A TRPV1 ÉS TRPA1 IONCSATORNÁK, VALAMINT SZENZOROS NEUROPEPTIDEK EXPRESSZIÓJA ÉS SZEREPE BŐR ÉS BÉL GYULLADÁSOS FOLYAMATAIBAN DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS
KUN JÓZSEF
Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet Gyógyszertudományok Doktori Iskola Neurofarmakológia Program Doktori Iskola és Programvezető: Prof. Dr. Pintér Erika Témavezető: Prof. Dr. Helyes Zsuzsanna
2014
Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke ..................................................................................................................... 4 Az állatkísérletek és a klinikai mintagyűjtés etikai vonatkozásai .................................................. 6 I.
Általános bevezetés .............................................................................................................. 7 1.
A TRPV1 receptor .............................................................................................................. 7
2.
A kapszaicin/RTX deszenzitizáció .................................................................................... 12
3.
A TRPA1 receptor ............................................................................................................ 14
4.
Nem-neuronális TRP receptorok ..................................................................................... 16
5.
A PACAP........................................................................................................................... 17
II.
Általános célkitűzések ......................................................................................................... 19 1.
A kapszaicin/RTX deszenzitizáció károsítja-e az extraneuronális TRPV1 csatornákat? .. 19
2. A kapszaicin által kiváltott bőrgyulladásban milyen szerepe van a TRPV1 és a PACAP közötti kapcsolatnak?.............................................................................................................. 19 3.
Milyen szerepet játszik a TRPA1 gyulladásos bélbetegségben? ..................................... 19
III. A kémiai és sebészi denerváció hatása a nem-neuronális TRPV1 kifejeződésére patkány szájnyálkahártyában és bőrben .................................................................................................. 20 1.
Irodalmi háttér, előzmények ........................................................................................... 20
2.
Célkitűzések..................................................................................................................... 22
3.
Anyagok és módszerek.................................................................................................... 23 Kísérleti állatok, RTX deszenzitizáció, sebészi denerválás .................................................. 23 Szövetminták előkészítése .................................................................................................. 24 mRNS expresszió vizsgálata ................................................................................................ 24 Immunhisztokémia.............................................................................................................. 24 Statisztika ............................................................................................................................ 25
4.
Eredmények .................................................................................................................... 26 TRPV1 mRNS expresszió patkány lábbőrben és szájnyálkahártyában ................................ 26 TRPV1 immunpozitivitás a patkány láb bőrszövetében ...................................................... 28
5.
Megbeszélés, következtetések ....................................................................................... 34
IV. A TRPV1 és a PACAP közötti kapcsolat hatása a kapszaicin által kiváltott bőrgyulladásban .......................................................................................................................... 40 1.
Irodalmi háttér, előzmények ........................................................................................... 40
2.
Célkitűzések..................................................................................................................... 41 1
3.
Anyagok és módszerek.................................................................................................... 41 Reagensek, vegyszerek....................................................................................................... 41 Kísérleti állatok .................................................................................................................... 41 Akut gyulladás kiváltása ...................................................................................................... 42 Radioimmunassay ............................................................................................................... 43 A PACAP-38 és PAC1 receptor mRNS detektálása a bőrben ............................................... 44 Szövettani, immunhisztokémiai vizsgálatok....................................................................... 44 Statisztika ............................................................................................................................ 45
4.
Eredmények .................................................................................................................... 46 A PACAP és a PAC1 kimutatható az egér bőrben ................................................................ 46 A PACAP és PAC1 expressziója eltérően változik kapszaicin és CFA hatására .................... 48 PACAP és TRPV1 hiányos egerek kisebb gyulladásos válasza kapszaicin hatására ............. 51
5. V.
Megbeszélés, következtetések ....................................................................................... 52 A TRPA1 expressziója és szerepe colitisben ........................................................................ 56
1.
Irodalmi háttér, előzmények ........................................................................................... 56
2.
Célkitűzések..................................................................................................................... 58
3.
Anyagok és módszerek.................................................................................................... 58 Kísérleti állatok .................................................................................................................... 58 Klinikai minták ..................................................................................................................... 59 Egér DSS colitis modell ........................................................................................................ 59 Betegségaktivitási Index meghatározása ............................................................................ 60 Szövettani elemzés .............................................................................................................. 61 Immunhisztokémia.............................................................................................................. 62 Kvantitatív PCR .................................................................................................................... 63 Luminex RNS assay .............................................................................................................. 64 Luminex Multiplex Immunassay ......................................................................................... 64 Statisztika ............................................................................................................................ 65
4.
Eredmények .................................................................................................................... 66 TRPA1 és TRPV1 génexpresszió........................................................................................... 66 TRPV1 és TRPA1 immunhisztokémiai lokalizáció ................................................................ 68 Betegségaktivitási Index az egér DSS modellben ................................................................ 72 Szövettani pontozás az egér DSS modellben ...................................................................... 73 Citokin mRNS expresszió egér DSS modellben ................................................................... 74
2
Citokin fehérjeexpresszió egér DSS modellben................................................................... 75 Receptor és neuropeptid génexpresszió a gyulladt vastagbélben ..................................... 77 5. VI.
Megbeszélés, következtetések ....................................................................................... 81 Új eredmények összefoglalása, következtetések............................................................ 89
Függelék ...................................................................................................................................... 91 Irodalomjegyzék .......................................................................................................................... 94 Köszönetnyilvánítás .................................................................................................................. 113 Publikációs lista ......................................................................................................................... 114
3
Rövidítések jegyzéke AC: adenilát-cikláz AITC: allil-izotiocianát ANOVA: analysis of variance/ variancia-analízis BCP: bromo-chloro-propane/ bróm-klór- propán BSA: bovine serum albumine/ borjú szérum albumin CAPS: capsaicin/ kapszaicin CCL5: chemokine (C-C motif) ligand 5/ kemokin (C-C motívum) ligand 5 (RANTES) CFA: complete Freund’s adjuvant/ teljes Freund adjuváns CGRP: calcitonin gene-related peptide/ kalcitonin gén-rokon peptid CLC2: chemokine (C-C motif) ligand 2/ kemokin (C-C motívum) ligand 2 (MCP-1) COX-2: ciklooxigenáz-2 Cq: quantification cycle/ kvantifikációs ciklus CXCL9: chemokine (C-X-C motif) ligand 9/ kemokin (C-X-C motívum) ligand 9 (MIG) DAB: diamino-benzidin DAG: diacil-glicerol DAI: disease activity index/ betegségaktivitási index DSS: dextran sulphate sodium/ dextrán-szulfát nátrium sója EC: extracelluláris tér EM: endomorfin GAPDH: glicerin-aldehid-3- dehidrogenáz GUSB: béta-glükuronidáz HPETE: hidroperoxi-eikoza-tetraénsav Hprt1: hipoxantin foszforibozil transzferáz 1 HT: hipotalamusz H2O2: hidrogén-peroxid IBD: inflammatory bowel diseases/ gyulladásos bélbetegségek IC: intracelluláris tér IFNɤ: gamma-interferon IL: interleukin IL-1β: interleukin-1 béta IL-1rn: interleukin-1 receptor antagonista gén (fehérje: IL-1RA) iNOS: inducable nitrogen-monoxide sytnhase/ indukálható nitrogén-monoxid szintáz IP3: inozitol-triszfoszfát i.p.: intraperitoneális i.pl.: intraplantáris i.v.: intravénás KO: knock-out/ génhiányos LPA: lizofoszfatidsav MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1/ monocita kemoattraktáns protein-1 (CLC2) MIG: monokine induced by gamma interferon/ gamma-interferon által indukált monokin (CXCL9) MO: mustard oil/ mustárolaj 4
NADA: N-arachidonoil-dopamin NF-κB: nukleáris faktor-κB Nrf-2: nukleáris faktor eritroid 2 [NF-E2]-kapcsolt faktor 2 NKA: neurokinin A NKB: neurokinin B NK sejtek: natural killer sejtek/ természetes ölősejtek OLP: oralis lichen planus PA: foszfatidsav PACAP: pituitary adenylate cyclase activating polypeptide/ hipofízis adenilát-cikláz aktiváló polipeptid PAC1R: PACAP specifikus receptora PACAP WT: PACAP génhiányos egerek vad típusú megfelelője (CD1 törzs) PACAP (Adcyap1) KO: PACAP génhiányos/ PACAP knockout PACAP-IR: PACAP immunreaktivitás PC: foszfatidil-kolin PCR: polymerase chain reaction/ polimeráz láncreakció PE2: prosztaglandin E2 PG: pituitary gland/ agyalapi mirigy PIP2: foszfatidil-inozitol-biszfoszfát PPE: plazma protein extravazáció PKC: protein kináz C PLC: foszfolipáz C qPCR: quantitative polymerase chain reaction/ kvantitatív polimeráz láncreakció PMSF: phenylmethylsulfonyl fluoride/ fenil-metil-szulfonil-fluorid RANTES: regulated on activation, normal T cell expressed and secreted/ aktiváció hatására szabályozott, normál T-sejt-expresszált és szekretált (CCL5) ROS: reactive oxygen species/ reaktív oxigéngyökök RT-PCR: reverse transcriptase polymerase chain reaction / reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció SAPE: streptavidin phycoerythrin/ sztreptavidin- fikoeritrin s.c.: subcutan SEM: standard error of the mean/ középérték közepes hibája SP: substance P/ P-anyag SST: szomatosztatin SSTR1/4: szomatosztatin 1/4 receptor TNBS: trinitro-benzol-szulfonsav TNF-α: tumor nekrózis faktor alfa TRP: Tranziens Receptor Potenciál TRPA1: Tranziens Receptor Potenciál Ankirin 1 TRPV1: Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 ttkg: testtömeg kg UC: ulcerative colitis/ colitis ulcerosa UV-sugárzás: ultraibolya sugárzás VIP: vazoaktív intesztinális polipeptid VPAC1/VPAC2: a VIP és a PACAP közös receptorai WT: wild-type/ vad típus 5
Az állatkísérletek és a klinikai mintagyűjtés etikai vonatkozásai Minden kísérleti eljárást az állatok védelmére és kíméletére vonatkozó, 1998. évi XXVIII. törvénynek, valamint az állatkísérletek végzésére vonatkozó 243/1988. (XII.31.) Kormányrendeletnek megfelelően hajtottunk végre. Kísérleteink összhangban voltak az International Association for the Study of Pain és a Helsinki Nyilatkozat elveivel. Vizsgálatainkat jóváhagyta a Pécsi Tudományegyetem Munkahelyi Állatkísérleti Bizottsága a PTE állatkísérleti etikai kódexe alapján. Engedélyszámok: BA 02/2000-16-2006 és BA 02/2000-2/2012 az állatkísérletek számára; BA 02/2000-1/2012 a klinikai minták gyűjtésére. Minden beteg beleegyező nyilatkozatot írt alá.
6
I.
Általános bevezetés
1. A TRPV1 receptor Az 1950-60-as években Magyarországon végzett kutatások alapján fedezték fel, hogy az erős paprika csípős anyaga, a kapszaicin szelektíven aktiválja, illetve nagy dózisok ismételt adása után károsítja a fájdalomérző idegvégződések egy hőérzékeny csoportját [1,2]. A következő évtizedben szintén hazánkban született meg az a koncepció,
mely
szerint
a
kapszaicin
egy
specifikus
receptoron
hat
a
plazmamembránban [3], amely Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1) néven ismert 1997-es klónozása óta [4]. A patkány Trpv1 cDNS egy 95 kDa nagyságú, nem szelektív kation csatorna alegységet kódol (1. ábra), amely a hátsó gyöki ganglionok (DRG), a trigeminus és a vagus ganglionok kis átmérőjű szenzoros neuronjai jelentős mértékben kifejeznek.
1. ábra A TRPV1 receptor alegység funkcionális szerkezete a kulcs aminosavak megjelölésével. Szolcsányi és Sándor, 2012 [5]. S1-6: transzmembrán domének; A: ankirin ismétlődés domén; TRP: tranziens receptor potenciál domén, amely a TRP csatornákban konzervált szerkezetű, és a foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát (PIP2) által történő aktiváláshoz szükséges; fekete kör: foszforilációs helyek, amelyek a protein kináz C (PKC) és a protein kináz A (PKA) általi szenzitizáció hatóhelyei; LPA: lizofoszfatidsav. 7
A TRPV1 alegység hat transzmembrán doménnel és kiterjedt N-, C-terminális régiókkal rendelkezik. Az alegységek tetramer és/vagy heteromer csatorna komplexeket képeznek (2. ábra).
2. ábra (A) A TRPV1 receptor alegység szerkezete. Kalia és Swartz, 2013 [6]. Négy alegység alakítja ki a funkcionális receptor-ioncsatorna komplexet. (B) A patkány TRPV1 tetramer szerkezetének modellje, az extracelluláris oldal felőli nézetben. A négy alegység (A, B, C, D) TM5 és TM6 transzmembrán hurokszerkezetű szakasza egy központi pórust alakít ki. Lee és mtsai, 2011 [7]. (C) A TRPV1 háromdimenziós szerkezetének elhelyezkedése a plazmamembránban. Moiseenkova-Bell és mtsai, 2008 [8].
8
Az N- és C- terminális, valamint egy intracelluláris régió a protein kináz A (PKA) és a protein
kináz
C
(PKC)
feltételezett
hatóhelyeit,
az
N-és
C-terminális
a
kalcium/kalmodulin komplex kötőhelyét, a C-terminális a foszfatidilinozitol-4,5biszfoszfát (PIP2) hatóhelyét tartalmazza. Ezek a foszforilációs és kötőhelyek feltehetően szerepet játszanak a TRPV1 ioncsatorna deszenzitizációjában [9–11] (1. ábra, 7. old.). A TRPV1-et a kapszaicinen kívül fájdalmas hőinger (>43 °C) és protonok (pH <6,0), valamint többféle gyulladás- és fájdalomkeltő endogén molekula aktivál (pl. Narachidonoil-dopamin: NADA, lipoxigenáz termékek, anandamid), vagy a perifériás idegvégződésen szenzitizál (pl. bradikinin, adenozin-trifoszfát: ATP, idegi növekedési faktor: NGF), illetve exogén vanilloidok aktiválnak [12,13]. Az utóbbi agonistacsoportba tartozó kapszaicin és ultrapotens analógja, a reziniferatoxin (RTX) a receptor intracelluláris és transzmembrán régióján hat (1. ábra, 7. old.) dózisfüggő módon [14]. Az RTX kémiai szerkezete magyarázza ultrapotens tulajdonságát [15] (3. ábra).
3. ábra A kapszaicin (8-metil-N-vanillil-6nonénamid) és a reziniferatoxin (RTX) molekulaszerkezete. Lee és mtsai, 2011 [7]. A:
4-hidroxi-3-
metoxifenil; B: összekötő amid(kapszaicin) (RTX);
vagy
C:
észtercsoport
lipofil
oldallánc
(kapszaicin: nonenil; RTX: diterpén). Az RTX legfontosabb farmakofórjai az „A” régión kívül a C20 észter-, a C3 ketocsoport és az ortofenil csoport [7,15,16].
9
A TRPV1 izgatásával generált akciós potenciál következménye az érzőműködés és a nocicepció kialakulása. Így egyfelől különböző szenzoros modalitások (fájdalom, viszketés, hőérzékelés, stb.) jelátvitelét közvetítik (afferens funkció) (4. ábra). Másrészt a kapszaicin-érzékeny szenzoros rostok aktiválása többféle, főleg gyulladáskeltő szenzoros neuropeptid felszabadulásához vezet (lokális efferens funkció) [17,18]. Az aktivált perifériás végződésekből olyan neuropeptidek szabadulnak fel (P anyag, neurokinin A: NKA, neurokinin B: NKB, kalcitonin gén-rokon peptid: CGRP), amelyek az arteriolák erőteljes tágulatát, a venulákból lokális plazmafehérje-kiáramlást, valamint gyulladásos sejtek aktivációját okozzák a beidegzési területen [19]. Az így létrejövő neurogén gyulladás számos betegség kialakulásában szerepet játszik, úgy mint asthma bronchiale, allergiás rhinitis, conjunctivitis és dermatitis, ekcéma, rheumatoid arthritis, migrén, gyulladásos bélbetegségek [20–22].
4. ábra A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések hármas funkciója. Helyes, 2009 [23]. EM: endomorfin. TRPA1: a TRPV1-rokon Tranziens Receptor Potenciál Ankyrin 1.
10
Munkacsoportunk korábban bizonyította, hogy ezzel párhuzamosan az aktivált, szenzoros idegvégződésből gyulladáscsökkentő hatású szomatosztatin is felszabadul, amely a szisztémás keringésbe is bekerül (szenzokrin hatás). A szomatosztatin mellett további szisztémás gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító hatású peptidek (pl. endomorfinok) is felszabadulnak ezen rostokból aktiválásuk hatására [18,24] (4. ábra, 10. old.).
11
2. A kapszaicin/RTX deszenzitizáció A kapszaicin nem csak szelektíven aktiválja, hanem hosszabb vagy ismétlődő kezelés után deszenzitizálja a „kapszaicin receptor” TRPV1-et expresszáló C-polimodális nociceptorokat [1,18] (5. ábra). Az így létrejövő kemoanalgézia jelenségét használják ki kísérleti eszközként, amikor a szenzoros TRPV1 funkció hiányát kívánják vizsgálni [18].
5. ábra A kapszaicin/RTX deszenzitizáció hatása a TRPV1-et kifejező érzőideg-végződésre. Anand és mtsai, 2011 [25]. Szisztémás TRPV1 deszenzitizációs kísérletekben az RTX-et részesítik előnyben a kapszaicin helyett, mivel előbbit az állatok jobban tolerálják [15]. Az RTX a kapszaicinhez képest 1000-szeres hatékonysággal képes deszenzitizációt kiváltani: a szisztémás RTX dózis a 150-200 μg/kg, míg a kapszaicin dózisa a 150-200 mg/kg tartományba esik [1,15,26–28]. A kapszaicin és az RTX nagyobbrészt más kötőhelyen, eltérő mechanizmussal aktiválja a TRPV1 receptort (1. ábra, 7. old), ugyanakkor a Ca2+toxicitás következménye hasonló [29]. Aktiváláskor a TRPV1 elsősorban kalciumionokat enged át a pórusán, amely az intracelluláris Ca2+-koncentráció és vele a membrán depolarizáció növekedéséhez vezet. Trpv1 knock-out (KO) egerekkel végzett vizsgálatok kimutatták, hogy az ioncsatorna kulcsfontosságú gyulladásos- és 12
fájdalomingerek integrálásában, amelynek köszönhetően célmolekulává vált a gyógyszerfejlesztésben [15,18,30]. Lokálisan vagy szisztémásan alkalmazott nagydózisú kapszaicin kezelés reverzíbilis, de hosszantartó analgéziát vált ki [1,18,31]. A kapszaicinnel ily módon deszenzitizált állatok káros kémiai anyagok hatására nem mutatnak védőreflexet vagy gyulladást: szisztémás kapszaicin előkezelés után a szenzoros idegvégződések stimulálása nem vált ki akut neurogén gyulladást [32], amely arra utal, hogy a gyulladásos mediátorok (Panyag, NKA, CGRP) kiürülnek a fájdalomérző idegvégződésekből. Ezen szenzoros neuropeptidek a neurogén gyulladás mellett simaizom kontrakciót váltanak ki, továbbá szabályozzák az értónust, a nyálkaszekréciót és az immunfunkciókat [33].
13
3. A TRPA1 receptor A Tranziens Receptor Potenciál Ankyrin 1 (TRPA1) a TRPV1-hez hasonló receptorioncsatorna komplex a molekulaszerkezete, funkciója és lokalizációja szempontjából [34] (6. ábra). 6. ábra A TRPA1 és TRPV1 receptor felépítése. Bessac és mtsai, 2008 [35].
Jól ismert, hogy a TRPA1 és a TRPV1 nagymértékben koexpresszálódik a peptiderg, afferens Aδ- és C-rostok egy alpopulációjában, amelyek sejttestje a dorzális, trigeminális ganglionokban és bolygóideg érződúcaiban (ggl. jugulare, ggl. nodosum) találhatóak [36–39]. A TRPV1-et kifejező neuronok 30-50%-a tartalmaz TRPA1-et is, míg utóbbi ritkán található meg a TRPV1 nélküli neuronokban [40,41]. Az agy több régiójában kimutatták a TRPV1-et [42–45] és a TRPA1 jelenlétére utaló adatok is ismertek [44,46,47]. A TRPA1, TRPV1 általában nem-neuronális sejtekben is együtt fordul elő (pl. epithelium, keratinociták) [13]. A TRPA1 nem szelektív Ca2+-csatornaként számos sejtszintű folyamatban tölt be szerepet a szenzoros funkcióktól a homeosztázis fenntartásáig. A receptort a hideg hőmérséklet (<17 °C), mechanikai ingerek, számtalan elektrofil, irritáns, csípős vegyület aktiválja, közülük több a táplálékban is megtalálható (pl. fahéjaldehid, mentol, allilizotiocianát, allicin, stb.) [48] (7. ábra, 15. old.). Az előbbi exogén vegyületek mellett a receptort a gyulladás, oxidatív stressz és szövetkárosodás során felszabaduló endogén
14
agonisták is képesek szenzitizálni/aktiválni [49–52]. A TRPA1 receptor lokalizációja és funkcionális tulajdonságai alapján kulcsszerepet játszik akut és krónikus fájdalomban, gyulladásban. Patofiziológiai jelentősége, potenciális gyógyszercélpont szerepe felmerült többek között a légutak, a kardiovaszkuláris rendszer és a bél gyulladásos betegségeiben [48].
7. ábra A TRPA1 receptor néhány, a táplálékban megtalálható természetes exogén liganduma. SuperPain Database, Charité Orvostudományi Egyetem, Berlin [53]. Az allicin a TRPV1 receptort is aktiválja [54].
15
4. Nem-neuronális TRP receptorok A TRPV1 előfordulását eredetileg kizárólag neuronális struktúrákon feltételezték, az elmúlt években azonban egyre több nem-neuronális sejttípuson is kimutatták: többek között keratinocitákon, epidermiszben, hízósejteken, dendritikus sejteken, Tlimfocitákon, epithelsejteken, vaszkuláris endothelsejteken, ér simaizomsejteken, az orrnyálkahártya
szubmukózus
mirigyeiben,
az
urotheliumban,
gyomornyálkahártyában, stb. [13,55–62]. In vitro kimutatták, hogy egyes sejeteken a nem-neuronális
TRPV1
receptorokat
aktiválja
a
kapszaicin/RTX,
gyulladásos
mediátorok, ultraibolya (UV) sugárzás és magas hőmérséklet, amely az extraneuronális ioncsatorna funkcionális jelenlétére utal [63–68]. Ugyanakkor a nem-neuronális receptorok szerepe a gyulladásos válaszok esetleges mediátoraként in vivo nem ismert. A TRPA1 receptor extraneuronálisan megtalálható többek között enterokromaffin sejtekben,
a
melanocytákban,
hasnyálmirigy
béta-sejtjeiben,
fibroblastokban,
epidermális
synoviocytákban,
a
keratinocitákban,
vékony-
és
vastagbél
szöveteiben, arteriolák simaizomsejtjeiben, gyulladásos sejteken [13,62,69]. Mivel a nem-neuronális TRPV1/TRPA1 receptorok funkciója, élettani, illetve kórélettani jelentősége tisztázatlan, az utóbbi években ez a kutatási irány az érdeklődés középpontjába került. A neuronális TRPV1/A1 receptorokat célzó hatóanyagok extraneuronális mellékhatásait nem ismerjük, emellett a nem-neuronális TRP csatornák maguk is potenciális gyógyszercélpontok lehetnek. Az ér simaizomsejteken lokalizálódó
TRPV1
mikrocirkuláció,
csatornák
vérnyomás
aktiválása
szabályozásában
vazokonstrikciót játszhat
okoz,
szerepet
amely
a
[69,70].
A
keratinocitákon expresszálódó TRPV1 izgatása, hasonlóan humán T-limfocitákhoz és egér hízósejtekhez, gyulladáskeltő mediátorok felszabadulásához vezethet in vitro [62,63,71,72], közülük számos szenzitizálhatja a szenzoros TRPV1-et [15,73]. Így a keratinocitákon, gyulladásos sejteken kimutatott [13,62] TRPV1 és a szenzoros idegrostok közötti interakciók modulálhatják a neurogén gyulladás folyamatait [74,75]. Az utóbbi években a nem-neuronális TRP csatornák, mint a farmakológiai kutatások „forró” területe felé fordult érdeklődésünk. Munkacsoportunk kimutatta a TRPV1 expresszió növekedését a szájnyálkahártya keratinocitáin oralis lichen planusban (OLP) [76], valamint hízósejteken asztmás orrpolipózisban [77]. 16
5. A PACAP A kapszaicin-érzékeny idegvégződésekben a gyulladáskeltő neuropeptidek mellett (pl. CGRP,
P-anyag,
egyéb
tachykininek,
stb.)
gyulladáscsökkentő
peptidek
is
expresszálódnak, például a PACAP. Utóbbi két különböző molekulaformában létezik: PACAP-27 és PACAP-38 (8. ábra), túlnyomóan az utóbbi van jelen az emlős szövetekben [78]. A PACAP a vazoaktív intesztinális peptid (VIP)/szekretin/glukagon peptid szupercsalád leginkább konzervált szerkezetű tagja [78–81]. 8. ábra A PACAP-38 molekula térszerkezete. Toyama Egyetem, Japán [82].
A PACAP specifikus receptora a PAC1, amely mind Gs, mind Gq proteinekhez kapcsolódhat, előbbi révén az adenilát-cikláz (AC) jelátviteli útvonalat, utóbbin keresztül a foszfolipáz C (PLC) utat aktiválja. A VPAC1 és VPAC2 receptorok hasonló mértékben kötik a PACAP-ot és VIP-et, és az adenilát ciklázt aktiválják, amely megnövekedett cAMP termelődéshez vezet [78,83] (9. ábra, 18. old). A PACAP és receptorai széles körben előfordulnak a szervezetben a központi és perifériás
idegrendszerben,
valamint
nem-neuronális
sejtekben
a
perifériás
szervekben, pl. a bőrben és a bélrendszerben is [78,84,85]. Ezáltal a PACAP számtalan fiziológiai és patofiziológiai folyamatban játszik szerepet, beleértve az immunfunkciók modulálását, az erek integritását, a neuronális fejlődést és regenerációt, a circadian ritmust, szaporodást, stb. [86–92]. A peptid alapvetően gyulladáscsökkentő, neuroprotektív funkcióiról ismert, de a gyulladás, fájdalomkeletkezés irányába is mediálhatja
a
patofiziológiai
folyamatokat
a
különböző
sejteken,
receptorvariánsokon/típusokon azonosított, ill. eddig nem ismert splice variánsokon feltételezett “kombinatorikusan” pleiotróp hatásától függően [78,81,83,88,92–99] (9. ábra, 18. old.). 17
9. ábra A specifikus PACAP receptor PAC1R (legelterjedtebb ún. null variánsa), valamint a PACAP/VIP receptor VPAC1/2 aktivációja által stimulált főbb intracelluláris jelátviteli útvonalak. Dickson és mtsai, 2009 [83]. Aktiváció hatására mindhárom receptor képes Gαs fehérjéhez kapcsolódni és cAMP szintézist indukálni. Ezen felül a három receptor a foszfolipáz C enzimet (PLC) is képes aktiválni, amely a [Ca2+]i növekedéséhez vezet Gαq (mindhárom receptor esetében) és Gαi fehérjéhez (VPAC1 és VPAC2 esetén) kapcsoltan. A foszfolipáz D (PLD) aktivitás is stimulálható a három receptortípuson keresztül, ADPribolizációs faktor (ARF) közvetítésével a VPAC1/2 receptorokon, és protein kináz C (PKC) közvetítésével a PAC1R receptoron át. EC: extracelluláris tér; IC: intracelluláris tér; PA: foszfatidsav; PIP2: foszfatidil-inozitol-biszfoszfát; IP3: inozitol-triszfoszfát; DAG: diacil-glicerol; PC: foszfatidil-kolin.
18
II. Doktori
Általános célkitűzések (PhD)
munkámat
2009
szeptemberében
kezdtem
meg
a
Pécsi
Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetében. Célom volt az alábbi kérdések megválaszolása:
1. A kapszaicin/RTX deszenzitizáció károsítja-e az extraneuronális TRPV1 csatornákat? Fájdalom- és gyulladás állatkísérletes modelljeiben a szenzoros neuronok szerepét kapszaicin vagy RTX kezeléssel történő deszenzitizálással vizsgálják. Arra voltunk kíváncsiak, hogy a kísérleti módszer valóban szelektív-e a TRPV1-pozitív szenzoros neuronokra és nem károsítja az extraneuronális TRPV1 receptorokat? RTXdeszenzitizált és összehasonlításként sebészileg denervált patkányok bőr és szájnyálkahártya mintáiban terveztünk TRPV1 fehérje- és génexpressziós vizsgálatokat.
2. A kapszaicin által kiváltott bőrgyulladásban milyen szerepe van a TRPV1 és a PACAP közötti kapcsolatnak? Ismert, hogy a) a specifikus TRPV1 agonista kapszaicin neurogén gyulladást vált ki a bőrben, és hogy b) a PACAP szerepet játszik akut vazodilatációban gyulladásos folyamatok során. Nem ismert azonban e kettő közti kapcsolat, és hogy a PACAP-nak és specifikus PAC1R receptorának milyen szerepe van ebben a folyamatban. A PACAP és a PAC1R fehérje és mRNS szintű expresszióját vizsgáltuk ezért a talpi, lábháti és háti bőrben, valamint a TRPV1 és PACAP génhiányos egerekben kapszaicinnel kiváltott neurogén, ill. összehasonlításként Komplett Freund adjuváns (CFA) segítségével indukált sejtes immunválaszon alapuló gyulladásban.
3. Milyen szerepet játszik a TRPA1 gyulladásos bélbetegségben? Elsőként a TRPA1 és a TRPV1 receptor lokalizációjára voltunk kíváncsiak az intakt és gyulladt egér vastagbélben és humán klinikai mintákban, különös tekintettel azok extraneuronális előfordulására. Majd Trpa1 KO egerekben dextrán-szulfát nátrium sójával (DSS) kiváltott colitisben kívántuk vizsgálni a receptor szerepét, ill. a mögöttes mechanizmusok
felderítésére
a
lokális
neuropeptid
útvonalakat,
valamint
citokinek/kemokinek szintézisét a disztális vastagbélben. 19
III.
