tartalmazó területekről regisztrálhatók legjobban mezőpotenciálok, mint amilyen az agykéreg és a hippocampus (HC), ahol a nagy piramis sejtek ilyen morfológiájúak. regisztrálhatóságuk
Az
egyes
feltétele
sejtek nagyszámú
potenciáljai sejt
igen
kis
potenciáljainak
amplitúdójúak, tér-
és
időbeli
szuperponálódása és a megfelelő mértékű erősítés. Ha a membránpotenciálok ingadozásai a szomszédos sejtekben időben összerendezetten zajlanak, akkor nagy amplitudójú és alacsony frekvenciájú hullámok jönnek létre (ún. SWA – slow wave activity). Ha a neuronok elektromos működése nem összehangolt, akkor az egyes neuronok jelei nagyrészt kioltják egymást. Ilyenkor kis amplitúdójú, nagy frekvenciájú hullámok jelennek meg (ún. LVFA – low voltage fast activity) (Elul 1971; Buzsaki and Traub 1997). 1.2. Az agykérgi és a magatartási aktiváció kapcsolata Már az első vizsgálatok, amelyek során az emlős agykéreg elektromos aktivitását regisztrálták (Caton 1875), rámutattak arra, hogy az agykérgi aktivitás mintázata függ attól, hogy a vizsgált személy vagy állat alszik vagy éppen ébren van. Az agykérgi aktivitás szintje (az ún. arousal) és az EEG-s mintázatok közötti kapcsolat hamar nyilvánvalóvá vált. Az EEG hullámait frekvenciájuk alapján az EEG-technika egyik úttörője, Hans Berger konvencionálisan felosztotta: delta (δ; 4 Hz alatt), teta (θ; 48 Hz), alfa (α; 8-13 Hz) és béta (β; 13-20 Hz) sávokra (Berger 1929). Valamivel később írták le az ún. gamma-hullámokat (γ; 20-80 Hz) (Adrian 1950). Magas éberségi szint mellett az EEG-ben LVFA mintázat jelentkezik, azaz a nagyfrekvenciájú, kis amplitúdójú hullámok dominanciája jellemző. Az éberség csökkenését és az alvás megjelenését az EEG-hullámok amplitúdójának növekedése és frekvenciájának csökkenése jelzi. Az arousal és az EEG közti összefüggés valójában a fentebb leírtnál bonyolultabb, ahogy az az alábbi kivételekből is látszik:
8
1. Kérgi aktiváció előfordulhat alacsony éberségi szint mellett is. Ezt mutatja a paradox alvás (PA)(Dement 1958), az illékony altatószerrel kiváltott narkózis (Rossi and Zirondoli 1955), a bazális köztiagy irtása (Feldman and Waller 1962), vagy a híd közepén, a nervus trigeminus kilépése előtt végzett átmetszés (Brunelli et al. 1972) után kialakuló állapot. 2. Éber állapotban is megfigyelhetők lassú hullámok az EEG-ben. Nagy delta hullámok jelennek meg ébrenlétben atropin és más muszkarinos acetilkolin (ACh)receptor blokkoló hatású anyagok beadása után (Longo 1966). Mozdulatlan, nyugodt ébrenléti állapotban patkányban 7-12 Hz közötti frekvenciájú orsó-tevékenység (ún. high-voltage spindle - HVS) figyelhető meg (Kaplan 1985). 3. Az LVFA jelenléte nem feltétlenül jelent magatartási aktivációt. Az ezerin (Bradley and Elkes 1953), illetve a kis dózisú rezerpin (Jouvet 1967) beadása kis amplitúdójú, nagy frekvenciájú EEG hullámtevékenységet vált ki, de magatartási aktiváció nem jelentkezik. A kétféle típusú aktivációt összehangoló mechanizmusok még mindig csak részben ismertek, annak ellenére, hogy intenzív kutatás folyik ezen a területen. Ezzel együtt intakt állatban a kettő szorosan kapcsolódik egymáshoz. A tradicionális elképzelés szerint tehát az agykéreg akkor van a külső szenzoros ingerek befogadására és feldolgozására alkalmas állapotben, amikor az EEG-re kis amplitúdójú és nagy frekvenciájú aktivitás jellemző. Ez jelenti az ún. kérgi aktivációt, amely definíció szerint az agykérgi idegsejtek megnövekedett válaszkészségét jelenti szenzoros és egyéb pályákon beérkező információkra (Steriade 1984). SWA mintázatot mutató EEG esetében az agykéreg ezirányú képessége korlátozott. Az újabb adatok azonban részben ellentmondanak ennek az elképzelésnek. Kimutatták ugyanis, hogy a külső ingerek lassú hullámú alvás alatt is képesek bejutni az agykéregbe, ahol feldolgozódnak (Czisch et al. 2002; Portas et al. 2000; Rosanova and Timofeev 2005). Az agykéreg tehát olyankor is képes a bejövő információk fogadására és feldolgozására, amikor az EEGben a lassú hullámok dominálnak. Az információfeldolgozás mechanizmusai azonban az éber, illetve az alvó állapotban eltérhetnek.
9
1.3. Az alvás-ébrenléti ciklus szakaszai és EEG mintázatai 1.3.1. Ébrenlét Aktív ébrenlét alatt LVFA típusú EEG tevékenység figyelhető meg, a béta és a gamma hullámok dominanciájával. Nyugodt ébrenlétben, csukott szemek és szenzoros nyugalom mellett 8-13 Hz frekvenciájú alfa hullámok jelennek meg (1. ábra). A szem kinyitása megszünteti az alfa tevékenységet. Az alfa hullámok az agykéregben keletkeznek, legnagyobb amplitúdóval az occipitális kéregről vezethetők el. Ha a
1. ábra. A különböző alvás-ébrenléti állapotokra jellemző EEG-s kép emberben (Siegel 2004) nyomán, módosítva.
10
vizsgált személy álmos, akkor az alfa hullámok kiterjednek a frontális régió felé is, egyes esetekben a hullámok frekvenciája is csökken. Ha az álmosság erősebb fokú, akkor az alfa hullámok aránya csökken az EEG-ben (Alloway et al. 1997). 1.3.2. Lassú hullámú alvás Egy normál alvási ciklus mindig a lassú hullámú alvással kezdődik. Ezt az alvásszakaszt az EEG mintázat alapján 4 további alszakaszra bontják emberben. Az 1. szakasz az éber és az alvó állapot közti átmenetet képviseli. Az EEG ekkor az ébrenlétihez hasonló, bár a béta hullámok frekvenciája kisebb és elszórtan teta hullámok jelennek meg. A 2. szakaszban 14-16 Hz frekvenciájú alvási orsók (szigma-orsók, bétaorsók) jelentkeznek, amelyek az elalvás biztos jelei. Az alvási orsókon kívül feltűnnek az ún. K-komplexek, amelyek polifázisos lassú hullámok. A 3. és a 4. szakaszban jelennek meg a progresszív módon növekvő amplitúdójú delta hullámok (Sinton and McCarley 2004). Meg kell jegyeznünk, hogy patkánykísérletekben a fenti felosztás nem érvényesül, a lassú hullámú alvást leggyakrabban egyszerűen „felületes” és „mély” alvásra osztják. A lassú hullámú alvás alatt jellegzetes fiziológiai változások következnek be. Az izomtónus csökken, de nem szűnik meg. A légzés és a szívritmus lelassul, a vérnyomás csökken. A vér eloszlása megváltozik a szervezetben: az izmok felé kevesebb vér áramlik, a zsigerek erei viszont kitágulnak (Jouvet 1992). A lassú hullámú alvás témájához kapcsolódik a napjainkban egyre intenzívebben kutatott lassú kérgi ritmus (slow cortical rhythm; SCR). Ez a ritmus a legkisebb frekvenciájú (< 1 Hz) EEG komponens, amely lassú hullámú alvás (4. szakasz) és műtéti narkózis során is jelentkezik (Steriade et al. 1993c; Steriade et al. 1993b; Steriade et al. 1993a). Jelen van in vitro is (Sanchez-Vives and McCormick 2000; Timofeev et al. 2000). Erős szinkronitást mutat egymástól távol lévő agykérgi területek között (Volgushev et al. 2006), létrejöttében a kérgi sejtek aktív (hipopolatizált; UP state) és inaktív (hiperpolarizált; DOWN state) állapotok közti oszcillációja a meghatározó. Az egyes állapotok időtartama 0.5-1.5 s. Az éles, hirtelen átmenetek a regisztrálás módjától függő lefutású, nagy amplitúdójú jeleket hoznak létre az EEG-ben. A hipopolarizált állapotban a kérgi sejtekben intenzív szinaptikus aktivitás és az éber állapotra jellemző intenzitású tüzelés figyelhető meg, míg a hiperpolarizált állapotban szinaptikus csend jellemző. Az SCR létrejöttében az agykéregnek tulajdonítanak elsődleges szerepet, mivel a mintázat talamusz-irtott állatban is fennmarad (Steriade et 11
al. 1993c) és megfigyelhető in vitro is (Sanchez-Vives and McCormick 2000; Timofeev et al. 2000). Újabb adatok szerint azonban a talamusznak fontos szerepe van az SCR létrejöttében (Blethyn et al. 2006). Az SCR ráterjed számos kéregalatti területre is, így a nucleus subthalamicus-globus pallidus komplexre (Bevan et al. 2002), a talamuszra (Blethyn et al. 2006), a striatumra (Wilson and Kawaguchi 1996), a HC-re (Wolansky et al. 2006), a nucleus pedunculopontinus tegmentalis (PPT)-ra (Balatoni and Detari 2003) és a BF-re is (Szentgyorgyi et al. 2006). Az UP és a DOWN állapotokban jellegzetes membánellenállás-változásokat írtak le. Altatott állatok esetében a membrán ellenállás 200-ról 100 megaohmra csökkent (Metherate and Ashe 1993), míg természetesen alvó macskában 11-ről 25-re nőtt (Steriade et al. 2001) a hipopolarizáltból a hiperpolarizált állapotba való átmenet során. Igen mély narkózisban az ún. burst-suppression mintázat alakul ki, amely az SCR szélsőséges formájának tekinthető. Ilyenkor a hiperpolarizált szakaszok akár több 10 másodpercig is eltarthatnak. A membrán ellenállás ekkor erősen lecsökken, mivel megnyílnak a K+-csatornák (Steriade et al. 1994). 1.3.3. Paradox (REM) alvás Neve onnan ered, hogy bár a kísérleti alany mélyen alszik és semleges ingerekkel nehezen ébreszthető, az agykéreg az ébrenlétre jellemző LVFA aktivitást mutat (1. ábra). A paradox alvás (PA) EEG-jében azonban megjelennek az ún. fűrészfog (sawtooth) hullámok is, amelyek ébren hiányoznak. Az első PA szakasz emberben az elalvás kezdetétől számítva 70-90 perc múlva jelentkezik. A lassú hullámú és a PA váltakozásának ez a kb. 90 perces ciklicitása megmarad az egész alvási periódus során, az ébredéshez közeledve a PA szakaszok egyre hosszabbá válnak (Sinton and McCarley 2004). Patkányokban a periódusidő rövidebb, 10-15 perc. A PA-ból ébresztett kísérleti személyek gyakran számolnak be álmokról, ezért valószínűleg ez az alvás álomlátásos szakasza. A PA-t REM (rapid eye movements) alvásnak is nevezik az ilyenkor tapasztalható gyors szemmozgások miatt. Ezt az alvásszakaszt jellegzetes fiziológiai változások jellemzik: a pulzus gyorsul, a vérnyomás és a testhőmérséklet megemelkedik, a légzés szaporábbá és rendszertelenebbé válik (Jouvet 1992). A PA-t kísérő változások lehetnek tónusosak illetve fázisosak. Tónusos az LVFA típusú kérgi aktivitás, a vázizmok elernyedése (atonia), a HC ritmikus teta hullámai és az agy hőmérsékletének növekedése. Fázisosak a PGO (ponto-genikulookcipitális)-hullámok, a gyors szemmozgások és a szórványos izomrángások. A 12
nyúltvelői nucleus reticularis magnocellularis, a híd tegmentumának egyes magjai és a középagyi retikuláris formáció vesz részt a PA szabályozásában (Hobson et al. 1993; Zamboni et al. 1999). A felsorolt területek mindegyike kolinerg sejteket tartalmaz. Az acetilkolin (ACh) szintje a kéregben a paradox alvás alatt is viszonylag magas szintre emelkedik (Marrosu et al. 1995). Ezzel szemben a noradrenalin (NA) és a szerotonin (5HT) koncentrációja tovább csökken (Hilakivi 1987), mivel a locus coeruleus és a raphe sejtjei szinte teljesen elhallgatnak (Hobson et al. 1993). A kolinerg és noradrenerg sejtek tehát együttesen szabályozzák a PA megjelenését és lefutását. 1.4. EEG mintázatok uretán narkózisban Mivel akut kísérleteinket uretán narkózisban végeztük, lényegesnek tűnik röviden szólnunk az uretán narkózisban megjelenő jellegzetes EEG mintázatokról (2. ábra). Détári és munkatársai öt olyan EEG mintázatot különítettek el, amelyek folyamatos átmenettel alakulnak át egymásba és az altatás eltérő mélységét jelzik (Detari et al. 1997). Az altatás mélységét igen nehéz objektív módon megítélni, de feltételezhető, hogy aktiváló inger (például farokcsípés) hatásának elmúltával az aktivitási szint fokozatosan csökken, és ez analóg az altatás elmélyülésével. Ezt a feltételezést megerősíti, hogy kiegészítő altató-adagok beadása után a különböző mintázatok hasonló sorrendben mennek át egymásba. A narkózis legfelületesebb szintjén erőteljes kérgi aktivációt jelző szakaszok spontán is jelentkeznek, de elsősorban különböző ingerlések (farokcsípés, agytörzsi elektromos ingerek) hatására lépnek fel (5. mintázat). Ezek a szakaszok megkülönböztethetetlenek az ébren megfigyelhető aktivációtól. Időtartamuk azonban sokkal rövidebb, és gyorsan átadják helyüket valamilyen, az alábbiakban ismertetendő, alacsonyabb aktivitási szintre jellemző mintázatnak. Az első ritmikus jellegű mintázat (4. mintázat) viszonylag felületesebb altatási szint mellett spontán is kialakul, illetve ébresztő hatású ingerek (pl. farokcsípés, az agytörzs elektromos ingerlése) utóhatásaként jelentkezik. A mintázatban néhány másodperces, lassú hullámokat tartalmazó periódusok és hasonló hosszúságú, nagy frekvenciájú, kis amplitúdójú EEG-t mutató szakaszok váltakoznak. A lassú hullámok a teta tartományba estek. A mintázat erősen emlékeztet az elalvás során jelentkező alfa orsókra, azonban a lassú hullámok sokkal kevésbé szabályosak, az egyes szakaszok pedig rövidebbek. A váltakozás frekvenciája 0.2 – 0.3 Hz közötti. Az altatás mélyebb szintjén lassú, a delta tartományba eső, szabálytalan hullámok mutatkoznak az EEG-ben (3. mintázat). Ez a mintázat emlékeztet a lassú 13
hullámú alvás során megfigyelhető kérgi aktivitásra, illetve az SCR-nek felel meg. A narkózis ennél mélyebb szintjein olyan EEG mintázatokat regisztrálhatunk (1. és 2. mintázat), amelyek csak narkózis alatt figyelhetők meg, természetesen módon alvó állatban hiányoznak. Ezen utolsó két, az altatás legmélyebb szintjein jelentkező mintázat közös jellemzője, hogy az EEG-ben átmeneti, szinte izoelektromos szakaszok vannak, melyeknek éles, a piramis sejtek rétegében negatív eltolódás vet véget. A mélyben negatív eltolódások 0.1 Hz-es alsó szűrés esetén néhányszor száz milliszekundumig fennmaradnak, és rájuk nagy frekvenciájú, a gamma tartományt is elérő hullámok szuperponálódnak. A két mintázat közül a kevésbé mély altatási szint mellett jelentkező elsősorban delta tartományba eső, szabálytalan hullámokból áll, amelyek között elszórtan izoelektromos EEG szakaszok, és az éles, mélyben pozitív eltolódások vannak (2. mintázat). Ez tehát átmenetet képzett a legmélyebb narkózisban fellépő mintázat felé, amikor az izoelektromos szakaszok és a nagy frekvenciájú hullámokat hordozó negatív eltolódások ritmikusan váltakoznak (1. mintázat). Ez utóbbi mintázatot nevezik „burst suppression”-nek.
2. ábra. EEG mintázatok uretán narkózisban. A regisztrátumok transzkortikális elektróddal készültek a frontális kéregből (Br: 2.0, L: 2.0). Az alkalmazott 1 Hz-es alsó szűrés eltorzítja a mélyben negatív eltolódásként jelentkező aktivált szakaszokat (1. görbe). Az altatás mélysége az 1. görbétől az 5-ig csökken. Kalibráció 2 mV és 2 s (Detari et al. 1997). 14
Az aktuálisan látható mintázatot nagyban befolyásolják az adott mérés technikai körülményei, a mérőműszerek beállításai is (elektród típusa, szűrés stb.). Akut kísérleteinkben (lásd később) csavarelektródok segítségével vezettük el az EEG-t. Az így kapott EEG hasonló a transzkortikális elektróddal regisztrálthoz, az egyes mintázatok jól felismerhetőek. Különbség viszont, hogy a főként 1. és 2. mintázat alatt jelentkező mélyben negatív eltolódások kevésbé élesen jelentkeznek. 1.5. Az alvás funkciója Az alvást szabályozó mechanizmusok egyre jobban ismertek, de az alvás funkcióját illetően még ma is csak találgatunk. Az alábbiakban röviden utalnánk néhány lényegesebb elképzelésre. 1. Az alvás, mint energiamegtakarítás. Alvás közben csökken az energiafelhasználás, így a környezeti erőforrások szűkössége esetén az alvás adaptív előnyt jelenthet. Másrészt az alvás távol tartja az élőlényeket a veszélyektől akkor, amikor fennmaradásuk szempontjából nem tudnak semmi hasznosat csinálni. Az alvás tehát szelekciós előnyt jelenthet az alvást mutató élőlényeknél (Webb and Cartwright 1978). 2. Az alvás, mint restauráció. Az alvás ezen funkciója a növekedési hormon lassú hullámú alvás alatti felszabadulásával lehet kapcsolatos. A növekedési hormon anabolikus hatása miatt fokozza a sejtek aminosav-felvételét és gátolja a dezaminálást. A proteinszintézist fokozó hatás az agyban is érvényesülhet és elősegítheti az emléknyomok konszolidációját (Idzikowski 1984). 3. Alvás, memória, szinaptikus homeosztázis. Az ébrenlét alatt főként a longterm potenciáció (LTP) mechanizmusával számos szinapszis erősödik meg az agykérgi neuronkörökben. Ez a szinaptikus potenciáció erősen összefügg a lassú hullámok mennyiségének homeosztatikus szabályozásával (delta homeosztázis). Az alvás alatt a szinapszisok egy része mintegy kiszelektálódik, leépül. Ennek célja, hogy csak annyi szinapszis
maradjon
meg,
amennyi
energetikailag
fenntartható
és
hatékony
helykihasználást tesz elehetővé a szürkeállományban. Az alvás tehát az az ár, amit a plaszticitásért fizetünk, a célja pedig az, hogy kiegyensúlyozza a neuronok szinapszisainak a számát (Tononi and Cirelli 2006). Egy másik, az előzőnek némileg ellentmondó elképzelés szerint (Kavanau 1997) az alvás alatti oszcillációk időről-időre, ritmikusan aktiválják a neuronköröket (különösen a ritkábban használtakat), így járulva hozzá azok fennmaradásához („dinamikus stabilizáció”). A szenzoros küszöbök alvás 15
alatti emelkedésével a külvilágból jövő információ mennyisége lecsökken. Ez szintén a szinapszisok stabilizálódásához vezet, mivel az újabb és újabb információk nem írják felül a kialakuló szinapszisokat. Az újonnan kialakult memórianyomok megerősítésében elsősorban a REMalvásnak tulajdonítanak jelentős direkt szerepet, bár a motorikával kapcsolatos tanulásban a lassú hullámú alvás 2. szakasza tűnik lényegesnek (Walker et al. 2002). A REM-alvás szerepével kapcsolatos kísérletes eredmények ellentmondóak. Humán kísérletekben a vizuális memóriával kapcsolatos tesztek eredményessége jól korrelált az azt követő REM (és lassú hullámú) alvás mennyiségével (Stickgold et al. 2000). A monoamin-oxidáz gátló antidepresszánsok (amelyek teljesen eltüntetik a REM-alvást), nem okoznak memóriazavarokat, sőt, akár memória-javulást is okozhatnak (Vertes and Eastman 2000). 1.6. Az alvás szabályozása 1.6.1. Homeosztatikus szabályozás Már az alváskutatás kezdeti szakaszában megindult az alvást elősegítő endogén anyagok keresése. Pieron 1913-ban azt feltételezte, hogy létezik egy ún. hypnotoxin, amelynek a szintje ébrenlét alatt megemelkedik, és létrehozza az alvást. A vizsgálatok során az alvásdeprivált kísérleti állatok vizeletéből vagy cerebrospinális folyadékából vontak ki olyan anyagokat, amelyet a kontroll állatok agykamrájába juttatva alvást okoztak (Pappenheimer et al. 1967). Kiderült, hogy ezek az anyagok a muramilpeptidek csoportjába tartoznak. A muramil-peptideket bélbaktériumok termelik és hatásukat részben a pirogén hatású interleukin-1 (IL-1) mennyiségének növelésén keresztül fejtik ki (Guenounou et al. 1985). Az IL-1 hipnogén hatású (Krueger et al. 2001), az általa kiváltott hipertermia pedig úgyszintén (Berger and Phillips 1988). A sokat keresett „univerzális alvásfaktort” nem sikerült ugyan megtalálni (és ma már nem is valószínű, hogy egyáltalán van ilyen), de számos anyagról bebizonyosodott, hogy befolyásolja az alvást. Az adenozin az idegsejtek fokozott aktivitása következtében halmozódik fel az extracelluláris térben (Radulovacki 1985). Hatásmechanizmusa nem ismert, de kimutatták, hogy hatását a BF-en keresztül fejti ki (Alam et al. 1999; Thakkar et al. 2003). Az adenozin antagonistája, a koffein serkenti az ébrenlétet (Daly et al. 1981). Számos hormon és citokin is hatással van az alvásra. Így például az IL-1, a tumor nekrózis faktor alfa (TNFα) és az interferon-α fokozza a lassú hullámú alvást (Obal, Jr.
16
and Krueger 2003). A neuropeptidek jelentős része is szerepel az alvás szabályozásában (lásd később). Egyes peptideket, így például a growth hormon releasing hormont (GHRH) szintén alvásfaktorként tartottak számon (Obal, Jr. et al. 1988). Részben a homeosztatikus szabályozáshoz kapcsolódik Krueger és Obal alváselmélete. E szerint az alvás szerepe az, hogy a meglévő be- és kimeneti viszonyokkal
rendelkező
neuroncsoportok
működésébe
beépülhessen
az
új
ingermintázatokra való válaszadási képesség, miközben a régi funkciók megőrződnek. A sejtcsoportokon belüli szinaptikus elrendeződések átalakulása aktivitás-függő faktorok kibocsájtásával jár. Amíg az átépülés tart, az adott neuroncsoport nem képes adaptív válaszadásra. Minél több csoportban zajlik az átépülés, annál kevésbé képes az idegrendszer a megfelelő válaszok kialakítására. Éppen ezért van szükség az alvásra, amelyet a kibocsájtott, különböző típusú faktorok (TNFα, NGF – nerve growth factor, adenozin, BDNF – brain derived neurotrophic factor, IL-1) hoznak létre (Krueger and Obal, Jr. 2003). 1.6.2. Alvásdepriváció Az alvásdepriváció az alváskutatás klasszikus módszere, amelynek segítségével bebizonyosodott, hogy a homeosztatikus tényezők igen lényegesek az alvás szabályozásában. A krónikus és teljes alvásmegvonás következményeit patkányokban 1983-ban írták le (Rechtschaffen et al. 1983). Az állatok átlagosan 16 napos depriváció hatására pusztultak el. Ez az érték összemérhető az éheztetéses és a szomjaztatásos kísérletek során tapasztaltakkal (17-19, illetve 20 nap) (Dewasmes et al. 1989). Ez alapján az alvás, illetve az alvás alatt végbemenő folyamatok hasonló elemi szükségletet jelentenek a szervezetnek, mint a víz és a táplálék. Az alvásdepriváció legfeltűnőbb következménye az energiaigény folyamatos növekedése volt. A táplálékfelvétel erősen megnőtt, de ezzel együtt a testtömeg csökkent. A megvonási periódus elején a testhőmérséklet enyhén megnőtt (<0,5 oC), majd a periódus utolsó kétharmadában visszatért a normál értékre. Az utolsó napokban enyhe hipotermia jelentkezett (kb. 1 oC), ami a hő-visszatartó mechanizmusok zavarára utalt. Az állatok farka és talpa kisebesedett. A sebek később nekrotikussá váltak, de nem fertőződtek el. Az alvásmegvonás legvégéig nem jelentkeztek hematológiai változások, amelyek a belső szervek működészavaraira utaltak volna. A periódus legvégén normocitás anémia és alacsony szérum albumin szint alakult ki. Az EEG amplitúdója csökkent,
feltehetően
az
alacsonyabb
agyhőmérséklet
miatt.
A
morfo-
és 17
hisztopatológiai vizsgálatok nem mutattak belső szervi elváltozásokat (Everson et al. 1989a). A paradox alvás szelektív megvonása hasonló eredményekkel járt, mint a teljes alvásmegvonás. A halál 16-54 napos depriváció után következett be. A teljes alvásmegvonáshoz hasonlóan nem volt észlelhető belső szervi elváltozás a halált követően. Hasonló tünet volt a fokozott táplálékfelvétel, a testsúlycsökkenés és a hipotermia is (Kushida et al. 1989). Rövidebb időtartamú depriváció esetében alváspótlás jelentkezik. A pótlás fokozott alvásigényt jelent, ez az ún. rebound jelensége (Ursin 1971). A lassú hullámú alvás időbeli pótlása nem teljes (a pótlás rövidebb időtartamú, mint maga a depriváció), de az alvás mélyebb, intenzívebb lesz. Ilyenkor a delta hullámok mennyisége és/vagy amplitúdója nő meg (Feinberg 1974). A paradox alvás megvonása után szintén pótlás következik be (KHAZAN and Sawyer 1963). A pótlás azonban a lassú hullámú alváséhoz viszonyítva erőteljesebb, nagyobb arányú és akár a lassú hullámú alvás terhére is történhet (Everson et al. 1989b). Meg kell jegyeznünk, hogy a sokat idézett Rechtschaffen-féle kísérletek eredményeit fenntartásokkal kell kezelni a használt metodika miatt. A deprivációs módszer („disk-over-water” technika) csak megzavarta az alvást és 70-90 %-al csökkentette a mennyiségét. A kontroll állatok 30-40 %-át vesztették el az alvásuknak (Everson et al. 1989a). Más fajokkal végzett teljes depriváció során nem sikerült reprodukálni ezeknek a kísérleteknek az eredményeit. Ugyanezzel a módszerrel 24-29 napig galambokat depriválva nem következett be halál (Newman et al. 2008) és szintén nem volt letális az alvásmegvonás más módszerrel deprivált patkányoknál sem (Siegel 2008). 1.6.3. Cirkadián szabályozás Az alvás és az ébrenlét külső, szinkronizáló ingerek hiányában is ritmikusan váltakozik. Ennek oka az, hogy a legtöbb soksejtű szervezetben cirkadián oszcillátorok, ún. biológiai órák vannak, amelyek hierarchikus rendszerbe szerveződnek. Emlősökben a hierarchia csúcsán a nucleus suprachiasmaticus (SCN) áll (Moore and Eichler 1972; Abrahamson and Moore 2001; Mistlberger 2005). Ennek a hipotalamikus magnak a neuronjai in vitro is mutatják jellegzetes ritmusukat, tehát a cirkadián ritmus létrejötte az egyedi neuronok belső tulajdonságainak és nem külső hatásoknak az eredménye (Reppert and Weaver 2002). A neuronok által generált ritmus az ún. óragének (BMAL, 18
PERIOD, CRYPTOCHROME, CLOCK) transzkripciójának és transzlációjának bonyolult mintázat szerinti váltakozásán alapul (Wager-Smith and Kay 2000). A szenzoros információk az óra működését a külvilág ciklikus folyamataihoz igazítják, amelyek közül a fény-sötét váltakozás a legfontosabb. Ez az információ a retinából a retinohipotalamikus pálya közvetítésével jut el az SCN-be (Johnson et al. 1988). Az SCN vezérli a tobozmirigy melatonintermelését és ezen keresztül, hormonszinten kényszeríti rá a ritmusát a szervezet sejtjeire (Cassone et al. 1986). A melatonin ugyanis csak sötétben termelődik, megvilágításkor a szekréció szünetel (Klein and Weller 1972). A cirkadián ritmusok számtalan élettani folyamatot befolyásolnak, az egyik legismertebb példa erre a szteroidhormonok szintézise és felszabadulása. Az SCN irtása a cirkadián ritmusok széteséséhez vezet, ha a kísérleti állat nem jut valamilyen egyéb környezeti ingerhez, amely beállíthatná a cirkadián ritmusát (Moore and Eichler 1972). Az SCN sejtjeinek aktivitása erősen korrelál az aktuális alvásfázissal: REM alvás alatt a sejtek aktivitása nő, míg lassú hullámú alvás alatt csökken (Deboer et al. 2003). Az SCN neuronjai tehát visszajelzést kapnak az alvás-ébrenlét változásairól. A visszajelzés mechanizmusában feltehetően az agytörzs és a BF kolinerg sejtjei szerepelnek. 1.6.4. Two process modell A cirkadián és a homeosztatikus folyamatok kölcsönhatásaira mutat rá Borbély elméleti modellje (Borbely 1982; Borbely and Tobler 1989). A modell szerint két különálló folyamat vesz részt az alvás szabályozásában. Az S (sleep) folyamat alvásfüggő, míg a C (circadian) folyamat az alvástól független. Az S folyamat szintje ébrenlét alatt nő és elér egy felső (H) küszöböt, amikor is alvás következik be. Alvás alatt az S folyamat szintje csökken, amíg el nem ér egy alsó (L) küszöböt, ami ébredéshez vezet. A H és az L értéke nem állandó és közösen alkotják a C folyamatot. A H és az L paraméter értéke szinuszoid hullámzást mutat, amelyet egy cirkadián oszcillátor irányít (ez lehet például az SCN). Az S és a C folyamat szintje közötti távolság szabja meg, hogy aktuálisan mekkora az igény az alvásra. A modellt később kiegészítették az ultradián ritmus bevonásával, amely egyrészt a lassú hullámú- és a REM-alvási szakaszok váltakozásának ritmusa, másrészt e szerint változik az ébrenlét alatti aktivitás szintje is (Borbely 1998).
19
1.7. A kérgi aktiváció szabályozásában részt vevő rendszerek Ha az agyat megfosztjuk a befutó szenzoros információktól (ún. cerveau isolée preparátum), akkor folyamatosan alvó állapotba kerül (Bremer 1935). Az alvás és az ébrenlét váltakozása nem pusztán a szervezet passzív reakciója a környezet változásaira, hanem az agy által igen bonyolultan szabályozott folyamatokról van szó. J. Allan Hobson-t idézve: „Sleep is in the brain, by the brain and for the brain”(Hobson 2005). A kutatások eredményeként kiderült, hogy számos agyterület elektromos, mechanikai vagy éppen farmakológiai manipulációja az alvás-ébrenlét paramétereinek megváltozásával jár. Az első struktúra, amelynek jelentőséget tulajdonítottak a kérgi aktiváció szabályozásában, az agytörzsi hálózatos állomány volt (Moruzzi and Magoun 1949). Az elképzelés szerint az agytörzs bizonyos területeinek stimulációja ébredést és LVFA-t vált ki. A későbbiekben a talamuszról, illetve számos transzmitterrendszerről is bebizonyosodott, hogy ún. felszálló aktiváló rendszerként (lásd 4. ábra) képes a kérgi aktiváció és így az alvás-ébrenlét szabályozására. 1.7.1. A talamokortikális rendszer Az agykéreg bemeneteinek többsége a talamuszból származik, így a talamusz aktivitása jelentős hatással van az agykéreg működésére. A talamusz specifikus (relé) magvaiban elhelyezkedő glutamáterg sejtek sokféle szenzoros bemenetet kapnak és az agykéregre vetülnek. A relésejtek az aspecifikus magvak közé tartozó RE GABA-erg neuronjaihoz axonkollaterálisokat küldenek és tőlük gátló impulzusokat kapnak. Az RE sejtjei axonkollaterálisaik segítségével egymást is gátlás alatt tartják. A szintén GABAerg gátló interneuronok bemenete az RE sejtektől származik, míg kimeneteik a relésejtekre irányulnak (3. ábra). A kéreg felől érkező serkentő, glutamáterg axonok mindhárom sejttípusra adnak kollaterálisokat (McCormick and Bal 1997). A talamokortikális rendszer sejtjeinek két fő aktivitásmintázata van. Az oszcilláló működésmód lassú hullámú alvás alatt jellemző. Ilyenkor a relésejtek ritmikusan tüzelnek és nagyfrekvenciás kisüléscsomagokat (burst) produkálnak, amelyek a delta hullámok és a 7-14 Hz közötti orsó-aktivitások kialakulását indukálják (McCormick and Bal 1997). Ez az oszcilláló aktivitás egyrészt a fentebb ismertetett szinaptikus
kapcsolatok,
másrészt
a
sejtek
egyedi
membrántulajdonságainak
következménye. A tónusos (relé) üzemmód idején, ébrenlétkor és REM-alváskor a relésejtek egyedi kisüléseket mutatnak vagy tónusosan, változó frekvenciával tüzelnek.
