Az emberi májrák komparatív genomikai osztályozása

Az emberi májrák komparatív genomikai osztályozása Doktori értekezés

Dr. Kaposi-Novák Pál Semmelweis Egyetem Patológia Tudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Kiss András, egyetemi docens, Ph.D., az orvostudományok kandidátusa Hivatalos bírálók: Dr. Horváth Gábor, Ph.D. Dr. Mózes Miklós, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:

Prof. Dr. Sótonyi Péter Dr. Lengyel Gabriella, Ph.D. Dr. Simon Károly, Ph.D.

Budapest

2008

1.

Tartalomjegyzék

1.

Tartalomjegyzék

3

2.

Rövidítések jegyzéke

5

3.

Irodalmi áttekintés

8

3.1

A hepatokarcinogenezis molekuláris háttere

8

3.1.1 A primer humán májrák epidemiológiája 8 3.1.2 A krónikus virális infekció patogenetikai szerepe 12 3.1.3 A májrákokban előforduló leggyakoribb genetikai eltérések 15 3.1.4 A májkarcinómák kialakulásában szerepet játszó legfontosabb molekuláris szabályozó mechanizmusok. 22

3.2 3.2.1 3.2.2

3.3

Transzkripciós analízis Az mikroarray alapú expressziós analízis technológiai háttere A mikroarray adatok statisztikai elemzése

32 43

A funkcionális genomika szerepe az emberi májrák patogenezisének

vizsgálatában 3.3.1 3.3.2 3.3.3

32

Génexpressziós analízis krónikus hepatitisben Májkarcinómákban megfigyelt génexpressziós eltérések Komparatív genomikai elemezések

51 52 53 55

4.

Célkitűzések

57

5.

Módszerek

59

5.1 5.1.1 5.1.2 5.1.3

Formalin fixálás RNAlater valamint aceton fixálás Szövettani vizsgálat

59 59 59 60

5.2

Humán hepatocelluláris karcinóma minták

60

5.3

Állatmodellek

60

5.3.1 5.3.2 5.3.3

5.4 5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4

5.5 5.5.1 5.5.2 5.5.3

6.

Humán edometriális minták gyűjtése és feldolgozása

Myc és Myc/Tgfα transzgénikus egérmodellek A c-Met kondicionális knock-out állatmodell létrehozása Egér primer májsejtek izolálása és kezelése sejtkultúrában

Egyéb kísérleti módszerek Lézer mikrodisszekció Immunhisztokémiai festések Valós idejű kvantitatív RT-PCR analízis Lineáris RNS amplifikáció

Mikroarray alapú transzkripciós analízis Felhasznált mikroarray platformok RNS minták jelölése és a mikroarrayk hibridizációja Expressziós adatok statisztikai elemzése

Eredmények 6.1

60 61 62

64 64 65 66 68

69 69 69 70

73

A kinyerhető RNS és a szöveti morfológia integritásának vizsgálata fixált

paraffinba ágyazott patológiai mintákban

73

6.2 Új két körös lineáris RNS amplifikációs eljárás kifejlesztése szensze szálú RNS minták szintézisére 6.3

76

T7T3 amplifikáció alkalmazása lézer mikrodisszektált minták expressziós

analízisére

79

6.4

79

A HGF/c-Met célgének azonosítása primer egér hepatocytákban

6.4.1 6.4.2

6.5

A humán HCC minták komparatív genomikai elemzése

6.5.1 6.5.2 6.5.2

7.

A c-Met útvonal aktivációjának szerepe a sejt motilitás szabályozásában A c-Met útvonal szerepe a sejten belüli oxidativ homeosztázis szabályozásban

A c-Met expressziós mintázat azonosítása humán májkarcinómákban A c-Met aktivált expressziós mintázat összefüggése a tumor fenotípussal A c-Met indukált expressziós mintázaton alapuló prognosztikai modell létrehozása

Megbeszélés

86 86 89 92

96

7.1

A rutin szöveti fixáció hatása a patológiai minták molekuláris analizisére

7.2

A T7T3 lineáris RNS amplifikáció alkalmazása a hepatikus léziók

transzkripciós elemzésére 7.3

84 86

96

98

A c-MET útvonal által aktivált génexpressziós mintázat felhasználása a

májtumorok molekuláris klasszifikációjára

100

8.

Megállapítások

104

9.

Conclusions

106

10.

Összefoglalás

108

11.

Summary

110

12.

Táblázatok és ábrák jegyzéke

112

12.1

Táblázatok jegyzéke

112

12.2

Ábrák jegyzéke

112

13.

Irodalomjegyzék

113

14.

Saját publikációk jegyzéke

136

14.1

A disszertációhoz kapcsolódó saját közlemények.

136

14.2

A disszertációtól független saját közlemények.

137

15.

Köszönetnyilvánítás

16.

Melléklet

138 Hiba! A könyvjelző nem létezik.

2.

Rövidítések jegyzéke

µPA

urokináz plazminogén aktivátor

AFP

alfa foetoprotein

APC

adenomatoid polipózis fehérje

bp

bázispár

CDK

cyclin-dependens kináz

cDNS

komplementer dezoxribonukleinsav

CGH

komparativ genomikus hibridizáció

CsCl

cézium klorid

CT

detekciós küszöb

DENA

dietil-nitrózamin

DMD

digitális mikrotükör

DTT

ditiothreitol

E2F

retinoblasztoma asszociált transzkripciós faktor

EGF

epidremális növekedési faktor

EGFR

epidremális növekedési faktor receptor

ERK

extra celluláris szignál aktivált kináz

EST

átiródó jelölő szekvencia (expresszed sequence tag)

FRA

fragilis genomi lokusz

GSK3b

glikogén szintáz kináz

HBsAg

hepatits B surface antigén

HBV

hepatitis B virus

HCC

hepatocelluláris karcinóma

HCV

hepatits C virus

HGF

hepatocita növekedési faktor

hTERT

humán telomeráz reverze transzkriptáz

IFN

interferon

IGF

inzulin szerű növekedési faktor

IGFR

inzulin szerű növekedési faktor receptor

IRS-1

inzulin receptor szubsztrát

KO

génkitütött

LDA

lineáris diszkriminátor analizis

LOH

loss of heterozygosity, allélvesztés

LOOCV

hagyj ki egyet keresztvalidálás (leave-one-out crossvalidation)

MAPK

mitogen aktivált kináz

MDS

több dimenziós arányositás

MEK

mitogén aktivált kináz kináz

MIAMI

a mikroarray kisérletek közléséhez szüksége minimális információ

MLH1

DNS mismatch repair fehérje

MM

bázispár eltérést mutató (mismatch - nukleotid próba)

MVD

mikrovaszkuláris denzitás

NAFLD

nem alkoholos zsirmáj

NASH

nem alkoholos steatohepatitis

NC

legközelebbi centroid

NCBI

nemzeti biotechnologiai információs közpönt (National Center for Biotechnology Information)

NN1

legközelebbi szomszéd 1

NN3

legközelebbi szomszéd 3

PCR

polimeráz láncreakció

PDGF

vérlemezkéből származó növekedési faktor

PM

tökéletesen egyező (perfect match - nukleotid próba)

RARb

retinoic receptor béta

Rb

retinoblasztoma fehérje

RNS

ribonkelinsav

RT-PCR

komplementer átirásos polimeráz láncreakció

SAGE

a génexpresszió szeriális elemzése (serial snalysis of gene expression)

SNP

egy nukleotidot érintő polimorfizmus

SOM

önszerveződő térkép (self-organizing map)

SSC

nátrium citrát

SVM

support vector machine

TCF

T-sejt faktor

TGFa

transzformáló növekedési faktor alfa

TGFb

transzformáló növekedési faktor béta

THRA

thyroid hormon receptor alfa

THRB

thyroid hormon receptor beta

TIMP

szöveti metalloproteináz gátló

Tm

olvadáspont

TNFa

tumor nekrózis faktor alfa

VEGF

vaszkuláris endoteliális növekedési faktor

WHV

mormota hepatitis virus

Wnt

wingless-type MMTV integration family

WT

vad genotipusú

ΔCT

detekciós küszöb vátozás

3.

3.1

3.1.1

Irodalmi áttekintés

A hepatokarcinogenezis molekuláris háttere

A primer humán májrák epidemiológiája Az emberi máj májsejt eredetű daganatos megbetegedése a primer

hepatocelluláris karcinóma, avagy májrák előfordulását tekintve az ötödik leggyakoribb rosszindulatú daganatos betegség a világon (1). Átlagos éves incidenciája 5.5 – 14.9 eset per 100,000 lakos között változik (2). A májrák évente több mint 500,000 ember halálát okozza, ezzel a harmadik a legrosszindulatúbb daganatféleség a szolid tumorok közül, és egyben a májban előforduló tumorok 85%át teszi ki (3). A májrák kialakulásához vezető legfontosabb rizikófaktorok viszonylag jól ismertek. A daganat kialakulását szinte minden egyes esetben (>80%-ban) több évtizedes krónikus májgyulladás előzi meg, aminek hátterében leggyakrabban virális vagy alkoholos etiológia található (4). A krónikus gyulladás a májsejtek kismértékű, de állandó pusztulását eredményezi, ami a fennmaradó sejtekben folytonos regeneratív sejtosztódást stimulál. Ezekben, a betegekben az állandósult sejtosztódás során felhalmozódó genetikai eltérések, illetve az egyes etiológiai faktorok a későbbiekben részletezett direkt karcinogenetikus hatásai együttesen vezetnek a májrák kialakulásának megnövekedett kockázatához (5). A májrák már napjainkban is a cirrhotikus betegek leggyakoribb haláloka Európában. A májrákok 60-80%-a fejlődik ki cirrhosis talaján. A májcirrhózisban szenvedő betegekben a májrák kialakulásának kockázata évente 1-5%-kal nő. Könnyen érthető tehát, hogy a májrák előfordulásának földrajzi eloszlása szinte teljes mértékben tükrözi a leggyakoribb virális etiológiai faktorok előfordulási gyakoriságát. Jelenleg a világon a legtöbb HCC esetet (100 eset per 100,000 lakos) az ázsiai országokban (Kína, Taiwan stb.) diagnosztizálják (2). Ebben a térségben a krónikus hepatitis B vírusfertőzés áll a legtöbb daganatos megbetegedés (40-90%) hátterében. Krónikus HBV hepatitisben szenvedő betegekben a májrák kialakulásának kockázata százszor akkora, mint az egészséges kontrol populációban (6). Krónikus HBV hordozókban a májrák kumulatív gyakorisága 0,5% évente, míg azokban a betegekben, ahol egyidejűleg cirrhozis is jelen van, ez az érték eléri a 2,5 %-ot. A

krónikus hepatitis B fertőzésben szenvedő betegek esélye, hogy májrákban fognak elhalálozni 10-25% százalék között mozog. A HBV fertőzés etiológia szerepének további bizonyítéka, hogy az újszülött korban általánosan megkezdett HBV vakcináció igen hatékonyan csökkentette a korai hepatitis B fertőzés, és ez által a májrák előfordulási gyakoriságát. A taiwani, szingapúri, kínai stb. nemzeti HBV immunizációs programok tapasztalatai megerősítették, hogy e stratégiát követve a HBV hordozók arányának 15%-ról 1%-ra való leesése együtt járt a HCC prevalencia 60%-os csökkenésével (7). Biztató eredmény, hogy egyes beszámolók szerint a HBV fertőzés esetén alkalmazott interferon kezelés is szignifikánsan csökkentette a HCC incidenciát és növelte a betegek túlélését (8). A krónikus hepatitis B fertőzést követően a májrák kialakulása átlagosan 20-50 évet vesz igénybe, ami lehetőséget ad a betegek monitorozására és a korai detekciójára is (9). Ugyancsak a magas hepatitis B vírus fertőzöttségi ráta, valamint az aflatoxin B1 kontaminált élelmiszerek fogyasztása áll a magas májrák előfordulási gyakoriság hátterében a szub-szaharai Afrikában (10). Az aflatoxin B1 az Aspergillus flavus penész gomba toxinja. Elsősorban a meleg és nyirkos körülmények között tárolt élelmiszereken, mint rizs vagy kukorica a gomba elszaporodása miatt az AFB1 nagy mennyiségben fordulhat elő. Az AFB1 kontaminált élelmiszer fogyasztása bizonyitottan növeli a HCC kialakulásának kockázatát (11). Bár az endémiás területeken, mint például a szub-szaharai Afrika, a betegek többségében az AFB1 toxin fogyasztás és a HBV fertőzés együttesen vannak jelen (12). A HCV fertőzés epidemiológiája ugyan kevésbé ismert, de a HCC kialakulásának arányát itt is 2 és 7 % közé tehetjük (13). Nyugat-Európában és ÉszakAmerikában a májrák előfordulása hagyományosan alacsonyabb, mint a világ többi részén. Ezekben, az országokban a hepatitis C vírus fertőzés valamint az alkoholos májbetegség található a legtöbb megbetegedés hátterében. Szintén a krónikus HCV fertőzésnek tulajdonítható a Japánban és Egyiptomban detektált HCC esetek túlnyomó többsége is (1). Amíg azonban az ázsiai országokban a fiatal, nem cirrhotikus HCC betegek aránya elérheti a 40%-ot is, a fejlettebb régiókban az érintettek nagy része idősebb és cirrhotikus. Epidemiológiai adatok szerint, amíg a májrák gyakorisága Ázsiában és Afrikában helyenként stagnál, vagy csökken, a nyugati országokban növekedése volt kimutatható. Az utóbbi két évtizedben, Japánban 15-20%-kal nőtt, az Egyesült Államokban pedig majdnem megduplázódott a májrák incidenciája (3). A drámai növekedés hátterében első sorban a HCV vírus

fertőzés előretörése áll. Korábbi kutatásokból jól ismert, hogy a HCV vírus járvány csúcspontja, amikor a legtöbb új HCV fertőzés történt, az 1980-as évek elejére tehető (14). Figyelembe véve, hogy a HCC kumulatív gyakorisága HCV asszociált cirrhozisban 2-8% között mozog évente valamint, hogy az esetek nagy többségében a HCV vírusfertőzés két-három évtizeddel előzi meg a tumor kialakulását, a májrák növekedési tendenciája tovább folytatódik az elkövetkező években (15). A májrákos esetek csak mintegy 29%-ában nem lehetett valamely vírus jelenlétét kimutatni. A rendszeres, nagy mennyiségű, 50-70 g/nap alkohol fogyasztás szintén a HCC egyik fontos rizikó faktora. Az alkohol májkárosító hatása a HBV és HCV vírusokkal szinergisztikus (16). Természtesen mint a májcirrhózis leggyakoribb etiológiai faktora, az alkohol abuzus elősegíti a májrák kialakulását. A nem virális eredetű májcirrózis hátterében gyakran a nem alkoholos eredetű faktorok is szerepet játszanak. A kóros elhízás járványszerű terjedése és az ennek következtében kialakuló nem alkoholos szteatohepatitis pedig egy újabb rizikófaktor feltűnését jelenti. A zsírmáj (hepatosteatosis) és a következtében fellépő májgyulladás (steatohepatitis) elfordulásának drámai növekedése a nyugati populációkban szorosan kapcsolódik a HCC esetek számának növekedéséhez, bár a direkt ok-okozati összefüggés kimutatása még várat magára. A krónikus steatohepatitis, az egyéb cirrhotikus elváltozásokhoz hasonlóan májsejt pusztulást és regeneratív proliferációt eredményez ugyan de az NASH alapján kifejlődő májrákokban a malignus transzformáció molekuláris mechanizmusa még nem tisztázott. Mindenesetre a cukorbetegség önmagában is a májrák független kockázati tényezői közé tartozik (17). A HCC betegek igen magas halálozási arányát elsősorban a daganat terápiás próbálkozásokkal szembeni rezisztenciája okozza. A májrákos betegek terápiás válasz hiányában bekövetkező 5 éves átlagos túlélése, 5% alatt marad, bár az utóbbi évtizedben valamelyes javulást mutat. A HCC betegeknek csak a legkorábbi stádiumban diagnosztizált viszonylag kis hányada (20%-30%) bizonyul alkalmasnak valamely agresszív sebészi kezelésre, amilyen a májtranszplantáció, a májrezekció, vagy az alkohol abláció (18). A sebészi kezelés mai tudásunk szerint az egyetlen, ami potenciálisan kuratív lehet. Ezeknek, a betegeknek az ötéves túlélése az átlagosnál lényegesen jobb 55-75% (19). A végstádiumban diagnosztizált betegek aránya 30% körül mozog és ezek a palliáción kívül nem részesülnek egyéb kezelésben. Reményt kelthet, hogy a Raf és más kinázokat gátló sorafenib a fázis III klinikai kisérletek

során jelentősen javitotta az előrehaladott stádiumú májákos betegek tünetmentes túlélését (20). A köztes stádiumban lévő, klinikai terápiában részesülő betegek csoportja (50%) azonban korántsem homogén. Llovet és tsai. 102 sebészileg nem kezelt cirrhotikus HCC betegen elemezték a betegség természetes lefolyását és a független prognosztikai szignifikanciával bíró faktorok eloszlását (21). Eredményeik alapján a HCC betegeket, prognózisuk, alapján legalább két alcsoportra oszthatjuk. A klinikai tüneteket nem mutató (stage 0) betegek 1, 2 és 3 éves túlélése -80%, 65%, és 50%- lényegesen jobb volt, mint a legalább egy klinikai tünettel (konstitucionális szindróma, vaszkuláris invázió, extrahepatikus szóródás) bíró „stage 1” csoportban látott 29%, 16%, és 8% (Ábra 1).

Ábra 1: A májkarcinómák természetes túlélése. Az HCC betegek kezelés néküli természetes túlélése a betegség különböző stádiumaiban. Llovet és Bruix alapján (21).