A kémiai és sebészi denerváció hatása a nem-neuronális TRPV1 kifejeződésére patkány szájnyálkahártyában és bőrben
Kun József, Helyes Zsuzsanna, Perkecz Anikó, Bán Ágnes, Polgár Beáta, Szolcsányi János, Pintér Erika Effect of Surgical and Chemical Sensory Denervation on Non-neural Expression of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) Receptors in the Rat. JOURNAL OF MOLECULAR NEUROSCIENCE 48:(3) pp. 795-803. (2012)
1. Irodalmi háttér, előzmények A szenzoros rostok gyulladásban betöltött szerepét (neurogén komponens) vizsgáló állatkísérletekben a szisztémás RTX előkezelést szelektív farmakológiai eszközként alkalmazzák a TRPV1-pozitív érzőideg-végződések deszenzitizációjára [18]. A nemneuronális TRPV1 csatornák felfedezésével adódik a kérdés: az évtizedek óta alkalmazott RTX deszenzitizáció vajon továbbra is szelektív kísérleti eszköznek tekinthető-e, amely kizárólag a szenzoros neuronokat érinti, de a nem-neuronális sejtekre nincs hatással? Keratinocitákon végzett in vitro vizsgálatok [100] alapján feltételezhetjük, hogy a nem-neuronális TRPV1 receptorok és gazdasejtjeik intakt állapotban maradnak szisztémás RTX kezelés után. A kapszaicin és az RTX fontos farmakológiai eszközzé vált a perifériás szenzoros neuronok szelektív aktiválásában, ill. ismételten, nagy dózisban történő alkalmazásuk esetén ezen neuronok szelektív károsításában [15] (10. ábra, 21. old.). A szenzoros idegvégződések RTX/kapszaicin nagydózisú vagy ismételt adása által kiváltott deszenzitizációjához három mechanizmus vezet. (1) Receptor szintű deszenzitizáció: az aktivált TRPV1 csatornán át beáramló Ca2+ ionáram a receptor defoszforilációját okozza, amely csökkenti annak érzékenységét. (2) Ingerület kialakulásának gátlása: a TRPV1 ismételt aktiválása és az ezzel járó kation beáramlás közvetetten blokkolja a feszültségfüggő Na+-csatornákat, amely az akciós potenciál kialakulása ellen hat. (3) Idegvégződés funkcionális károsodása: a mitokondriális membrán depolarizációja az organellum duzzadásához és Ca2+ kiáramlásához vezet a citoplazmába. Nagy dózisokban adott RTX tehát az idegvégződés funkcionális károsodását okozza, ez a folyamat a deszenzitizáció, amelyet az idegvégződés fizikai 20
károsodása követhet, utóbbi a kémiai denerváció [10,25]. A deszenzitizáció szinonimájaként használják az irodalomban a deszenzibilizáció kifejezést is, amely az idegi-ingerületvezetési funkciók hiányát hangsúlyozza ki.
10. ábra A kapszaicin/RTX deszenzitizáció hatásmechanizmusa a TRPV1-et kifejező érzőidegvégződésekben. Anand és mtsai, 2011 [25]. Mivel a krónikus, súlyos fájdalommal járó állapotok kezelésében az eddigi TRPV1 antagonisták nem jutottak túl a II-es fázisú klinikai vizsgálatokon a mellékhatásaik (elsősorban a fájdalmas hőküszöb emelkedése) miatt, előtérbe került a kapszaicinérzékeny idegvégződések deszenzitizációja mint terápiás eszköz. Ennek legfrissebb irodalmát Nilius és Szállási (2014, [44]) tekintette át: a nagy dózisú (8%) kapszaicint tartalmazó Qutenza bőrtapaszt jelenleg posztherpetikus neuralgia (PHN, övsömör utáni idegzsába) és nem diabéteszes perifériás neuropátiás fájdalom kezelésére alkalmazzák. A transzdermális kapszaicin terápia a TRPV1-pozitív szenzoros afferensek reverzíbilis eliminációját okozza a bőrben, amely fájdalomcsillapító hatású [25]. Szintén PNH-ban analgetikus hatású a nagykoncentrációjú (20%) kapszaicin folyadék formuláció (NGX-1998), továbbá klinikai vizsgálatok alatt áll a zu-kapszaicin (kapszaicin 21
cisz-izomer; Civamid: ízületi fájdalom, migrén, cluster-fejfájás; Civanex krém: ízületi fájdalom csillapítása COX-2 gátlóval kombinációban) [44]. Az RTX deszenzitizáció is újra az érdeklődés középpontjába került, más módon nem kezelhető daganatos fájdalom csillapításában, a bíztató állatkísérletek után I-es fázisú klinikai vizsgálat indult [44]. Vizsgálataink előtt nem volt ismert, hogy a szenzoros TRPV1 károsodását okozó kapszaicin/RTX terápiák [44] károsítják-e a nem-neuronális TRPV1 receptorokat.
2. Célkitűzések A fenti előzmények alapján vizsgálataink céljául tűztük ki patkány lábbőr és szájnyálkahártya mintákban a nem-neuronális TRPV1 (1) jelenlétének, valamint (2) expresszióváltozásának vizsgálatát RTX deszenzitizáció és sebészi denerváció után, mRNS és fehérjeszinten. Azt szerettük volna kimutatni, hogy a szenzoros denerváció valóban szelektíven a neuronálisTRPV1 receptorra hat-e.
22
3. Anyagok és módszerek Kísérleti állatok, RTX deszenzitizáció, sebészi denerválás
A kísérleteket felnőtt hím Wistar patkányokon (tömeg: kb. 300 g) végeztük. (11. ábra) Az állatok egy csoportjában (n=6) a hátsó lábakon denerválást végeztünk, amellyel az idegrostok degenerálódását idéztük elő. Nátrium-pentobarbitál (Euthasol; 40 mg/ttkg i.p.; Produlab Pharma b. v., Hollandia) altatás alatt a patkányok jobb hátsó lábán a comb magasságában elvágtuk a n. ischiadicust és a n. saphenust, ezzel denerváltuk a végtagot. Az ellentétes hátsó végtagok szolgáltak kontrollként. A denerválás után öt nappal a nátrium-pentobarbitállal túlaltatott állatokat feláldoztuk. A denervált és kontroll hátsó lábak dorzális (szőrrel borított) és plantáris (szőrtelen) bőrét kimetszettük, két darabra vágtuk kvantitatív qPCR és immunhisztokémiai vizsgálatok céljára. Öt másik patkányt deszenzitizáltunk RTX (Sigma, St. Louis, MO, USA) kezeléssel: 30, 70, és 100 μg/ttkg RTX s.c., három egymást követő napon [101]. Öt állat fiziológiás sóoldatot kapott kontrollként. Az állatokat két héttel később feláldoztuk, a hátsó lábak dorzális és plantáris bőr-, és szájnyálkahártya mintáit kimetszettük qPCR és immunhisztokémiai jelölés céljából. (11. ábra)
11. ábra Kísérleti elrendezés. 23
Szövetminták előkészítése
Minden egyes kimetszett szövetmintát két darabra vágtunk, a szövetminta felét RNA Later (Sigma-Aldrich Magyarország Kft, Budapest) folyadékba helyeztük, és −80°C-on tároltuk, másik felét 4%-os paraformaldehidben fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk immunhisztokémiai jelölés céljára. mRNS expresszió vizsgálata
Az RNA Later folyadékban tárolt mintákat 1 ml TRI reagensben (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) homogenizáltuk és a gyártó utasításainak megfelelően teljes RNS-t izoláltunk belőlük. Az izolált RNS mennyiségét és tisztaságát Nanodrop
ND-1000
Spectrophotometer
V3.5
(NanoDrop
Technologies,
Inc.,
Wilmington, DE, USA) segítségével határoztuk meg. Mintánként 1 µg totál RNS-t írtunk át reverz transzkripcióval cDNS-re a RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas/Thermo Fisher Scientific, USA) segítségével, 5 µM oligo(dT)18 primerrel 20 μl térfogatban, a gyártó utasításainak megfelelően. Ezt követően kvantitatív PCR (qPCR) detektálást hajtottunk végre Roche LightCycler készüléken TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems/LifeTechnologies, USA), TaqMan primerek és próbák (patkány TRPV1-re specifikus, Rn00583117_m1 azonosítójú assay, LifeTechnologies, USA) alkalmazásával, a gyártó utasításainak megfelelően (900 nM primer, 250nM próba, 20 µl reakciótérfogatban; kétlépéses PCR program: 95°C 10 perc; 95°C 15s, 60°C 1 perc, 40 ciklus). A mintákat triplikátumban mértük le, a génexpressziót a hipoxantin foszforibozil-transzferáz-1 (Hprt1) gén transzkriptumaira normalizáltuk (patkány Hprt1re specifikus, Rn01527840_m1 azonosítójú assay, LifeTechnologies, USA). A relatív génexpressziót a referenciagénhez képest számítottuk ki a szövettípusok közötti összehasonlításra a 2-ΔCt képlettel. Immunhisztokémia
A deparaffinizált és rehidrált szöveti mintákat pH 6-on citrát pufferben inkubáltuk mikrohullámú sütőben, 3x5 percig, 750 W-on, antigén feltárás céljából. A szövetek endogén peroxidáz aktivitását 20 perces 3%-os hidrogén-peroxidban (H2O2) való inkubációval
gátoltuk.
A
másodlagos
antitest
nem
specifikus
kötődését
24
megakadályozandó a mintákat normál kecske szérumban inkubáltuk 20 percig. Ezután a metszeteket előbb 1:1000-es hígításban nyúl poliklonális anti-TRPV1 antitesttel (Kat. szám: 2233; Tocris Bioscience, USA) inkubáltuk 1 órán keresztül, majd másodlagos torma-peroxidázzal konjugált EnVision system anti-nyúl szekunder antitesttel (DakoCytomation, Dako North America, USA) 30 percig. Végül a TRPV1 receptorok immunlokalizációját diamino-benzidinnel (DAB) hívtuk elő 10 percig, magfestést hematoxilinnal végeztünk. Az elsődleges antitest szelektivitását Western blot segítségével bizonyították [102]. Negatív kontrollként elsődleges antitest nélküli, másodlagos antitest és kecskeszérum hozzáadásával inkubált metszetek szolgáltak, mindhárom
szövettípuson.
A
szájnyálkahártyában
a
TRPV1
receptorok
immunpozitivitását szemikvantitatív pontozással határoztuk meg egy, a kísérletekben részt nem vevő patológus segítségével. Image Pro Plus 4.5 szoftverrel analizáltuk a metszetekről készült képeket, és az immunspecifikus festődés alapján azonosítottuk az pozitív pixeleket. Az adatokat a vizsgált régióban (epithelium, kötőszövet) százalékos arányban adtuk meg. A dorzális mintákban az epidermális réteg nem bizonyult kellő vastagságúnak a keratinocita szám pontos meghatározásához, ezért ezt csak a talpi bőrmintákban végeztük el, az ImageJ 1.44p szoftverrel (National Institutes of Health, USA).Az előhívás után kialakult specifikus immunfestési színre manuálisan beállítottunk egy detektálási küszöbértéket az immunpozitív keratinociták azonosítására. Kijelöltük az epidermális régiót és lemértük a területét, amelyet a pixelek számában ad meg a szoftver, majd megszámoltuk a TRPV1-re specifikusan festődő keratinociták számát. Minden egyes kontroll és kezelt állatból öt metszetet elemeztünk, metszetenként öt fotó készült. Az adatokat egységnyi epidermisz területre (100 000 pixel) vonatkoztatott TRPV1-pozitív keratinociták számaként adtuk meg. Statisztika
Az eredményeket átlag±átlag szórása (SEM) formában fejeztük ki. A statisztikai analízis során
Mann-Whitney-próbát,
a
szövettípusok
qPCR
eredményeinek
összehasonlításakor Kruskal-Wallis és Dunn-féle többszörös összehasonlító próbát alkalmaztunk, a p<0,05 értékeket tekintettük szignifikánsnak.
25
4. Eredmények TRPV1 mRNS expresszió patkány lábbőrben és szájnyálkahártyában RTX kezelés
A Trpv1 receptor mRNS az előzetes várakozásaink szerint kimutatható volt qPCR-ral a lábháti (12. ábra) és talpi bőrben (13. ábra), valamint a szájnyálkahártyában (14. ábra, 27. old.) mind az RTX-előkezelt, mind a kezeletlen kontroll állatokban. A relatív Trpv1 mRNS expresszió nem különbözött szignifikánsan a deszenzitizált és kontroll állatok azonos típusú mintái között. A szövettípusok közül a szájnyálkahártya mutatja a legmagasabb mértékű génexpressziót, amelyet a dorzális és plantáris bőr követ (15. ábra). A Trpv1 szignifikánsan magasabb szinten expresszálódik a dorzális bőrben és két nagyságrenddel magasabban a szájnyálkahártyában, a talpi bőrhöz képest.
12. ábra A relatív Trpv1 génexpresszió a lábháti bőrben a kontroll és RTX-kezelt állatok között. Nincs szignifikáns különbség a kontroll és RTX-kezelt csoport között. Mann-Whitney-próba.
13. ábra Relatív
Trpv1 génexpresszió a talpi
bőrben a kontroll és RTX-kezelt állatok között. Nincs szignifikáns különbség a kontroll és RTX-kezelt csoport között. Mann-Whitney-próba.
26
14. ábra Relatív
TRPV1
génexpresszió
a
szájnyálkahártyában a kontrol és RTXkezelt állatok között. Nincs szignifikáns különbség
a
kontroll
és
RTX-kezelt
csoport között. Mann-Whitney-próba.
15. ábra Relatív
Trpv1
génexpresszió
összehasonlítása a szövettípusok között a
kezeletlen
Kruskal-Wallis
kontrollmintákban. próba
és
Dunn-féle
többszörös összehasonlító próba: talpi bőr vs. szájnyálkahártya **p<0,01. Mann-Whitney próba lábháti vs. talpi bőr #p<0,05.
Sebészi denerváció
A qPCR-ral mért Trpv1 mRNS expresszió mértéke hasonló volt a sebészileg denervált és ellenoldali ép kontroll lábháti (16. ábra) és talpi (17. ábra, 28. old.) bőrminták között. Nem volt különbség a vizsgált bőrterületek között. 16. ábra Relatív Trpv1 génexpresszió a lábháti bőrben a kontroll és sebészileg denervált láb között. Nincs szignifikáns különbség a kontroll és denervált csoport között. MannWhitney-próba.
27
17. ábra Relatív
Trpv1 génexpresszió a talpi
bőrben a kontroll és sebészileg denervált láb között. Nincs szignifikáns különbség a kontroll és denervált csoport között. Mann-Whitney-próba.
TRPV1 immunpozitivitás a patkány láb bőrszövetében RTX kezelés
A negatív kontrollként szolgáló szövetmetszetek, amelyeket csak a másodlagos antitesttel és kecskeszérummal inkubáltunk, nem mutattak immunpozitivitást (18. ábra, 29. old.; 19. ábra, 30. old.; 20. ábra, 31. old). Erős pozitív TRPV1 protein immunfestést a lábi bőr keratinocitákon, a talpbőr kapilláris endothel sejteken, a dorzális bőrben sebocitákon is (18. ábra, 29. old; 19. ábra, 30. old) kimutattunk. Szájnyálkahártyában egyértelmű TRPV1 immunopozitivitást találtunk keratinocitákon, valamint a kötőszövetben fibroblastokon, limfocitákon és érendothel sejteken (20. ábra, 31. old). A TRPV1 immunfestődés intenzitása nem mutatott különbséget a három szöveti régióban és nem változott RTX deszenzitizáció hatására. A TRPV1 immunpozitivitás szemikvantitatív értékelése a talpi bőr (21. ábra, 32. old.), valamint szájnyálkahártya metszeteken (22. ábra, 32. old.) nem mutatott ki szignifikáns különbséget az RTX-előkezelt és kontroll minták között.
28
A
18. ábra Reprezentatív TRPV1specifikus immunhisztokémiai felvételek a (A) negatív kontroll (elsődleges antitest nélküli) lábháti bőr szövetmetszetekről, valamint a (B) kontroll és (C) RTX-kezelt állatok lábháti
B
bőr mintáiról. Lépték: 500 µm.
A kezeletlen kontroll (B) lábháti (szőrrel borított) bőrminták TRPV1 immunpozitivitást mutatnak keratinocitákon (felső nyíl) és sebocitákon (alsó nyíl).
C
A 3 egymást követő napon 30, 70 és 100 μg/ttkg s.c. RTX dózissal deszenzitizált állatok (C) lábháti bőrmintái szintén TRPV1 immunpozitivitást mutatnak keratinocitákon (felső nyíl) és sebocitákon (alsó nyíl).
29
A
19. ábra Reprezentatív TRPV1specifikus immunhisztokémiai felvételek a (A) negatív kontroll (elsődleges antitest nélküli) talpi bőr szövetmetszetekről, valamint a (B) kontroll és (C) RTXkezelt állatok talpi bőr mintáiról. Lépték: 500 µm.
B A kezeletlen kontroll (B) talpi (szőrtelen) bőrminták TRPV1 immunpozitivitást mutatnak keratinocitákon (felső nyíl) és kapilláris endothelsejteken (alsó nyíl). A 3 egymást követő napon 30, 70 és 100 μg/ttkg s.c.
C
RTX dózissal deszenzitizált állatok (C) talpi bőrmintái szintén TRPV1 immunpozitivitást mutatnak keratinocitákon (felső nyíl) és kapilláris endothelsejteken (alsó nyíl).
30
A
20. ábra Reprezentatív TRPV1specifikus immunhisztokémiai felvételek a (A) negatív kontroll (elsődleges antitest nélküli) szájnyálkahártya szövetmetszetekről, valamint a (B) kontroll és (C) RTXkezelt állatok szájnyálkahártya mintáiról.
B
Lépték: 500 µm. A kezeletlen kontroll (B) állatok szájnyálkahártya mintái TRPV1 immunpozitivitást mutatnak keratinocitákon (nyíl) és a kötőszövetben.
C
A 3 egymást követő napon 30, 70 és 100 μg/ttkg s.c. RTX dózissal deszenzitizált állatok (C) szájnyálkahártya mintái szintén TRPV1 immunpozitivitást mutatnak keratinocitákon (nyíl) és a kötőszöveti régióban.
31
21. ábra RTX-kezelt állatok talpbőréből készült
metszetek
TRPV1
szemikvantitatív immunpontozása.
100 000
pixel epidermisz területre eső TRPV1-pozitív
keratinociták
száma. Átlag ± SEM. Nincs szignifikáns
különbség
a
kontroll és RTX kezelt csoportok között. Mann-Whitney próba.
22. ábra RTX-kezelt
állatok
szájnyálkahártya TRPV1
metszetei
szemikvantitatív
immunpontozása.
A
TRPV1-
pozitivitás pontozása az epithel rétegben és a kötőszövetben, összetett
pontszámként
összegezve. Átlag ± SEM. Nincs szignifikáns különbség a kontroll és RTX kezelt csoportok között. Mann-Whitney próba.
Sebészi denerváció
A keratinociták és kapilláris endothel sejtek specifikus immunfestődése a talpi bőrben és a sebociták jelölődése a lábháti bőrben változatlan maradt sebészi denerváció után (23. ábra, 33. old.). Nem találtunk különbséget a denervált és ép kontroll talpi metszetek között szemikvantitatív TRPV1 immunpontozással (24. ábra, 34. old).
32
A
23. ábra Reprezentatív
TRPV1-specifikus
immunhisztokémiai
felvételek
a
sebészi denerváción átesett láb, ill. az intakt
ellenoldali
hátsó
végtag
bőrmintáiból. Lépték: 100 μm.
B
A (A) nem denervált hátsó lábháti bőrminták
TRPV1
keratinocitákon
(felső
festődése nyíl)
és
sebocitákon (alsó nyíl). A sebészileg denervált állatok az idegátvágás után 5 nappal kerültek leölésre. Az
ép
hátsó
bőrmintái
C
végtag
(B)
szintén
immunpozitivitást keratinocitákon
lábháti TRPV1
mutatnak (felső
nyíl)
és
sebocitákon (alsó nyíl). A (C) kontroll talpi bőrminták TRPV1 specifikus immunpozitivitást mutatnak keratinocitákon kapilláris
D
(felső
nyilak)
endothelsejteken
és (alsó
nyilak). A (D) kontroll talpi bőrminták szintén TRPV1
specifikus
immunpozitivitást
mutatnak keratinocitákon (felső nyilak) és kapilláris endothelsejteken (alsó nyilak).
33
24. ábra Sebészileg denervált és intakt ellenoldali láb talpi bőréből készült metszetek TRPV1 szemikvantitatív immunpontozása. 100 000 pixel epidermisz területre számított TRPV1-pozitív keratinociták száma. Átlag ± SEM. Nincs szignifikáns különbség a kontroll és denervált csoport között. Mann-Whitney próba.
5. Megbeszélés, következtetések Elsőként mutattuk ki patkány talpi és lábháti bőrben, továbbá szájnyálkahártyában a TRPV1 receptor mRNS és fehérjeszintű jelenlétét. Keratinocitákon végzett in vitro vizsgálatok [100] alapján előzetesen feltételeztük, hogy a nem-neuronális TRPV1 receptorok és az azokat tartalmazó sejtek épek maradnak szisztémás RTX előkezelés után. Bizonyítottuk, hogy a szisztémás RTX kezelés kizárólag a neuronális TRPV1 receptorokra szelektív, mivel a szisztémás RTX deszenzitizáció, amely kémiai denervációt eredményezett, nem változtatja meg a TRPV1 kifejeződését nemneuronális sejteken a patkány lábbőrben és a szájnyálkahártyában. A n. ischiadicus és a n. saphenus átvágása patkány lábon comb magasságban, amely a TRPV1-pozitív érzőideg-végződések degenerálódásával jár, nem befolyásolja a nemneuronális TRPV1 expresszióját a lábbőrben. Idegi ligációs vizsgálatok alapján a TRPV1 receptorproteinek a primér szenzoros neuronok sejttesteiben szintetizálódnak, ahonnan
ligandkötésre
képes
receptormolekulák
formájában
intraaxonális
transzporttal jutnak el a perifériára [73]. Ezért a TRPV1 mRNS jelenlétét a periférián lokális, nem-neuronális eredetűnek tekintjük. A TRPV1 mRNS detektálása RTXelőkezelt állatokból származó lábbőr és szájnyálkahártya mintákban bizonyítékot szolgáltat a TRPV1 kizárólagosan nem-neuronális sejteken való jelenlétére. Specifikus TRPV1 immunfestődés figyelhető meg keratinocitákon és kapilláris endothelsejteken a 34
talpi bőrben, míg a lábháti bőrminták TRPV1-pozitív sebocitákat is tartalmaznak. A szájnyálkahártya TRPV1 immunpozitivitást tartalmaz mind keratinocitákon, mind kötőszöveti
elemeken
(fibroblastok,
limfociták,
érendothel
sejtek).
Az
immunhisztokémiai eredményeinket a TRPV1 receptorok lokalizációjáról alátámasztják in vitro funkcionális irodalmi adatok: az általunk kimutatott TRPV1-pozitív sejttípusok szelektív TRPV1 agonista vagy antagonista kezelés hatására megfelelő választ adtak sejtkultúrában [63,68,102–105]. Szájnyálkahártyában a Hprt1 referenciagénhez viszonyított Trpv1 génexpresszió két nagyságrenddel magasabb, mint a talpi bőrben. A detektált mRNS szintjét arányosnak tekintjük a TRPV1-et kifejező sejtek számával, míg az egyes sejteken belüli kifejeződés szintjével csak kismértékben [67]. A nagyobb számú keratinocita és a kötőszövet további TRPV1-pozitív sejtjeinek (T-limfociták, fibroblastok) jelenléte magyarázhatja a szájnyálkahártya legmagasabb génkifejeződését az általunk vizsgált szövettípusok között. Az RTX által kiváltott deszenzitizáció a neurogén gyulladás hiányához vezet [15], amely bizonyítja a neuronális TRPV1 receptorok funkcióvesztését. RTX kezelés után a TRPV1 mRNS szint nem mutatott változást sem a bőr, sem a szájnyálkahártya mintákban a megfelelő kontrollokhoz viszonyítva. Ismert, hogy magas vagy ismételt szisztémás RTX dózisok hosszútávon károsítják a TRPV1-pozitív szenzoros neuronokat [15]. A TRPV1 receptor mRNS-t detektáltuk nem-neuronális sejtekben az RTXelőkezelés után, a változatlan mRNS szint ép sejtfunkcióra utal. Így bizonyítottnak tekintjük, hogy a TRPV1-et kifejező nem-neuronális sejtek nem érzékenyek a szisztémás RTX citotoxikus hatásaira. A lábbőr és szájnyálkahártya minták specifikus immunfestése is bizonyította a TRPV1 receptorfehérje változatlan jelenlétét RTX deszenzitizáció után. A talpi bőr és szájnyálkahártya metszetek szemikvantitatív TRPV1 immunpontozása nem mutatott különbséget az RTX-előkezelt és kontroll állatok között. Összességében a qPCR és immunhisztokémiai eredményeink alapján kimondhatjuk, az általunk alkalmazott szisztémás RTX előkezelés elegendőnek bizonyult az idegkárosító hatáshoz, a TRPV1-pozitív nem-neuronális sejtek károsítása nélkül. Ez az eredmény jól korrelál az irodalmi adatokkal, amelyek szerint a nagy dózisú (>0,8 M kapszaicin [106]), de nem az alacsony dózisú (<1 μM RTX; <10 μM kapszaicin [100]) vanilloidok 35
citotoxikus hatásúak humán keratinocitákra in vitro. A nagy dózisú vanilloidok citotoxikus hatását nem-neuronális sejttenyészetekre nem TRPV1 receptor által mediált folyamatnak tekintik [100,102]. A TRPV1 receptorok RTX által kiváltott hosszan tartó aktiválása az intracelluláris szabad Ca2+ szint nagymértékű növekedéséhez vezet, amely a neuronális sejtekre citotoxikus, míg a nem-neuronális sejtek tolerálják, vagy a kation beáramlás eleve kisebb mértékű/rövidebb ideig tart. Ismert, hogy a nem-neuronális sejttípusok kisebb sűrűségben fejezik ki a sejtmembránon a TRPV1 receptort a neuronális sejtekhez képest [15,100], hiszen ebben az esetben nem szerepük akciós potenciál generálása. Ez magyarázhatja az agonistára való kisebb érzékenységet. Keratinocitákon végzett in vitro vizsgálat alapján [100] az RTX citotoxikus hatása a TRPV1 receptorexpresszió szintjétől függ. Hozzájárulhatnak az RTX differenciális hatásához a neuronális és nemneuronális sejttípusok közötti strukturális különbségek, ill. a receptorok eltérő érzékenysége. A mikrotubulus rendszer és kapcsolódó intracelluláris jelátviteli komplexek szabályozzák a TRPV1 deszenzitizáció mértékét [74]. Elképzelhető, hogy fejlődéstanilag különböző eredetű sejtekben ez a reguláció eltérően játszódik le. Ismert, hogy a heterológ módon kifejeztetett TRP csatornák farmakológiai tulajdonságai eltérőek, amelyet a szignalizációs komponensek másfajta összetétele okozhat [107]. Munkacsoportunk korábbi eredményei alapján a TRPV1 ioncsatornát a külső plazmamembránban körülvevő lipid raft különböző összetétele részben felelős lehet a kapszaicin/RTX differenciális hatásaiért szenzoros ganglionsejtekben és transzfektált sejtvonalakban [108]. Korábban leírták, hogy a kapszaicin/RTX előkezelés dózisfüggő módon deszenzitizálja az egér hízósejteket további vanilloid stimulustól, de nem citotoxikus [72]. Kimutatták, hogy a patkány arteriola simaizomsejteken található TRPV1 receptorok gyorsan (perceken belül) deszenzitizálódnak kapszaicin hatására in vitro [109], amely behatárolja a Ca2+-toxicitás mértékét. A fentieken túl eredményeink jól összeegyeztethetőek azon korábbi adatokkal is, amelyek szerint a TRPV1 receptor által mediált vazodilatációs hatás megszüntethető szisztémás kapszaicin kezeléssel, ugyanakkor a kapszaicin érösszehúzó hatása ezután is megmarad vagy fokozódik [110]. Azóta tudjuk, hogy az érfal simaizomsejtjei funkcionális TRPV1 receptorokat expresszálnak [55,69], így a nem-neuronális 36
ioncsatornák közvetíthetik az érösszehúzó hatásokat. Időközben igazolták, hogy újszülött
patkányokban
a
neuronális
TRPV1
receptorokat
anatómiailag
és
funkcionálisan elimináló szisztémás kapszaicin kezelés (5 napon át összesen 300 mg/ttkg) nem befolyásolja a vázizom arteriolák TRPV1-et kifejező sejtjeit, azok életképességét [109], amely összhangban van munkacsoportunk eredményeivel. Kísérleteink másik szakaszában sebészi denervációval károsítottuk a TRPV1 receptorokat. A n. ischiadicus és n. saphenus idegek átvágása a lábon comb magasságban a TRPV1-pozitív szenzoros idegvégződések degenerációját idézi elő [1]. Ez az eljárás csak a neuronális TRPV1 receptorokat károsítja fizikailag. Ez magyarázhatja, hogy kísérletünkben miért maradtak épen a nem-neuronális eredetű receptorok: hasonlóan a kémiai denerváláshoz, a sebészi denerválás sem volt hatással a nem-neuronális Trpv1 mRNS expresszióra. Továbbá, a lábbőr minták specifikus immunfestése szintén a TRPV1 receptorproteinek változatlan jelenlétét demonstrálja sebészi denerválást követően keratinocitákon és kapilláris endothelsejteken (talpi bőr), és sebocitákon (lábháti bőr). A keratinocitákon található TRPV1 receptorok, hasonlóan az idegvégződéseken jelenlévőkhöz, szöveti sérüléskor felszabaduló protonok és hő által aktiválhatóak [64,65,111,112]. Ez azt sugallja, hogy elsődleges sejtes kémiai és hőszenzor szerepet játszik a receptor [63]. Keratinocitákon és egyéb nem-neuronális sejteken található TRPV1 receptorok lehetséges szerepe a gyulladásos folyamatokban tisztázásra vár. TRPV1 stimulációja keratinocitákon prosztaglandin E2 és interleukin-8 felszabaduláshoz, megnövekedett COX-2 és mátrix metalloproteináz-1 expresszióhoz vezet in vitro [63,65]. Az epidermális TRPV1 szerepet játszik abban a gyulladásos válaszban, amelyet a bőrfelszín savas hámlasztása okoz [68]. Pro-inflammatorikus mediátorok, amelyeket az epithelsejtek TRPV1 receptoraira ható káros környezeti hatások szabadítanak fel, neurogén gyulladásos válaszhoz vezethetnek, részben a szenzoros
idegek
Munkacsoportunk
TRPV1 korábban
csatornáinak kimutatta
[76]
aktiválásával/szenzitizálásával a
keratinocita-TRPV1
[30].
expresszió
fokozódását egy szájüregi gyulladásos betegségben, oralis lichen planusban, amely a fenti in vitro előzmények alapján okozati szerepet sugall ebben a kórképben. A Tlimfocitákból, amelyek TRPV1 specifikus festődését kimutattuk a szájnyálkahártyában,
37
a kapszaicin képes P-anyagot felszabadítani [71]. Nemrégiben igazolták a funkcionális TRPV1 jelenlétét limfocitákon [62]. Következtetésként elmondhatjuk, hogy az RTX előkezelés kizárólag a kapszaicinszenzitív neuronokra citotoxikus, így továbbra is a neuronális TRPV1 receptorokra szelektív farmakológiai eszköznek tekinthetjük. Az ultrapotens kapszaicin analóg RTX alkalmazásával kapott eredményeink alapján a primér szenzoros neuronokra szelektív neurotoxinként alkalmazott kapszaicin nem károsítja az extraneuronális sejteket [18]. A vanilloid deszenzitizáció eliminálja a neuronális TRPV1 receptorokat. Ha megfordítjuk a gondolatmenetet, mindez egyúttal megnyitja a lehetőséget a (kémiai denerválás után
is
intakt)
nem-neuronális
TRPV1
receptorfunkció
szelektív
in
vivo
tanulmányozására. Az RTX/kapszaicin „nem specifikus”, azaz nem TRPV1 által mediált hatásait a szervezetben több helyen leírták, a TRPV1 nem-neuronális sejteken történt felfedezésével ezeket a vanilloid hatásokat újraértékelhetjük [15]. Jól ismert például, hogy a TRPV1 aktiváció neurogén mechanizmusokon keresztül vazodilatációt [21], míg bizonyos körülmények között vazokonstrikciót (mesentericus, coronaria és vázizom, dura mater) okoz [69,103,113–115]. Ezen korábbi irodalmi adatok az érfalban lokalizálódó TRPV1 összehúzó funkcióját sugallták, amely azóta igazolást nyert az arteriola simaizomban [69,114] (míg az érendothelben a TRPV1 dilatációt okozó CGRP felszabadítását mediálja [13]). Eredményeink alapján feltételezzük továbbá, hogy a kapszaicin/RTX deszenzitizáción alapuló terápiák nem károsítják az extraneuronális TRPV1 receptorokat, ill. az azokat kifejező sejteket (25. ábra, 39. old.).