20
Az RE sejtek tüzelési mintázata a relésejtekéihez hasonlóan változik. A kétféle üzemmód közti váltás egyik legfontosabb mechanizmusa az alacsony küszöbű, kálcium kisülés (Jahnsen and Llinas 1984). Az alacsony küszöbű Ca2+-áram a nyugalmi potenciál normális értéke mellett inaktív, hiperpolarizáció hatására azonban az inaktiváció megszűnik, a Ca2+-áram dezinaktiválódik. Aktiváló hatások ilyenkor kálcium akciós potenciál-hullámot válthatnak ki, amelynek nagysága elegendő ahhoz, hogy egy burst jöjjön létre. A burst alatt a relésejtek ritmikus gátló potenciálokat kapnak az RE neuronjaitól. A hiperpolarizáció felfüggeszti az alacsony küszöbű kálciumáram inaktivációját (dezinaktiválja). Az emiatt létrejövő nagy frekvenciájú kisüléssorozat az RE
sejtekben
ismét
akciós
potenciál-hullámokat
vált
ki,
amelyek
újabb
hiperpolarizációs hullámot indítanak a relésejtekben. Az RE sejtekben is megtalálható az alacsony küszöbű kálcium kisülés mechanizmusa, de itt összetettebb ionáramok lépnek működésbe, amelyek a relésejtből az orsó időtartama alatt érkező EPSP-kkel együtt biztosítják azt, hogy az RE sejt az orsó egész időtartama alatt hipopolarizált állapotban legyen. Az oszcilláció üzemmód kialakulásának előfeltétele, hogy a relésejtek hiperpolarizált állapotban legyenek, ami a specifikus bemenetek és felszálló aktiváló hatások (kolinerg, noradrenerg, szerotoninerg, hisztaminerg) erőteljes csökkenése következtében alakul ki az elalvás kezdetén (Steriade and Deschenes 1984; Steriade 2003). Ébredéskor vagy REM-alvásba való átmenetkor pedig a relésejtek és az RE sejtek depolarizálódnak az aktiváló rendszerek működése miatt (McCormick 1992a). 1.7.2. A hisztaminerg rendszer Hisztamint (HA) tartalmazó neuronok a hipotalamusz tuberomamilláris magjaiban (TMN) találhatók (Panula et al. 1984). Ezen sejtek projekciója kiterjedt, innerválják az agykérget, a BF-et, a talamuszt és az agytörzsi aminerg magvakat is (Panula et al. 1989). A TMN kérgi aktivációban játszott szerepét támasztja alá, hogy az allergiás reakciók kezelésére használt anti-HA (H1 receptor antagonista) szerek álmosító hatásúak (White and Rumbold 1988). A HA-tartalmúnak feltételezett neuronok tüzelése az alvás-ébrenlét ciklussal párhuzamosan változik macskákban (Monti 1993) és patkányokban (John et al. 2004). A HA felszabadulás cirkadián ritmust mutat (Friedman and Walker 1968). A GABA A receptor agonista muszcimol injekciója a TMN-be hiperszomniát vagy álmosságot idéz elő (Lin et al. 1989). I.c.v. vagy lokális
21
3.ábra. Sejtkapcsolatok a talamokortikális rendszerben (Steriade 1997), módosítva. (RE): a retikuláris mag GABAerg sejtjei; (Th-cx): talamokortikális sejtek; (L-circ): helyi interneuronok; (Aff): afferens; (Eff): kérgi efferens; (+): serkentő kapcsolat; (-): gátló kapcsolat. A felső Th-cx sejt erősebb afferentációjú, mint az alsó. Az RE sejtek dendro-dendritikus kapcsolatokon és axonkollaterálisokon keresztül egymást, a lokális interneuronok egy csoportját és a talamokortikális sejteket is gátolják. Ennek eredményeként az alsó, gyenge afferentációjú Th-cx-sejt gátlódik, mivel az azt gátló Lcirc sejtre nem érkezik gátlás, a felső Th-cx sejt viszont az erőteljes bemeneti információt továbbíthatja a kéreg felé. A Th-cx-sejtek axonkollaterálisai serkentik az őket gátló RE-sejteket. A kéreg efferens rostjai mindhárom sejtféleségre vetülnek.
22
HA vagy H1 agonista injekció az EEG-ben LVFA megjelenését váltja ki, fokozza az ébrenlétet és csökkenti a lassú hullámú alvást (Monnier and Hatt 1969; Tasaka et al. 1989). A HAerg neuronok működésének szabályozásában fontosak a laterális preoptikus area-ból (POA; a feltételezett „alvásközpont”-ból – lásd később) érkezőGABAerg rostok (Kitahama et al. 1989; Sherin et al. 1998). Az anatómiai kapcsolatok és a funkcionális adatok alapján a HA az egész agy aktivitásának szabályozásában részt vállal, leginkább azonban az aktivitási szint stabilizálása lehet a feladata (Passani et al. 2000; Wada et al. 1991). Megjegyzendő azonban, hogy a H1 receptor génkiütött egerek és a vad típusú fajtársaik alvás-ébrenléti ciklusa normál körülmények mellett nem tér el. Ez arra utal, hogy a HAerg rendszer önmagában nem kulcsfontosságú
az
alvás-ébrenlét
szabályozásában,
sérülését
a
többi
transzmitterrendszer kompenzálni képes (Huang et al. 2001). 1.7.3. Noradrenerg rendszer A noradrenerg (NAerg) rendszer alvás-ébrenlét szabályozásában részt vevő neuronjai a híd dorzális részében elhelyezkedő locus coeruleusban (LC) találhatók. Az LC a negyedik agykamra alatt elhelyezkedő, kisméretű páros mag. A mag NA-tartalmú sejtjei szinte az egész központi idegrendszerre vetülnek (Foote et al. 1983). Az NAerg sejtek aránya fajról-fajra változik az emlősök körében és az agykéreg fejlettségével korrelál. Patkányban az LC szinte minden idegsejtje NAerg, de macskában ACh-t és 5HT-t tartalmazó sejtek is találhatók itt (King and Angelakos 1973). Az NAerg sejtek populációja is heterogén, sok közülük galanint (GAL) és/vagy NPY-t is tartalmaz (Olpe and Steinmann 1991). Az NAerg sejtek kisülései a szerotoninerg sejtekhez hasonlóan erősen korrelálnak az alvás-ébrenléti ciklussal. A legnagyobb frekvenciával ébrenlét alatt tüzelnek, lassú hullámú alvás alatt tüzelésük csökken, majd REM-alvás idején gyakorlatilag elhallgatnak (Aston-Jones and Bloom 1981). Mint már utaltunk rá, a REM-alvás genezisében lényegesek az agytörzsi kolinerg és a monoaminerg, így az LC NAerg sejtjei közötti kétirányú, gátló és serkentő kapcsolatok (Hobson 1992). A kolinerg agonista bethanechol, amely stimulálja az LC serkentő hatású kolinerg afferenseit, kérgi LVFA-t vált ki és a hippokampális teta-ritmus fokozódását okozza (Berridge and Foote 1991). Az LC egyoldali irtása patkányokban nem okozott változást sem az azonos oldali, sem az ellenoldali EEG-ben (Cirelli et al. 1996). Az LC NAerg sejtjeinek szelektív neurotoxinos irtása után nem változott sem a lassú hullámú, sem a REM-alvás összértéke. Az alvás mennyisége kismértékben megnőtt a fény-sötét 23
váltáskor, és az ébrenlét fokozódott a sötét periódus elején (Blanco-Centurion et al. 2004). Az LC lényeges komponense az izomtónus szabályozásának. A narkolepsziára jellemző kataplexia során az NAerg neuronok tüzelése megszűnik, így az LC igen lényeges lehet az izomtónus fenntartásában az ébrenlét során. REM-alvásban és kataplexia során az izomtónus megszüntetésében vesz részt (John et al. 2004; Wu et al. 1999). Általános értelemeben az NAerg sejtek hatása az általuk beidegzett neuronokon a jel/zaj viszony javítása, a háttéraktivitás csökkentésével a lényeges stimulusok kiemelése és a válaszkészség növelése (Aston-Jones and Bloom 1981; Berridge and Foote 1991). Az LC szerepet játszik a neurális plaszticitás és a tanulás szabályozásában is. Számos transzkripciós faktor nagyobb mennyiségben expresszálódik ébrenlét alatt, mint az alvás során (Cirelli and Tononi 1998; Tononi and Cirelli 2001). Az LC kiirtása után az NA mennyisége erősen lecsökkent és a transzkripciós faktorok expressziója ébrenlét során is olyan alacsony szintű maradt, mint alvásban (Cirelli et al. 1996). 1.7.4. A dopaminerg rendszer A legfontosabb dopaminerg (DAerg) neuroncsoportok a középagy substantia nigra pars compacta (SNpc) nevű részében és a szintén középagyi ventrális tegmentális areában (VTA) találhatók. Az SNpc-ből kiinduló nigrostriatalis pálya a striatumban (Sourkes and Poirier 1965), a mezolimbikus/mezokortikális pálya a VTA-ból indulva limbikus rendszerben, a tuberculum olfactoriumban illetve a prefrontális kéregben végződik (Oades and Halliday 1987). A DAerg rendszer alvás-ébrenléti szerepe ellentmondásos. A DAerg-nek feltételezett neuronok tüzelése ugyanis nem változik az alvás-ébrenléti ciklus során. REM alvás alatt azonban a sejtek tüzelése variábilisabbá válik, mint lassú hullámú alvásban. A feltételezhetően nem DAerg sejtek tüzelési frekvenciája azonban magasabb REM alvásban, mint lassú hullámú alvásban és magasabb mozgás alatt, mint nyugodt ébrenlétben (Miller et al. 1983). A DA felszabadulása azonban a mediális prefrontális kéregben és a nuclues accumbens-ben változik az alvás-ébrenléttel: Ébrenlét és REMalvás során nagyobb mértékű a felszabadulás, mint lassú hullámú alvás alatt (Lena et al. 2005). A DAerg rendszert károsító neurodegeneratív betegségek tünetei között szerepelnek az alvászavarok is (Arnulf 2006). A Parkinson-kórban szenvedő betegek 24
zöme alvászavaros, amely gyakran súlyos fokú (Adler and Thorpy 2005). Huntingtonkórban szintén alvászavarokat írtak le. A betegség egyik állatmodellje szerint a nappali aktivitás megnő, míg az éjszakai csökken, a cirkadián alvás-ébrenlét mintázat szétesik (Morton et al. 2005).
4. ábra. A felszálló aktiváló rendszerek emberi agyban (Fuller et al. 2006). A locus coeruleusból (LC) noradrenalin (NE), a raphe-ból szerotonin (5-HT), a periakveduktális szürkeállományból (vPAG) dopamin (DA), a tuberomamilláris magból (TMN) hisztamin (his), a laterális hipotalamuszból (LH) pedig orexin (ORX)-tartalmú rostok vetülnek az agykéregre. A bazális előagy (BF) kolinerg (ACh) és GABA-erg kérgi vetületet ad, míg az agytörzsi kolinerg magvak (LDT és PPT) a talamuszra vetülnek. 1.7.5. A szerotoninerg rendszer A szerotoninerg (5-HTerg) neuronok az agytörzs teljes hosszában végighúzódó, centrális helyzetű raphe-magvakban találhatók (Anden et al. 1965). Ez a rendszer tartalmazza a monoaminerg rendszerek közül a legtöbb neuront. A raphe magvak területéről induló projekciók monoszinaptikusan, ill. varikozitásokon át az egész központi idegrendszert ellátják (Anden et al. 1965; Dahlstrom et al. 1965). A kezdeti kutatások az 5-HT-t az alvás elindításával és fenntartásával hozták összefüggésbe. Jovet 1972-ben publikált „egy amin-egy funkció“ elmélete szerint az 5-HT az alvásért felelős, míg a katekolaminok az ébrenlétért (Jouvet 1972). Az elméletet számos kísérleti bizonyíték támogatta. A raphe nem-specifikus irtása hosszú ideig (10-15 nap) tartó 25
álmatlanságot okozott macskákban (Jouvet and Pujol 1972). Az 5-HT bioszintézisének kulcsenzimét (triptofán-hidroxiláz) gátló para-kloro-fenilalanin (PCPA) beadását teljes inszomnia követte macskákban (Koella et al. 1968) és patkányokban (Tobler and Borbely 1982). Később azonban számos ellentmondás merült fel az elmélettel kapcsolatban. A macskában kialakuló inszomnia krónikus PCPA kezelés esetén idővel megszűnt, és az alvás visszatért. A raphe dorsalis neuronjai nem alvás, hanem ébrenlét alatt tüzelnek a leggyorsabban, lassú hullámú alvás idején kisülési frekvenciájuk csökken és REM alvás alatt gyakorlatilag elhallgatnak (McGinty and Harper 1976). Az 5-HT-felszabadulás a kéregben és a talamuszban ébrenlét alatt fokozott, míg lassú hullámú alvás alatt lecsökken (Cespuglio et al. 1983). A raphe nagyfrekvenciás ingerlésével nem lehetett alvást kiváltani (Houdouin et al. 1991). Az 5-HT-nek a mai modellek az ébrenlét fenntartásában tulajdonítanak szerepet. Feltételezések szerint ez a rendszer lenne felelős a nem automatizálódott, akaratlagos mozgások alatt az agykéregben megfigyelt atropin-rezisztens - nem kolinerg – LVFAért (Vanderwolf 1988). Egy másik hipotézis szerint (Jouvet 1999) a raphe dorsalis fokozott aktivitása olyan folyamatokat indít el, amelyek végül alváshoz vezetnek. 5-HTprekurzor
(L-5-HTP)
beadása
az
alvásközpontként
számon
tartott
POA-ba
helyreállította az alvást PCPA injekcióval álmatlanná tett macskákban (Denoyer et al. 1989). 5-HT és 5-HT1A receptor agonisták hiperpolarizálták a BF kolinerg neuronjait in vitro (Khateb et al. 1993). 5-HT beadás a BF-be in vivo csökkentette az EEG gamma (30-60 Hz) teljesítményét, bár az alvás-ébrenléti fázisok időtartamát nem változtatta meg (Cape and Jones 1998). 1.7.6. Az agytörzsi kolinerg magvak Az agytörzsi kolinerg sejtek a nucleus laterodorsalis tegmentalis (LDT), a nucleus subpeduncularis tegmentalis (SPT), illetve a nucleus pedunculopontinus tegmentalis (PPT, Kölliker-Fuse mag) területén találhatók (Mesulam et al. 1983) amelyek gyakorlatilag egy folytonos kolinerg sejtpopulációt jelentenek. A PPT kompaktabb, mint az LDT és az SPT, a kolinerg sejtek aránya itt a legmagasabb. A PPT a kolinerg sejtek mellett glutamáterg neuronokat is tartalmaz (Clements and Grant 1990). A kolinerg sejtekben az ACh mellett P-anyag, glutamát, és a nitrogén-monoxid szintetáz is kimutatható (Dawson et al. 1991; Standaert et al. 1986; Vincent et al. 1983).
26
A BF kolinerg sejtekkel ellentétben az agytörzsi neuronok NADPH diaforáz aktivitást mutatnak (Geula et al. 1993). A PPT kolinerg sejtjei számos kéregalatti területre vetülnek (Datta 1995), de agykérgi vetületre (mediális prefrontális kéreg) csak patkányból vannak adatok (Satoh and Fibiger 1986). Az agytörzsi kolinerg magvak kétirányú kapcsolatban állnak a BF-el (Semba and Fibiger 1992). Leírtak kolinerg vetületet a PPT-ből a BF-be és a PPT ingerlése növelte az ACh felszabadulást a kéregben (Rasmusson et al. 1994). Ennek elentmond azonban, hogy a kérgi ACh felszabadulás csökkent a BF-be adott nemspecifikus glutamát antagonista kinurénsav hatására, míg az atropin hatására nem (Rasmusson et al. 1994). Az ACh gátolta a BF kolinerg sejteket in vitro (Khateb et al. 1997). A két struktúra közti kapcsolat tehát valószínűleg indirekt, glutamáterg. Azon régiók irtása, amelyek az agytörzsi kolinerg magvakat tartalmazzák, kómát vált ki (Stewart-Amidei 1991). A PPT sejtjeinek aktivitása az esetek 73 %-ában erősen korrelált az alvás-ébrenléti ciklussal szabadon mozgó állatban. Éber állapotban a sejtek aktivitása fokozott a mély alváshoz és a paradox alváshoz képest is (Datta and Siwek 2002). A PPT sejtjeinek spontán aktivitása erős korrelációt mutat a kérgi EEG-vel uretán-altatott patkányokban. A sejtek egy csoportja (F-sejtek) növelte tüzelési frekvenciáját kérgi aktiváció alatt, míg az ún. S-sejtek a nagy, lassú hullámok alatt mutattak fokozott aktivitást (Balatoni and Detari 2003). A PPT szerepet játszik kognitív és tanulási folyamatokban (Steckler et al. 1994), a motiváció szabályozásában (Inglis et al. 2000), valamint a figyelemben (Kozak et al. 2005). Ezek az adatok arra utalnak hogy az agytörzsi kolinerg magvak lényegesek az EEG-s és a magatartási aktiváció összehangolásában. 1.7.7. Alvásközpontok Miután leírták az agytörzsi ébresztő rendszert, igen sok próbálkozás történt feltételezett ellenpárjának, az alvásközpontnak a megtalálására. Az újabb kutatási eredmények a ventrolaterális preoptikus areát (VLPO) alvási központként említik (Lu et al. 2000; Saper et al. 2001; Salin-Pascual et al. 2001). Az itt elhelyezkedő GABA-erg és GALerg neuronok alvás alatti tüzelési frekvenciája az ébrenlét alattinak közel kétszerese. VLPO-irtott állatokban, mind a lassú hullámú-, mind a REM-alvás mennyisége erősen csökkent. A lassú hullámú alvás mennyiségének csökkenésével nagymértékben korrelált a VLPO-sejtek számában bekövetkezett csökkenés. Az ún. kiterjesztett VLPO, azaz a VLPO körüli terület sejtjei a REM-alvás szabályozásában 27
vehetnek részt. A sejtpusztulás mértéke és a REM-alvásban bekövetkezett csökkenés erősen korrelált ezzel a területtel (Lu et al. 2000). Az LC-re, a raphe-ra és a PPT/LDT komplexre vetülő sejtek zömmel a kiterjesztett VLPO-ban helyezkednek el. A VLPO és a monoaminerg sejtek kapcsolata kétirányú (Wagner et al. 2000; Chou et al. 2002). A VLPO erősen vetül a kolinerg sejteket tartalmazó BF területekre is, bár a vetület itt nem kolinerg sejteken végződik (Steininger et al. 2001). Az SCN kapcsolatban áll a VLPO-val, részben a hipotalamusz dorzomediális magján keresztül. Ez a kapcsolat lehetővé teszi, hogy a napi ritmusok befolyályosolják a feltételezett alvásközpont működését (Deurveilher et al. 2002). A VLPO szerepével kapcsolatban azonban meg kell jegyezni, hogy sejtjei csak akkor aktiválódnak, amikor az alvás már létrejött. Alvásdepriváció után közvetlenül feláldozott állatokban nincs megnövekedett c-fos expresszió ezen a területen (Sherin et al. 1996). A VLPO sejtjeinek működése tehát nem jelzi az alvás iránti igényt és nem is indíthatja el az alvás folyamatát az ébresztőrendszerek gátlásán keresztül, bár az ezekkel a rendszerekkel fennálló kölcsönös gátlás stabilizálhatja a magatartási állapotokat (Saper et al. 2001). Meg kell jegyeznünk, hogy a VLPO alvásközpont szerepe nem általánosan elfogadott, az erről szóló cikkek zöme egyazon (bár igen elismert) kutatócsoporttól származik. 1.7. 8. A bazális előagy A BF az előagy alapján, a hipotalamusz előtt, a törzsdúcoktól ventrálisan elhelyezkedő, anatómiailag igen heterogén terület. Frontálisan a tuberculum olfactorium és a nucleus accumbens, laterálisan az amigdala és a praepiriformis kéreg határolja.. A BF-en számos pálya fut keresztül, ráadásul ez a terület neurokémiailag nagyon változatos és egymással keveredő sejtcsoportokat tartalmaz (5 és 6. ábra). A kérgi aktiváció szempontjából azok a BF területek lényegesek, ahol kolinerg projekciós neuronok helyezkednek el. A mediális szeptum/vertikális diagonális köteg területén elhelyezkedő kolinerg neuronok elsődlegesen a HC-re vetülnek: Ezek a neuronok a dolgozat szempontjából nem relevánsak, így részletesen nem tárgyaljuk őket. A substantia innominata (SI), a ventrális pallidum (VP), a globus pallidus (GP), a magnocelluláris preoptikus mag (MCPO) és a diagonális köteg horizontális szárának (HDB) neuronjai pedig elsősorban az agykéreggel állnak kapcsolatban. A BF területén elsősorban kolinerg idegsejtek, GABAerg projekciós neuronok és interneuronok különböző csoportjai, valamint glutamáterg és peptiderg sejtek találhatók (Gritti et al. 1997; Zaborszky and Duque 2000). A neurokémiailag eltérő sejtpopulációk egymással 28
keveredve, térben csak kismértékben elkülönülve vannak jelen (Zaborszky and Duque 2003) (5. ábra). A különböző transzmitter-tartalmú sejtcsoportokat, kérgi vetületeiket illetve az általuk alkotott neuronköröket a továbbiakban részletesen is ismertetjük. A BF-en áthaladó pályák közül jelentős az ansa lenticularis és a mediális előagyi köteg, ami még nehezebbé teszi a sejtcsoportok körülhatárolását. A közvetlenül a hipotalamusz és a chiasma opticum előtt elterülő része a POA, amely az utóbbi években mint ún. alvásközpont jelenik meg az irodalomban (Lu et al. 2000; Saper et al. 2001; Kumar 2004). A BF anatómiájára egységes nevezéktan sajnos nem létezik, ez pedig a különböző munkákból nyert eredmények összevetését erősen megnehezíti. 1.7.8.1. A bazális előagy kapcsolatrendszere 1.7.8.1.1. Bemenetek A BF kérgi bemenete igen körülhatárolt területekről, a prefrontális kéreg mediális és orbitofrontális részeiből, az insularis és a piriform kéregből ered. A kérgi bemenet kizárólag nem-kolinerg sejteken végződik (Zaborszky et al. 1997), de nem világos, hogy pontosan mely BF sejtpopulációk fogadják ezt a bemenetet. A PFC mediális részének elektromos stimulációja az ingerre reagáló BF sejtek több, mint felében gátlást okozott (Gyengesi et al. 2008). Ez arra utalhat, hogy a kérgi bemenet a helyi gátló (inter)neuronokon végződik. Ezek a sejtek NPY-t és szomatosztatint (SOM) tartalmaznak és feltételezték, hogy lényegesek lehetnek a kérgi bemenet továbbításában a projekciós sejtek felé (Zaborszky and Duque 2003). Újabb eredmények szerint azonban SOMerg BF sejtek nem fogadnak prefrontális bemenetet (Gyengesi et al. 2007). Egyelőre nem tudjuk, hogy NPY-tartalmú sejtek kapnak-e kérgi bemenetet. Elképzelhető, hogy a PV neuronok fogadják a kérgi afferentációt, erre vannak is adatok, de ennek a kérdésnek a tisztázása még további vizsgálatokat igényel. A BF az agykérgen kívül még számos agyterületről kap bemenetet. Az LC felől NA-tartalmú rostok érkeznek. A rostok kolinerg dendritekkel szinaptizálnak (Zaborszky 1989). Az NA depolarizálja a kolinerg sejteket in vitro (Fort et al. 1995). Az agytörzsben elhelyezkedő adrenalin-tartalmú neuronok vetülnek a kolinerg sejtekre és velük aszimmetrikus szinapszisokat alkotnak, az adrenerg bemenet tehát valószínűleg serkentő hatású (Hajszan and Zaborszky 2002).
29
A VTA-ból és az SNpc-ből DAerg rostok idegzik be a kolinerg, a PV- és a SOM-tartalmú neuronokat (Gaykema and Zaborszky 1996; Gaykema and Zaborszky 1997; Zaborszky and Duque 2003). Az amigdalából nagy részében gátló bemenet éri el a BF neuronokat. A bemenet zöme nem-kolinerg, azonosítatlan transzmitterű sejteken végződik, kisebb része pedig kolinerg neuronokon (Zaborszky et al. 1984; Jolkkonen et al. 2002). Az LH orexint (ORX) tartalmazó neuronjai erősen vetülnek BF-re (Nambu et al. 1999) és az ORX serkentő hatású volt a kolinerg sejteken in vitro (Eggermann et al. 2001). Az agytörzsi raphe magvakból 5-HT-tartalmú rostok is elérik a BF kolinerg sejtjeit. Ez a bemenet gátló lehet, mivel az 5-HT hiperpolarizálta a kolinerg sejteket in vitro (Khateb et al. 1993). 1.7.8.1.2. Kimenetek A BF igen szerteágazó kimenetei révén fontos szerepet játszik a kognitív és vegetatív működések,
a
limbikus
struktúrák
és
a
különböző
magatartási
állapotok
szabályozásában, amelyek erősen kötődnek a magas éberségi szinthez (Semba 2000). A kérgi vetületen kívül a talamusz RE magvához (Hallanger et al. 1987a), az amigdalához (Ottersen 1980), a hipotalamuszhoz (Heimer et al. 1990) és középagyi struktúrákhoz (Swanson et al. 1984) is futnak rostok, így a BF igen komplex módon befolyásolhatja a legkülönbözőbb agyi funkciókat. 1.7.8.1.2.1. Az agykérgi vetület Az alvás-ébrenlét szabályozás szempontjából legfontosabb BF vetület az agykéreghez fut. A vetület neurokémiailag heterogén: kolinerg, GABA-erg és glutamáterg/peptiderg komponenseket egyaránt tartalmaz. 1.7.8.1.2.1.1. A kolinerg vetület A BF kolinerg sejtjeinek monoszinaptikus vetületét az 1980-as években írták le és azóta is intenzíven vizsgálják (Mesulam et al. 1983; Saper 1984). Az ACh gyors, ionotróp, és lassú, metabotróp receptorokon keresztül fejti ki biológiai hatásait. Az ionotróp receptor vegyes kation csatornát nyit, a nikotin agonistaként hat rajta. A metabotróp („muszkarinos”) receptoroknak öt típusa ismert (M1-M5). Az M1, M3 és M5
30
receptorok a Gq fehérje közvetítésével a foszfolipáz C-t aktiválják, ami diacilglicerol-on át a proteinkináz C-t mozgósítja, illetve az inozitol-trisz-foszfát útján a belső raktárakból Ca2+ felszabadulást eredményez. Ez – többek között- serkenti a nitrogénmonoxid szintetizáló enzimet. Az M2 és M4 ugyanakkor a Gi/Go közvetítésével gátolja az adenilciklázt, így csökkenti a cAMP szintet. Az ACh felszabadulás a kéregben komplex hatásokkal jár. A piramissejteken és a serkentő interneuromokon a kolinerg bemenet hosszan tartó serkentést idézhet elő a metabotrop receptorokon keresztül. Ennek hátterében többféle típusú K+-csatorna, illetve K+-áram gátlása áll (McCormick 1992b). A kolinerg terminálisok azonban olyan gátló interneuronokkal is szinaptizálnak, amelyek kiterjedt axon-kollaterális hálózattal rendelkeznek. Az ACh felszabadulás így gyors, rövid ideig tartó, de nagy területet érintő kérgi gátlást is okozhat. Ezzel magyarázható, hogy ACh hatására a piramissejtek először gyorsan hiperpolarizálódtak, majd lassan depolarizálódtak in vitro (McCormick and Prince 1986). A gyors gátlásnak szerepe lehet abban, hogy csökkentse a spontán aktivitást a kéregben és elősegítse a szenzoros információkra adott szelektív válaszokat, ahogy az a kérgi aktiváció során megfigyelhető (Beaulieu and Somogyi 1991). A kolinerg vetület gyakorlatilag egyoldali, csak nagyon kevés kolinerg rost kereszteződik át. Reciprok BF-kéreg kapcsolatok nem jellemzőek, csak a limbikus kéregrészek vetítenek vissza a BF-re (prefrontális, insularis és piriform kéreg). A kéregre vetülő kolinerg neuronok csak nagyon kevés axonkollaterálist küldenek nem kérgi célpontok felé (Semba 2000). A kolinerg (és a nem-kolinerg) vetület topografikus jelleget mutat (Baskerville et al. 1993; Zaborszky 2002). Kimutatták, hogy egy-egy BF neuron csak 1-2 mm2-nyi területet lát el rostjaival a kéregben (Price and Stern 1983). Újabb adatok szerint viszont a projekció jóval kiterjedtebb (Gritti et al. 1997). A kolinerg terminálisok a kérgi területtől függő eloszlást mutatnak a kéreg különböző rétegeiben (Eckenstein et al. 1988). A terminálisok kisméretűek és főként a kérgi sejtek dendritjeivel alakítanak ki szimmetrikus szinapszisokat (Houser et al. 1985). A partnerneuron mind piramissejt, mind serkentő illetve gátló interneuron is lehet. Utóbbi csoport legfontosabb bemenetét adják a kolinerg terminálisok (Beaulieu and Somogyi 1991). Mindezekkel együtt is, a kérgi kolinerg terminálisok csak viszonylag kis számú szinapszist alakítanak ki, ami arra utal, hogy az ACh parakrin módon, extraszinaptikusan is felszabadulhat (Descarries et al. 1997). Ilyen módon az ACh nem csak a neuronokra, hanem az erekre is hatással lehet (Chedotal et al. 1994). Az ereken végződő kolinerg rostok fontos forrása a BF (Sato et al. 2001), az Ach-kiváltotta 31
fokozott vérátáramlás pedig az EEG-re is hatással lehet. Az ACh ilyen irányú hatásait azonban limitálja, hogy extracellulárisan az agyszövet nagy mennyiségben tartalmaz ACh-t elimináló enzimeket (Ach-észteráz és butirilkolin-észteráz)(Giacobini 2003). 1.7.8.1.2.1.2. A GABA-erg vetület Szintén az 1980-as évek óta ismert, hogy a kérgi BF vetületnek van egy nemkolinerg része is (Rye et al. 1984). Az is világossá vált, hogy a kolinerg és a nem kolinerg vetület hasonló mintázat alapján idegzi be az agykérget (Woolf et al. 1986). A GABA-erg vetület igen jelentős, a becslések szerint a BF kérgi vetületének legalább 50 %-át adja (Gritti et al. 1993; Gritti et al. 1997). A kéregre vetülő GABA-erg sejtek főként gátló interneuronokon végződnek és dezinhibícióval képesek kérgi aktivációt okozni (Freund and Meskenaite 1992). Ha a kérgi interneuron jelentős axonkollateralizációval rendelkezik, akkor a dezinhibíció jelentős kérgi területre is kiterjedhet. A GABAerg BF neuronok tehát rövid ideig tartó, de nagy területet érintő kérgi aktivációt képesek kiváltani. 1.7.8.1.2.1.3. A glutamáterg/peptiderg vetület A nem-kolinerg, nem-GABA-erg vetület kb. egyharmadát adhatja a BF kérgi vetületének (Gritti et al. 1997). A kortikopetális BF sejtek 8 %-a GAL-pozitív, ezek a sejtek főként a HDB területén vannak (Senut et al. 1989). A neurokininB-t expresszáló BF sejtek szintén vetítenek a kéregre (Burgunder and Young, III 1989). Elképzelhető az is, hogy a glutamát és a különböző neuropeptidek kolokalizáltak a BF neuronokban (Semba 2000). 1.7.8.1.2.2. A talamikus vetület Patkányokban a BF talamikus vetülete korlátozott, csak az RE és a mediodorzális magra (MD) korlátozódik. A talamikus vetület az agykérgihez hasonlóan túlnyomórészt ipszilaterális és mind kolinerg, mind GABA-erg rostokat tartalmaz (Asanuma and Porter 1990). Az RE-re irányuló kolinerg vetület kb. kétharmada a BFből, míg egyharmada a középagyi kolinerg magvakból (PPT és LDT) származik (Hallanger et al. 1987b). A kolinerg axonterminálisok szimmetrikus szinapszisokat adnak az RE neuronok dendritjeire (Hallanger and Wainer 1988). A BF vetületnek szerepe lehet az RE sejtjeinek alvás-ébrenléttel összefüggő változásainak kialakításában
32
(egyedi vs. burst kisülések) és az adott tüzelési mintázat stabilizálásában (McCormick 1992b). Ennek pontos mechanizmusa azonban egyelőre tisztázatlan: az ébrenléttel összefüggő transzmitterekkel (mint pl. a monoaminokkal) ellentétben az ACh hiperpolarizálja az RE neuronjait (McCormick 1992b). A limbikus funkciójú MD főként a VP-ből, az SI-ből és a HDB-ból kap BF bemenetet (Grove 1988). A vetület patkányban főként GABA-erg, kolinerg komponenst nem tartalmaz (Kuroda and Price 1991). Az MD kapcsolatban áll a mediális prefrontális kéreggel, a ventrális striatummal és a mezolimbikus DAerg rendszerrel, amelyek igen lényegesek a viselkedés és a különböző motivációk szabályozásában (Kalivas and Nakamura 1999). Ez a vetület tehát a BF és a limbikus rendszer egy lényeges kapcsolódási pontja. 1.7.8.2. A BF különböző sejttípusai 1.7.8.2.1. Kolinerg sejtek A BF kolinerg rendszerét nagy (20-50mm) átmérőjű, multipoláris, kiterjedt dendritfával és sok dendrittüskével (Semba and Fibiger 1989) rendelkező sejtek összefüggő láncolata alkotja. A sejtek morfológiája is utal arra, hogy projekciós neuronokról van szó. A sejtrendszer íves, görbületével előre néző magcsoportot alkot. 1.7.8.2.2. GABA-erg sejtek A BF a kolinerg sejteknél nagyobb számban tartalmaz GABA-erg neuronokat. Ezek a kolinerg sejtekkel keveredő sejtpopulációt alkotnak, egy részük nagy méretű, projekciós sejt, mások kisebbek és feltehetően interneuronként működnek (Gritti et al. 1993; Gritti et al. 1997). A kéregre vetülő GABA-erg sejtek gátló interneuronokon végződnek és dezinhibícióval képesek kérgi aktivációt okozni (Freund and Meskenaite 1992). A GABA-erg sejtek különböző Ca2+-kötő fehérjéket (parvalbumin, calretinin, calbindin) tartalmazhatnak és a különböző altípusok térbeli megoszlása különböző. A GABA-erg sejtek egy része neuropeptid Y-t (NPY) és/vagy SOM-ot tartalmaz és ezek a sejtek valószínűleg lokális interneuronok (Zaborszky and Duque 2003). A működés szempontjából azok a GABA-erg sejtek is lényegesek lehetnek, amelyek rostjai a tágabb értelemben vett BF, a ventrális striatum (nucleus accumbens) és pallidum, vagy a POAanterior hipotalamusz területén találhatók.
33
1.7.8.2.3. Glutamáterg sejtek Akár interneuronokról, akár projekciós neuronokról van szó, glutamáterg sejtek jelenlétének igazolása metodikailag igen nehéz. A glutamát metabolikus prekurzorként jelen van a GABA szintézisben (Roberts 1981). A neurotranszmitterként használt glutamát főként glutaminból származik (Bradford et al. 1978), és az átalakítást a foszfát-aktivált glutamináz enzim (PAG) végzi. Az enzim ellen termelt ellenanyag segítségével tehát szelektíven meg lehet jelölni a glutamáterg sejteket, legalábbis egyes szerzők szerint (Manns et al. 2001). A PAG segítségével végzett vizsgálatok szerint jelentős számú, a kéregre vetítő BF neuron szintetizál glutamátot. Ezen sejtek egy része csak glutamátot termel, míg más részük GABA-t vagy ACh-t is szintetizál a glutamát mellett (Manns et al. 2001). Ezek az eredmények vitatottak, más szerzők szerint csak a közelmúltban klónozott vezikuláris glutamát transzporterek (a Vglut-ok) jelentenek a glutamáterg neuronok számára megbízható markereket (Zaborszky and Duque 2003), (Fremeau, Jr. et al. 2001). Vglut2 mRNS in szitu hibridizációjával kiderült, hogy számos BF sejt glutamáterg és a BF kérgi vetületének kb. 5%-a glutamáterg. A glutamáterg sejtek nagyobb arányban vetültek a mediális prefrontális kéregre (Hur and Zaborszky 2005). Feltételezhető, hogy a kolinerg sejtek egy kis része glutamátot is tartalmaz (Szerb and Fine 1990).
5. ábra. A neurokémiailag eltérő BF sejtek eloszlásának átfedése a BF négy különböző rostrocaudalis szintjében (Zaborszky and Duque 2003). Bal oldal: piros-kolinerg, zöldPVerg. Jobb oldal: piros-kolinerg, fekete-szomatosztatinerg.