3.1.2

A krónikus virális infekció patogenetikai szerepe Mint azt az előzőekben említettük a krónikus hepatitis B és C vírus fertőzés a

májrák kialakulásának legfontosabb etiológiai faktora (4). Ezért szükséges patológiai hatásuk részletesebb ismertetése. A hepatokarcinogenezis folyamatának megértéséhez szükséges annak megfejtése, hogy a virális infekció mely elemei vezetnek karcinóma képződéshez, és mely ponton válik a tumorgenezis folyamata függetlenné a virális faktoroktól. 3.1.2.1

Hepatitis B virus

A világon a krónikus HBV fertőzöttek számát 350 millió főre becsülik, és ez által a hepatitis B a világ leggyakoribb vírusfertőzései közé tartozik. A hepatitis B vírusfertőzés a májrák kialakulásának legfontosabb oka világszerte, és 250 ezer új HCC esetet okoz évente. Összességében a HBV fertőzést a HCC esetek 80%-ában lehet kimutatni (4). A krónikusan HBV szeropozitív betegek között a májrák kialakulásának kockázata százszoros az átlag populációhoz viszonyítva. Ezen betegek mintegy 10-25%-a hal meg HCC következtében. A krónikus HBV fertőzés szövődményei közül elsődlegesen a cirrhozis az, amely a HCC kialakulását leginkább elősegíti, de a vírus direkt karcinogén hatása is egyértelmű bizonyítást nyert (22). A hepatitis B vírus a hepadnaviridae vírusok családjába tartozó, részlegesen kettős szálú DNS vírus. A replikáció során, a genomiális DNS teljes hosszában RNSre íródik át, ezért a HBV-t „para-retrovirusnak” is nevezik (4). A virális DNS a fertőzés során a gazda sejt genetikai állományába beépülve replikálódik (23). A virális DNS a replikáció során, a két végén túlnyúló „nick” és repetitiv szakaszokat tartalmaz, amelyek elősegítik a gazdaszervezet DNS-ébe történő integrálódást. Minél magasabb kópiaszámban történik a beépülés, annál nagyobb az onkogenikus genetikai hibák kialakulásának valószínűsége (6). Sokáig úgy tűnt, hogy a genomikus integráció helye nem rögzített, random eloszlást mutat (24). Mára azonban egyértelművé vált, hogy a humán genom egyes fragilis régióiban (FRA) a vírus beépülésének valószínűsége lényegesen magasabb, mint a genom többi részén. Ilyen például, az 1q36 szakaszon található FRA1A lokusz, ahol HBV DNS beépülése genetikai instabilitást eredményez (6). A HBV integrációja a FRA5E régióban a hTETRT (25), az FRA5C szakaszon pedig a PDGFR gén

trasznaktivációját eredményezheti, amelyek egyaránt tumor promóter hatással rendelkeznek (26). A HBV DNS az integrációs hely közelében a virális gének átíródását szabályozó promóter szakaszok, mint az X promóter/enchancer és a preS/S egyes humán gének közelébe kerülhetnek (27). Így, a virális DNS integrációja egyes onkogének és tumor szupresszor gének szabályozását a promóter régió cisz aktivációján keresztül, vagy a hibrid fehérjék kialakulása révén is vezethet HCC kialakulásához (28). A sejtciklus szabályozó cyclin A2 génnel alkotott HBV fúziós fehérje például, nélkülözi azt a szakaszt, ami normális körülmények között a fehérje degradációját szabályozza. A RARβ-val alkotott fúzió során, pedig elveszik a transzkripciós faktor sejtosztódást gátló hatása (27). A HBV-vel rokon WHV vírus integrációja állatmodellben például, az N-myc onkogén aktivációján keresztül vezet májtumorok kialakulásához (29). A HBV genom többek között reverz transzkriptáz/DNS polimeráz (pol), kapszid (core), L M és S burok (env), és pontosan nem ismert funkciójú (HBx és HBe) fehérjéket kódol. Az egyik legtöbbet vizsgált virális fehérje a 154 aminosavból álló HBV X antigénen. A HBxAg olyan direkt transz-aktivációs hatással bír, amelynek szerepe lehet a májsejtek és malignus transzformációjában (30). Krónikus fertőzés esetén a HBxAg a gazdasejtek genomjába integrálódva mind a májtumorokban mind a környező májban expresszálódhat (31). Transzgenikus egerekben a HBxAg fehérje túltermeltetése a májban előbb diszplasztikus sejtcsoportok, majd májkarcinómák, kifejlődését eredményezte (32). A HBxAg túltermelése többféle módon is hozzájárulhat a májkarcinómák kifejlődéséhez (33). Egyfelől stimulálja a NF-κB (34), AP-1, AP-2 (35), JAK/STAT (36), PI3K/Akt (37), Ras/Raf/MAPK (38) valamint a Wnt (39) intracelluláris jelátviteli útvonalakat, másrészt direkt módon kötődik az ATF-2, CREB (40), Oct-1 (41), p53 (42), bZip (43) és más bázikus transzkripciós faktorokhoz. A HBxAg, ezen felül, gátolja a p21WAF1/SDI1/CIP1 (22) és p53 (44) sejtciklus szabályozó gének átíródását, leblokkolja a senescence reguláló p55sen (45) faktort, és elősegíti az Rb tumor szupresszor foszforilációját. A HBxAg expressziója a HCC-ben genetikai instabilitást is okoz. A HBxAg részben az UV-DDB fehérje megkötése, részben a p53 inaktivációja által blokkolja a DNS hibajavító mechanizmusokat (46). A HBxAg ugyancsak lenyomja az XBP és XPD fehérjék kifejeződését. Ez, extranumerális centroszómák és multi-poláris

mitotikus orsók kialakulását eredményezi (47). A Crm1 nukleáris transzporter szekvesztrációja az NfκB és mdm2 fehérjék sejtmagban történő felhalmozódásán keresztül vezet sejtosztódáshoz (48). A HBxAg emellett képes a metilációs mintázat megváltoztatására

is.

Az

E-cadherin

transzkripcióját

például,

a

promóter

hipermetilációján keresztül gátolja (49). A HBxAg mellet a HBV egyéb virális fehérjéi is rendelkeznek direkt vagy indirekt onkogenikus hatással. A HBV L burok fehérjét túltermelő transzgenikus egerekben májkarcinómák fejlődtek ki (50). A feltételezett patomechanizmus alapján, az L fehérje citotoxikus hatása, és az ezt követő regeneratív proliferáció ismétlődése önmagában is elégséges a tumorképződés beindításához. Az L és M burokfehérjék emellett, a citoplazmában felhalmozódva, oxidativ és metabolikus stresszt okoznak, ami direkt mutagén hatású lehet (51). 3.1.2.2

Hepatitis C virus

A krónikus hepatitis C vírus fertőzés a nyugati országokban és Japánban is a májrák kialakulásának egyik legjelentősebb kockázati tényezője (52). Az egész világot tekintve, a 170 millió HCV szeropozitív emberből mintegy 132 millió szenved krónikus fertőzésben. A HCC kialakulásának esélye HCV hordozók estében 17szeresére emelkedik, és májrák végül a betegek 2-7%-ban fejlődik ki. Az Európában észlelt HCC esetek 26-76%-ának, és a Japánban esetek 80-90% hátterében a hepatitis C fertőzés áll (53). A hepatitis C vírus a flaviviridae RNS vírusok családjába tartozik. Mivel, nem tartalmaz reverz transzkriptáz enzimet, ellentétben a hepatitis B vírussal, nem integrálódik a megfertőzött sejt genetikai állományába. A HCV RNS genomról átíródó poliproteinből a virális proteázok (NS2-NS3) hasítják ki különböző virális antigéneket (core, E1-E2, P7, NS2-NS3, NS4a –b, NS5a –b) (54). A HCV virion szaporodása a májrákokban is kimutatható (55). A virális genom replikációja

során

a

genetikai

hibák

előfordulása

magas,

aminek

eredményeként a vírus egyszerre különböző variánsok formájában van jelen. E variánsok között a gazdaszervezet immunválaszával szemben rezisztens típusok szelekciós előnyt élveznek, és hozzájárulnak a permanens infekció és egyben a májsejtpusztulás

fenntartásához.

Az

immunválasz

és

az

endoplazmatikus

retikulumban (ER) végbemnő virális replikáció során jelentős metabolikus stressz lép fel. Ez kezdetben gátolja a fehérje szintézist, és végső esetben a caspase 12

aktivációján keresztül sejthalálhoz is vezethet. Az ER stressz és a hozzá társult oxidatív stressz a JUNK/p38 kináz útvonal aktiválása által, részben pedig direkt genotoxikus hatás révén is malignus transzformációt eredményezhet (56). A HCV vírus által kódolt fehérjék némelyike direkt karcinogén hatással is rendelkezik.

Transzgénikus egerekben a HCV core antigén túltermelése először

májadenómák, később májkarcinómák kialakulásához vezetett (57). A core fehérje képes számos gén, közöttük a c-myc onkogén, expresszióját aktiválni, és így kóros sejtproliferációt eredményez. A HCV core aktiválja az anti-apoptótikus Nf-κB transzkripciós faktort. A HCV core a programozott sejthalált emellett, a TNFα receptorral történő interakció útján is gátolja. Ez a megfertőzött sejtek túlélését eredményezi, és elősegíti a krónikus fertőzés kialakulását (58). A HCV NS5a fehérje direkt onkogenikus hatását a gazdasejt génexpressziós profiljának megváltoztatása réven fejti ki (59). Az NS5a NIH 3T3 sejtekben gátolja az interferon által indukált anti-virális választ, és a kétszálú RNS molekulák kiváltotta apoptózist (60). Az NS3 és NS5a nem strukturális fehérjék túltermelése fibroblaszt sejtekben elősegítette a letapadás nélküli sejtosztódást, valamint hozzájárult az immunszupresszált „nude” egerekben történő tumorok kialakulásához is (59). A teljes HCV transzkriptum HepG2 sejtekben történő stabil transzfekciója pedig, serkenti a sejtosztódást és a sejtek túlélését (61). Mindezek alapján feltételezhetjük, hogy a HCV, legalább is részben, az onkogenikus útvonalak direkt aktivációja révén fejti ki karcinogén hatását.

3.1.3

A májrákokban előforduló leggyakoribb genetikai eltérések Jól ismert, hogy a malignus tumorok kialakulásának hátterében a

sejtproliferációt és a sejthalált szabályozó géneket érintő genetikai elváltozások szekvenciális felhalmozódása áll. Vogelstein és tsai. kutatásai nyomán azt is tudjuk, hogy a teljes malignus konverzióhoz minimálisan négy szabályozó gén defektusa szükséges (62). Ennek megfelelően a tumorok kialakulását gyakran hosszú lappangási idő és különféle stádiumú pre-neoplasztikus elváltozások előzik meg. A hepatocelluláris karcinómák és előzményeik genetikai hátterének részletesebb vizsgálatát a 90-es években bevezetett mikroszatelita PCR (MSA) és komparatív hibridizációs (CGH) technikák tették lehetővé. Napjainkban az SNP genotipizáló és

CGH mikroarrayk által elérhetővé vált, hogy a teljes genomot egy időben, nagy felbontással vizsgálhassuk (63). A hepatocelluláris karcinóma kialakulását egy olyan, egymásra épülő szakaszokból álló, folyamatként foghatjuk fel, ahol a különféle genetikai és epigenetikai elváltozások lépésről lépésre történő felhalmozódása vezet először a tumorok kialakulásához, és azok disszeminációjához (Ábra 2). Ezt a folyamatot morfológiailag is jól reprezentálja, hogy a korai diszplasztikus sejtekből álló fókuszok és atípusos nodulusok egy része előbb korai, majd érett hepatocelluláris karcinómává alakul át (64). A malignitásba történő transzformáció közvetlenül is tetten érhető a nodulus a nodulusban jelenség kapcsán. Ilyenkor az addigi pre-neoplasztikus elváltozásban egy újabb, immár malignus klón felszaporodása figyelhető meg. A már a diszplasztikus léziókban is megnövekedett sejtproliferáció és genomikus instabilitás- elősegíti a genetikai eltérések további felhalmozódását, lépésről lépésre fokozva a májrák kialakulásának kockázatát. Mind a hepatocelluláris karcinómákban, mind annak prekurzoraiban számos onkogén és tumor szupresszor gén elváltozását írták már le (65). Nem mindig sikerül viszont különbséget tenni az elsődleges tumorgenikus és a másodlagos genetikai instabilitással együtt járó, genetikai hibák között. Mégis megfigyelhető, hogy Wnt/β-catenin, a p53, a cyclin D1, a Ras, c-myc, PEG, SOCS-1 és PTEN útvonalak eltéréseit a HCC progressziójával, az oszteopontin (SPP1), ARHC-t, KAI1-et, és az MMP14-et érintő genetikus aberrációkat a tumorok disszeminációjával és az áttétek képződésével hozzák elsősorban összefüggésbe. A VEGF, angiopoetin-2 és más az extracelluláris mátrix átépítésében involvált fehérjék túltermelése pedig a tumorok vaszkularizációját fokozza (1).

Ábra 2: Genetikai eltérések fokozódó frekvenciája a HCC progressziója során. A telomeráz expressziós, promóter metiláció, mikroszatelita instabilitás és allélvesztés gyakoriságának lineáris növekedését demonstrálja a hepatokarcinogenezis egymást követő stádiumaiban. Thorgeirsson és Grisham alapján (65). 3.1.3.1

Allélikus egyensúlyvesztés és mikroszatelita instabilitás

A genomban univerzálisan megtalálható, rövid tandemismétlődő, 2-6 bp hosszúságú szakaszokat mikroszatelitáknak nevezzük. Előfordulásuk és hosszúságuk az egyének között jelentős polimorfizmust mutat, ezért alkalmasak az individuális allélek nagy felbontással történő megkülönböztetésére. Az egyes kromoszómák átlagosan mintegy 10000-15000 egyedi mikroszatelita markert tartalmaznak (66). A polimorf ismétlődő szakaszok lokalizációja pontosan ismert és az emberek többsége az anyai és apai kromoszómákon eltérő hosszúságú markereket hordoz. Az LOH analízis során tehát, az allélvesztés helye nagy pontossággal meghatározható. A legújabb technikák az SNP polimorfizmusok hibridizáción alapuló detektálását felhasználják fel az LOH és más allélszám változással járó genetikai eltérések detektálására (63). Nagai és tsai. 120, ázsiai és európai betegeket egyaránt tartalmazó HCC mintán végeztek nagy felbontású mikroszatelita elemzést 195 polimorf marker felhasználásával (67). Az LOH által leggyakrabban érintett kromoszóma szakaszok a

8p23, 4q22-24, 4q35, 17p13, 16q23-24, 6q27, 1p36 és 9p12-14 régiókban helyezkedtek el. Az LOH eloszlás nem mutatott összefüggést sem a virális etiológiával, sem a virális integráció helyével, sem más klinikai változóval. A preneoplasztikus elváltozásokban valamint a kisméretű, jól differenciált HCC-kben az 1p és 1q régiókban, míg az előrehaladott, metasztatikus tumorokban a 16p és 17p szakaszokon volt LOH gyakrabban kimutatható. Sheu és tsai. 34, HBV és HCV fertőzés alapján kialakult májrákban vizsgálták az LOH előfordulását. Ebben a tanulmányban a 16q, 13q, 17p, 5q, 11p és 9p lokuszok mutattak leggyakrabban eltérést (68). A csekély mértékben eltérő eredmények hátterében a HBsAg pozitív betegek eltérő száma is állhat. A HBsAg jelenléte szignifikáns összefüggést mutat az általánosan magas LOH gyakorisággal és a 16q régióban bekövetkező specifikus allélvesztéssel. Egyes tanulmányok szerint a p53 mutáció esetén a 4q kromoszóma kar elváltozása lép fel gyakrabban. Ezen esetek döntő többsége a kínai Qidong tartományból került közlésre, és valószínűleg az aflatoxin B1 expozíció is szerepet játszik ennek az egyedi mintázatnak a kialakulásában (5). Az 1p, 4q, 8p, 13q, 16q, és 17p szakaszokon, elsősorban az előrehaladott tumorokban megfigyelt allélikus instabilitás, rosszabb prognózist és magasabb kiújulási gyakoriságot eredményez (10). Primer és metasztatikus tumorok összehasonlítása során pedig a 8p LOH csak a metasztatikus elváltozásokban volt kimutatható (69). Régóta vitatott kérdés, hogy a HBV DNS genomikus integrációjának milyen szerepe lehet a kromoszómális instabilitás kialakulásában. A HBV DNS transzfektált HepG2 sejtekben, csakúgy, mint a fertőzött betegekből származó fehérvérsejtekben a genomikus elváltozások száma megemelkedik (47). Laurent-Puig és tsai. 137 májkarcinómában vizsgálták a mikroszatelita instabilitást, a β-catenin és az axin mutáció előfordulását (70). Adataik alapján, a májkarcinómákon belül két jellegzetes csoportot sikerült azonosítani: amíg a genomikus instabilitást mutató tumorok általában nagyobb méretűek és HBV pozitívak voltak, addig a β-catenin mutáció elsősorban a jobban differenciált, kevesebb genetikus eltérést tartalmazó, HBV negatív tumorokra volt jellemző. 3.1.3.2