38
25. ábra Eredményeink összefoglalása.
39
IV.
A TRPV1 és a PACAP közötti kapcsolat hatása a kapszaicin által kiváltott bőrgyulladásban
Helyes Zsuzsanna, Kun József, Dobrosi Nóra, Sándor Katalin, Németh József, Perkecz Anikó, Pintér Erika, Szabadfi Krisztina, Gaszner Balázs, Tékus Valéria, Szolcsányi János, Martin Steinhoff, Baba Akemichi, Reglődi Dóra, Bíró Tamás Capsaicin induces skin inflammation via Transient Receptor Potential Vanilloid-1mediated up-regulation of Pituitary Adenylate-Cyclase Activating Polypeptide Közlésre benyújtva a Journal of Investigative Dermatology folyóirathoz, a bírálók kérdéseire a válaszadás folyamatban.
1. Irodalmi háttér, előzmények A PACAP és más neuropeptidek kolokalizációját RT-PCR-ral és immunhisztokémiával kimutatták kapszaicin-szenzitív neuronok sejttestében és végződéseiben [116–120]. Munkacsoportunk a közelmúltban bizonyította, hogy a PACAP-38 felszabadul in vitro a kapszaicin-érzékeny afferensek stimulált perifériás végződéseiből [121] és in vivo a szisztémás keringésbe [93]. A PACAP emberi bőrben való lokalizációját leírták a dermális-epidermális
határhoz
közeli
dermális
idegrostokban,
szőrtüszőkben,
véredényekben, és izzadságmirigyekben [78]. Továbbá, a nagy affinitással bíró PAC1 receptort (9. ábra, 18. old) is kimutatták. Kifejezett PACAP és PAC1 upregulációt figyeltek meg psoriasisos betegekben, amely a PACAP szerepére utal a bőr gyulladásos folyamataiban [122]. A számos vizsgálat ellenére, amely a PACAP gátló hatását mutatta ki sejtes gyulladásos és immunválaszokra [123–128], viszonylag keveset tudunk a gyulladás neurogén komponensére kifejtett hatásairól. Munkacsoportunk kimutatta korábban, hogy exogén PACAP bejuttatása gátolja a szenzoros neuropeptidek felszabadulását és az ezt követő akut neurogén gyulladást [93,121]. A PACAP-hiányos egerekkel végzett vizsgálatok segítségével feltárhatóak az endogén PACAP funkciói gyulladásos reakciókban in vivo. Néhány vizsgálat megnövekedett gyulladásos választ mutatott PACAP génhiányos egerekben kiváltott colitis, autoimmun encephalomyelitis, légúti és idegi gyulladás [88,129–134], továbbá allergiás kontakt dermatitisz modelljeiben [94].
40
2. Célkitűzések Mivel korábban nem volt irodalomi adat a PACAP expresszióra, annak gyulladásban bekövetkező változására és szerepére egér bőrben, a jelenlegi vizsgálat célja volt ezekre választ keresni radioimmunassay és molekuláris biológiai módszerekkel. A TRPV1 és a PACAP közötti lehetséges közvetlen kapcsolat vizsgálatára funkcionális teszteket végeztünk génhiányos egereken két akut in vivo bőrgyulladás modellben, amelyek mechanizmusa elkülöníthetően neurogén, ill. nem neurogén.
3. Anyagok és módszerek Reagensek, vegyszerek
PACAP-38, kapszaicin (8-metil-N-vanillil-6-nonenamid), CFA és etidium bromid a Sigma (USA), az etanol és a Tween 80 a Reanal (Budapest) gyártmánya. A molekuláris biológiai vizsgálatokhoz a TRIzol és a primerek az Invitrogentől kerültek beszerzésre (Invitrogen, Egyesült Királyság), az AMV reverz transzkriptáz a Promegától (USA), a Thermal Cycler az Applied Biosystemstől (USA). A kapszaicint 10% etanol, 10% Tween 80 és 80% sóoldatban (0,9% NaCl) oldottuk fel 10 mg/ml törzsoldatba, amit tovább higítottunk sóoldattal. A PACAP-38 antiszérum Prof. A. Arimura (Tulane University, New Orleans, USA) nagylelkű ajándéka volt. Kísérleti állatok
Kísérleteinket hím CD1 egereken (25-35g) végeztük, amelyeket a PTE ÁOK Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet Állatházában 24-25°C-on tartottunk, normál élelemmel és vízzel ad libitum ellátva. A kísérletek egy része során a CD1 törzsből létrehozott PACAP génhiányos egereket [135] használtuk fel a kapszaicin és CFAkiváltotta lábduzzadás vizsgálatára, az endogén PACAP szerepének feltárására. A TRPV1 receptor génhiányos egereket (Trpv1 KO) és C57Bl/6 vad típusú megfelelőiket a Jackson Laboratories-tól szereztük be, a Charles-River Hungary Kft.-én keresztül. Az altatást ketamin-xilazinnal (100 mg/kg ketamin i.p., Richter Gedeon NyRt., Budapest; 5 mg/kg xilazin i.p., Eurovet Animal Health BV, Hollandia) végeztük, majd a gerincvelő megszakításával leöltük az állatokat és kimetszettük a bőrmintákat. A szövetmintákat 41
három darabra vágtuk, az egyik RNAlater (Sigma-Aldrich Kft., Budapest) folyadékba került molekuláris biológiai vizsgálatokra, egy másikat lefagyasztottunk -20˚C-on radioimmunassay mérésekhez, a fennmaradó részt formaldehidben fixáltuk. Akut gyulladás kiváltása
Neurogén, ill. vegyes típusú gyulladásos reakciót váltottunk ki 50 μl kapszaicin (100 μg/ml, Sigma, USA) intraplantáris injekciójával, ill. teljes Freund-adjuvánssal (complete Freund’s
adjuvant:
CFA;
elölt
Mycobacterium
tuberculosis
szuszpenziója
paraffinolajban; 50 μl, 1 mg/ml) a bal hátsó lábba. A megfelelő oldószer azonos térfogata került befecskendezésre az ellenoldali lábba. Az egereket mélyaltatásban kivéreztettük 24 órával a kapszaicin vagy CFA adása után. A hátsó lábból származó talpi és lábháti, valamint háti bőrdarabokat, ill. kontrollként fül, agyalapi mirigy és hipotalamusz szövetmintákat kettévágtuk a PCR és RIA mérésekhez (lásd lentebb) (26. ábra). A kapszaicin és CFA által kiváltott lábduzzadás mértékének meghatározására a láb térfogatát pletizmométer segítségével mértük meg (Ugo Basile Type 7140, Comerio, Olaszország), a gyulladás kiváltása előtt és utána többször. Az ödémát a kezdeti kontroll %-ában fejeztük ki (n=6-8 csoportonként) [136].
26. ábra Kísérleti elrendezés. 42
Radioimmunassay
A PACAP-38-szerű immunreaktivitás (PACAP-38-LI) meghatározása egy specifikus és érzékeny RIA technikával történt laboratóriumunkban [137]. A PACAP-24-38 peptidszármazékot a Szegedi Tudományegyetem Orvosi Vegytani Intézetében szintetizálták. A „88111-3” PACAP-38 antiszérumot nyúlban termeltették, amelyhez szintetikus
peptideket
konjugáltak
szarvasmarha
szérum
albuminhoz
vagy
tiroglobulinhoz, glutáraldehiddel vagy carbodiimiddel. Az így nyert antitest nagymértékű specificitását és a C-terminálisára való érzékenységét keresztreakciós vizsgálatokkal igazolták. Az antitest sem a PACAP-27-tel, sem más neuropeptiddel (VIP, glukagon, szekretin) nem adott keresztreakciót [137]. A kimetszett bőrminták tömegét lemértük, és steril foszfát-pufferelt fiziológiás sóoldatban (PBS) homogenizáltuk. 2 centrifugálást követően (4000 rpm, 10 perc, 4C, majd 10000 rpm, 10 perc, 4C) történt a RIA meghatározás. A
PACAP
24-38
peptidszármazék
125
I
jódizotóppal
való
jelölését
saját
laboratóriumunkban végeztük. A kalibrációs görbe elkészítéséhez szintetikus peptidet használtunk, melyet 0-10000 fmol/ml koncentrációban mértünk az inkubációs oldatokba. Az assay-t 1 ml 0,05 mol/l (pH 7,4) foszfátpufferben mértük össze, amely 0,1 mol/l nátrium-kloridot, 0,25 % (w/v) szarvasmarha szérum albumint (BSA) és 0,05 % (w/v) nátrium azidot tartalmazott. Az antiszérumot (100 μl, 1:10000 hígitás), a RIA jelölőt (tracer) (100 μl 3000 cpm/cső) és a standardet (100 μl) vagy az ismeretlen mintát, valamint az assay puffert polipropilén csövekbe mértük. 4°C-on 48-72 óráig történt inkubáció után az antitesthez kötött jelölt peptidet tartalmazó frakciót elválasztottuk a szabad jelölt peptidektől olyan módon, hogy csövenként 100 μl szeparálószuszpenziót (10 g mosott szén, 1 g dextrán, és 0,2 g zsírmentes tejpor 100 ml desztillált vízben) mértünk hozzá. A mintákat 4°C-on 20 percig 3000 rpm-en centrifugáltuk, majd a felülúszót óvatosan leöntöttük. A szénhez kötött szabad peptidfrakció radioaktivitását NZ310 típusú gamma számlálóval mértük. Ebből következtettünk az ellenanyaghoz kötött radioaktivitás értékére, majd a kalibrációs görbéről leolvastuk az ismeretlen minta neuropeptid koncentrációját.
43
A PACAP-38 és PAC1 receptor mRNS detektálása a bőrben
A PACAP (Adcyap1) és a PAC1 receptor (Adcyap1r1) mRNS-t szemikvantitatív reverz transzkripciós (RT) PCR-ral határoztuk meg kapszaicin és CFA-kezelt egerekből származó szövetmintában [104,138]. Az RNA Later folyadékban tárolt mintákat 1 ml TRI reagensben (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) homogenizáltuk és a gyártó utasításainak megfeleően totál RNS-t izoláltunk belőlük. Az izolált RNS mennyiségét és tisztaságát Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer V3.5 (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA) segítségével határoztuk meg. Mintánként 1 mikrogramm total RNS-t írtunk át reverz transzkripcióval cDNS-re a 15 U oAMV reverz transzkriptáz enzimmel és 0,025 μg/μl random hexamer primerekkel. Ezt követte a PCR amplifikáció (95 °C 2 perc, 35 ciklus: 94 °C 1 perc; 61,5 °C PACAP (Adcyap1) 1 perc / 62,5 °C PAC1 (Adcyap1r1) 90 s / 55,5 °C Gapdh 60 s, 72 °C 1 perc; 72°C 2 perc) GeneAmp PCR System 2400 DNA Thermal Cycler készüléken. Primerek: PACAP (Adcyap1) F 5’-GGGGCAAGTCTAGCTCCTCT-3’, R 5’-GGGTCTCCAGAAAATCCACA-3’; PAC1
receptor
(Adcyap1r1)
F
5’-AGGCAATGAGTCGAGCATCT-3’,
R
5’-
GTCTTTCCCTCTTGCTGACG-3’; Gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (Gapdh), F: 5’ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3’;
R:
5’-GCTGACAATCTTGAGGGAGT-3’.
A
PCR
termékeket 1,5 %-os agaróz gélen detektáltuk etidium bromid nukleinsav festékkel (0,5 mg/ml), UV-fény alatt. Szövettani, immunhisztokémiai vizsgálatok
A talpi bőrszövet mintákat 4%-os paraformaldehidben fixáltuk, majd 0,1 M PBS-be helyztük szobahőmérsékleten 1 órára, majd sorozatmetszeteket készítettünk. Hematoxilin-eozin festést alkalmaztunk a rutin morfológiai vizsgálathoz. Az immunhisztokémiai analízishez a mintákat PBS-ben öblítettük, permeabilizáltuk PBSben oldott 0,1% Triton X-100-ban 5 percig, majd 0,1% BSA, 1% normal goat serum és 0,1% Na-azid PBS oldatában inkubáltuk, hogy a nem specifikus jelölést minimalizáljuk. A metszeteket szobahőmérsékleten inkubáltuk egy éjszakán át nyúlban termeltetett anti-PAC1 antitesttel (1:100, Prof. Seiji Shioda nagylelkű ajándéka). PBS-ben történő többszöri mosás után a metszeteket két órán keresztül sötétben inkubáltuk a megfelelő Alexa Fluor ‘‘568’’ másodlagos antitesttel, amelyet szintén nyúlban 44
terneltettek (1:1000, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA). A metszeteket PBS-ben mostuk, Fluoromount-G-vel (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) rögzítettük őket. Kontrollként az elsődleges antitest elhagyása szolgált, ebben az esetben nem tapasztaltunk specifikus festődést a metszeteken. Digitális fényképeket készítettünk egy CCD kamerával felszerelt Nikon Eclipse 80i mikroszkóp és a Spot software package segítségével. A szemikvantitatív immunfluoreszcencia meghatározásához a PAC1 intenzitást ImageJ 1.440 szofverrel mértük, az expresszió szintjét korrigáltuk a szöveti háttérrel. A különböző
csoportok
közötti intenzitás összehasonlítására
standardizáltuk
a
paraméreket: minden egyes metszetet azonos körülmények között analizáltunk (a felvétel időtartama, azonos beállítások, unit range: 250x250 pixel, metszetenként 10 mérés átlaga). Statisztika
A PACAP-IR és mRNS adatok statisztikai elemzése Mann-Whitney U próbával történt. A gyulladásos kísérletekből (ödémakeletkezés, PAC1 immunreaktivitás) származó adatok elemzése ANOVA-val és Bonferroni post hoc teszttel történt. p<0,05-t fogadtunk el szignifikánsnak minden esetben.
45
4. Eredmények A PACAP és a PAC1 kimutatható az egér bőrben
Nem volt korábban irodalmi adat a PACAP és specifikus receptora, a PAC1 expressziójára egér bőrben. Ezért kísérleteinket ezek kimutatásával kezdtük. A PACAP38 immunreaktivitás (IR) radioimmunassay által megbízhatóan mérhető mennyiségben van jelen a különböző egér bőrminták homogenizátumában (27. ábra). A koncentrációja hasonló volt (20 és 25 fmol/mg nedves szövet) a talpi és lábháti bőrben és a fülben. Ezzel ellentétben a PACAP-IR kifejezetten kisebb mintegy 7-8 fmol/mg volt a háti bőrben.
Háti bőr
Talpi bőr Lábháti bőr
Fül
27. ábra PACAP-38 immunreaktivitás (PACAP-38-IR) radioimmunassay módszerrel történt meghatározása különböző egér bőrterületekből származó homogenizátumokban.
46
28. ábra (A) PACAP (Adcyap1) és (B) PAC1 receptor (Adcyap1r1) génexpresszió
Gapdh
referenciagén
arányában
különböző gél
bőrrégiókban, alapú
denzitometriás alapján.
PCR értékelése
OD:
optikai
denzitás. A hipofízis (PG) és a
hipotalamusz
szolgáltak kontrollként. csoportonként.
(HT) pozitív
n=4-5 Átlag
egér ±
SEM.
A PACAP-IR jelenléte mellett a peptid a bőrben mRNS szinten is kimutatható volt (28. ábra A). A Gapdh referenciagénhez képest számított relatív expressziója hasonló volt a vizsgált bőrrégiókban. Ugyanakkor a háti bőrben mért PACAP mRNS expresszió nem szignifikáns mértékben, de kisebb volt, mint más bőrterületeken, ellentétben a peptidszinten mért eredménnyel. A PACAP mRNS szintje mintegy 4-5 ször nagyobb volt a pozitív kontrollként használt hipotalamuszban és az agyalapi mirigyben. A PACAP specifikus receptora, a PAC1 szintén kimutatható volt az egér bőrben (28. ábra B). A PACAP-hoz hasonlóan, a PAC1 (Adcyap1r1) specifikus mRNS viszonylag állandó expressziót mutatott a különböző bőrterületeken. Ezen felül a specifikus PAC1IR kimutatható volt a talpbőr papilláris rétegében (27. ábra, 50. old.), ahol a felszínközeli erek és a hő-, fájdalom- és tapintási ingert felfogó szenzoros idegvégződések találhatóak [139].
47
A PACAP és PAC1 expressziója eltérően változik kapszaicin és CFA hatására
A következő lépésben meghatároztuk, hogy a neurogén (talpbőrbe adott kapszaicin injekcióval kiváltott) vagy a túlnyomórészt nem neurogén (CFA-val kiváltott) gyulladás befolyásolja-e a PACAP és a PAC1 receptor expresszióját. A kapszaicin szignifikáns, több, mint kétszeres PACAP-38-IR növekedést idézett elő a talpi bőrben 24 órával a beadása után, míg a kontralaterális, nem gyulladt oldalon nem volt változás. Ezzel ellentétben a láb talpi felszínbe adott CFA injekció nem befolyásolta a PACAP-IR-t (29. ábra).
Nem gyulladt
Gyulladt
Nem gyulladt
Kapszaicin
Gyulladt
CFA
29. ábra PACAP-immunreaktivitás
(PACAP-IR)
radioimmunassay
módszerrel
történt
meghatározása gyulladt és nem gyulladt egér talpi bőrmintákban 24 órával a gyulladás kiváltása után. A neurogén gyulladást intraplantáris kapszaicin injekcióval váltottuk ki, míg a túlnyomórészt nem-neurogén gyulladást CFA adásával. A kontralaterális oldali lábakat a megfelelő oldószerrel kezeltük. Átlag ± SEM, n=5-6 egér. *p<0,05 MannWhitney U próba vs. megfelelő nem gyulladt minta.
48
30. ábra (A) PACAP (Adycap1) és (B) PAC1 (Adycap1r1) specifikus mRNS
transzkriptumok
gyulladt és nem gyulladt egér talpi bőrben 24 órával az intraplantáris kapszaicin (Kap) vagy CFA injekció után. A kontralaterális talp bőrét a megfelelő kezeltük,
oldószerrel továbbá
kontrollként szolgált a nem kezelt dorzális lábbőr. n=5 egér/csoport.
Átlag ± SEM
relatív expresszió értékeket a Gapdh arányában fejeztük ki. *p<0,05 Mann-Whitney U próba.
Az előbbi adatokkal összhangban a PACAP mRNS expresszió a gyulladt talpi bőrben szintén szignifikánsan magasabb volt 24 órával a kapszaicinkezelés után, míg a CFA injekciót követően nem mutatott változást (30. ábra A). Ehhez hasonlóan a PAC1 receptor mRNS szintén upregulálódott a kapszaicinre, de nem a CFA-ra adott válaszként (30. ábra). Öszehasonlításként, a lábháti bőrben a PACAP és PAC1 receptor mRNS változatlan maradt talpi bőr gyulladása esetén (30. ábra A, B).
49
31. ábra A PAC1 receptorfehérje immunlokalizációja a talpi bőrben. A bal oldali panelek DAB festéssel előhívott (A) kis nagyítású (lépték: 20 μm) és (B) nagy nagyítású. Az A panel belső fotója a negatív kontrollt mutatja a PAC1 antitest blokkoló peptiddel való inkubálás után végzett immunjelöléssel. A (C) panel PAC1 expresszió kvantitatív értékelését mutatja az immunfluoreszcens metszeteken. A bőrgyulladást kapszaicinnel (Kap.) vagy CFA adásával váltottuk ki vad típusú vagy PACAP (Adycap1) génhiányos egerekben, kontrollként a megfelelő oldószer szolgált. n=6 egér/csoport, több metszet/egér, átlag ± SEM (unit range: 250x250 pixel, 10 mérés/metszet átlaga). Kétutas ANOVA és Bonferroni post hoc próba. A PCR eredményekkel összhangban az immunhisztokémiai eredmények is azt mutatják, hogy vad típusú egerekben a kapszaicin kiváltotta talpi bőrduzzadás hatására jelentősen megnövekedett a PAC1 receptorfehérje jelenléte (31. ábra). Érdekes módon, a RT-PCR eredményekkel ellentétben, a CFA kezelés szintén megnövelte a PAC1 receptorfehérje expresszióját a nem gyulladt szövetekhez képest (31. ábra C).
50
PACAP és TRPV1 hiányos egerek kisebb gyulladásos válasza kapszaicin hatására
Ezek után a kapszaicin feltételezett hatásmechanimusát vizsgáltuk PACAP és Trpv1 génhiányos egerek segítségével. Mind CD1, amelyen a PACAP hiányos egerek alapulnak, mind C57Bl/6 vad típusú egerekben a potens és szelektív TRPV1 receptor agonista kapszaicin jelentős mértékű lábduzzadást váltott ki (32. ábra A, B).
32. ábra Intraplantáris kapszaicin (A, B) vagy CFA (C, D) adásával PACAP (Adycap) és TRPV1 génhiányos
egerekben,
és
a
megfelelő
vad
genotípusú
(CD1,
C57Bl/6)
alomtestvéreikben kiváltott gyulladás során a lábduzzadás dinamikája. A hátsó láb pletizmométerrel mért térfogatnövekedése a gyulladás kiváltása előtti kiindulási érték %-ában. Átlag ± SEM, n=5-6 egér/csoport; **p<0.01 ***p<0.001 vs. WT; egyutas ANOVA és Bonferroni post hoc próba.
51
A gyulladásos válasz a maximumát (25-30%) 2 órával az intraplantáris injekció után érte el. Az ödéma fokozatosan 5-10%-ára csökkent az intraplantáris injekciót követő 24 órában (32. ábra A, B). PACAP-hiányos állatokban ez a kapszaicin által kiváltott akut (túlnyomórészt neurogén) ödémakeletkezés szignifikánsan kisebb volt a kísérlet teljes ideje alatt (32. ábra A). A várakozásoknak megfelelően a kapszaicin nem váltott ki jelenős lábduzzadást Trpv1 KO egerekben (32. ábra B). Intraplantáris CFA adása szintén a láb duzzadását eredményezte. A kinetikát tekintve a lábduzzadás szignifikáns szintet (a kiindulási értékhez képest 25-35 %-os emelkedést) ért el két órával az injekció beadása után, stabil maradt 6 órán keresztül, majd újra emelkedett 45-55%-ra a 24 órás mérési pontnál, mindkét vad típusú törzsben (32. ábra A, B). Fontos kiemelni, hogy a kapszaicinnel kiváltott válasszal ellentétben, nem volt különbség a CFA-kiváltotta ödéma között sem a PACAP (Adcyap1), sem a Trpv1 génhiányos egerekben a megfelelő vad típusú csoportokhoz képest (32. ábra C, D).
5. Megbeszélés, következtetések Eredményeink szolgáltatják az első bizonyítékot, hogy a PACAP-IR kimutatható az egér bőr különböző területein. A koncentrációja viszonylag hasonló a lábháti és talpi bőrben, valamint a fülben, míg a háti bőrben gyengébb PACAP-IR van jelen. A PACAP a peptid jelenléte mellett mRNS szinten is kimutatható volt ezekben a bőrterületeken. A Gapdh referenciagénhez képest közel azonos az expressziója a dorzális és plantáris lábbőrben, és a fülben. A PACAP (Adcyap1) mRNS kismértékben, de nem szignifikánsan kisebb a háti bőrben. A PACAP jelenlétét kimutatták korábban szenzoros idegekben [140,141], szőrtüszőkben, vérerekben, verejtékmirigyekben [122], továbbá gyulladásos sejtekben is [78]. A peptid jelentős mRNS szintű expressziója a bőrben arra utal, hogy szintézise nem-neuronális sejtekben is végbemegy. A háti bőrben mérhető kisebb, fmol/mg nedves szövettömegre számított PACAP-IR expresszió azzal magyarázható, hogy a terület kevésbé beidegzett szenzoros idegekkel, ezáltal kevesebb neuronális eredetű PACAP-ot tartalmaz, de a bőrszövet nagyobb vastagsága és az eltérő szerkezete is szerepet játszhat.
52
A PACAP szignifikáns upregulációja megfigyelhető volt a talpi bőrben mind peptid, mind mRNS szinten a kapszaicin adása után 24 órával. A kapszaicin szelektíven aktiválja a TRPV1 ioncsatornát, amelyet nem csak szenzoros idegvégződéseken, hanem pl. dendritikus sejteken és sebocitákon is leírtak a bőrben [142,143]. A TRPV1 aktiváció hatására megnövekedett PACAP expresszió magyarázható a kapszaicin közvetlen hatásával az extraneuronális TRPV1 receptorokra vagy a szenzoros idegekből felszabaduló gyulladásos mediátorok közvetett hatásával. A P-anyagról és a CGRP-ről kimutatták, hogy képesek stimulálni ezeket az epitheliális és gyulladásos sejteket, így ezek potenciálisan megnövelhetik a PACAP szintézist bennük. Munkacsoportunk korábban igazolta, hogy in vivo körülmények között a PACAP-38 a bőrben kapszaicinérzékeny rostokból felszabadul szisztémás TRPV1 aktiváció hatására [93]. Hasonlóan kimutatta csoportunk a PACAP felszabadulását ezekből az afferensekből elektromos és kémiai stimuláció hatására in vitro is [121]. Noha a szenzoros eredetű PACAP hozzájárulhat
a
gyulladt
bőrszövet-homogenizátumokban
mért
emelkedett
immunreaktivitáshoz, az mRNS szint esetében ezt nem tekintjük számbavehető mértékű tényezőnek. A kapszaicin-kiváltotta PACAP növekedéssel ellentétben, a CFA injekció nem változtatta meg sem a peptid-IR, sem az mRNS koncentrációt. A CFA kezelés megnövelte a PAC1 receptorfehérje expresszióját a nem gyulladt szövetekhez képest az mRNS eredményekkel ellentétben. E mögött állhatnak poszttranszkripciós mechanizmusok: elképzelhető a receptor mRNS megnövekedett féléletideje. A kapszaicin akut, tisztán neurogén gyulladást vált ki nociceptív szenzoros idegrostok egy alpopulációja aktiválásával a TRPV1 receptoron keresztül, amely során vazoaktív neuropeptidek szabadulnak fel [19,20,144,145], köztük PACAP is. Ugyanakkor a CFA krónikus, túlnyomórészt nem neurogén típusú gyulladásos választ idéz elő a veleszületett immunrendszer, makrofágok, T-sejtek aktiválásával, amely sejtes beszűrődéshez vezet. Mindebben a szenzoros elemek csak későbbi fázisban jutnak szerephez [146,147]. A specifikus PACAP receptor PAC1 expressziója párhuzamosan változott a PACAP-pal, amely azt jelezheti, hogy a receptor a peptid gyulladásos hatásait közvetíti.