34
1.7.8.3. A bazális előagy szerepe a kérgi aktivációban A BF kitüntetett szerepét a kérgi aktivációban számos kísérleti bizonyíték támasztja alá. Az első kísérleti eredmények a kérgi kolinerg vetület fontosságára mutattak rá és csak az 1990-es években ismerték fel a GABAerg vetület jelentőségét. Az agykérgi ACh kizárólagos forrása a BF (Mesulam et al. 1983; Rye et al. 1984). Az EEG-ben látható LVFA-val párhuzamosan ébrenlét és paradox alvás alatt az ACh felszabadulás megnő az egész agykéregben (Kanai and Szerb 1965). A BF elektromos ingerlésére a kérgi ACh felszabadulás megnő (Rasmusson et al. 1992). Az ACh felszabadulás az agykéregben és a dorzális HC-ben változik az éberségi szinttel (Rye et al. 1984). A muszkarin receptor antagonista atropin beadása nagy lassú, hullámokat idéz elő az EEG-ben (Longo 1966; Stewart et al. 1984; Vanderwolf 1975). Az ébrenlét alatti SWA mintázatú EEG azonban csak akkor maradt meg, ha a patkány az ún. 2-es típusú viselkedési elemeket mutatta (mozdulatlanság, szaglászás a fej mozgása nélkül, arc önápolása). A lassú hullámok az 1-es típusú viselkedés alatt (járkálás, fej mozgása) nem jelentek meg, illetve eltűntek, ha az állat a 2-es típusú viselkedésről átváltott az 1-es típusúra (Stewart et al. 1984). A BF irtása erős hatást gyakorolt a kérgi aktivációra, jelentős különbség van azonban a szelektív és a nem-szelektív irtások eredményei között. Nem-szelektív excitotoxikus léziók a kolinerg sejteket tartalmazó BF területeken az EEG lassulását eredményezték a megfelelő agykérgi régiókban (Buzsaki et al. 1988), míg lokális léziók a talamusz RE-ben és egyéb talamikus régiókban (például az intralamináris magvakban) nem befolyásolták a kérgi EEG-t (Stewart et al. 1984; Buzsaki et al. 1988) . A nucleus basalis Meynert (NBM) nem-szelektív (iboténsavval történt) kiirtása viszont drámaian megnövelte a delta teljesítményt az irtott oldalon, hasonlóan a szkopolamin beadás hatásához (Buzsaki et al. 1988). A BF irtása erősen lecsökkentette az ACh felszabadulást a kéregben. Az EEG minden sávjában csökkent a teljesítmény, legnagyobb mértékben a magas frekvenciatartományokban. Az irtott állatokban a spontán mozgás fokozódott, kondícionált aktív elkerülési viselkedés viszont gátlódott (Lo et al. 1982). Egyoldali, kainsavas BF irtással nagy amplitúdójú, lassú hullámú aktivitás jelent meg ipszilaterálisan. Kolinerg agonisták (oxotremorin, pilokarpin) képesek voltak visszaállítani a normálishoz hasonló neokortikális aktivitást az irtás után (Vanderwolf et al. 1993). Egy másik tanulmány szerint a BF területén agyszövetbe adott AMPA injekció után 45 %-a pusztult el a kolinerg sejteknek, a totál EEG teljesítmény
35
6. ábra. Sejtkapcsolatok a BF-ben (Zaborszky and Duque 2003). A kis fehér körök serkentő, a feketék gátló kapcsolatokat jeleznek. A fehér körök mínusz jellel dopaminerg, közepükön ponttal pedig noradrenerg vagy szerotoninerg szinapszisokat jelentenek. A fekete szín a sejttestek esetében GABApozitivitást jelent, míg a szürke sejttest azt jelzi, hogy az adott sejttípus esetében bizonytalan, hogy GABA-t vagy éppen glutamátot tartalmaz. Az üres körben végződő axonkollaterálisok azt jelzik, hogy a posztszinaptikus partner bizonytalan. Jelölések: CH-kolinerg sejt, PV-parvalbumin-tartalmú sejt, SOMszomatosztatin-tartalmú sejt, NPY- neuropeptid Y-tartalmú sejt, CR – calretinin-tartalmú sejt. A kolinerg sejtek különböző részei más-más bemenetet kapnak. Az amigdalából (AMY) és a locus coeruleusból (LC) jövő bemenet a disztális dendriteken végződik. A szomatosztatin (SOM), neuropeptid Y (NPY), GABA, mediális preoptikus areából jövő (MPA) és dopaminerg bemenet a sejttestre illetve proximális dendritekre érkezik. A PV sejtek kérgi bemenete a prefrontális kéregből származik, és rostokat kapnak a ventrális tegmentális areából is (VTA). A mezopontin tegmentumból (MPT) eredő axonok a PV és a CH neuronokon végződnek. A CR és a PV sejtek szerotonint (5-HT) tartalmazó rostokat kapnak a raphe-ból. Az orexin (Hcrt)-tartalmú rostok a laterális hipotalamuszból erednek, CH illetve PV sejteken végződnek a BF-ben. Adrenerg (A) axonok érik el az LC sejtjeit, a Hcrt neuronokat és a BF CH sejtjeit is. Az ábrán nem szerepel néhány, a BF-ben jelen lévő neuropeptid. A neurotenzin-tartalmú axonok valószínűleg CH sejteken végződnek. A substance P-t tartalmazó rostok eredete ismeretlen, de CH és nem-CH sejteket egyaránt innerválnak. Neurokinin B-t tartalmazó rostok érkeznek a striatumból és egyes kéregre vetülő BF sejtek expresszálják is ezt a peptidet. A CH sejtek egy része galanint is tartalmaz. Jobb illetve bal oldalon immunhisztokémiailag azonosított PV, CH és NPY neuronok aktivitásának az EEG-vel való korrelációja látható. A PV és a CH neuronok ún. F-sejtek, míg az NPY neuronok S-sejtek. További részletekért lásd a szöveget.
(0.25-16 Hz között) illetve minden egyes sáv külön-külön vett teljesítménye is nőtt (Rispoli et al. 2004). Iboténsavas irtás után a kéregben megnőtt a lassú hullámok mennyisége és a kolinerg markerek csökkent mennyisége 8 hónap alatt sem állt helyre (Riekkinen, Jr. et al. 1991).
36
A kolinerg sejtek szelektív kiirtására a receptor-specifikus szaporin-konjugált neurotoxinok kifejlesztése után nyílt lehetőség. A kolinerg sejtek zömén megtalálható a p75 NGF receptor (Schweitzer 1987), amelyhez a 192-IgG-szaporin elnevezésű neurotoxin szelektíven kötődik. A receptor és a hozzá kötődött toxin együttese internalizálódik, majd a szaporin a riboszómák működésének gátlásán keresztül 7-10 nap alatt elpusztítja a sejtet. A VP és a sublenticularis SI területén a kolinerg sejtek egy része nem expesszál p75 NGF receptort (Woolf et al. 1989). Ezek a neuronok a toxinnal nem elpusztíthatóak, NK-1 receptorral rendelkeznek és az amigdalára, illetve az azzal szomszédos kéregre vetülnek (Hecker and Mesulam 1994) és valószínűleg nem vesznek részt az alvás-ébrenlét szabályozásában. A toxin lokális beadása a BF-be jelentősen csökkentette a nagyfrekvenciás EEG hullámok mennyiségét. Igen kifejezett volt a csökkenés a gamma sávban (30.5-58 Hz). Az alvás-ébrenlét mennyisége nem változott, de minden alvás-ébrenléti szakaszban lecsökkent a nagyfrekvenciás hullámtevékenység (Berntson et al. 2002). Egy másik tanulmány szerint sem az egyoldali, sem a kétoldali BF irtás nem okozott szignifikáns változásokat az EEG-spektrumban. Az ACh mennyisége és az EEG delta sávjának (1-4 Hz) teljesítményében beállt változások között az irtott és a kontroll féltekékben nem volt összefüggés a szenzorimotoros kéregben (Wenk et al. 1994). A BF kolinerg sejtek szelektív irtása nem változtatta meg az ébrenlét, a lassú hullámú- és a REM-alvás napi mennyiségét és nem volt hatással az alvásdeprivációra adott homeosztatikus válaszra (adenozin) sem (Blanco-Centurion et al. 2006a). Kapás és munkatársai tanulmánya szerint az EEG teljesítménye minden frekvenciasávban csökkent, az agykéreg pedig jelentősen (mintegy 1 oC-al) lehűlt. A hőmérséklet csökkenése már a toxin beadása után 1-2 nappal megindult, amikor a kolinerg sejtek még nem pusztultak el (Kapas et al. 1996). A szelektív irtás eredményei arra utalnak, hogy a GABA-erg illetve transzmittert használó vetület lényegesebb a kérgi aktivációban, mint azt sokáig feltételezték. A BF kutatásának nagy lökést adott, amikor az 1980-es években leírták, hogy a kolinerg sejtek száma és mérete lecsökken Alzheimer-kórban (Whitehouse et al. 1982; Whitehouse et al. 1981). A betegségben jelentkező kognitív hanyatlást egyértelműen a kérgi ACh hiányának tulajdonították (Boller and Forette 1989). Ez volt az ún. kolinerg hipotézis, amellyel kapcsolatban azonban kiderült, hogy a kolinerg sejtek pusztulása és az ebből eredő ACh hiány a kéregben inkább következménye, mintsem oka a betegségnek.
37
1.8. A neuropeptidek és jelentőségük az alvásban A neuropeptidek olyan, idegsejtek és gliasejtek által termelt fehérjék, amelyek hormonként, neuromodulátorként és neurotranszmitterként is működhetnek és így rendkívül komplex módon vehetnek részt az életműködések szabályozásában. A substance P 1931-es felfedezése óta (US and Gaddum 1931) számos neuropeptidet azonosítottak. Jelentős részükről kiderült, hogy részt vesz az alvás-ébrenlét szabályozásában. Ezek a peptidek az idegrendszer legkülönbözőbb szintjein, változatos mechanizmusokkal felszabadulva és más fiziológiai funkciókkal kapcsolatot teremtve lehetőve teszik az alvás ébrenlét finom, a mindenkori körülményekhez jól igazodó szabályozását.
Számos
neuropeptidről
leírták
például,
hogy
mind
a
táplálékfelvétel/energiaháztartás, mind az alvás szabályozásában egyaránt részt vesz. Ilyen például az ORX (Willie et al. 2001), az NPY (Pedrazzini et al. 2003), a SOM (Obal, Jr. and Krueger 2001), a vazoaktív intesztinális peptid (Obal, Jr. et al. 1986) és a ghrelin (Szentirmai et al. 2007). A peptidek ugyanúgy felszabadulhatnak akciós potenciálok hatására az idegvégződésekből, mint a „klasszikus” transzmitterek. Jellemző azonban a nemszinaptikus felszabadulás is, lényegében a peptidet expresszáló sejt bármelyik pontján felszabadulhat a peptid. Különösen jelentős a dendritek területén történő felszabadulás (Ludwig and Leng 2006). A neuropeptidek specifikus, G-fehérje kapcsolt receptorokon keresztül fejtik ki hatásaikat, amelyek elhelyezkedhetnek extraszinaptikusan is (Hokfelt et al. 2000). A peptidek nagyméretű prekurzor molekulák alakjában expresszálódnak, kizárólag a szóma területén. A biológiailag aktív szekvencia konvertáz enzimek segítségével lejátszódó enzimatikus hasítás után alakul ki (Strand 1999). A módosított peptidek
az
axonterminálisokhoz
szállítódnak,
miközben
a
poszt-transzlációs
processzálásuk (csomagolás, enzimatikus hasítások és módosítások) folytatódik. Végül szekréciós vezikulákba csomagolódnak, ezek az ún. large, dense-core vezikulák (LDCV). Miután a peptidek felszabadultak, az esetek döntő többségében újrafelvétel nélkül inaktiválódnak (Hokfelt et al. 2000). Annak ellenére, hogy számos peptid hat az alvásra, az alvással kapcsolatos kórképek terápiájában egyelőre nem játszanak lényeges szerepet, a vonatkozó gyógyszerek elsősorban nem-peptid farmakonok. Ennek oka a peptidek szerkezeti instabilitása, az extracelluláris térben való gyors eliminációja (EC proteázok) és a
38
központi idegrendszeren belüli korlátozott mértékű penetrációja (Nishino and Fujiki 2007). A továbbiakban áttekintjük néhány, a kérgi aktiváció szabályozásában lényeges peptiddel kapcsolatos irodalmi adatokat. Részletesebben szólunk az NPY-ról és a SOMról, mivel kísérleteinkben ezen két peptid hatásait vizsgáltuk. Ezen kívül ismertetjük a BF-ben előforduló egyéb neuropeptidek alvás-ébrenléttel kapcsolatos adatait és a BF neuronköreiben betöltött szerepükről jelenleg ismert adatokat. 1.8.1. A szomatotrop tengely peptidjei és az alvás A gonadotrophin releasing hormon (GHRH), a hatására termelődő növekedési hormon (GH) és SOM együttesének alvási hatásai már régóta ismertek. A GHRH-t termelő neuronok egyrészt a hipotalamikus nucleus arcuatusban helyezkednek el, ahol a sejtek axonjai az eminentia mediana-ba futnak, itt pedig a peptid a portalis keringésbe jutva serkenti a GH szekrécióját. Kisebb GHRH termelő sejtcsoportok vannak a hipotalamusz dorzomediális magvában, a paraventrikuláris mag (PVN) kissejtes részében és a ventromediális mag caudalis részénél. Ezek a neuronok a hipotalamusz periventrikuláris részéhez és a BF-POA területére vetülnek (Sawchenko et al. 1985). A GHRH fokozza a lassú hullámú alvást, ezt a hatását több fajban – így emberben is kimutatták (Ehlers et al. 1986; Obal, Jr. et al. 1988; Steiger et al. 1992). A GHRH elősegítheti a REM-alvást is (Obal, Jr. et al. 1988), de az eredmények ellentmondóak ezzel kapcsolatban (Zhang et al. 1999). A GH mély, lassú hullámú alvás alatti fokozott felszabadulása már 40 éve ismert (Takahashi et al. 1968) és szintén fokozza a lassú hullámú alvást (Drucker-Colin et al. 1975). A GHRH és a GH egymástól függetlenül hat az alvásra (Beranek et al. 1997). A GH valószínűleg indirekt módon hat, a metabolizmus megváltoztatásán vagy az IGF-1-en keresztül (Beranek et al. 1997). A nucleus arcuatus GHRH sejtjeit lokális SOM-erg interneuronok szabályozzák, míg az arcuatus-on kívüli GHRH neuronokat valószínűleg szintén SOM-erg interneuronok. A periventrikuláris hipofizeotrop SOM-erg interneuronok direkt bemenetet kapnak az arcuatuson kívüli GHRH neuronoktól (Bertherat et al. 1995) A szomatotrop tengelyen belül számos negatív visszacsatoláson alapuló szabályozó mechanizmus működik. A GHRH aktiválja a SOM-erg neuronokat, amelyek aztán gátolják a GHRH felszabadulását és hatását (Weiss et al. 1987; Katakami et al. 1988). A GH csökkenti a GHRH szintézist, szintén SOM-erg mechanizmussal. A GH
39
serkenti a hipotalamikus SOM-erg sejteket. A SOM gátolja a GHRH sejteket és a portális keringésbe is ürülve direkt módon gátolja a GH felszabadulást a hipofízisben. Az IGF-1 a GHRH felszabadulását közvetett mechanizmussal gátolja. Összefoglalva: az IGF-1, a GH, a SOM és maga a GHRH is gátolhatja a GHRH felszabadulást, a SOM pedig főszerepet játszhat a negatív visszacsatolásban. Az IGF-1 nagyon gyorsan képes csökkenteni a GH (és ezen keresztül a GHRH) szintjét és így az alvást is, bár az alvás és a GH szekréció 1 óra után visszatér (Obal, Jr. et al. 1999). A SOM-nak eddig leírt 5 receptora (sst1-sst5) közül (Cervia and Bagnoli 2007) a szomatotrop tengely gátlásában főként az sst2 receptor vesz részt (Bluet-Pajot et al. 1998). Az egyik gyakran használt SOM-analóg, az oktreotid (OKTR) hidrolízisrezisztens molekula (Wynants et al. 1985). Az OKTR nagy affinitású az sst2 és az sst5 receptor irányába, közepes affinitású az sst3 receptorhoz, de nem kötődik az sst1-hez és az sst4-hez (Hoyer et al. 1995). Az OKTR i.c.v. vagy szisztémás beadása gyors, dózisfüggő és szimultán csökkenést váltott ki a lassú hullámú alvásban és a GH szekrécióban (Beranek et al. 1999). 1.8.2. Orexin Az ORX (pontosabban orexinek) kiemelten fontos neuropeptid(ek) a kérgi aktiváció szabályozásában, egy külön felszálló aktiváló rendszert alkotnak. Hiányuk, illetve
a
szignalizációjukban
fellépő
zavarok
ugyanis
egy
súlyos
alvási
rendellenességhez, a narkolepsziához vezetnek (Lin et al. 1999; Chemelli et al. 1999b; Thannickal et al. 2000). Az ORX peptideket (orexin A – ORX-A és orexin B – ORX-B, illetve más néven hipokretin-1 és hipokretin-2) 1998-ban fedezték fel (Sakurai et al. 1998; de Lecea et al. 1998). Hatásaikat két, G-protein kapcsolt receptoron (OX1R vagy Hcrtr1 és OX2R vagy Hcrtr2) keresztül fejtik ki (Sakurai et al. 1998). Az ORX-et termelő idegsejtek kizárólag a laterális hipotalamuszban (LH) helyezkednek el és rostjaik gyakorlatilag az egész központi idegrendszert innerválják (Peyron et al. 1998; Date et al. 2000; Nambu et al. 1999). A projekciók közül kitüntetett szerepűek azok, amelyek a kérgi aktivációban szerepet játszó területekre irányulnak és azokat serkentik (LC, BF, TMN, raphe, agytörzsi kolinerg magvak)(Hagan et al. 1999; Eriksson et al. 2001; Brown et al. 2001; Eggermann et al. 2001).
40
Az ORX-tartalmú neuronok aktivitása erősen korrelál az alvás-ébrenléttel. Aktivitásuk fokozott ébrenlét alatt, míg lassú hullámú és REM-alvás alatt csökken (Lee et al. 2005). Ezzel párhuzamosan az ORX-felszabadulás a BF, az LC és az LH területén aktív ébrenlét alatt magasabb, mint lassú hullámú alvásban. A REM-alvás alatti felszabadulás mértéke szintén meghaladta a lassú hullámú alvás alatti szintet (Kiyashchenko et al. 2002). ORX génkiütött egerek mind viselkedési, mind EEG-s jegyeiket tekintve a humán narkolepsziás betegekhez hasonló fenotípust mutatnak (Chemelli et al. 1999b). A genetikusan narkolepsziás doberman kutyatörzsek OX2R génje hibás (Lin et al. 1999). Az OX2R génkiütött egerek szintén narkolepsziásak (Chemelli et al. 1999a), hasonlóan azokhoz, amelyekből az ORX-tartalmú neuronok hiányoznak (Hara et al. 2001). Egészséges emberekben az ORX-A szintje mérhető, míg narkolepsziásokban legtöbbször a kimutatási küszöb alatti (Nishino et al. 2000). Narkolepsziás személyek posztmortem vizsgálatai azt mutatták, hogy az ORX-tartalmú sejtek 85-95 %-a szelektíven elpuszult (Thannickal et al. 2000). Humán adatok alapján a narkolepszia valószínűleg egy autoimmun betegség, amely során a pubertás körüli életkorban az ORX-termelő sejtek szelektíven elpusztulnak (Mignot 2001). Bár az ORX peptideket a közelmúltban fedezték fel, az alvás-ébrenlétben betöltött szerepükre hamarosan egy azóta már igen elterjedt modellt dolgoztak ki (Kilduff and Peyron 2000; Saper et al. 2001). E szerint ébrenlét alatt az ORX sejtek az arousal magas szintjének fenntartásában vesznek részt, mivel serkentik a felszálló aktiváló rendszereket. Lassú hullámú alvás alatt az ORX-tartalmú neuronok aktivitása lecsökken és a VLPO gátló neuronjainak („alvásközpont”) aktivitása fokozódik. Ezek a változások a monoaminerg és kolinerg sejtek csökkent mértékű serkentéséhez, illetve gátlásához vezetnek, a kéregben SWA jelentkezik. REM-alváskor a kolinerg sejtekre irányuló serkentő ORX bemenet újra elősegíti a kérgi LVFA megjelenését. A monoaminerg rendszerek serkentését GABA-erg gátló hatások megakadályozhatják, mivel a GABA szintje ilyenkor mind az LC, mind a raphe területén magas. A GABAerg gátlás a kiterjesztett VLPO, illetve a periakveduktális szürkeállomány területéről származhat. Narkolepsziában a hiányzó ORX serkentő bemenet a monoaminerg rendszerek alulműködését okozza. Ez a kéreg direkt serkentő bemeneteinek csökkenéséhez és a kolinerg sejtcsoportok aktivitásának fokozódásához vezethet. A kolinerg és a monoaminerg rendszerek közötti egyensúly tehát felborul, ami a REM alvási szakaszok gyakori és szabálytalan megjelenését eredményezheti. 41
1.8.3. Neuropeptid Y A pancreas polipeptidek családjába sorolt neuropeptid tirozint (NPY) 1981-ben izolálták birka agyból (Tatemoto 1982). A legnagyobb mennyiségben jelen lévő és legszélesebb körben elterjedt neuropeptid az emlősök központi és környéki idegrendszerében (Balasubramaniam 1997). Eloszlása a központi idegrendszerben igen komplex (Allen et al. 1983). Az agykéregben és az előagy területén hasonló neuronokban fordul elő, amelyek zömmel GABA-t és SOM-ot is tartalmaznak (Aoki and Pickel 1989). Más agyterületeken az NPY adrenalinnal, NA-val vagy 5-HT-vel kolokalizált. Jelenleg 6 különböző receptorát ismerjük (Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 és y6) (Shaw et al. 2003), amelyek mindegyike 7 transzmembrán domént tartalmazó G-fehérje kapcsolt receptor. A dolgozat szempontjából legfontosabb BF régiók NPY receptor eloszlása csak részben ismert. A VP, az NBM, az MCPO, a bed nucleus of stria terminalis (BST) és a mediális szeptum diagonális kötegének (MSDB) területén Y1 receptorokat írtak le. Az MSDB-ben Y5 receptorok is vannak (Wolak et al. 2003). Y2 receptorokat találtak a laterális szeptumban, a mediális POA-ban, illetve a BST-ben (Shaw et al. 2003). Az NPY alvási hatásaival foglalkozó tanulmányok ellentmondó adatokat közölnek. Ez nem is meglepő annak fényében, hogy az NPY milyen elterjedt a központi idegrendszerben. Nehéz egyértelmű kijelentést tenni és az NPY-t egyértelműen altató vagy ébresztő peptidként definiálni, hiszen a különböző agyterületekre történő NPY beadás különböző alvási hatásokat okoz. Az i.c.v. adott NPY csökkentette a lassú hullámú- és a REM alvást is (Szentirmai and Krueger 2006), míg más eredmények szerint a lassú hullámú alvás nem változott szignifikánsan (Ehlers et al. 1997). A negyedik agykamrába injekciózott NPY nem befolyásolta az alvást (Corp et al. 1990). A lokális, különböző agyterületekbe történő injekciók szintén változatos eredményeket hoztak. Az LH-ba történő NPY beadás csökkentette az alvást és az EEG delta sávjában is változások következtek be (Szentirmai and Krueger 2006). Ez utóbbi modell esetében elképzelhető, hogy az LH-ban elhelyezkedő ORX-tartalmú sejtek serkentésén keresztül képes az NPY az alvás csökkentésére. Az NPY hatásában szerepet játszhatnak a PVNben elhelyezkedő CRF neuronok is (Szentirmai and Krueger 2006). Egy régebbi tanulmány szerint viszont a PVN-be adott NPY növelte az alvást (Stanley and Leibowitz 1984).
42
Humán kísérletekben az ismételt NPY beadás fiatal, egészséges férfi személyekben csökkentette az alvás latenciáját és csökkentette az ébrenlétet. Az éjszaka második felében az EEG delta teljesítménye, a kortizol és az adrenokortikotrop hormon (ACTH) szintje csökkent. A CRF szintje megnő depresszióban. Depressziós személyeknek NPY-t adva éjjel mind a lassú hullámú, mind a REM-alvás latenciája lecsökkent és az éjjeli prolaktin-szint nem-szignifikánsan nőtt (mind a kontroll, mind a depressziós személyekben). Az ACTH és a kortizol szintje nem változott (sem a kontrollban, sem a depressziósokban, ellentéte az előzetes eredményeknek). A CRF-et az
NPY
funkcionális
antagonistájának
tekintik,
az
NPY
pedig
GABA(A)
agonista/benzodiazepin-szerű hatású. Az ébrenlétet és a hormonszinteket tehát azért nem befolyásolta az NPY depressziósokban, mert azok CRF szintje magasabb volt (Held et al. 2006). I.v. NPY beadás fiatal emberekben csökkentettte az ACTH szekréciót, ha a beadás az éjszaka első felében történt. A kortizol szekréció is csökkent, ha az NPY beadás az éjszaka második felében történt. Az NPY meghosszabbította az alvás periódusidejét és növelte a lassú hullámú alvás 2. szakaszának mennyiségét. Az alvás latenciája és az ébren töltött idő csökkent. A REM alvás is megváltozott, az első REM szakasz meghosszabbodott, míg a harmadik rövidült. Az EEG spektrumra az NPY nem volt hatással. Ezen kísérletek eredményeit összegezve az NPY elősegíti az alvást és gátolja a hipotalamusz-hipofízis-mellékvesekéreg tengely működését (Antonijevic et al. 2000). Az NPY kérgi aktivációban játszott szerepével kapcsolatosan fontos tényező, hogy az NPY – sok más neuropeptidhez hasonlóan - befolyásolja a táplálékfelvételt, erősen orexigén hatású (Stanley and Leibowitz 1984; Ida et al. 1999). Evés pedig csak ébren, LVFA típusú EEG tevékenység mellett képzelhető el. Az NPY globális hatással is lehet az agyi elektromos aktivitásra. Elképzelhető ugyanis, hogy az NPY rendszer az etanolhoz illetve a benzodiazepinekhez hasonló anxiolitikus hatású és a közeljövőben új anxiolitikumokat lehet a segítségével kifejleszteni. Az erre utaló adatok szerint az i.c.v. NPY beadás lelassította a delta (1-2 Hz) és a magas theta aktivitást (6-8 Hz) a frontális kéregben, gyorsította viszont az alacsony thetat (4-6 Hz) a kéregben, a HC-ben és az amigdalában. Magasabb dózisban az NPY nem csupán az említett sávok csúcsfrekvenciájára, hanem az összes frekvenciasávra 0,5 és 50 Hz között hatással volt, mindegyik teljesítményét csökkentette a kéregben. I.c.v. adott Y1 és Y2 receptor agonisták szelektíven depresszálták az EEG teljesítményét a HC-ben (Ehlers et al. 1997). Nagyobb dózisban az Y1 agonista i.c.v. 43
beadása csökkentette az EEG stabilitását, ez a hatás az anxiolitikumokra jellemző. Az NPY illetve az Y-receptor-agonisták csökkentették a hangkiváltott potenciálok N1 komponensét, szintén az anxiolitikumokra jellemző módon (Ehlers et al. 1997). Az NPY anxiolitkus voltára utal az is, hogy i.c.v. adott NPY hatására a szedáció magatartási jelei mutatkoztak. Az NPY jelen van a BF területén is. Az NPY-tartalmú BF sejtek elektrofiziológiai szempontból az ún. S-sejtek közé tartoznak, amelyek tüzelési frekvenciája – legalábbis uretán-altatott patkányokban - a kérgi EEG aktív szakaszai alatt csökken, míg nagy, lassú hullámok jelenléte esetén nő (7. ábra)(Duque et al. 2000). Az S-sejtek, amelyek NPY-t és/vagy SOM-ot tartalmaznak, valószínűleg interneuronok, mivel a kéreg felőli antidrómos ingerlésre nem válaszolnak (Detari et al. 1997). A BF NPY-tartalmú sejtjeinek fő transzmittere valószínűleg a GABA, mivel az előagy területén a GABA NPY-al kolokalizált (Aoki and Pickel 1989). Biocitinnel feltöltött és immunhisztokémiailag azonosított BF NPY sejtek számos axon-kollaterálissal rendelkeznek, amelyek egy része kolinerg sejtek dendritjeivel alakít ki szimmetrikus (tehát gátló) szinapszist a HDB dorzális részében (Tamiya et al. 1991; Zaborszky and Duque 2000) és az SI-ben (Zaborszky and Duque 2000). Egy NPY-tartalmú neuron számos kolinerg sejttel létesít kapcsolatot (Zaborszky and Duque 2000). Egy feltöltött,
7. ábra. Egy bioctinnel feltöltött és immunhisztokémiailag azonosított NPY-tartalmú BF neuron tüzelésének korrelációja a kérgi EEG-vel (Duque et al. 2000). Az NPY-tartalmú sejtek az ún. S sejtek közé tartoznak, amelyek a nagy amplitúdójú, kis frekvenciájú hullámformák alatt mutatnak magasabb kisülési frekvenciát. Felső sor: nyers EEG, 2. sor: a nullapont-átmenetek (zero-cross – ZCR) száma másodpercenként, 3. sor: a sejttüzelés hisztogramja, legalsó sor: a regisztrátumból kivágott spike-ok.
44
8. ábra. Az NPY-tartalmú neuronok eloszlása a BF négy különböző rostrocaudalis szintjében. Minden fekete pont egy-egy sejtet jelez (Zaborszky and Duque 2003). Rövidítések: AC-anterior commisure; bst-bed nucleus of stria terminalis; cpcaudatoputamen; F-fornix; gp-globus pallidus; hdb-nucleus of the horizontal diagonal band of Broca; IC-internal capsule; LV-lateral ventricle; SI-substantia innominata; SMnucleus of stria medullaris azonosított BF NPY sejt axonjai egészen a dorzális talamuszig és az amigdaláig nyúltak (Duque et al. 2000). Az NPY-tartalmú sejtek (8. ábra) tehát nem csak a BF-en belüli információáramlás integrációjában vehetnek részt, hanem esetleg a BF működésének más agyterületekkel való összehangolásában is szerepet játszhatnak. 1.8.3.1. A neuropeptid Y hatása az ébresztő rendszerekre A központi idegrendszerben szinte minden területén előforduló NPY számos, a kérgi aktivációt befolyásoló neuronkörben is jelen van és azok működését preszinaptikus mechanizmusokkal befolyásolhatja. Az NPY kolokalizált NA-val az LC sejtjeinek egy részében (Everitt et al. 1984; Moore and Gustafson 1989) és preszinaptikus mechanizmusokkal (Y2 receptorokon keresztül) gátolja az NA felszabadulást az LC neuronokból in vitro (Illes et al. 1993). Kis dózisú NPY i.c.v. beadása után az agy NA szintje nem-szignifikánsan nőtt, míg nagyobb dózis beadása után csökkent (Heilig et al. 1990). NPY i.c.v. beadása után a DA szintje megnőtt az agyban (Heilig et al. 1990).