Kromoszóma szám változással járó elváltozások

Hepatocelluláris karcinómákban a kromoszómális instabilitás gyakori allélvesztéshez és aneuploidiához vezet. A leggyakrabban érintett gének tumor

szupresszor funkcióval rendelkeznek és az allélvesztés epigenetikai modifikációk, vagy mutáció révén biallélikus inaktivációt eredményez. Ezeket, a genetikai eltéréseket komparatív hibridizációval, valamint a teljes genomra kiterjedő alléltipizálással vizsgálhatjuk. A komparatív hibridizációs kísérletek alapján a májkarcinómákban kromoszómális amplifikációk az 1q (55%), 6p (22%) 8q (45%), és 17q, míg deléciók a 1p, 4q (33%), 8p (36%), 9p, 13q, 16q (35%) és 17p (31%) szakaszokon fordulnak elő a leggyakrabban (10). A tumorsejtek között fellépő pozitív szelekciós hatás alapján feltételezhető, hogy az amplifikációt mutató szakaszok lényeges onkogéneket, a delécióra hajlamos szakaszok ezzel szemben tumor szupresszor géneket kódolnak. Ezzel összhangban áll, hogy a leggyakrabban érintett régiók közül a 17p, a p53, a 13q az Rb1-et, a 9p, a p16, a 6q pedig az IGF2R tumor szupresszor géneket tartalmazzák (71). Az LOH események előfordulása a májrákot megelőző alacsony és magas grade-et mutató pre-neoplasztikus elváltozásokban is meghaladja az 50, illetve a 80%-ot (65, 72). A 8q22-24 és az 1q21-23 régiók amplifikációja a humán HCC-kben észlelt legkorábbi elváltozások közé tartozik. Ez azért is érdekes mert, a 8q24 lokusz tartalmazza egyben a c-Myc onkogént (73). A HCC-k mikroarray alapú CGH elemzése során a 7q22-36, 8p11-24, 9p, 10p 10q, 12p11-q13, és 19p12 régiók nagyfokú genetikai instabilitást mutattak. Ezen szakaszok deléciója, vagy amplifikációja az összes vizsgált karcinómában kimutatható volt (74). Fontos megjegyeznünk, hogy az egyes kromoszóma karok genomi dózisának növekedése szinte minden esetben együtt járt az ellentétes kar elvesztésével, azaz izokromoszóma képződést jelentett. Ebben a konstellációban pedig nehéz eldönteni, hogy a kópia szám változásának biológiai jelentőség egy onkogén megnövekedésétől vagy egy tumor szupresszor gén deléciójától függ-e jobban. Ahogy azt a 1-es számú táblázatban (Táblázat 1) is összegeztük, 187 HCC CGH analízise alapján a leggyakoribb amplifikációt az 1q, 8q, és 17q, illetve deléciókat a 4q, 8p, 13q, 16q és 17p szakaszok mutatták (5). A HBV és a HCV fertőzéssel társult tumorok összehasonlítása azt mutatta, hogy a 10q régió kópia számának növekedése a HCV, míg a 11q régióé a HBV pozitív májkarcinómákra jellemző (22). A 8q kar amplifikációját elsősorban jól differenciált tumorokban figyelték meg. Ezzel szemben 11q13 amplifikáció és a 13q13-14 kópiavesztés a rosszul differenciált, a 4q11-23 deléció a nagyméretű tumorokban volt gyakoribb (73). A kromoszómális instabilitás molekuláris háttere a májrákok estében még nem teljesen ismert. Jól tudott, hogy a mismatch hibajavító enzimek (hMLH1, hMSH2)

hiánya tápcsatorna eredetű tumorokban mikroszatelita instabilitást eredményez. A HCC-k estén azonban e gének nem mutatnak gyakori eltérést, expressziójuk megtartott volt. Valószínű tehát, hogy a májrákokban betöltött szerepük csekély (75).

Mikroszatelita elemzés

CGH

allélvesztés (%)

amplifikáció (+) és deléció (-) előfordulása (%)

Kromoszóma régió

Vegyes

Franciaország

1p

26

44

Taiwan

Kína (Qiudong)

Japán

Vegyes

Japán (HCV)

46

31

(-) 30

(-) 37

(+) 58

1q 2q

29

4q

40

42

50

21

Japán (HCV + HBV)

Kína

Taiwan

(+) 46

(+) 78

(+) 72

(+) 20

(-) 70

(-) 48

(-) 32

(-) 32

(-) 15

(+) 33

(+) 20

(-) 37

(-) 23

26

5q

(-) 35

6p 6q

36

35

8p

42

60

18

8q 9p

21

10q

24

30

(-) 65

(-) 28

(-) 29

(-) 37

(-) 15

(+) 60

(+) 31

(+) 66

(+) 48

(+) 30

20 (-) 17 23

11p

(+) 15

11q 13q

32

29

16p

22

40

16q

28

17p

33

17q

(+) 20

32

38

18

(-) 37

(-) 20

(-) 37

(-) 37

(-) 20

39

47

42

26

(-) 54

(-) 33

(-) 46

(-) 30

(-) 43

48

32

70

17

(-) 51

(-) 37

(-) 51

(+) 33

(+) 43

(-) 20 (+) 30 (+) 37

20q

Táblázat 1: A májrákokban előforduló leggyakoribb LOH és kromoszóma eltérések. Az LOH és kromoszóma eltérések gyakorisága virális etiológiájú HCC-kben. Buendia alapján (5).

(+) 18

3.1.4

A májkarcinómák kialakulásában szerepet játszó legfontosabb molekuláris szabályozó mechanizmusok.

3.1.4.1 A

p53

p53 fehérje

funkciója

elengedhetetlen

a

humán

genom

integritásának

fenntartásához, ezért gyakran a „genom őreként” is nevezik. A p53 tumor szupresszor hatását azáltal fejti ki, hogy részt vesz a DNS hibák kijavításában, és visszafordíthatatlan károsodás esetén aktiválja az apoptotikus programot. A p53 mutációja humán tumorokban az egyik leggyakrabban előforduló onkogenikus esemény (76). A funkcionálisan releváns mutációk többsége a fehérje C-terminális DNS kötő szakaszát érinti (77). A p53 mutációját a májkarcinómák mintegy 30-67%ban sikerült megtalálni (Táblázat 2). A p53 mutáció lényegesen gyakrabban fordul elő azokon a területeken (Afrika), ahol a betegek nagyobb mennyiségű aflatoxin B1 toxicitásnak vannak kitéve. A 249-es kodont érintő guanin-thimin tranzició, az epidemiológiai és kísérleti adatok alapján az aflatoxin B1 (az Apergillus flavus micotoxinja) expozíció és az egyidejű HBV fertőzés által indukált tumorokra jellemző (78). Ez a mutáció a nyugati országokban diagnosztizált esetekben csak ritkán fordul elő. Meg kell jegyezünk azt is, hogy a p53 mutáció összesített frekvenciája ugyanakkor az aflatoxin B1-HBV-vel társult esetekben viszonylag alacsony, ami más patogenetikai faktorok szerepét is feltételezi.

Érdekes módon, a p53 öröklődő

mutációja viszont (Li-Fraumeni szindróma) nem emeli meg a HCC előfordulását. A HBxAg a p53 hibajavító funkciójának gátlása révén hozzájárul a tumorokban észlelt genetikai instabilitás kialakulásához is (79). A HCV core fehérje, az effektor T limfociták és p53 modulációján keresztül, lecsökkenti a májsejtek Fas ligand indukált apoptózissal szembeni érzékenységét, ami lehetővé teszi, hogy a tumor sejtek elkerüljék az immunválasz által kiváltott sejthalált. Az NS5A fehérje pedig, a p53 citoplazmikus szekvesztrációján keresztül gátolja meg a májsejt apoptózist (80). A p53 fehérje család másik két tagja a p63 és p73 transzkripciós faktorokDNS kötő régiójának aminosav szekvenciája a p53-ral 63%-os homológiát mutat. Emellett biológiai funkciójuk nagymértékben átfed a p53-éval, és a p53 károsodása esetén részben pótolhatja annak hibajavító és apoptózis ellenőrző szerepét (81). Bár a

p63 mutációját humán HCC-ben még nem mutatták ki, egyes tanulmányokban a p73 túltermelése rossz prognózissal mutatott összefüggést (82). 3.1.4.2

Rb1 és PTEN

A retinoblasztoma gén (Rb1) az elsőként felfedezett tumor szupresszor, amelynek mutációját számos tumorféleségben leírták már. Az Rb1 mutációját a HCCk mintegy 15-22%-ában lehet kimutatni, míg az RB-t kódoló 13q régió a tumorok 2548%-ban érintett LOH által (65). Az Rb tumor szupresszor funkcióját a sejtciklus progressziójának szabályozásán keresztül fejti ki. Natív állapotban az Rb az E2F1 faktorhoz kötődik és meggátolja annak transzkripciós hatását. Az Rb foszforilációja azonban a fehérje inaktivációjához vezet, ami egyben együtt jár az E2F1 felszabadulásával, ami pedig a sejtciklus gének átíródásához vezet (83). E2F1 transzgénikus egerekben ugyanakkor, májkarcinómák kialakulás volt megfigyelhető (84). A HBxAg májsejtekben képes az Rb gén promóterének aktivációjára. Válaszképpen a megnövekedett Rb szint meggátolja a sejtek apoptózisát, és egyben serkenti a vírus felszaporodásához szükséges gének kifejeződését (85). Az előrehaladott májrákokban az Rb gén mutációja vagy LOH által történő ínaktivációja viszonylag gyakran fordul elő . A gankyrin onkogén az Rb fehérje proteázoszómális lebontásában játszik szerepet. Nem meglepő tehát, hogy a gankyrin megnövekedett expressziója a HCC-ben, mutáció hiányában is, az Rb fehérje alacsony szintjéhez vezet (86). Az Rb több más funkcióján kívül az több a sejtciklus szabályozásában szerepet játszó cyclin átíródását is szabályozza. A cyclin D1 overexpresszióját a májtumorok 10-13%-ban figyelték meg, ami a cyclin D1 gén amplifikációjával együtt agresszív fenotípussal is társult (87). Ezzel szemben a cyclin D1 anti-sense transzdukció által történt leütése xenograft hepatoma modellben meggátolta a tumorok növekedését. A PTEN tumor szupresszor gén a 10q23.3 kromoszóma régióban található. A PTEN a humán hepatocelluláris karcinómák 10-30%-ában inaktiválódik LOH vagy mutáció által (88). A PTEN gátló hatását az IGF és a VEGF növekedési faktorok átíródásának gátlásán keresztül fejti ki. A p53 egyéb funkciói mellett fokozza a PTEN átíródását is, tehát a p53 elvesztését eredményező genomikus eltérések a PTEN aktivitására is hatással vannak (89). A HCV és HBV vírus fehérjék képesek a PTEN

és p53 tumor szupresszor funkciójának gátlására. A vad-típusú p53 hiánya, vagy a PTEN deléciója a PI3K útvonal aktivációjához vezet, ami elősegíti a genetikusan károsodott sejtek túlélését és letapadás nélküli szaporodását. A p53 és a PTEN inaktivációja egyben a HIF1 transzkripciós és a VEGF transzkripciós faktorok szintjét is megemeli, ami a transzformált sejtek korai túlélése és a tumorok vaszkularizációja szempontjából elengedhetetlen (90). 3.1.4.3

p21WAF/CIP1 és p16INK4/ARF

A p21WAF/CIP1 fehérje a cyclin-dependens kinázok (CDK) egyik széles spektrumú inhibitora, és mint ilyen, meggátolja a tumorsejtek belépését a sejtciklusba. Májrákokban a p21 fehérje szintje alacsonyabb, mint a környező májban, és egyben szoros összefüggést mutat p53 mutációk jelenlétével is (91). A p21 fehérje a p53 és a TGFβ1 jelátviteli útvonalak által közvetített sejtosztódást gátló és senescence hatások közös effektora. A HCV core fehérje a p21 expresszióját a promóter régió TGFβ reszponziv elemének (TGFβ-RE) blokkolásán keresztül inhibitálja (92). Emellett a HCV core-t termelő sejtekben a p21 fehérje fél-életideje is jelentősen lecsökkent. HBV fertőzés esetén, pedig a HBxAg a p53 transzkipciós hatásának gátlása révén nyomja el a p21 termelődését (93). A p21 fehérjét mutált p53-t tartalmazó HCC sejtekbe juttatva meggátolja a tumor sejtek osztódását és apoptózishoz vezet. Gyakran érintettek még a G1-S1 tranziciót reguláló p16INK4/ARF (p14-p16) és cyclin D1 gének is (87). A sejtosztódás során az S fázisba történő átmenetet szabályozó útvonalak hatása végül a cyclin dependens kinázok foszforilációjában nyilvánul meg. A CDK-k pedig a Rb foszforilációját és inaktivációját mediálják. A CDK aktivitását a ciklinek kötődése serkenti, a CDK inhibitorok (p16, p21 stb.) pedig gátolják (83). Emellett a p16 szerepet játszik a DNS károsodást követő p53-tól független G1 blokk indukciójában is. A p16 lokuszról alternatív spliceing eredményeként keletkező ARF tumor szupresszor emellett, az Mdm2 gátlásán keresztül a p53 indukált anti-tumorgenikus program aktivációjára is hat (94). A p16, LOH vagy új promóter metiláció útján a HCC-k 60%-ban ínaktiváltak. Az INK4AARF-p53 tengely bár különböző szinten, de együttesen a májkarcinómák 86%-ában mutat elváltozást (95). Egyes megfigyelések szerint a p53 és a p14 ínaktiváció között negatív korreláció áll fenn. A p14-et érintő elváltozások többsége az intakt p53-t tartalmazó májtumorokban fordul elő. Ezen felül az INK-ARF lokuszt tartalmazó

9q21 régió a tumorok mintegy 78%-ában érintett vagy aberráns metiláció, vagy deléció által (67). Megállapíthatjuk tehát, hogy a p16-cyclin D1- CDK4-Rb1 tengely a májkarcinóma képződés egyik domináns útvonala. c-Myc

3.1.4.4

A c-Myc az egyike az elsőként azonosított onkogéneknek, az avian leukemia vírus transzformációs faktorának humán homológja. Funkciója a tumorok kialakulásában kettős. A celuláris kontextus függvényében, elősegíti a malignus sejtek apoptózisát, másrészt hozzájárul a tumorsejtek növekedéséhez (96). Egérmodellekben a Myc hepatocita specifikus túltermelése, az E2F-hez hasonlóan, májkarcinómák kialakulását eredményezi (84). Ezek a tumorok korai fázisban onkogén dependensek, és a Myc indukálható kikapcsolása egyben a tumor teljes regresszióját eredményezi. Humán májkarcinómákban az onkogenikus hatás gyakran a Myc túltermelésének, mutációjának, amplifikációjának (97), vagy esetleg a promóter hipometilációjának az eredménye (98). A Myc egyben a Wnt/β-catenin útvonal egyik célgénje is. A βcatenin indukált expressziós mintázat nagy része pedig, a Myc inaktiválásával inaktiválható (99). Az a megfigyelés, hogy a pre-neoplasztikus májelváltozásokban a Myc expressziós szintje viszonylag magas, míg a genomi amplfikációt mutató tumorokban a Myc gén akár transzkripcionálisan inaktív is lehet, azt valószínűsíti, hogy a kópiaszám a karcinogén hatás szempontjából nem döntő tényező (10). A HBxAg, és in vitro adatok szerint a HCV core fehérje is, képes a Myc transzkripcióját aktiválni (100). A májkarcinómákban az 10q24-25 lokuszon megfigyelt LOH pedig, a Myc negatív regulátora, az MMAC1 gén gátlásán keresztül járulhat hozzá a májkarcinómák progressziójához (101).

3.1.4.5

E-cadherin és Wnt/β-catenin

Az E-cadherin gén az epiteliális sejtek közötti kapcsolatot biztosító macula adherens felépítéséhez szükséges transzmembrán fehérjét kódol, amely egyben tumor szupresszor funkciót is betölt. Az E-cadherin jelenléte a membránban gátolja a tumorsejtek növekedését és a környező szövetek invázióját (102). A E-cadherin lokuszt érintő LOH májkarcinómákban a nagyobb tumor mérettel és a rossz prognózissal

Gén M6P/IGF2R p53 Rb P16/CDKN2A E-cadherin DLC1 p73 PTEN Cyclin IGFBP EXT1 MLH1 p14 TGFbR2 IGF2 Smad2/4 Beta-catenin Axin-1 K-/N-/H-ras c-myc THRB THRA E2F4

LOH (%) 42 ± 28 42 ± 18 35 ± 17 30 ± 22 69 44 30 30 20 20 20 20 15 5 5 -

Mutáció (%) 13 ± 20 27 ± 18 22 6±8 2-6 17 ± 18 10 10 50 76 65 36

Elváltozás mutáció mutáció, LOH

mutáció amplifikáció amplifikáció

Táblázat 2 : A leggyakoribb mutációk és LOH-k frekvenciája a humán májrákokban. Tannapfel alapján (72)

mutatott összefüggést (26). Az E-cadherin promóterének metilációja pedig prekurzor léziókban és korai tumorokban egyaránt kimutatható volt. A HBxAg képes az Ecadherin komplex destabilizására, azáltal, hogy meggátolja az E-cadherin és az aktin citoszkeleton közötti kötődést (103). Az E-cadherin lebomlása pedig a β-catenin magi transzlokáció következtében a c-Myc, c-Jun és Cyclin D1 onkogének aktivációját is maga után vonhatja (104). A β-catenin onkogén a Wnt jelátviteli útvonal által aktivált transzkripciós faktor, ami egyben az E-cadherin és az aktin citoszkeleton kapcsolódását is mediálja. A Wnt/β-catenin útvonal jelentős szerepet tölt be az embriógenezis során az egyes

szervek morfogenezisének szabályozásában (105). A β-catenin transzkripciós aktívitásának szabályozása a fehérje szerin foszforilációja útján történik, amely a βcatenin magi transzlokációját eredményezi. Ennek elmaradása a β-catenin nem membrán kötött frakciójának proteázoszoma mediált degradációjához vezet. Ezt a folyamatot többek között a GSK3β, CBP, groucho, axin és conductin fehérjékkel történő interakciók szabályozzák (105). A Wnt útvonalban szerepet játszó gének mutációja viszonylag gyakori esemény a különböző hámeredetű tumorokban. A humán májrákok mintegy 20-30%-a hordoz mutáns β-catenin gént (106). A mutációk szinte kizárólag a fehérje szerin foszforilációs helyét kódoló hármas exonra korlátozódnak, és β-catenin mediált proliferativ transzkripciós program konstitutív aktivációját eredményezik. A β-catenin transzkripciós célgénjei között megtaláljuk a c-Myc és a Cyclin D1 fehérjéket is. A β-catenint citoplazmatikus körforgalmát szabályozó gének (APC, GSK3β, axin) ugyancsak gyakran mutatnak genetikai vagy epigenetikai eltéréseket (107). Az axin gén, a β-catenin egyik fontos regulátora a májkarcinómák megközelítően 10%-ában mutált, ami szintén a Wnt/β-catenin útvonal aktivációjához vezet (108). Vad-típusú axin gén transzdukciója májkarcinóma sejtekben apoptózist indukált. Érdekes módon, a β-catenin mutációját már a korai HCC korai stádiumában is ki lehet mutatni, és az érintett a tumorok a többinél jobb prognózist mutatnak (109) .