53
A PACAP génhiányos egerekkel kapott eredményeink a lokálisan megemelkedett PACAP in vivo funkcionális jelentőségét is feltárták akut vaszkuláris gyulladásos válaszokban. A lokális, endogén PACAP potens gyulladáskeltő mediátornak bizonyult, amely
növeli
az
ödémaképződést
neurogén,
és
nem
nem-neurogén
mechanizmusoknak köszönhetően. A hátsó lábba intradermálisan beadott PACAP extravazációt kiváltó hatását szintén leírták [95]. Ezzel ellentétben munkacsoportunk korábban kimutatta, hogy i.p. injektált, alacsony dózisú PACAP-38 peptid gátolja a TRPV1 vagy TRPA1 agonisták által kiváltott akut neurogén plazma extravazációt vagy a carragenin által kiváltott “vegyes típusú” gyulladást a patkány hátsó láb talpi bőrében [93,121]. Ez a gátló hatás a P-anyag és CGRP szenzoros rostokból, valamint további gyulladásos mediátoroknak a szimpatikus rostokból vagy sejtes forrásokból való felszabadulásának gátlásával indokolható. Továbbá a PACAP közvetlen gátló hatása a vaszkuláris endotéliumra szintén feltételezhető. Ezt a lehetőséget erősíti meg a PAC1 receptorok jelenléte endothelsejteken [148], de számos adat arra utal, hogy a PACAP az érsimaizmot képest ellazítani [120,149], függetlenül az endotheliumtól. Ezen adatok alapján az endogén PACAP az akut neurogén ödéma előidézésével a bőrben a gyulladás irányába hat, pro-inflammatorikus szerepű, míg az exogén peptid gátló hatású a szenzoros neuronokból felszabaduló neuropeptidek szintjére [93,121]. Az utóbbi hatás nem az ismert PACAP receptorokon keresztül mediálódhat, mivel azok az
idegvégződésekre
stimuláló
hatású
jelátviteli
folyamatokat
közvetítenek.
Magyarázatként ettől eltérő gátló hatású mechanizmusok és célpontok szolgálhatnak, a szenzoros rostokon eddig nem azonosított receptor- vagy splice variánson keresztül. Összegezve, bizonyítékot szolgáltattunk a PACAP expressziójára és kapszaicin közvetítette upregulációjára egér bőrben, mRNS és peptid szinten egyaránt. PACAPhiányos egerekkel kimutattuk továbbá a peptid funkcionális jelentőségét: a peptid a TRPV1 aktiváció által kiváltott akut neurogén ödémaképződés fontos mediátora (33. ábra, 55. old.).
54
[107–109, 138–140]
33. ábra Eredményeink összefoglalása.
55
V.
A TRPA1 expressziója és szerepe colitisben
Kun József, Szitter István, Kemény Ágnes, Perkecz Anikó, Kereskai László, Pohóczky Krisztina, Vincze Áron, Gódi Szilárd, Szabó Imre, Szolcsányi János, Pintér Erika, Helyes Zsuzsanna Upregulation of the Transient Receptor Potential Ankyrin 1 ion channel in the inflamed human and mouse colon and its protective roles PLoS ONE, megjelenés: 2014. szeptember 29.; DOI: 10.1371/journal.pone.0108164
1. Irodalmi háttér, előzmények A gyulladásos bélbetegségek (inflammatory bowel diseases, IBD) a bélrendszer leggyakrabban előforduló krónikus gyulladásos rendellenességeit foglalja magába. Közéjük tartozik a colitis ulcerosa (UC) és a Crohn-betegség. A UC csak a vastagbelet érinti, míg a Crohn-betegségben az egész gasztrointesztinális traktust érintheti a krónikusan fennálló gyulladt állapot, de leggyakrabban a vékonybél disztális szakasza, a csípőbél és a vastagbél érintett. Az IBD fő klinikai tünetei a hasi fájdalom, hasmenés, gasztrointesztinális vérzés és testúlycsökkenés [150]. A dextrán nátrium-szulfát sója (DSS) által kiváltott egér colitis az egyik leggyakrabban alkalmazott, nem genetikai IBD modell. A DSS kémiai úton károsítja a bélnyálkahártyát (epitheliális barriert), vastagbélgyulladást és fekélyesedést idéz elő, amely a nyálkahártyában a Lieberkühnféle
kripták
progresszív
elvesztéséhez,
a
béllumen
baktériumösszetételének
megváltozásához, valamint a gyulladásos sejtek aktiválásához vezetnek [151,152]. Az IBD az emésztőrendszer fájdalmas és az életminőséget jelentősen rontó, akár életveszélyes betegségévé válhat. Az elérhető immunszupresszív terápiák komoly mellékhatásokkal járhatnak, és a betegek egy csoportja visszaeső vagy kiújuló betegségtől szenvednek. Mindezek hajtóerőt jelentenek, hogy megértsük az összetett kórélettani mechanizmusokat, kulcsmediátorokat azonosítsunk, és új terápiás célpontokat találjunk [153]. A kapszaicin-érzékeny idegrostok [18,154] az emésztőcsatornát is sűrűn beidegzik [155,156]. Itt is peptid transzmitterek, pl. P-anyag, NKA, CGRP szabadul fel ezekből a rostokból a TRPV1 aktiválás hatására [157]. A TRPV1-et kifejező, extrinsic (külső úton beidegző) szenzoros neuronok szerepet játszanak a bélgyulladásban, azonban ennek iránya ellentmondásos az IBD patogenezisében [158–165]. Az emésztőtraktusban a 56
TRPA1 különböző rendszerekben fordul elő: extrinsic elsődleges afferens neuronok, intrinsic enterikus neuronok, ill. a nyálkahártya endokrin és epithelsejtjei [34,155,156]. A TRPA1 a béllumeben környezeti kemoszenzorként működik, és gasztrointesztinális funkciókat modulál: fájdalomérzékelés, gyomortónus, a fűszeres ételek által kiváltott telítettségérzés, motilitás és szekréció [34]. A TRPA1-aktiváció gyulladásos neuropeptidek felszabadulásához vezet (tachykininek: P-anyag, NKA; CGRP) a szenzoros idegvégződésekből [166] és neurogén gyulladást váltanak ki, amelyet vazodilatációt és plazma extravazációt követő ödéma, leukocita aktiváció és migráció jellemez [17,18,167]. A trinitro-benzol-szulfonsav (TNBS) vagy dextrán-nátrium-szulfát (DSS) vastagbélbe juttatása súlyos colitist vált ki, neurogén komponenssel: CGRP és P-anyag szabadul fel az extrinsic szenzoros neuronokból [168– 170]. A CGRP szerepe protektívnek bizonyult vastagbélgyulladásban [168,169]. Irodalmi adatok szerint a P-anyag colitist kiváltó és fenntartó szerepű a DSS modellben, valamint colitis ulcerosában szenvedő
betegekben [168,171,172]. A P-anyag NK1
receptora upregulálódott a vastagbélben rágcsálókban kiváltott colitisben és IBD-ben szenvedő emberekben [170,173,174]. Kutatócsoportunk kimutatta korábban, hogy az NK1 receptor farmakológiai gátlása és a receptorgén hiánya egyaránt enyhítette az egérben kiváltott vastagbélgyulladást [173]. A TRPA1 aktiváció P-anyag felszabadulást idéz elő, ugyanakkor a receptor IBD-ben betöltött szerepe össszetett [175]. A TRPA1 irodalma colitis egérmodellben ellentmondásos, egyaránt leírták gyulladáskeltő, gyulladáscsökkentő vagy hatás nélküli szerepét is [168,176–178]. Munkacsoportunk kimutatta a 90-es években, hogy a szenzoros TRPA1 aktivációja gyulladáscsökkentő peptidek, pl. szomatosztatin felszabadulásához vezet, amely egy ellenregulációs „szenzokrin” hatást vált ki [179,180]. A téma összetettségéhez hozzájárul, hogy a nem-neuronális TRPA1 csatornák élettani szerepét még nem ismerjük [13].
57
2. Célkitűzések A jelen vizsgálat céljai a következők voltak: 1. A lokális neuronális és nem-neuronális TRPA1 mRNS és fehérjeexpresszió vizsgálata a TRPV1-gyel összehasonlításban az ép és gyulladt egér disztális vastagbélben, továbbá IBD-s betegek biopsziás mintáiban. 2. A TRPA1 szerepének vizsgálata receptor génhiányos egerekben DSS-sel kiváltott vastagbélgyulladásban és a receptor által mediált citokin, neuropeptid és neuropeptid receptor változások elemzése. A DSS által kiváltott egér colitis összevetése a humán adatokkal , eredményeink transzlációs relevanciájának kiderítése érdekében.
3. Anyagok és módszerek Kísérleti állatok
A 10 napos DSS kezelést hím, Trpa1 génhiányos (knock-out, KO) egereken [181] hajtottuk végre, amelyek 8-10 generációra visszakeresztezésre kerültek C57BL/6 egerekkel, valamint azok vad típusú (wildtype, WT) megfelelőin. Az eredeti heterozigóta (Trpa1+/-) tenyészpárokat Pierangelo Geppetti (Firenzei Egyetem) bocsájtotta rendelkezésünkre. A Trpa1 WT és Trpa1 KO vonalakat külön tenyésztettük tovább a PTE ÁOK Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetének Állatházában, 24–25 ˚C-on, standard egértáppal és víz ad libitum fogyasztásával, 12 órás sötét ciklus alatt. A kísérleti egerek 8-10 hetesek és 22-25 g közötti tömegűek voltak. Az eredeti Trpa1+/egerek utódjainak tenyészete, továbbá a kísérletek során használt egerek genotipizálása PCR módszerrel történt [182].
58
Klinikai minták
A vastagbél biopsziás mintavétel a PTE Klinikai Központ I.sz. Belgyógyászati Klinikán három betegcsoportból történt: 1. nem gyulladásos bélbetegség vagy szűrővizsgálatra érkezett egyén (n=5); 2. vastagbél tumor (polypus coli, adenocarcinoma, n=8); 3. colitis ulcerosa vagy Crohn betegség (n=10). A mintákat RNALater (Sigma-Aldrich Ltd, Budapest) folyadékban tároltuk -80˚C-on a qPCR vizsgálatokhoz. Az immunhisztokémiai mintákat formaldehidben tároltuk. Egér DSS colitis modell
Krónikus vastagbélgyulladást (colitis) váltottunk ki WT és Trpa1 KO hím egerek ivóvízébe 10 napon keresztül adagolt 2% dextrán-szulfáttal (DSS, MP Biochemical) (34. ábra, 60. old.). A vad és KO állatokat véletlenszerűen osztottuk be egy csapvizet ivó kontrollcsoportra (1-1 kontrollcsoport/genotípus, n=5/csoport) és DSS-t kapó csoportokra (n=9 WT és n=9 KO). 3-3 vad és génhiányos egeret választottunk ki véletlenszerűen a DSS-kezelés 3., 7. és 10. napján, amelyet előző éjjeli ételmegvonás után, ketamin-xilazin mélyaltatásban (100 mg/kg ketamin i.p.; Richter Gedeon NyRt, 5 mg/kg xilazin i.p.; Eurovet Animal Health BV, Hollandia) leöltünk. A vastagbél disztális harmadát kimetszettük a további vizsgálatok céljára [158,173].
59
34. ábra Kísérleti elrendezés. PFA: paraformaldehid.
Betegségaktivitási Index meghatározása
A colitis klinikai tünetei (testtömeg-változás, székletkonzisztencia, széklet vértartalma) a kezelés 1-10. napján pontozásra került. A széklet vértartalmát Hemocare teszttel (Care Diagnostica, Ausztria) határoztuk meg. A 3 paraméter pontszámait átlagoltuk az egyes egerek esetében, amellyel megkaptuk a Betegségaktivitási Indexet (Disease Activity Index, DAI) [173] (1. táblázat, 61. old.).
60
Pont Testtömeg-
0
1
2
3
4
0-0.9%
1-5%
5.1-10%
10.1-20%
>20.1%
negatív
világoskék
kék festődés
véres
teljesen
foltok/kék
véres
csökkenés
Széklet vértartalma
festődés
festődés
(Hemocare test)
Széklet
normális
normális/puha
puha
puha/vizes
vizes
konzisztencia
1. táblázat Betegségaktivitási index számítási módja.
Szövettani elemzés
A disztális vastagbél-mintákat 40 mg/ml pufferelt formaldehidben fixáltuk, metszeteket készítettünk (5 µm), majd hematoxilin-eozin festést végeztünk. Digitális mikrofotókat készítettünk Olympus BX51 mikroszkóp és Olympus DP50 fényképezőgép segítségével. A gyulladásos elváltozásokat patológus szakértő értékelte és pontozta [173], aki nem vett részt a kísérletben (2. táblázat, 62. old.).
61
Pont
0
1
2
3
4
normális
enyhe
közepes
súlyos
-
egyharmad
kétharmad
kripták
mucosa
arány
arány
eltűntek
eltűnt
csak mucosa
submucosa
teljes bélfal
-
1-25%
26-50%
51-75%
76-100%
Gyulladás súlyossága Bélkripták ép károsodása Gyulladás
nem
kiterjedése
gyulladt
Károsodott 0% terület aránya
2. táblázat A szövettani pontozás szempontjai.
Immunhisztokémia
Az immunhisztokémiai jelölést paraffinba ágyazott metszeteken végeztük. A deparaffinizált és rehidrált szöveti mintákat pH 6-on citrát pufferben inkubáltuk mikrohullámú sütőben, 3x5 percig, 750 W-on, antigénfeltárás céljából. A szövetek endogén peroxidáz aktivitását 20 perces 3%-os hidrogén-peroxidban (H2O2) való inkubációval
gátoltuk.
A
másodlagos
antitest
nem
specifikus
kötődését
megakadályozandó a mintákat normál kecske szérumban inkubáltuk 20 percig. Ezután a metszeteket poliklonális elsődleges antitesttel inkubáltuk 1 órán át: egér anti-CD68 (KP1) antitest: ab125212 (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) 1:300 hígításban; egér és humán TRPA1 antitest: ab68847 1:300 hígításban, a specificitását teszteltük az immunizáló peptiddel történő preadszorpcióval (ab150297, 1:100 hígításban, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság); egér TRPV1 antitest ab74813 1:300 hígításban, a specificitását teszteltük az immunizáló peptiddel történő preadszorpcióval (ab190844 1:100 hígításban, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság; humán TRPV1 antitest: GP14100 1:100 hígításban, a specificitását teszteltük az immunizáló peptiddel történő preadszorpcióval (P14100 1:10 hígításban, Neuromics, Edina, USA). 62
Ezek után másodlagos torma-peroxidázzal konjugált EnVision system megfelelő antinyúl vagy anti-tengerimalac másodlagos antitesttel (Dako-Cytomation) 30 percig. Végül a TRPV1 receptorok immunlokalizációját diamino-benzidinnel (DAB) hívtuk elő 10 percig, magfestést hematoxilinnal végeztünk.
Kvantitatív PCR
Az RNA Later folyadékban (Sigma-Aldrich Kft.) -80°C-on tárolt mintákat 1 ml TRI reagensben (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) homogenizáltuk. Totál RNS-t izoláltunk a gyártó utasításainak megfeleően, a vizes fázis kinyeréséig. A szövetmintákat 1 ml TRI Reagensben homogenizáltuk, majd 200 µl bróm-klór-propánt (BCP, Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) adtunk hozzá. A következő lépésben kapott vizes fázisból RNS-t izoláltunk a Direct-zol RNA MiniPrep kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA) segítségével, a gyártó leírásának megfelelően. 400 µl vizes fázishoz 400 µl abszolút etanolt adtunk, az elegyet az oszlopra mértük, majd mosási lépések után 50 µl RNáz mentes vízben eluáltuk. A kinyert RNS mennyiségét és tisztaságát Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer V3.5 (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA) segítségével állapítottuk meg. 1 µg total RNS reverz transzkripcióját végeztük Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) segítségével, oligo dT-vel, 20 μl térfogatban, a gyártó utasításainak megfelelően. Az így kapott cDNS mintákat MX3000P qPCR system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) és Maxima Master Mix (SYBR Green vagy próba detektáláshoz, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). A PCR ciklusok paramétereit a master mix gyártójának utasításai alapján állítottuk be (kétlépéses PCR program: 95°C 10 perc; 95°C 15s, 60°C 1 perc, 40 ciklus). Az alkalmazott assay-ket a 2. függelék tartalmazza. Referenciagénként a béta-glükuronidáz (GUSB) és a GAPDH szolgáltak, az Cq értékeik mértani közepét vettük. A primerek hatékonyságát meghatároztuk, értékeik a 95-105% tartományba estek. A cDNS mintákat duplikátumban mértük le, a minták Cq értékei átlagát vettük figyelembe a technikai variabilitás csökkentése érdekében, a grafikonok a biológiai variabilitást ábrázolják. A relatív génexpressziót a 2-ΔΔCt módszerrel számítottuk ki. 63
Luminex RNS assay
QuantiGene 2.0 Plex Assay (Plex Set 21491 MOUSE 8 plex Magnetic Beads; kat. szám: 321491; Affymetrix Inc./Panomics, USA) segítségével kvantifikáltuk 1 referenciagén (beta-aktin) és 7 célgén mRNS szintjét (3. függelék) az egér disztális vastagbél mintákból izolált totál RNS-ből (az RNS izolálás leírását lásd a Kvantitatív PCR-nál), a gyártó instrukcióinak megfelelően. A befogó próbákat tartalmazó Luminex gyöngyöket inkubáltuk overnight 20 μl RNS mintával (0,5 µg/µl) és a génspecifikus próbákkal. Minden mintát duplikátumban mértünk le. A 2. napon hajtottuk végre a jelamplifikálást: a mintákat inkubáltuk a pre-amplifikáló, amplifikáló, majd a jelölő próbákkal. A detektálást streptavidin phycoerythrin (SAPE) hozzáadásával, majd a jel leolvasásával végeztük el Magpix készülék (Luminex Corp., USA) segítségével. Az mRNS expresszióváltozást a béta-aktin referenciagénhez normalizáltuk és a gyártó utasításainak megfelelően számoltuk ki.
Luminex Multiplex Immunassay
A kimetszett és -80°C-on tárolt egér disztális vastagbél szövetmintákat a mérés megkezdése előtt kiolvasztottuk, lemértük a tömegüket, és azonnal proteáz inhibitort (10 mg/ml fenil-metil-szulfonil-fluorid: PMSF) tartalmazó PBS oldatba helyeztük, majd homogenizáltuk.
Ezután
Triton
X-100-at
adtunk
a
mintákhoz
(10
mg/ml
végkoncentráció) és centrifugáltuk (10000g, 5 perc) a sejttörmelék eltávolításához. A Luminex Multiplex Immunoassay végrehajtása a korábban leírtaknak megfelelően történt [183]. Az alábbi citokineket/kemokineket határoztuk meg (Milliplex Map Kit, egyedi rendelésre összeállított, Millipore), amelyeket munkacsoportunk korábbi mérései alapján [44] választottunk ki: 1. interleukin-1β (IL-1β); 2. monocita chemotaktikus protein-1 (MCP-1, más néven chemokine /C-C motif/ ligand 2: CLC2); 3. monokine induced by gamma interferon (MIG, más néven chemokine, C-X-C motif ligand 9: CXCL9); 4. regulated on activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES, más néven chemokine /C-C motif/ ligand 5: CCL5). A mérést a gyártó utasításainak megfelelően végeztük el. Előzetes optimalizálást követően a mintákat hígítás nélkül, vakon mértük le. Luminex100 készüléket használtunk és Luminex 100 IS 64
szoftverrel analizáltuk a gyöngyök medián fluoreszcens intenzitásértékeit. A mintákat RPMI-1640 (GIBCO) oldatban (1% protease inhibitor keveréket tartalmazott) homogenizáltuk, a mintákat 20 mg/ml koncentrációban mértük le, duplikátumban. Minden minta, kontroll vagy standard 25 µl-ét 96 lyukú lemezre (a kit része) mértük, 25 µl antitesttel borított, fluoreszcens gyönggyel együtt. Biotinilált másodlagos antitestet és streptavidin-PE-t adtunk a lemezre, a megfelelő inkubációs és mosási lépések után. Az utolsó mosási lépés után 100 µl puffert adtunk minden egyes well-be.; a lemezt a Luminex100 array reader készülékben inkubáltuk és olvastuk le, majd öt-PL regressziós görbe segítségével ábrázoltuk a standard görbét. Az adatokat MasterPlex szoftver segítségével elemeztük. A végeredményt pg/g nedves szövet formában adtuk meg. Statisztika
Az eredményeket átlag ± SEM formában fejeztük ki. Az állatok egy csoportban egyszerre elemzett számának (n=3-5 állat/csoport) megfelelően nem paraméteres statisztikai próbákat alkalmaztunk (Kruskal-Wallis és Mann-Whitney próba). A Betegségaktivitási Index esetében, a két genotípus összehasonlításakor az egyszerre elemzett nagyobb elemszám (n=14/genotípus) miatt, a normáleloszlás tesztelése után (Kolmogorov-Smirnov próba) kétutas ANOVA-t és Bonferroni post hoc próbát használtunk. A statisztikai számításokat GraphPad Prism 5.02 for Windows (GraphPad Software, USA) szoftverrel végeztük. p<0,05 valószínűségi értékeket tekintettük szignifikánsnak.
65
4. Eredmények TRPA1 és TRPV1 génexpresszió
Egér DSS colitis
35. ábra A
B
Trpa1 mRNS expresszió 10 napos DSS kezelés során (A) qPCR és (B) RNS assay módszerrel.
Átlag ± SEM. Mann-Whitney próba, *p<0,05 vs. intakt kontroll; n=3-5/csoport. A qPCR eredmények alapján a Trpa1 mRNS upregulálódott egerekben a DSS kezelés 7. napján, a vizet ívó kontrollokhoz képest (35. ábra A). Az RNS assay adatai megerősítik ezt az expressziós mintázatot (35. ábra B).
A
B
36. ábra Trpv1 mRNS expresszió 10 napos DSS kezelés során (A) qPCR és (B) RNS assay módszerrel.
Átlag ± SEM. Mann-Whitney próba; n=3-5/csoport.
A Trpv1 mRNS szintek WT egerekben qPCR (36. ábra A) és RNS assay (36. ábra B) módszerrel sem mutattak statisztikailag szignifikáns változást a DSS kezelés hatására. 66
Az RNS assay közvetlenül az mRNS-t detektálja, ellentétben a qPCR-ral. Utóbbi egy további lépést (reverz transzkripció) is magában foglal, amely növeli a technikai variabilitást. A két módszer egyező értékei validálják eredményeinket.
Klinikai minták
A
B
37. ábra (A) TRPA1 és (B) TRPV1 mRNS expresszió aktív (+) és inaktív (-) fázisú IBD-ből származó vastagbél
szövetmintákban, a gyulladás nélküli kontroll, illetve tumormintákhoz viszonyítva. Átlag ± SEM. Kruskal-Wallis és Dunn post hoc próba: *p<0,05; n=5-8/csoport.
A TRPA1 mRNS szintje szignifikánsan megnőtt az aktív státuszú IBD-betegekben, míg az inaktív állapotúakban nem (37. ábra A). A TRPV1 mRNS szignifikánsan csökkent az aktív IBD betegekben a gyulladás nélküli csoporthoz képest (37. ábra B). Az összehasonlításként használt tumoros vastagbél biopsziás mintákban kimutatható a lokális TRPV1 és TRPA1 génexpresszió, de egyik sem mutat szignifikáns különbséget a nem gyulladt kontrollokhoz képest (37. ábra).
67
TRPV1 és TRPA1 immunhisztokémiai lokalizáció Egér DSS colitis
68
38. ábra Reprezentatív szövettani felvételek (A) TRPA1 és (B) TRPV1 antitest jelöléssel. Intakt, nem gyulladt disztális vastagbél, és 7 napig DSS-t ivó egerek gyulladt bélszövete. Belső kép: KP1 (anti-CD68) antitesttel jelölt makrofágok. Csillag: vastagbél lumen. Nyílak: a: gyenge immunpozitivitás a nyálkahártya epithelsejtjein; b: jelentős immunpozitivitás a nyálkahártya idegrostjai és vérerei régiójában; c: plexus myentericus idegrostok; d: plexus myentericus ganglionok; e: submucous plexus. g: infiltrálódó leukociták; h: kifejezett immunpozitivitás a gyulladásos leukocitákon; i: intersticiális plazmasejtek a submucosában. Immunhisztokémiai bizonyítékot szolgáltattunk arra, hogy a TRPA1 receptor immunpozitivitás megtalálható a nyálkahártya epithelsejtjein, a bélnyálkahártya idegrostjai és vérerei környezetében, a myenterikus idegrostokon és ganglionokon a vizet ivó, kontroll C57Bl/6 egerek disztális vastagbél metszetein (38. ábra A, 68. old.). A DSS-kezelt egerek disztális vastagbél metszetei ezen felül TRPA1 immunfestődést mutattak intersticiális makrofágokon és a plexius submucosus struktúráin. Az infiltrálódó
makrofágok
jelenlétét
megerősítettük
a
mucosában
anti-CD68
immunjelöléssel. A TRPV1 receptort detektáltuk az enterikus ganglionokon, és gyenge immunpozitivitás volt jelen az intakt, kontroll egerek disztális vastagbél metszeteiben az epithelrétegben (38. ábra B, 68. old.). A DSS-kezelt állatok ezen felül TRPV1 immunjelölést mutatnak a plexus submucosában, a mucosa makrofágaiban, a submucosa plazmasejtjeiben és jelentős immunfestődés volt jelen az epithelréteg közeli fehérvérsejteken. Humán disztális vastagbél
A kontrollként szolgáló, nem gyulladt vastagbél klinikai mintákban gyenge TRPA1 (39. ábra, 70. old.) és TRPV1 (40. ábra, 71. old.) immunpozitivitást találtunk a bélkripták epitheliumában. IBD betegekben TRPA1-pozitív immunjelölés volt kimutatható a bélkripták neuroendokrin sejtjein, Paneth sejteken, makrofágokon és intersticiális plazmasejteken.
A
TRPV1
immunfestést
szintén
kimutattuk
intersticiális
plazmasejteken és makrofágokon. A neuroendokrin sejtek egy részén gyenge, sporadikus TRPV1 immunjelölést detektáltunk. 69
A
39. ábra Reprezentatív mikrofotók TRPA1 specifikus antitesttel jelölt klinikai szövetmintákról. (A) nem gyulladt szövetminta. Nyílhegy: kripta epithelsejtek.
B (B) Colitis ulcerosa. a: neuroendokrin sejteknek megfelelő granulált mirigysejtek; b: Paneth sejtek; c: intersticiális makrofágok.
(C) Crohn betegség. a:
C
neuroendokrin sejteknek megfelelő granulált mirigysejtek; d: infiltrálódó plazmasejtek és makrofágok.
70
A
40. ábra Reprezentatív mikrofotók TRPV1specifikus antitesttel jelölt klinikai szövetmintákról. (A) Nem gyulladt kontrollminta. Nyílhegy: kripta epithelsejtek;
B
(B) Colitis ulcerosa c: intersticiális makrofágok.
C
(C) Crohn betegség. d: infiltrálódó plazmasejtek és makrofágok.
71
Betegségaktivitási Index az egér DSS modellben
A
B
41. ábra A. A betegségaktivitási index ábrázolása a DSS kezelés 10 napja folyamán Trpa1 WT és KO genotípusú egerekben. Kétutas ANOVA genotípus faktor: ***p<0,0001; Bonferroni post hoc próba: 8. nap **p<0,01; 9. nap *p<0,05. B. Az „A” grafikon görbe alatti területeinek összehasonlítása a 10 napig DSS-t ivó állatok csoportjában. Mann-Whitney próba *p<0,05.
72
A Betegségaktivitási Index (Disease Activity Index, DAI) szignifikánsan nagyobb volt a TRPA1 receptor hiányában a 10 napos kísérlet során (kétutas ANOVA genotípus faktor, görbe alatti terület), ill. a KO állatokban a WT genotípusúakhoz képest a 8. és 9. napon (41. ábra, 72. old.).
Szövettani pontozás az egér DSS modellben
42. ábra Hematoxilin-eozin festés intakt és 10 napig DSS-t ivó, vad genotípusú és Trpa1 K.O. egerek disztális vastagbél mintáiból készült szövetmetszeteken. a: intakt bélkripta; b: károsodott bélkripta; c: neutrofil infiltráció a mucosában; neutrofil infiltráció a submucosában. Nagyítás: 100x; belső képek: 400x.
73
2% DSS kezelés gyulladást és szöveti károsodást okozott a szövettani (hematoxilineozinnal festett) metszetek alapján, az intakt állatok ép kriptákat és nyálkahártya epithelréteget tartalmazó szövettani felvételeihez képest (42. ábra, 73. old.). A mucosában és a submucosában fokozott neutrofil infiltráció, a bélkripták elvesztése, továbbá a nyálkahártya szerkezetének dezintegrációja volt megfigyelhető mindkét genotípusban. A súlyossága és kiterjedtsége ezen patológiai elváltozásoknak szignifikánsan nagyobb volt a TRPA1 receptor hiányában a 10. napon a WT egerekhez képest (43. ábra).
43. ábra A szövettani pontozás eredménye intakt és DSS-kezelt, WT és Trpa1 KO egerek disztális vastagbél szövetmintáiból készült, hematoxilin-eozinnal festett metszetein. Kétutas ANOVA és Bonferroni post hoc próba **p<0,01 WT vs. KO a 10. napon.
Citokin mRNS expresszió egér DSS modellben
A
TNF-α,
BLC,
M-CSF
és
IL-1
receptor
antagonista
citokinek/kemokinek
transzkriptumait kimutattuk az ép és gyulladt vastagbélmintákban (44. ábra, 75. old.). A TNF-α (Tnf) génexpresszió upregulálódott a 3. napon mindkét genotípusban a nem gyulladt kontrollhoz képest. A KO állatokban magasabb volt a TNF-α expresszió a vad 74
típusúakhoz képest. A BLC (Cxcl13) mRNS szintje szignifikánsan megnőtt a DSS kezelés 10. napján a KO egerekben, mind az azonos napon leölt vad állatokhoz, mind a kezeletlen kontroll egerekhez képest. Az M-csf génexpresszió mindkét genotípusban csökkent a 10. napon, a vad és génhiányos egerek között nem volt különbség. Az IL-1rn génexpresszió nem változott szignifikánsan a vizet ivó kontrollcsoporthoz képest.