45
NPY-tartalmú rostok jelen vannak a raphe-ban (Yamazoe et al. 1985) és számos Y2 receptor is található itt (Gustafson et al. 1997). Az NPY gátolta a lassú, 5-HT1A receptor közvetítette lassú szinaptikus potenciálokat a dorzális raphe-ban, míg a gyors, aminosav-mediált szinaptikus válaszokat nem befolyásolta. A gátlás preszinaptikus mechanizmusokon keresztül valósulhatott meg. Az NPY tehát a raphe neuronok endogén modulátora és részt vesz a raphe kimeneteinek szabályozásában (Kombian and Colmers 1992). Az NPY i.c.v. beadása után az 5-HT szintje azonban nem változott meg az agyban (Heilig et al. 1990). A HA-tartalmú TMN neuronokon NPY-tartalmú afferensek végződnek (Tamiya 1991). Az afferensek valószínűleg az intergeniculate leaflet-ből érkeznek, amely lényeges a cirkadián ritmusok beállításában (Harrington 1997). NPY beadás egerekben fokozta a HA felszabadulását a hipotalamuszban (Ishizuka et al. 2006). Az NPY az ORX rendszer szabályozásában is részt vesz. A nucleus arcuatus NPY neuronjaival az LH ORX-tartalmú neuronjai kétirányú kapcsolatban vannak (Horvath et al. 1999). A serkentő hatású ORX peptidek fokozhatják az NPY felszabadulást
a
hipotalamuszban,
az
NPY
pedig
pre-
és
posztszinaptikus
mechanizmusokkal képes csökkenti az ORX sejtek aktivitását és így tónusosan gátolni az ORX-indukálta arousalt (Fu et al. 2004). 1.8.4. Szomatosztatin A SOM egy 14 aminosavból álló neuropeptid, amelyet 1972-ben írtak le először. Napjainkig 5 különböző (sst1-sst5), 7 transzmembrán doménnel rendelkező, G-protein kapcsolt receptort klónoztak, amelyek a SOM hatásait közvetítik (Dournaud et al. 2000). A SOM széleskörűen elterjedt mind az agyban (Epelbaum 1986), mind a periférián (Reisine 1995). A SOM-tartalmú sejtek egyaránt lehetnek projekciós- és interneuronok (Viollet et al. 2007). A SOM-tartalmú interneuronok az agykéreg, a HC, az amigdala, a neostriatum és a bulbus olfactorius esetében a GABA-erg interneuronok egy alpopulációját alkotják (Kosaka et al. 1988; Markram et al. 2004). A projekciós sejtek neurokémiai sajátságai kevésbé ismertek, egy részükről szintén leírták, hogy GABA-erg (Tomioka et al. 2005). A SOM szomatotrop tengelyben játszott szerepére, illetve az ezzel összefüggő alvási vonatkozásokra már utaltunk. A kísérleti adatok szerint azonban a SOM más mechanizmusokon keresztül is hatással lehet az alvásra. A SOM antagonista cyclo-(7-aminoheptanoyl-phe-d-trp-lys-thr(bzl)) i.c.v. és lokális injekciója az LC-be csökkentette a spontán és az alvásmegvonás utáni rebound 46
REM alvás mennyiségét (Toppila et al. 2000). Subcutan (S.c.) vagy i.c.v. OKTR (SOM analóg) beadás csökkentette a a lassú hullámú alvást a beadást követő első órában, míg enyhe emelkedés következett be a 2. és a 3. órában (Beranek et al. 1997; Beranek et al. 1999). I.p. (Danguir and Saint-Hilaire 1989) vagy s.c. (Beranek et al. 1997) OKTR beadás után a REM-alvás mennyisége megemelkedett. Ismételt (naponta 2 beadás 5 napon keresztül) s.c. injektálás hatására a non-REM alvás időtartama és intenzitása egyaránt tartósan csökkent (Beranek et al. 1997). Az LH-ba és a laterális POA laterális részébe adott OKTR megnövelte az alvás mennyiségét (Hajdu et al. 2003), feltételezhetően az itt elhelyezkedő kolinerg sejtek gátlásán keresztül. Amint azt a következőkben látni fogjuk, a kolinerg sejtek a BF más részeiben is fontos közvetítői lehetnek a SOM alvási hatásainak. A SOM jelen van a BF-ben és számos SOM-tartalmú rost létesít szinaptikus kapcsolatot a kolinerg projekciós sejtekkel (Zaborszky 1989). A SOM neuronok GABA-t is expresszálnak az előagy területén (Esclapez and Houser 1995; Hendry et al. 1984). A megfigyelt szinapszisok gátló szinapszisra utalóan szimmetrikusak és főkent a proximális dendriteken és a sejttesten vannak jelen. A SOM-tartalmú axonkollaterálisok szorosan körülveszik mind a kolinerg, mind a nem-kolinerg sejteket. A rostok egy része GABA-erg interneuronokból ered, amelyek főként a VP-ben, az SI-ben és a HDB-ben helyezkednek el (Zaborszky and Duque 2003), a többi rost eredete jelenleg még nem ismert. 1-1 SOM sejt akár 8-10 kolinerg sejttel is szinaptizál és valószínűleg 1-1 kolinerg sejt több SOM sejttől is kap afferenseket. A feltételezett AChSOM kölcsönhatás részletei egyelőre csak részben tisztázottak (Momiyama and Zaborszky 2006). Nincs adat például arra nézve, hogy pontosan hogyan befolyásolja a SOM a nem-kolinerg sejtek tüzelését. Érdekes lenne tudni azt is, hogy vajon a SOM sejtek aktivitása hogyan változik az alvás-ébrenlét ciklus során. Nem ismert az sem, hogy a BF sejtek mekkora hányadában fordul elő a GABA és a SOM együtt, egy neuronban. 1.8.5. Neuropetidek a bazális előagyban 1.8.5.1. Neurotenzin Az anterior SI és a HDB területén lévő sejtek neurotenzin (NT)-pozitív afferenseket kapnak a laterális septum, a mediális POA, a hipothalamusz és a nucleus accumbens területéről. A posterior SI és az MCPO sejtjeinek NT-erg beidegzése pedig a
47
limbikus előagyi területekről és a középagyi tegmentumból származik (Morin and Beaudet 1998). A BF-be adott NT szabadon mozgó patkányokban dózisfüggően csökkentette a delta (1-4 Hz) teljesítményt, míg a teta (4-9 Hz) és a gamma tartományban (30-60 Hz) növekedést idézett elő. Egyidejűleg a lassú hullámú alvás csökkent, az ébrenlét és a REM-alvás fokozódott (Cape et al. 2000). Az EEG-s és alvási hatások a kolinerg sejtekre kifejtett direkt NT hatásoknak tulajdoníthatóak. A kolinerg sejtek ugyanis szelektíven internalizálták a fluoreszcensen jelölt NT-t és ritmikus kisüléscsomagokkal válaszoltak az NT beadásra in vivo (Cape et al. 2000) és in vitro (Alonso et al. 1994). NTerg varikozitásokat írtak le a kolinerg szómák közvetlen közeléből (Cape et al. 2000), de az anatómiai kapcsolatok validálásához azonban még további, elsősorban elektronmikroszkópos kísérletek szükségesek. 1.8.5.2. Substance P A serkentő neurotranszmitterként leírt és a tachikinin peptidcsaládba tartozó substance P –t (SP) tartalmazó rostok kolinerg és nem-kolinerg sejtekkel egyaránt szinaptizálnak a BF-ben (Bolam et al. 1986). A rostok pontos eredetére azonban nincs adat. Az SP serkentette a BF kolinerg sejteket in vitro (Nakajima et al. 1991), míg az SP beadása a VLPO-ba a lassú hullámú alvás fokozódását okozta az itt elhelyezkedő, feltételezhetően alvást elősegítő GABA-erg sejtek izgatása révén (Zhang et al. 2004). I.c.v. adott SP csökkentette az alvás hatékonyságát, növelte az alvás latenciáját és megnövelte az ébrenléti szakaszok számát egérben (Andersen et al. 2006). Az SP jelen van az agytörzsi kolinerg sejtekben is, amelyek 16 %-a SP-t is tartalmaz (Kohlmeier et al. 2002). Ezek a kolinerg sejtek vetülnek a hídi retikuláris formációra, amely a REMalvás indukciójában játszik szerepet. Az ACh és az SP együttes felszabadulása additív hatású, erősebb serkentő hatást vált ki a hídi területeken, mint a két transzmitter különkülön. A BF kolinerg sejtjein az SP az 1-es és a 3-as típusú neuromedin K receptorokon (NK1 és NK3) át hathat (Chen et al. 2001b; Chen et al. 2001a). 1.8.5.3. Neurokinin B A szintén a tachikinin peptidcsaládba tartozó neurokinin B-t (NKB) tartalmazó rostok a dorzális striatumból érkeznek az SI sejtjeihez. A ventrális striatumból eredő, NKB-tartalmú rostok szintén BF sejtcsoportokon végződnek, de a kétfajta vetület nagyrészben elválik egymástól (Zhou et al. 2004). Az NKB csak kis számú, kéregre
48
vetülő BF neuronban expresszálódik. Ezen projekciós sejtek többsége a frontális és a parietális kéregre vetít, míg a sejtek csekély hányada az occipitális kéregre (Burgunder and Young, III 1989). Kimutatták, hogy a BF GABA-erg projekciós neuronjainak egy része NK3
receptort expresszál. Ezek a sejtek elektrofiziológiai sajátságaikban
különböznek a kolinerg sejtektől és az NK3 receptor stimulációjára aktivitásuk nő (Furuta and Kaneko 2006). Az NKB-tartalmú NBM neuronok (és az általuk beidegzett sejtek) jellegzetes tulajdonsága, hogy nem érzékenyek az AMPA-ra és az NMDA-ra. Az NKB-t tartalmazó neuronok diffúz eloszlásúak a BF-ben és az NBM sejtjeinek csak egy kis része tartalmaz NKB-t, az NKB tehát csak kis részben kolokalizált ACh-val a BF-ben (Wenk et al. 1995). 1.8.5.4. Galanin A GAL a BF neuronjainak egy részében kolokalizált az ACh-val. A BF különböző részein elhelyezkedő kolinerg sejtek azonban eltérő arányban tartalmazzák ezt a neuropeptidet. A legtöbb GAL-t tartalmazó kolinerg sejt az HDB centrális részén található. Szintén sok sejt van a mediális POA-ban és BST-ben (Miller et al. 1998). Metodikai problémák miatt azonban a pontos arányok és mennyiségek kétségesek. Fajspecifikus különbségek is fennállnak, emberben például nem találtak GAL immunoreaktivitást a BF kolinerg sejtekben (Kordower and Mufson 1990). Egyes szerzők szerint a BF kérgi vetületének körülbelül egyharmada kolinerg, egyharmada GABA-erg, míg a harmadik harmadba tartoznak a peptiderg sejtek (Gritti et al. 1997). Ezek közül valószínűleg a legnagyobb arányban a GAL-tartalmú sejtek szerepelnek (Senut et al. 1989). Bár az irodalom a GAL-t egy gátló hatású neuromodulátornak tartja (Kask et al. 1995), a BF kolinerg sejtjeit a GAL serkentette in vitro, míg a GABAerg sejteken nem volt hatásos. Elképzelhető, hogy az Alzheimer-kórban csökkenő AChfelszabadulást ellensúlyozó folyamatokban vehet részt a GAL. A betegség során az egyre csökkenő számú kolinerg sejtből a GAL több ACh-t szabadíthat fel (Jhamandas et al. 2002). Ezt az elképzelést támogatja, hogy a GAL pozitív rostok hiperinnerválják a kolinerg BF sejteket Alzheimer-kórban (Counts et al. 2006).
49
1.8.5.5. Orexin Az LH-ból eredő, ORX-A-tartalmú rostok nagy mennyiségben vannak jelen a BF területén (Peyron et al. 1998; Espana et al. 2001). Az ORX-tartalmú sejtek BF vetülete 80 %-ban ipszilaterális (Espana et al. 2005). Az ORX-A direkt serkentő hatással volt a BF kolinerg sejtjeire in vitro, de nem befolyásolta VLPO GABA-erg alvás-promótáló sejtjeit (Eggermann et al. 2001). ORX-A mikroinjekció a VLPO-ba növelte az ébrenlétet és csökkentette az összes alvási fázis időtartamát (Methippara et al. 2000). ORX-A beadás különböző BF területekbe (mediális POA, SI és mediális szeptum) erősen megnövelte az ébrenlétet és csökkentette a lassú hullámú alvást (Espana et al. 2001) valamint fokozta az ACh felszabadulást a prefrontális kéregben (Fadel et al. 2005). Anatómiai vizsgálatok alapján a BF neuronok visszavetülnek az ORX-tartalmú sejtekre. A BF glutamáterg sejtjei képesek serkenteni az ORX sejteket, míg a GABA-erg sejtek gátolhatják őket (Henny and Jones 2006). A BF kolinerg neuronjainak 192-IgG szaporinnal történt szelektív kiirtása utáni ORX beadás a BF-be növelte az ébrenlétet és csökkentette az alvás (mind a REM, mind a lassú hullámú) mennyiségét. A nem-kolinerg BF neuronok tehát képesek az ORX alvás-ébrenléti hatásait közvetíteni a kolinerg neuronok nélkül is (Blanco-Centurion et al. 2006b).
50
2. KÉRDÉSFELVETÉS A bazális előagy (BF) fontos szerepet játszik a kérgi aktiváció, illetve az alvás-ébrenlét szabályozásában. A neuropeptidek szintén fontos regulátorai ezeknek a folyamatoknak. Kevés információ áll azonban rendelkezésre a BF-ben is jelen lévő neuropeptidek alvásébrenléti, EEG-s és viselkedési hatásairól, illetve arról, hogy hogyan vesznek részt ezek a peptidek a kérgi aktiváció szabályozásában szerepet játszó BF neuronkörök működésében. Kísérleteinkben a BF-ben jelen lévő neuropeptidek közül az NPY illetve a SOM ilyen irányú vizsgálatát céloztuk meg. A SOM hatásait a SOM-analóg OKTR beadásán keresztül vizsgáltuk. Irodalmi adatok alapján tudjuk, hogy az NPY illetve a SOM hatással van a kérgi EEG-re és az alvás-ébrenlétre, de nincs adat arra nézve, hogy ezekben a hatásokban pontosan milyen szerepet játszanak a BF peptiderg sejtjei, illetve a BF neuronkörei. Ebből a célból mind akut, mind krónikus elektrofiziológiai vizsgálatokat végeztünk patkányokon, amelyeket kiegészítettünk a spontán viselkedés elemzésével valamint standard szövettani festési és immunhisztokémiai eljárásokkal. Akut kísérletek Uretán-altatott patkányokkal végzett kísérleteinkben az alábbi kérdésekre kerestük a választ: 1. Hogyan befolyásolja a BF-be injektált NPY és OKTR az agykérgi EEG-t altatott állatokban? 2. Milyen hatással vannak az NPY illetve OKTR injekciók a fájdalmas ingerre (farokcsípés) bekövetkező kérgi aktivációra altatott állatokban? Krónikus kísérletek: Természetes módon alvó-ébren levő, szabadon mozgó patkányok segítségével az alábbiakat vizsgáltuk: 3. Az NPY injekciók okoznak-e változást a patkányok spontán viselkedésében? 4. Hogyan befolyásolja a BF-be injektált NPY a különböző alvás-ébrenléti állapotokat?
51
3. ANYAG ÉS MÓDSZER Kérdéseink megválaszolásához akut és krónikus patkányokon egyaránt végeztünk méréseket. Bár a kétfajta megközelítésben módszertani szempontból sok közös pont van, az áttekinthetőség kedvéért külön fejezetekben ismertetjük ezeket. 3.1. Akut kísérletek 3.1.1. Műtét Akut kísérleteinkhez 280 és 400 g közötti tömegű felnőtt, hím Wistar patkányokat használtunk. Az állatokat uretánnal elaltattuk (1.0-1.2 g/kg, i.p.) és fejüket sztereotaktikus készülékben vízszintesen rögzítettük a Bregma és a Lambda vonatkoztatási pontok alapján. A fejbőr megnyitása után 2%-os lidokainnal helyi érzéstelenítést alkalmaztunk. A testhőmérsékletet rektális hőmérővel mértük és egy elektromos fűtőpárnával (Fine Science Tools) folyamatosan 37°C-on tartottuk. A kötőszöveteket, a csonthártyát és a tapadó izmokat eltávolítottuk a koponyacsontokról, majd mindkét félteke felett kb. 3 mm átmérőjű lyukakat fúrtunk fogászati fúróval (A.: Br-1.30 mm; L.: ±2.8 mm) a BF-be beültetett kanülök számára. A koordináták a lyukak középpontját jelölik. A műtéteket és a kísérleteket az Eötvös Loránd Tudományegyetem Állatvédelmi Szabályzatának és a vonatkozó európai uniós szabályoknak (European Communities Council Directive 86/609/EEC) megfelelően végeztük. 3.1.2. Anyagbeadások A BF-be történő anyagbeadásokhoz boroszilikát üvegkapillárisokat készítettünk (hegy átmérője: 30-50 µm) egy Sutter P-97 horizontális kapillárishúzóval (Sutter Instrument). Egyoldali nyomás mikroinjekciókat (térfogat: 0.5 µl, beadási sebesség: 0.25 µl/perc) adtunk egy mikroprocesszor-kontrollált fecskendőpumpával (IITC Inc., CA, USA), amelybe két Hamilton-fecskendőt rögzítettünk. Minden állat egy fiziológiás só és egy NPY/OKTR injekciót kapott random sorrendben. A két injekció között legalább másfél óra telt el. Az NPY-t (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Németország) steril fiziológiás sóban oldottuk fel és hatását két dózisban teszteltük: 300 pmol/0.5 µl, 500 pmol/0.5 µl. A SOM hatásainak vizsgálatához a vele analóg vegyületet, az OKTR-ot használtuk, amelynek több előnye is van a SOM-al szemben. Egyrészt 20-75-ször
52
hatékonyabb annál (mint a szomatotrop tengely inhibítora)(Pless et al. 1986), másrészt az OKTR féléletideje 45-120 perc, míg a SOM-é csak néhány perc (Bauer et al. 1982). Az OKTR-ot (Phoenix Pharma) steril fiziológiás sóban oldottuk fel és 500 nmol/0.5 µl dózisban adtuk be. Az injekciókat olyan, viszonylag felületesebb szintű narkózisban adtuk, amelyet a 2. ábra 3.-4.-5. görbén látható EEG-s kép jellemez. Ezzel együtt különös figyelmet fordítottunk arra, hogy a kísérleti állat a kísérlet teljes ideje alatt a műtétéi narkózis megfelelő szintjén maradjon. A farokcsípések hatására soha nem észleltünk fájdalomra utaló jeleket, így például flexor reflexet. 3.1.3. Elektrofiziológiai mérések Az EEG-t csavarelektródokkal vezettük el a frontális (A: Br 2.0 mm, L 2.0 mm) és a parietális kéregről (A: Br -4.5 mm, L 2.0 mm) mindkét oldalon. Az EEG jelet szűrtük (0.3-500 Hz) és erősítettük (10000X) egy 2 csatornás, extracelluláris mérésekhez készült erősítővel (A-M Systems, USA). Az elektrofiziológiai jeleket 200 Hz frekvenciával mintavételeztük (DataWave Discovery) és az adatokat a számítógép merevlemezén tároltuk a későbbi analízishez. 3.1.4. Adatelemzés Az adatok kiértékeléséhez egy dr. Détári László által írt programot használtunk. A nyers EEG jel egymásra következő 5 másodperc hosszú szakaszaiból gyors Fouriertranszformációval (FFT) teljesítményspektrumot számoltunk, majd ezeket átlagoltuk 1 perc hosszú szakaszokra. A teljesítményspektrumból integrált relatív teljesítményt számoltunk a következő frekvenciatartományokban: delta (0-3 Hz), theta (3-9 Hz), alfa (9-16 Hz) és béta (16-48 Hz). Ezután kiszámítottuk a kezelt és a kontroll oldal relatív teljesítményértékeinek hányadosát. A felvételek azon pontjait, amelyeket az injekciók, a farokcsípések alatt, illetve a farokcsípéseket követő 1 perc alatt vettünk fel, kihagytuk az elemzésből. Minden EEG felvétel 1 óra hosszú volt (15 perc kontroll, 2 perc injekció, 43 perc poszt-injekció). A farokcsípéseket az NPY beadással kapcsolatos kísérletekben a regisztrálás 5., 10., 25., 35., 45. és 55. percénél alkalmaztuk abból a célból, hogy teszteljük erre a fájdalmas ingerre adott esetlegesen eltérő válaszokat a kontroll és a kezelt oldal EEG-jében. A farokcsípések hatását az OKTRos kísérletsorozatban a regisztrálás 10., 27. és 37. percénél teszteltük. A farokcsípéseket manuálisan, néhány másodperc hosszan adtuk, 53
amíg egyértelmű kérgi LVFA nem jelent meg a kontroll oldalon. Az EEG teljesítményértékek hányadosait normalizáltuk a kontroll szakasz első farokcsípés előtti, 5 perc hosszú szakaszának értékeivel. A statisztikai szignifikancia megállapításához a normalizált teljesítményértékek hányadosának 10-es alapú logaritmusra emelése után kétutas ANOVA-t (kofaktorok: kezelés és idő) számítottunk Newman-Keuls poszt-hoc tesztekkel az egymás után következő 10 perces szakaszokra. A statisztikai elemzéshez a STATISTICA for Windows (StatSoft Inc., USA) programot használtuk. 3.2. Szövettan Minden egyes kísérlet után szövettani feldolgozást végeztünk abból a célból, hogy megállapítsuk a BF-be beültetett kanülök pontos pozícióját. Az állatok mellkasát mély uretán narkózisban megnyitottuk és a bal szívkamrába kanült vezettünk. Először 150 ml fiziológiás sóoldatot, majd az állat testtömegétől függően 300-400 ml 4 %-os, foszfát-pufferelt paraformaldehid-oldatot (0,1 M; pH=7.4) áramoltattunk át a keringési rendszeren. A perfúzió befejeztével az agyat a koponyábol kiemeltük. A fixált agyakat a fixáló oldatban utófixáltuk 16-24 óra hosszan vagy az ekvilibráció bekövetkeztéig 30 %-os szacharóz oldatban tartottuk +4 oC-on. A szúrcsatornákat tartalmazó régiókból fagyasztó mikrotómmal vagy vibrotómmal 50 µm vastag koronális metszeteket vágtunk. 3.2.1. Nissl-festés A zselatinos tárgylemezre felhúzott metszeteket 1.5 %-os gallocianid oldatban inkubáltuk 24 óra hosszan. A felesleges festéket 10 perces desztillált vizes inkubációval távolítottuk el. Felszálló alkoholsoros (50%, 70%, 96%, 100 %) víztelenítés és xilolos inkubáció után a metszeteket DepEx-el (Serva) fedtük le. 3.2.2.Tormaperoxidáz beadás és kimutatás A BF-be adott peptidek szétterjedési távolságának megállapításához 5 %-os tormaperoxidáz oldatot (HRP; Sigma-Aldrich) injektáltunk 0.5 µl-es térfogatban a substantia innominata területére két patkányban. Az injekciót követően azonnal perfundáltuk az állatokat, hogy megelőzzük a peptid felvételét a sejtekbe. 3,3’diaminobenzidin (DAB; Sigma-Aldrich) mint kromogén segítségével láthatóvá tettük a
54
peroxidáz reakciót. A HRP kb. 1000 µm sugarú körben terjedt szét az injekció helyétől számítva. 3.2.3. Kolin-acetiltranszferáz immunhisztokémia A
SOM-beadásos
kísérleteink
után
kolin-acetiltranszferáz
(ChAT)
immunhisztokémiát is végeztünk a Nissl-festésen kívül. A metszeteket két csoportra osztottuk. Az egyik sorozaton a Nissl-festést, míg a másikon a ChAT-kimutatást végeztük el. Az egymásra következő metszetek felváltva kerültek egyik vagy másik csoportba. A Nissl-festéssel való összevetés elősegítette a ChAT-festett metszeteken a különböző BF struktúrák behatárolását. A ChAT immunhisztokémiához szabadon úszó (free-floating) metszeteket használtunk. A metszeteket PBS-ben (pH 7.4) mostuk 3X20 percig, majd az endogén peroxidázok aktivitását 20 perces, 1 %-os H2O2-ben történő inkubálással blokkoltuk. 3X20 perc PBS (pH 7.4) mosás után a membránokat 0.5 %-os Triton-X100-al (1X20 perc) permeabilizáltuk. A nem-specifikus kötőhelyeket PBS-ben oldott 2 %-os BSA (bovine serum albumine; +0.1 % Na-azid) oldattal blokkoltuk (1 óra). A primer ellenanyag oldatában (monoklonális egér anti-ChAT; 1:1000 higítás) egy éjszakán keresztül inkubáltuk a metszeteket, +4 oC-on. Ezután újból 3X20 perc PBS (pH 7.4) mosás következett, majd a szekunder ellenanyagban való 2-3 órás inkubálás szobahőmérsékleten (biotinilált anti-egér IgG, 1:500; Vector). Az ABC reakcióhoz 2 órát inkubáltunk (Vectastain Elite ABC Kit, 1:500; Vector). Ezután PBS mosás (2 X 20 perc) következett, majd a DAB reakció (0.05 % DAB in Tris-HCl; pH=7.6 + 0.01 % H2O2; 5-30 perc) mikroszkópos kontroll mellett. A ChAT-ra festett metszeteket a Nisslfestetettekhez hasonlóan víztelenítettük és lefedtük. 3.2.4. A szövettani adatok feldolgozása A szúrcsatornákat magába foglaló metszeteket egy Fview-2 CCD kamerával felszerelt Olympus BFX51 mikroszkóppal vizsgáltuk és fotóztuk. A fotókat egy imageanalízis program (Analysys, Hamamatsu Co., Japan) segítségével értékeltük ki és Adobe Photoshop CS 2.0-vel szerkesztettük. A szövettani kép alapján rekonstruáltuk a szúrcsatornákat és meghatároztuk a kanülök pontos lokalizációját. Ezután a sztereotaxikus atlasz számítógépes verziója segítségével (Paxinos G. and Watson 1998) bejelöltük a kanülök pozícióit.
55
3.3. Krónikus kísérletek 3.3.1. Műtét Krónikus kísérleteinkhez felnőtt hím Wistar patkányokat használtunk (n=9). Az állatokat nátrium-pentobarbitállal (Nembutal, 40 mg/kg i.p., Phylaxia-Sanofi) elaltattuk, majd fejüket sztereotaxisba (David-Kopf) fogtuk be. Az EEG méréséhez 0.8 mm átmérőjű rozsdamentes acélból készült csavarelektródokat (Fine Science Tools, USA) ültettünk be a frontális (Br 2.0; L 2.0) és a parietális kéreg(Br -4.5; L 2.0) fölé mindkét oldalon. Egy, a kisagy fölé beültetett csavarelektród szolgált az állat földelésére. Az EMG aktivitás méréséhez teflonnal szigetelt rozsdamentes acélból készült elektródokat (átmérő: 250 mm; California Fine Wire, CA, USA) ültettünk be a nyakizmokba, közel a koponya felszínéhez. Az elektródok elvezetéseit egy miniatűr csatlakozóhoz forrasztottuk hozzá. A BF-be történő injekciók beadásához rozsdamentes acélból készült vezető kanülöket (C313G/SPC, 22 gauge, Plastic One) ültettünk be mindkét oldalon, 10o-os szögben oldalirányban megdöntve. A vezető kanülökbe „dummy” kanülöket illesztettünk, amelyek vége 1 mm-el túllógott a vezető kanülön. A kanülöket és a csatlakozót kranioplasztikus cementtel (Plastic One) a koponyacsontokhoz rögzítettük. A műtét után az állatokat visszahelyeztük a lakóketrecükbe. 3.3.2. Elektrofiziológiai mérések A patkányokat egyesével helyeztük el ketreceikben, amelyek egy hangszigetelt szobában voltak. A hengeres ketrecek átlátszó plexi műanyagból készültek (magasság: 330 mm, átmérő: 300 mm) és egy fémrácsra voltak helyezve. A fémrács alatt helyezkedtek el az almot tartalmazó műanyag tálcák. Az almot sohasem cseréltük ki közvetlenül a mérések előtt. Az alomcsere ugyanis erőteljes változásokat okoz a spontán viselkedésben,
amely
változások
interferálhattak
volna
a
kezelések
okozta
változásokkal. Vízhez és a standard laboratóriumi rágcsáló-táphoz az állatok korlátozás nélkül hozzáférhettek. Az állatokat szabályozott megvilágítás mellett tartottuk (12 óra fény/12 óra sötét; fény 9:30 és 21:30 között). A teljes kísérleti elrendezés nagyon hasonló volt a Bertram és társai által leírtakhoz (Bertram et al. 1997). A kezeléseket a műtét utáni 14 napos felépülési periódus letelte után kezdtük el. Minden felvétel a patkányok lakóketrecében készült az adott napon délelőtt 10 óra és
56
következő nap 8:30 óra között (22 és fél óra). A patkányok fejében lévő miniatűr csatlakozóba rugalmas szalagkábelek voltak rögzítve, amelyek egy forgócsatlakozón át (Plastic One vagy Litton) vezettek az erősítőig. A patkányok a kísérletek teljes ideje alatt csatlakoztatva voltak a mérőrendszerhez, kivéve az anyagbeadások néhány perces időszakait. Mindkét oldalon fronto-parietális EEG-t regisztráltunk. A csavarelektródok jelét saját tervezésű előerősítőkön vezettük át. Előerősítőként nyomtatott áramkör-lapkákra ültetett TLC22641I jelzésű field effect transistor-ok (FET-ek; Texas Instruments, USA) szolgáltak, amelyek katódkövető kapcsolási elrendezésbe voltak bekötve (Shaw et al. 2002). Az EEG és EMG jeleket egy 32 csatornás erősítővel erősítettük (1000 X) és szűrtük (0.3 Hz-100 Hz). Az erősített jeleket folyamatosan digitalizáltuk 2 darab UAM3216 típusú A/D konverter segítségével, amelyek egy IBM-kompatibilis személyi számítógépbe voltak beépítve. A felvételeket egy általunk írt mérőprogram segítségével készítettük. A mintavételi frekvenciát 102.4 Hz-re állítottuk be, hogy az 5 másodperc alatt felvett 512 adatpont könnyen feldolgozható legyen a gyors Fourier-transzformáció számára. 3.3.3. Viselkedési felvételek A patkányok viselkedéséről videófelvételeket készítettünk az anyagbeadásokat követő 4 órában. A videokazettákat a kísérletek befejeződése után betanított, ám az egyes anyagbeadások sorrendjét nem ismerő személyek értékelték ki. A kiértékelők visszanézték a felvételeket és egy általunk írt Excel program segítségével értékelték azt. Az állatok viselkedését 0.1 ms felbontással a következő kategóriákba sorolták: nyugalom (hely- és helyzetváltoztató mozgás hiánya), mozgás (hely- és/vagy helyzetváltoztató mozgás), ágaskodás, önápolás, evés és ivás. A különböző viselkedési elemekkel töltött időt az egymást követő fél órás időszakokra összegeztük. 3.3.4. Kezelések Az injektálások ideje alatt a patkányokat egy kisméretű, felül nyitott dobozba helyeztük. Szükség esetén óvatosan lefogtuk őket, hogy megakadályozzuk menekülési szándékukat. A „dummy” kanülöket 28 gauge átmérőjű injekciós kanülökre (C313I/SPC, Plastics One) cseréltük ki. Az injekciós kanülök polietilén csöveken keresztül 25 μl-es Hamilton-fecskendőkhöz voltak csatlakoztatva, amelyeket egy
57
mikroprocesszor-kontrollált fecskendőpumpa (IITC Inc., CA, USA) foglalataiba rögzítettünk. Kétoldali nyomás mikroinjekciókat adtunk a BF-be (térfogat: 0.5 μl; sebesség: 0.25 μl/min). Az injekciókat követően a kanülöket további két percre a helyükön hagytuk. Az injekciók kezdete előtt a patkányokat hozzászoktattuk az injekciókkal járó procedurához. Az NPY-t steril fiziológiás sóoldatban oldottuk fel és 300 pmol/0.5 μl vagy 500 pmol/0.5 μl dózisban adtuk be. A bal oldal mindig fiziológiás só injekciót kapott, míg a jobb oldal vagy sót (kontroll felvételnél) vagy valamelyiket a kétféle dózisú NPY-ból. Minden patkány mind a három kezelést megkapta randomizált elrendezésben. Az egyes kezelések között legalább két nap telt el. 3.3.5. Adatelemzés Az alvás-ébrenléti szakaszok elkülönítéséhez először kiszámoltuk az egymásra következő 5 másodperces EEG szakaszok teljesítményspektrumát egy általunk írt program
segítségével.
A
spektrumból
meghatároztuk
az
alábbi
EEG-sávok
teljesítményértékeit: alacsony delta (0.5-2 Hz), totál delta (0.5-4 Hz), theta (4-10 Hz), alfa (10-16 Hz), béta (16-30 Hz), és gamma (30-48 Hz). Ezeken kívül kiszámítottuk a theta és delta teljesítményértékek hányadosát is. Az EMG teljesítményt integráltuk 5 és 48 Hz között. Az összes kiszámolt értéket eltároltuk és később felhasználtuk az analízis további lépéseiben. Az alvásszakaszokat egy félautomata program segítségével osztottuk be a kontroll (csak fiziológiás sóval injektált) oldal EEG jele alapján. A műtermékeket tartalmazó szakaszokat megjelöltük és kihagytuk az elemzésből. A paradox alvási szakaszokat manuálisan jelöltük ki a regisztrátumokban az előzetesen kiszámított delta teljesítményértékek, a theta/delta hányados és az integrált EMG jel alapján. Csak a 30 másodpercnél hosszabb paradox alvási szakaszokat vettük figyelembe az analízis során. Az EEG-ben található lassú hullámok (delta, 0.5-4 Hz) mennyisége szorosan és inverz módon összefügg a kérgi aktiváció szintjével (Riekkinen, Jr. et al. 1990), így ez a paraméter jól használható az aktív és nyugodt ébrenlét, illetve a felületes- és a mély alvás elkülönítésére (Detari et al. 1993; Detari et al. 1999b). Első lépésben előállítottuk a delta teljesítmény hisztogramjait a paradox alvási szakaszok mellőzésével, a kontroll felvételek alapján. Azok az 5 másodperc hosszú szakaszok, amelyek a 75 %-os percentil érték fölé estek a hisztogram alapján, mély alvásként lettek definiálva. Az első, a második és a harmadik negyedbe eső szakaszokat aktív ébrenlétként, nyugodt 58
ébrenlétként illetve felületes alvásként vettük figyelembe. A négy negyedet kijelölő delta teljesítményértékeket használtuk fel az alvásszakaszok azonosításához a többi felvétel esetében. 3.3.6. Statisztikai elemzés Az alvási és a viselkedési adatokat egymást követő 30 perc hosszú blokkokban elemeztük. Az injekciók utáni első fél órát elhagytuk, mivel az állatoknak némi időre volt szükségük, hogy megnyugodjanak az injekciós procedúra után. A különböző viselkedési elemekkel töltött időt összegeztük az egymásra következő fél órás időszakokban és a teljes időszak százalékában fejeztük ki. Az alvás-ébrenléti adatokat hasonlóan összegeztük, de ez esetben az egyes alvás-ébrenléti szakaszok számát is meghatároztuk. A változások statisztikai szignifikanciáját kétutas kevert elrendezésű ANOVA (split-plot analízis) számításával ellenőriztük (Armstrong et al. 2002). Az idő volt az egyik, míg az NPY dózis volt a másik szempont. Minden teszt kétoldali volt és p<0.05 értéket fogadtuk el, mint a szignifikancia legalsó határát.
59
4. EREDMÉNYEK 4.1. A bazális előagyba adott neuropeptid Y és oktreotid hatásai az EEG-re altatott patkányokban Uretánnal elaltatott patkányok segítségével két kísérletsorozatot végeztünk. Az egyik sorozatban a BF-be adott NPY, míg a másikban a SOM-analóg OKTR EEG-s hatásait vizsgáltuk. Minden egyes kísérleti állat esetében egy 10 perces EEG felvétel készült a lyukak kifúrása után, de még a kanülök behelyezése előtt. A legtöbb esetben enyhe EEG aszimmetria volt észlelhető a féltekék között. Szisztematikusan egyik félteke EEG-je sem volt nagyobb amplitúdójú, így az aszimmetria valószínűleg az elektródok esetenként kissé eltérő pozíciójából adódott. A kanül behelyezése az aszimmetriát kifejezettebbé tette és az EEG amplitúdója a kanült tartalmazó féltekében lecsökkent. Ez az átmeneti jelenség azonban csak 15-20 percig tartott. A felvételeket akkor indítottuk el, amikor az EEG amplitúdója visszatért az eredeti szintre. 4.1.1. A neuropeptid Y hatásai az EEG-re Mindkét NPY dózis beadása szignifikáns változásokat okozott a két félteke teljesítményértékeinek
hányadosában,
minden
vizsgált
frekvenciasávban.
Szisztematikus dózis-hatás összefüggés nem volt észlelhető, így a két különböző dózishoz tartozó adatokat összevonva elemeztük. Az NPY injekciók megnövelték a relatív EEG teljesítményt a delta (0-3 Hz) sávban, míg a theta (3-9 Hz), alfa (9-16 Hz) és a béta (16-48 Hz) sávban csökkenést okoztak (9. ábra, felül). A hatás folyamatosan növekedett az egymás után következő 10 perces szakaszokban minden egyes frekvenciasávban. A legerősebb hatások a peptid injekciója utáni 20-30 perc között voltak, majd a felvételek hátralévő részében a hatás csökkent. A legnagyobb változások a béta (16-48 Hz) frekvenciasávban következtek be, ezek már az első 10 perces periódusban erősen szignifikánsnak bizonyultak. Akut kísérleteink folyamán egyoldali NPY injekciókat adtunk és az ellenoldali félteke szolgált kontrollként. Ezen kívül azt is teszteltük, hogy a kontroll injekciók önmagukban okoznak-e EEG változásokat. Ehhez az ellenoldali BF-be helyezett kanülön keresztül fiziológiás só injekciókat adtunk az NPY beadás előtt vagy után. A só injekciók szintén hatással voltak a két oldal teljesítményértékeinek hányadosára, de ezek a hatások az NPY beadások után tapasztaltaknál sokkal gyengébbek és
60
variábilisabbak voltak (9. ábra, alul). A változások iránya azonban hasonló volt, mint az NPY esetében: az EEG teljesítmény megnőtt a delta sávban, míg az alfa és a béta sávban lecsökkent az injektált oldalon. Az NPY beadásokkal ellentétben ezek a változások a statisztikailag szignifikáns szintet (p<0.05) csak három pontban értek el: a só beadás szignifikánsan megnövelte a delta (0-3 Hz) teljesítményt 20-30, illetve 30-40 perc között és lecsökkentette az alfa (9-16 Hz) teljesítményt 20 és 30 perc között. Ha a narkózist elmélyítettük és „burst-suppression” (2. ábra 1. görbe) illetve ahhoz közelítő állapot (2. ábra, 2. görbe) jött létre, a beadott NPY nem volt hatással az EEG-re. 4.1.2. Az oktreotid hatásai az EEG-re Az OKTR hatását csak egy dózisban (500 nmol/patkány) teszteltük (n=14), így dózis-hatás összefüggések vizsgálatára nem volt lehetőségünk. A tesztelt dózis az alfa (9-16 Hz) és a béta (16-48 Hz) frekvencia-tartományokban okozott szignifikáns változásokat (11. ábra, felül). A delta (0-3 Hz) illetve a theta (3-9 Hz) tartományban is megfigyelhető volt egy tendenciózus növekedés, de ez nem volt statisztikailag szignifikáns. A béta tartomány teljesítménye az injektált oldalon a beadás utáni teljes vizsgált időszakban (17.-57. perc) szignifikáns növekedést mutatott. Az alfa sáv teljesítménye viszont csak a 17. és a 37. perc között nőtt meg szignifikánsan. Feltételezhető, hogy az OKTR hatása tovább tartott, mint a regisztrálás időtartama, mivel a regisztráció végén (47.-57. perc) még szignifikáns változások láthatóak. A kontroll fiziológiás sóoldat beadása után szignifikáns változás egyik frekvenciasávban sem következett be (11. ábra, alul). A delta (0-3 Hz) tartomány teljesítménye a beadás után tendenciózusan növekedett, a theta, alfa és béta tartományoké pedig csökkent. A változások iránya csak a delta tartomány esetében egyezett meg az OKTR beadása után látottakkal (enyhe növekedés), a nagyobb frekvenciájú sávokban ellentétes volt azzal. A hatás amplitúdója kisebb volt az OKTR beadása után tapasztaltnál. Kivételt a 17.-27. perc közötti időszak jelentett a delta sáv esetében, amikor a kontrollban nagyobb változás jelentkezett, mint az OKTR beadása után.
