BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian ini adalah penelitian non-eksperimental dengan pendekatan survei serta rancangan deskriptif dan eksploratif. B. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan selama bulan Maret sampai April 2016. Pengujian cemaran AKK dan S.aureus pada sampel dilakukan di Laboratorium Pusat MIPA Universitas Sebelas Maret Surakarta. C. Variabel Penelitian 1.
Variabel Penelitian a. Variabel Bebas : jamu temulawak, kunyit, dan beras kencur yang diproduksi oleh dua penjual jamu di pasar Gede Surakarta. b. Variabel Tergantung : nilai AKK dan keberadaan bakteri S.aureus. c. Variabel Terkendali : suhu inkubasi, lama inkubasi, media, sterilisasi alat, dan sterilisasi media. D. Definisi Operasional a. Jamu gendong merupakan campuran atau ramuan berbagai macam simplisia tanaman yang berkhasiat sebagai obat dan tersedia dalam bentuk cair yang dapat langsung diminum oleh konsumen. b. Uji Angka Kapang/Khamir (AKK) adalah suatu uji cemaran mikroba yang dilakukan dengan menghitung jumlah koloni kapang dan khamir yang
14
15
terdapat dalam sampel yang diperiksa setelah cuplikan diinokulasikan pada media yang sesuai dan diinkubasi pada suhu 25oC. c. Uji cemaran bakteri S.aureus adalah uji untuk melihat keberadaan bakteri S.aureus pada sampel yang diperiksa menggunakan media selektif MSA dan pengamatan hasil dapat dilakukan dengan mengamati adanya koloni cembung warna kuning dan media berubah menjadi jernih. E. Alat dan Bahan Penelitian Peralatan yang digunakan pada penelitian ini yaitu Laminar Air Flow (Speg Air Tec), autoklaf (Sturdy), inkubator (Memert), pipet volume (pyrex), pipet tetes, tabung reaksi (pyrex), gelas beaker (pyrex), cawan petri, gelas ukur (pyrex), neraca analitik (Mettler Toledo), batang pengaduk, spreader glass, hotplate, bunsen, dan colony counter (colony star). Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah cairan jamu temulawak, kunyit, dan beras kencur yang diperoleh dari dua penjual jamu di pasar Gede Surakarta. Bahan yang digunakan untuk media pengujian AKK adalah PDA sedangkan untuk pengujian cemaran bakteri S.aureus digunakan media MSA. Bahan lain yang digunakan yaitu kloramfenikol, akuades steril, dan akuades. F. Tata Cara Penelitian 1.
Pemilihan sampel Sampel jamu yang dipilih diambil dari dua pedagang jamu di Pasar Gede Surakarta. Dari masing-masing pedagang diambil 3 macam jenis jamu yaitu
16
jamu temulawak, jamu kunyit, dan jamu beras kencur. Sampel jamu dihomogenkan terlebih dahulu dengan cara digojok sebelum diambil. 2.
Penanganan wadah/kemasan sampel Kemasan jamu dibersihkan dengan kapas beralkohol 70%, selanjutnya dipindahkan kedalam botol kaca steril secara aseptis.
3.
Sterilisasi Alat Alat-alat yang digunakan terlebih dahulu dicuci bersih dan dikeringkan. Tabung reaksi, erlenmeyer, gelas ukur, dan pipet volume ditutup mulutnya dengan kapas, kemudian dibungkus dengan kertas perkamen. Cawan petri dibungkus terpisah dengan perkamen, kemudian semua alat disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit. Lemari aseptis dibersihkan dengan menggunakan alkohol.
4.
Persiapan Pembuatan Media a. Potato Dextrose Agar (PDA) Serbuk PDA sebanyak 19,5 gram disuspensikan dalam 500ml akuades, kemudian dilarutkan dengan pemanasan dan diaduk hingga merata. Sterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC. Kemudian ditambah 25mg kloramfenikol dan dicampur hingga merata, lalu dituang kedalam cawan petri dan biarkan memadat. b. Manitol Salt Agar (MSA) Sebanyak 16,65 gram media disuspensikan dalam 150ml akuades, dipanaskan sampai bahan terlarut. Selanjutnya media disterilisasi
17
menggunakan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Kemudian dituang ke dalam cawan petri steril dan media dibiarkan memadat. 5.