A
B
C
D
44. ábra Intakt és DSS-kezelt, Trpa1 WT és KO egerek disztális vastagbél szövetmintáiban (A) TNF-α, (B) BLC, (C) M-CSF, (D) IL-1rn citokin mRNS expresszió változása. Átlag ± SEM. Mann-Whitney próba, *p<0,05 vs. intakt kontroll; #p<0,05 WT vs. KO. n=3-5/csoport.
Citokin fehérjeexpresszió egér DSS modellben
A Luminex multiplex mikrogyöngy array módszer segítségével (45. ábra, 76. old.) az egér disztális vastagbélmintákban detektált 4 citokin/kemokin közül az IL-1β protein szignifikánsan kisebb mennyiségben volt jelen a vizet ivó kontroll KO állatokban, a megfelelő vad típusú csoporthoz képest (45. ábra A). 75
A
B
C
D
45. ábra Luminex
multiplex
mikrogyöngy
array
módszerrel
detektált
gyulladásos
citokin/kemokin (A: IL-1β, B: MCP-1, C: RANTES, D: MIG) fehérjexpressziós mintázat intakt és DSS-kezelt, vad és Trpa1 KO egerek disztális vastagbél szövetmintáiban. Átlag ±SEM. Mann-Whitney próba *p<0,05, **p<0,01 vs. intakt kontroll; #p<0,05, ##p<0,01 WT vs. KO, n=3-5/csoport.
76
A DSS kezelés szignifikánsan megemelte a citokin szintjét mindkét genotípusban. A kísérlet 3. és 7. napján szignifikánsan megnőtt az IL-1β szintje a KO állatokban, a megfelelő intakt kontrollcsoporthoz képest. A 10. napon csökken a citokin expressziója a KO egerekben a 7. naphoz képest, de még szignifikánsan magasabb marad a megfelelő intakt kontrollhoz képest. A vad genotípusú állatokban az expressziója csökken a 10. napra a vad intakt csoporthoz képest. Az MCP-1 szintje szignifikánsan megnőtt a DSS-kezelt KO csoportban a 7. és 10. napon mind a vizet ivó KO kontrollokhoz, mind a 10. napon a vad típusúakhoz képest (45. ábra B). A RANTES koncentrációja szignifikánsan csökkent a DSS fogyasztás hatására a 10. napra mindkét genotípusban a megfelelő intakt kontrollokhoz képest (45. ábra C). A vad és KO egerek mintáiban nem különbözött a RANTES szintje. A MIG expresszió szignifikánsan megemelkedett a KO egerekben a 7. napon mind a vizet fogyasztó, intakt KO, mind az azonos napi WT állatokhoz képest (45. ábra D).
Receptor és neuropeptid génexpresszió a gyulladt vastagbélben
46. ábra qPCR módszerrel detektált Trpv1 génexpressziós profil intakt és DSS kezelt, vad és Trpa1 KO egerek disztális vastagbél szövetmintáiban. Átlag ± SEM. Mann-Whitney próba, *p<0,05 vs. intakt kontroll; n=35/csoport.
A Trpv1 mRNS expresszióját nem változtatta meg szignifikánsan a DSS kezelés a vad genotípusú egerekben (46. ábra). A KO állatokban ugyanakkor szignifikánsan csökkentette a DSS fogyasztás a Trpv1 génexpressziót a 10. napon.
77
B
A
C
D
E
F
G
H
47. ábra qPCR és Luminex multiplex mikrogyöngy array módszerekkel detektált neuropeptid és neuropeptid receptor génexpressziós profil intakt és DSS-kezelt, vad és Trpa1 KO egerek disztális vastagbél szövetmintáiban. (A) Vip, (B) PACAP (Adcyap), (C) PAC1R (Adcyap1r1), (D) VPAC1 (Vipr1), (E) VPAC2 (Vipr2), (F) Szomatosztatin, (G) Sstr1, (H) Sstr4. Átlag ± SEM. Mann-Whitney próba, *p<0,05 vs. intakt kontroll; #p<0,05, WT vs. KO, n=3-5/csoport.
78
A szomatosztatin, PACAP és VIP neuropeptidek, valamint receptoraik (SSTR1, SSTR4, PAC1, VPAC1, VPAC2) mRNS szinten kimutathatóak mind a nem gyulladt, mind a gyulladt disztális vastagbélben (47. ábra, 79. old.). A vizet ivó intakt állatokban nincs különbség a neuropeptid és receptor génexpressziós profilban a vad és Trpa1 KO állatok között. A Vip génexpresszió szignifikánsan megnőtt mindkét genotípusban a DSS kezelés hatására a saját intakt kontrollcsoportjaikhoz képest, de a 10. napon jelentősen megnőtt a KO egerekben a WT egerekhez képest is (47. ábra A, 79. old.). DSS kezelés hatására a PACAP (Adcyap1) mRNS szignifikánsan megnőtt a KO, de nem a vad egerekben, a megfelelő intakt kontrollcsoportokhoz viszonyítva (47. ábra B, 79. old.). A 10. napon a PACAP (Adcyap1) mRNS szintje szignifikánsan nagyobb volt a Trpa1 KO egerekben a vad típusúakhoz viszonyítva. A PAC1 (Adcyap1r1), a VPAC1 (Vipr1) és a VPAC2 (Vipr2) transzkriptumai kimutathatóak a vizet ivó és DSS-kezelt vad és KO állatokban (47. ábra C, D, E, 79. old.). A VPAC1 (Vipr1) receptor expressziója szignifikánsan csökkent a KO csoportban a 10. napon az intakt kontrollokhoz képest (47. ábra D, 79. old.). A PAC1 és VPAC2 szintjét nem befolyásolta szignifikánsan a genotípus vagy a DSS kezelés (47. ábra C, E, 79. old.). A lokális, leukocita eredetű szomatosztatin génexpresszió nem változott szignifikánsan egyik genotípusban sem a DSS fogyasztás hatására, és a genotípusok között sem volt különbség (47. ábra F, 79. old). Hasonlóan, a SSTR1 és a SSTR4 receptorok mRNS expresszióját sem befolyásolta a DSS adása vagy a TRPA1 hiánya (47. ábra G, H, 79. old.). A P-anyagot és a NKA-t kódoló Tac1 gén, a NKB-t kódoló Tac3 gén és az NK1 receptort kódoló Tacr1 gén expressziója kimutatható a nem gyulladt és a DSS-kezelt disztális vastagbélben egyaránt (48. ábra, 81. old). A Tac1 és Tacr1, de nem a Tac3 mRNS szignifikánsan kisebb a vizet kapó, intakt KO állatokban, a WT egerekhez képest. DSS adás hatására, a Tac1 mRNS megemelkedett mindkét genotípusban. A 10. napon a Tac1 génexpresszió szignifikánsan nagyobb volt a KO állatokban a vad típusúakhoz képest. A Tac3 mRNS upregulálódott a KO egerekben a 10. napon mind az intakt KO, mind a megfelelő WT egerekhez képest. A Tacr1 mRNS szignifikánsan megnőtt a DSS kezelés hatására a 3., 7. és 10. napokon a KO állatokban.
79
A
48. ábra Tachykinin
és
tachykinin
receptor
génexpressziós profil intakt és DSS kezelt, vad
és
Trpa1
KO
egerek
disztális
vastagbél szövetmintáiban. Átlag ± SEM. Mann-Whitney próba, *p<0,05 vs. intakt kontroll; #p<0,05, ##p<0,01 WT vs. KO, n=3-5/csoport. (A) Tac1 mRNS; (B) Tac3
B
mRNS; (C) NK1 (Tacr1) mRNS.
C
80
5. Megbeszélés, következtetések TRPA1 és TRPV1 immunfestődést és génkifejeződést mutattunk ki egér és humán vastagbélben. Gyulladás hatására a TRPA1, de nem a TRPV1 mRNS szignifikánsan megemelkedett. A TRPA1 receptor protektív szerepét egyértelműen demonstráltuk DSS colitis modellben a betegség aktivitási index és a szövettani pontozás alapján, amelyeket a TRPA1 által mediált gyulladásos citokin és neuropeptid csökkenés is alátámaszt. A TRPA1 szerepe a viscerális fájdalom közvetítésében bizonyított [155,156,178,184– 187]. TRPA1 antagonisták klinikai vizsgálatok alatt állnak gyulladásos, neuropáthiás és viszcerális fájdalom kezelésére [188]. Az IBD patogenezisében betöltött szerepére ugyanakkor ellentmondó adatok állnak rendelkezésre: leírták a TRPA1 gyulladáskeltő és gyulladásgátló hatást közvetítő szerepeit, valamint ezek hiányát is [168,177,178]. Az általunk vizsgált, vizet ivó kontroll, vad genotípusú egerek vastagbélmintáiban gyulladáskeltő mediátorok (P-anyag, NKA és NKB mRNS, IL-1β fehérje) szignifikánsan nagyobb alapszintjét mértük a TRPA1 receptorgén-hiányos egerekhez képest. Ezt azzal magyarázhatjuk, hogy a Trpa1 gén hiánya csökkenti a bél mikroflórájának és metabolitjainak aktiváló/szenzitizáló hatását. Ez a TRPA1 folytonos, „tónikus” aktiválására utal, amelynek a homeosztázis fenntartásában lehet szerepe. Mindez megfelel az irodalomban leírt, P-anyag felszabadítással mediált gyulladáskeltő szerepének [168,169]. Ezzel ellentétben adataink alapján azt gondoljuk, hogy gyulladásos körülmények között a vastagbélben a TRPA1 szerepe eltolódik a gyulladásgátlás irányába. Ismert, hogy a TRPA1 gyulladáscsökkentő szomatosztatin felszabadulását mediálja [180], amely anti-inflammatorikus lehet gyulladásos bélbetegségben is. A TRPA1-et expresszáló szenzoros rostok stimulációjakor felszabaduló CGRP hiányában kiváltott kísérletes colitis súlyosabb [168,169]. Munkacsoportunk kimutatta, hogy a szenzoros TRPA1 specifikus aktiválása H 2S-dal CGRP felszabadulással jár, amely vazodilatációt okoz [189], valamint a H2S, részben a TRPA1 aktiválásán keresztül, protektív lehet DSS colitisben [190]. A TRPA1 által közvetített gyulladásgátló szerep mechanizmusát illetően a DSS által kiváltott egér colitisben, az NK1 receptor csökkent expresszióját mutattuk ki vad genotípusú egerekben, a TRPA1 hiányos egerekhez képest. Az NK1 receptor (Tac1r) 81
mRNS szintjének növekedését írták le a TRPA1 agonista mustárolajjal (MO) kiváltott colitisben [170], azonban TRPA1 hiányos egerekben nem vizsgálták a mustárolaj hatását. A TRPA1 védőhatást fejtjhet ki a gyulladáskeltő, IBD-ben is szerepet játszó P-anyag, NKA és NKB [168,171,172,191–195] expressziójának csökkentésével. A TRPA1 jelenléte csökkenti a PACAP és a VIP szintézisét a gyulladt vastagbélben, míg a PACAP/VIP receptorok szintje nem változik szignifikánsan. Közelmúltbeli adatok a VIP gyulladáskeltő szerepére utalnak DSS-colitisben, ugyanakkor más források heterogén képet mutatnak a VIP kísérletesen kiváltott colitisben és humán IBD-ben való expressziójáról és szerepéről [97,196–201]. A vastagbélben detektált VIP (Vip) és PACAP (Adcyap1) mRNS-nek számos forrása van (enterikus neuronok, leukociták), továbbá ezen peptidek többféle PACAP/VIP receptortípuson és variánson hatnak, amelyek sejttípustól függően eltérő jelátviteli útvonalakhoz kapcsolódhatnak (10. ábra, 18. old.) [78,196]. Ezért további vizsgálatok tárgya lehet, hogy az általunk mért szignifikáns PACAP és VIP szintézis emelkedés milyen szerepet játszik a vastagbél gyulladásos folyamataiban. Munkacsoportunk korábban nagyszámú citokin/kemokin (panel alapú) vizsgálatát végezte el [173], amely alapján 8 mediátort választottunk ki a vastagbélgyulladás jellemzésére
kísérletünkben.
Közülük
három
kifejeződésében
nem
találtunk
különbséget a WT és Trpa1 KO egerek között, így nem feltételezzük, hogy a TRPA1 mediálja a keletkezésüket: RANTES és M-CSF: szintézisük szignifikánsan csökkent a DSS-kezelés 10. napjára, mindkét genotípusban. A RANTES (CCL5) elsősorban T-limfociták által termelt, míg az M-CSF-et leukociták széleskörűen expresszálhatják, utóbbi szerepe a monociták aktiválása [202]. IL-RN: az anti-inflammatorikus, leukociták és epithelsejtek által is termelt interleukin-1 receptor antagonista citokin a DSS kezelés hatására emelkedő majd csökkenő tendenciát mutatott mindkét egértörzsben [202]. További öt citokin genotípus szerint differenciáltan expresszálódott, a TRPA1 jelenléte csökkentette szintézisüket: 82
TNF-α: korai gyulladásos citokin, amelyet leukociták termelnek. Diszregulációja szerepet játszik IBD-ben; az anti-TNF-α terápia alkalmazása elterjedt [203,204]. Kimutatták, hogy DSS colitis modellben a korai immunválaszban játszik szerepet. [152,205,206] A Th1/Th17 sejtek által mediált, magas TNF-α szinttel járó akut gyulladást egy túlnyomórészt Th2 sejtek által dominált krónikus gyulladásos válasz váltja fel, amely alacsonyabb TNF-α szinttel jár. Érdemes megemlíteni, hogy a TNF-α fehérje mennyisége késéssel követheti a kísérlet 10. napján mért kisebb mRNS szintet, azaz a géntermék még jelen lehet nagyobb mennyiségben. Eredményeink alapján a TRPA1 receptor aktiválása csökkentheti a TNF-α szintézisét, amely hozzájárulhat a receptor gyulladásgátló funkcióhoz. MIG és MCP-1: a két leukocita attraktáns kemokin szintjét is szignifikánsan csökkentette a TRPA1 aktiváció a gyulladásgátló hatásainak részeként. IL-1β: gyulladáskeltő citokin, amelyet a veleszületett immunrendszer setjei (pl. gyulladáskeltő M1 típusú makrofágok) mellett az enterikus neuronok is termelnek [207]. Az IBD lefolyását súlyosbító szerepe jól ismert
[208]. TRPA1 jelenlétében
szignifikánsan csökkent a szintje. BLC (CXCL13): a szerepét kimutatták az IBD-ben keletkező aberráns limfoid szövet kialakulásában [209], szintje csak a TRPA1 receptor hiányában emelkedett meg a DSS kísérlet 10. napján. Citokineket/kemokineket immunrendszer és más eredetű sejtek (epithelsejtek, enterikus neuronok) is termelhetnek, így kifejeződésüket nem tudjuk minden kétséget kizáróan sejttípushoz rendelni adataink alapján. Érdemes kiemelni, hogy a TRPA1 receptor jelenléte csökkentette a klasszikus úton aktivált, gyulladáskeltő M1 irányba polarizált makrofágok által karakterisztikusan szekretált [202] IL-1β, MCP-1 (CCL2) és TNF-α szintjét. Ugyanakkor a túlnyomórészt T-limfocita eredetű [202] RANTES szintézisét nem mediálta a TRPA1 receptor. Poole és mtsai [210] 2011-ben leírták a TRPA1 ioncsatorna jelenlétét és bizonyos protektív hatásait az egér vastagbélben. Azt találták, hogy a neuronális TRPA1 aktiválása gátolja a spontán neurogén kontrakciókat és így a béltranzitot. A TRPA1 83
ilyen módon véd a gyulladásos mediátorok szenzitizáló/aktiváló hatásától. Az általunk kimutatott és mások eredményeivel [170,211,212] korreláló TRPA1 génexpresszió emelkedés
egér
és
emberi
vastagbél-mintákban
az
enterikus
neuronok
receptorszintézisére utalhat. A TRPA1, TRPV1 receptorfehérjét kimutattuk a plexus myentericusban és a plexus submucosusban. A Trpa1 mRNS upregulációja a DSS kezelés 7. napján, de még nem a 3. napon a génexpresszió szintjén késleltetett választ jelezhet. Kimutatták, hogy stimuláció hatására a TRPA1 receptorfehérje az intracelluláris raktárakból a neuronok plazmamembránjába szállítódik [213]. Mivel a citoplazmában már jelenlévő TRPA1 fehérjemolekulák kerülnek a membránba, az aktív ioncsatorrnák száma a transzkripció azonnali növekedése nélkül is emelkedhet. A 10. napon tapasztalt emelkedés hiánya a Trpa1 mRNS-t szintetizáló struktúrák károsodásával magyarázható. Érdemes figyelembe venni, hogy az mRNS szint csökkenését késéssel követheti a fehérjeszint változása. A makrofágokon található TRPA1 receptornak gyulladáscsökkentő szerepet is tulajdonítanak [176], lásd lentebb, ezen sejtek infiltrációja is hozzájárulhat a megnőtt Trpa1 génexpresszióhoz. A mintáinkban detektált lokális Trpa1 mRNS kevésbé valószínű, hogy az extrinsic szenzoros neuronokból ered, ezért nem informatív a vastagbelet beidegző dorzális ganglionokban szintetizált TRPA1 csatornák szerepét illetően. A Trpv1 esetében nem tapasztaltunk szignifikáns mRNS upregulációt a DSS kezelt vad típusú állatokban, hasonlóan a mustárolajjal kiváltott colitishez [170]. Érdekes módon a Trpa1 KO állatokban a DSS által okozott nagyobb gyulladással párhuzamosan a lokális Trpv1 mRNS szignifikánsan csökkent a 10. napra. Az IBD betegek esetében szintén csökkent TRPV1 mRNS expressziót detektáltunk, míg mások colitis ulcerosa betegekben nem mértek változást [214]. További vizsgálatok szükségesek annak tisztázására, hogy az általunk mért TRP mRNS szintekért az egyes sejttípusok milyen arányban felelősek, hiszen a szövetmintáinkban a különböző sejtek mRNS expresszió változásai eredőjét mértük. Az extrinsic szenzoros TRPV1 receptorok gyulladáskeltő és gyulladáscsökkentő funkciókat
egyaránt
mediálnak,
upregulációjukat
detektálták
IBD-ben
[158–
165,184,215–217]. A receptorfehérje intraaxonálisan transzlokálódik a perifériára [73], ugyanakkor van adat arra vonatkozóan, hogy a TRPV1 mRNS kimutatható perifériás 84
axonokban [218]. Korábbi eredményeink szerint a bőrben és szájnyálkahártyában az extraneuronális TRPV1 expressziót nem befolyásolja a primér szenzoros afferensek kémiai vagy sebészi denervációja [219]. Továbbá, a nem neuronális TRP mRNS szintek jóval alacsonyabbak a neuronális sejtekénél [15,100]. E mögött azt feltételezhetjük, hogy az akciós potenciál kiváltásához nagyobb receptorsűrűségre van szükség, mint a nem neuronális sejtekben ellátott szerepekhez. Mindezek alapján úgy gondoljuk, enterikus neuronok járulnak hozzá túlnyomórészt a mintáinkban mért TRP mRNS expresszióhoz. Az intrinsic enterikus TRPV1 jelenlétére egyre több bizonyíték van, de a bélben
betöltött
excitatórikus/szekréciós
szerepeit
még
nem
tárták
fel
[160,168,191,220–226]. A gyulladás TRPA1 és TRPV1 pozitív fehérvérsejtek akkumulációját okozta, amelyek közül nagyszámú sejtet makrofágként azonosítottunk anti-CD68 immunfestéssel a nyálkahártyarétegben. Az infiltrálódó makrofágok szerepet játszanak az IBD kiváltásában és fenntartásában [227]. Eredményeink alapján nagyobbrészt M1 típusú gyulladásos makrofágok által jellemzően szekretált citokinek/kemokinek szintjét csökkentette a TRPA1 receptor jelenléte. Ez lehet a szenzoros TRPA1 közvetítésével felszabaduló, gyulladáscsökkentő szomatosztatin „szenzokrin” hatása közvetve vagy közvetlenül a makrofágok szomatosztatin receptorain [228]. Ugyanakkor ismert in vitro irodalmi adat a makrofágok saját TRPA1 csatornái részleges anti-inflammatorikus szerepére is, ennek funkcionális jelentőségét in vivo gyulladásos folyamatokban még nem tárták fel [176]. A gyulladáscsökkentő szerep lehetőségét alátámasztja továbbá, hogy leírták TRPA1 agonisták (kurkumin, szulforafán, fahéjaldehid, hidroxi-fahéjaldehid, tiocianátok) és a TRPV1-aktiváló kapszaicin, ill. a mindkét
receptort
izgató
gingerol
gyulladáscsökkentő
hatását
egér/patkány
makrofágokban, humán monocitákban/makrofágokban in vitro [229–236]. A TRPA1 agonisták anti-inflammatorikus hatása makrofágokban a gyulladáskeltő útvonalak gátlásában (NF-κB, PKCα, indukálható nitrogén-monoxid szintáz: iNOS, reaktív oxigén gyökök: ROS, leukotriének, prosztaglandinok, hidrolítikus enzimek, IL-1, IL-1β, IL-6, miRNS-155) valamint az antioxidáns útvonalak aktiválásában (Nrf2 transzkripciós faktor-hemoxigenáz-1; peroxinitrit elleni védelem) nyilvánult meg; a TNF-α szintézisére ellentmondásos adatok állnak rendelkezésre. Ezen közlemények egy része a TRPA1 85
ioncsatorna felfedezése, exogén ligandumainak feltérképezése előtt született vagy pusztán nem vizsgálták a TRPA1 szerepét. Ezért tisztázásra vár, vajon a protektív hatásokat valóban a TRPA1 receptor mediálja-e? Munkacsoportunk a közelmúltban mustárolajjal (ill. kapszaicinnel) vad típusú és génhiányos egerek peritoneális makrofágjain szelektíven kiváltott Ca2+-beáramlás detektálásával bizonyította a funkcionális TRPA1 (ill. TRPV1) jelenlétét [237]. A nem gyulladt, kontrollként szolgált biopsziás mintákban gyenge TRPA1 és TRPV1 immunpozitivitást találtunk a bélkripták epitheliális sejtjeiben, hasonlóan az egér vastagbélhez. Az IBD-betegek szövetmintáiban az intesztinális kripták neuroendokrin sejtjei festődtek TRPA1 antitesttel. Az egérhez hasonlóan a humán disztális vastagbélben található fehérvérsejtek TRPV1 és TRPA1 immunfestődést mutattak. IBDbetegek vastagbél metszetein a Lieberkühn-féle kriptákban Paneth sejtek és granulált neuroendokrin sejtek TRPA1 immunfestődést produkáltak. A sejteken lokalizálódó TRPA1 receptorok szerepet játszhatnak a colitis modulálásában a szerotonin és melatonin felszabadulás szabályozásával [238–240]. Mivel a TRPA1 receptort izgatják a táplálékban, különösen a fűszernövényekben előforduló egyes elektrofil, irritáló, csípős vegyületek, feltehetjük a kérdést: megfelelő étrenddel
javítható-e
a
betegek
állapota?
Nilius
és
Appendino
irodalmi
összefoglalójában (2013) részletesen áttekintette a TRP csatornák, a fűszerek és az egészségi állapot kölcsönhatásait [241]. Ezek alapján elmondható: a fűszernövények hatóanyagait komplex polifarmakológia jellemzi, azaz hatásukat egyszerre több molekuláris célponton fejtik ki, ill. a bioaktív anyagok sajátságainak megfelelően hatásuk egyszerre lehet előnyös és kedvezőtlen. A piperin (feketebors) és az allicin (fokhagyma) például a TRPA1 mellett az IBD-ben pro-inflammatorikus szerepűnek bizonyuló TRPV1-et is aktiválja [54,242]. A TRPA1-et izgató kurkuminnak (kurkuma) 100-nál több molekuláris célpontja létezik az emberi szervezetben [241,243]. A TRPA1 agonista allil-izotiocianát (mustár, retek, torma, wasabi) fogyasztása 10-25 mg/ttkg koncentrációban enyhíti az egér DSS-colitis tüneteit [244], bár ebben a TRPA1 receptor szerepe tisztázásra vár. Ugyanakkor a vastagbélbe adott 0,5% mustárolaj akut colitist vált ki egérben [170]. Evolúciós perspektívából szemlélve nem tekinthető véletlennek, hogy ezek az elektrofil, irritáns vegyületek fájdalmas ingert váltanak ki. 86
Epidemiológiai tanulmányok alapján negatívan korrelál az IBD előfordulásával, így kismértékű védőhatást sugall a zöldségek fogyasztása [245,246]. A számos konyhakerti növényt magába foglaló káposztafélék családja például gazdag TRPA1-izgató szerves kénvegyületekben. Közülük a szulforafánnal történő előkezelés (25 mg/ttkg per os) enyhíti a DSS-colitis tüneteit egérben [247], de itt a TRPA1 szerepét nem ismerjük. Az epidemiológiai vizsgálatokban szintén előnyösnek mutatkozó olivaolajban a TRPA1 ligandum oleocanthal van jelen [248,249]. Adódik a kérdés, vajon a jótékony exogén agonistákat „terápiás dózisban” tartalmazó táplálékmennyiség elfogyasztható-e reálisan, főképpen hosszútávon és különös tekintettel a gyakran erős aromára? Óvatosságra int az is, hogy célzott étrenddel eddig nem tudtak átütő javulást elérni IBD-betegek állapotában a klinikai tapasztalatok alapján [250]. Tisztázásra vár, hogy az exogén aktivátorok a szenzoros vagy a lokális (autonóm idegrendszer, epithel-, neuroendokrin sejtek, leukociták) TRPA1 receptorokra hatnak. Figyelembe kell venni továbbá a táplálékban található TRPA1 agonisták szisztémás hatását, a májban, ill. a mikroflóra által a bélben keletkező metabolitjaikat, valamint az örökítőanyag egyéni eltéréseit (nutrigenomika). A TRPA1 csatorna lokalizációja a vastagbél különböző sejttípusain (extrinsic szenzoros neuronok,
enterikus
/intrinsic/
neuronok,
neuroendokrin
sejtek,
leukociták,
plazmasejtek), gyulladás hatására egérben és emberben hasonló upregulációja, továbbá egy krónikus colitismodellben tapasztalt egyértelmű gyulladáscsökkentő szerepe fontos protektív szerepre utal IBD-ben. A TRPA1 anti-inflammatorikus szerepe mögött a lokális P-anyag, NKA, NKB és NK1 receptor,
továbbá
a
feltehetően
makrofág
eredetű
citokin/kemokinszintézis
csökkenése állhat adataink alapján. Továbbá mindezek hátterében feltételezhetjük a szenzoros
TRPA1
szomatosztatin
és
CGRP
felszabadításával
kifejtett
gyulladáscsökkentő szerepét. Az egérből származó és a klinikai vastagbél minták egybevágó TRPA1 expressziós mintázata állatkísérletes eredményeink transzlációs relevanciájára utal. A TRPA1 általunk bizonyított protektív szerepe a gyulladásos betegségek kutatásában perspektívával kecsegtet (49. ábra, 88. old.).
87
49. ábra Eredményeink összefoglalása.
88
VI.
Új eredmények összefoglalása, következtetések
1. Az RTX előkezelés kizárólag a kapszaicin-szenzitív neuronokra citotoxikus, nem károsítja az extraneuronális TRPV1 receptorokat a patkány talpi, lábháti bőrben és szájnyálkahártyában. A Ca2+-toxicitás hiánya nem-neuronális sejteken a kisebb TRPV1 receptorsűrűségre, eltérő sejtstruktúrára, az ioncsatorna eltérő érzékenységre utalhat. Továbbra is szelektív farmakológiai eszközként tekinthetünk az RTX/kapszaicindeszenzitizációra, amellyel a szenzoros TRPV1 funkciók vizsgálhatók kísérletesen. Eredményeink az sugallják, hogy az RTX/kapszaicin deszenzitizáción alapuló terápiák nem károsítják extraneuronálisan a TRPV1-et, ill. az ioncsatornát kifejező sejteket.
2. a. Bizonyítékot szolgáltattunk a PACAP expressziójára és kapszaicin közvetítette upregulációjára egér bőrben, mRNS és peptid szinten egyaránt. b. PACAP-hiányos egerekkel kimutattuk továbbá a peptid funkcionális jelentőségét: a TRPV1 aktiváció által kiváltott akut neurogén ödémaképződés fontos mediátora. Ennek hátterében a PACAP arteriola dilatációt és plazmafehérje extravazációt növelő hatása állhat.
3. a. Egér colitis és humán gyulladásos bélbetegségben számos neuronális és nemneuronális sejt expresszálja a TRPA1 receptort; b. a TRPA1 protektív DSS-colitis egérmodellben; c. a receptor aktivációja csökkenti a lokális, gyulladáskeltő tachykininek és számos citokin/kemokin szintjét. Mindebben fontos szerepet játszhat a makrofágfunkciók gátlása, amelyben a sejteken lokalizálódó TRPA1 közvetlen funkciója is lehetséges. A TRPA1-aktiváció hatására a szenzoros neuronokból felszabaduló szomatosztatin és CGRP szerepe elképzelhető a protektív hatás közvetítésében bélgyulladásban. A TRPA1 ígéretes célpont lehet a gyulladásos bélbetegségek kutatásában.
Dolgozatom legfontosabb eredményeinek összefoglalásaként (50. ábra, 90. old.) elmondható, hogy az RTX előkezelés kizárólag a kapszaicin-szenzitív neuronokra citotoxikus, a TRPV1 aktiváció által kiváltott akut neurogén ödémaképződés fontos mediátora a PACAP, valamint a TRPA1 protektív egér DSS-colitis modellben.
89
50. ábra A dologozat legfontosabb új eredményeinek összefoglalása.
90
Függelék
1. függelék A TRPA1 és TRPV1 specifikus antitestek szelektivitásának tesztelése. Részletesen lásd Anyagok és módszerek, V. Fejezet.