61
4.1.3. A neuropeptid Y és az oktreotid hatása a fájdalmas ingerrel kiváltott kérgi aktivációra A spontán EEG-re gyakorolt hatásokon kívül teszteltük a kérgi aktivációban esetlegesen bekövetkező változásokat is fájdalmas inger (farokcsípés) adása után. Farokcsípéseket mind a kontroll periódusban, mind az NPY, az OKTR vagy a fiziológiás só injekciók után alkalmaztunk. A fájdalmas inger minden egyes esetben 510 másodpercig tartó kérgi aktivációt okozott mindkét oldalon. Az NPY és kontroll (fiziológiás só) injekciót kapott féltekék aktivációja között kis különbség volt (10. ábra, felül): az NPY injektált oldal EEG-je kevesebb gyors hullámot tartalmazott a farokcsípés kiváltotta kérgi aktivációkor. Az OKTR hatását tesztelő kísérletsorozatunkban a kontroll-szakaszban és az OKTR, ill. a fiziológiás sóoldat beadása utáni 10. és 20. percben alkalmaztunk farokcsípést. Az inger hatására, valószínűleg a narkózis mély szintje miatt, az esetek egy részében nem következett be aktiváció. Azokban az esetekben, amikor a farokcsípés hatásos volt, szemmel láthatóan nem különbözött az OKTR-injektált és a kontroll féltekék aktivitása (10. ábra, alul). Gyakran előfordult, hogy farokcsípés hatása úgy jelentkezett, hogy az SCR-re jellemző mintázatot theta ritmus váltotta fel, amely viszonylag hosszú időre egyeduralkodóvá vált az EEG-ben. Ennek oka az lehetett, hogy a parietális csavarelektród a HC felett helyezkedett el, amelynek térvezetéssel terjedő theta ritmusát az elektród érzékelhette. 4.2. Neuropeptid Y beadás a bazális előagyba krónikus patkányokban 4.2.1. Viselkedési változások A kísérleti patkányok jól viselték az anyagbeadásokkal együtt járó zavaró hatásokat, ellenállást és vokalizációt nem tapasztaltunk. Az anyagbeadások hatására nem jelentek meg abnormális (például sztereotip) viselkedésmintázatok. Az injekciós procedúra egy átmeneti, nem-specifikus viselkedési aktivációt okozott, amely az injekció utáni első fél órában fokozatosan lecsengett. Ezt az időszakot kizártuk mind a viselkedési, mind az alvási analízisből. Az ezt követő periódusban a nyugalom dominált, a teljes időszak legalább 60 %-át kitéve. A nyugalmi állapot mennyisége jellegzetes változást mutatott mind a kontroll, mind a kezeléses felvételekben. Ez alapján a három szakaszt definiáltunk (n = 8, 12. ábra). Az első szakaszban (2. félóra) az
62
aktív viselkedési elemek (mozgás, ágaskodás, önápolás) magas szintet értek el. Elképzelhető, hogy ez még az injekciós procedúra utóhatása volt. A második szakaszban (3, és 4. félóra) az aktivitási szint lecsökkent, az alvás mennyisége megnőtt. A harmadik szakaszban (5. és 6. félóra) újból megnőtt az aktív viselkedési elemek mennyisége. Általánosságban az NPY enyhe-közepes szintű viselkedési változásokat okozott, amelyek gyakran a p <0.05 szignifikanciaszint alatt maradtak. 1. szakasz. Mindkét NPY dózis szignifikánsan növelte az ágaskodás, evés és ivás mennyiségét a kontrollhoz viszonyítva (12. ábra, C, E, F). A kisebb dózis szignifikánsan növelte az önápolás mennyiségét is. A domináns viselkedésforma ebben a szakaszban azonban a nyugalom, illetve a mozgás volt (60, illetve 15 % a teljes időből) (12. ábra, B ill. A). 2. szakasz. A mozgás, ágaskodás, önápolás és az evés mennyisége erősen lecsökkent a 3. félórában és alacsony szinten is maradt a 4. félórában. Ezzel egyidőben a nyugalom mennyisége megnőtt, mind a kontroll, mind az NPY beadásos felvételekben. Mivel a patkányok idejük nagy részét a mozdulatlan, nyugalmi állapotban töltötték és egyéb viselkedési elemek csak szórványosan fordultak elő, csak nagyon kevés szignifikáns változás volt látható. Az NPY injekció után a mozgás nem-szignifikánsan lecsökkent, míg a nyugalom nem-szignifikánsan megnőtt. Ez a hatás kifejezettebb volt a kisebb dózis esetében és a 4. félórában szignifikáns volt. Az ivás mennyisége mindkét NPY dózis esetében lecsökkent a só kontrollhoz képest (12. ábra, F). Ez a különbség utalhat rebound hatásra, mivel az 1. szakaszban az NPY kezelés után az ivás a gyakoribbá vált a kontrollhoz képest. 3. szakasz. Az előző szakaszban tapasztalt inaktivitás után a kezeléstől függetlenül újból viselkedési aktiváció volt látható. Az alacsonyabb NPY dózis szignifikánsan csökkentette a nyugalmi állapot mennyiségét és növelte az önápolással, evéssel és ivással töltött időt az 5. félórában. Az önápolás szintje a 6. félórában is magas volt (12. ábra, D). A nagyobb dózis kevesebb szignifikáns változást okozott, hatására az önápolás és az evés fokozódott a 6. félórában (12. ábra, D és E). 4.2.2. Alvási változások A BF-be adott NPY injekciók nem okoztak abnormális EEG tevékenységet. Az alvás-ébrenléti paraméterek közepes mértékben változtak (n = 6, 13. és 14. ábra). A
63
három, egymás után következő szakasz, amelyeket a viselkedési változások alapján definiáltunk, részben megfigyelhető volt az alvás-ébrenléttel kapcsolatosan is. 1. szakasz. Az anyagbeadást követő 2. félórát viselkedési aktiváció jellemezte. A kisebb NPY dózis növelte az ébrenlétet (13. ábra, C) és csökkentette a mély alvást (14. ábra, C). Hasonló, bár gyengébb hatás volt látható a nagyobb dózis esetében is, bár ekkor a hatás nem volt szignifikáns. A paradox alvás és a felületes alvás mennyisége nem változott (14. ábra, A és B). A 2. szakaszban a viselkedési aktiváció elmúlt. Ez a változás azonban kevésbé volt egyértelmű az alvás-ébrenlét vonatkozásában. Az ébrenlét (aktív, nyugodt és az összesített is) mindkét dózis esetében enyhe, nem-szignifikáns emelkedést mutatott a 3. félórában, míg csökkenést a 4.-ben (13. ábra, C). A mély alvás és az összesített lassú hullámú alvás nem szignifikánsan csökkent a 3., és növekedett a 4. félórában (14. ábra, C és D). A magasabb dózis szignifikánsan növelte a paradox alvás mennyiségét a 4. órában (14. ábra, A). A 3. szakaszban az ébrenlét (aktív, nyugodt és összesített is) megnövekedett, míg az alvás (a felületes, a mély, az összesített lassú hullámú és a paradox is) csökkent. A magasabb NPY dózis azonban szignifikánsan növelte a mély és az összesített lassú hullámú alvást az 5. félórában (14. ábra, C és D). A 3. szakaszt követően az alvás csökkent és az ébrenlét fokozódott egészen a világos fázis végéig, tekintet nélkül a kezelésre. A megfigyelt alvás-ébrenléti változások az egyes szakaszok számának a növekedéséből eredtek (adatok nem mutatva), az NPY injekciók tehát nem befolyásolták az egyes alvás-ébrenléti epizódok hosszát. 4.3. Szövettani eredmények Amint az a 15. ábrán látható, a szövettani vizsgálatok alapján az injekciók olyan BF struktúrákba vagy azok közvetlen közelébe történtek, ahol az irodalmi adatok alapján nagyszámú kolinerg neuron van jelen (GP ventrális része, HDB, MCPO, SI, VP) (Zaborszky et al. 1986). A kolinerg sejtek jelenlétét a BF kanül végének környezetében az OKTR hatását tesztelő kísérletsorozatunkban ChAT-immunhisztokémiával is ellenőriztük (16. ábra). A ChAT-immunoreaktív sejtek előfordulása és morfológiája (20-50 μm átmérőjű multipoláris szóma, 3-8 elsődleges dendrit, kiterjedt dendrithálózat) megegyezett az irodalomban leírtakkal (Semba and Fibiger 1989)(16. ábra, C). 64
Az NPY hatása és az injekció helye között sem akut, sem krónikus kísérleteinkben nem találtunk szisztematikus összefüggést.
65
4.4. Ábrák
NPY
Kontroll (fiziológiás só)
9. ábra. A BF-be adott NPY (felső panel) illetve kontroll (fiziológiás só; alsó panel) injekciók hatásai az EEG-re (n=9). A kontroll és az NPY-injektált féltekék integrált relatív EEG-teljesítményértékeinek logaritmusos hányadosát számítottuk ki. Kétutas ANOVA-val, Newman-Keuls post-hoc teszt segítségével összehasonlítottuk az NPY injekció előtti (kontroll) és az injekció utáni értékeket, külön-külön minden frekvenciasávra. A szignifikáns változásokat csillag jelzi. Szignifikanciaszintek: * - p < 0,05; ** - p< 0,01; *** - p < 0,001.
66
10. ábra. A farokcsípésre bekövetkező változások az EEG-ben a bazális előagyba adott NPY (felül), illetve OKTR injekciók (alul) után. A farokcsípésre mindkét oldalon kérgi aktiváció alakult ki, de az NPY-injektált oldalon sokkal kevesebb gyors hullám volt jelen. Az OKTR-injektált oldal EEG-jében farokcsípés után nem volt feltűnő különbség a kontroll oldalhoz viszonyítva. Az NPY esetében az EEG-görbéket 0 és 40 Hz között megszűrtük. 67
11. ábra. A BF-be adott OKTR (felső panel) illetve kontroll (fiziológiás só; alsó panel) injekciók hatásai az EEG-re (n=14). A kontroll és az OKTR-injektált féltekék integrált relatív EEG-teljesítményértékeinek logaritmusos hányadosát számítottuk ki, majd a kontroll szakasz (beadás előtti 15 perc) értékét kivontuk a beadás utáni, egymásra következő 10 perces blokkok értékeiből. Kétutas ANOVA-val, Newman-Keuls post-hoc teszt segítségével összehasonlítottuk az OKTR injekció előtti (kontroll) és az injekció utáni értékeket külön-külön minden frekvenciasávra. A szignifikáns változásokat csillag jelzi. Szignifikanciaszintek: * - p < 0,05; ** - p< 0,01; *** - p < 0,001.
68
69
12. ábra. Viselkedési változások a BF-be adott kontroll (fiziológiás só) illetve NPY injekciók után (n=8). (A) Mozgás, (B) Nyugalom, (C) Ágaskodás, (D) Önápolás, (E) Evés, (F) Ivás. A nyugalom mennyisége jellegzetes mintázat szerint változott a kontroll és az NPY beadással járó regisztrátumokban, ami alapján három, egymásra következő szakaszt definiáltunk (I. szakasz: 2. félóra, II. szakasz: 3. és 4. félóra, III. szakasz: 5. és 6. félóra) Az NPY és a só injekciókat a világos fázis kezdetén adtuk és a viselkedést videóra rögzítettük 4 óra hosszan. Az injekciók utáni első fél órát kihagytuk az elemzésből. A kihagyott periódus után az egyes viselkedési elemekkel töltött időt az egymást követő 30 perces időszakokban összegeztük és az adott periódus %-ában adtuk meg. Csillag (*) jelzi a kontrollhoz viszonyított szignifikáns eltéréseket az NPY injekciók esetében. A szignifikanciát kétutas, kevert elrendezésű ANOVA-val (split-plot analízis) teszteltük. Szignifikanciaszintek: * - p < 0.05; ** - p< 0.01; *** - p < 0.001. Az adatokat átlag + S.E.M. formájában adtuk meg.
13. ábra. A BF-be adott NPY injekciók hatása az ébrenlétre (n=6). Az ábra a százalékos eltérést mutatja a kontrollhoz képest. (A) Aktív ébrenlét, (B) Nyugodt ébrenlét, (C) Összesített ébrenlét (aktív és nyugodt együtt), (D) Az összesített ébrenlét abszolút értékei a kontroll (fiziológiás só) injekciók után. A kontroll és NPY injekciókat a világos fázis kezedetén adtuk. Az injekciók utáni első fél órát kihagytuk az elemzésből. A kihagyott periódus után az egymást követő 30 perces blokkok adatait elemeztük. Csillag (*) jelzi a szignifikáns eltérést a megfelelő kontroll értéktől az NPY beadások után. A szignifikanciát kétutas, kevert elrendezésű ANOVA-val (split-plot analízis) teszteltük. Szignifikanciaszintek: * - p < 0.05; ** - p< 0.01; *** - p < 0.001.
70
14. ábra. A BF-be adott NPY injekciók hatása az alvásra (n=6). Az ábra a százalékos eltérést mutatja a kontrollhoz képest. (A) Paradox alvás, (B) Felületes alvás, (C) Mély alvás, (D) Összesített lassú hullámú alvás (felületes+mély együtt), (E) Az összesített lassú hullámú alvás abszolút értékei a kontroll (fiziológiás só) injekciók után. A kontroll és NPY injekciókat a világos fázis kezedetén adtuk. Az injekciók utáni első fél órát kihagytuk az elemzésből. A kihagyott periódus után az egymást követő 30 perces blokkok adatait elemeztük. Üres csillag (¶): szignifikáns eltérés a megfelelő kontrolltól az alacsonyabb NPY dózis beadása után (300 pmol/0.5 ml). Teli csillag (*): szignifikáns eltérés a megfelelő kontroll értéktől a magasabb NPY dózis beadása után (500 pmol/0.5 ml). A szignifikanciát kétutas, kevert elrendezésű ANOVA-val (split-plot analízis) teszteltük. Szignifikanciaszintek: * - p < 0.05; ** - p< 0.01; *** - p < 0.001. 71
15. ábra. A BF kanülök pozíciója akut NPY (bal panel), krónikus NPY (középső panel), illetve akut OKTR (jobb panel) beadással járó kísérleteinkben. Az átláthatóság miatt minden injekciós helyet ugyanarra az oldalra rajzoltunk fel. A frontális metszetek rajzai Paxinos és Watson atlaszából származnak. A panelek jobb oldalán látható számok a Bregmától való antero-posterior távolságot mutatják milliméterben. Jelölések: r = fiziológiás só injekciós hely, p =NPY injekciós hely (bal és jobb panel). A középső panelen: p = NPY injekciós helyek viselkedési és alvási analízisbe bevont patkányoknál (6 hely), n = fiziológiás sóoldat injekciós helyek a viselkedési és alvási analízisbe bevont patkányoknál (6 hely), r = NPY injekciós helyek a csak a viselkedési analízisbe bevont patkányoknál (2 hely), m = fiziológiás sóoldat a csak a viselkedési analízisbe bevont patkányoknál (2 hely). Rövidítések: 3V – 3. agykamra; B –nucleus basalis Meynert; CeM – centralis amygdala, medial; CPu – caudato-putamen; GP – globus pallidus, HDB – horizontal limb of diagonal band, ic – capsula interna, LGP – lateralis globus pallidus; LH – lateralis hypothalamus, MCPO – magnocellular preoptic nucleus, SIB – substantia innominata; basalis; SID – substantia innominata, dorsalis, SIV – substantia innominata, ventralis; VP – ventral pallidum
72
16. ábra. Kolin-acetiltranszferáz (ChAT)-pozitív sejtek a BF-ben. Az OKTR hatását tesztelő kísérletsorozatunkban a kolinerg sejtek jelenlétét a BF-be ültetett kanül környékén ChAT immunhisztokémia segítségével ellenőriztük. (A) Reprezentatív koronális metszet. A szúrcsatorna jól látható, helyzetét nyilak jelzik. Kalibráció: 2 mm. (B) Az (A) panel téglalappal jelzett része kinagyítva. Megfigyelhető a szúrcsatorna vége az SI területén (nyíllal jelezve), ahol számos ChAT-pozitív sejt van jelen. Kalibráció: 200 μm. (C) ChATpozitív sejtek az SI területén. Megfigyelhető a nagyméretű (20-50 μm), multipoláris szóma, kiterjedt dendrithálózattal. Kalibráció: 50 μm. Henter Tamás felvétele és készítménye.
73
5. MEGVITATÁS Kísérleteink eredményei szerint a BF-be adott NPY és OKTR szignifikáns változásokat idézett elő a kérgi EEG-ben akut, uretán-altatott patkányokban. A BF-be adott NPY injekciók krónikus, szabadon mozgó állatokban jellegzetes, szakaszos változásokat idéztek elő az alvásban és a viselkedésben. A továbbiakban megvitatjuk a kísérleteinkkel kapcsolatban felmerülő technikai-metodikai problémákat, ezt követően pedig az irodalmi adatokkal való összevetéssel értelmezzük saját kísérleti eredményeinket. 5.1. Technikai megfontolások Mind akut, mind krónikus kísérleteink során lokális agyszöveti injekciókat adtunk. Az ilyen típusú injekciókkal kapcsolatban felmerülő technikai problémák közül igen lényeges a beadott anyag diffúziós távolságának megállapítása/becslése. Ettől függ ugyanis, hogy a beadott anyag pontosan milyen struktúrák működését képes befolyásolni. Erre irányuló méréseink szerint a BF-be adott HRP körülbelül 1 mm-re diffundált el a beadás helyétől. Bár az NPY, az OKTR és a HRP molekulatömege eltér egymástól, más lehetőség nem állt rendelkezésünkre a diffúziós távolság megállapítására. Radioaktívan jelzett peptidek beadásával és ezt követően a radioaktivitás valamilyen formában történő detektálásával meghatározható ez a távolság, de erre alkalmas módszer számunkra nem volt hozzáférhető. Tehovnik és Sommer publikált egy összefüggést, amely segítségével meg lehet becsülni az agyszövetbe adott lidokain diffúzióját (Tehovnik and Sommer 1997), de ez az összefüggés csak nehezen vonatkoztatható peptidekre a jelentős fiziko-kémiai eltérések miatt (molekulatömeg, hidrofóbicitás, térszerkezet stb.). Lényeges szempont, hogy a beadott anyag ne diffundáljon be egyik agykamrába sem, hiszen akkor már nem beszélhetünk lokális injekcióról. A BF-be adott injekcióknál a laterális koordináta 2.8-3 mm volt a középvonaltól számítva, így a kb. 1 mm-es diffúziós távolságot figyelembe véve az általunk beadott anyagok nem juthattak be a harmadik agykamrába. Eredményeink tehát lokális injekciók hatásait mutatják. Altatott állatokkal végzett kísérleteink során a kanülök behelyezése után átmeneti változások jelentkeztek az EEG-ben. A kontrollként használt fiziológiás sóoldat injekciói szintén hatással voltak az EEG-re. Úgy tűnik, hogy ezek a változások az ilyen típusú kísérletek természetes kísérőjelenségei, mivel irodalmi adatok szerint kontroll (Ringer) oldat injekciója a BF-be enyhén csökkentette az EEG amplitúdóját a 0,5-40 Hz-es
74
intervallumban (Dringenberg and Olmstead 2003). A kanült igyekeztünk igen lassan, óvatosan behelyezni a beadási helyre. Ezzel együtt a kanül valószínűleg még így is némileg lenyomta az agyat, mivel a megcélzott terület igen ventrálisan helyezkedett el a kéreg felszínétől számítva. Az injekciók sebességét igen alacsony értéken tartottuk (0,25 μl/min), de az ebből eredő lokális nyomásfokozódás hatása sem elhanyagolható. A felsorolt szempontok megmagyarázhatják, hogy a kanül beültetés és a fiziológiás sóoldat beadása hatással volt az EEG-re (9 és 11 .ábra, alul), de nem tehetők felelőssé az NPY beadása után tapasztalt erős és konzisztens EEG-s lassulásért (9. ábra, alul), illetve az OKTR beadása után látott EEG-s változásokért (11. ábra, felül). 5.2. A neuropeptid Y és az oktreotid hatásai az EEG-re altatott patkányokban Kísérleteinkben a BF-be injektált OKTR minden egyes EEG frekvenciasávban növelte a teljesítményt, bár szignifikáns változásokat csak az alfa (9-16 Hz) és a béta (16-48 Hz) sávban okozott (11. ábra, felül). Az OKTR feltételezhetően a kolinerg sejteken keresztül lehet hatással a kérgi EEG-re. Mint már említettük, a SOM-tartalmú rostokat és a helyi SOM neuronok axonjait a kolinerg sejtek sejttestjének és proximális dendritjeinek a közvetlen közelében figyelték meg a BF területén (Zaborszky and Duque 2000). Az OKTR hatását tesztelő kísérleteinkben a kolinerg sejtek jelenlétét a BF-be helyezett kanül környékén ChAT immunhisztokémia segítségével ellenőriztük (16. ábra). A BF kolinerg sejtjei erős GABA-erg (Zaborszky et al. 1986) és glutamáterg kontroll alatt állnak. A GABA-erg bemenetnek jelenlegi ismereteink szerint 3 forrása van: (1) a nucleus accumbensből jövő GABA-erg vetület (Zaborszky and Cullinan 1992) (2) PV-tartalmú GABA-erg projekciós neuronok axonkollaterálisai (Zaborszky and Duque 2000) és (3) helyi GABA-erg interneuronok, amelyek feltételezhetően NPY-t és/vagy SOM-ot is tartalmaznak. A glutamáterg bemenet ismert forrásai a következők: (1) amygdalofugális axonok (Zaborszky et al. 1984), (2) a középagyi tegmentumból eredő glutamáterg rostok (Rasmusson et al. 1994), (3) helyi glutamáterg neuronok kollaterálisai (Hur and Zaborszky 2005). In vitro mérésekben a SOM preszinaptikusan gátolta mind a GABA, mind a glutamát felszabadulást a BF kolinerg neuronjain (Momiyama and Zaborszky 2006). Ez arra utal, hogy a SOM szabályozhatja a kolinerg sejtek ingerelhetőségét, mivel mind a serkentő, mind a gátló transzmissziót gátolja, feltételezhetően viszont nem egyenlő mértékben.
A
szerzők
előzetes
eredményei
szerint
a
SOM
posztszinaptikus
75
mechanizmusokkal hiperpolarizálta a BF –ebben az esetben csak feltételezhetően- kolinerg neuronjait. A hatás időtartama olyan volt, amely már elegendő a transzmitter-felszabadulás gátlásához. A SOM-pozitív sejtek GABA-t is expresszálnak számos előagyi területen (Hendry et al. 1984; Kosaka et al. 1988), így valószínűleg a BF-ben is, bár ez utóbbi feltevés egyelőre nem bizonyított kísérletesen. Az sem tisztázott, hogy a kolinerg neuronokon végződő SOM-tartalmú terminálisokból felszabadul-e GABA is. Azt, hogy a SOM-GABA kolokalizáció milyen mértékű, eddig csak a HC hilus dentatus-ában vizsgálták. Itt a GABA-erg sejtek 30-50 %-a tartalmazott SOM-ot is, míg a többi GABAerg sejtben más neuropeptid expresszálódott (Esclapez and Houser 1995; Kosaka et al. 1988). Napjainkig 5 külöböző (sst1-sst5), G-protein kapcsolt receptort klónoztak, amelyek a SOM hatásait közvetítik (Dournaud et al. 2000). A HDB és az SI területén sst1 és sst2 receptorokat találtak (Hervieu and Emson 1998), míg az sst5 receptorok széleskörűen elterjedtek a BF-ben (Stroh et al. 1999). Az sst5 receptorok feltételezhetően kolinerg sejteken expresszálódnak (Stroh et al. 1999). A kolinerg sejtekhez futó GABAerg és glutamáterg rostokon a SOM preszinaptikus hatása ezeken a receptor-altípusokon keresztül valósulhat meg. Újabb eredmények szerint a GABA felszabadulás modulációja főként sst2 receptorok közvetítésével történik, míg a glutamát felszabadulás befolyásolása sst1 és sst4 receptorokon keresztül (Bassant et al. 2005). Az OKTR nagy affinitású az sst2 és az sst5 receptor irányába, míg közepes affinitású az sst3 receptorhoz, de nem kötődik az sst1-hez és az sst4-hez (Hoyer et al. 1995). Eredményeink tehát a jelenleg még kevéssé ismert posztszinaptikus hatásokon kívül a SOM GABA felszabadulást gátló hatásait mutathatják. Ez a kolinerg sejtek esetében pedig a gátlás csökkenését, aktivációt jelenthet. A magasabb frekvenciájú
(alfa
és
béta)
hullámok
mennyiségének
növekedése
erre
utalhat.
Posztszinaptikusan elhelyezkedő receptorokon át viszont a SOM, illetve az OKTR hiperpolarizálhatja a kolinerg sejteket, a SOM - ACh kölcsönhatások tehát igen komplexek. A SOM BF-beli szerepével kapcsolatban jelenleg még számos alapvető kérdés áll megválaszolatlanul. Nem ismert a kolinerg neuronok SOM inputjának a pontos eredete. Nem ismert a SOM receptorok pontos celluláris és szubcelluláris szintű lokalizációja. Nincs még adat arra nézve sem, hogy hogyan korrelál egymással a kolinerg és a SOM-erg sejtek tüzelése a BF-ben a különböző EEG-s mintázatok, illetve az alvás-ébrenléti ciklus során. Az NPY-ra immunoreaktivitást mutató sejtpopulációk erősen átfednek a SOM-ra pozitívakkal (Kohler et al. 1987; Gulyas et al. 2003), a neostriatumban a kolokalizáció 100 76
%-os (Tepper and Bolam 2004). A BF NPY- illetve SOM-erg neuronjai tehát – legalábbis részben – egyazon neuronpopulációt jelenthetik, ezt azonban szisztematikusan még nem vizsgálták. Lényeges szempont, hogy a neuropeptidek nem csak szinaptikusan (sőt, ez a ritkább eset), hanem extra-szinaptikusan, gyakorlatilag a neuron bármely pontján felszabadulhatnak (Morris and Pow 1991). Különösen lényeges a dendritek területén történő felszabadulás (Ludwig and Leng 2006). Egyelőre sem az NPY, sem a SOM esetében nem ismert receptoraik szubcelluláris lokalizációja a BF különböző sejttípusai esetében. Számolnunk kell tehát extraszinaptikus hatásokkal is, amelyek mértékét azonban nagyon nehéz megbecsülni. Az NPY agykamrai beadása után a kérgi EEG teljesítmény minden egyes frekvenciasávban csökkent 0.5-50 Hz között szabadon mozgó patkányokban (Ehlers et al. 1997). Ez a hatás hasonló ahhoz, mint amit a benzodiazepin vegyületcsaládba tartozó diazepam beadása után írtak le (Robledo et al. 1994). Mi hasonló változásokat találtunk a 3 Hz fölötti frekvenciájú sávokban, de a delta sáv teljesítményében (0-3 Hz) erős növekedés jelentkezett (9. ábra, felül). A különböző NPY receptor altípusok széleskörűen elterjedtek az agyban (Parker and Herzog 1999; Wolak et al. 2003), így az agykamrai beadás során az NPY számos olyan neuronkör működését képes befolyásolni, amelyekre a BF-be történő lokális beadás nincs hatással. Ezen kívül az uretán narkózis önmagában is befolyásolhatja az NPY hatását, bár ezt a lehetőséget még sohasem vizsgálták. Az NPY-tartalmú S-sejtek valószínűleg GABA-t is tartalmaznak. Ezen sejtek aktivációja tehát nem csak NPY, hanem a GABA felszabadulást is okoz. A neuropeptidek hatása rendszerint lassan bontakozik ki és hosszú ideig tart (Hokfelt et al. 2000). Kísérleteink során az NPY hatása a beadás utáni 20-30 perc között volt maximális, ami megfelel ez előbbi elképzelésnek. Mind az NPY, mind az OKTR esetében még szignifikáns változások voltak láthatóak a regisztrációs periódus végén, a peptidek tehát biztosan hosszabb ideig hatottak, mint a regisztálás 45 perce. Elképzelhető, hogy a GABA a gyors és gyorsan eliminálódó hatásokat közvetíti, míg a neuropeptid felszabadulás lassabb és tartósabb hatású. Irodalmi adatok szerint a kéregre vetülő BF sejtek legalább fele GABA-erg (Gritti et al. 1997). Ezek a sejtek GABA-erg kérgi interneuronokkal szinaptizálnak (Freund and Meskenaite 1992) és dezinhibíción át kérgi aktivációt okoznak. A BF NPY-tartalmú
77
neuronjai számos axon-kollaterálissal rendelkeznek, amelyek egy része kolinerg sejtekkel lép kapcsolatba (Zaborszky and Duque 2000), de arról nincsenek adatok, hogy ezek az NPY sejtek vajon kapcsolatban lépnek-e kéregre vetülő GABA-erg sejtekkel. Ha lenne köztük kapcsolat, akkor az NPY nem csak a kolinerg, hanem a GABA-erg sejteken keresztül is befolyásolhatná a kérgi aktivációt. Az a terület, ahova az NPY injekciókat adtuk, a kéregre vetülő kolinerg és GABA-erg sejteken kívül glutamáterg sejteket is tartalmaz, amelyek egy része szintén vetül a kéregre (Hur and Zaborszky 2005), míg más részük interneuron, akárcsak a szeptumban (Hajszan et al. 2004). További vizsgálatok szükségesek tehát ahhoz, hogy megállapítsuk, pontosan milyen BF sejtekre hatva fejti ki a lassú EEG hullámok megjelenését elősegítő hatását az NPY. Az NPY sejtek tüzelési tulajdonságai (7. ábra) és jelen eredményeink egybevágnak azzal a feltételezéssel, hogy az NPY-tartalmú axonok a kolinerg sejtek gátlásán keresztül képesek SWA-t kiváltani a kérgi EEG-ben. NPY beadás utáni farokcsípés képes volt kérgi aktiváció kiváltására. Ez arra utal, hogy egyéb felszálló aktiváló rendszerek ilyenkor is képesek elérni a talamokortikális vagy a bazális ganglionokból a kéreg felé induló rendszereket és így képesek megváltoztatni a kérgi EEG-t. Akut kísérleteinkben nem találtunk szignifikáns különbséget a kétfajta NPY dózis hatása között. Ez a jelenség számos, egymást nem kizáró módon magyarázható. A kéregre vetülő BF sejtek számos egyéb sejttípussal keveredve helyezkednek el (lásd 5. ábra) és a vetítő neuronok arányát a beadás helyén pontosan nem tudhatjuk (15. ábra). Az is lehetséges, hogy a kisebb dózis már maximális választ váltott ki, így ezt a nagyobb dózis már nem tudta tovább növelni. Az NPY neuronok továbbá gátló hatást fejthetnek ki a BF neuronokra amelyek direkt vagy indirekt úton serkentő hatással vannak az agykéregre. Ezeknek a sejteknek az aktivitása az NPY injekció előtt nem ismert, de módosíthatják az NPY-indukált gátlás hatását és így megakadályozhatják, hogy tiszta dózis-hatást lássunk. 5.3. Az NPY viselkedési hatásai szabadon mozgó patkányokban Irodalmi adatok alapján az i.c.v. vagy különböző agyterületekbe adott lokális NPY injekciók erőteljesen befolyásolták a patkányok spontán viselkedését. Az NPY hatásai azonban egyértelműen összefüggtek azzal, hogy pontosan milyen agyterületre történt a beadás. Az i.c.v. NPY beadás szignifikánsan csökkentette a motoros aktivitást mind open field, mind lakóketrec esetében (Jolicoeur et al. 1991; Heilig and Murison 1987),
78
megnövelte az izomtónust és dózisfüggő módon katalepsziát okozott (Jolicoeur et al. 1991). Ezzel ellentétben, mind az explorációs, mind a lokomotor aktivtás megnőtt agykéregbe történt injekció után (Smialowski et al. 1992), de nem volt változás a mozgásban és a táplálékfelvételben, mikor az NPY injektálás centrális amigdala-magba történt (Katner et al. 2002). Saját adataink szerint a BF-be adott NPY injekciók globális módon változtatták meg a kérgi aktivációt és az arousal-t, de az így kialakult, fokozott arousal-al járó állapot nem járt együtt fokozott lokomócióval. Az NPY erőteljesen fokozza a táplálékfelvételt i.c.v. beadás után (Ida et al. 1999). A PVN-be injektált NPY fokozta mind a táplálék-, mind a folyadékfelvételt (Stanley and Leibowitz 1984). Kísérleteinkben mind az evéssel, mind az ivással töltött idő megnőtt mindkét NPY dózis hatására (12. ábra, E és F). Az elfogyasztott táplálék tömegét és a felvett víz térfogatát azonban nem mértük, csak a fogyasztással eltöltött időt. Az NPY a vízfelvételt egy komplex mintázat alapján fokozta. Erőteljes vízfelvétel volt látható röviddel az injekciók után (1. szakasz) és a viselkedési felvételek végén (3. szakasz), míg szignifikáns csökkenés volt látható a 2. szakaszban (12. ábra, F). Kísérleteinkben mindkét NPY dózis növelte az önápolással töltött időt. I.c.v. beadás (Ida et al. 1999) és a PVN-be történő injekció (Stanley and Leibowitz 1984) után azonban ez a növekedés nem volt észlelhető. Az 1. szakaszban megnőtt az ágaskodással töltött idő is (12. ábra, C), míg irodalmi adatok alapján az i.c.v. NPY beadás csökkentette az ágaskodást (von Horsten et al. 1998), a PVN-be történő injekció pedig nem befolyásolta (Stanley and Leibowitz 1984). Az önápolás mennyiségének változásai összefüggést mutathatnak a stresszel és a szorongással. Az összefüggés azonban nem egyértelmű, mivel mind a komfortérzet (Spruijt et al. 1992), mind az erős (Katz and Roth 1979), illetve a gyenge stressz (Eguibar and Moyaho 1997) egyaránt növeli az önápolás mennyiségét. Az NPY-nak anxiolitikus hatásokat tulajdonítanak (Ehlers et al. 1997). Ezekben a hatásokban lényeges lehet az NPY corticotropin releasing-faktorral (CRF) való funkcionális antagonizmusa (Sajdyk et al. 2004). Bár korábban felmerült, hogy az NPY anxiolitikus hatásaiban fontos szerepe lehet a BF-nek (Zaborszky and Duque 2000), a dolgozatban részletezett adatok alapján nehéz ilyen irányú kijelentést tenni. Bár a spontán, ismerős környezetben végzett önápolás mennyisége megnőtt a BF NPY beadás hatására, és ez akár anxiolitikus hatást is jelenthet, kísérleteinkben nem használtunk olyan speciális viselkedési teszteket (Fogelteszt, open-field, emelt keresztlabirintus stb.), amelyek a stressz, illetve a szorongás mérésére szolgálnak. Az az adat, hogy abnormális (például sztereotip) viselkedésformákat
79
nem tapasztaltunk, arra utalhat, hogy ezek létrejöttében a BF NPY-tartalmú neuronjai nem játszanak szerepet. Vizsgálatainkban két NPY dózis hatását teszteltük: 300 pmol/patkány és 500 pmol/patkány. A két dózis különböző, gyakran ellentétes alvási és viselkedési változásokat okozott. Egy előzetes kísérletsorozatban kipróbáltuk egy még alacsonyabb NPY dózis hatását is (100 pmol/patkány). Az ekkor tapasztalt alvási és viselkedési változások hasonlóak voltak a 300 pmol/patkány dózis esetén látottakhoz. Az irodalmi adatok alapján az NPY a dózistól függően képes akár ellentétes fiziológiai változásokat is okozni. A laterális hipotalamuszba történő beadáskor az NPY kétfázisú változásokat okozott: kisebb dózisa (30-50 pmol) hipertermiát, míg a nagyobb dózis hipotermiát (200-400 pmol) váltott ki (Jolicoeur et al. 1995). Ennek a jelenségnek a pontos mechanizmusa egyelőre ismeretlen. Alvási és viselkedési adataink hasonló kétfázisú változásokat mutattak és elképzelhető, hogy ezt hasonló – bár eddig feltáratlan - mechanizmusok okozhatták. 5.4. A neuropeptid Y alvási hatásai szabadon mozgó patkányokban Krónikus, szabadon mozgó patkányaink segítségével mi vizsgáltuk első alkalommal a BF-be injektált NPY alvási és viselkedési hatásait. Akut kísérleteink eredményei alapján arra számítottunk, hogy az NPY injekciók hatására az ébrenléttel töltött idő csökkenni, míg az alvással töltött növekedni fog, hiszen altatott patkányokban az NPY megnövelte az EEGben a lassú hullámok mennyiségét. Ezzel ellentétben, az észlelt változások komplexebbek voltak (13. és 14. ábra). Az ébrenlét tendenciaszerűen fokozódott (13. ábra) és az ébrenléttel összefüggő viselkedési elemek gyakoribbá váltak, különösen a kisebb NPY dózis esetében (12. ábra). A korábbi kísérletek, amelyek az NPY alvási hatásait igyekeztek leírni, ellentmondó eredményekkel jártak. Egy régebbi tanulmány szerint az i.c.v. NPY beadás nem okozott szignifikáns változásokat a lassú hullámú alvással töltött időben (Ehlers et al. 1997), egy újabb közlemény viszont csökkenésről számol be (Szentirmai and Krueger 2006). Mivel az NPY nagy mennyiségben fordul elő a 3. agykamra környezetében elhelyezkedő struktúrákban, az agykamrai beadás nem tűnik megfelelő módszernek arra, hogy leírjuk az NPY komplex alvási hatásait. A lokális NPY beadások viszont változatos eredményekkel jártak. A PVN-be történő beadás nem okozott alvási változásokat (Stanley and Leibowitz 1984), míg a laterális hipotalamuszba adott NPY csökkentette mind a REM, mind a nonREM alvást (Szentirmai and Krueger 2006). Saját kísérleteink alapján a BF-be adott NPY
80
szignifikáns változásokat okozott az alvás-ébrenlétben. Az eredmények alapján úgy tűnik, hogy az NPY alvási hatásai (hasonlóan a viselkedési hatásokhoz), igen erősen függenek a beadás helyétől. Mivel a BF igen fontos terület az kérgi aktiváció és az alvás-ébrenlét szabályozásában (Detari et al. 1999a; Zaborszky and Duque 2003; Jones 2004), eredményeink alapján az NPY-nak szerepe van az alvás-ébrenlét szabályozásában a BF-en keresztül. Mint arra már többször utaltunk, a BF anatómiailag igen komplex struktúra, számos különböző sejttípussal (lásd 5. és 6. ábra). Ahhoz, hogy pontosan meghatározzuk, milyen sejteken és milyen receptorokon keresztül fejti ki hatását az NPY, az adott struktúrák szelektív blokkolására lenne szükség. Ezt azonban igen nehéz megvalósítani, mivel az NPY receptorok eloszlása nem mutat specifikus mintázatot ezen az agyterületen. A BF különböző részei heterogén sejtpopulációt tartalmaznak (Zaborszky and Duque 2000). Annak ellenére, hogy az NPY-tartalmú sejtek száma viszonylag alacsony (lásd a 8. ábrát)(Zaborszky and Duque 2003), ezek a neuronok fontos szerepet játszanak a különböző BF sejtcsoportok működésének a szabályozásában. A BF-be injektált különböző neuropeptidek alvási és EEG-s változásokat okoztak. Ezeket a változásokat nagyrészt annak tulajdonították, hogy az injektált peptid megváltoztatta a BF kolinerg sejtek működését. Ezt a mechanizmust írták le a neurotenzin (Cape et al. 2000) és a SOM (Hajdu et al. 2003) esetében és erre utalnak az altatott állatokból származó eredményeink az NPY, illetve az OKTR esetében is. Az NPY-tartalmú axonterminálisok szimmetrikus szinapszisokat alakítanak ki a kolinerg sejtekkel (Zaborszky and Duque 2000), a szimmetrikus szinapszisok pedig gátló kapcsolatot jeleznek (Ribak and Roberts 1990). Az NPY pontos hatása BF kolinerg sejtek működésére azonban pontosan nem ismert sem in vivo, sem in vitro. A BF sejtek tüzelése erősen korrelál az alvás-ébrenléti szakaszokkal (Detari et al. 1984; Detari et al. 1987; Detari et al. 1999a). Bár direkt bizonyíték egyelőre nem támasztja alá, a kolinerg BF sejtek tüzelése feltételezhetően változik az alvás-ébrenléti ciklus során (Detari et al. 1984). Feltételezhető az is, hogy az NPY sejtek aktivitása szintén összefügg a különböző éberségi szintekkel. Az NPY sejtek így az alvás-ébrenléti ciklus során különböző mértékben befolyásolhatják a kolinerg sejtek működését. Nem állnak rendelkezésre adatok azonban sem az NPY peptid, sem az NPY mRNS szintjeinek változásairól, sem pedig az NPY transzmisszió intenzitásáról a BF-ben az alvás-ébrenléti ciklus során.