3.1.4.6

Ras

A Ras útvonal aktivációja igen erőteljes proliferációs szignált közvetít. Nem meglepő tehát, hogy a Ras családba tartozó gének mutációja egyike a humán tumorokban előforduló leguniverzálisabban előforduló genetikai eltéréseknek (110). Bár Ras mutáció a HCC-kben igen ritkán fordul elő a Ras anti-apoptotikus, proliferativ és motilitást serkentő funkcióit moduláló Rassf1, Nore1 stb. gének genetikai és epigenetikai elcsendesülése a májkarcinómákban is jól dokumentált (26). A HBxAg képes a Ras útvonal stimulációjára, ez pedig a PI3K, és MAPK szignál aktivációján keresztül, és más onkogenikus útvonalak aktivációjához vezet (111).

3.1.4.7

IGF/IGFR

Az IGF1 sejtfelszíni receptorán, az IGF1R-en keresztül más növekedési faktorokhoz hasonlóan, mitogén és anti-apoptotikus hatással bír, ami hozzájárulhat az epiteliális sejtek malignus transzformációjához. Az IGF2R ezzel szemben elsősorban lizoszomális enzimek intracelluláris transzportjában és az IGF2 internalizációjában játszik szerepet, és tumor szupresszor hatású (112). Régóta ismert, hogy az IGF2 gén átíródása mind a pre-neoplasztikus léziókban, mind a kifejlett májkarcinómákban megemelkedik (113). Az IGF2 gén ezen felül alléllikus egyensúlytalanságot mutat, tehát a diszplasztikus nodulusokban és a tumorokban csak az egyik allél íródik át. A HBxAg transzfekciója HCC sejtvonalakon, a P3 és P4 embrionális promóterek stimulációján keresztül mind az IGFR1, mind az IGFR1 expresszióját megnövelte (114). Feltételezhetően a HCV és HBV virális fehérjék indirekt módon a Ras és p53 útvonalakon keresztül is képesek az IGFR aktivációjára. Az IGF2 gén siRNS mediált elcsendesítése HepG2 és Huh7 sejtvonalakban gátolta a proliferációt (115). Az IGFB fehérje család tagjai képesek megkötni az IGF1 faktort, és ez által biológiai elérhetőségét legátolni. A PLC és HepG2 hepatoma sejteket rekombináns IGFBP-3 fehérjével kezelve azok mitotikus aktivitása lecsökkent (116). Az IGF az IGFBP-vel komplexből limitált proteolizis útján szabadulhat fel. Egyes hepatociták által termelt proteázok, mint a cathepsin B, képesek tehát az IGF fehérjéket reaktiválni (112, 117). A cathepsin B szérum szintje májkarcinómában szenvedő betegekben megemelkedett, míg a proteáz inhibitor TIMP-1 túltermelése állatmodellekben meggátolta az SV40 indukált májtumorok növekedését, és egyben gátolta az IGFR1 foszforilációját (112).

3.1.4.8

TGFβ

A TGFβ növekedési faktor hatását a sejtmembránban található TGFβIR és TGFβIIR receptorokból álló heterodimer tirozin kináz receptor komplexen keresztül fejti ki. A TGFβIR ligand mediált aktivációja a sejten belül a Smad jelátviteli molekulák foszforilációján keresztül indítja el a specifikus transzkripciós programot (118). A TGFβ kezelés a hepatocitákban egyszerre okoz apoptózist és növekedési blokkot. A Smad2 és Smad4 gének mutációját a HCC-k mintegy 10%-ában lehet kimutatni (119). A Smad és a viszonylag ritkább TGFβIR mutációk pedig, a TGFβ

útvonal inaktivációját eredményezik. A TGFβ1 szérum szintje a HCC betegekben gyakran emelkedett értéket mutat (120). A TGFβ1 átíródásának szintje a HCC sejtvonalakban is megemelkedett, a tumorok progresszióját in vivo ez nem gátolja . A TGFβ ugyanakkor szerepet játszhat a környező, nem tumoros májsejtek növekedésének gátlásában és gyorsabb pusztulásában, ami paradox módon elősegíti a tumor kifejlődését (5). A 6q26-27 szakaszt érintő LOH a mannose 6-foszfát/IGFR2 receptor gyakori inaktivációját eredményezi. Ez az imprintinget mutató régió a ugyancsak a TGFβ1 aktiválásán keresztül és az IGF2 gátlásán keresztül fejti ki tumor szupresszor funkcióját (113). Az M6P/IGFR2 mutációját már a pre-neoplasztikus májléziók többségében is ki lehet mutatni, ami azt valószínűsíti, hogy ez a gén fontos szerepet játszhat a májrákok korai patogenezisében (121). Az ilyen módon a TGFβ1 rezisztenssé vált sejtek pedig, bár a genotoxikus hatásokkal szemben érzékenyebbek, növekedési előnyhöz jutnak. Hasnyálmirigy szigetsejteket patkány májba ültetve a szigetek szomszédságában májkarcinómák kialakulását figyelték meg. Ez azt sugallja, hogy a lokális inzulin felesleg a májsejtekben karcinogén lehet. Az IGFR1 relatív alacsony transzkripciója a pre-neoplasztikus léziókban pedig arra utal, hogy a korai szakaszban az inzulin mediált proliferativ hatás elsősorban az inzulin receptoron és annak szubsztrátjain IRS-1, RAF-1, MEK-1 keresztül valósul meg; és a IGFR1 csak a HCC stádiumban tölti be a primer mitogén szerepet (113).

3.1.4.9

HGF/c-Met

A HGF és sejtfelszíni tirozin kináz receptora, a c-Met fiziológiás funkcióik mellett döntően hozzájárulnak a malignus tumorok esetén tapasztalt invazív növekedési folyamathoz (122). Míg egészséges szövetekben a HGF/c-Met útvonal nélkülözhetetlen a sejtek migrációjához, a placenta, máj és végtagok kifejlődéséhez, addig ugyanez az útvonal a transzformált szövetekben fokozza az érképződést, és az áttétek képződését eredményezi. A HGF a plazminogén fehérje család tagja, és ennek megfelelően négy úgynevezett kringle domént tartalmaz (123). A HGF prekurzor fehérje formájában az extracelluláris mátrixhoz kötve tárolódik, ahonnan aktív formában urokináz-tipusú plazminogén aktivátor (uPA), faktor XII, vagy thrombin proteázok által mediált hasítás után szabadul fel (124). A HGF mind in vivo, mind in

vitro a primer májsejtek növekedését segíti. A c-Met receptor elemei egy közös fehérje hasítása réven jönnek létre. Az extracelluláris α lánc és a

membránon

áthaladó β lánc közösen alkotja a heterodimer receptort. Az intracelluláris régió tartalmazza azokat a foszforilációs helyeket, amelyek a receptor katalitikus aktivitását (Tyr 1234 és Tyr 1235), valamint a multifunkcionális dokkolóhely kialakítását (Tyr 1349 és Tyr 1356) szabályozzák (Ábra 3) (124). A c-Met aktivációja során a foszforilált dokkoló hely számos SH2 doménnel rendelkező intermedier jelátvivők megkötésére képes. Az Shc, Src, Grb2, p85α fehérjék direkt, míg mások a Gab1 adapteren keresztül indirekt módon kötődnek. A Gab1 fehérje a c-Met által kiváltott jel legfontosabb intracelluláris közvetítője (124). Amit jól szemléltet, hogy egerekben a c-Met és a Gab1 kiütött fenotípusok gyakorlatilag

megegyeznek

(125).

A

c-Met

receptor

Shc,

Grb2

kaszkád

közbeiktatásával a a Ras/mitogén aktivált kináz (MAPK) útvonalon keresztül a sejtproliferációt; a Gab1 PI3K láncon át a sejtmotilitást és az apoptózist a PLCγ és Shp2 aktiváción át pedig a tubulus elágazódását szabályozza (126). A c-Met receptort, vagy a HGF faktort transzfekció után túltermelő sejtek immunszupresszált „nude” egerekben tumorgenikusak, és fokozott áttétképzést mutatnak.

Másrészről

a

c-Met

shRNS

általi

leütése

lecsökkentette

a

rhabdomioszarkoma sejtek túlélését, valamint proliferációs, és invazív potenciálját, és jn vivo meggátolta a tumor xenograftok növekedését is (127). Megjegyzendő, hogy a c-Met leütése csak azokban a tumorokban volt hatásos, ahol a c-Met gén amplifikált volt. Az örökletes és sporadikus papilláris veserákokban és a fej-nyak tumorok egy csoportjában a c-Met tirozin kináz folytonos aktivációját eredményező mutáció vezet tumor képződéshez. A c-Met membránközeli régiójának elváltozását gyomor és tüdő rákokban találták meg (122). A gyomor, epeúti, tüdő és nyelőcső rákokban pedig a cMet gén amplifikációja a receptor túlzott kifejeződéséhez vezet, és ezáltal karcinogenetikus. A c-Met fokozott átíródását megfigyelték már oszteoszarkómákban, vese, petefészek, tüdő, prosztata, hasnyálmirigy, metasztatikus vastagbél és májkarcinómákban egyaránt. Ez szinte mindig rossz prognózissal jár együtt. A c-Met túltermelése hátterében sok esetben a tumorokban fellépő hipoxia állhat, amely képes az inváziós program aktiválására (128).

Ábra 3 : A c-Met receptor és ligandja, a HGF, strukturális felépítése. A c-Met receptor felépítésében a diszulfid hidakkal összekapcsolt extracelluláris α és a transzmembrán β láncok vesznek részt. Az extracelluláris régió négy IPT domén mellett tartalmazza a Sema, a cisztein gazdag MRS doméneket. Az intracelluláris szakasz membránközei régiója katalitikus a C-terminális vég pedig a dokkoló helyet kódolja. A HGF és MSP ligandok négy kringle (K1-K4), valamint egy-egy aktivációs és szerin proteáz szakaszból épülnek fel. Benvenuti és Comoglio alapján (122) .

A HGF/c-Met útvonal gátlására több új terápiás szer áll kipróbálás alatt. Az NK4 a HGF-hez hasonlóan négy kringle domént tartalmaz, ezáltal annak kompetitív inhibitora. A porteolitikus kodoban mutált ezért nem hasítható pro-HGF fehérje egyaránt gátolja a HGF természetes aktivációját és receptorhoz kötődését. Mindkét szerrel biztató kísérleti eredményeket értek el tumorok angiogenezisének és növekedésének megakadályozásában. A HGF-t és a c-Met receptorhoz kötődő neutralizáló antitestek is a kompetitiv inhibíció alapján hatnak. A kis molekulatömegű kináz inhibitorok (SU11274, PHA-665752, K252a) pedig a c-Met receptor foszforiláció függő transzaktivációját támadják. Más molekulák, mint a DN30 és anti-Sema antitestek, vagy a szabad receptor fragment (decoy Met) a c-Met ligand

mediált dimerizációját gátolják. Végezetül ígéretes alternatíva lehet még a c-Met gén lentivirális shRNS vektorokkal történő elcsendesítése is (129).

3.2 3.2.1

Transzkripciós analízis Az mikroarray alapú expressziós analízis technológiai háttere Egy sejt expressziós profiljának megalkotása során több száz, vagy ezer gén

szimultán transzkripcióját vizsgáljuk egyszerre a meghatározott kondíciók között. Az így kapott gén expressziós mintázat vizsgálhatóvá teszi a mintára jellemző fenotípus molekuláris hátterét, és lehetőséget teremt a különböző a kísérleti kondíciók által indukált válaszok összehasonlítására a minták osztályozására esetleg, prognózis felállítására (130). Az expressziós profilalkotás széles körben elterjedt változatai között a technológiai megvalósítás alapján megkülönböztethetünk szekvenáláson (SAGE) és hibridizáción (mikroarray és membrán arrayk) alapuló módszereket, valamint ide sorolunk néhány nagy felbontású PCR alapú technikát is. Az

expressziós

mikroarryak

olyan

kísérletes

eszközök,

amelyek

a

komplementer polinukleotid szakaszok közötti szekvencia specifikus hibridizáció jelenségét felhasználva képesek a gén expresszió kvantitatív detektálására. A mikroarrayken az egyes géneket a szilárd hordozó felszínhez kötött az expresszált szekvenciára specifikus kétszálú cDNS vagy szintetikus oligonukleotid szakaszok reprezentálják. Ezeket a mikroarray felszínéhez kötött nukleotid szakaszokat konvencionálisan próbáknak, a vizsgálni kívánt biológiai mintából származó szakaszokat pedig cél szekvenciáknak nevezzük. Minden mikroarray kísérlet alapelve, hogy a jelölt cél molekulák kikötődnek azon komplementer próbákhoz, amelyekkel szekvencia egyezést mutatnak. A kikötődő cél molekulák mennyisége és ez által a próbáról detektálható jel nagysága arányos az adott génnek a biológiai mintában található expressziós szintjével (131). A mikroarray technika megjelenése szorosan összefügg a genetika és informatika területén az elmúlt évtizedben tapasztalt forradalmi fejlődéssel. A humán genom projekt sikeres befejezése lehetővé tette a mikroarryak széleskörű alkalmazását, ami a rákkutatásban jelentős eredményekhez vezetett. Elérhetővé vált a daganatok génexpressziós hátterét jellemző átfogó kép megalkotása. Bizonyítást

nyert, hogy az egyes daganat típusok megkülönböztethetők pusztán jellegzetes trasznkripciós mintázatuk alapján (132, 133). Még jelentősebb eredmény azonban a biológiai fenotípussal, mint az áttétképzés, rekurrencia, terápiás érzékenység- szoros összefüggést mutató expressziós mintázatok alkalmazása új daganat típusok és altípusok azonosítására. Ezen új tumor klasszifikációs rendszerek közül néhány, mint az emlő (134) ovárium (135) és tüdő karcinómák (136) valamint egyes limfómák (137) vizsgálatából származó példák azt mutatják, hogy már közel áll a klinikai gyakorlatban történő hasznosítás is. A mikroarrayk által nyert eredmények kiértékelése azonban nem lehetséges a technológiai háttér alapszintű ismerete nélkül. Az egyes kísérletek által generált több ezer adatpont statisztikai elemzése és értelmezése még a megfelelő analitikus programok birtokában is komoly kihívást jelent a legtöbb kutató számára. A következő néhány fejezet e területekről próbál rövid összefoglalást nyújtani.

3.2.1.1

cDNS könyvtárak és az első mikroarrayk Az első, széles körben alkalmazott mikroarrayk a humán genom szekvenálása

során megalkotott cDNS könyvtárak újszerű felhasználásán alapultak. 1991-ben Craig Venter és társai fejlesztették ki azt a módszert, amely lehetővé tette új gének felfedezését anélkül, hogy a human genom teljes szekvenciája ismert lett volna (138). Jól ismert, hogy a különböző szövetekben a genom aktívan átíródó szakaszairól mRNS molekulák keletkeznek. Ezek az expresszált szekvenciák a reverz transzkriptáz enzim segítségével stabilabb komplementer DNS (cDNS) szakaszokká írhatók át, amelyeket expresszált azonosító szekvenciának (EST) nevezünk. Az egyes EST szekvenciákat

cDNS

bakteriális

vektorokba

klónozva

cDNS

könyvtárakat

alkothatunk, és az egyes EST szekvenciák átfedő szakaszait meghatározva a humán gének teljes szekvenciája megismerhetővé válik (139). A cDNS könyvtárak konstrukciója során az individuális cDNS klónokat tartalmazó baktérium törzsek mikrotiter lemezeken tárolhatók. Ebben az elrendezésben az egyes baktérium kolóniákat array formájában filter papírra cseppentve, és azokat a vizsgálni kívánt jelölt cDNS szakasszal hibridizálva, viszonylag könnyen meghatározható az egyes gének különböző szövetekben mutatott expressziója (140). A cDNS klónok ilyen formában történő elrendezése kiváló alapot nyújt további felhasználások. így a