91
Humán
Gén
Accession
Assay
GAPDH
NM_001256799 NM_002046
(2) Hs02758991
GUSB
NM_000181
(2) Hs00939627_m1
TRPV1
NM_018727 NM_080704 NM_080705 NM_080706 NM_007332 NM_008084
(2) Hs00218912_m1
Gusb Trpv1 Trpa1 Vip Adcyap1 (PACAP) Sst Cxcl13 (BLC) Il1rn (IL-1RA) Tac1
NM_010368 NM_001001445 NM_177781 NM_011702 NM_009625
(1) Mm.PT.39a.22214848 (1) Mm.PT.56a.13426135 (2) Mm00625268_m1 (1) Mm.PT.56a.32346790 (1) Mm.PT.56a.31241204
NM_009215 NM_018866 NM_001039701 NM_009311
Tac3
NM_001199971
Tacr1 (NK1)
NM_009313
Tnf
NM_013693
Csf1
NM_007778 NM_001113529 NM_001113530
(2) Mm00436671_m1 (1) Mm.PT.56.31389616 (1) Mm.PT.56.43781580 (3) F 5′- AAATGTGCGCTATGAGGAATGA -3′ R 5′- GGAAACATGCTGCTAGGAATACAAA -3′ (3) F 5′-TCTGGAAGGATTGCTGAAAGTG-3′ R 5′-GTAGGGAAGGGAGCCAACAG-3′ (3) F 5′-TGGACTCTGATCTCTTCCCCAACA-3′ R 5′-GGACCCAGATGACAAAGATGACCA-3′ (3) F 5′-CCCAGACCCTCACACTCAGAT-3′ R 5′-TTGTCCCTTGAAGAGAACCTG-3′ (3) F 5′-GGCTTGGCTTGGGATGATT-3′ R 5′-AGGCGTGGAGGGGGAAAAC-3′
Egér
TRPA1 Gapdh
(2) Hs00175798_m1 (1) Mm.PT.39a.1
2. függelék Az egér és humán vastagbél minták qPCR analíziséhez használt primerek és hidrolízis próbák listája. (1): Integrated DNA Technologies, Inc. (Iowa, USA); (2): Life Technologies (Kalifornia, USA); (3): [251,252]. GAPDH (gliceraldehid 3-foszfát dehidrogenáz); GUSB (béta-glükuronidáz); TRPV1 (tranziens receptor potenciáll vanilloid 1); TRPA1 (tranziens receptor potenciáll ankirin 1); Vip (vazoaktív intesztinális polipeptid); Adycap1 (hipofízos adenilát cikláz aktiváló polipeptid, PACAP); Sst (szomatosztatin); Cxcl13 (kemokin (C-X-C motívum) ligand 13 azaz B-limfocita kemoattraktáns, BLC); Il1rn (interleukin-1 receptor antagonista, IL-1RA); Tac1 (tachykinin 1); Tac3 (tachykinin 3); Tacr1 (tachykinin 1 azaz neurokinin receptor 1); Tnf (tumor nekrózis faktor α); Csf1 (macrophage colony stimulating factor 1, M-CSF).
92
Gén
Trpv1
Trpa1 Actb Adcyap1r1 Vipr1
Teljes név transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 1 transient receptor potential cation channel, subfamily A, member 1 actin-beta adenylate cyclase activating polypeptide 1 receptor 1 (PAC1) vasoactive intestinal peptide receptor 1 (VPAC1)
Accession
NM_001001445
NM_177781 NM_007393 NM_007407 NM_011703
Vipr2
vasoactive intestinal peptide receptor 2 (VPAC2)
NM_009511
Sstr1
somatostatin receptor 1
NM_009216
Sstr4
somatostatin receptor 4
NM_009219
3. függelék A Quantigene 2.0 Plex RNA Assay módszer segítségével detektált egér gének.
93
Irodalomjegyzék 1.
Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J (1967) Direct evidence for neurogenic inflammation and its prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin. Br J Pharmacol Chemother 31: 138–151.
2.
Jancsó N (1960) Role of the nerve terminals in the mechanism of inflammatory reactions. Bull Millard Fill Hosp: 53–77.
3.
Szolcsanyi J, Jancso-Gabor A (1975) Sensory effects of capsaicin congeners. Part II: Importance of chemical structure and pungency in desensitizing activity of capsaicintype compounds. Arzneimittelforschung 26: 33–37.
4.
Caterina MJ, Schumacher M a, Tominaga M, Rosen T a, Levine JD, et al. (1997) The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 389: 816– 824.
5.
Szolcsányi J, Sándor Z (2012) Multisteric TRPV1 nocisensor: a target for analgesics. Trends Pharmacol Sci 33: 646–655.
6.
Kalia J, Swartz KJ (2013) Exploring structure-function relationships between TRP and Kv channels. Sci Rep 3: 1–9.
7.
Lee JH, Lee Y, Ryu H, Kang DW, Lee J, et al. (2011) Structural insights into transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1) from homology modeling, flexible docking, and mutational studies. J Comput Aided Mol Des 25: 317–327.
8.
Moiseenkova-Bell VY, Stanciu L a, Serysheva II, Tobe BJ, Wensel TG (2008) Structure of TRPV1 channel revealed by electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 7451–7455.
9.
Alawi K, Keeble J (2010) The paradoxical role of the transient receptor potential vanilloid 1 receptor in inflammation. Pharmacol Ther 125: 181–195.
10.
Vyklický L, Nováková-Tousová K, Benedikt J, Samad A, Touska F, et al. (2008) Calciumdependent desensitization of vanilloid receptor TRPV1: a mechanism possibly involved in analgesia induced by topical application of capsaicin. Physiol Res 57 Suppl 3: S59– S68.
11.
Szallasi A, Cortright DN, Blum C a, Eid SR (2007) The vanilloid receptor TRPV1: 10 years from channel cloning to antagonist proof-of-concept. Nat Rev Drug Discov 6: 357–372.
12.
Starowicz K, Nigam S, Di Marzo V (2007) Biochemistry and pharmacology of endovanilloids. Pharmacol Ther 114: 13–33.
13.
Fernandes ES, Fernandes M a, Keeble JE (2012) The functions of TRPA1 and TRPV1: moving away from sensory nerves. Br J Pharmacol 166: 510–521.
94
14.
Calixto JB, Kassuya C a L, André E, Ferreira J (2005) Contribution of natural products to the discovery of the transient receptor potential (TRP) channels family and their functions. Pharmacol Ther 106: 179–208.
15.
Szallasi A, Blumberg PM (1999) Vanilloid (Capsaicin) Receptors and Mechanisms. Pharmacol Rev 51: 159–211.
16.
Appendino G, Ech-Chahad A, Minassi A, Bacchiega S, De Petrocellis L, et al. (2007) Structure-activity relationships of the ultrapotent vanilloid resiniferatoxin (RTX): the homovanillyl moiety. Bioorg Med Chem Lett 17: 132–135.
17.
Szolcsányi J (1996) Capsaicin-sensitive sensory nerve terminals with local and systemic efferent functions : facts and scopes of an unorthodox neuroregulatory mechanisms. Prog Brain Res 113: 343–359.
18.
Szolcsányi J (2004) Forty years in capsaicin research for sensory pharmacology and physiology. Neuropeptides 38: 377–384.
19.
Holzer P (1998) Implications of Tachykinins and Calcitonin Gene-Related Peptide in. Digestion 43: 269–283.
20.
Maggi CA (1995) Tachykinins and calcitonin gene-related peptide (CGRP) as cotransmitters released from peripheral endings of sensory nerves. Prog Neurobiol 45: 1– 98.
21.
Geppetti P, Nassini R, Materazzi S, Benemei S (2008) The concept of neurogenic inflammation. BJU Int 101 Suppl : 2–6.
22.
Geppetti P, Holzer P (1996) Neurogenic inflammation. CRC Press.
23.
Helyes Z (2009) Szenzoros neuropeptidek szerepének vizsgálata légúti és ízületi gyulladás, valamint fájdalom állatkísérletes modelljeiben - MTA doktori értekezés.
24.
Helyes Z, Pinter E, Szolcsanyi J (2009) Regulatory role of sensory neuropeptides in inflammation. In: Kovacs M, Merchentahler I, editors. Neuropeptides and Peptide Analogs. Kerala, India: Research Signpost, Vol. 661. pp. 111–141.
25.
Anand P, Bley K (2011) Topical capsaicin for pain management: therapeutic potential and mechanisms of action of the new high-concentration capsaicin 8% patch. Br J Anaesth 107: 490–502.
26.
Sugimoto T, Xiao C, Ichikawa H (1998) Neonatal primary neuronal death induced by capsaicin and axotomy involves an apoptotic mechanism. Brain Res 807: 147–154.
27.
Ohtori S, Chiba T, Takahashi K, Ino H, Yamagata M, et al. (2000) Neonatal capsaicin treatment decreased substance P receptor immunoreactivity in lamina III neurons of the dorsal horn. Neurosci Res 38: 147–154.
95
28.
Maggi C, Patacchini R, Tramontana M, Amann R, Giuliani S, et al. (1990) Similarities and differences in the action of resiniferatoxin and capsaicin on central and peripheral endings of primary sensory neurons. Neuroscience 37: 531–539.
29.
Szolcsányi J, Pintér E (2013) Transient receptor potential vanilloid 1 as a therapeutic target in analgesia. Expert Opin Ther targets 17: 641–657.
30.
Gunthorpe MJ, Szallasi A (2008) Peripheral TRPV1 receptors as targets for drug development: new molecules and mechanisms. Curr Pharm Des 14: 32–41.
31.
Jancsó G, Kiraly E, Jancsó-Gábor A (1977) Pharmacologically induced selective degeneration of chemosensitive primary sensory neurones. Nature 270: 741–743.
32.
Pinter E, Szolcsanyi J (1995) PLASMA EXTRAVASATION IN THE SKIN AND PELVIC ORGANS EVOKED BY ANTIDROMIC STIMULATION OF THE LUMBOSACRAL DORSAL ROOTS OF THE RAT. Neuroscience 68: 603–614.
33.
Helyes Z, Elekes K, Sándor K, Szitter I, Kereskai L, et al. (2010) Involvement of preprotachykinin A gene-encoded peptides and the neurokinin 1 receptor in endotoxininduced murine airway inflammation. Neuropeptides 44: 399–406.
34.
Nilius B, Appendino G, Owsianik G (2012) The transient receptor potential channel TRPA1: from gene to pathophysiology. Pflugers Arch 464: 425–458.
35.
Bessac BF, Jordt S-E (2008) Breathtaking TRP channels: TRPA1 and TRPV1 in airway chemosensation and reflex control. Physiology (Bethesda) 23: 360–370.
36.
Story GM, Peier AM, Reeve AJ, Eid SR, Mosbacher J, et al. (2003) ANKTM1, a TRP-like channel expressed in nociceptive neurons, is activated by cold temperatures. Cell 112: 819–829.
37.
Jordt S, Bautista DM, Chuang H, Meng ID, Julius D (2004) Mustard oils and cannabinoids excite sensory nerve fibres through the TRP channel ANKTM1. Nature 427: 260–264.
38.
Nagata K, Duggan A, Kumar G, García-Añoveros J (2005) Nociceptor and hair cell transducer properties of TRPA1, a channel for pain and hearing. J Neurosci 25: 4052– 4061.
39.
Spahn V, Stein C, Zöllner C (2014) Modulation of transient receptor vanilloid 1 activity by transient receptor potential ankyrin 1. Mol Pharmacol 85: 335–344.
40.
Kobayashi K, Fukuoka T, Obata K, Yamanaka H, Dai Y, et al. (2005) Distinct expression of TRPM8, TRPA1, and TRPV1 mRNAs in rat primary afferent neurons with adelta/c-fibers and colocalization with trk receptors. J Comp Neurol 493: 596–606.
41.
Storti B, Bizzarri R, Cardarelli F, Beltram F (2012) Intact microtubules preserve transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) functionality through receptor binding. J Biol Chem 287: 7803–7811.
96
42.
Steenland HW, Ko SW, Wu L-J, Zhuo M (2006) Hot receptors in the brain. Mol Pain 2: 34.
43.
Han P, Korepanova A V, Vos MH, Moreland RB, Chiu ML, et al. (2013) Quantification of TRPV1 protein levels in rat tissues to understand its physiological roles. J Mol Neurosci 50: 23–32.
44.
Nilius B, Szallasi A (2014) Transient receptor potential channels as drug targets: from the science of basic research to the art of medicine. Pharmacol Rev 66: 676–814.
45.
Tóth A, Boczán J, Kedei N, Lizanecz E, Bagi Z, et al. (2005) Expression and distribution of vanilloid receptor 1 (TRPV1) in the adult rat brain. Brain Res Mol Brain Res 135: 162– 168.
46.
Doihara H, Nozawa K, Kawabata-Shoda E, Kojima R, Yokoyama T, et al. (2009) Molecular cloning and characterization of dog TRPA1 and AITC stimulate the gastrointestinal motility through TRPA1 in conscious dogs. Eur J Pharmacol 617: 124–129.
47.
De Moura JC, Noroes MM, Rachetti VDPS, Lobão-Soares B, Preti D, et al. (2014) The blockade of transient receptor potential ankirin 1 (TRPA1) signaling mediates antidepressant- and anxiolytic-like actions in mice. Br J Pharmacol 1: 1–26.
48.
Bautista DM, Pellegrino M, Tsunozaki M (2013) TRPA1: A gatekeeper for inflammation. Annu Rev Physiol 75: 181–200.
49.
Bandell M, Story GM, Hwang SW, Viswanath V, Eid SR, et al. (2004) Noxious cold ion channel TRPA1 is activated by pungent compounds and bradykinin. Neuron 41: 849– 857.
50.
Taylor-Clark TE, McAlexander M a, Nassenstein C, Sheardown S a, Wilson S, et al. (2008) Relative contributions of TRPA1 and TRPV1 channels in the activation of vagal bronchopulmonary C-fibres by the endogenous autacoid 4-oxononenal. J Physiol 586: 3447–3459.
51.
Takahashi N, Mizuno Y, Kozai D (2008) Molecular characterization of TRPA1 channel activation by cysteine-reactive inflammatory mediators. Channels 2: 1–12.
52.
Takahashi N, Mori Y (2011) TRP Channels as Sensors and Signal Integrators of Redox Status Changes. Front Pharmacol 2: 58.
53.
SuperPain Database (n.d.). http://bioinformatics.charite.de.
54.
Salazar H, Llorente I, Jara-Oseguera A, García-Villegas R, Munari M, et al. (2008) A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci 11: 255–261.
55.
Birder LA, Kanai AJ, Groat WC De, Kiss S, Nealen ML, et al. (2001) Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. PNAS 98: 13396– 13401.
97
56.
Denda M, Fuziwara S, Inoue K, Denda S, Akamatsu H, et al. (2001) Immunoreactivity of VR1 on epidermal keratinocyte of human skin. Biochem Biophys Res Commun 285: 1250–1252.
57.
Lazzeri M, Vannucchi MG, Zardo C, Spinelli M, Beneforti P, et al. (2004) Immunohistochemical evidence of vanilloid receptor 1 in normal human urinary bladder. Eur Urol 46: 792–798.
58.
Seki N, Shirasaki H, Kikuchi M, Himi T (2007) Capsaicin induces the production of IL-6 in human upper respiratory epithelial cells. Life Sci 80: 1592–1597.
59.
Saunders CI, Kunde D a, Crawford A, Geraghty DP (2007) Expression of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) and 2 (TRPV2) in human peripheral blood. Mol Immunol 44: 1429–1435.
60.
Charrua A, Reguenga C, Cordeiro JM, Correiade-Sá P, Paule C, et al. (2009) Functional transient receptor potential vanilloid 1 is expressed in human urothelial cells. J Urol 182: 2944–2950.
61.
Stander S, Moormann C, Schumacher M, Buddenkotte J, Artuc M, et al. (2004) Expression of vanilloid receptor subtype 1 in cutaneous sensory nerve fibers, mast cells, and epithelial cells of appendage structures. Exp Dermatol 13: 129–139.
62.
Bertin S, Aoki-Nonaka Y, de Jong PR, Nohara LL, Xu H, et al. (2014) The ion channel TRPV1 regulates the activation and proinflammatory properties of CD4(+) T cells. Nat Immunol.
63.
Southall MD, Li TAO, Gharibova LS, Pei Y, Nicol GD, et al. (2003) Activation of Epidermal Vanilloid Receptor-1 Induces Release of Proinflammatory Mediators in Human Keratinocytes. 304: 217–222.
64.
Lee H, Caterina MJ (2005) TRPV channels as thermosensory receptors in epithelial cells. Pflugers Arch 451: 160–167.
65.
Li WH, Lee YM, Kim JY, Kang S, Kim S, et al. (2007) Transient receptor potential vanilloid-1 mediates heat-shock-induced matrix metalloproteinase-1 expression in human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol 127: 2328–2335.
66.
Lee YM, Li WH, Kim YK, Kim KH, Chung JH (2008) Heat-induced MMP-1 expression is mediated by TRPV1 through PKCalpha signaling in HaCaT cells. Exp Dermatol 17: 864– 870.
67.
Saunders CI, Fassett RG, Geraghty DP (2009) Up-regulation of TRPV1 in mononuclear cells of end-stage kidney disease patients increases susceptibility to N-arachidonoyldopamine (NADA)-induced cell death. Biochim Biophys Acta 1792: 1019–1026.
68.
Denda S, Denda M, Inoue K, Hibino T (2010) Glycolic acid induces keratinocyte proliferation in a skin equivalent model via TRPV1 activation. J Dermatol Sci 57: 108– 113.
98
69.
Kark T, Bagi Z, Lizanecz E, Pásztor TE, Erdei N, et al. (2008) Tissue-Specific Regulation of Microvascular Diameter : Opposite Functional Roles of Neuronal and Smooth Muscle Located Vanilloid Receptor-1. Mol Pharmacol 73: 1405–1412.
70.
Czikora Á, Lizanecz E, Bakó P, Rutkai I, Ruzsnavszky F, et al. (2012) Structure-activity relationships of vanilloid receptor agonists for arteriolar TRPV1. Br J Pharmacol 165: 1801–1812.
71.
Lai J, Douglas SD, Ho W (1998) Human lymphocytes express substance P and its receptor. J Neuroimmunol 86: 80–86.
72.
Bíró T, Maurer M, Modarres S, Lewin NE, Brodie C, et al. (1998) Characterization of Functional Vanilloid Receptors Expressed by Mast Cells. Blood 91: 1332–1340.
73.
Szallasi A, Nilsson S, Farkas-Szallasi T, Blumberg PM, Hökfelt T, et al. (1995) Vanilloid (capsaicin) receptors in the rat: distribution in the brain, regional differences in the spinal cord, axonal transport to the periphery, and depletion by systemic vanilloid treatment. Brain Res 703: 175–183.
74.
Ferrandiz-Huertas C, Mathivanan S, Wolf C, Devesa I, Ferrer-Montiel A (2014) Trafficking of ThermoTRP Channels. Membranes (Basel) 4: 525–564.
75.
Flockerzi V, Nilius B (2014) TRPs: truly remarkable proteins.
76.
Bán Á, Marincsák R, Bíró T, Perkecz A, Gömöri É, et al. (2010) Upregulation of Transient Receptor Potential Vanilloid Type-1 Receptor Expression in Oral Lichen Planus. Neuroimmunomodulation 17: 103–108.
77.
Tóth E, Kun J, Perkecz A, Tornoczky T, Gerlinger I, et al. (2014) Expression of transient receptor potential Vanilloid 1 (TRPV1) and Ankyrin 1 (TRPA1) receptors in chronic rhinosinusitis. Rhinology 52: 625.
78.
Vaudry D, Falluel-Morel A, Bourgault S, Basille M, Burel D, et al. (2009) Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide and Its Receptors: 20 Years after the Discovery. Pharmacol Rev 61: 283–357.
79.
Miyata A, Arimura A, Dahl RR, Minaminot N, Ueharas A, et al. (1989) ISOLATION OF A NOVEL 38 RESIDUE-HYPOTHALAMIC POLYPEPTIDE WHICH STIMULATES ADENYLATE CYCLASE IN PITUITARY CELLS. Biochem Biophys Res Commun 164: 567–574.
80.
Arimura A (1998) Perspectives on pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the neuroendocrine, endocrine, and nervous systems. Jpn J Physiol 48: 301– 331.
81.
Arimura A (2007) PACAP: the road to discovery. Peptides 28: 1617–1619.
82.
Faculty of Science, University of Toyama http://www.sci.u-toyama.ac.jp/ (n.d.).
83.
Dickson L, Finlayson K (2009) VPAC and PAC receptors: From ligands to function. Pharmacol Ther 121: 294–316. 99
84.
Somogyvari-Vigh A, Reglodi D (2004) Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide : A Potential Neuroprotective Peptide. Curr Pharm Des 10: 2861–2889.
85.
Tan Y-V, Waschek J a (2011) Targeting VIP and PACAP receptor signalling: new therapeutic strategies in multiple sclerosis. ASN Neuro 3.
86.
Ohtaki H, Nakamachi T, Dohi K, Shioda S (2008) Role of PACAP in ischemic neural death. J Mol Neurosci 36: 16–25.
87.
Rácz B, Gasz B, Borsiczky B, Gallyas F, Tamás A, et al. (2007) Protective effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide in endothelial cells against oxidative stress-induced apoptosis. Gen Comp Endocrinol 153: 115–123.
88.
Reglodi D, Kiss P, Szabadfi K, Atlasz T, Gabriel R, et al. (2012) PACAP is an endogenous protective factor-insights from PACAP-deficient mice. J Mol Neurosci 48: 482–492.
89.
Reichenstein M, Rehavi M, Pinhasov A (2008) Involvement of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the mechanism of antidepressant action. J Mol Neurosci 36: 330–338.
90.
Shimakura S-I, Kojima K, Nakamachi T, Kageyama H, Uchiyama M, et al. (2008) Neuronal interaction between melanin-concentrating hormone- and alpha-melanocytestimulating hormone-containing neurons in the goldfish hypothalamus. Peptides 29: 1432–1440.
91.
Lenti L, Domok F, Kis D, Zimmermann A (2008) Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide ( PACAP ) preserves pial arteriolar dilation to hypercapnia and N-methyl-Daspartate ( NMDA ) after global cerebral ischemia in piglets. FASEB J 22: 1151.
92.
Tamas A, Reglodi D, Farkas O, Kovesdi E, Pal J, et al. (2012) Effect of PACAP in Central and Peripheral Nerve Injuries. Int J Mol Sci 13: 8430–8448.
93.
Helyes Z, Pozsgai G, Börzsei R, Németh J, Bagoly T, et al. (2007) Inhibitory effect of PACAP-38 on acute neurogenic and non-neurogenic inflammatory processes in the rat. Peptides 28: 1847–1855.
94.
Kemény A, Reglodi D, Cseharovszky R, Hashimoto H, Baba A, et al. (2010) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide deficiency enhances oxazolone-induced allergic contact dermatitis in mice. J Mol Neurosci 42: 443–449.
95.
Cardell LO, Stjärne P, Wagstaff SJ, Agustí C, Nadel J a (1997) PACAP-induced plasma extravasation in rat skin. Regul Pept 71: 67–71.
96.
Markovics A, Kormos V, Gaszner B, Lashgarara A, Szoke E, et al. (2012) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide plays a key role in nitroglycerol-induced trigeminovascular activation in mice. Neurobiol Dis 45: 633–644.
97.
Yadav M, Huang M-C, Goetzl EJ (2011) VPAC1 (vasoactive intestinal peptide (VIP) receptor type 1) G protein-coupled receptor mediation of VIP enhancement of murine experimental colitis. Cell Immunol 267: 124–132. 100
98.
Chen Y, Zhou Z, Wang Z, Gao H, Zheng X (2004) On PACAP-aggravated experimental acute pancreatitis. J Biomed Eng 21: 964–969.
99.
El Zein N, Badran B, Sariban E (2008) The neuropeptide pituitary adenylate cyclase activating polypeptide modulates Ca2+ and pro-inflammatory functions in human monocytes through the G protein-coupled receptors VPAC-1 and formyl peptide receptor-like 1. Cell Calcium 43: 270–284.
100.
Pecze L, Szabó K, Széll M, Jósvay K, Kaszás K, et al. (2008) Human Keratinocytes Are Vanilloid Resistant. PLoS One 3: 1–10.
101.
Bánvölgyi A, Pálinkás L, Berki T, Clark N, Grant AD, et al. (2005) Evidence for a novel protective role of the vanilloid TRPV1 receptor in a cutaneous contact allergic dermatitis model. J Neuroimmunol 169: 86–96.
102.
Athanasiou A, Smith P a, Vakilpour S, Kumaran NM, Turner AE, et al. (2007) Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death. Biochem Biophys Res Commun 354: 50–55.
103.
Porszasz R, Porkolab A, Ferencz A, Pataki T, Szilvassy Z, et al. (2002) Capsaicin-induced nonneural vasoconstriction in canine mesenteric arteries. Eur J Pharm 441: 173–175.
104.
Bodó E, Kovács I, Telek A, Varga A, Paus R, et al. (2004) Vanilloid receptor-1 (VR1) is widely expressed on various epithelial and mesenchymal cell types of human skin. J Invest Dermatol 123: 410–413.
105.
Engler A, Aeschlimann A, Simmen BR, Michel B a, Gay RE, et al. (2007) Expression of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) in synovial fibroblasts from patients with osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Biochem Biophys Res Commun 359: 884– 888.
106.
Ko F, Diaz M, Smith P, Emerson E, Yj K, et al. (1998) Toxic effects of capsaicin on keratinocytes and fibroblasts . PubMed Commons. J Burn Care Rehabil 19: 409–413.
107.
Liedtke WB, Heller S (2007) TRP Ion Channel Function in Sensory Transduction and Cellular Signaling Cascades. Liedtke WB, Heller S, editors CRC.
108.
Szoke E, Börzsei R, Tóth DM, Lengl O, Helyes Z, et al. (2010) Effect of lipid raft disruption on TRPV1 receptor activation of trigeminal sensory neurons and transfected cell line. Eur J Pharmacol 628: 67–74.
109.
Czikora Á, Rutkai I, Pásztor ET, Szalai A, Pórszász R, et al. (2013) Different desensitization patterns for sensory and vascular TRPV1 populations in the rat: expression, localization and functional consequences. PLoS One 8: e78184.
110.
Donnerer J, Lembeck F (1982) Analysis of the effects of intravenously injected capsaicin in the rat. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 320: 54–57.
101
111.
Inoue K, Koizumi S, Fuziwara S, Denda S, Inoue K, et al. (2002) Functional vanilloid receptors in cultured normal human epidermal keratinocytes. Biochem Biophys Res Commun 291: 124–129.
112.
Radtke C, Sinis N, Sauter M, Jahn S, Kraushaar U, et al. (2011) TRPV channel expression in human skin and possible role in thermally induced cell death. J Burn Care Res2 32: 150–159.
113.
Dux M, Sántha P, Jancsó G (2003) Capsaicin-sensitive neurogenic sensory vasodilatation in the dura mater of the rat. J Physiol 552: 859–867.
114.
Lizanecz E, Bagi Z, Pásztor ET, Papp Z, Edes I, et al. (2006) Phosphorylation-dependent desensitization by anandamide of vanilloid receptor-1 (TRPV1) function in rat skeletal muscle arterioles and in Chinese hamster ovary cells expressing TRPV1. Mol Pharmacol 69: 1015–1023.
115.
Szolcsanyi J, Oroszi G, Nemeth J, Szilvassy Z, Blasig IE, et al. (2001) Functional and biochemical evidence for capsaicin-induced neural endothelin release in isolated working rat heart. Eur J Pharmacol 419: 215–221.
116.
Dun EC, Huang RL, Dun SL, Dun NJ (1996) Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-immunoreactivity in human spinal cord and dorsal root ganglia. Brain Res 721: 233–237.
117.
Zhang Y, Malmberg a B, Yaksh TL, Sjölund B, Sundler F, et al. (1997) Capsaicin-evoked release of pituitary adenylate cyclase activating peptide (PACAP) and calcitonin generelated peptide (CGRP) from rat spinal cord in vivo. Regul Pept 69: 83–87.
118.
Fahrenkrug J, Hannibal J (1998) PITUITARY ADENYLATE CYCLASE ACTIVATING POLYPEPTIDE IMMUNOREACTIVITY IN CAPSAICIN-SENSITIVE NERVE FIBRES SUPPLYING THE RAT URINARY TRACT. Neuroscience 83: 1261–1272.
119.
Møller M, Fahrenkrug J, Hannibal J (1999) Innervation of the rat pineal gland by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)-immunoreactive nerve fibres. Cell Tissue Res 296: 247–257.
120.
Hannibal J, Fahrenkrug J (2000) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in intrinsic and extrinsic nerves of the rat pancreas. Cell Tissue Res 299: 59–70.
121.
Németh J, Reglödi D, Pozsgai G, Szabó A, Elekes K, et al. (2006) Effect of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-38 on sensory neuropeptide release and neurogenic inflammation in rats and mice. Neuroscience 143: 223–230.
122.
Steinhoff M, McGregor GP, Radleff-Schlimme A, Steinhoff A, Jarry H, et al. (1999) Identification of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and PACAP type 1 receptor in human skin: expression of PACAP-38 is increased in patients with psoriasis. Regul Pept 80: 49–55.
102
123.
Kodali S, Friedman I, Ding W, Seiffert K, Wagner J a, et al. (2003) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide inhibits cutaneous immune function. Eur J Immunol 33: 3070–3079.
124.
Peters EMJ, Ericson ME, Hosoi J, Seiffert K, Hordinsky MK, et al. (2006) Neuropeptide control mechanisms in cutaneous biology: physiological and clinical significance. J Invest Dermatol 126: 1937–1947.
125.
Gomariz RP, Juarranz Y, Abad C, Arranz A, Leceta J, et al. (2006) VIP-PACAP system in immunity: new insights for multitarget therapy. Ann N Y Acad Sci 1070: 51–74.
126.
Ding W, Wagner J a, Granstein RD (2007) CGRP, PACAP, and VIP modulate Langerhans cell function by inhibiting NF-kappaB activation. J Invest Dermatol 127: 2357–2367.
127.
Ding W, Manni M, Stohl LL, Zhou XK, Wagner J a, et al. (2012) Pituitary adenylate cyclase-activating peptide and vasoactive intestinal polypeptide bias Langerhans cell Ag presentation toward Th17 cells. Eur J Immunol 42: 901–911.
128.
Tan Y-V, Abad C, Wang Y, Lopez R, Waschek J a (2013) Pituitary adenylate cyclase activating peptide deficient mice exhibit impaired thymic and extrathymic regulatory T cell proliferation during EAE. PLoS One 8: e61200.