81
Az NPY EEG-s hatása attól is függ, hogy a BF neuronkörei aktuálisan milyen funkcionális állapotban vannak. Akut kísérleteinkben az NPY nem okozott változásokat a kérgi EEG-ben igen mély narkózis esetén. Amikor viszont a narkózis felületesebbé vált, egyértelmű EEG-s változásokat láttunk (9. ábra). A BF neuronkörei az altatás mélységétől függő mértékben gátolt állapotban vannak. Úgy tűnik tehát, hogy az NPY akkor képes EEG-s változásokat okozni, ha a BF neuronkörök aktivitása kellően magas. Szabadon mozgó állatban a BF jóval aktiváltabb, mint egy uretánnal elaltatott egyedben. Várakozásainkkal ellentétben a BF-be adott NPY megnövelte az ébrenlétet (13. ábra) és az ébrenléthez kapcsolódó viselkedési elemek mennyiségét (12. ábra), különösen a kisebb dózis. Irodalmi adatok szerint az NPY számos neurotranszmitter felszabadulását modulálhatja preszinaptikus mechanizmusokon keresztül (Sun et al. 2001), így például a GABA-ét (Hastings et al. 2001; Martin 2002). A BF kolinerg sejtjei GABA-erg kontroll alatt állnak, az ebből eredő gátlás pedig erősebb aktiváltabb állapotok alatt (Givens and Sarter 1997; Sarter and Bruno 1994). Így tehát a kolinerg sejtek diszinhibíciója megmagyarázhatja az ébrenlét növekedését, míg a nagyobb dózis gyengébb hatása és a lassú EEG-s hullámtevékenység fokozódása altatott állatban egy ellenkező, a kolinerg sejtekre irányuló direkt hatásnak tulajdonítható.
82
6. ÖSSZEFOGLALÁS Kísérleteink eredményei alapján a Célkitűzések című fejezetben részletezett kérdéseinkre az alábbi válaszokat adhatjuk: 1.
Akut, uretán-altatott patkányokkal végzett kísérleteinkben megmutattuk, hogy mind
az NPY, mind a SOM-analóg OKTR szignifikáns változásokat okoz az ipszilaterális oldal EEG-jében. Mindkét NPY dózis (300, illetve 500 pikomol/patkány) szignifikánsan megnövelte a relatív EEG teljesítményt a delta (0-3 Hz) sávban, míg a theta (3-9 Hz), alfa (9-16 Hz) és a béta (16-48 Hz) sávban szignifikáns csökkenés volt látható. A legnagyobb változások a béta (16-48 Hz) frekvenciasávban következtek be. A legerősebb hatások a peptid injekciója utáni 20. és 30. perc között jelentkeztek. A peptid hatása függött a narkózis mélységétől, mivel a mély narkózis esetén nem jelentkeztek szignifikáns változások az EEG-ben. Az OKTR hatását csak egy dózisban (500 nmol/patkány) teszteltük, amely az alfa (9-16 Hz) és a béta (16-48 Hz) frekvenciasávokban okozott szignifikáns változásokat. A delta (0-3 Hz) illetve a theta (3-9 Hz) tartományban is megfigyelhető volt egy tendenciózus növekedés, de ez nem volt statisztikailag szignifikáns. Mindkét peptid esetében feltételezhető, hogy hatásuk tovább tartott, mint a regisztrálás időtartama (45 perc az injektálás után), mivel a regisztrációs periódus végén még szignifikáns változások voltak láthatóak az EEG-ben. 2.
Az NPY hatását tesztelő kísérleteinkben a fájdalmas inger minden egyes esetben 5-
10 másodpercig tartó kérgi aktivációt okozott mindkét oldalon. Az NPY és kontroll (só) injekciót kapott féltekék aktivációja között kis különbség volt: az NPY injektált oldal EEGje kevesebb gyors hullámot tartalmazott a farokcsípés kiváltotta kérgi aktivációkor. Az OKTR hatását tesztelő kísérletsorozatunkban az inger hatására, valószínűleg a narkózis mély szintje miatt, az esetek egy részében nem következett be aktiváció. Azokban az esetekben, amikor a farokcsípés hatásos volt, szemmel láthatóan nem különbözött az OKTR-injektált és a kontroll féltekék aktivitása. A peptidek BF-be történő beadása tehát nem befolyásolta a fájdalmas inger agykéregbe való bejutását, egyéb felszálló rendszereken keresztül az információ eljuthatott
83
a talamokortikális és/vagy a bazalo-kortikális neuronkörökhöz, amelyek hatással vannak a kérgi EEG-re. 3.
Krónikus, szabadon mozgó patkányokkal végzett kísérleteink eredményei alapján a
BF-be injektált NPY hatással van a spontán viselkedésre. Az anyagbeadások hatására nem jelentek meg abnormális (például sztereotip) viselkedésmintázatok. Az NPY enyhe-közepes szintű viselkedési változásokat okozott, amelyek gyakran a p <0.05 szignifikanciaszint alatt maradtak. A nyugalmi állapot mennyisége jellegzetes változást mutatott mind a kontroll, mind az NPY-kezeléses felvételekben. Ez alapján a beadást követő 4 órás időszakban három, egymást követő szakaszt definiáltunk. Az első szakaszban (2. félóra) az aktív viselkedési elemek (mozgás, ágaskodás, önápolás) magas szintet értek el. A második szakaszban (3. és 4. félóra) az aktivitási szint lecsökkent, az alvás mennyisége megnőtt. A harmadik szakaszban (5. és 6. félóra) újból megnőtt az aktív viselkedési elemek (önápolás, evés, ivás) mennyisége. Adataink szerint a BF-be adott NPY injekciók globális módon változtatták meg a kérgi aktivációt és az arousal-t, de az így kialakult, fokozott arousal-al járó állapot nem járt együtt fokozott lokomócióval. 4.
Krónikus, szabadon mozgó patkányokon kimutattuk, hogy a BF-be injektált NPY
szignifikáns változást okoz az alvás-ébrenlétben. A három, egymást követő szakasz, amelyeket a viselkedési változások alapján definiáltunk, részben megfigyelhető volt az alvás-ébrenléttel kapcsolatosan is. Az NPY hatására az alvás-ébrenléti paraméterek közepes mértékben változtak. Az 1. szakaszban (2. félóra) viselkedési aktiváció volt látható, amely során az ébrenlét mennyisége nőtt, míg a mély alvásé csökkent. A 2. szakaszban (3. és 4. félóra) a viselkedési aktiváció elmúlt. Ez a változás azonban kevésbé volt egyértelmű az alvás-ébrenlétben. Az ébrenlét (az aktív, a nyugodt és az összesített is) enyhe, nemszignifikáns emelkedést mutatott a 3. félórában, míg csökkenést a 4. félórában. A mély alvás és az összesített lassú hullámú alvás nem szignifikánsan csökkent a 3., és növekedett a 4. félórában. A magasabb dózis szignifikánsan növelte a paradox alvás mennyiségét a 4. órában. A 3. szakaszban az ébrenlét (aktív, nyugodt és összesített is) megnövekedett, míg az alvás (felületes, mély, összesített lassú hullámú és a paradox is) csökkent. A 3. szakaszt követően az alvás csökkent és az ébrenlét fokozódott egészen a világos fázis végéig, tekintet nélkül a kezelésre. A megfigyelt alvás-ébrenléti változások az egyes szakaszok
84
számának a növekedéséből eredtek, az NPY injekciók tehát nem befolyásolták az egyes alvás-ébrenléti epizódok hosszát. A dolgozatban ismertetett kísérletek eredményei alapján arra következtethetünk, hogy az NPY és a SOM lényeges szerepet játszik a BF neuronköreiben. Az NPY beadása a BF-be hatással volt a kérgi EEG-re, az alvás-ébrenlétre és a spontán viselkedésre is. A SOManalóg OKTR a BF-be injektálva szignifikáns változásokat okozott az EEG-ben. Az irodalmi adatok alapján az általunk vizsgált két peptid feltételezhetően a BF GABA-t is tartalmazó interneuronjaiban expresszálódik. Bár kísérleteink direkt bizonyítékot nem szolgáltattak rá, de adataink alapján valószínűnek tűnik, hogy az NPY és a SOM a BF kolinerg sejtjein keresztül lehet hatással a kérgi aktivációval összefüggő funkciókra, így az EEG-re, az alvásra és a viselkedésre. Ezek a peptidek feltételezhetően mind pre-, mind posztszinaptikus mechanizmusokkal képesek befolyásolni a BF egyik, lényeges kimenetét adó „principális” sejttípusát, a kolinerg neuronokat. Más neuronpopulációk szerepe (pl. glutamáterg sejtek) sem zárható ki. Számos alapvető kérdés azonban még nyitott a két peptid BF-beli szerepével kapcsolatosan. Nem ismert, hogy hatással vannak-e nem-kolinerg kéregre vetítő neuronokra. Nem állnak rendelkezésre in vitro adatok arról, hogy az NPY hogyan befolyásolja a BF kolinerg sejtek működését. Nem tudjuk, hogy az NPY és a SOM receptorai a BF-ben pontosan milyen sejteken fejeződnek ki. Kérdéses, hogy az NPY- és a SOM-tartalmú neuronok két különböző vagy esetleg részben átfedő sejtpopulációt alkotnak-e. Talán a legfontosabb kérdés pedig az, hogy pontosan hogyan épülnek fel a BF neuronkörök. Ez utóbbi máig csak részben ismert, a nyitva maradt kérdéseket pedig a jövőbeli vizsgálatok fogják megválaszolni.
85
7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Détári Lászlónak a fáradozásait és a bizalmát, hogy részese lehettem (és lehetek) a tanszéken folyó oktatói és kutatói munkának. Hálával tartozom neki a szakdolgozatom, illetve doktori értekezésem elkészítésével kapcsolatos segítségéért és tanácsaiért. Köszönetet mondanék laborunk volt asszisztensének, Prímás Józsefné Marikának, aki mindig készségesen állt rendelkezésemre bármilyen kérdésben és megosztotta velem a kísérleti állatokkal és anyagbeadásokkal kapcsolatos tudását. Köszönet illeti kolleganőmet, Dr. Hajnik Tündét a mindennapi munkában nyújtott segítségéért. Szeretném megköszönni laborunk volt PhD-hallgatóinak, Dr. Balatoni Balázsnak és Dr. Szentgyörgyi Viktornak, hogy segítségemre voltak a különböző műtéti és adatfeldolgozási eljárások elsajátításában. Köszönöm Gyengési Erikának, hogy segítségemre volt az anatómiai módszerekkel kapcsolatos kérdésekben. Köszönet laborunk volt szakdolgozójának, Henter Tamásnak az oktreotidos kísérletekért és a szövettani feldolgozásért. Szeretném megköszönni Dr. Záborszky Lászlónak, a Rutgers University professzorának szakmai támogatását és a lehetőséget, hogy laboratóriumában tanulmányozhattam a bazális előagy anatómiáját. Köszönet illeti a Tanszék összes dolgozóját segítőkészségükért és tanácsaikért. Végül, de nem utolsósorban nagyon köszönöm családomnak a türelmet és a munkámhoz szükséges stabil hátteret.
86
8. IRODALOMJEGYZÉK 1. Abrahamson, E. E. and Moore, R. Y. (2001) Suprachiasmatic nucleus in the mouse: retinal innervation, intrinsic organization and efferent projections. Brain Res 916, 172-191. 2. Adler, C. H. and Thorpy, M. J. (2005) Sleep issues in Parkinson's disease. Neurology 64, S12-S20. 3. Adrian, E. D. (1950) The electrical activity of the mammalian olfactory bulb. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 2, 377-388. 4. Alam, M. N., Szymusiak, R., Gong, H., King, J., and McGinty, D. (1999) Adenosinergic modulation of rat basal forebrain neurons during sleep and waking: neuronal recording with microdialysis. J Physiol 521 Pt 3, 679-690. 5. Allen, Y. S., Adrian, T. E., Allen, J. M., Tatemoto, K., Crow, T. J., Bloom, S. R., and Polak, J. M. (1983) Neuropeptide Y distribution in the rat brain. Science 221, 877-879. 6. Alloway, C. E., Ogilvie, R. D., and Shapiro, C. M. (1997) The alpha attenuation test: assessing excessive daytime sleepiness in narcolepsy-cataplexy. Sleep 20, 258266. 7. Alonso, A., Faure, M. P., and Beaudet, A. (1994) Neurotensin promotes oscillatory bursting behavior and is internalized in basal forebrain cholinergic neurons. J Neurosci 14, 5778-5792. 8. Anden, N. E., Dahlstrom, A., Fuxe, K., and Larsson, K. (1965) Mapping out of catecholamine and 5-hydroxytryptamine neurons innervating the telencephalon and diencephalon. Life Sci 4, 1275-1279. 9. Andersen, M. L., Nascimento, D. C., Machado, R. B., Roizenblatt, S., Moldofsky, H., and Tufik, S. (2006) Sleep disturbance induced by substance P in mice. Behav Brain Res 167, 212-218. 10. Antonijevic, I. A., Murck, H., Bohlhalter, S., Frieboes, R. M., Holsboer, F., and Steiger, A. (2000) Neuropeptide Y promotes sleep and inhibits ACTH and cortisol release in young men. Neuropharmacology 39, 1474-1481. 11. Aoki, C. and Pickel, V. M. (1989) Neuropeptide Y in the cerebral cortex and the caudate-putamen nuclei: ultrastructural basis for interactions with GABAergic and non-GABAergic neurons. J Neurosci 9, 4333-4354. 12. Armstrong, R. A., Eperjesi, F., and Gilmartin, B. (2002) The application of analysis of variance (ANOVA) to different experimental designs in optometry. Ophthalmic Physiol Opt 22, 248-256. 13. Arnulf, I. (2006) Sleep and wakefulness disturbances in Parkinson's disease. J Neural Transm Suppl 357-360.
87
14. Asanuma, C. and Porter, L. L. (1990) Light and electron microscopic evidence for a GABAergic projection from the caudal basal forebrain to the thalamic reticular nucleus in rats. J Comp Neurol 302, 159-172. 15. Aston-Jones, G. and Bloom, F. E. (1981) Activity of norepinephrine-containing locus coeruleus neurons in behaving rats anticipates fluctuations in the sleep-waking cycle. J Neurosci 1, 876-886. 16. Balasubramaniam, A. A. (1997) Neuropeptide Y family of hormones: receptor subtypes and antagonists. Peptides 18, 445-457. 17. Balatoni, B. and Detari, L. (2003) EEG related neuronal activity in the pedunculopontine tegmental nucleus of urethane anaesthetized rats. Brain Res 959, 304-311. 18. Baskerville, K. A., Chang, H. T., and Herron, P. (1993) Topography of cholinergic afferents from the nucleus basalis of Meynert to representational areas of sensorimotor cortices in the rat. J Comp Neurol 335, 552-562. 19. Bassant, M. H., Simon, A., Poindessous-Jazat, F., Csaba, Z., Epelbaum, J., and Dournaud, P. (2005) Medial septal GABAergic neurons express the somatostatin sst2A receptor: functional consequences on unit firing and hippocampal theta. J Neurosci 25, 2032-2041. 20. Bauer, W., Briner, U., Doepfner, W., Haller, R., Huguenin, R., Marbach, P., Petcher, T. J., and Pless (1982) SMS 201-995: a very potent and selective octapeptide analogue of somatostatin with prolonged action. Life Sci 31, 1133-1140. 21. Beaulieu, C. and Somogyi, P. (1991) Enrichment of cholinergic synaptic terminals on GABAergic neurons and coexistence of immunoreactive GABA and choline acetyltransferase in the same synaptic terminals in the striate cortex of the cat. J Comp Neurol 304, 666-680. 22. Beranek, L., Hajdu, I., Gardi, J., Taishi, P., Obal, F., Jr., and Krueger, J. M. (1999) Central administration of the somatostatin analog octreotide induces captoprilinsensitive sleep responses. Am J Physiol 277, R1297-R1304. 23. Beranek, L., Obal, F., Jr., Taishi, P., Bodosi, B., Laczi, F., and Krueger, J. M. (1997) Changes in rat sleep after single and repeated injections of the long-acting somatostatin analog octreotide. Am J Physiol 273, R1484-R1491. 24. Berger, H. (1929) Über das Elektrenkephalogramm des Menschen. Archive für Psychiatrie und Nervenkrankheiten 87, 527-570. 25. Berger, R. J. and Phillips, N. H. (1988) Comparative aspects of energy metabolism, body temperature and sleep. Acta Physiol Scand Suppl 574, 21-27. 26. Berntson, G. G., Shafi, R., and Sarter, M. (2002) Specific contributions of the basal forebrain corticopetal cholinergic system to electroencephalographic activity and sleep/waking behaviour. Eur J Neurosci 16, 2453-2461.
88
27. Berridge, C. W. and Foote, S. L. (1991) Effects of locus coeruleus activation on electroencephalographic activity in neocortex and hippocampus. J Neurosci 11, 3135-3145. 28. Bertherat, J., Bluet-Pajot, M. T., and Epelbaum, J. (1995) Neuroendocrine regulation of growth hormone. Eur J Endocrinol 132, 12-24. 29. Bertram, E. H., Williamson, J. M., Cornett, J. F., Spradlin, S., and Chen, Z. F. (1997) Design and construction of a long-term continuous video-EEG monitoring unit for simultaneous recording of multiple small animals. Brain Res Brain Res Protoc 2, 85-97. 30. Bevan, M. D., Magill, P. J., Terman, D., Bolam, J. P., and Wilson, C. J. (2002) Move to the rhythm: oscillations in the subthalamic nucleus-external globus pallidus network. Trends Neurosci 25, 525-531. 31. Blanco-Centurion, C., Gerashchenko, D., Salin-Pascual, R. J., and Shiromani, P. J. (2004) Effects of hypocretin2-saporin and antidopamine-beta-hydroxylase-saporin neurotoxic lesions of the dorsolateral pons on sleep and muscle tone. Eur J Neurosci 19, 2741-2752. 32. Blanco-Centurion, C., Xu, M., Murillo-Rodriguez, E., Gerashchenko, D., Shiromani, A. M., Salin-Pascual, R. J., Hof, P. R., and Shiromani, P. J. (2006a) Adenosine and sleep homeostasis in the Basal forebrain. J Neurosci 26, 8092-8100. 33. Blanco-Centurion, C. A., Shiromani, A., Winston, E., and Shiromani, P. J. (2006b) Effects of hypocretin-1 in 192-IgG-saporin-lesioned rats. Eur J Neurosci 24, 20842088. 34. Blethyn, K. L., Hughes, S. W., Toth, T. I., Cope, D. W., and Crunelli, V. (2006) Neuronal basis of the slow (<1 Hz) oscillation in neurons of the nucleus reticularis thalami in vitro. J Neurosci 26, 2474-2486. 35. Bluet-Pajot, M. T., Epelbaum, J., Gourdji, D., Hammond, C., and Kordon, C. (1998) Hypothalamic and hypophyseal regulation of growth hormone secretion. Cell Mol Neurobiol 18, 101-123. 36. Bolam, J. P., Ingham, C. A., Izzo, P. N., Levey, A. I., Rye, D. B., Smith, A. D., and Wainer, B. H. (1986) Substance P-containing terminals in synaptic contact with cholinergic neurons in the neostriatum and basal forebrain: a double immunocytochemical study in the rat. Brain Res 397, 279-289. 37. Boller, F. and Forette, F. (1989) Alzheimer's disease and THA: a review of the cholinergic theory and of preliminary results. Biomed Pharmacother 43, 487-491. 38. Borbely, A. A. (1982) A two process model of sleep regulation. Hum Neurobiol 1, 195-204. 39. Borbely, A. A. (1998) Processes underlying sleep regulation. Horm Res 49, 114117.
89
40. Borbely, A. A. and Tobler, I. (1989) Endogenous sleep-promoting substances and sleep regulation. Physiol Rev 69, 605-670. 41. Bradford, H. F., Ward, H. K., and Thomas, A. J. (1978) Glutamine--a major substrate for nerve endings. J Neurochem 30, 1453-1459. 42. Bradley, P. and Elkes, N. (1953) A technique for recording the electrical activity of the brain in the conscious animal. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 5, 451-456. 43. Bremer, F. (1935) Cerveau isolee et physiologie du sommeil. C R Soc Biol 118, 1235-1241. 44. Brown, R. E., Sergeeva, O., Eriksson, K. S., and Haas, H. L. (2001) Orexin A excites serotonergic neurons in the dorsal raphe nucleus of the rat. Neuropharmacology 40, 457-459. 45. Brunelli, M., Magni, F., Moruzzi, G., and Musumeci, D. (1972) Brain stem influences on waking and sleep behaviors in the pigeon. Arch Ital Biol 110, 285321. 46. Burgunder, J. M. and Young, W. S., III (1989) Neurons with neurokinin B mRNA in the rat magnocellular basal nucleus: distribution, projection and colocalization studies. J Chem Neuroanat 2, 239-251. 47. Buzsaki, G., Bickford, R. G., Ponomareff, G., Thal, L. J., Mandel, R., and Gage, F. H. (1988) Nucleus basalis and thalamic control of neocortical activity in the freely moving rat. J Neurosci 8, 4007-4026. 48. Buzsaki, G. and Traub, R. D. (1997) Physiological Basis of EEG Activity. In: Epilepsy: A Comprehensive Textbook, pp. 819-830. Eds J. Jr. Engel, T. A. Pedley. Lippincott-Raven: Philadelphia. 49. Cape, E. G. and Jones, B. E. (1998) Differential modulation of high-frequency gamma-electroencephalogram activity and sleep-wake state by noradrenaline and serotonin microinjections into the region of cholinergic basalis neurons. J Neurosci 18, 2653-2666. 50. Cape, E. G., Manns, I. D., Alonso, A., Beaudet, A., and Jones, B. E. (2000) Neurotensin-induced bursting of cholinergic basal forebrain neurons promotes gamma and theta cortical activity together with waking and paradoxical sleep. J Neurosci 20, 8452-8461. 51. Cassone, V. M., Chesworth, M. J., and Armstrong, S. M. (1986) Entrainment of rat circadian rhythms by daily injection of melatonin depends upon the hypothalamic suprachiasmatic nuclei. Physiol Behav 36, 1111-1121. 52. Caton, R. (1875) The elecrtic currents of the brain. Br Med J 2, 278. 53. Cervia, D. and Bagnoli, P. (2007) An update on somatostatin receptor signaling in native systems and new insights on their pathophysiology. Pharmacol Ther 116, 322-341. 90
54. Cespuglio, R., Faradji, H., and Jouvet, M. (1983) [Voltammetric detection of extracellular 5-hydroxyindole compounds at the level of cell bodies and the terminals of the raphe system: variations during the wake-sleep cycle in the rat in chronic experiments]. C R Seances Acad Sci III 296, 611-616. 55. Chedotal, A., Umbriaco, D., Descarries, L., Hartman, B. K., and Hamel, E. (1994) Light and electron microscopic immunocytochemical analysis of the neurovascular relationships of choline acetyltransferase and vasoactive intestinal polypeptide nerve terminals in the rat cerebral cortex. J Comp Neurol 343, 57-71. 56. Chemelli, R. M., Willie, J. T., Sinton, C. M., Elmquist, J. K., Scammell, T., Lee, C., Richardson, J. A., Williams, S. C., Xiong, Y., Kisanuki, Y., Fitch, T. E., Nakazato, M., Hammer, R. E., Saper, C. B., and Yanagisawa, M. (1999a) Narcolepsy in orexin knockout mice: molecular genetics of sleep regulation. Cell 98, 437-451. 57. Chemelli, R. M., Willie, J. T., Sinton, C. M., Elmquist, J. K., Scammell, T., Lee, C., Richardson, J. A., Williams, S. C., Xiong, Y., Kisanuki, Y., Fitch, T. E., Nakazato, M., Hammer, R. E., Saper, C. B., and Yanagisawa, M. (1999b) Narcolepsy in orexin knockout mice: molecular genetics of sleep regulation. Cell 98, 437-451. 58. Chen, L. W., Wei, L. C., Liu, H. L., Ding, Y. Q., Zhang, H., Rao, Z. R., Ju, G., and Chan, Y. S. (2001a) Cholinergic neurons expressing neuromedin K receptor (NK3) in the basal forebrain of the rat: a double immunofluorescence study. Neuroscience 103, 413-422. 59. Chen, L. W., Wei, L. C., Liu, H. L., Qiu, Y., and Chan, Y. S. (2001b) Cholinergic neurons expressing substance P receptor (NK(1)) in the basal forebrain of the rat: a double immunocytochemical study. Brain Res 904, 161-166. 60. Chou, T. C., Bjorkum, A. A., Gaus, S. E., Lu, J., Scammell, T. E., and Saper, C. B. (2002) Afferents to the ventrolateral preoptic nucleus. J Neurosci 22, 977-990. 61. Cirelli, C., Pompeiano, M., and Tononi, G. (1996) Neuronal gene expression in the waking state: a role for the locus coeruleus. Science 274, 1211-1215. 62. Cirelli, C. and Tononi, G. (1998) Differences in gene expression between sleep and waking as revealed by mRNA differential display. Brain Res Mol Brain Res 56, 293-305. 63. Clements, J. R. and Grant, S. (1990) Glutamate-like immunoreactivity in neurons of the laterodorsal tegmental and pedunculopontine nuclei in the rat. Neurosci Lett 120, 70-73. 64. Corp, E. S., Melville, L. D., Greenberg, D., Gibbs, J., and Smith, G. P. (1990) Effect of fourth ventricular neuropeptide Y and peptide YY on ingestive and other behaviors. Am J Physiol 259, R317-R323. 65. Counts, S. E., Chen, E. Y., Che, S., Ikonomovic, M. D., Wuu, J., Ginsberg, S. D., Dekosky, S. T., and Mufson, E. J. (2006) Galanin fiber hypertrophy within the cholinergic nucleus basalis during the progression of Alzheimer's disease. Dement Geriatr Cogn Disord 21, 205-214.
91
66. Czisch, M., Wetter, T. C., Kaufmann, C., Pollmacher, T., Holsboer, F., and Auer, D. P. (2002) Altered processing of acoustic stimuli during sleep: reduced auditory activation and visual deactivation detected by a combined fMRI/EEG study. Neuroimage 16, 251-258. 67. Dahlstrom, A., Fuxe, K., Olson, L., and Ungerstedt, U. (1965) On the distribution and possible function of monamine nerve terminals in the olfactory bulb of the rabbit. Life Sci 4, 2071-2074. 68. Daly, J. W., Bruns, R. F., and Snyder, S. H. (1981) Adenosine receptors in the central nervous system: relationship to the central actions of methylxanthines. Life Sci 28, 2083-2097. 69. Danguir, J. and Saint-Hilaire, K. S. (1989) Reversal of desipramine-induced suppression of paradoxical sleep by a long-acting somatostatin analogue (octreotide) in rats. Neurosci Lett 98, 154-158. 70. Date, Y., Mondal, M. S., Matsukura, S., and Nakazato, M. (2000) Distribution of orexin-A and orexin-B (hypocretins) in the rat spinal cord. Neurosci Lett 288, 8790. 71. Datta, S. (1995) Neuronal activity in the peribrachial area: relationship to behavioral state control. Neurosci Biobehav Rev 19, 67-84. 72. Datta, S. and Siwek, D. F. (2002) Single cell activity patterns of pedunculopontine tegmentum neurons across the sleep-wake cycle in the freely moving rats. J Neurosci Res 70, 611-621. 73. Dawson, T. M., Bredt, D. S., Fotuhi, M., Hwang, P. M., and Snyder, S. H. (1991) Nitric oxide synthase and neuronal NADPH diaphorase are identical in brain and peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 7797-7801. 74. de Lecea, L., Kilduff, T. S., Peyron, C., Gao, X., Foye, P. E., Danielson, P. E., Fukuhara, C., Battenberg, E. L., Gautvik, V. T., Bartlett, F. S., Frankel, W. N., van den Pol, A. N., Bloom, F. E., Gautvik, K. M., and Sutcliffe, J. G. (1998) The hypocretins: hypothalamus-specific peptides with neuroexcitatory activity. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 322-327. 75. Deboer, T., Vansteensel, M. J., Detari, L., and Meijer, J. H. (2003) Sleep states alter activity of suprachiasmatic nucleus neurons. Nat Neurosci 6, 1086-1090. 76. Dement, W. (1958) The occurrence of low voltage, fast, electroencephalogram patterns during behavioral sleep in the cat. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 10, 291-296. 77. Denoyer, M., Sallanon, M., Kitahama, K., Aubert, C., and Jouvet, M. (1989) Reversibility of para-chlorophenylalanine-induced insomnia by intrahypothalamic microinjection of L-5-hydroxytryptophan. Neuroscience 28, 83-94. 78. Descarries, L., Gisiger, V., and Steriade, M. (1997) Diffuse transmission by acetylcholine in the CNS. Prog Neurobiol 53, 603-625.