mikroarray kísérletek számára. Az array formájában elrendezett cDNS könyvtárak hibridizálhatók egy adott sejttípusból, vagy szövetből izolált teljes cDNS mintával, és az így nyert hibridizációs jel erősségét kvantitálva összehasonlíthatóvá válik az egyes gének expressziója a különböző kísérleti kondiciók között (141). Jelenleg az amerikai National Center for Biotechnology Information (NCBI) adatbázisa több mint 4.4 millió a különböző kutatócsoportok által meghatározott EST szekvenciát tartalmaz. Az emberi gének számát a legutóbbi becslések 20,000 és 25,000 közé teszik (142), ami egyértelműen jelzi az EST szekvenciák redundanciáját, aminek oka, hogy ugyanazon génszekvenciához számos EST klón tartózik. Ezért a UniGene (www.ncbi.nlm.nih.gov/./UniGene/ ) adatbázisban, amely az egyes EST-ket a szekvencia információ alapján rendezi csoportokba, UniGene klaszterekbe úgy rendezésre, hogy mindegyikük egy egyedi gén transzkriptumot képviseljen. A UniGene azonosító számok alapján a továbbiakban visszakereshetők azon cDNS klónok, amelyek reprezentatívak az adott klaszterre. A kiválogatott klónokat újra rendezve és a szekvenciákat validálva kapjuk meg a cDNS próba készletet, amely már alkalmas mikroarray készítéséhez. A cDNS mikroarray nagy előnye, hogy viszonylag könnyen konsturálhatunk tetszőleges számú próbát tartalmazó, egyes jelátviteli útvonalakban érintett génekre vagy meghatározott fehérje családokra specifikus arrayket. Azokban az esetekben, amikor a vizsgált szervezet genomi szekvecniája nem teljesen ismert, valamint amikor egymással közeli rokonságban álló fajok expressziós összehasonlítását kívánjuk elvégezni, vagy egy specifikus gén csoport transzkripcióját vizsgáljuk, a cDNS arrayk alkalmazása még mindig az egyik legéletképesebb alternatívát jelenti (143, 144). Az alkalmazások többségénél azonban, a megoldást olyan mikroarray platform megalkotása jelenti, amely a teljes expresszált humán genom detektálására alkalmas. E cél gyakorlati megvalósítása cDNS próbák használatával számos akadályba ütközik. A kevésbé, vagy csak bizonyos szövetekben, esetleg csak az embriógenezis meghatározott időpontjában expresszálódó gének egy részéről nem lelhető fel reprezentatív cDNS klón. Bár sok esetben ez nem befolyásolja döntően a gén expresszió globális vizsgálatát, mégis előfordulhat, hogy egyes kulcsfontosságú gének nem kerülnek detektálásra. A UniGene adatbázisban található mintegy 100.000 klaszter közül jelenleg több mint 36,000 csak egy cDNS szekvencia által azonosított. Ezek esetében nehéz annak meghatározása, hogy ezen egyedi szekvenciák valójában egy adott alacsonyan expresszálódó gént képviselnek-e, vagy pusztán a cDNS

könyvtár létrehozása közben keletkező szekvencia hiba (artifaktum) eredményei (145). A kettős szálú cDNS próbák magas szenzitivitása és viszonylagos toleranciája a kisebb szekvencia eltérésekkel szemben, mint amilyenek a természetes nukleotid polimorfizmusok (SNP-k), számos alakalommal előnyös lehet. Ugyanakkor ez a tulajdonság hátrányos olyan estekben, amikor nagyfokú szekvencia-homológiát mutató transzkriptumok, például az alternatív splice variánsok kimutatása a cél. DNS könyvtárak létrehozása illetve arrayken használt cDNS próbák szintézise során jelentős problémaként lép fel az eredeti szekvencia integritásának megőrzése. A mikroarrayk nyomtatására alkalmas próbák az eredeti cDNS klónok pár száz esetleg ezer bázis pár hosszúságú szakaszainak PCR alapú felsokszorozásával hozhatók létre. A PCR szintézis bázispár tévesztési valószínűségét, valamint a több tízezer egyedi klón kontamináció nélküli kezelésével együtt járó nehézségeket figyelembe véve, szinte elkerülhetetlen, hogy a próbák egy része ne tartalmazzon eltérést az eredeti génszekvenciához képest (146). Egyes megfigyelések szerint, a PCR amplifikációt követően, a próbáknak csak mintegy 66-79%-a százaléka volt szennyeződést mentes és mutatott teljes egyezést az eredeti genomikus szekvenciával (147). A szekvencia hibák aspecifikus hibridizációhoz, valamint a klónok téves azonosításához vezetnek (148), ez pedig jelentősen leronthatja a cDNS arrayk felhasználásával szerzett adatok reprodukálhatóságát (149). 3.2.1.2

Oligonukleotid próbák

A kettős szálú cDNS próbákkal együtt járó technológia nehézségek miatt, a modern mikroarray alkalmazásokban egyre inkább elterjed az oligonukleotid próbák felhasználása (150). Az oligonukleotid próbák előnye a magasabb szintű specificitás, a hibridizációs kondíciók jobb kontrolálhatósága és uniformitása, valamint az egymáshoz hasonló szekvenciát tartalmazó transzkriptumok (lsd. splice variánsok) jobb megkülönböztethetősége. A próbák koncentrációja és hibridizációs affinitása uniformizálható,

az

aspecifikus

kereszthibridizáció

pedig

a

megfelelő

próbaválasztással a minimumra csökkenthető. Így elkerülhetőek a palindrom szakaszokat tartalmazó szekvenciák, amelyek DNS hurkokat képezve akadályozzák a hibridizációt. A szekvenciákra jellemző olvadási hőmérséklet (Tm) és más empirikus szabályok figyelembevételével pedig a próbákat az adott hibridizációs paraméterekre

(pH, só koncentráció és hőmérséklet) optimalizálhatjuk.

A ma használt

oligonukleotid készletekben a próbák szekvenciája megegyezik az mRNS szekvenciájával, tehát a genomiális DNS sense szekvenciájával. Ezen próbák tehát egyformán hibridizálhatók mind a hagyományos reverz transzkripcióból származó egyszálú cDNS, mind a lineáris RNS amplifikáció során nyert komplementer RNS molekulákkal, amelyek a komplementer anti-sense szekvenciát hordozzák (150). A humán genom szekvenciájának teljes ismeretében elérhetővé vált az egyes gének

specifikus

szakaszaira

történő

próbák

tervezésének

lehetősége.

Az

oligonukleotid mikroarraykkel bizonyítottan jobb szekvencia diszkrimináció érhető el, mint a kétszálú cDNS arraykkel (151). Így lehetségessé válik az egyes géncsaládok akár 90%-ban homológ tagjai és az alternatív splice variánsok közötti diszkrimináció lehetősége (150). A transzkriptumok 3’ vagy 5’ végeire specifikus próbákat tervezve, a jelintenzitások hányadosából következtethetünk az RNS minta integritására. Létrehozhatók a fragmentált RNS szakaszokat tartalmazó (mikrodisszektált, fixált) mintákra optimálisabb, csak 3’-es próbákat tartalmazó arrayk is. A nem kódoló genomi promóter szakaszokra specifikus, oligonukleotid próbák pedig számos új alakalmazás, (chip-on-chip, promóter, metilációs, haplotipus és SNP) arrayk előtt nyitották meg az utat (152). Az expressziós profilalkotás során az adatok integritását befolyásoló tényezők között a legfontosabbak a szenzitivitás valamint a specificitás optimalizálása. Ezeket jól jellemzi a célszekveciának a specifikus próbához történő kötődését megbízhatóan jelző legkisebb jel, valamint a célszekvenciáknak a nem specifikus próbákhoz kötődése következtében detektált jel nagysága. Továbbá szükség van még a hibridizációs jel random változásából adódó zaj és a próbák, esetleg az array konstrukciójából adódó szisztematikus mérési eltérések, hibák minimalizálására is. Az oligonukleotid próbák lehetnek rövidebb, 25 bázispár hosszúságúak, ilyenek például a GeneChip® arrayken alkalmazott in situ szintetizált próbák (153). Más platformokon hosszabb. 35-70 bázispár közötti oligonukleotid próbákat használhatunk (154, 155). A mikroarray platform szenzitivitását megnövelhetjük hosszabb próbák alkalamazásval, mivel a hosszabb DNS szakaszok hibridizációja alkalmával a kötési energia magasabb, például egy 60 bp hosszúságú próba szenzitivitása akár nyolcszorosa is lehet egy 25 bp nagyságúénak (156). A túl rövid próbák esetében a specificitás is alacsony, mivel ilyenkor megnő a több célszekvenciával történő random egyezés esélye.

Ugyanakkor, a próbák hosszának egy határon felüli növelése megnöveli

annak az esélyét, hogy egy szakasz eltérő cél szekvenciával is egyezést mutasson különösen akkor, ha figyelembe vesszük az egyes géncsaládokban evolucionálisan konzervált szakaszok előfordulását is. A hibridizációs zaj szintén csökkenthető hosszabb próbák alkalmazásával, és különböző, de ugyanarra a célszekvenciára specifikus próbákról nyert jel átlagolásával. Az átlagolás során az egyes próbákra esetleg jellemző szisztematikus hiba is jobban kezelhető. A különböző faktorok mindegyikét figyelembe véve az optimális legközelebbi eredmény 50 és 150 bp közötti próba hosszúság esetén érhető el (156). Az ennél rövidebb próbák használata esetén tanácsos a kísérleti zajt a több próbáról, esetleg a több arrayről nyert adatok átlagolásával csökkenteni. Mindezen szempontok figyelembe vétele mellett az oligonukleotid mikroarrayk alkalmazásával igen jól reprodukálható, tiszta expressziós adatokat nyerhetünk. 3.2.1.3

Expressziós mikroarray platformok A próbák mikroarraykre történő felvitelére két alapvető technológiai

megoldás terjedt el. Az előzetesen megszintetizált kétszálú cDNS vagy egyszálú oligonukleotid próbákat az erre a feladatra specifikus robot (arrayer) segítségével nyomtathatjuk

a szilárd hordozó, legtöbbször üveg mikroszkóplemez, felületére

(157). A próbák fotolitographikus in situ szintézisén alapuló eljárás pedig leginkább az Affymetrix vállalat GeneChip® arrayhez köthető (153). A mikroarrayk készítése során használt nyomtatási felszín elektrosztatikus taszításának hatására a hibridizáció hatékonysága a felére is csökkenhet a felszínhez közelebb lévő próba szakaszok pedig hozzáférhetetlenné válhatnak (158). 30-60 karbon csoportból álló amfiphil távtartó szakaszoknak a próba végéhez illesztése, vagy az üvegfelszín például epoxiszilánnal való bevonása az elektrosztatikus taszítást gátolja és a hibridizáció szenzitivitását 150-szeresére is növelheti (159). A fotolitografikus in situ szintézise során a használt módosított nukleotidok fényérzékeny hidroxi csoportot tartalmaznak. Különböző fényáteresztő maszkokat alkalmazva a felszínhez kötött oligonukleotidok tetszőleges mintázat szerint aktiválhatók és reagálnak az újonnan felvitt nukleotid csoportokkal. A folyamatot szekvenciálisan ismételve, a génspecifikus próbákat igen magas denzitásban tartalmazó mikroarray hozható létre (160). Az új nukleotidok beépülésének hatékonysága ciklusonként 92-94% közé tehető (161), ami csak rövid próbák

szintézisét teszi lehetővé. A hibridizációs jel specificitását növelendő a platform génenként 11-14 25bp hosszúságú, úgynevezett „perfect match” (PM) próbát tartalmaz. A transzkripttal teljes szekvencia homológiát mutató PM próbák mellett, az arrayken azonos számú, a PM-től a 13-dik pozícióban eltérő szekvenciát tartalmazó mismatch (MM) próbák is találhatók. A PM jelintenzitásnak az MM jellel történő normalizációja ugyancsak rövid próbáknál fellépő aspecifikus hibridizációt hivatott korrigálni. Maszkok alkalmazásával a fotoglitografikus eljárás arrayként ~ 1,300,000 próba elhelyezésére alkalmas. A módszer kiválóan használható nagy mikroarray szériák ipari szintű előállítására, de a maszkok előállításának magas költsége miatt a specializált arrayk készítése nem gazdaságos. A „digital mikromirror device” (DMD) technológia alkalmazása új alternatívát jelent az in situ szintetizált mikroarrayk gyártásában. A DMD-vel 400,000/array próbadenzitás érhető el, de mivel a fotoszenzitív aktiváció hatásfoka eléri a 98%-ot, hosszabb oligonukleotid próbák szintézise is lehetséges (162), valamint a szekvenciák flexibilisen változtathatók. A Nimblegen expressziós platformok például transzkriptumonként öt, 60 bp hosszúságú próbát alkalmaznak. Az “ink jet” alapú nukleotid felvitellel, mintegy 40,000 próba denzitással, de igen flexibilisen készíthetőek arrayk. A magas reakciós hatékonyság (98%) következtében pedig ezeken, például az Agilent által készített arrayken, transzkriptumonként egy-két 60 bp nagyságú próbával történik a gén expressziós analízis (163, 164). A pre-szintetizált próbák tisztasága és a szintézis hatékonyság jóval felülmúlja az in situ szintézis során elérhetőt. Az oligonukleotidok folyadék kromatográfia vagy poliakrilamid gélelektroforézis eljárásokkal tovább tisztíthatók (165). A szintézis közben a teljes hossz elérése előtt terminálódott próbákból eredő szennyeződés az 5’ végeken amino csoportok elhelyezésével és aldehid szubsztrát filtrációval is eltávolítható (166). A pre-szintetizált kétszálú cDNS, valamint oligonukleotid próbák egy három dimenzióban mozogni képes precíziós robot, és speciálisan megmunkált acél, wolfram, vagy szilikon tűk segítségével történnek. A próbák általában 386 helyes mikrotiter lemezről kerülnek a megfelelő hordozó, általában mikroszkópüveg felszínére. Egyes korai alkalmazásokban szilárd hordozóként polimer membránokrat is használtak. A nyomtatás során az uniformitás érdekében minden paraméter (viszkozitás,

páratartalom,

légáramlás)

szigorúan

kontrollált.

Nyomtatással

maximálisan 40,000 próba per array denzitást érhetünk el (167). A bead array, azaz gyöngy array technológiával ennél sokkal magasabb próbadenzitás élérése, 300 nm

átmérőjű gyöngyöket alkalmazva a nyomtatottnak akár ~40,000-szerese is lehetséges (168).

Ebben

az

elrendezésben

az

oligomer

próbák

egy

jelölő

szakasz

közbeiktatásával szilikon mikro gyöngyök felszínéhez csatlakoznak. A gyöngyök szerint random eloszlás szerint kerülnek a hordozó felszínére ahol azonosításuk a jelölő szakaszra specifikus próbák hibridizációjával történik. Az Illumia vállalat gyöngy arrayin akár 700,000 próba, egy lemezre pedig 1-16 számú array is elhelyezhető, ami a különböző alkalmazásoknál igen nagy flexibilitást jelent (169).

Kiindulási RNS mennyiség

Reverz Transzkripció (Direkt jelölés)

Reverz Transzkripció (Indirekt jelölés)

T7 RNS Polimeráz Amplifikáció

SMART PCR

Dendimer

TSA

Direkt RNS jelölés

10-15

10-15

0.05-1

0.05-1

1

0.5-2

10-15

Minta szekvencia

Anti-sense

Szensz

Próba szekvencia

Sense

Anti-szensz

Jel amplifikáció Nincs

Van

Nincs

Nincs

Van

Minta amplifikációja

Minta amplifikáció Array platform

Affymetrix, Oligo, cDNS

Oligo, cDNS

Affymetrix, Oligo, cDNS

cDNS

cDNS

cDNS

Affymetrix, cDNS

Időigény (óra)

~4

~9

Egy-két nap

~4

~6

~9

~2

Munkaigény

Alacsony

Közepes

Magas

Alacsony

Alacsony

Magas

Alacsony

Táblázat 3 : A mikroarray próbák jelölésére használt módszerek összehasonlítása.

3.2.1.4

Minták jelölése és detektálása

A mikroarray kísérletek alapvető feltétele, hogy a vizsgálni kívánt biológiai mintákból izolált mRNS frakció jelölése során detektálható és kvantitálható célszekvenciát hozzunk létre az eredeti expressziós arányok megtartása mellett. A jelölés történhet direkt kémiai reakció, illetve enzimatikus szintézis által.

Az

enzimatikus folyamatokon belül megkülönböztethetünk még direkt és indirekt ínkorporációs metodikát is. A direkt jelölés során, a fluoreszscens festékkel jelölt nukleotidokat a reverz transzkriptáz enzim építi be cDNS szekvenciába (131). Mivel a különböző fluoreszcens festékek beépülésének hatásfoka a sztérikus eltérések miatt változó, problémát jelent a minták nem egyenlő mértékű jelölődéséből adódó „dye bias” (170). Az optimális szignál eléréséhez ezen felül viszonylag nagy mennyiségű (50-100 μg), teljes RNS jelölésére van szükség. Ugyanilyen módon lehetséges

32

P

33

vagy P jelölt nukleotidokat felhasználva radioaktiv próbák szintézise is, amelyeket a nylon membrán arrayken használhatunk (Táblázat 3). Napjainkban mégis az indirekt enzimatikus jelölés a leggyakrabban alkalmazott metodika. Az aminoallyl gyököt tartalmazó nukleotidok, vagy reverz transzkripció, vagy az RNS amplifikáció során építhetők be a cDNS vagy cRNS célszekvenciába. Ezt követi az amino csoportoknak a fluoreszcens Cy3 vagy Cy5 festékekkel való párosítása egy gyors kémiai reakció révén. Elméletileg ez a metódus mentes a „dye bias” hibától, ami azonban a fluoreszcens festékek eltérő stabilitása miatt, különösen, ha a légtérben magas ózon koncentráció van jelen, továbbra is problémát okozhat (164). Az indirekt jelölés hatásfoka jobb, mint a direkt jelölésé, 10-20 μg RNS már kiváló jelet ad. A jelintenzitás jelölt primerek alkalmazásával a cDNS szintézis során tovább növelhető. Jelentősen eltérő az Affymetrix által gyártott arrayken alkalmazott jelölési módszer. Itt az RNS amplifikációhoz a biotinhoz kötött ribonukleotidokat használva, hibridizáció után, a jel detektálása sztreptavidinphicoerythrin konjugáttal történik. Bár a módszer 3’ irányban torzít, de a platform kompenzál, mivel a próbák a 3’ végtől maximum 600 bp távolságra helyezkednek el (www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression_manual.affx ). Számos kémiai, nem enzimatikus jelölési eljárás is kidolgozásra került, ám ezek jóval kevésbé terjedtek el, mint az enzimatikus formák. A Cy festékkel jelölt cisz-platinum származékok a nukleotidok negatív töltéssel, rendelkező gyökeivel,

például a guanin N7-es csoportjával, reagálnak (171). A karbodiamide alapú cianin festékek a DNS-ben, vagy RNS-ben található timin, guanin és uracil bázisokhoz kötődnek (172). Az arildiazometan csoportok pedig kovalensen kötődnek a foszfát csoportokhoz (173). A hibridizációs jel detektálása fluoreszcens szkenner segítségével történik, melynek működése nagyon hasonló konfokális lézer szkennelő mikroszkópokéhoz. A leolvasás során a Cy3 és Cy5 által 510-550, illetve 630-660 nm hullámhosszon kibocsátott jelet fotóelektron sokszorozó csövek érzékelik. Az amplifikációs feszültség beállítása úgy történik, hogy a fotóelektron sokszorozó dinamikus legjobb kihasználása mellett, a telített pixelek aránya ne haladja meg az 1%-ot. A modern szkennerek 0.3 µ képfelbontásra és másodpercenként 20 soros olvasási sebességre is képesek. Így a nyomtatott arrayket 10 μm felbontással pásztázva, egy átlagosan 50100 μm próbahelyet, „spotot”, 25-100 pixel képez le. A nyers adatok ezután egy képfájl formájában kerülnek archiválásra. A képfeldolgozás első lépéseiben, a megfelelő programok segítségével, az egyes próbahelyek beazonosítása érdekében az array felszínére négyzethálós rácsot illesztünk. Megtörténik a próbahelyhez és a háttérhez tartozó pixelek azonosítása és átlagolása is. Az egyes próbákhoz tartozó expressziós hányados pedig a:

log

FR − BR 2 FG − BG

formula alapján kerül kiszámításra,kiszámolásra ahol FR és FG a próba, mig az BR és BG a háttér medián a Cy5 és Cy3 csatornákon mért medián intenzitása. Amint a fenti képlet alapján is kitűnik a array adatok értékelése szempontjából rendkívül fontos a specifikus jelnek a háttér jelintenzitásához való viszonya. Mind az alacsony jelintenzitás mind a magas háttér jelentősen torzíthatják az adott próbára jellemző expressziós hányadost. Ugyancsak az alapszintű képfeldolgozás részét képezi az arrayk és a hibridizáció minőségének ellenőrzése.