Pengenceran Sampel a. Sampel uji AKK Sampel jamu dipipet secara aseptis sebanyak 1mL dan dimasukkan dalam wadah yang telah berisi 10ml akuades steril sehingga diperoleh pengenceran 10-1. Kemudian dikocok hingga homogen. Selanjutnya dipipet 1ml sampel pengenceran 10 -1, dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi 9ml akuades steril kemudian dikocok hingga homogen sehingga diperoleh pengenceran 10 -2. Pengenceran dibuat hingga pengenceran 10-4. b. Sampel untuk uji cemaran bakteri S.aureus Satu mililiter sampel jamu dilarutkan dalam 10ml akuades steril, dikocok hingga homogen sehingga diperoleh pengenceran 10-1.
6.
Pengujian sampel a. Uji Angka Kapang/Khamir Pengujian cemaran angka kapang/khamir dari sampel jamu gendong dilakukan dengan teknik cawan agar sebar/spread plate method dan dilakukan replikasi duplo. Sebanyak 1ml suspensi hasil pengenceran sampel dituang pada permukaan media PDA dan diratakan dengan spreader glass. Sebagai kontrol digunakan media yang telah ditambah kloramfenikol dan larutan pengencer. Cawan petri selanjutnya diinkubasi pada suhu 250C selama 3. Penghitungan jumlah koloni kapang/khamir
18
yang tumbuh pada media dilakukan sesuai cara perhitungan yang ditetapkan dalam prosedur operasional baku pengujian mikrobiologi oleh Departemen Kesehatan tahun 1992. b. Uji cemaran bakteri S.aureus Pengujian cemaran S.aureus dilakukan dengan sebanyak 1ml suspensi sampel hasil pengenceran dituang pada permukaan media MSA dan diratakan dengan spreader glass. Cawan petri selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Bakteri S.aureus dapat diketahui dengan adanya perubahan warna media dari warna merah menjadi kuning atau jernih. 7.
Analisis Data Menurut peraturan Kepala BPOM RI nomor 12 tahun 2014 tentang persyaratan kualitas obat tradisional bahwa sediaan cairan obat dalam tidak boleh mengandung angka kapang/khamir ≥103koloni/ml dan bakteri S.aureus harus negatif. Apabila jamu yang diuji menunjukkan nilai AKK ≥10 3 koloni/mL dan terdapat cemaran bakteri S. aureus, maka sampel jamu yang diuji tidak memenuhi persyaratan kualitas obat tradisional yang ditetapkan oleh Kepala BPOM RI nomor 12 tahun 2014. Hasil data yang diperoleh kemudian dianalisis sebagai berikut: a. Perhitungan cemaran AKK Perhitungan jumlah koloni cemaran kapang/khamir mengacu pada standar atau peraturan yang ditetapkan oleh Departemen Kesehatan tahun 1992. Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 40-60. Jumlah koloni dari kedua cawan petri dihitung
19
kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya. Bila pada dua cawan pada dua tingkat pengenceran dan berurutan menunjukkan jumlah antara 40-60, maka dihitung jumlah koloni dan dikalikan faktor pengenceran kemudian diambil rata-rata. Angka diambil dinyatakan sebagai angka kapang/khamir dalam tiap gram contoh. Untuk beberapa kemungkinan lain yang berbeda dari pernyataan di atas, maka mengikuti petunjuk berikut: 1) Bila hanya salah satu dari kedua cawan petri dari pengenceran yang sama menunjukkan jumlah koloni antara 40-60 buah, dihitung jumlah koloni dari kedua cawan dan dikalikan dengan faktor pengenceran. 2) Bila pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapat koloni lebih besar dari dua kali jumlah koloni pada pengenceran dibawahnya, maka dipilih tingkat pengenceran terendah. 3) Bila dari seluruh cawan petri tidak ada satu pun yang menunjukkan jumlah antara 40-60 koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat
pengenceran
terendah
dan
dihitung
sebagai
angka
kapang/khamir perkiraan. 4) Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan bukan disebabkan faktor inhibitor, maka angka kapang/khamir dilaporkan sebagai kurang dari satu dikalikan faktor pengenceran. b. Analisis cemaran bakteri S. aureus Analisis dilakukan dengan cara mengamati adanya koloni cembung warna kuning yang menyebabkan media berubah menjadi kuning atau jernih.