92
79. Detari, L., Juhasz, G., and Kukorelli, T. (1984) Firing properties of cat basal forebrain neurones during sleep-wakefulness cycle. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 58, 362-368. 80. Detari, L., Juhasz, G., and Kukorelli, T. (1987) Neuronal firing in the pallidal region: firing patterns during sleep-wakefulness cycle in cats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 67, 159-166. 81. Detari, L., Kukorelli, T., and Hajnik, T. (1993) Long-term sleep deprivation by hypothalamic stimulation in cats. J Neurosci Methods 49, 225-230. 82. Detari, L., Rasmusson, D. D., and Semba, K. (1997) Phasic relationship between the activity of basal forebrain neurons and cortical EEG in urethane-anesthetized rat. Brain Res 759, 112-121. 83. Detari, L., Rasmusson, D. D., and Semba, K. (1999a) The role of basal forebrain neurons in tonic and phasic activation of the cerebral cortex. Prog Neurobiol 58, 249-277. 84. Detari, L., Szentgyorgyi, V., Hajnik, T., Szenasi, G., Gacsalyi, I., and Kukorelli, T. (1999b) Differential EEG effects of the anxiolytic drugs, deramciclane (EGIS3886), ritanserin and chlordiazepoxide in rats. Psychopharmacology (Berl) 142, 318-326. 85. Deurveilher, S., Burns, J., and Semba, K. (2002) Indirect projections from the suprachiasmatic nucleus to the ventrolateral preoptic nucleus: a dual tract-tracing study in rat. Eur J Neurosci 16, 1195-1213. 86. Dewasmes, G., Duchamp, C., and Minaire, Y. (1989) Sleep changes in fasting rats. Physiol Behav 46, 179-184. 87. Dournaud, P., Slama, A., Beaudet, A., and Epelbaum, J. (2000) Somatostatin receptors. In: Peptide Receptors. Part I. Handbook of Chemical Neuroanatomy., pp. 1-43. Elsevier: Amsterdam. 88. Dringenberg, H. C. and Olmstead, M. C. (2003) Integrated contributions of basal forebrain and thalamus to neocortical activation elicited by pedunculopontine tegmental stimulation in urethane-anesthetized rats. Neuroscience 119, 839-853. 89. Drucker-Colin, R. R., Spanis, C. W., Hunyadi, J., Sassin, J. F., and McGaugh, J. L. (1975) Growth hormone effects on sleep and wakefulness in the rat. Neuroendocrinology 18, 1-8. 90. Duque, A., Balatoni, B., Detari, L., and Zaborszky, L. (2000) EEG correlation of the discharge properties of identified neurons in the basal forebrain. J Neurophysiol 84, 1627-1635. 91. Eckenstein, F. P., Baughman, R. W., and Quinn, J. (1988) An anatomical study of cholinergic innervation in rat cerebral cortex. Neuroscience 25, 457-474.
93
92. Eggermann, E., Serafin, M., Bayer, L., Machard, D., Saint-Mleux, B., Jones, B. E., and Muhlethaler, M. (2001) Orexins/hypocretins excite basal forebrain cholinergic neurones. Neuroscience 108, 177-181. 93. Eguibar, J. R. and Moyaho, A. (1997) Inhibition of grooming by pilocarpine differs in high- and low-yawning sublines of Sprague-Dawley rats. Pharmacol Biochem Behav 58, 317-322. 94. Ehlers, C. L., Reed, T. K., and Henriksen, S. J. (1986) Effects of corticotropinreleasing factor and growth hormone-releasing factor on sleep and activity in rats. Neuroendocrinology 42, 467-474. 95. Ehlers, C. L., Somes, C., Lopez, A., Kirby, D., and Rivier, J. E. (1997) Electrophysiological actions of neuropeptide Y and its analogs: new measures for anxiolytic therapy? Neuropsychopharmacology 17, 34-43. 96. Elul, R. (1971) The genesis of the EEG. Int Rev Neurobiol 15, 227-272. 97. Epelbaum, J. (1986) Somatostatin in the central nervous system: physiology and pathological modifications. Prog Neurobiol 27, 63-100. 98. Eriksson, K. S., Sergeeva, O., Brown, R. E., and Haas, H. L. (2001) Orexin/hypocretin excites the histaminergic neurons of the tuberomammillary nucleus. J Neurosci 21, 9273-9279. 99. Esclapez, M. and Houser, C. R. (1995) Somatostatin neurons are a subpopulation of GABA neurons in the rat dentate gyrus: evidence from colocalization of preprosomatostatin and glutamate decarboxylase messenger RNAs. Neuroscience 64, 339-355. 100. Espana, R. A., Baldo, B. A., Kelley, A. E., and Berridge, C. W. (2001) Wakepromoting and sleep-suppressing actions of hypocretin (orexin): basal forebrain sites of action. Neuroscience 106, 699-715. 101. Espana, R. A., Reis, K. M., Valentino, R. J., and Berridge, C. W. (2005) Organization of hypocretin/orexin efferents to locus coeruleus and basal forebrain arousal-related structures. J Comp Neurol 481, 160-178. 102. Everitt, B. J., Hokfelt, T., Terenius, L., Tatemoto, K., Mutt, V., and Goldstein, M. (1984) Differential co-existence of neuropeptide Y (NPY)-like immunoreactivity with catecholamines in the central nervous system of the rat. Neuroscience 11, 443462. 103. Everson, C. A., Bergmann, B. M., and Rechtschaffen, A. (1989a) Sleep deprivation in the rat: III. Total sleep deprivation. Sleep 12, 13-21. 104. Everson, C. A., Gilliland, M. A., Kushida, C. A., Pilcher, J. J., Fang, V. S., Refetoff, S., Bergmann, B. M., and Rechtschaffen, A. (1989b) Sleep deprivation in the rat: IX. Recovery. Sleep 12, 60-67. 105. Fadel, J., Pasumarthi, R., and Reznikov, L. R. (2005) Stimulation of cortical acetylcholine release by orexin A. Neuroscience 130, 541-547. 94
106. Feinberg, I. (1974) Changes in sleep cycle patterns with age. J Psychiatr Res 10, 283-306. 107. Feldman, S. and Waller, H. (1962) Dissociation of electrocortical activation and behavioural arousal. Nature 196, 1320-1322. 108. Foote, S. L., Bloom, F. E., and Aston-Jones, G. (1983) Nucleus locus ceruleus: new evidence of anatomical and physiological specificity. Physiol Rev 63, 844-914. 109. Fort, P., Khateb, A., Pegna, A., Muhlethaler, M., and Jones, B. E. (1995) Noradrenergic modulation of cholinergic nucleus basalis neurons demonstrated by in vitro pharmacological and immunohistochemical evidence in the guinea-pig brain. Eur J Neurosci 7, 1502-1511. 110. Fremeau, R. T., Jr., Troyer, M. D., Pahner, I., Nygaard, G. O., Tran, C. H., Reimer, R. J., Bellocchio, E. E., Fortin, D., Storm-Mathisen, J., and Edwards, R. H. (2001) The expression of vesicular glutamate transporters defines two classes of excitatory synapse. Neuron 31, 247-260. 111. Freund, T. F. and Meskenaite, V. (1992) gamma-Aminobutyric acid-containing basal forebrain neurons innervate inhibitory interneurons in the neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 738-742. 112. Friedman, A. H. and Walker, C. A. (1968) Circadian rhythms in rat mid-brain and caudate nucleus biogenic amine levels. J Physiol 197, 77-85. 113. Fu, L. Y., Acuna-Goycolea, C., and van den Pol, A. N. (2004) Neuropeptide Y inhibits hypocretin/orexin neurons by multiple presynaptic and postsynaptic mechanisms: tonic depression of the hypothalamic arousal system. J Neurosci 24, 8741-8751. 114. Fuller, P. M., Gooley, J. J., and Saper, C. B. (2006) Neurobiology of the sleep-wake cycle: sleep architecture, circadian regulation, and regulatory feedback. J Biol Rhythms 21, 482-493. 115. Furuta, T. and Kaneko, T. (2006) Third pathway in the cortico-basal ganglia loop: Neurokinin B-producing striatal neurons modulate cortical activity via striatoinnominato-cortical projection. Neurosci Res 54, 1-10. 116. Gaykema, R. P. and Zaborszky, L. (1996) Direct catecholaminergic-cholinergic interactions in the basal forebrain. II. Substantia nigra-ventral tegmental area projections to cholinergic neurons. J Comp Neurol 374, 555-577. 117. Gaykema, R. P. and Zaborszky, L. (1997) Parvalbumin-containing neurons in the basal forebrain receive direct input from the substantia nigra-ventral tegmental area. Brain Res 747, 173-179. 118. Geula, C., Schatz, C. R., and Mesulam, M. M. (1993) Differential localization of NADPH-diaphorase and calbindin-D28k within the cholinergic neurons of the basal forebrain, striatum and brainstem in the rat, monkey, baboon and human. Neuroscience 54, 461-476.
95
119. Giacobini, E. (2003) Cholinesterases: new roles in brain function and in Alzheimer's disease. Neurochem Res 28, 515-522. 120. Givens, B. and Sarter, M. (1997) Modulation of cognitive processes by transsynaptic activation of the basal forebrain. Behav Brain Res 84, 1-22. 121. Gritti, I., Mainville, L., and Jones, B. E. (1993) Codistribution of. J Comp Neurol 329, 438-457. 122. Gritti, I., Mainville, L., Mancia, M., and Jones, B. E. (1997) GABAergic and other noncholinergic basal forebrain neurons, together with cholinergic neurons, project to the mesocortex and isocortex in the rat. J Comp Neurol 383, 163-177. 123. Grove, E. A. (1988) Efferent connections of the substantia innominata in the rat. J Comp Neurol 277, 347-364. 124. Guenounou, M., Vacheron, F., and Nauciel, C. (1985) Interleukin 1, a mediator of immunoadjuvant peptidoglycans. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 8, 273-284. 125. Gulyas, A. I., Hajos, N., Katona, I., and Freund, T. F. (2003) Interneurons are the local targets of hippocampal inhibitory cells which project to the medial septum. Eur J Neurosci 17, 1861-1872. 126. Gustafson, E. L., Smith, K. E., Durkin, M. M., Walker, M. W., Gerald, C., Weinshank, R., and Branchek, T. A. (1997) Distribution of the neuropeptide Y Y2 receptor mRNA in rat central nervous system. Brain Res Mol Brain Res 46, 223235. 127. Gyengesi, E., Rommer, E., and Zaborszky, L. Prefrontal input to the basal forebrain: possible connection with the somatostatin and neuropeptide Y containing local interneurons. 2007. Neuroscience Meeting, San Diego. 2007. Ref Type: Conference Proceeding 128. Gyengesi, E., Zaborszky, L., and Detari, L. (2008) The effect of prefrontal stimulation on the firing of basal forebrain neurons in urethane anesthetized rat. Brain Res Bull 75, 570-580. 129. Hagan, J. J., Leslie, R. A., Patel, S., Evans, M. L., Wattam, T. A., Holmes, S., Benham, C. D., Taylor, S. G., Routledge, C., Hemmati, P., Munton, R. P., Ashmeade, T. E., Shah, A. S., Hatcher, J. P., Hatcher, P. D., Jones, D. N., Smith, M. I., Piper, D. C., Hunter, A. J., Porter, R. A., and Upton, N. (1999) Orexin A activates locus coeruleus cell firing and increases arousal in the rat. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 10911-10916. 130. Hajdu, I., Szentirmai, E., Obal, F., Jr., and Krueger, J. M. (2003) Different brain structures mediate drinking and sleep suppression elicited by the somatostatin analog, octreotide, in rats. Brain Res 994, 115-123. 131. Hajszan, T., Alreja, M., and Leranth, C. (2004) Intrinsic vesicular glutamate transporter 2-immunoreactive input to septohippocampal parvalbumin-containing neurons: novel glutamatergic local circuit cells. Hippocampus 14, 499-509.
96
132. Hajszan, T. and Zaborszky, L. (2002) Direct catecholaminergic-cholinergic interactions in the basal forebrain. III. Adrenergic innervation of choline acetyltransferase-containing neurons in the rat. J Comp Neurol 449, 141-157. 133. Hallanger, A. E., Levey, A. I., Lee, H. J., Rye, D. B., and Wainer, B. H. (1987a) The origins of cholinergic and other subcortical afferents to the thalamus in the rat. J Comp Neurol 262, 105-124. 134. Hallanger, A. E., Levey, A. I., Lee, H. J., Rye, D. B., and Wainer, B. H. (1987b) The origins of cholinergic and other subcortical afferents to the thalamus in the rat. J Comp Neurol 262, 105-124. 135. Hallanger, A. E. and Wainer, B. H. (1988) Ultrastructure of ChAT-immunoreactive synaptic terminals in the thalamic reticular nucleus of the rat. J Comp Neurol 278, 486-497. 136. Hara, J., Beuckmann, C. T., Nambu, T., Willie, J. T., Chemelli, R. M., Sinton, C. M., Sugiyama, F., Yagami, K., Goto, K., Yanagisawa, M., and Sakurai, T. (2001) Genetic ablation of orexin neurons in mice results in narcolepsy, hypophagia, and obesity. Neuron 30, 345-354. 137. Harrington, M. E. (1997) The ventral lateral geniculate nucleus and the intergeniculate leaflet: interrelated structures in the visual and circadian systems. Neurosci Biobehav Rev 21, 705-727. 138. Hastings, J. A., McClure-Sharp, J. M., and Morris, M. J. (2001) NPY Y1 receptors exert opposite effects on corticotropin releasing factor and noradrenaline overflow from the rat hypothalamus in vitro. Brain Res 890, 32-37. 139. Hecker, S. and Mesulam, M. M. (1994) Two types of cholinergic projections to the rat amygdala. Neuroscience 60, 383-397. 140. Heilig, M. and Murison, R. (1987) Intracerebroventricular neuropeptide Y suppresses open field and home cage activity in the rat. Regul Pept 19, 221-231. 141. Heilig, M., Vecsei, L., Wahlestedt, C., Alling, C., and Widerlov, E. (1990) Effects of centrally administered neuropeptide Y (NPY) and NPY13-36 on the brain monoaminergic systems of the rat. J Neural Transm Gen Sect 79, 193-208. 142. Heimer, L., Zahm, D. S., and Schmued, L. C. (1990) The basal forebrain projection to the region of the nuclei gemini in the rat; a combined light and electron microscopic study employing horseradish peroxidase, fluorescent tracers and Phaseolus vulgaris-leucoagglutinin. Neuroscience 34, 707-731. 143. Held, K., Antonijevic, I., Murck, H., Kuenzel, H., and Steiger, A. (2006) Neuropeptide Y (NPY) shortens sleep latency but does not suppress ACTH and cortisol in depressed patients and normal controls. Psychoneuroendocrinology 31, 100-107. 144. Hendry, S. H., Jones, E. G., DeFelipe, J., Schmechel, D., Brandon, C., and Emson, P. C. (1984) Neuropeptide-containing neurons of the cerebral cortex are also GABAergic. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 6526-6530. 97
145. Henny, P. and Jones, B. E. (2006) Innervation of orexin/hypocretin neurons by GABAergic, glutamatergic or cholinergic basal forebrain terminals evidenced by immunostaining for presynaptic vesicular transporter and postsynaptic scaffolding proteins. J Comp Neurol 499, 645-661. 146. Hervieu, G. and Emson, P. C. (1998) The localization of somatostatin receptor 1 (sst1) immunoreactivity in the rat brain using an N-terminal specific antibody. Neuroscience 85, 1263-1284. 147. Hilakivi, I. (1987) Biogenic amines in the regulation of wakefulness and sleep. Med Biol 65, 97-104. 148. Hobson, J. A. (1992) Sleep and dreaming: induction and mediation of REM sleep by cholinergic mechanisms. Curr Opin Neurobiol 2, 759-763. 149. Hobson, J. A. (2005) Sleep is of the brain, by the brain and for the brain. Nature 437, 1254-1256. 150. Hobson, J. A., Datta, S., Calvo, J. M., and Quattrochi, J. (1993) Acetylcholine as a brain state modulator: triggering and long-term regulation of REM sleep. Prog Brain Res 98, 389-404. 151. Hokfelt, T., Broberger, C., Xu, Z. Q., Sergeyev, V., Ubink, R., and Diez, M. (2000) Neuropeptides--an overview. Neuropharmacology 39, 1337-1356. 152. Horvath, T. L., Diano, S., and van den Pol, A. N. (1999) Synaptic interaction between hypocretin (orexin) and neuropeptide Y cells in the rodent and primate hypothalamus: a novel circuit implicated in metabolic and endocrine regulations. J Neurosci 19, 1072-1087. 153. Houdouin, F., Cespuglio, R., and Jouvet, M. (1991) Effects induced by the electrical stimulation of the nucleus raphe dorsalis upon hypothalamic release of 5hydroxyindole compounds and sleep parameters in the rat. Brain Res 565, 48-56. 154. Houser, C. R., Crawford, G. D., Salvaterra, P. M., and Vaughn, J. E. (1985) Immunocytochemical localization of choline acetyltransferase in rat cerebral cortex: a study of cholinergic neurons and synapses. J Comp Neurol 234, 17-34. 155. Hoyer, D., Bell, G. I., Berelowitz, M., Epelbaum, J., Feniuk, W., Humphrey, P. P., O'Carroll, A. M., Patel, Y. C., Schonbrunn, A., Taylor, J. E., and . (1995) Classification and nomenclature of somatostatin receptors. Trends Pharmacol Sci 16, 86-88. 156. Huang, Z. L., Qu, W. M., Li, W. D., Mochizuki, T., Eguchi, N., Watanabe, T., Urade, Y., and Hayaishi, O. (2001) Arousal effect of orexin A depends on activation of the histaminergic system. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 9965-9970. 157. Hur, E. E. and Zaborszky, L. (2005) Vglut2 afferents to the medial prefrontal and primary somatosensory cortices: a combined retrograde tracing in situ hybridization. J Comp Neurol 483, 351-373.
98
158. Ida, T., Nakahara, K., Katayama, T., Murakami, N., and Nakazato, M. (1999) Effect of lateral cerebroventricular injection of the appetite-stimulating neuropeptide, orexin and neuropeptide Y, on the various behavioral activities of rats. Brain Res 821, 526-529. 159. Idzikowski, C. (1984) Sleep and memory. Br J Psychol 75 ( Pt 4), 439-449. 160. Illes, P., Finta, E. P., and Nieber, K. (1993) Neuropeptide Y potentiates via Y2receptors the inhibitory effect of noradrenaline in rat locus coeruleus neurones. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 348, 546-548. 161. Inglis, W. L., Olmstead, M. C., and Robbins, T. W. (2000) Pedunculopontine tegmental nucleus lesions impair stimulus--reward learning in autoshaping and conditioned reinforcement paradigms. Behav Neurosci 114, 285-294. 162. Ishizuka, T., Nomura, S., Hosoda, H., Kangawa, K., Watanabe, T., and Yamatodani, A. (2006) A role of the histaminergic system for the control of feeding by orexigenic peptides. Physiol Behav 89, 295-300. 163. Jahnsen, H. and Llinas, R. (1984) Electrophysiological properties of guinea-pig thalamic neurones: an in vitro study. J Physiol 349, 205-226. 164. Jhamandas, J. H., Harris, K. H., MacTavish, D., and Jassar, B. S. (2002) Novel excitatory actions of galanin on rat cholinergic basal forebrain neurons: implications for its role in Alzheimer's disease. J Neurophysiol 87, 696-704. 165. John, J., Wu, M. F., Boehmer, L. N., and Siegel, J. M. (2004) Cataplexy-active neurons in the hypothalamus: implications for the role of histamine in sleep and waking behavior. Neuron 42, 619-634. 166. Johnson, R. F., Moore, R. Y., and Morin, L. P. (1988) Loss of entrainment and anatomical plasticity after lesions of the hamster retinohypothalamic tract. Brain Res 460, 297-313. 167. Jolicoeur, F. B., Bouali, S. M., Fournier, A., and St Pierre, S. (1995) Mapping of hypothalamic sites involved in the effects of NPY on body temperature and food intake. Brain Res Bull 36, 125-129. 168. Jolicoeur, F. B., Michaud, J. N., Rivest, R., Menard, D., Gaudin, D., Fournier, A., and St Pierre, S. (1991) Neurobehavioral profile of neuropeptide Y. Brain Res Bull 26, 265-268. 169. Jolkkonen, E., Miettinen, R., Pikkarainen, M., and Pitkanen, A. (2002) Projections from the amygdaloid complex to the magnocellular cholinergic basal forebrain in rat. Neuroscience 111, 133-149. 170. Jones, B. E. (2004) Activity, modulation and role of basal forebrain cholinergic neurons innervating the cerebral cortex. Prog Brain Res 145, 157-169. 171. Jouvet, M. (1967) Mechanisms of the states of sleep: a neuropharmacological approach. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis 45, 86-126.
99
172. Jouvet, M. (1972) The role of monoamines and acetylcholine-containing neurons in the regulation of the sleep-waking cycle. Ergeb Physiol 64, 166-307. 173. Jouvet, M. (1992) Le sommeil et le réve. Février. 174. Jouvet, M. (1999) Sleep and serotonin: an unfinished story. Neuropsychopharmacology 21, 24S-27S. 175. Jouvet, M. and Pujol, J. F. (1972) [Role of monoamines in the regulation of alertness. Neurophysiological and biochemical study]. Rev Neurol (Paris) 127, 115138. 176. Kalivas, P. W. and Nakamura, M. (1999) Neural systems for behavioral activation and reward. Curr Opin Neurobiol 9, 223-227. 177. Kanai, T. and Szerb, J. C. (1965) Mesencephalic reticular activating system and cortical acetylcholine output. Nature 205, 80-82. 178. Kapas, L., Obal, F., Jr., Book, A. A., Schweitzer, J. B., Wiley, R. G., and Krueger, J. M. (1996) The effects of immunolesions of nerve growth factor-receptive neurons by 192 IgG-saporin on sleep. Brain Res 712, 53-59. 179. Kaplan, B. J. (1985) The epileptic nature of rodent electrocortical polyspiking is still unproven. Exp Neurol 88, 425-436. 180. Kask, K., Langel, U., and Bartfai, T. (1995) Galanin--a neuropeptide with inhibitory actions. Cell Mol Neurobiol 15, 653-673. 181. Katakami, H., Downs, T. R., and Frohman, L. A. (1988) Inhibitory effect of hypothalamic medial preoptic area somatostatin on growth hormone-releasing factor in the rat. Endocrinology 123, 1103-1109. 182. Katner, S. N., Slawecki, C. J., and Ehlers, C. L. (2002) Neuropeptide Y administration into the amygdala does not affect ethanol consumption. Alcohol 28, 29-38. 183. Katz, R. J. and Roth, K. A. (1979) Stress induced grooming in the rat--an endorphin mediated syndrome. Neurosci Lett 13, 209-212. 184. Kavanau, J. L. (1997) Origin and evolution of sleep: roles of vision and endothermy. Brain Res Bull 42, 245-264. 185. Khateb, A., Fort, P., Alonso, A., Jones, B. E., and Muhlethaler, M. (1993) Pharmacological and immunohistochemical evidence for serotonergic modulation of cholinergic nucleus basalis neurons. Eur J Neurosci 5, 541-547. 186. Khateb, A., Fort, P., Williams, S., Serafin, M., Jones, B. E., and Muhlethaler, M. (1997) Modulation of cholinergic nucleus basalis neurons by acetylcholine and Nmethyl-D-aspartate. Neuroscience 81, 47-55.
100
187. KHAZAN, N. and Sawyer, C. H. (1963) "REBOUND" RECOVERY FROM DEPRIVATION OF PARADOXICAL SLEEP IN THE RABBIT. Proc Soc Exp Biol Med 114, 536-539. 188. Kilduff, T. S. and Peyron, C. (2000) The hypocretin/orexin ligand-receptor system: implications for sleep and sleep disorders. Trends Neurosci 23, 359-365. 189. King, M. P. and Angelakos, E. T. (1973) Differentiation of noradrenaline and adrenaline containing cells in the adrenal medulla by the trihydroxyindole histochemical reaction. Acta Histochem 45, 61-70. 190. Kitahama, K., Sallanon, M., Lin, J. S., Maeda, T., and Jouvet, M. (1989) Type B monoamine-oxidase-containing cells and fibers in the cat hypothalamus demonstrated by an improved enzyme histochemical method. J Comp Neurol 285, 218-230. 191. Kiyashchenko, L. I., Mileykovskiy, B. Y., Maidment, N., Lam, H. A., Wu, M. F., John, J., Peever, J., and Siegel, J. M. (2002) Release of hypocretin (orexin) during waking and sleep states. J Neurosci 22, 5282-5286. 192. Klein, D. C. and Weller, J. L. (1972) Rapid light-induced decrease in pineal serotonin N-acetyltransferase activity. Science 177, 532-533. 193. Koella, W. P., Feldstein, A., and Czicman, J. S. (1968) The effect of parachlorophenylalanine on the sleep of cats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 25, 481-490. 194. Kohler, C., Eriksson, L. G., Davies, S., and Chan-Palay, V. (1987) Co-localization of neuropeptide tyrosine and somatostatin immunoreactivity in neurons of individual subfields of the rat hippocampal region. Neurosci Lett 78, 1-6. 195. Kohlmeier, K. A., Burns, J., Reiner, P. B., and Semba, K. (2002) Substance P in the descending cholinergic projection to REM sleep-induction regions of the rat pontine reticular formation: anatomical and electrophysiological analyses. Eur J Neurosci 15, 176-196. 196. Kombian, S. B. and Colmers, W. F. (1992) Neuropeptide Y selectively inhibits slow synaptic potentials in rat dorsal raphe nucleus in vitro by a presynaptic action. J Neurosci 12, 1086-1093. 197. Kordower, J. H. and Mufson, E. J. (1990) Galanin-like immunoreactivity within the primate basal forebrain: differential staining patterns between humans and monkeys. J Comp Neurol 294, 281-292. 198. Kosaka, T., Wu, J. Y., and Benoit, R. (1988) GABAergic neurons containing somatostatin-like immunoreactivity in the rat hippocampus and dentate gyrus. Exp Brain Res 71, 388-398. 199. Kozak, R., Bowman, E. M., Latimer, M. P., Rostron, C. L., and Winn, P. (2005) Excitotoxic lesions of the pedunculopontine tegmental nucleus in rats impair performance on a test of sustained attention. Exp Brain Res 162, 257-264.
101
200. Krueger, J. M. and Obal, F., Jr. (2003) Sleep function. Front Biosci 8, d511-d519. 201. Krueger, J. M., Obal, F. J., Fang, J., Kubota, T., and Taishi, P. (2001) The role of cytokines in physiological sleep regulation. Ann N Y Acad Sci 933, 211-221. 202. Kumar, V. M. (2004) Why the medial preoptic area is important for sleep regulation. Indian J Physiol Pharmacol 48, 137-149. 203. Kuroda, M. and Price, J. L. (1991) Synaptic organization of projections from basal forebrain structures to the mediodorsal thalamic nucleus of the rat. J Comp Neurol 303, 513-533. 204. Kushida, C. A., Bergmann, B. M., and Rechtschaffen, A. (1989) Sleep deprivation in the rat: IV. Paradoxical sleep deprivation. Sleep 12, 22-30. 205. Lee, M. G., Hassani, O. K., and Jones, B. E. (2005) Discharge of identified orexin/hypocretin neurons across the sleep-waking cycle. J Neurosci 25, 6716-6720. 206. Lena, I., Parrot, S., Deschaux, O., Muffat-Joly, S., Sauvinet, V., Renaud, B., SuaudChagny, M. F., and Gottesmann, C. (2005) Variations in extracellular levels of dopamine, noradrenaline, glutamate, and aspartate across the sleep--wake cycle in the medial prefrontal cortex and nucleus accumbens of freely moving rats. J Neurosci Res 81, 891-899. 207. Lin, J. S., Sakai, K., Vanni-Mercier, G., and Jouvet, M. (1989) A critical role of the posterior hypothalamus in the mechanisms of wakefulness determined by microinjection of muscimol in freely moving cats. Brain Res 479, 225-240. 208. Lin, L., Faraco, J., Li, R., Kadotani, H., Rogers, W., Lin, X., Qiu, X., de Jong, P. J., Nishino, S., and Mignot, E. (1999) The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2 gene. Cell 98, 365-376. 209. Lo, C. G., Casamenti, F., Bigl, V., Milaneschi, E., and Pepeu, G. (1982) Effect of magnocellular forebrain nuclei lesions on acetylcholine output from the cerebral cortex, electrocorticogram and behaviour. Arch Ital Biol 120, 176-188. 210. Longo, V. G. (1966) Behavioral and electroencephalographic effects of atropine and related compounds. Pharmacol Rev 18, 965-996. 211. Lu, J., Greco, M. A., Shiromani, P., and Saper, C. B. (2000) Effect of lesions of the ventrolateral preoptic nucleus on NREM and REM sleep. J Neurosci 20, 3830-3842. 212. Ludwig, M. and Leng, G. (2006) Dendritic peptide release and peptide-dependent behaviours. Nat Rev Neurosci 7, 126-136. 213. Manns, I. D., Mainville, L., and Jones, B. E. (2001) Evidence for glutamate, in addition to acetylcholine and GABA, neurotransmitter synthesis in basal forebrain neurons projecting to the entorhinal cortex. Neuroscience 107, 249-263. 214. Markram, H., Toledo-Rodriguez, M., Wang, Y., Gupta, A., Silberberg, G., and Wu, C. (2004) Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nat Rev Neurosci 5, 793-807. 102
215. Marrosu, F., Portas, C., Mascia, M. S., Casu, M. A., Fa, M., Giagheddu, M., Imperato, A., and Gessa, G. L. (1995) Microdialysis measurement of cortical and hippocampal acetylcholine release during sleep-wake cycle in freely moving cats. Brain Res 671, 329-332. 216. Martin, J. R. (2002) Neuropeptide Y potentiates the pressor response evoked by carbachol administration into the posterior hypothalamic nucleus of conscious rat. Brain Res 949, 79-87. 217. McCormick, D. A. (1992a) Neurotransmitter actions in the thalamus and cerebral cortex. J Clin Neurophysiol 9, 212-223. 218. McCormick, D. A. (1992b) Neurotransmitter actions in the thalamus and cerebral cortex and their role in neuromodulation of thalamocortical activity. Prog Neurobiol 39, 337-388. 219. McCormick, D. A. and Bal, T. (1997) Sleep and arousal: thalamocortical mechanisms. Annu Rev Neurosci 20, 185-215. 220. McCormick, D. A. and Prince, D. A. (1986) Mechanisms of action of acetylcholine in the guinea-pig cerebral cortex in vitro. J Physiol 375, 169-194. 221. McGinty, D. J. and Harper, R. M. (1976) Dorsal raphe neurons: depression of firing during sleep in cats. Brain Res 101, 569-575. 222. Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Levey, A. I., and Wainer, B. H. (1983) Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol 214, 170-197. 223. Metherate, R. and Ashe, J. H. (1993) Ionic flux contributions to neocortical slow waves and nucleus basalis-mediated activation: whole-cell recordings in vivo. J Neurosci 13, 5312-5323. 224. Methippara, M. M., Alam, M. N., Szymusiak, R., and McGinty, D. (2000) Effects of lateral preoptic area application of orexin-A on sleep-wakefulness. Neuroreport 11, 3423-3426. 225. Mignot, E. (2001) A hundred years of narcolepsy research. Arch Ital Biol 139, 207220. 226. Miller, J. D., Farber, J., Gatz, P., Roffwarg, H., and German, D. C. (1983) Activity of mesencephalic dopamine and non-dopamine neurons across stages of sleep and walking in the rat. Brain Res 273, 133-141. 227. Miller, M. A., Kolb, P. E., Planas, B., and Raskind, M. A. (1998) Few cholinergic neurons in the rat basal forebrain coexpress galanin messenger RNA. J Comp Neurol 391, 248-258. 228. Mistlberger, R. E. (2005) Circadian regulation of sleep in mammals: role of the suprachiasmatic nucleus. Brain Res Brain Res Rev 49, 429-454.
103
229. Momiyama, T. and Zaborszky, L. (2006) Somatostatin presynaptically inhibits both GABA and glutamate release onto rat basal forebrain cholinergic neurons. J Neurophysiol. 230. Monnier, M. and Hatt, A. M. (1969) Afferent and central activating effects of histamine on the brain. Experientia 25, 1297-1298. 231. Monti, J. M. (1993) Involvement of histamine in the control of the waking state. Life Sci 53, 1331-1338. 232. Moore, R. Y. and Eichler, V. B. (1972) Loss of a circadian adrenal corticosterone rhythm following suprachiasmatic lesions in the rat. Brain Res 42, 201-206. 233. Moore, R. Y. and Gustafson, E. L. (1989) The distribution of dopamine-betahydroxylase, neuropeptide Y and galanin in locus coeruleus neurons. J Chem Neuroanat 2, 95-106. 234. Morin, A. J. and Beaudet, A. (1998) Origin of the neurotensinergic innervation of the rat basal forebrain studied by retrograde transport of cholera toxin. J Comp Neurol 391, 30-41. 235. Morris, J. F. and Pow, D. V. (1991) Widespread release of peptides in the central nervous system: quantitation of tannic acid-captured exocytoses. Anat Rec 231, 437445. 236. Morton, A. J., Wood, N. I., Hastings, M. H., Hurelbrink, C., Barker, R. A., and Maywood, E. S. (2005) Disintegration of the sleep-wake cycle and circadian timing in Huntington's disease. J Neurosci 25, 157-163. 237. Moruzzi, G. and Magoun, H. W. (1949) Brain stem reticular formation and activation of the EEG. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 1, 455-473. 238. Nakajima, Y., Stanfield, P. R., Yamaguchi, K., and Nakajima, S. (1991) Substance P excites cultured cholinergic neurons in the basal forebrain. Adv Exp Med Biol 295, 157-167. 239. Nambu, T., Sakurai, T., Mizukami, K., Hosoya, Y., Yanagisawa, M., and Goto, K. (1999) Distribution of orexin neurons in the adult rat brain. Brain Res 827, 243-260. 240. Newman, S. M., Paletz, E. M., Rattenborg, N. C., Obermeyer, W. H., and Benca, R. M. (2008) Sleep deprivation in the pigeon using the Disk-Over-Water method. Physiol Behav 93, 50-58. 241. Nishino, S. and Fujiki, N. (2007) Neuropeptides as possible targets in sleep disorders. Expert Opin Ther Targets 11, 37-59. 242. Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., and Mignot, E. (2000) Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet 355, 39-40. 243. Oades, R. D. and Halliday, G. M. (1987) Ventral tegmental (A10) system: neurobiology. 1. Anatomy and connectivity. Brain Res 434, 117-165.