A képalkotás során előforduló, az adatok

minőségét szignifikánsan befolyásoló hibák korlátozódhatnak egyedi próbákra, de akár az egész arrayt is érinthetik. Az egyes próbák jelének integritását leginkább a nyomtatás minősége, a minta nem egyenletes eloszlása, valamint a háttér jelintenzitása, esetleges szennyeződése befolyásolják. Ezért elengedhetetlen minden egyes szkennelés során az array képének vizuális ellenőrzése, ami során könnyen

kiszűrhetők az elemi szálak, szemcsék, por, buborékok, vagy nem megfelelő mosás miatt kialakult egyeletlen háttér által érintett spotok. A képelemzésre használt programok többsége automatikusan szűri, ha a spot körvonal irreguláris, illetve mérete egy adott pixelszám alatt van. Az array általános minőségét és az adatok megbízhatóságát jól jellemzi a detektálható próbák aránya, ha a spotok több, mint 30%-a hiányzik, az szisztematikus hibára utal. További fontos indikátor az egyes csatornákon érkező jel alacsony varianciája (174), a szaturált pixelek magas száma, ami valós expressziós értékek alulbecsléséhez vezet, valamint az adatelemzés során kalkulált

normalizációs

faktor

nagysága,

amely

optimális

esetben

lineáris

normalizációnál kisebb, mint ± 1.6 log2.

3.2.2

A mikroarray adatok statisztikai elemzése

3.2.2.1

Mikroarray kísérletek tervezésének alapjai

Két mintát mikroarrayvel legegyszerűbben és legkisebb költséggel úgy hasonlíthatunk össze, ha a mintákat különböző jelöléssel ellátva, ugyanazon arrayre hibridizáljuk őket (175). Ilyen kísérleti konstrukciónál a jelintenzitások hányadosából direkt következtethetünk a fennálló expressziós különbségekre.

A direkt

összehasonlítás azonban csak korlátozott statisztikai elemzést tesz lehetővé, hiszen hiányoznak a replikátumok, holott a mikroarray adatok kiértékelése során a statisztikai elemzés jelentősége igen nagy, hiszen ellentétben a hagyományos kísérletekkel több tízezer gén átíródását vizsgáljuk egyszerre, tehát a véletlenszerű események szerepe jelentős. Biológiai és technikai replikátumok hiányában, az eredményeket erősen eltorzíthatják a minták közötti variabilitásból eredő (176), illetve a technikai kivitelezés során fellépő egyedi hibák. A statisztikailag helytálló elemzéshez

szükséges

replikátumok

számát

(n)

az

alábbi

képlettel

is

meghatározhatjuk: 2

4⎛⎜ tα + t β ⎞⎟ n= ⎝ 2 2⎠ , (δ / σ )

ahol σ az adott gén standard deviációja, δ az expresszió különbsége a két összehasonlított csoportban, tα/2 és tβ pedig a (100)α/2 és a 100β percentil érték a teloszlásban n-2 szabadsági foknál (130).

A technikai ismétlések esetén az azonos mintából kapott adatok átlagolása növelheti az eredmény pontosságát. Gyakran használt megoldás, hogy a két minta közti fluoreszcens jelölést megcserélik (dye swapping). Erre akkor van elsősorban szükség, amikor a Cy3 és Cy5 jelölés intenzitása eltér az egyes gének esetén, esetleg különbség van egyes festékek stabilitásában. A technikai replikátumok amellett, hogy hasznos információt nyújtanak a jelölés, a hibridizáció, valamint a képalkotás reprodukálhatóságáról, lehetővé teszik a rossz minőségű kísérletek kiszűrését is. Helyenként felmerül az az elgondolás, hogy a felhasznált arrayk száma jelentősen csökkenthető, ha az azonos csoportba tartozó mintákat összemérjük (pooling), és egy arrayn értékeljük őket. Így azonban az adott minták közötti biológiai variabilitásról minden információ elvész, ezért statisztikailag helytálló kiértékelés nem végezhető el (177). A replikátumok viszonylag egyszerűen elkészíthetők az egyféle jelöléssel dolgozó platformok (pld. Affymetrix, Ingenuity) esetén.

Azonban ott, ahol két

fluoreszcens festékkel jelölt minta kerül egyszerre hibridizációra (dual color array), fontos a minták megfelelő párosítása, vagy a helyes referencia minta megválasztása. Az egyik leggyakrabban használt kísérleti elrendezés a közös referencia modell. A minden arrayre felvitt közös referencia minta univerzális belső kontrollként funkcionál. Az expressziós hányadosok tehát a spotok méretétől és a minta eloszlásától függetlenül standardizálhatók az egyes arrayk között. Tehát lehetőség nyílik akár különböző kísérletekből, esetleg különböző laboratóriumokból származó arrayk direkt összevetésére is. Ebben a modellben nem szükséges, hogy a közös referencia minta biológiailag releváns legyen, azaz azonos szövetből vagy sejtvonalból származzon. Az viszont elengedhetetlen, hogy a kísérleti mintában expresszálódó gének nagy része referencia mintában is jól detektálható legyen. A balanced block modellnél nincs referencia minta, hanem az összehasonlítandó csoportokba tartozó mintákat felváltva jelöljük és hibridizáljuk egymás ellen. Így jelentős számú arrayt takaríthatunk meg, de a módszer legfeljebb két csoport összehasonlítására alkalmas. A hurok (loop) elrendezésnél az első arrayn egy bizonyos színnel jelölt minta a következő arrayn az ellentétes színnel kerül felvitelre. Tehát minden mintát két ismétlésben elemezhetünk, de a változó párosítások miatt a módszer nem tesz lehetővé például klaszter, vagy egyéb komplikáltabb analízist (170).

Amint az előbbiekben láttuk a mikroarray kísérletek során mind a minták izolálására és megjelölésére, mind az array platform megválasztása és a hibridizációs elrendezés terén számos alternatív lehetőség áll a kutatók rendelkezésére, és ezek megválasztása nemegyszer szignifikáns módon befolyásolhatja a kísérlet független reprodukálhatóságát. Jól ismert probléma, hogy még azonos minták felhasználás esetén is jelentős diszkrepancia mutatkozik a különböző laboratóriumokban, vagy eltérő platformokkal azonosított génlisták között (178). Öt különböző platformmal kapott eredménye összehasonlítása során, Kuo és tsai. (179) például 0.63-0.92 közötti Spearman korrelációt találtak az expressziós hányadosok esetén. Egy másik tanulmányban csak minimális hasonlóságot tudtak kimutatni az Affymetrix és a cDNS arraykkel nyert eredmények között (180). Ezért került megalkotásra a mikroarray kísérletek

minimális

leírását

(Minimum

Information

About

a

Mikroarray

Experiments, MIAMI) szabályozó protokoll (181). A MIAMI kritériumok rögzítik, hogy a szerzőnek be kell számolnia. Mára a MIAMI az általánosan elfogadott standard az array eredmények publikálásakor illetve a nyilvános adatbázisok megalkotásakor.

3.2.2.2

Az expressziós adatok normalizációja

Mielőtt az egyes arrayket és a különféle csoportokat össze tudnánk hasonlítani, normalizálnunk kell a nyers expressziós adatokat. A normalizációs lépésre azért van szükség, mert a hibridizáció és a minta előkészítés egyenetlensége függvényében is intenzitás különbség jelenhet meg az egyes mikroarraykkel mért értékek között. A normalizáció célja tehát az adatok egybehangolása, mégpedig úgy, hogy a kísérleti kondíciók által nem indukált génekre vonatkozó expressziós értékek azonosak legyenek a különböző arryaken. A normalizáció során két alapvető kérdést kell tisztáznunk: mely géneket figyelembe véve, és milyen algoritmussal kívánjuk az arrayket normalizálni (182). A

háztartási

(housekeeping)

génekhez

történő

normalizáció

során

feltételezzük, hogy e gének expressziója minden mintában állandó, függetlenül a kísérleti körülményektől. Sajnos az ilyen gének száma viszonylag alacsony az összes vizsgált gén számához képest, valamint eltérő kísérleti kondíciók között nagyban változik azon gének csoportja, amelyek expressziója állandónak tekinthető. A gének

expressziós

profilja

pedig

szövettípustól

függően

is

különbözhet,

egyes

háztartásgének expressziója lehet állandó az egyik szövetben, míg variábilis a másikban. A háztartásgénekhez történő normalizáció jelentősége ezért limitált, és használata esetén ajánlott ellenőrizni, hogy a háztartásgének normalizált expressziós értékeinek variabilitása valóban alacsony-e. Egy másik megoldás az úgynevezett „spiking”, amikor a hibridizálandó mintákhoz meghatározott mennyiség idegen RNS molekulát adunk, például élesztő RNS-t keverünk a humánhoz. Mivel az idegen gének egyik mintában sem expresszálódnak endogén módon, gyakorlatilag mesterséges háztartásgéneket hozunk létre, amelyek intenzitáskülönbségei révén könnyen detektálhatjuk az arrayk közötti technikai eltéréseket. Az Affymetrix arrayken számos ilyen külső kontroll gént használnak, amelyek nemcsak a normalizációban hanem a gének lokalizációjában is segítenek. A mára legelterjedtebb normalizáció algoritmusok azonban az arrayken megtalálható összes gén expressziós értékeinek felhasználásán alapulnak. Ezek a módszerek arra a feltételezésre épülnek, hogy a kísérlet során, egy véletlenszerű módon kiválasztott génszetben nagyjából azonos arányban találunk megemelkedett, valamint lecsökkent expressziót mutató elemeket. Tehát, ha ettől jelentősen eltérő eloszlást látunk, akkor az expresszós értékeket egy normalizációs faktorral korrigálnunk kell. Kettős jelölésű arrayk esetén tehát a k arrayn j gén normalizált, x expressziós érték a kiszámolható a: ⎛ R jk x jk = log⎜ ⎜G ⎝ jk

⎞ ⎟ − C jk ⎟ ⎠

képlet segítségével, ahol az R és G a Cy5 és Cy3 csatornákon mért jelintenzitások C pedig a normalizációs faktor. A globális, vagy lineáris normalizáció esetén ez a faktor minden génre azonos, míg az intenzitásfüggő és lokalizáció függő normalizációnál az expressziós értékektől és az arrayn való elhelyezkedéstől függően változik az egyes génekre. Mindkét esetben a normalizációs faktor arrayként különböző, tehát az egyes arrayket mindig külön, de azonos algoritmust követve normalizáljuk. Globális, vagy lineáris normalizációnál a normalizációs faktor megegyezik az intenzitás hányadosok mediánjával. A lineáris normalizáció azon a feltételezésen alapul, hogy a két fluoreszcens csatornán (vörös és zöld) beérkező jel a normalizációnál figyelembe vett próbák esetében egyenes arányosságot mutat

egymással. A globális normalizáció során tehát az arrayn található minden egyes próba expressziós hányadosát ugyanazon normalizációs faktorral módosítjuk, ahol a normalizációs faktor a normalizációs gének logaritmikus expressziós hányadosainak mediánjával egyezik meg. A tapasztalatok szerint, ez az egyszerű módszer igen megbízható azokban az esetekben, amikor a közös referencia és a kísérleti mintákban az expresszálódó gének száma és az expresszió nagyságrendje hasonló. Jó példája ennek, amikor egy adott szövetből származó tumor mintákat az azonos szövetből nyert normál referencia mintával szemben hibridizálunk. Amennyiben azonban a referencia és a kísérleti minta között a valós expresszióval bíró gének száma és eloszlása nagymértékben eltér (lsd. lép és agyminták egymás elleni hibridizációja), a relatív intenzitáson alapuló globális normalizáció nem hatékony (183). Egyes platfomok esetén a különböző fluoreszcens hullámhosszokon kapott jel hányadosa a jel intenzitásának függvényében is változik. Ezt legjobban az úgynevezett intenzitás hányados, vagy M-A grafikonon (Ábra 4) tudjuk szemléltetni, ahol az expressziós hányadost

⎛ R jk M jk = log⎜ ⎜G ⎝ jk

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

a két csatornán mért jelintenzitás (RNS mennyiség) függvényében

A jk =

1 (log(R jk ) + log(G jk )) 2

ábrázoljuk az adott array (j) egy bizonyos génjére (k). Amennyiben az expressziós adatpontok az M=0 egyenes mentén szimmetrikusan helyezkednek el, úgy további normalizációra nincs szükség (184). Ha az expressziós hányadosok által adott görbe az alapvonallal párhuzamosan, de az alatt vagy felett helyezkedik el, a lineáris normalizációs faktor megegyezik a 0-hoz képest történt pozitív vagy negatív irányú eltolódások mértékével. Végül, ha az expressziós hányadosok eloszlása valamilyen szöget zár be az alapvonallal, akkor célszerű a spektrális különbségeket figyelembe vevő intenzitás alapú normalizációs algoritmust használni. Ezek közül a súlyozott regressziós görbékkel (Loess smoother) történő normalizáció a legkedveltebb. Az intenzitás alapú normalizációs módszerek hátránya, hogy a relatív kevesebb expressziós

értéket

tartalmazó

intenzitás

tartományokban

az

expressziós

hányadosokat túlkorrigálja, ami akár a releváns információ elvesztéséhez vezethet (130).

A

B

Δ

Ábra 4 : A mikroarray adatok intenzitásfüggő normalizációja. Az M-A grafikonokon a x tengelyen a Cy3 és Cy5 jelintenzitások átlagát (M) az y tengelyen a log2 transzformált expressziós hányadosokat ábrázolja. (A) A normalizáció előtt az expressziós hányadosok eloszlása az alapvonaltól tendenciózusan eltérhet (Δ). (B) A Loess faktorral történt normalizáció után viszont, az alapvonal mentén szimmetrikus eloszlást mutat. A nyers fluoreszcens szignál normalizációjára az egyféle jelölést alkalmazó mikroarray platformok (Affymetrix, Illumina) esetén is szükség van, hiszen a kísérletek során keletkező zaj torzíthatja a próbaintenzitások eloszlását. Az Affymetrix MAS szoftver által is alkalmazott lineáris normalizáció ez esetben is a legegyszerűbb megoldást kínálja. A GeneChip arrayk kiértékelésére az úgy nevezett quantile normalizáció is széles körben elterjedt. A Bolstad és tsai. által kidolgozott algoritmus azon a sejtésen alapul, hogy bár az individuális expressziós értékek eltérhetnek az egyes arrayk között, az intenzitások eloszlása az összes próbára vonatkoztatva relatíve hasonló a arrayk között. A normalizáció során minden vizsgált arrayn meghatározzuk a génre a k-dik, legalacsonyabb expressziós értéket Xj(k). Ezekből az arrayk között átlagot vonunk X(k). Ezután minden arrayn a Xj(k) értéket behelyettesítjük az

X(k)-val. A szignál intenzitás eloszlása tehát minden arrayn

azonos, hiszen ugyanazokon az expressziós hányadosokon osztoznak, de az X(k) intenzitást mutató, k-dik gén a különböző kísérleti kondíciók között ugyanakkor más és más lesz (www.berkeley.edu/~bolstad/stuff/qnorm.pdf ). 3.2.2.3

Az expressziós analízis statisztikai alapjai

A biológiailag szignifikáns expressziós mintázatok meghatározására használt statisztikai módszerek részletes ismertetése meghaladja e dolgozat kereteit. Az adatelemzés legtöbbször nem egy előre meghatározott rutin protokoll szerint halad. Az egyes kísérletekben, a megválaszolandó kérdés és a kutató személyes tapasztalata függvényében más és más statisztikai eszközök kombinációjának alkalmazása jelenti az optimális megoldást. A mikroarray adatok kiértékelése során két, lényegében különböző elemzési stratégia közül választhatunk. Ha a biológiai, vagy klinikai változók alapján előzetesen definiált csoportok közötti jellegzetes expressziós különbségek meghatározása az elemzés célja, akkor az összehasonlító statisztika (class comparison) teszteket alkalmazzuk. Amennyiben viszont, a vizsgált minták, vagy gének halmazán belül az expressziós mintázat perturbációi alapján kívánunk új csoportokat beazonosítani, akkor a csoportfelismerő (class discovery) módszereket használjuk (185). A csoportfelismerő módszerek egyik leggyakrabban alkalmazott válfaja a hierarchikus klaszter elemzés (186). A minták közötti hasonlóság fokát az expressziós profilok közötti korreláció alapján felépített dendogramokon ábrázoljuk. Az egyes profilok közötti hasonlóság mértékét többféle módszer alapján (Pearson korreláció, Euklideszi távolság, Manhattan távolság) is kiszámolhatjuk.