129.
Armstrong BD, Abad C, Chhith S, Cheung-Lau G, Hajji OE, et al. (2008) Impaired nerve regeneration and enhanced neuroinflammatory response in mice lacking pituitary adenylyl cyclase activating peptide. Neuroscience 151: 63–73.
130.
Azuma Y-T, Hagi K, Shintani N, Kuwamura M, Nakajima H, et al. (2008) PACAP provides colonic protection against dextran sodium sulfate induced colitis. J Cell Physiol 216: 111–119.
131.
Nemetz N, Abad C, Lawson G, Nobuta H, Chhith S, et al. (2008) Induction of colitis and rapid development of colorectal tumors in mice deficient in the neuropeptide PACAP. Int J Cancer 122: 1803–1809.
132.
Tan Y-V, Abad C, Lopez R, Dong H, Liu S, et al. (2009) Pituitary adenylyl cyclaseactivating polypeptide is an intrinsic regulator of Treg abundance and protects against experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci 106: 2012–2017.
133.
Abad C, Waschek J a (2011) Immunomodulatory roles of VIP and PACAP in models of multiple sclerosis. Curr Pharm Des 17: 1025–1035.
134.
Elekes K, Sandor K, Moricz A, Kereskai L, Kemeny A, et al. (2011) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide plays an anti-inflammatory role in endotoxin-induced airway inflammation: in vivo study with gene-deleted mice. Peptides 32: 1439–1446.
135.
Hashimoto H, Shintani N, Baba A (2006) New insights into the central PACAPergic system from the phenotypes in PACAP- and PACAP receptor-knockout mice. Ann N Y Acad Sci 1070: 75–89.
103
136.
Boros M, Kemény Á, Sebők B, Bagoly T, Perkecz A, et al. (2013) Sulphurous medicinal waters increase somatostatin release: It is a possible mechanism of anti-inflammatory effect of balneotherapy in psoriasis. Eur J Integr Med 5: 109–118.
137.
Jakab B, Reglodi D, Józsa R, Hollósy T, Tamás A, et al. (2004) Distribution of PACAP-38 in the central nervous system of various species determined by a novel radioimmunoassay. J Biochem Biophys Methods 61: 189–198.
138.
Dobrosi N, Tóth BI, Nagy G, Dózsa A, Géczy T, et al. (2008) Endocannabinoids enhance lipid synthesis and apoptosis of human sebocytes via cannabinoid receptor-2-mediated signaling. FASEB J 22: 3685–3695.
139.
De Falco M, Pisano MM, Luca A De (2014) Embryology and Anatomy of the Skin. Skin Cancer - Current Clinical Pathilogy. Springer Netherlands. pp. 1–15.
140.
Moller K, Zhangj Y, Lurs AA, Lund RSJ, Uddman RJ (1993) PITUITARY ADENY LATE CYCLASE ACTIVATING PEPTIDE IS A SENSORY NEUROPEPTIDE: IMMUNOCYTOCHEMICAL AND IMMUNOCHEMICAL EVIDENCE. Neuroscience 57: 725–732.
141.
Mulder H, Jongsma H, Zhang Y, Gebre-medhin S, Sundler F, et al. (1999) Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide and Islet Amyloid Polypeptide in Primary Sensory Neurons. Mol Neurobiol 19: 229–253.
142.
Tóth BI, Géczy T, Griger Z, Dózsa A, Seltmann H, et al. (2009) Transient receptor potential vanilloid-1 signaling as a regulator of human sebocyte biology. J Invest Dermatol 129: 329–339.
143.
Tóth BI, Benko S, Szöllosi AG, Kovács L, Rajnavölgyi E, et al. (2009) Transient receptor potential vanilloid-1 signaling inhibits differentiation and activation of human dendritic cells. FEBS Lett 583: 1619–1624.
144.
Holzer P (1988) LOCAL EFFECTOR FUNCTIONS OF CAPSAKIN-SENSITIVE SENSORY NERVE ENDINGS: INVOLVEMENT OF TACHYKININS, CALCITONIN GENE-RELATED PEPTIDE AND OTHER NEUROPEPTIDES. Neuroscience 24: 739–768.
145.
Szolcsányi J (1996) Neurogenic inflammation, reevaluation of axon reflex theory. In: Geppetti P, Holzer P, editors. Neurogenic inflammation. Boca Raton: CRC Press. pp. 33– 42.
146.
Qin HY, Sadelain MW, Hitchon C, Lauzon J, Singh B (1993) Complete Freund’s adjuvantinduced T cells prevent the development and adoptive transfer of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol 150: 2072–2080.
147.
Allison AC (2008) Effects of Adjuvants on Different Cell Types and Their Interactions in Immune Responses. In: Wolstenholme GEW, Knight J, editors. Ciba Foundation Symposium 18 - Immunopotentiation.
148.
Abu-Hamdan MD, Drescher MJ, Ramakrishnan N a, Khan KM, Toma VS, et al. (2006) Pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptor (PAC1-R) in
104
the cochlea: evidence for specific transcript expression of PAC1-R splice variants in rat microdissected cochlear subfractions. Neuroscience 140: 147–161. 149.
Dalsgaard T, Hannibal J, Fahrenkrug J, Larsen CR, Ottesen B (2003) VIP and PACAP display different vasodilatory effects in rabbit coronary and cerebral arteries. Regul Pept 110: 179–188.
150.
Rubin DC, Shaker A, Levin MS (2012) Chronic intestinal inflammation: inflammatory bowel disease and colitis-associated colon cancer. Front Immunol 3: 107.
151.
Solomon L, Mansor S, Mallon P, Donnelly E, Hoper M, et al. (2010) The dextran sulphate sodium (DSS) model of colitis: an overview. Comp Clin Path 19: 235–239.
152.
Perše M, Cerar A (2012) Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol 2012: 718617.
153.
McLean MH, Neurath MF, Durum SK (2014) Targeting Interleukins for the Treatment of Inflammatory Bowel Disease-What Lies Beyond Anti-TNF Therapy? Inflamm Bowel Dis 20: 389–397.
154.
Szolcsányi J (1982) Capsaicin type pungent agents producing pyrexia. Pyretics and Antipyretics. pp. 437–478.
155.
Holzer P (2011) TRP channels in the digestive system. Curr Pharm Biotechnol 12: 24–34.
156.
Holzer P (2011) Transient receptor potential (TRP) channels as drug targets for diseases of the digestive system. Pharmacol Ther 131: 142–170.
157.
Holzer P (1992) Peptidergic sensory neurons in the control of vascular functions: mechanisms and significance in the cutaneous and splanchnic vascular beds. Rev Physiol Biochem Pharmacol 121: 49–146.
158.
Szitter I, Pozsgai G, Sandor K, Elekes K, Kemeny A, et al. (2010) The role of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) receptors in dextran sulfate-induced colitis in mice. J Mol Neurosci 42: 80–88.
159.
Lee J, Yamamoto T, Kuramoto H, Kadowaki M (2012) TRPV1 expressing extrinsic primary sensory neurons play a protective role in mouse oxazolone-induced colitis. Auton Neurosci 166: 72–76.
160.
Holzer P (2004) Vanilloid receptor TRPV1: hot on the tongue and inflaming the colon. Neurogastroenterol Motil 16: 697–699.
161.
Fujino K, Takami Y, de la Fuente SG, Ludwig K a, Mantyh CR (2004) Inhibition of the vanilloid receptor subtype-1 attenuates TNBS-colitis. J Gastrointest Surg 8: 842–847; discussion 847–848.
162.
Kimball ES, Wallace NH, Schneider CR, D’Andrea MR, Hornby PJ (2004) Vanilloid receptor 1 antagonists attenuate disease severity in dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Neurogastroenterol Motil 16: 811–818. 105
163.
Massa F, Sibaev A, Marsicano G, Blaudzun H, Storr M, et al. (2006) Vanilloid receptor (TRPV1)-deficient mice show increased susceptibility to dinitrobenzene sulfonic acid induced colitis. J Mol Med (Berl) 84: 142–146.
164.
Goso C, Evangelista S, Tramontana M, Manzini S, Blumberg PM, et al. (1993) Topical capsaicin administration protects against trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in the rat. Eur J Pharmacol 249: 185–190.
165.
Vinuesa AG, Sancho R, García-Limones C, Behrens A, ten Dijke P, et al. (2012) Vanilloid receptor-1 regulates neurogenic inflammation in colon and protects mice from colon cancer. Cancer Res 72: 1705–1716.
166.
Trevisani M, Siemens J, Materazzi S, Bautista DM, Nassini R, et al. (2007) 4Hydroxynonenal, an endogenous aldehyde, causes pain and neurogenic inflammation through activation of the irritant receptor TRPA1. PNAS 104: 13519–13524.
167.
Brain SD, Williams TJ, Tippins JR, Morris HR, MacIntyre I (1985) Calcitonin gene-related peptide is a potent vasodilator. Nature 313: 54–56.
168.
Engel M a, Leffler A, Niedermirtl F, Babes A, Zimmermann K, et al. (2011) TRPA1 and substance P mediate colitis in mice. Gastroenterology 141: 1346–1358.
169.
Engel M a, Khalil M, Siklosi N, Mueller-Tribbensee SM, Neuhuber WL, et al. (2012) Opposite effects of substance P and calcitonin gene-related peptide in oxazolone colitis. Dig Liver Dis 44: 24–29.
170.
Kimball ES, Prouty SP, Pavlick KP, Wallace NH, Schneider CR, et al. (2007) Stimulation of neuronal receptors, neuropeptides and cytokines during experimental oil of mustard colitis. Neurogastroenterol Motil 19: 390–400.
171.
Engel MA, Becker C, Reeh PW, Neurath MF (2011) Role of sensory neurons in colitis: increasing evidence for a neuroimmune link in the gut. Inflamm Bowel Dis 17: 1030– 1033.
172.
Bernstein C, Robert M, Eysselein E (1993) Rectal Substance P Concentrations Are Increased in Ulcerative Colitis But Not in Crohn ’s Disease . Am J Gastroenterol 88: 908– 913.
173.
Szitter I, Pintér E, Perkecz A, Kemény A, Kun J, et al. (2014) Role of neurokinin 1 receptors in dextran sulfate-induced colitis: studies with gene-deleted mice and the selective receptor antagonist netupitant. Inflamm Res DOI 10.100.
174.
Goode T (2000) Neurokinin-1 receptor expression in inflammatory bowel disease: molecular quantitation and localisation. Gut 47: 387–396.
175.
Kaneko Y, Szallasi A (2013) Transient Receptor Potential (TRP) channels: a clinical perspective. Br J Pharmacol.
106
176.
Romano B, Borrelli F, Fasolino I, Capasso R, Piscitelli F, et al. (2013) The cannabinoid TRPA1 agonist cannabichromene inhibits nitric oxide production in macrophages and ameliorates murine colitis. Br J Pharmacol 169: 213–229.
177.
Pozsgai G, Helyes Z, Pinter E (2013) P42 Intricate regulatory role of hydrogen sufide in dextran sulfate sodium-induced colitis. Nitric Oxide 31: S53–S54.
178.
Cattaruzza F, Spreadbury I, Miranda-Morales M, Grady EF, Vanner S, et al. (2010) Transient receptor potential ankyrin-1 has a major role in mediating visceral pain in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 298: G81–G91.
179.
Szolcsányi J, Helyes Z, Oroszi G, Németh J, Pinter E (1998) Release of somatostatin and its role in the mediation of the anti-inflammatory effect induced by antidromic stimulation of sensory fibres of rat sciatic nerve. Br J Pharmacol 123: 936–942.
180.
Szolcsanyi J, Pinter E, Helyes Z, Petho G (2011) Inhibition of the Function of TRPV1Expressing Nociceptive Sensory Neurons by Somatostatin 4 Receptor Agonism: Mechanism and Therapeutical Implications. Curr Top Med Chem 11: 2253–2263.
181.
Bautista DM, Jordt S-E, Nikai T, Tsuruda PR, Read AJ, et al. (2006) TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell 124: 1269– 1282.
182.
Knowlton WM, Bifolck-Fisher A, Bautista DM, McKemy DD (2010) TRPM8, but not TRPA1, is required for neural and behavioral responses to acute noxious cold temperatures and cold-mimetics in vivo. Pain 150: 340–350.
183.
Nedvig K, Weber G, Nemeth J, Kovacs K, Reglodi D, et al. (2012) Changes of PACAP immunoreactivities and cytokine levels after PACAP-38 containing intestinal preservation and autotransplantation. J Mol Neurosci 48: 788–794.
184.
Akbar a, Yiangou Y, Facer P, Walters JRF, Anand P, et al. (2008) Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut 57: 923–929.
185.
Kondo T, Oshima T, Obata K, Sakurai J, Knowles CH, et al. (2010) Role of transient receptor potential A1 in gastric nociception. Digestion 82: 150–155.
186.
Yu Y-B, Yang J, Zuo X-L, Gao L-J, Wang P, et al. (2010) Transient receptor potential vanilloid-1 (TRPV1) and ankyrin-1 (TRPA1) participate in visceral hyperalgesia in chronic water avoidance stress rat model. Neurochem Res 35: 797–803.
187.
Feng B, La JH, Schwartz ES, Gebhart GF (2012) Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 302: G1085–G1098.
188.
Brederson J-D, Kym PR, Szallasi A (2013) Targeting TRP channels for pain relief. Eur J Pharmacol 716: 61–76.
107
189.
Pozsgai G, Hajna Z, Bagoly T, Boros M, Kemény Á, et al. (2012) The role of transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) receptor activation in hydrogen-sulphide-induced CGRP-release and vasodilation. Eur J Pharmacol 689: 56–64.
190.
Pozsgai G, Helyes Z, Pintér E (1998) Intricate regulatory role of hydrogen sufide in dextran sulfate sodium-induced colitis: 100.
191.
Holzer P, Holzer-Petsche U (2001) Tachykinin receptors in the gut: physiological and pathological implications. Curr Opin Pharmacol 1: 583–590.
192.
Menzies JR, McKee R, Corbett a D (2001) Differential alterations in tachykinin NK2 receptors in isolated colonic circular smooth muscle in inflammatory bowel disease and idiopathic chronic constipation. Regul Pept 99: 151–156.
193.
Renzi D, Pellegrini B, Tonelli F, Surrenti C, Calabrò A (2000) Substance P (neurokinin-1) and neurokinin A (neurokinin-2) receptor gene and protein expression in the healthy and inflamed human intestine. Am J Pathol 157: 1511–1522.
194.
Evangelista S, Tramontana M, Maggi C a (2008) Spatial and temporal expression of tachykinins and NK1- and NK2-receptor gene during TNB induced colitis in rats. Neuropeptides 42: 663–670.
195.
Sanger GJ (2004) Neurokinin NK1 and NK3 receptors as targets for drugs to treat gastrointestinal motility disorders and pain. Br J Pharmacol 141: 1303–1312.
196.
Vu JP, Million M, Larauche M, Luong L, Norris J, et al. (2014) Inhibition of Vasoactive Intestinal Polypeptide (VIP) Induces Resistance to Dextran Sodium Sulfate (DSS)Induced Colitis in Mice. J Mol Neurosci 52: 37–47.
197.
Todorovic V, Janic B, Koko V, Micev M, Ja N, et al. (1996) Colonic vasoactive intestinal polypeptide (VIP) in ulcerative colitis--a radioimmunoassay and immunohistochemical study. Hepatogastroenterology 43: 483–488.
198.
Abad C, Juarranz Y, Martinez C, Arranz A, Rosignoli F, et al. (2005) cDNA array analysis of cytokines, chemokines, and receptors involved in the development of TNBS-induced colitis: homeostatic role of VIP. Inflamm Bowel Dis 11: 674–684.
199.
Sigalet DL, Wallace LE, Holst JJ, Martin GR, Kaji T, et al. (2007) Enteric neural pathways mediate the anti-inflammatory actions of glucagon-like peptide 2. J Mol Neurosci 293: 211–221.
200.
Lakhan SE, Kirchgessner A (2010) Neuroinflammation in inflammatory bowel disease. J Neuroinflammation 7: 37.
201.
Newman R, Cuan N, Hampartzoumian T, Connor SJ, Lloyd a R, et al. (2005) Vasoactive intestinal peptide impairs leucocyte migration but fails to modify experimental murine colitis. Clin Exp Immunol 139: 411–420.
202.
Thomson AW, Lotze MT, editors (2003) The Cytokine Handbook, Two-Volume Set. Gulf Professional Publishing. 108
203.
Brynskov J, Foegh P, Pedersen G, Ellervik C, Kirkegaard T, et al. (2002) Tumour necrosis factor alpha converting enzyme (TACE) activity in the colonic mucosa of patients with inflammatory bowel disease. Gut 51: 37–43.
204.
Deleporte A, Viennot S, Dupont B, Giletta C, Allaire M, et al. (2013) Efficacy of anti-TNFalpha monoclonal antibodies in inflammatory bowel disease treatment. Int J Interf Cytokine Mediat Res 5: 11–31.
205.
Bauer C, Loher F, Dauer M, Mayer C, Lehr HA, et al. (2007) The ICE inhibitor pralnacasan prevents DSS-induced colitis in C57BL/6 mice and suppresses IP-10 mRNA but not TNFalpha mRNA expression. Dig Dis Sci 52: 1642–1652.
206.
Alex P, Zachos NC, Nguyen T, Gonzales L, Chen T-E, et al. (2009) Distinct cytokine patterns identified from multiplex profiles of murine DSS and TNBS-induced colitis. Inflamm Bowel Dis 15: 341–352.
207.
Tixier E, Galmiche J-P, Neunlist M (2006) Intestinal neuro-epithelial interactions modulate neuronal chemokines production. Biochem Biophys Res Commun 344: 554– 561.
208.
Li L, Liu Z, Yang X, Yan H, Bao S, et al. (2013) Bioluminescence imaging for IL-1β expression in experimental colitis. J Inflamm (Lond) 10: 16.
209.
Carlsen HS, Baekkevold ES, Johansen F-E, Haraldsen G, Brandtzaeg P (2002) B cell attracting chemokine 1 (CXCL13) and its receptor CXCR5 are expressed in normal and aberrant gut associated lymphoid tissue. Gut 51: 364–371.
210.
Poole DP, Pelayo JC, Cattaruzza F, Kuo Y-M, Gai G, et al. (2011) Transient receptor potential ankyrin 1 is expressed by inhibitory motoneurons of the mouse intestine. Gastroenterology 141: 565–575, 575.e1–e4.
211.
Izzo A, Capasso R, Aviello G, Borrelli F, Romano B, et al. (2012) Inhibitory effect of cannabichromene, a major non-psychotropic cannabinoid extracted from Cannabis sativa, on inflammation-induced hypermotility in mice. Br J Pharmacol 166: 1444–1460.
212.
Yang J, Li Y, Zuo X, Zhen Y, Yu Y, et al. (2008) Transient receptor potential ankyrin-1 participates in visceral hyperalgesia following experimental colitis. Neurosci Lett 440: 237–241.
213.
Schmidt M, Dubin AE, Petrus MJ, Earley TJ, Patapoutian A (2009) Nociceptive signals induce trafficking of TRPA1 to the plasma membrane. Neuron 64: 498–509.
214.
Keszthelyi D, Troost FJ, Jonkers DM, Helyes Z, Hamer HM, et al. (2013) Alterations in mucosal neuropeptides in patients with irritable bowel syndrome and ulcerative colitis in remission: a role in pain symptom generation? Eur J Pain 17: 1299–1306.
215.
Engel M a, Khalil M, Mueller-Tribbensee SM, Becker C, Neuhuber WL, et al. (2012) The proximodistal aggravation of colitis depends on substance P released from TRPV1expressing sensory neurons. J Gastroenterol 47: 256–265.
109
216.
Yiangou Y, Facer P, Dyer NHC, Chan CLH, Knowles C, et al. (2001) Vanilloid receptor 1 immunoreactivity in inflamed human bowel Variant Creutzfeldt-Jakob disease in an elderly patient. Lancet 357: 1338–1339.
217.
Matsumoto K, Lo MW, Hosoya T, Tashima K, Takayama H, et al. (2012) Experimental colitis alters expression of 5-HT receptors and transient receptor potential vanilloid 1 leading to visceral hypersensitivity in mice. Lab Invest 92: 769–782.
218.
Tohda C, Sasaki M, Konemura T, Sasamura T, Itoh M, et al. (2001) Axonal transport of VR1 capsaicin receptor mRNA in primary afferents and its participation in inflammationinduced increase in capsaicin sensitivity. J Neurochem 76: 1628–1635.
219.
Kun J, Helyes Z, Perkecz A, Bán Á, Polgár B, et al. (2012) Effect of Surgical and Chemical Sensory Denervation on Non-neural Expression of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) Receptors in the Rat. J Mol Neurosci 48: 795–803.
220.
Barthó L, Benkó R, Patacchini R, Pethö G, Holzer-Petsche U, et al. (2004) Effects of capsaicin on visceral smooth muscle: a valuable tool for sensory neurotransmitter identification. Eur J Pharmacol 500: 143–157.
221.
Matsumoto K, Kurosawa E, Terui H, Hosoya T, Tashima K, et al. (2009) Localization of TRPV1 and contractile effect of capsaicin in mouse large intestine: high abundance and sensitivity in rectum and distal colon. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 297: G348–G360.
222.
Patapoutian A, Tate S, Woolf CJ (2009) Transient receptor potential channels : targeting pain at the source. Nat Rev Drug Discov 8: 55–68.
223.
Chan CLH, Facer P, Davis JB, Smith GD, Egerton J, et al. (2003) Sensory fibres expressing capsaicin receptor TRPV1 in patients with rectal hypersensitivity and faecal urgency. Lancet 361: 385–391.
224.
Holzer P (2003) Acid-sensitive ion channels in gastrointestinal function. Curr Opin Pharmacol 3: 618–625.
225.
Anavi-goffer S, Mckay NG, Ashford MLJ, Coutts AA (2002) Vanilloid receptor type 1immunoreactivity is expressed by intrinsic afferent neurones in the guinea-pig myenteric plexus. Neurosci Lett 319: 53–57.
226.
Holzer P (2004) TRPV1 and the gut : from a tasty receptor for a painful vanilloid to a key player in hyperalgesia. Eur J Pharmacol 500: 231–241.
227.
Steinbach EC, Plevy SE (2014) The role of macrophages and dendritic cells in the initiation of inflammation in IBD. Inflamm Bowel Dis 20: 166–175.
228.
Patel YC (1999) Somatostatin and its receptor family. Front Neuroendocrinol 20: 157– 198.
110
229.
Joe B, Lokesh BR (1997) Effect of curcumin and capsaicin on arachidonic acid metabolism and lysosomal enzyme secretion by rat peritoneal macrophages. Lipids 32: 1173–1180.
230.
Ippoushi K, Azuma K, Ito H, Horie H, Higashio H (2003) [6]-Gingerol inhibits nitric oxide synthesis in activated J774.1 mouse macrophages and prevents peroxynitrite-induced oxidation and nitration reactions. Life Sci 73: 3427–3437.
231.
Ippoushi K, Itou H, Azuma K, Higashio H (2002) Effect of naturally occurring organosulfur compounds on nitric oxide production in lipopolysaccharide-activated macrophages. Life Sci 71: 411–419.
232.
Wagner AE, Boesch-Saadatmandi C, Dose J, Schultheiss G, Rimbach G (2012) Antiinflammatory potential of allyl-isothiocyanate--role of Nrf2, NF-(κ) B and microRNA155. J Cell Mol Med 16: 836–843.
233.
Lee T-Y, Lee K-C, Chen S-Y, Chang H-H (2009) 6-Gingerol inhibits ROS and iNOS through the suppression of PKC-alpha and NF-kappaB pathways in lipopolysaccharidestimulated mouse macrophages. Biochem Biophys Res Commun 382: 134–139.
234.
Lee SH, Lee SY, Son DJ, Lee H, Yoo HS, et al. (2005) Inhibitory effect of 2’hydroxycinnamaldehyde on nitric oxide production through inhibition of NF-kappa B activation in RAW 264.7 cells. Biochem Pharmacol 69: 791–799.
235.
Lee H-S, Kim B-S, Kim M-K (2002) Suppression effect of Cinnamomum cassia barkderived component on nitric oxide synthase. J Agric Food Chem 50: 7700–7703.
236.
Chao LK, Hua K-F, Hsu H-Y, Cheng S-S, Lin I-F, et al. (2008) Cinnamaldehyde inhibits proinflammatory cytokines secretion from monocytes/macrophages through suppression of intracellular signaling. Food Chem Toxicol 46: 220–231.
237.
Kun J, Helyes Z, Szitter I, Kemény Á, Ernszt D, et al. (2013) TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR KNOCKOUT MICE ARE MORE SUSCEPTIBLE TO DEXTRANE-SULFATE INDUCED COLITIS. Period Biol 115: 38.
238.
Nozawa K, Kawabata-Shoda E, Doihara H, Kojima R, Okada H, et al. (2009) TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 3408–3413.
239.
Ahern GP (2011) 5-HT and the immune system. Curr Opin Pharmacol 11: 29–33.
240.
Chojnacki C, Wiśniewska-Jarosińska M, Kulig G, Majsterek I, Reiter RJ, et al. (2013) Evaluation of enterochromaffin cells and melatonin secretion exponents in ulcerative colitis. World J Gastroenterol 19: 3602–3607.
241.
Nilius B, Appendino G (2013) Spices : the savory and beneficial science of pungency . Rev Physiol Biochem Pharmacol 164: 1–76.
242.
Vriens J, Appendino G, Nilius B (2009) Pharmacology of vanilloid transient receptor potential cation channels. Mol Pharmacol 75: 1262–1279. 111
243.
Leamy AW, Shukla P, McAlexander M a, Carr MJ, Ghatta S (2011) Curcumin ((E,E)-1,7bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione) activates and desensitizes the nociceptor ion channel TRPA1. Neurosci Lett 503: 157–162.
244.
Davaatseren M, Hwang J-T, Park JH, Kim M-S, Wang S, et al. (2014) Allyl isothiocyanate ameliorates angiogenesis and inflammation in dextran sulfate sodium-induced acute colitis. PLoS One 9: e102975.
245.
Sakamoto N, Kono S, Wakai K, Fukuda Y, Satomi M, et al. (2005) Dietary Risk Factors for Inflammatory Bowel Disease. Inflamm Bowel Dis 11: 154–163.
246.
Chapman-Kiddell C, Davies PSW, Gillen L, Radford-Smith GL (2010) Role of diet in the development of inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 16: 137–151.
247.
Wagner AE, Will O, Sturm C, Lipinski S, Rosenstiel P, et al. (2013) DSS-induced acute colitis in C57BL/6 mice is mitigated by sulforaphane pre-treatment. J Nutr Biochem 24: 2085–2091.
248.
Peyrot des Gachons C, Uchida K, Bryant B, Shima A, Sperry JB, et al. (2011) Unusual pungency from extra-virgin olive oil is attributable to restricted spatial expression of the receptor of oleocanthal. J Neurosci 31: 999–1009.
249.
Bennett SM, Hayes JE (2012) Differences in the chemesthetic subqualities of capsaicin, ibuprofen, and olive oil. Chem Senses 37: 471–478.
250.
Yamamoto T (2013) Nutrition and diet in inflammatory bowel disease. Curr Opin Gastroenterol 29: 216–221.
251.
Berger A, Paige CJ (2005) Hemokinin-1 has Substance P-like function in U-251 MG astrocytoma cells: a pharmacological and functional study. J Neuroimmunol 164: 48– 56.
252.
Berger A, Tran AH, Paige CJ (2007) Co-regulated decrease of Neurokinin-1 receptor and Hemokinin-1 gene expression in monocytes and macrophages after activation with proinflammatory cytokines. J Neuroimmunol 187: 83–93.
112
Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt szeretném hálámat kifejezni témavezetőmnek, Helyes Zsuzsanna professzornak, hogy bevezetett a kutatás világába és szakmai, személyes példamutatásával, pozitív szemléletével korábban nem remélt távlatok elérésére sarkallt. Hálás köszönetem Pintér Erika professzornak, intézetvezetőnek, Doktori Iskola és Programvezetőnek, aki gyakorlatilag szintén témavezetőmként, kutatói és emberi értékek átadásával ösztönzött. Köszönöm Szolcsányi János Professzor Úrnak, hogy mindvégig figyelemmel kísérte munkámat és iránymutatásokkal látott el. Köszönöm Dr. Kemény Ágnes és Dr. Szőke Éva lelkes segítségét. Külön köszönöm Hírné Perkecz Anikónak és Bagoly Teréznek a nélkülözhetetlen munkát, és nem utolsósorban odaadó asszisztensemnek, Buzási Ádámné Annának az együtt töltött vidám perceket. Köszönöm Dr. Szitter István, Dr. Sándor Katalin, Dr. Tékus Valéria és Olaszné Zádor Csilla állatkísérletekben való közreműködését. Köszönet illeti továbbá a Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet valamennyi munkatársát, az összes kutatót, PhD hallgatót, az asszisztenseket és állatgondozókat, hogy munkámat kivételesen segítőkész, támogató légkörben végezhettem. Eredményeim nem jöhettek volna létre külső együttműködők nélkül. Köszönöm Dr. Bíró Tamásnak (Debreceni Egyetem) az értékes kooperációt, Dr. Szabadfi Krisztinának (TTK Kísérletes Állattani és Neurobiológiai Tanszék), Dr. Kereskai Lászlónak (Pathologiai Intézet) és Dr. Gaszner Balázsnak (Anatómiai Intézet) a szövettani munkában nyújtott segítséget. Köszönettel tartozom a klinikai mintákért Dr. Szabó Imrének, Dr. Vincze Áronnak és Dr. Gódi Szilárdnak (I. sz. Belgyógyászati Klinika), továbbá a metodikai segítségért az Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet munkatársainak: Dr. Polgár Beátának, Dr. Palkovics Tamásnak és Kiss Áginak. Külön köszönöm Nagy Ágnes és Kovács Sándor (PTE SzKK Növénybiológiai Csoport) szakmai és baráti támogatását. Végül, nem lehetek eléggé hálás családomnak, akik mindvégig támogattak és megfelelő hátteret biztosítottak a munkámhoz. Köszönöm a Nemzeti Kiválóság Program Apáczai Csere János Doktoranduszi Ösztöndíj (TÁMOP 4.2.4.A/1-11-1-2012-0001) támogatását.