104
244. Obal, F., Jr., Alfoldi, P., Cady, A. B., Johannsen, L., Sary, G., and Krueger, J. M. (1988) Growth hormone-releasing factor enhances sleep in rats and rabbits. Am J Physiol 255, R310-R316. 245. Obal, F., Jr., Kapas, L., Gardi, J., Taishi, P., Bodosi, B., and Krueger, J. M. (1999) Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)-induced inhibition of growth hormone secretion is associated with sleep suppression. Brain Res 818, 267-274. 246. Obal, F., Jr. and Krueger, J. M. (2001) The somatotropic axis and sleep. Rev Neurol (Paris) 157, S12-S15. 247. Obal, F., Jr. and Krueger, J. M. (2003) Biochemical regulation of non-rapid-eyemovement sleep. Front Biosci 8, d520-d550. 248. Obal, F., Jr., Sary, G., Alfoldi, P., Rubicsek, G., and Obal, F. (1986) Vasoactive intestinal polypeptide promotes sleep without effects on brain temperature in rats at night. Neurosci Lett 64, 236-240. 249. Olpe, H. R. and Steinmann, M. (1991) Responses of locus coeruleus neurons to neuropeptides. Prog Brain Res 88, 241-248. 250. Ottersen, O. P. (1980) Afferent connections to the amygdaloid complex of the rat and cat: II. Afferents from the hypothalamus and the basal telencephalon. J Comp Neurol 194, 267-289. 251. Panula, P., Pirvola, U., Auvinen, S., and Airaksinen, M. S. (1989) Histamineimmunoreactive nerve fibers in the rat brain. Neuroscience 28, 585-610. 252. Panula, P., Yang, H. Y., and Costa, E. (1984) Histamine-containing neurons in the rat hypothalamus. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 2572-2576. 253. Pappenheimer, J. R., Miller, T. B., and Goodrich, C. A. (1967) Sleep-promoting effects of cerebrospinal fluid from sleep-deprived goats. Proc Natl Acad Sci U S A 58, 513-517. 254. Parker, R. M. and Herzog, H. (1999) Regional distribution of Y-receptor subtype mRNAs in rat brain. Eur J Neurosci 11, 1431-1448. 255. Passani, M. B., Bacciottini, L., Mannaioni, P. F., and Blandina, P. (2000) Central histaminergic system and cognition. Neurosci Biobehav Rev 24, 107-113. 256. Paxinos G. and Watson, C. (1998) The rat brain in stereotaxic coordinates. Academic Press: London. 257. Pedrazzini, T., Pralong, F., and Grouzmann, E. (2003) Neuropeptide Y: the universal soldier. Cell Mol Life Sci 60, 350-377. 258. Peyron, C., Tighe, D. K., van den Pol, A. N., de Lecea, L., Heller, H. C., Sutcliffe, J. G., and Kilduff, T. S. (1998) Neurons containing hypocretin (orexin) project to multiple neuronal systems. J Neurosci 18, 9996-10015.
105
259. Pless, J., Bauer, W., Briner, U., Doepfner, W., Marbach, P., Maurer, R., Petcher, T. J., Reubi, J. C., and Vonderscher, J. (1986) Chemistry and pharmacology of SMS 201-995, a long-acting octapeptide analogue of somatostatin. Scand J Gastroenterol Suppl 119, 54-64. 260. Portas, C. M., Krakow, K., Allen, P., Josephs, O., Armony, J. L., and Frith, C. D. (2000) Auditory processing across the sleep-wake cycle: simultaneous EEG and fMRI monitoring in humans. Neuron 28, 991-999. 261. Price, J. L. and Stern, R. (1983) Individual cells in the nucleus basalis--diagonal band complex have restricted axonal projections to the cerebral cortex in the rat. Brain Res 269, 352-356. 262. Radulovacki, M. (1985) Role of adenosine in sleep in rats. Rev Clin Basic Pharm 5, 327-339. 263. Rasmusson, D. D., Clow, K., and Szerb, J. C. (1992) Frequency-dependent increase in cortical acetylcholine release evoked by stimulation of the nucleus basalis magnocellularis in the rat. Brain Res 594, 150-154. 264. Rasmusson, D. D., Clow, K., and Szerb, J. C. (1994) Modification of neocortical acetylcholine release and electroencephalogram desynchronization due to brainstem stimulation by drugs applied to the basal forebrain. Neuroscience 60, 665-677. 265. Rechtschaffen, A., Gilliland, M. A., Bergmann, B. M., and Winter, J. B. (1983) Physiological correlates of prolonged sleep deprivation in rats. Science 221, 182184. 266. Reisine, T. (1995) Somatostatin. Cell Mol Neurobiol 15, 597-614. 267. Reppert, S. M. and Weaver, D. R. (2002) Coordination of circadian timing in mammals. Nature 418, 935-941. 268. Ribak, C. E. and Roberts, R. C. (1990) GABAergic synapses in the brain identified with antisera to GABA and its synthesizing enzyme, glutamate decarboxylase. J Electron Microsc Tech 15, 34-48. 269. Riekkinen, P., Jr., Sirvio, J., Hannila, T., Miettinen, R., and Riekkinen, P. (1990) Effects of quisqualic acid nucleus basalis lesioning on cortical EEG, passive avoidance and water maze performance. Brain Res Bull 24, 839-842. 270. Riekkinen, P., Jr., Sirvio, J., Riekkinen, M., and Riekkinen, P. (1991) EEG changes induced by acute and chronic quisqualic or ibotenic acid nucleus basalis lesions are stabilized by tacridine. Brain Res 559, 304-308. 271. Rispoli, V., Rotiroti, D., Carelli, V., Liberatore, F., Scipione, L., Marra, R., Tortorella, S., and Di Rienzo, B. (2004) Electroencephalographic effects induced by choline pivaloyl esters in scopolamine-treated or nucleus basalis magnocellularis lesioned rats. Pharmacol Biochem Behav 78, 667-673.
106
272. Roberts, E. (1981) Strategies for identifying sources and sites of formation of GABA-precursor or transmitter glutamate in brain. Adv Biochem Psychopharmacol 27, 91-102. 273. Robledo, P., Lumeng, L., Li, T. K., and Ehlers, C. L. (1994) Effects of MK 801 and diazepam on the EEG of P and NP rats. Alcohol Clin Exp Res 18, 363-368. 274. Rosanova, M. and Timofeev, I. (2005) Neuronal mechanisms mediating the variability of somatosensory evoked potentials during sleep oscillations in cats. J Physiol 562, 569-582. 275. Rossi, G. and Zirondoli, A. (1955) On the mechanism of the cortical desynchronization elicited by volatile anesthetics. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 7, 383-390. 276. Rye, D. B., Wainer, B. H., Mesulam, M. M., Mufson, E. J., and Saper, C. B. (1984) Cortical projections arising from the basal forebrain: a study of cholinergic and noncholinergic components employing combined retrograde tracing and immunohistochemical localization of choline acetyltransferase. Neuroscience 13, 627-643. 277. Sajdyk, T. J., Shekhar, A., and Gehlert, D. R. (2004) Interactions between NPY and CRF in the amygdala to regulate emotionality. Neuropeptides 38, 225-234. 278. Sakurai, T., Amemiya, A., Ishii, M., Matsuzaki, I., Chemelli, R. M., Tanaka, H., Williams, S. C., Richarson, J. A., Kozlowski, G. P., Wilson, S., Arch, J. R., Buckingham, R. E., Haynes, A. C., Carr, S. A., Annan, R. S., McNulty, D. E., Liu, W. S., Terrett, J. A., Elshourbagy, N. A., Bergsma, D. J., and Yanagisawa, M. (1998) Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior. Cell 92, 1. 279. Salin-Pascual, R., Gerashchenko, D., Greco, M., Blanco-Centurion, C., and Shiromani, P. J. (2001) Hypothalamic regulation of sleep. Neuropsychopharmacology 25, S21-S27. 280. Sanchez-Vives, M. V. and McCormick, D. A. (2000) Cellular and network mechanisms of rhythmic recurrent activity in neocortex. Nat Neurosci 3, 10271034. 281. Saper, C. B. (1984) Organization of cerebral cortical afferent systems in the rat. II. Magnocellular basal nucleus. J Comp Neurol 222, 313-342. 282. Saper, C. B., Chou, T. C., and Scammell, T. E. (2001) The sleep switch: hypothalamic control of sleep and wakefulness. Trends Neurosci 24, 726-731. 283. Sarter, M. F. and Bruno, J. P. (1994) Cognitive functions of cortical ACh: lessons from studies on trans-synaptic modulation of activated efflux. Trends Neurosci 17, 217-221. 284. Sato, A., Sato, Y., and Uchida, S. (2001) Regulation of regional cerebral blood flow by cholinergic fibers originating in the basal forebrain. Int J Dev Neurosci 19, 327337. 107
285. Satoh, K. and Fibiger, H. C. (1986) Cholinergic neurons of the laterodorsal tegmental nucleus: efferent and afferent connections. J Comp Neurol 253, 277-302. 286. Sawchenko, P. E., Swanson, L. W., Rivier, J., and Vale, W. W. (1985) The distribution of growth-hormone-releasing factor (GRF) immunoreactivity in the central nervous system of the rat: an immunohistochemical study using antisera directed against rat hypothalamic GRF. J Comp Neurol 237, 100-115. 287. Schweitzer, J. B. (1987) Nerve growth factor receptor-mediated transport from cerebrospinal fluid to basal forebrain neurons. Brain Res 423, 309-317. 288. Semba, K. (2000) Multiple output pathways of the basal forebrain: organization, chemical heterogeneity, and roles in vigilance. Behav Brain Res 115, 117-141. 289. Semba, K. and Fibiger, H. C. (1989) Organization of central cholinergic systems. Prog Brain Res 79, 37-63. 290. Semba, K. and Fibiger, H. C. (1992) Afferent connections of the laterodorsal and the pedunculopontine tegmental nuclei in the rat: a retro- and antero-grade transport and immunohistochemical study. J Comp Neurol 323, 387-410. 291. Senut, M. C., Menetrey, D., and Lamour, Y. (1989) Cholinergic and peptidergic projections from the medial septum and the nucleus of the diagonal band of Broca to dorsal hippocampus, cingulate cortex and olfactory bulb: a combined wheatgerm agglutinin-apohorseradish peroxidase-gold immunohistochemical study. Neuroscience 30, 385-403. 292. Shaw, F. Z., Lai, C. J., and Chiu, T. H. (2002) A low-noise flexible integrated system for recording and analysis of multiple electrical signals during sleep-wake states in rats. J Neurosci Methods 118, 77-87. 293. Shaw, J. L., Gackenheimer, S. L., and Gehlert, D. R. (2003) Functional autoradiography of neuropeptide Y Y1 and Y2 receptor subtypes in rat brain using agonist stimulated [35S]GTPgammaS binding. J Chem Neuroanat 26, 179-193. 294. Sherin, J. E., Elmquist, J. K., Torrealba, F., and Saper, C. B. (1998) Innervation of histaminergic tuberomammillary neurons by GABAergic and galaninergic neurons in the ventrolateral preoptic nucleus of the rat. J Neurosci 18, 4705-4721. 295. Sherin, J. E., Shiromani, P. J., McCarley, R. W., and Saper, C. B. (1996) Activation of ventrolateral preoptic neurons during sleep. Science 271, 216-219. 296. Siegel, J. (2004) Brain mechanisms that control sleep and waking. Naturwissenschaften 91, 355-365. 297. Siegel, J. M. (2008) Do all animals sleep? Trends Neurosci 31, 208-213. 298. Sinton, C. M. and McCarley, R. W. (2004) Neurophysiological mechanisms of sleep and wakefulness: a question of balance. Semin Neurol 24, 211-223.
108
299. Smialowski, A., Lewinska-Gastol, L., and Smialowska, M. (1992) The behavioural effects of neuropeptide Y (NPY) injection into the rat brain frontal cortex. Neuropeptides 21, 153-156. 300. Sourkes, T. L. and Poirier, L. (1965) Influence of the substantia nigra on the concentration of 5-hydroxytryptamine and dopamine of the striatum. Nature 207, 202-203. 301. Spruijt, B. M., van Hooff, J. A., and Gispen, W. H. (1992) Ethology and neurobiology of grooming behavior. Physiol Rev 72, 825-852. 302. Standaert, D. G., Saper, C. B., Rye, D. B., and Wainer, B. H. (1986) Colocalization of atriopeptin-like immunoreactivity with choline acetyltransferase- and substance P-like immunoreactivity in the pedunculopontine and laterodorsal tegmental nuclei in the rat. Brain Res 382, 163-168. 303. Stanley, B. G. and Leibowitz, S. F. (1984) Neuropeptide Y: stimulation of feeding and drinking by injection into the paraventricular nucleus. Life Sci 35, 2635-2642. 304. Steckler, T., Inglis, W., Winn, P., and Sahgal, A. (1994) The pedunculopontine tegmental nucleus: a role in cognitive processes? Brain Res Brain Res Rev 19, 298318. 305. Steiger, A., Guldner, J., Hemmeter, U., Rothe, B., Wiedemann, K., and Holsboer, F. (1992) Effects of growth hormone-releasing hormone and somatostatin on sleep EEG and nocturnal hormone secretion in male controls. Neuroendocrinology 56, 566-573. 306. Steininger, T. L., Gong, H., McGinty, D., and Szymusiak, R. (2001) Subregional organization of preoptic area/anterior hypothalamic projections to arousal-related monoaminergic cell groups. J Comp Neurol 429, 638-653. 307. Steriade, M. (1984) The exciatory-inhibitory response sequence in thalamic and neocortical cells: state-related changes and regulatory system. In: Dynamic Aspects of Neocortical Functions, pp. 107-157. Eds G.M.Edelman, W.E.Gall, W.M.Cowan. Wiley-Interscience: New York. 308. Steriade, M. (1997) Synchronized activities of coupled oscillators in the cerebral cortex and thalamus at different levels of vigilance. Cereb Cortex 7, 583-604. 309. Steriade, M. (2003) The corticothalamic system in sleep. Front Biosci 8, d878-d899. 310. Steriade, M., Amzica, F., and Contreras, D. (1994) Cortical and thalamic cellular correlates of electroencephalographic burst-suppression. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 90, 1-16. 311. Steriade, M., Contreras, D., Curro, D. R., and Nunez, A. (1993a) The slow (< 1 Hz) oscillation in reticular thalamic and thalamocortical neurons: scenario of sleep rhythm generation in interacting thalamic and neocortical networks. J Neurosci 13, 3284-3299.
109
312. Steriade, M. and Deschenes, M. (1984) The thalamus as a neuronal oscillator. Brain Res 320, 1-63. 313. Steriade, M., Nunez, A., and Amzica, F. (1993b) A novel slow (< 1 Hz) oscillation of neocortical neurons in vivo: depolarizing and hyperpolarizing components. J Neurosci 13, 3252-3265. 314. Steriade, M., Nunez, A., and Amzica, F. (1993c) Intracellular analysis of relations between the slow (< 1 Hz) neocortical oscillation and other sleep rhythms of the electroencephalogram. J Neurosci 13, 3266-3283. 315. Steriade, M., Timofeev, I., and Grenier, F. (2001) Natural waking and sleep states: a view from inside neocortical neurons. J Neurophysiol 85, 1969-1985. 316. Stewart, D. J., MacFabe, D. F., and Vanderwolf, C. H. (1984) Cholinergic activation of the electrocorticogram: role of the substantia innominata and effects of atropine and quinuclidinyl benzilate. Brain Res 322, 219-232. 317. Stewart-Amidei, C. (1991) Assessing the comatose patient in the intensive care unit. AACN Clin Issues Crit Care Nurs 2, 613-622. 318. Stickgold, R., James, L., and Hobson, J. A. (2000) Visual discrimination learning requires sleep after training. Nat Neurosci 3, 1237-1238. 319. Strand, F. L. (1999) Neuropeptides: Regulators of Physiological Processes. The MIT Press: Cambridge. 320. Stroh, T., Kreienkamp, H. J., and Beaudet, A. (1999) Immunohistochemical distribution of the somatostatin receptor subtype 5 in the adult rat brain: predominant expression in the basal forebrain. J Comp Neurol 412, 69-82. 321. Sun, Q. Q., Akk, G., Huguenard, J. R., and Prince, D. A. (2001) Differential regulation of GABA release and neuronal excitability mediated by neuropeptide Y1 and Y2 receptors in rat thalamic neurons. J Physiol 531, 81-94. 322. Swanson, L. W., Mogenson, G. J., Gerfen, C. R., and Robinson, P. (1984) Evidence for a projection from the lateral preoptic area and substantia innominata to the 'mesencephalic locomotor region' in the rat. Brain Res 295, 161-178. 323. Szentgyorgyi, V., Balatoni, B., Toth, A., and Detari, L. (2006) Effect of cortical spreading depression on basal forebrain neurons. Exp Brain Res 169, 261-265. 324. Szentirmai, E., Kapas, L., Sun, Y., Smith, R. G., and Krueger, J. M. (2007) Spontaneous sleep and homeostatic sleep regulation in ghrelin knockout mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 293, R510-R517. 325. Szentirmai, E. and Krueger, J. M. (2006) Central Administration of Neuropeptide Y Induces Wakefulness in Rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 326. Szerb, J. C. and Fine, A. (1990) Is glutamate a co-transmitter in cortical cholinergic terminals? Effects of nucleus basalis lesion and of presynaptic muscarinic agents. Brain Res 515, 214-218. 110
327. Takahashi, Y., Kipnis, D. M., and Daughaday, W. H. (1968) Growth hormone secretion during sleep. J Clin Invest 47, 2079-2090. 328. Tamiya, R. (1991) Synaptic inputs to histaminergic neurons in the rat posterior hypothalamus. Osaka City Med J 37, 107-122. 329. Tamiya, R., Hanada, M., Inagaki, S., and Takagi, H. (1991) Synaptic relation between neuropeptide Y axons and cholinergic neurons in the rat diagonal band of Broca. Neurosci Lett 122, 64-66. 330. Tasaka, K., Chung, Y. H., and Sawada, K. (1989) Excitatory effect of histamine on EEGs of the cortex and thalamus in rats. Agents Actions 27, 127-130. 331. Tatemoto, K. (1982) Neuropeptide Y: complete amino acid sequence of the brain peptide. Proc Natl Acad Sci U S A 79, 5485-5489. 332. Tehovnik, E. J. and Sommer, M. A. (1997) Effective spread and timecourse of neural inactivation caused by lidocaine injection in monkey cerebral cortex. J Neurosci Methods 74, 17-26. 333. Tepper, J. M. and Bolam, J. P. (2004) Functional diversity and specificity of neostriatal interneurons. Curr Opin Neurobiol 14, 685-692. 334. Thakkar, M. M., Delgiacco, R. A., Strecker, R. E., and McCarley, R. W. (2003) Adenosinergic inhibition of basal forebrain wakefulness-active neurons: a simultaneous unit recording and microdialysis study in freely behaving cats. Neuroscience 122, 1107-1113. 335. Thannickal, T. C., Moore, R. Y., Nienhuis, R., Ramanathan, L., Gulyani, S., Aldrich, M., Cornford, M., and Siegel, J. M. (2000) Reduced number of hypocretin neurons in human narcolepsy. Neuron 27, 469-474. 336. Timofeev, I., Grenier, F., Bazhenov, M., Sejnowski, T. J., and Steriade, M. (2000) Origin of slow cortical oscillations in deafferented cortical slabs. Cereb Cortex 10, 1185-1199. 337. Tobler, I. and Borbely, A. A. (1982) Sleep regulation after reduction of brain serotonin: effect of p-chlorophenylalanine combined with sleep deprivation in the rat. Sleep 5, 145-153. 338. Tomioka, R., Okamoto, K., Furuta, T., Fujiyama, F., Iwasato, T., Yanagawa, Y., Obata, K., Kaneko, T., and Tamamaki, N. (2005) Demonstration of long-range GABAergic connections distributed throughout the mouse neocortex. Eur J Neurosci 21, 1587-1600. 339. Tononi, G. and Cirelli, C. (2001) Modulation of brain gene expression during sleep and wakefulness: a review of recent findings. Neuropsychopharmacology 25, S28S35. 340. Tononi, G. and Cirelli, C. (2006) Sleep function and synaptic homeostasis. Sleep Med Rev 10, 49-62.
111
341. Toppila, J., Niittymaki, P., Porkka-Heiskanen, T., and Stenberg, D. (2000) Intracerebroventricular and locus coeruleus microinjections of somatostatin antagonist decrease REM sleep in rats. Pharmacol Biochem Behav 66, 721-727. 342. Ursin, R. (1971) Sleep in the cat: a parallel increase of deep slow wave sleep and REM sleep following total sleep deprivation. Acta Physiol Scand 82, 1A. 343. US, V. E. and Gaddum, J. H. (1931) An unidentified depressor substance in certain tissue extracts. J Physiol 72, 74-87. 344. Vanderwolf, C. H. (1975) Neocortical and hippocampal activation relation to behavior: effects of atropine, eserine, phenothiazines, and amphetamine. J Comp Physiol Psychol 88, 300-323. 345. Vanderwolf, C. H. (1988) Cerebral activity and behavior: control by central cholinergic and serotonergic systems. Int Rev Neurobiol 30, 225-340. 346. Vanderwolf, C. H., Raithby, A., Snider, M., Cristi, C., and Tanner, C. (1993) Effects of some cholinergic agonists on neocortical slow wave activity in rats with basal forebrain lesions. Brain Res Bull 31, 515-521. 347. Vertes, R. P. and Eastman, K. E. (2000) The case against memory consolidation in REM sleep. Behav Brain Sci 23, 867-876. 348. Vincent, S. R., Satoh, K., Armstrong, D. M., and Fibiger, H. C. (1983) NADPHdiaphorase: a selective histochemical marker for the cholinergic neurons of the pontine reticular formation. Neurosci Lett 43, 31-36. 349. Viollet, C., Lepousez, G., Loudes, C., Videau, C., Simon, A., and Epelbaum, J. (2007) Somatostatinergic systems in brain: Networks and functions. Mol Cell Endocrinol. 350. Volgushev, M., Chauvette, S., Mukovski, M., and Timofeev, I. (2006) Precise longrange synchronization of activity and silence in neocortical neurons during slowwave oscillations [corrected]. J Neurosci 26, 5665-5672. 351. von Horsten, S., Exton, N. G., Exton, M. S., Helfritz, F., Nave, H., Ballof, J., Stalp, M., and Pabst, R. (1998) Brain NPY Y1 receptors rapidly mediate the behavioral response to novelty and a compartment-specific modulation of granulocyte function in blood and spleen. Brain Res 806, 282-286. 352. Wada, H., Inagaki, N., Yamatodani, A., and Watanabe, T. (1991) Is the histaminergic neuron system a regulatory center for whole-brain activity? Trends Neurosci 14, 415-418. 353. Wager-Smith, K. and Kay, S. A. (2000) Circadian rhythm genetics: from flies to mice to humans. Nat Genet 26, 23-27. 354. Wagner, D., Salin-Pascual, R., Greco, M. A., and Shiromani, P. J. (2000) Distribution of hypocretin-containing neurons in the lateral hypothalamus and Cfos-immunoreactive neurons in the VLPO. Sleep Res Online 3, 35-42.
112
355. Walker, M. P., Brakefield, T., Morgan, A., Hobson, J. A., and Stickgold, R. (2002) Practice with sleep makes perfect: sleep-dependent motor skill learning. Neuron 35, 205-211. 356. Webb, W. B. and Cartwright, R. D. (1978) Sleep and dreams. Annu Rev Psychol 29, 223-252. 357. Weiss, J., Cronin, M. J., and Thorner, M. O. (1987) Periodic interactions of GHreleasing factor and somatostatin can augment GH release in vitro. Am J Physiol 253, E508-E514. 358. Wenk, G. L., Rance, N. E., and Mobley, S. L. (1995) Effects of excitatory amino acid lesions upon neurokinin B and acetylcholine neurons in the nucleus basalis of the rat. Brain Res 679, 8-14. 359. Wenk, G. L., Stoehr, J. D., Quintana, G., Mobley, S., and Wiley, R. G. (1994) Behavioral, biochemical, histological, and electrophysiological effects of 192 IgGsaporin injections into the basal forebrain of rats. J Neurosci 14, 5986-5995. 360. White, J. M. and Rumbold, G. R. (1988) Behavioural effects of histamine and its antagonists: a review. Psychopharmacology (Berl) 95, 1-14. 361. Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Coyle, J. T., and DeLong, M. R. (1981) Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Ann Neurol 10, 122-126. 362. Whitehouse, P. J., Price, D. L., Struble, R. G., Clark, A. W., Coyle, J. T., and Delon, M. R. (1982) Alzheimer's disease and senile dementia: loss of neurons in the basal forebrain. Science 215, 1237-1239. 363. Willie, J. T., Chemelli, R. M., Sinton, C. M., and Yanagisawa, M. (2001) To eat or to sleep? Orexin in the regulation of feeding and wakefulness. Annu Rev Neurosci 24, 429-458. 364. Wilson, C. J. and Kawaguchi, Y. (1996) The origins of two-state spontaneous membrane potential fluctuations of neostriatal spiny neurons. J Neurosci 16, 23972410. 365. Wolak, M. L., DeJoseph, M. R., Cator, A. D., Mokashi, A. S., Brownfield, M. S., and Urban, J. H. (2003) Comparative distribution of neuropeptide Y Y1 and Y5 receptors in the rat brain by using immunohistochemistry. J Comp Neurol 464, 285311. 366. Wolansky, T., Clement, E. A., Peters, S. R., Palczak, M. A., and Dickson, C. T. (2006) Hippocampal slow oscillation: a novel EEG state and its coordination with ongoing neocortical activity. J Neurosci 26, 6213-6229. 367. Woolf, N. J., Gould, E., and Butcher, L. L. (1989) Nerve growth factor receptor is associated with cholinergic neurons of the basal forebrain but not the pontomesencephalon. Neuroscience 30, 143-152.
113
368. Woolf, N. J., Hernit, M. C., and Butcher, L. L. (1986) Cholinergic and noncholinergic projections from the rat basal forebrain revealed by combined choline acetyltransferase and Phaseolus vulgaris leucoagglutinin immunohistochemistry. Neurosci Lett 66, 281-286. 369. Wu, M. F., Gulyani, S. A., Yau, E., Mignot, E., Phan, B., and Siegel, J. M. (1999) Locus coeruleus neurons: cessation of activity during cataplexy. Neuroscience 91, 1389-1399. 370. Wynants, C., Van Binst, G., and Loosli, H. R. (1985) SMS 201-995, a very potent analogue of somatostatin. Assignment of the 1H 500 MHz n.m.r. spectra and conformational analysis in aqueous solution. Int J Pept Protein Res 25, 608-614. 371. Yamazoe, M., Shiosaka, S., Emson, P. C., and Tohyama, M. (1985) Distribution of neuropeptide Y in the lower brainstem: an immunohistochemical analysis. Brain Res 335, 109-120. 372. Zaborszky, L. (1989) Afferent connections of the forebrain cholinergic projection neurons, with special reference to monoaminergic and peptidergic fibers. In: Central cholinergic synaptic transmission, pp. 12-32. Eds M.Frotscher, U.Misgeld. Birkhauser: Basel. 373. Zaborszky, L. (2002) The modular organization of brain systems. Basal forebrain: the last frontier. Prog Brain Res 136, 359-372. 374. Zaborszky, L. and Cullinan, W. E. (1992) Projections from the nucleus accumbens to cholinergic neurons of the ventral pallidum: a correlated light and electron microscopic double-immunolabeling study in rat. Brain Res 570, 92-101. 375. Zaborszky, L. and Duque, A. (2000) Local synaptic connections of basal forebrain neurons. Behav Brain Res 115, 143-158. 376. Zaborszky, L. and Duque, A. (2003) Sleep-wake mechanisms and basal forebrain circuitry. Front Biosci 8, d1146-d1169. 377. Zaborszky, L., Gaykema, R. P., Swanson, D. J., and Cullinan, W. E. (1997) Cortical input to the basal forebrain. Neuroscience 79, 1051-1078. 378. Zaborszky, L., Heimer, L., Eckenstein, F., and Leranth, C. (1986) GABAergic input to cholinergic forebrain neurons: an ultrastructural study using retrograde tracing of HRP and double immunolabeling. J Comp Neurol 250, 282-295. 379. Zaborszky, L., Leranth, C., and Heimer, L. (1984) Ultrastructural evidence of amygdalofugal axons terminating on cholinergic cells of the rostral forebrain. Neurosci Lett 52, 219-225. 380. Zamboni, G., Perez, E., Amici, R., Jones, C. A., and Parmeggiani, P. L. (1999) Control of REM sleep: an aspect of the regulation of physiological homeostasis. Arch Ital Biol 137, 249-262. 381. Zhang, G., Wang, L., Liu, H., and Zhang, J. (2004) Substance P promotes sleep in the ventrolateral preoptic area of rats. Brain Res 1028, 225-232. 114
382. Zhang, J., Obal, F., Jr., Zheng, T., Fang, J., Taishi, P., and Krueger, J. M. (1999) Intrapreoptic microinjection of GHRH or its antagonist alters sleep in rats. J Neurosci 19, 2187-2194. 383. Zhou, L., Furuta, T., and Kaneko, T. (2004) Neurokinin B-producing projection neurons in the lateral stripe of the striatum and cell clusters of the accumbens nucleus in the rat. J Comp Neurol 480, 143-161.
115
9. PUBLIKÁCIÓS LISTA A dolgozat témájához kapcsolódó, referált nemzetközi folyóiratban megjelent közlemények Tóth A, Hajnik T, Záborszky L, Détári L. Effect of basal forebrain neuropeptide Y administration on sleep and spontaneous behavior in freely moving rats. Brain Res Bull. 2007, 72(4-6):293-301. Tóth A, Záborszky L, Détári L. EEG effect of basal forebrain neuropeptide Y administration in urethane anaesthetized rats. Brain Res Bull. 2005, 66(1):37-42. Más témájú, referált nemzetközi folyóiratban megjelent közlemények Szentgyörgyi V, Balatoni B, Tóth A, Détári L. Effect of cortical spreading depression on basal forebrain neurons. Exp Brain Res. 2006, 169(2):261-5. Kantor S, Jakus R, Molnar E, Gyongyosi N, Toth A, Detari L, Bagdy G. Despite similar anxiolytic potential, the 5-hydroxytryptamine 2C receptor antagonist SB-242084 [6chloro-5-methyl-1-[2-(2-methylpyrid-3-yloxy)-pyrid-5-yl carbamoyl] indoline] and chlordiazepoxide produced differential effects on electroencephalogram power spectra. J Pharmacol Exp Ther. 2005, 315(2):921-30. Szegedi V, Bárdos G, Détári L, Tóth A, Banczerowski-Pelyhe I, Világi I. Transient alterations in neuronal and behavioral activity following bensultap and fipronil treatment in rats. Toxicology. 2005, 214(1-2):67-76.
116
Tóth Attila Bazális előagyi neuropeptidek szerepe az agykérgi aktivációban A bazális előagy (BF) fontos szerepet játszik a kérgi aktiváció, illetve az alvásébrenlét szabályozásában. A neuropeptidek szintén fontos regulátorai ezeknek a folyamatoknak. Kevéssé ismert azonban, hogy a BF-ben is jelen lévő neuropeptidek milyen hatással vannak a kérgi aktivációval összefüggő funkciókra. Kísérleteinkben a neuropeptid Y (NPY) és a szomatosztatin (SOM)-analóg oktreotid (OKTR) ilyen irányú vizsgálatát céloztuk meg. Akut, uretán-altatott patkányokkal végzett kísérleteinkben a BF-be injektált NPY (300-500 pmol/patkány) és OKTR (500 nmol/patkány) szignifikáns változásokat okozott az EEG-ben. Az NPY megnövelte a relatív EEG teljesítményt a delta (0-3 Hz) sávban, míg a theta (3-9 Hz), az alfa (9-16 Hz) és a béta (16-48 Hz) sávban csökkenést okozott. A peptid hatása függött a narkózis mélységétől. Az OKTR az alfa és a béta frekvenciasávok teljesítményében szignifikáns -, míg a delta illetve a theta tartományban nem-szignifikáns növekedést váltott ki. A peptidek BF-be történő beadása nem befolyásolta a fájdalmas inger (farokcsípés) agykéregbe való bejutását. Krónikus, szabadon mozgó patkányokban a BF-be injektált NPY hatással volt a spontán viselkedésre és az alvásra. A nyugalmi állapot mennyisége jellegzetes változást mutatott mind a kontroll, mind a kezeléses felvételekben. Ez alapján három, egymást követő szakaszt definiáltunk. Az első szakaszban (2. félóra) az aktív viselkedési elemek (mozgás, ágaskodás, önápolás) magas szintet értek el. A második szakaszban (3, és 4. félóra) az aktivitási szint lecsökkent, az alvás mennyisége megnőtt. A harmadik szakaszban (5. és 6. félóra) újból megnőtt az aktív viselkedési elemek (önápolás, evés, ivás) mennyisége. Adataink szerint a BF-be adott NPY injekciók globális módon változtatták meg a kérgi aktivációt és az arousal-t. Az így kialakult, fokozott arousal-al járó állapot azonban nem járt együtt fokozott lokomócióval. A három szakasz részben megfigyelhető volt az alvás-ébrenlét változásaiban is. Az első szakaszban az alacsonyabb NPY dózis növelte az ébrenlétet és csökkentette a mély alvást. A második szakaszban az ébrenlét megnőtt a 3. félórában, míg csökkent a 4. félórában. A mély alvás és az összesített lassú hullámú alvás nem-szignifikánsan csökkent a 3., és nőtt a 4. félórában. A 3. szakaszban az ébrenlét növekedett, míg az alvás csökkent. Eredményeink szerint az NPY és a SOM fontos szerepet játszanak a kérgi aktiváció szabályozásában a BF-en keresztül. A peptidek hatásainak legvalószínűbb közvetítői a BF kolinerg sejtjei. 117
Attila Tóth Role of basal forebrain neuropeptides in the cortical activation The basal forebrain (BF) plays an important role in the regulation of the cortical activation and sleep-wake stages. Neuropeptides are important regulators of these processes too. However, little is known about the effect of neuropeptides available in the BF to the functions related to the cortical activation. In our experiments, the role of neuropeptid Y (NPY) and the somatostatin (SOM)-analog octreotide (OKTR) was examined. In our experiments with acute, urethane-anaesthetized rats, NPY (300-500 pmol/rat) or OKTR (500 nmol/patkány) was injected to the BF and significant EEG changes were seen. NPY caused an increase in the delta (0-3 Hz) band while decrease was seen in the theta (3-9 Hz), alpha (9-16 Hz) and beta (16-48 Hz) bands. NPY effects depended on the depth of the anaesthesia. OKTR caused signifcant increase in the power of the alpha and beta band while the increase was non-significant in case of the delta and theta bands. Peptides injected to the BF did not influence the ability of painful stimuli (tail pinches) to reach the cortex. NPY injected to the BF caused changes in behavior as well as in sleep in chronic, freely-moving rats. Amount of the quiet state changed in a characteristic fashion both in control as well as in all other recording sessions. This enabled the definition of three consecutive phases. In phase I (half hour 2), activated behavioral items (moving, rearing, grooming) appeared frequently. In phase II (half hours 3 and 4) activity decreased, while motionless state increased. Reappearance of activity was seen in phase III (half hours 5 and 6) when the amount of the activated behavioral elements (grooming, feeding, drinking) increased again. Our results suggest that BF NPY injections caused global changes in cortical activity and arousal, but the evoked, aroused state was not accompanied by increased locomotion. The three phases were also reflected in the sleep data. During phase I, lower NPY dose increased wakefulness and decreased deep sleep. In phase II, wakefulness tended to increase in the third half hour, while decreased in the 4th half hour. Deep sleep and total slow wave sleep non-significantly decreased in the third and increased in the 4th half hour. Wakefulness was elevated again during phase III, while sleep decreased. Our results suggest an importart role of NPY and SOM in the regulation of cortical activation via the BF. Cholinergic cells in the BF seem to be the most likely mediators of the peptidergic effects.
118