A k-mean klaszter

elemzés során nem a hasonlóság szekvenciálisan csökkenő mértéke alapján rendezzük el a vizsgált mintákat, hanem az előre megadott (k) számú centroid körül próbáljuk őket koheziv csoportokba elosztani (187). Egy adott adatpont és a legközelebbi centroid távolságát itt is az Euklideszi távolságból kalkuláljuk ki. Népszerű még a Self-Organizing Map (SOM, Ábra 5) a k-mean klaszterezéshez hasonló machine learning algoritmus (188). Az multidimenzionális expressziós adatok komplexitását csökkenteni tudjuk a principal component elemzése során. Az adatokat, a legnagyobb varianciát mutató komponensből számított súlyozott vektorokkal, egy alacsonyabb dimenziójú matematikai térbe transzformáljuk. Az ebben a térben számolt euklidészi

távolságok

alapján

pedig

az

adatpontok

hasonlóságának

fokát

ábrázoló

háromdimenziós térképet készíthetünk (174).

Ábra 5 : Self-organizing map (SOM) klaszter elemzés. Az ábrán a HGF kezelt primer hepatocitákban szignifikáns regulációt mutató gének SOM klaszter elemzésének eredménye látható. A SOM algoritmus a kiválasztott géneket a kezelési idő függvényében, egységes transzkripciós mintázattal rendelkező, csoportokba sorolta. A előre definiált csoportok közötti szignifikáns különbségek extrakciójához használt módszereknél az egyszerű t-teszttől a permutációs algoritmusokig széles skálán válogathatunk. A mikroarray elemzésnél azonban figyelembe kell vennünk, hogy több tízezer változót is vizsgálunk egyszerre (185). Ilyenkor nem elég csak a statisztikai szignifikancia küszöbértékét megadni, mivel a hamis pozitív változók szelekciójának esélye magas. Ezért olyan metodika alkalmazása javasolt, amivel a hamis pozitív változók arányát az összes szignifikáns változón belül kontrollálni tudjuk. Erre alkalmasak lehetnek a Bonferoni közelítésen, vagy multivariáns permutáción alapuló tesztek (189). Az így definiált csoportok stabilitását különféle predikciós (class prediction) algoritmusokat alkalmazva (SVM, LDA, NN1 stb.). egy független, ellenőrző teszttel szükséges validálnunk. Az egy betegcsoportra jellemző regionális, valamint a használt technológiából adódó tendenciózus eltérések még így is gyakran vezetnek a predikciós modellek diszkriminációs hatékonyságának túlbecsléséhez (overfitting) (190).

3.3

A funkcionális genomika szerepe az emberi májrák patogenezisének

vizsgálatában A mikroarray alkalmazások széleskörű elterjedésével a génexpresszió globális vizsgálata az emberi májrákokban is elérhetővé vált. A közelmúltban számos tanulmány született, amelyek az egyes klinikai paraméterekkel (virális etiológia, cirrhózis stb.) összefüggést mutató gének csoportját próbálták meghatározni (191). Ígéretes próbálkozások történtek a génexpresszió alapuló, a klinikai kimenetelt, esetleg az áttétképződés valószínűségét megjósolni képes perdikciós modellek létrehozására is (192). A májelváltozások transzkripciós elemzése tehát számtalan olyan molekuláris alkalmazást rejt magában, amelyek a jövőben kiegészíthetik a jelenleg döntően a májbiopsziákon alapuló diagnosztikai lehetőségeket. Emellett új terápiás célpontok és diagnosztikus, vagy egyéb markerek azonosítását is remélhetjük a mikroarray alapú módszerek rutin alkalmazásától. Az emberi máj transzkripciós profilja igen komplex. Az agy után a legtöbb gén, a teljes humán transzkriptum 25-40%-a a májban expresszálódik. Az alternatív splice variánsokkal együtt ez mintegy 100,000 különböző transzkriptumot jelent (193). Ezen transzkriptumok 15-30%-ának funkcióját részben ismerjük, de a májsejtekben ismert funkcióval bíró gének száma ennél jelentősen kisebb (194). A májszövetből izolált RNS minták hepacitákból, Kupffer sejtekből, szinuszoidális endotélből,

epeutakból

és

gyulladásos

sejtekből

származó

transzkriptumok

keverékéből állnak. Bebizonyosodott, hogy a teljes RNS mennyiség 90%-a hepatocita eredetű (195). A májban átíródó gének expressziós szintje emellett az elváltozást nem mutató mintákban is jelentős variabilitást mutathat. Ennek hátterében az individuális genetikai eltérések és környezeti faktorok együttes hatása áll. Normál májminták mikroarray elemzése azt mutatta, hogy a vizsgált 2418 génnek csak mintegy fele, 1212 gén átíródása volt egységes a négy minta között (196). Egy másik tanulmány szerint a normál májmintákban expresszálódó gének 2.6%-4.6%-a mutatott legalább 2,5-szeres

transzkripciós

szintkülönbséget

valamelyik

mintában

a

többihez

viszonyítva (197). Saját eredményeink alapján ugyanakkor a normál mintákban tapasztalt expressziós variabilitás szintje jóval alacsonyabb, mind a cirrhotikus, mind

a májkarcinóma mintákban tapasztaltakhoz képest, és a betegcsoportok azonosítását nem befolyásolta (198).

3.3.1

Génexpressziós analízis krónikus hepatitisben Krónikus HBV és HCV hepatitisben szenvedő betegek májából származó

expressziós profilokat a normál májhoz hasonlítva, arra derült fény, hogy a HCV fertőzés során elsősorban az anti-inflammatórikus, sejtproliferációs, és antiapoptotikus gének expressziója változik (199). A HCV kiváltott cirrhózisban emellett a fibrózis kialakulását segítő PDGF és TGFβ3 gének átíródása is megnőtt. Ugyanebben a tanulmányban sikerült a HCV citopatikus hatásában közvetlen szerepet vállaló géneket (Frizzled-kötött fehérjék, DDR1, SARP3) is azonosítani (200). Smith és tsai. normál, valamint HCV fertőzés talaján kialakult cirrhotikus és HCC minták expresszióját vizsgálták (201). Először a normál májban magas variabilitást, illetve a tumor indukált expressziós profilt, mutató géneket zárták ki a további adatelemzésből. A megmaradt gének közül a HCV specifikus transzkripciós mintázattal rendelkezőket funkciójuk alapján tovább rendszerezték. A mintázat nagy részét a limfociták és makrofágok aktivációjában, az extracelluláris mátrix átrendeződésében, a sejt-sejt közötti kapcsolatokban, a Bcl2 szabályozott anti-apoptótikus útvonalban és az interferon válaszban involvált gének tették ki. Akkutan és krónikusan HCV fertőzött csimpánzok májából vett rendszeres biopsziák expressziós elemzése során az interferon (IFN-α és IFN-γ)

válasz gének és az antigén feldolgozásban és

prezentációban szerepet játszó gének mutatták a legmarkánsabb eltérést. A krónikus HCV fertőzött és az egészséges állatok májából származó minták között összesen 162 gén expressziója mutatott szignifikáns különbséget (202). A nem alkoholos szeteatohepatitis eredete inzulin rezisztenciára és ehhez kapcsolódó mitokondriális diszfunkcióra vezethető vissza. Sreekumar és tsai. hat betegben vizsgálták a NASH-ra jellemző transzkripciós eltéréseket. A NASH következtében cirrhotikus májakat HCV és primer biliáris cirrhozisban szenvedő betegekből származó illetve egészséges kontroll mintákkal hasonlították össze (203). A NASH mintákban négy gén specifikus túltermelődését és tizenkét gén represszióját sikerült kimutatni. Az alacsonyan expresszált gének többsége a mitokondriális metabolizmusban, a megnövekedett expessziót mutató gének az inzulin rezisztencia kialakulásában tölthetnek be szerepet. Egy másik tanulmányban huszonkilenc NASH

betegtől (12 csak szteatohepatitisben szenvedő, 7 elhízott, és 6 egészséges kontroll) származó mintát vetettek alá mikroarray elemzésnek (204). Az elhízás által indukált gének beazonosításának érdekében a elhízott betegekből származó értékeket a NASH és a sovány kontroll profilokkal is összehasonlították. A NASH mintákban 34 gén mutatott szignifikáns expressziós eltérést, melyek közül 19 volt a szteatohepatitsre specifikus, 15 pedig a lipid metabolizmushoz és a mátrix átépüléshez volt kapcsolható. A differenciáltan expesszálódó gének közül a májregenerációhoz szükséges FGL1 magas, az oxidativ stressz elleni védekezésben szerepet kapó adrenomedullin és az α-foetoprotein pedig alacsony expressziót mutattak (204). Bariátrikus műtéten átesett betegek mája a nem alkoholos zsírmájhoz (NAFLD) hasonló elváltozást mutat. Kilencvennyolc ilyen mintát vizsgálva 22 gén mutatott szignifikáns expressziós eltérést az elhízott kontroll csoporthoz viszonyítva (205). Ezek között számos, az endoplazmatikus retikulumban található, detoxifikáló (GST, SULT1A2) és fibrózist elősegítő (CPSG2, MMP2, FIGF) gén identifikálható.

3.3.2

Májkarcinómákban megfigyelt génexpressziós eltérések A májrákot megelőző prekurzor léziók és a korai HCC-k közötti

különbségtétel gyakran komoly diagnosztikus kihívás elé állítja a patológust. Számos immunhisztokémiai markerről (gyplican-3, HSP70, hTERT, STK15) jelentették, hogy expressziója a korai májrákokra specifikus. Egy 13 tagú, RT-PCR által detektált, génszet szintén jól hatásfokkal volt képes a rosszindulatú elváltozások azonosítására (206). Nam és tsai. HBV fertőzött betegekből származó minták mikroarray elemzése alapján, egy 120 génből álló predikciós modellt javasoltak a diszplasztikus léziók és a korai májrákok megkülönböztetésére (207). Mi a pre-neoplasztikus elváltozások komparatív genomikai elemzése során azt láttuk, hogy a malignus traszformáció együtt jár a c-myc szabályozott célgének transzkripciós aktivációjával. A primer májrákok a gyakorlatban jelenleg is használt osztályozási rendszerei (Barcelona-Clinic Liver Cancer staging) klinikai és patológiai változók értékein alapulnak. A betegek általános klinikai státuszának, a máj funkcionális kapacitásának és a tumor stádiumának figyelembe vételével az osztályozási rendszerek alkalmasak a legmegfelelőbb kezelési stratégia kiválasztására (208). Általánosan elfogadott molekuláris klasszifikációs rendszer azonban a májkarcinómák esetében még nem került kidolgozásra.

A HCC transzkriptumot vizsgáló tanulmányok többsége mindezideig arra törekedett, hogy a klinikai, vagy szövettani paraméterek alapján előzetesen meghatározott csoportok közötti különbségeket meghatározza. A mikroarray technika segítségével már eddig is számos, az etiológiai faktorral (209), a betegség stádiumával (210), a kiújulás valószínűségével (198, 211, 212) és a túléléssel (198, 212) korrelációt mutató expressziós mintázat került publikációra. Ezek a tanulmányok egyben kiváló bizonyítékai a morfológia, a tumor fenotípus és az expressziós mintázatok közötti szoros összefüggésnek.

A HCC-k új, tisztán genomikai

osztályozása egyelőre várat magára. Lee és tsai. elsők között dolgoztak ki olyan perdikciós modellt, amely egy 406 „osztályozó” gén expressziós mintázata alapján képes volt a májrákban szenvedő betegeket jó és rossz prognózisú csoportokba sorolni (212). Ezen prognosztikus csoportok egyben az ubiquitináció, az apoptózis és a hiszton

modifikáció

mértékében

is

szignifikáns

eltérést

mutattak,

részben

magyarázatot adva a drámaian különböző biológiai viselkedésre. A HCC betegek túlélésének vizsgálatakor mindig figyelembe kell vennünk, hogy e betegek jelentős hányada a tumortól függetlenül is előrehaladott májelégtelenségben szenved, ami önmagában is lehet a halál oka.

Felmerül ugyanakkor az a kérdés is, hogy a

génexpresszió ilyen globális változása valójában jól körülírható szabályozó mechanizmusok specifikus eltérését, eltérő szöveti eredetet, vagy esetleg a proliferativ aktivitást mutató sejtek eltérő arányát reprezentálja-e. Ez utóbbi esetben a génexpresszión alapuló klasszifikáció valójában a tumor fenotípussal (grade) mutat igazi összefüggést. Az agresszívabb fenotípus egyben magyarázatot ad a túlélésben látott drámai különbségekre. Ha tehát a transzkripciós profilok elsősorban a tumor fenotipust, nem pedig az annak hátterében álló genetikai eltérést reprezentálják, hasznosságuk a célzott terápiák irányításában kérdésessé válik. Lényeges elem, hogy az eddig ismertetett klasszifikációs rendszerek az adott minták halmazán belüli relatív expresszión alapulnak (lsd. az expressziós értékek mediánhoz igazítása). Így bár alkalmasak a relatív különbségek kihangsúlyozására, abszolút küszöbértékek hiányában,

diagnosztikus

szempontból

nehezen

értelmezhetők.

Egy

másik

munkacsoport, 40 betegből származó 67 párosított primer és metasztatikus HCC összehasonlítása után, az intra-hepatikus áttétképzéssel összefüggést mutató, 153 génből álló transzkripciós mintázatot határozott meg (192). Ez a génszet alkalmas volt a metasztatikus és primer tumorok közötti különbségtételre, és ez által a prognózis felállítására. Bár a májkarcinómák sebészi rezekciója az esetek egy részében kuratív,

az ezt követő három évben a tumorok mintegy 50%-a mutat rekurrenciát. Szatelita léziók, vaszkuláris invázió és a rosszul differenciált szövettani kép mind elősegítik a tumorok kiújulását. A rekurrencia mikroarrayvel történt vizsgálata során egy 12 génből álló mintázat 90%-os pontossággal volt képes a rekurrenciára hajlamos HCC-k azonosítására (211). Egy ettől független tanulmányban 3072 gén expressziójának 100 HCC-ben PCR alapú detektálása alapján, a szerzők egy 20 gént alapul vevő algoritmust javasolnak a májrák kiújulásának perdikciójára (213).

3.3.3

Komparatív genomikai elemezések A komparatív genetikai elemzések során az egymással rokonságban álló fajok

közötti genetikai hasonlóságot vizsgáljuk. Az orthológ genomi szekvenciákat párba állítva beazonosíthatjuk azokat a nagyfokú egyezést mutató, funkcionálisan nélkülözhetetlen szakaszokat, amelyek az evolúció során konzerválódtak (214). Ez a stratégia lehetővé tette új gének és át nem íródó szabályozó szakaszok azonosítását. Alapos okunk van tehát feltételezni, hogy ahogy a genomi szabályozó elemek, úgy az adott stimulusok hatására bekövetkező transzkripciós válasz is konzervált lehet a rokon fajok között. A genetikailag módosított egér modellek már eddig is nagymértékben elősegítették a karcinogenezis folyamatában szerepet játszó gének funkciójának megértését (84). A közelmúltban több tanulmány is vizsgálta humán és az egerekben kifejlődő tumorok expressziós mintázata közötti hasonlóság mértékét. Elsőként Ellwood-Yen és tsai. próbálkoztak meg Myc transzgenikus egerekben kialakuló prosztata rákokból, és humán prosztata mintákból származó expressziós adatok integratív elemzésével (215). Ennek során azt találták, hogy a humán tumorokban megfigyelt konzervált mintázat hasonlóságot mutat, a Myc transzgén által indukált génexpressziós profillal. Ez a megfigyelés lehetővé tette azon prosztatarákok azonosítását, ahol a tumor progresszió hátterében, legalább részben, a Myc onkogén amplifikációja, vagy más módon történő aktivációja állhat. SweetCordero és tsai. demonstrálták, hogy az egérmodellből extrahált KRAS expressziós mintázat akkor is sikerrel alkalmazható a humán tüdő adenokarcinómák diverzifikációjára, amikor önmagában vizsgálva a KRAS gén mutációja nem eredményezett specifikus transzkripciós eltérést (216). Annak érdekében, hogy meghatározzák a humán karcinogenezist legjobban modellező kísérletes konstrukciót, Lee és munkatársai hétféle transzgén, kettős

transzgén és kémiai májkarcinóma modell mikroarray elemzését végezték el. Az így kapott expressziós adatokat, az orthológ génekkel végrehajtott standardizáció után, egyesítették a humán májkarcinómákkal. Az expressziós profilok korrelációs térképe alapján megállapították, hogy a Myc/Tgfα és a dietilnitrozamin (DENA) indukált egér tumorok a rosszabb prognózisú, az E2F, Myc/E2F, és Myc transzgenikus tumorok a jobb prognózisú májrákokkal mutattak domináns hasonlóságot (217). Ezzel szemben az Acox1 KO és ciprofibrát kezelt modellek sajátos, az emberi májrákoktól jelentősen eltérő transzkripciós mintázattal rendelkeztek. Vitatható azonban, hogy ennek a jelenségnek a hátterében vajon a peroxiszóma proliferátor ágensek által indukált egyedi metabolikus válasz, vagy a humán és egér tumorok pathomechnizmusa közötti fundamentális

eltérés

áll-e.