113
Publikációs lista Az értekezés alapjául szolgáló eredeti közlemények Kun József, Helyes Zsuzsanna, Perkecz Anikó, Bán Ágnes, Polgár Beáta, Szolcsányi János, Pintér Erika Effect of Surgical and Chemical Sensory Denervation on Non-neural Expression of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) Receptors in the Rat. JOURNAL OF MOLECULAR NEUROSCIENCE 48:(3) pp. 795-803. (2012) IF: 2,504 Helyes Zsuzsanna, Kun József, Dobrosi Nóra, Sándor Katalin, Németh József, Perkecz Anikó, Pintér Erika, Szabadfi Krisztina, Gaszner Balázs, Tékus Valéria, Szolcsányi János, Capsaicin induces skin inflammation via Transient Receptor Potential Vanilloid-1mediated up-regulation of Pituitary Adenylate-Cyclase Activating Polypeptide Közlésre benyújtva a Journal of Investigative Dermatology folyóirathoz, a bírálók kérdéseire a válaszadás folyamatban. IF: 6,372 Kun József, Szitter István, Kemény Ágnes, Perkecz Anikó, Kereskai László, Pohóczky Krisztina, Vincze Áron, Gódi Szilárd, Szabó Imre, Szolcsányi János, Pintér Erika, Helyes Zsuzsanna Upregulation of the Transient Receptor Potential Ankyrin 1 ion channel in the inflamed human and mouse colon and its protective roles PLoS ONE, megjelenés: 2014. szeptember 29., DOI: 10.1371/journal.pone.0108164 IF: 3,534 Az értekezés alapját képező közlemények kumulatív impakt faktora: 6,038. Független idézők száma: 4.
Egyéb teljes közlemények Szitter István, Pintér Erika, Perkecz Anikó, Kemény Ágnes, Kun József, Kereskai László, Claudio Pietra, John P. Quinn, Andreas Zimmer, Alexandra Berger, Christopher J. Paige, Helyes Zsuzsanna Role of neurokinin 1 receptors in dextran sulfate-induced colitis: studies with genedeleted mice and the selective receptor antagonist netupitant Inflamm. Res. (2014) 63:399–409 IF: 2,143
114
Markovics Adrienn, Kormos Viktória, Gaszner Balázs, Arvin Lashgarara, Szőke Éva, Sandor Katalin, Szabadfi Krisztina, Tuka Bernadett, Tajti János, Szolcsányi János, Pintér Erika, Hitoshi Hashimoto, Kun József, Reglődi Dóra, Helyes Zsuzsanna Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide plays a key role in nitroglycerolinduced trigeminovascular activation in mice. NEUROBIOLOGY OF DISEASE 45: pp. 633-644. (2012) IF: 5,403, független idézők: 15.
Az értekezés alapját képező konferencia prezentációk
J. Kun, I. Szitter, Á. Kemény, A. Perkecz, L. Kereskai, Krisztina Pohóczky, Áron Vincze, Szilárd Gódi, Imre Szabó, János Szolcsányi, Erika Pintér, Zsuzsanna Helyes UPREGULATION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 RECEPTOR IN THE INFLAMED HUMAN AND MOUSE COLON The 8th International Symposium on Cell/Tissue Injury and Cytoprotection/ Organoprotection and IUPHAR Meeting of the 17th World Congress of Basic and Clinical Pharmacology, Budapest, 2014. szeptember 24-26. (poszter) J. Kun, I. Szitter, Á. Kemény, A. Perkecz, L. Kereskai, Krisztina Pohóczky, Áron Vincze, Szilárd Gódi, Imre Szabó, János Szolcsányi, Erika Pintér, Zsuzsanna Helyes UPREGULATION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 ION CHANNEL IN THE INFLAMED HUMAN AND MOUSE COLON AND ITS PROTECTIVE ROLES The 8th International Symposium on Cell/Tissue Injury and Cytoprotection/ Organoprotection and IUPHAR Meeting of the 17th World Congress of Basic and Clinical Pharmacology, Budapest, 2014. szeptember 24-26. (előadás) J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Á. Kemény, É. Szőke, É. Sághy, D. Ernszt, T. Bagoly, A. Perkecz, K. Pohóczky, A. Markovics, V. Tékus, E. Pintér TRPA1 RECEPTOR HAS A PROTECTIVE ROLE IN DEXTRANE-SULFATE INDUCED MOUSE COLITIS BY DECREASING TACHYKININ AND INFLAMMATORY CYTOKINE EXPRESSIONS Semmelweis Symposium 2013: Molecular mechanisms and therapeutic targets in inflammatory diseases, Budapest, 2013. november 7-9. (poszter) J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Á. Kemény, D. Ernszt, É. Szőke, É. Sághy, T. Kovács, A. Bognár, K. Pohóczky, T. Bagoly, A. Markovics, A. Perkecz, Z. Sándor, E. Pintér TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR HAS A PROTECTIVE ROLE IN DEXTRANE-SULFATE INDUCED MOUSE COLITIS Magyar Immunológiai Társaság 42. Vándorgyűlése, Pécs, 2013. október 16-18. (poszter)
115
J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Á. Kemény, D. Ernszt, É. Szőke, É. Sághy, T. Kovács, A. Bognár, K. Pohóczky, T. Bagoly, A. Markovics, A. Perkecz, Z. Sándor, E. Pintér TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR KNOCKOUT MICE ARE MORE SUSCEPTIBLE TO DEXTRANE-SULFATE INDUCED COLITIS Horvát Élettani Társaság Konferenciája – Élettani Társaságok 1. Regionális Konferenciája, 2013. szeptember 13-15., Fiume, Horvátország (poszter) Zs. Helyes, J. Kun, N. Dobrosi, K. Sandor, J. Nemeth, A. Perkecz A, E. Pinter, K. Szabadfi, V. Tekus, J. Szolcsanyi, A. Baba, D. Reglodi, T. Biro CAPSAICIN INDUCES SKIN INFLAMMATION VIA TRPV1- MEDIATED UP-REGULATION OF PACAP The 11th International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides. Konferencia helye, ideje: Pécs, Magyarország, 2013.08.27-2013.08.31. Pécs. (előadás) J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Sz. Gódi, I. Szabó, Á. Kemény, K. Pohóczky, A. Perkecz, E. Pintér A tranziens receptor potenciál ankyrin 1 (TRPA1) és vanilloid 1 (TRPV1) receptor mRNS expresszió gyulladásos bélbetegségben (IBD) és dextrán-szulfát (DSS) által indukált egér colitis modellben A Magyar Élettani, Farmakológiai és Mikrocirkulációs Társaságok 2013. évi közös Tudományos Kongresszusa, 2013.június 5-8., Budapest, Semmelweis Egyetem Testnevelési és Sporttudományi Kar (poszter) J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Sz. Gódi, I. Szabó, Á. Kemény, K. Pohóczky, A. Perkecz, E. Pintér TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) AND VANILLOID 1 (TRPV1) RECEPTOR mRNA EXPRESSION IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE (IBD) AND DEXTRAN SULFATEINDUCED COLITIS IN MICE Joint Meeting of The European Neuropeptide Club (ENC) Meeting and Summer Neuropeptide Conference, 2013. május 29 – június 1., Gdynia, Lengyelország (poszter) J. Kun, E. Pintér, I. Szitter, I. Szabó, Sz. Gódi, A. Perkecz, Zs. Helyes A TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR EXPRESSZIÓVÁLTOZÁSA GYULLADÁSOS BÉLBETEGSÉGBEN (IBD) ÉS DEXTRÁN-SZULFÁT ÁLTAL INDUKÁLT EGÉR COLITIS MODELLBEN Magyar Anatómus Társaság, a Magyar Biofizikai Társaság, a Magyar Élettani Társaság, és a Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Vándorgyűlése, Debrecen, 2012. június 10-13. (poszter) J. Kun, Zs. Helyes, A. Perkecz, Sz. Gódi, I. Szabó, E. Pinter A tranziens receptor potenciál ankyrin 1 (TRPA1) receptor expresszióváltozása gyulladásos bélbetegségben (IBD) és dextrán-szulfát kiváltotta egér colitisben Kisfaludy Lajos Alapítvány előadóülés, Richter Gedeon Vegyészeti Gyár Rt., Budapest, 2013. április 15. (előadás)
116
J. Kun, Zs. Helyes, A. Perkecz, Sz. Gódi, I. Szabó, E. Pinter EXPRESSION CHANGE OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE (IBD) AND DEXTRAN SULFATE-INDUCED COLITIS IN MICE 6th European Congress of Pharmacology (EPHAR), Granada, Spanyolország, 2012. július 17-20. (poszter) J. Kun, Zs. Helyes, A. Perkecz, Á. Bán, B. Polgár, J. Szolcsányi, E. Pintér EFFECT OF SURGICAL AND CHEMICAL SENSORY DENERVATION ON NON-NEURAL EXPRESSION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL VANILLOID 1 (TRPV1) RECEPTORS IN THE RAT International Brain Research Organization IBRO 2012 Workshop, 2012. január 19-21, Szeged (poszter) J. Kun, E. Pintér, A. Perkecz, J. Szolcsányi: "EFFECT OF SURGICAL AND CHEMICAL SENSORY DENERVATION ON NON-NEURAL EXPRESSION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL VANILLOID 1 (TRPV1) RECEPTORS IN THE RAT" The 8th International Medical Postgraduate Conference, Károly Egyetem Orvostudományi Kar, Hradec Kralove, Cseh Köztársaság, 2011. november 10-12. (előadás)
Egyéb konferencia prezentációk E. Tóth, J. Kun, A. Perkecz, Z. Piski, I. Gerlinger, J. Szolcsányi, E. Pintér Nem-neurális tranziens receptor potenciál VANILLOID 1 (TRPV1) - azaz kapszaicin receptor - és ANKYRIN 1 (TRPA1) receptorok jelenléte orrpolipózisban, asztmás betegcsoporton A MAGYAR FÜL-, ORR-, GÉGE ÉS FEJ-, NYAKSEBÉSZ ORVOSOK EGYESÜLETE 43. KONGRESSZUSA, TAPOLCA, 2014. OKTÓBER 15-18. (előadás) A. Kemeny, Zs. Hajna, I. Szitter, J. Kun, E. Pinter, Zs. Helyes Role of TRPV1 and TRPA1 ion channels in cigarette smoke-induced chronic airway inflammation model of the mouse 20th International Symposium on Regulatory Peptides (REGPEP2014), Kiotó, Japán, 2014. szeptember 7-10. (poszter) K. Pohóczky, J. Kun, B. Szalontai, K. Kovács, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) and Vanilloid 1 (TRPV1) ion channels are expressed and upregulated in response to estrogen in the rat endometrium 20th International Symposium on Regulatory Peptides (REGPEP2014), Kiotó, Japán, 2014. szeptember 7-10. (poszter)
117
J. Kun, D. Feller, I. Szitter, Zs. Hajna, Á. Kemény, A. Perkecz, V. Csöngei, D. Ernszt, T. Kovács, J. E. Pongrácz, Zs. Helyes CIGARETTE SMOKE-INDUCED UPREGULATION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 ION CHANNEL IN THE MOUSE LUNG AND IN A HUMAN PULMONARY TISSUE 3DIMENSIONAL MODEL 20th International Symposium on Regulatory Peptides (REGPEP2014), Kiotó, Japán, 2014. szeptember 7-10. (poszter) J. Kun , D. Feller, I. Szitter, Zs. Hajna, Á. Kemény, A. Perkecz, V. Csöngei, D. Ernszt, T. Kovács, J. Pongrácz, Zs. Helyes CIGARETTE SMOKE-INDUCED UPREGULATION OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 ION CHANNEL IN THE MOUSE LUNG AND IN A HUMAN PULMONARY TISSUE 3DIMENSIONAL MODEL Joint Meeting of the Federation of European Physiological Societies (FEPS) and the Hungarian Physiological Society, Budapest, 2014. August 27-30. (poszter) E. Toth, J. Kun, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsanyi, E. Pinter EXPRESSION OF TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL VANILLOID 1 (TRPV1) AND ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTORS IN CHRONIC RHINOSINUSITIS 25th Congress of the European Rhinologic Society in conjunction with 32ndInternational Symposium of Infection & Allergy of the Nose; Amszterdam, Hollandia, 2014. június 22-26. (előadás) K. Pohóczky, J. Kun, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes Expression and hormone-mediated upregulation of Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) and Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in the rat endometrium Horvát Élettani Társaság Konferenciája – Élettani Társaságok 1. Regionális Konferenciája, 2013. szeptember 13-15., Fiume, Horvátország (poszter) A. Markovics, V. Kormos, B. Gaszner, A. Lashgarara, E. Szoke, K. Sandor, K. Szabadfi, B. Tuka, J. Tajti, J. Szolcsanyi, E. Pinter, H. Hashimoto, J. Kun, D. Reglodi, Zs. Helyes Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide plays a key role in nitroglycerol-induced trigeminovascular activation in mice NEUROINFLAMMATION: A satellite symposium to the regional FENS meeting. Konferencia helye, ideje: Prága, Csehország, 2013.09.08-2013.09.11. (poszter) A. Markovics, V. Kormos, B. Gaszner, A. Lashgarara, E. Szoke, K. Sandor, K. Szabadfi, B. Tuka, J. Tajti, J. Szolcsanyi, E. Pinter, H. Hashimoto, J. Kun, D. Reglodi, Zs. Helyes PITUITARY ADENYLATE CYCLASE-ACTIVATING POLYPEPTIDE PLAYS A KEY ROLE IN NITROGLYCEROL-INDUCED TRIGEMINOVASCULAR ACTIVATION IN MICE The 11th International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides. Konferencia helye, ideje: Pécs, Magyarország, 2013.08.27-2013.08.31. (poszter)
118
K. Pohóczky, J. Kun, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes A TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL VANILLOID 1 (TRPV1) RECEPTOR ÉS A MAKROFÁG MIGRÁCIÓT GÁTLÓ FAKTOR (MIF) HORMONFÜGGŐ EXPRESSZIÓ-VÁLTOZÁSAI PATKÁNY ENDOMETRIUMBAN A Magyar Élettani, Farmakológiai és Mikrocirkulációs Társaságok 2013. évi közös Tudományos Kongresszusa, 2013.június 5-8., Budapest, Semmelweis Egyetem Testnevelési és Sporttudományi Kar (poszter) I. Szitter, E. Pintér, A. Perkecz, Á. Kemény, J. Kun, C. Pietra, J. Quinn, A. Zimmer, A. Berger, Zs. Helyes. ROLE OF NEUROKININ 1 (NK1) RECEPTORS IN DEXTRAN SULFATE-INDUCED COLITIS: STUDIES WITH GENE-DELETED MICE AND A SELECTIVE RECEPTOR ANTAGONIST Joint Meeting of The European Neuropeptide Club (ENC) Meeting and Summer Neuropeptide Conference 2013. május 29 – június 1., Gdynia, Lengyelország (poszter) D. Feller, Zs. Helyes, J. Rapp, J. Kun, D. Ernszt, T. Kovács, E. J. Pongracz Changes in expression levels of Wnt signalling molecules in cigarette smoke- induced experimental model systems. 9thJános Szentagothai Inredisciplinary Conference and Student Competition, Pécs, Hungary, 3-4 May 2013 (poszter) D. Feller, Zs. Helyes, J. Rapp, J. Kun, E. J. Pongrácz Expression levels of Wnt5a and Wnt11 molecules in cigarette smoke-exposed in vitro and in vivo inflammation models. The Student Scientific Conference on Biotechnology and Biomedicine. Brno, Czech Republic, 10-12 April 2013 (előadás) J. Kun, K. Pohóczky, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes The presence and estrogen-mediated upregulation of the TRPV1 receptor in rat endometrium Magyar Biokémiai Egyesület (MBKE), a Magyar Genetikusok Egyesülete (MAGE) és a Sejt- és Fejlődésbiológiai Szakosztály közös konferenciája: Molekuláris Élettudományi Konferencia, 2013. április 5-7, Siófok (poszter) D. Feller, J. Rapp, J. Kun Changes in expression levels of Wnt signalling molecules in cigarette smoke-exposed experimental model systems. 9th International Biomedical Croatian Student Summit, University of Zagreb, Croatia, 20-23 March 2013 (előadás) D. Feller, Zs. Helyes, J. Rapp, J. Kun, T. Kovács, V. Csöngei, J. Pongrácz A Wnt szignálmolekulák expressziójának vizsgálata dohányfüst indukálta in vivo és in vitro kísérleti modellrendszererekben. XVIII. Bolyai Konferencia, Budapest, 2013. március 23-24. (poszter)
119
Zs. Hajna, É. Borbély, V. Tékus, I. Tóth, A. Berger, C. J. Paige, E. Pintér, J. Kun, J. Szolcsányi, Zs. Helyes Hemokinin-1 induces hyperalgesia in inflammatory and neuropathic pain models of the mouse A Magyar Idegtudományi Társaság XIV. Konferenciája, 2013. január 17-19., Budapest (poszter) K. Pohóczky, J. Kun, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes A TRPV1 receptor jelenléte és ösztrogén kezelés hatására történő expresszió-növekedése patkány endometriumban A Magyar Idegtudományi Társaság XIV. Konferenciája, 2013. január 17-19., Budapest (poszter) E. Tóth, J. Kun, A. Perkecz, T. Tornóczky, I. Gerlinger, J. Szolcsányi, E. Pintér NEM-NEURÁLIS TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL VANILLOID 1 (TRPV1)-AZAZ KAPSZAICIN RECEPTOR- ÉS ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOROK JELENLÉTE KRÓNIKUS RHINOSINUSITISBEN Magyar Fül-, Orr-, Gége és Fej-, Nyaksebész Orvosok Egyesülete 42. Kongresszusa, Pécs, 2012. okt. 17-20. (előadás) D. Feller, Zs. Helyes, J. Kun, T. Kovács, V. Csöngei, J. Rapp, M. Avdičević, E. Kiss, E. J. Pongrácz The expression of the wnt11 and wnt5a signal molecules in cigarette smoke-exposed airway inflammation models. Janos Szentagothai Memorial Conference and Student Competition, Pécs, Hungary, 29-30 October 2012 (poszter) V. Tékus, Zs. Helyes, Zs. Hajna, Á. Horváth, J. Kun, K. Bölcskei, E. Pintér, J. Szolcsányi Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1), but not Ankyrin 1 (TRPA1) ion channels mediate mustard oil-induced hyperalgesia in mice 1st International Doctoral Workshop on Natural Sciences, Pécsi Tudományegyetem, 2012. október 3. (előadás) Á. Bán, J. Kun, A. Perkecz, E. Pintér A tranziens receptor potenciál vanilloid 1 (TRPV1) és a tranziens receptor potenciál ankyrin 1 (TRPA1) receptorok expressziójának összehasonlítása orális lichen planusban Magyar Fogorvosok Egyesülete, Árkövy Vándorgyűlés, Pécs, 2012. szeptember 20-22. (előadás) D. Feller, Zs. Helyes, J. Kun, T. Kovács, V. Csöngei, J. Rapp, M. Avdičević, E. Kiss, E. J. Pongrácz THE EXPRESSION OF THE WNT11 AND WNT5A SIGNAL MOLECULES IN CIGARETTE SMOKEINDUCED AIRWAY INFLAMMATION MODELS The 22nd Annual BioCity Symposium - PERSONAL GENOMICS FROM TECHNOLOGIES TO APPLICATIONS, Turku, Finnország, 2012. augusztus 23-24. (poszter)
120
V. Tékus, Zs. Helyes, Zs. Hajna, Á. Horváth, J. Kun, K. Bölcskei, E. Pintér, J. Szolcsányi A TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL VANILLOID 1 (TRPV1) ÉS ANKYRIN 1 (TRPA1) IONCSATORNÁK SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA MUSTÁROLAJJAL KIVÁLTOTT NOCIFENZÍV VISELKEDÉSBEN ÉS AKUT GYULLADÁSOS HIPERALGÉZIÁBAN Magyar Anatómus Társaság, a Magyar Biofizikai Társaság, a Magyar Élettani Társaság, és a Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Vándorgyűlése, Debrecen, 2012. június 10-13. (poszter) Zs. Hajna, É. Borbély, V. Tékus, I. Tóth, A. Berger, J. Kun, E. Pintér, J. Szolcsányi, Zs. Helyes A HEMOKININ-1 FONTOS SZEREPET JÁTSZIK A HIPERALGÉZIA KIALAKULÁSÁBAN KÜLÖNBÖZŐ GYULLADÁSOS ÉS DEGENERATÍV KÓRKÉPEK EGÉRMODELLJEIBEN Magyar Anatómus Társaság, a Magyar Biofizikai Társaság, a Magyar Élettani Társaság, és a Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Vándorgyűlése, Debrecen, 2012. június 10-13. (poszter) Á. Ban, J. Kun, A. Perkecz, E. Pinter COMPARISON OF TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL VANILLOID 1 (TRPV1) AND TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR EXPRESSION IN ORAL LICHEN PLANUS Europerio 7 – Coference of the European Federation of Periodontology, Bécs, Ausztria, 2012. június 6-9. (poszter) V. Tékus, Zs. Hajna, Á. Horváth, J. Kun, K. Bölcskei, J. Szolcsányi, Zs. Helyes ROLE OF THE TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL VANILLOID 1 AND ANKYRIN 1 (TRPV1 AND TRPA1) ION CHANNELS IN THERMONOCICEPTION IN MICE International Brain Research Organization IBRO 2012 Workshop, 2012. január 19-21, Szeged (poszter) P. Kiss, J. Farkas, A. Matkovits, G. Horváth, Zs. Helyes, J. Kun, H. Hitoshi, B. Akemichi, L. Welke, A. Tamás, D. Reglődi NEUROBEHAVIOURAL DEVELOPMENT IN PACAP KNOCKOUT NEWBORN MICE International Brain Research Organization IBRO 2012 Workshop, 2012. január 19-21, Szeged (poszter) J. Kun, E. Tóth, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsanyi, E. Pinter NEM-NEURÁLIS TRANZIENS RECEPTOR POTENCIÁL VANILLOID 1 (TRPV1) ÉS ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOROK JELENLÉTE RHINOSINUSITISBEN Magyar Farmakológiai, Anatómus, Mikrocirkulációs, Élettani Társaságok közös tudományos konferenciája (FAMÉ), PTE ÁOK, Pécs, 2011. június 8-11 (poszter) J. Kun, E. Toth, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsanyi, E. Pinter EXPRESSION OF TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL RECEPTORS VANILLOID 1 (TRPV1) AND ANKYRIN 1 (TRPA1) IN NASAL POLYPOSIS The 8th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the American Summer Neuropeptide Conference, Boston, 2011. május 22-25. (poszter)
121
J. Kun, T. Palkovics, A. Perkecz, T. Laszlo, E. Pinter, J. Szolcsanyi, P. Nagy, B. Polgar, L. Jakab, T. F. Molnar, Zs. Helyes EXPRESSION OF SOMATOSTATIN RECEPTOR SUBTYPE 1 (SST1) IN DIFFERENT TYPES OF LUNG CANCER The 7th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the American Summer Neuropeptide Conference, Pécs, 2010. június 21 - 24. (poszter)
Idézhető kivonatok (absztraktok) E. Tóth, J. Kun, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsányi, E. Pinter Expression of transient receptor potential Vanilloid 1 (TRPV1) and Ankyrin 1 (TRPA1) receptors in chronic rhinosinusitis Rhinology (2014) 52:S25:625; IF: 2,8 J. Kun, D. Feller, I. Szitter, Zs. Hajna, Á. Kemény, A. Perkecz, V. Csöngei, D. Ernszt, T. Kovács, J. E. Pongrácz, Zs. Helyes CIGARETTE SMOKE EXPOSURE UPREGULATES TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 ION CHANNELS IN THE MOUSE LUNG AND IN A HUMAN PULMONARY TISSUE 3-DIMENSIONAL MODEL J Mol Neurosci (2014) 53:S175; IF: 2,757 A. Kemeny, Zs. Hajna, I. Szitter, J. Kun, E. Pinter, Zs. Helyes ROLE OF TRPV1 AND TRPA1 ION CHANNELS IN CIGARETTE SMOKE-INDUCED CHRONIC AIRWAY INFLAMMATION MODEL OF THE MOUSE J Mol Neurosci (2014) 53:S174; IF: 2,757 K. Pohóczky, J. Kun, B. Szalontai, K. Kovács, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) and Vanilloid 1 (TRPV1) ion channels are expressed and upregulated in response to estrogen in the rat endometrium J Mol Neurosci (2014) 53:S179; IF: 2,757 A. Markovics, V. Kormos, B. Gaszner, A. Lashgarara, E. Szoke, K. Sandor, K. Szabadfi, B. Tuka, J. Tajti, J. Szolcsanyi, E. Pinter, H. Hashimoto, J. Kun, D. Reglodi, Zs. Helyes PITUITARY ADENYLATE CYCLASE-ACTIVATING POLYPEPTIDE PLAYS A KEY ROLE IN NITROGLYCEROL-INDUCED TRIGEMINOVASCULAR ACTIVATION IN MICE J Mol Neurosci (2013) 51:S220; IF: 2,757 Zs. Helyes, J. Kun, N. Dobrosi, K. Sandor, J. Nemeth, A. Perkecz A, E. Pinter, K. Szabadfi, V. Tekus, J. Szolcsanyi, A. Baba, D. Reglodi, T. Biro CAPSAICIN INDUCES SKIN INFLAMMATION VIA TRPV1-MEDIATED UP-REGULATION OF PACAP J Mol Neurosci (2013) 51:S190; IF: 2,757
122
J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Sz. Gódi, I. Szabó, Á. Kemény, K. Pohóczky, A. Perkecz, E. Pintér TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) AND VANILLOID 1 (TRPV1) RECEPTOR mRNA EXPRESSION IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE (IBD) AND DEXTRAN SULFATEINDUCED COLITIS IN MICE J Mol Neurosci (2013) 51:S159; IF: 2,757 I. Szitter, E. Pintér, A. Perkecz, Á. Kemény, J. Kun, C. Pietra, J. Quinn, A. Zimmer, A. Berger, Zs. Helyes ROLE OF NEUROKININ 1 (NK1) RECEPTORS IN DEXTRAN SULFATE-INDUCED COLITIS: STUDIES WITH GENE-DELETED MICE AND A SELECTIVE RECEPTOR ANTAGONIST J Mol Neurosci (2013) 51:S165; IF: 2,757 J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Á. Kemény, D. Ernszt, É. Szőke, É. Sághy, T. Kovács, A. Bognár, K. Pohóczky, T. Bagoly, A. Markovics, A. Perkecz, Z. Sándor, E. Pintér TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR KNOCKOUT MICE ARE MORE SUSCEPTIBLE TO DEXTRANE-SULFATE INDUCED COLITIS PERIODICUM BIOLOGORUM 115:(2) p. 38. (2013); IF: 0,2 K. Pohóczky, J. Kun, J. Garai, A. Garami, A. Perkecz, Zs. Helyes Expression and hormone-mediated upregulation of Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) and Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in the rat endometrium PERIODICUM BIOLOGORUM 115:(2) p. 46. (2013); IF: 0,2 J. Kun, Zs. Helyes, I. Szitter, Á. Kemény, D. Ernszt, É. Szőke, É. Sághy, T. Kovács, A. Bognár, K. Pohóczky, T. Bagoly, A. Markovics, A. Perkecz, Z. Sándor, E. Pintér TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL ANKYRIN 1 (TRPA1) RECEPTOR HAS A PROTECTIVE ROLE IN DEXTRANE-SULFATE INDUCED MOUSE COLITIS IMMUNOLÓGIAI SZEMLE V:(3) p. 32. (2013); IF: 0 P. Kiss, J. Farkas, A. Matkovits, G. Horváth, Zs. Helyes, J. Kun, H. Hitoshi, B. Akemichi, L. Welke, A. Tamás, D. Reglődi Neurobehavioral development in PACAP knockout newborn mice JOURNAL OF MOLECULAR NEUROSCIENCE 48:(1) p. S164. 1 p. (2012); IF: 2,504 J. Kun, E. Toth, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsanyi, E. Pinter Expression of transient receptor potential receptors vanilloid 1 (TRPV1) and ankyrin 1 (TRPA1) in nasal polyposis JOURNAL OF MOLECULAR NEUROSCIENCE 48:(1) pp. S197-S198. (2012); IF: 2,504 B. Sandor, D. Hobor, P. Kiss, K. Szabadfi, D. Makovics, A. Matkovics, J. Farkas, M. Wlaschits, A. Jungling, B. Kaszas, J. Kun, A. Nagy, R. Gabriel, D. Reglodi, A. Tamas Comparative examination of tooth development in wild type and PACAP deficient mice JOURNAL OF MOLECULAR NEUROSCIENCE 48:(1) p. S164. 1 p. (2012); IF: 2,504
123
V. Tékus, Zs. Hajna, Á. Horváth, J. Kun, K. Bölcskei, J. Szolcsányi, Zs. Helyes Role of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 and Ankyrin 1 (TRPV1 and TRPA1) ion channels in thermonociception in mice. CLINICAL NEUROSCIENCE 65:(1) p. 68. (2012); IF: 1,247 J. Kun, E. Tóth, A. Perkecz, T. Tornoczky, I. Gerlinger, J. Szolcsanyi, E. Pinter THE PRESENCE OF NON-NEURAL TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL RECEPTORS VANILLOID 1 (TRPV1) AND ANKYRIN 1 (TRPA1) IN RHINOSINUSITIS ACTA PHYSIOLOGICA 202:(S683) pp. 64-65. (2011); IF: 0,453 J. Kun, T. Palkovics, A. Perkecz, T. Laszlo, E. Pinter, J. Szolcsanyi, P. Nagy, B. Polgar, L. Jakab, T. F. Molnar, Zs. Helyes EXPRESSION OF SOMATOSTATIN RECEPTOR SUBTYPE 1 (SST1) IN DIFFERENT TYPES OF LUNG CANCER NEUROPEPTIDES 44:(6) p. 542. (2010); IF: 2,036
Az összes publikáció (teljes közlemények és kivonatok) kumulatív impakt faktora IF: 47,331 Független idézők: 19
124