Hasonló

klasszifikációs

stratégiát

követve

a

májkarcinómákon belül fellelhető további csoportok is megkülönböztethetővé válhattak. A patkány hepatoblasztok intra-uterin differenciálódása során szignifikáns regulációt mutató gének expresszióját humán HCC-kben vizsgálva sikerült a májkarcinómákon

belül

egy,

valószínűsíthetően

progenitor

sejt

eredetű,

szubpopulációt beazonosítani. Ezekre, a tumorokra, egyes máj őssejt markerek (CK19, AFP) expresszióján túl, az agresszív fenotípus és rövid túlélés is jellemző volt (198). Napjainkban számos, az onkogenikus útvonalakat specifikusan támadó, új rákellenes készítmény áll klinikai tesztelés alatt (218). A bcl-abl fúziós kináz inhibitora az imatinib (219), az EGFR tirozin kináz gátló erlotinib (220), és a VEGF elleni monoklonális antitest, a bevacizumab (221), fázis II kipróbálása előrehaladott stádiumú májrákos betegeken jelenleg is zajlik. A legbiztatóbb klinikai eredményeket eddig a multi-kináz ihibitor sorafenib-bel érték el, amely a fázis III vizsgálatok során szignifikánsan javitotta az előrehaladott stádiumban lévő májrákos betegek túlélését (20). szerek rutin klinikai alkalmazása, új fejezetet nyithat a gyógyszeres kezelésben, amire ez ideig igen csekély lehetőség volt. Az elkövetkezőkben olyan diagnosztikus metodikák kifejlesztése a cél, amelyek az expressziós és genetikai adatok integrációja segítségével képesek a májkarcinómák eltérő csoportjaiban a tumor progresszióját vezérlő patofiziológiai elváltozások lokalizációjára. Ez valóban elérhetővé tenné, hogy olyan egyénre szabott, célirányos terápiás kombinációkat alkalmazzunk, amelyek jelentős mértékben javíthatják a primer májkarcinómában szenvedő betegek jelenleg rendkívül rossz életkilátásait.

4.

1)

Célkitűzések

Rutin szöveti fixációs metodikák hatása a patológiai minták expressziós analízisére. Vizsgáltuk, hogy a különböző rutin szövettani fixációs metodikák (formalin, aceton, etanol) milyen mértékben őrzik meg a szövetekben az mRNS integritását, valamint azt, hogy real-time RT-PCR segítségével lehetséges-e az ily módon archivált tumor minták transzkripciós analízise.

2)

A kis mennyiségű biológiai minták oligonukleotid mikroarray alapú expressziós analízisét lehetővé tevő lineáris RNS sokszorozási technológia kifejlesztése. Célul tűztük ki olyan mRNS amplifikációs metodika kifejlesztését, amely kétkörös virális RNS polimeráz (T7 és T3) amplifikációt alkalmazva sense szekvenciájú RNS terméket generál, és felhasználható aminoallyl jelölt cDNS szintézisére.

3)

A T7T3 lineáris RNS sokszorosítás reprodukálhatóságának és megbízhatóságának vizsgálata. Bizonyítani kívántuk, hogy a T7T3 metodika lehetővé teszi igen kis mennyiségű, lézer mikrodisszektált szöveti minták mikroarray analízisét oly módon, hogy az amplifikáció eredménye reprodukálható és jól korrelál az amplifikáció nélküli mikroarray kísérletekben kapott génexpressziós értékekkel. Ezáltal jól alkalmazható kisméretű hepatikus léziók vizsgálatára.

4)

A HGF/c-Met jelátviteli útvonal által transzkripciós szinten regulált célgének

azonosítása

genetikailag

módosított

egérmodell

segítségével. Célunk volt, hogy c-met kondicionális knock-out és kontroll

egerekből

izolált

primer

hepatociták

génexpresszióját

rekombináns HGF kezelés után különböző időpontokban (30 perc, 2, 12 és 24 óra) mikroarrayvel vizsgálva feltérképezzük, és meghatározzuk a HGF/c-met jelátviteli útvonal aktivációja által indukált hepatocita specifikus transzkripciós választ.

4. Célkitűzések

5)

HGF májsejtekben betöltött fiziológiás hatásának elemzése a célgének funkcionális klasszifikációjával. Vizsgálni kívántuk, a HGF célgének funkcionális klasszifikációja alapján, a HGF/c-Met útvonal aktivációjának hatását a májsejtek fenotípusára és homeosztázisára.

6)

Humán hepatocelluláris karcinóma molekuláris klasszifikációja összehasonlító funkcionális genomikai módszerekkel. A komparatív funkcionális genomikai elemzést alkalmazva az elsők között vizsgáltuk a genetikailag módosított egérmodellben beazonosított HGF/c-Met specifikus célgének expressziós profilját humán hepatocelluláris, karcinómákban és azonosítottuk a humán tumorok azon alcsoportját, ahol a c-Met aktiváció részvétele a tumor patogenezisében kimutatható.

7)

A c-Met útvonal aktivációjának a humán májrák patogenezisében betöltött szerepének vizsgálata. Az expressziós mintázat alapján a HGF/c-Met útvonal aktivációját mutató májrákoknak a többi tumorral való összehasonlító klinikopatológiai elemzése során feltártuk azon változók csoportját, amelyek összefüggést mutatnak a génexpressziós mintázattal.

8)

Génexpressziós mintázaton alapuló prediktiv statisztikai modell megalkotása. Célunk volt, hogy a c-Met indukált génexpressziós mintázat és túlélés korrelációja alapján, olyan predikciós modellt alkossunk, ami képes a HCC betegek prognózisának előrevetítésére.

5.

5.1

Módszerek

Humán edometriális minták gyűjtése és feldolgozása A tizennyolc hiszterektómiai minta mindegyikét háromfelé osztottuk, és

fixáltuk a három különböző fixálószer valamelyikében. Minden mintát a regionális etikai bizottság engedélyével és a fennálló jogszabályokkal összhangban kezeltünk. A hiszterektómia minták jóindulatú méhelváltozásban szenvedő, menopausa előtt lévő 35-43 év közötti betegekből származtak, akik a beavatkozást megelőzően semmilyen hormonkezelést nem kaptak. A szerv kivételét követően a mintákat tizenöt percen belül makroszkópos patológiai vizsgálatra kerültek, ahol a szakképzett patológus az alkalmas területből 10 x 10 x 5 mm-es szöveti mintákat vett és azokat azonnal a fixáló oldatba helyezte.

5.1.1

Formalin fixálás A szövetdarabokat 5-5 ml friss 10% pufferelt (pH 7.0) formalinban 24 órán át

szobahőmérsékleten (22 oC) fixáltuk. Ezt követően a mintákat 6 x 10 percen keresztül felszálló alkohol sorral (50%, 75%, 2 x 96%, és 2 x 100%) valamint 2 x 15 perc xylol inkubáció során patológiai szövet processzorral (Shandon Hypercenter XP) dehidráltuk. A paraffinba ágyazás során a mintákat először két órán át 56 oC-os paraffinban (Reanal), majd egy éjszakán át friss paraffinba merítve kezeltük.

5.1.2

RNAlater valamint aceton fixálás Az aceton kezelt minták 5 ml friss CuSO4 szaturált szobahőmérsékletű

acetonba (Reanal) kerültek 15-60 perc közötti időtartamra. Ezt, közvetlenül, 2 x 15 perces xylol kezelés követte. A minták harmadik csoportját RNAlaterben 24 órán át szobahőn (22 oC) inkubáltuk. A RNAlater fixált minták dehidrációja, illetve a paraffin kezelés az összes minta esetén megegyezett a formalin fixálásnál korábban leírt lépésekkel.

5.1.3

Szövettani vizsgálat A minták szövettani vizsgálatát két szakorvos egymástól függetlenül vakon

végezte. A paraffinba ágyazott szöveti blokkokból 3 µ vastagságú, hematoxylin-eosin festett metszetek készültek, a standard diagnosztikus protokollnak megfelelően. A szövettani vizsgálat során azon proliferativ fázisban lévő normál endometrium minták kerültek kiválasztásra, amelyek nem mutattak kórós elváltozást. A továbbiakban a fenti kritériumoknak megfelelő öt esetet vetettük alá részletes molekuláris elemzésnek. A minták prezervációja, a festés intenzitása, nem szerepeltek a szelekciós szempontok között. A morfológiai paraméterek statisztikai összehasonlítására MannWhitney U tesztet használtunk.

5.2

Humán hepatocelluláris karcinóma minták Normál kontrollként tizennyolc, metasztatikus vastagbélrák vagy közlekedési

baleset miatt májrezekción átesett betegekből származó tumormentes mintákat használtunk. A humán arrayken használt hibridizációs kontroll mintát a normál májakból izolált RNS-eket egyenlő arányban összekeverve állítottuk elő. A 139 hepatocelluláris karcinóma mintát és 60 párosított tumormentes környező májból vett mintát, 138 lobektómián átesett májrákos betegből izoláltuk. A tumorok között virális (HBV, HCV), toxikus és örökletes anyagcserezavar (hemokromatózis, α1-antitripszin hiány) hátterén kialakulók is megtalálhatóak voltak. Hetven beteg estében tumor közeli májból származó nem tumor minta is elérhető volt. A tumor minták Kínából, Belgiumból és a Mayo Clinic-ről, a normál májminták pedig a Pittsburghi Egyetemről származtak. A szövetek tárolása és felhasználása az összes érintett intézet kísérleti bizottsága által jóváhagyottan történt. A humán mintákból a teljes RNS-t CsCl gradiens centrifugálással izoláltuk meg (212).

5.3

5.3.1

Állatmodellek

Myc és Myc/Tgfα transzgénikus egérmodellek

Az RNS amplifikációs kísérletek során használt Alb c-myc monotranszgén és az Alb c-myc/ MT TGF-α kettős transzgén egér törzsek létrehozásának részletes leírása, valamint az ezekre az állatokra jellemző patológiai elváltozások összefoglalása szorosan nem kapcsolódik a dolgozat témájához, de korábbi közleményekben elérhető. A májkarcinóma mintákat nyolc hónapos állatokból gyűjtöttük. A negatív kontroll minták két B6/CBA genotípusú egér májból kerültek felhasználásra. Minden állatkísérleti eljárás a National Institutes of Health állatkísérletekre vonatkozó irányelvei szerint került végrehajtásra.

5.3.2

A c-Met kondicionális knock-out állatmodell létrehozása A c-Met receptor kondicionális knock-out egérmodell létrehozása során a c-

Met gén 16-os exonja került módosításra a Cre-loxP metodika felhasználásával. A cMet 16-os exonját megcélzó gén konstrukttal a 16-os exon megelőző intronba egy loxP felismerőhelyet, míg az exont követő intronba egy flox szakasz határolt neomicin rezisztencia gén szakaszt juttatunk be HM-1 embrionális sejtekben (Ábra 6). Az így létrehozott c-Metwt/t állatoknak EIIaCre egerekkel történő keresztezése cMetwt/Δ16 és c-Metwt/flox genotípusú vonalakat eredményezett. A további keresztezések során homozigóta c-Metflox/flox és c-MetΔ16/Δ16 genotípusok jöttek létre. Az Alb-Cre törzsben a Cre rekombináz expresszióját a humán albumin gén promótere szabályozza, így a Cre indukált deléció a posztnatális májsejtekre specifikus. A cMetflox/flox és Alb-Cre vonalak párosítása tehát olyan Alb-Cre+/- / c-Metflox/wt heterozigóta egereket produkált amelyek beltenyészetével létrejöttek az Alb-Cre+/- / cMetflox/flox kondicionális KO és a kontrollként használt Alb-Cre+/- / c-Metwt/wt genotípusok.

A

génvonalakat

129SV/C57BL/6

törzs

háttéren

az

alom

beltenyészetével tartottuk fenn. Az állatok genotipizálása a farokvégekből izolált DNS segítségével, PCR és Southern-blott analízissel történt (Ábra 7).

Ábra 6 : A c-Met indukálható delécióját lehetővé tévő génkonstrukt felépítése. A c-Met gén 16-os exonja köré két flox rekombinációs helyet építettünk be. A transzformált klónokat a neomicin rezisztencia alapján azonosítottuk. Amikor a hepatocitákban a humán albumin promóter által vezérelt Cre rekombináz expressziója beindul a c-Met foszforliációs helyét kódoló 16-os exon kivágódik, és a génről a továbbiakban csak trunkált, diszfunkcionális fehérje keletkezik Factor és tsai. alapján (222).

5.3.3

Egér primer májsejtek izolálása és kezelése sejtkultúrában A primer májsejtek izolálásához két lépcsős kollagenáz emésztést

használtunk. A kontroll és a c-Met knock-out egerek máját először a vena cava inferioron keresztül öt percig 10mM HEPES-t és 0.2 mM EGTA-t is tartalmazó kalcium és magnézium mentes Hanks oldattal perfundáltuk, ezt követően pedig, tizenöt percen át, 10mM HEPES-t és 0.03% kollagenáz H-t tartalmazó William’s E mediummal perfundáltuk. A kollagenáz emésztést követően, az életképes májsejteket (~95%) az egyéb sejt frakcióktól percoll sűrűség gradiensen-centrifugálással választottuk el. Az így megtisztított májsejt frakcióból edényenként 2 x 106 sejtet a letapadást segítő médiumban 10 cm átmérőjű kollagénnel bevont sejtkultúra

edényekbe osztottuk szét. A sejteket 1:1 volumen arányban oldottuk fel a 6.25 µg/ml inzulint, 6.25 µg/ml transferrint, 6.25 ng/ml szeleniumot, 1.25 ng/ml bovin szérum albumint, 5.35 µg/ml linolén savat 2 mM glutamint, 30 µg/ml prolint, 1 mg/ml galaktózt, 18 mM HEPES-t, 1 mM nátrium-piruvátot, 1.4 x 10-2 M nátriumbikarbonátot és 10% foetális bovin szérumot (FBS) tartalmazó médiumban. Négy órás inkubáció után a letapadt sejteken a kezdeti médiumot szérum mentes médiumra cseréltük. A sejteket egy éjszakán át szérum mentes környezetben növesztettük, majd 50 ng/ml rekombináns humán HGF-fel kezeltük a fél, két, tizenkettő illetve huszonnégy órán át. A nem kezelt vad-típusú és c-Met-/- sejteket pedig 0 órás kontrollként alkalmaztuk. Minden kísérletet triplikátumban ismételtünk meg. A hibridizációs referenciaként pedig több B6/129 vad genotípusú egérből frissen izolált és összekevert primer májsejteket használtunk. A primer májsejtekből az RNS-t Trizol (Invitrogen) reagenst felhasználva izoláltuk. Röviden, a ~2 x 106 sejtet először 37 oC-ra melegített PBS oldattal kétszer megmostuk, majd tenyésztőedényenként 5 ml Trizol reagenst mértünk. A sejtek teljes lizise után a reagenst műanyag centrifugacsövekbe transzferáltuk és 1 ml kloroformmal összeráztuk. Az RNS-t tartalmazó vizes fázist centrifugálással választottuk el a lipid és fehérje frakcióktól. Majd a felülúszó vizes fázisból az RNS-t 5 ml izopropil-alkohol hozzáadásával kicsaptuk és 10 perc inkubáció után ismételt centrifugálással az RNS-t pellet formájában nyertük ki. Az RNS pelletet 1 ml 70%-os etanollal mostuk meg és RNáz mentes vízben oldottuk fel. Az RNS minták integritását és koncentrációját Bioanalyzer (Agilent) kapilláris elektroforézis készülékkel ellenőriztük a gyártó útmutatásai alapján.

PCR on hepatocytes

Southern blot

1 day

2 weeks 4 weeks 8 weeks

Fl

Fl

KO

KO

Fl

KO

Fl

Met KO brain liver

KO

1.7 kb

fl gapd

0.7 kb Ábra 7 : A c-Met indukált specifikus deléciója az érett májsejtekben.

A primer hepatocitákon végzett PCR elemzés demonstrálja, hogy a c-Met Alb-Cre rekombináz mediált kondicionális deléciója a nyolcadik posztnatális héten lesz teljes. A Southern-blotton pedig jól látható, hogy a deléció májsejt specifikus (222).

5.4

5.4.1

Egyéb kísérleti módszerek

Lézer mikrodisszekció A vad típusú és a transzgenikus egerek májából származó szövetminták OCT

médiumban (Sakura Finetek) kerültek beágyazásra és lefagyasztásra. A fagyasztott blokkokból 7 μm vastagságú metszeteket vágtunk, amelyeket kezeletlen üveg tárgylemezekre vittünk fel és a mikrodisszekcióig -80

o

C-on tároltunk. A

metszetkészítés, a szövettani festés és a mikrodisszekció azonos napon lettek végrehajtva, ezáltal minimalizálva az RNS degradációt. A festés során a metszeteket először 70%-os etanolban fixáltuk fél percig, majd diethylpirocarbon (DEPC) kezelt vízben 30 másodpercig rehidráltuk és alcian kék festékkel festettük 10 másodpercig. A mintákat ezután újból megmostuk DEPC vízzel és felszálló alkohol soron (50%, 75%, 95% és 100%. mindegyikben 20 másodperc) dehidráltuk. Ezután a metszeteket xilán oldatban tartottuk egy percig, majd a gyors mozgatással a levegőn megszárítottuk őket. A mikrodisszekcióhoz az Arcturus PixCell IIe (Arcturus) lézer mikrodisszekciós készüléket használtuk. Mind a tumorsejtek, mind a normál minták mikrodisszekciója során ezer darab, 30 μm átmérőjű impulzusnak megfelelő nagyságú területet vágtunk ki. Mintánként mintegy 3000-4000 sejtet gyűjtöttünk. A fixálás, a festés és a mikrodisszekció metszetenként mintegy 15 percet vett igénybe.

A

mikrodisszektált szövetmintákból történő RNS izoláláshoz PicoPure kittet (Arcturus) használtunk. A Dnáz emésztést az izoláló oszlopon hajtottuk végre. Az RNS koncentrációját NanoDrop ND 1000 (NanoDrop Technologies) spektrofotométerrel mértük meg. Az RNS integritását pedig Bioanalyzer (Agilent) készülék segítségével ellenőriztük le.

5.4.2

Immunhisztokémiai festések

5.4.2.1

Claudin 4 és 7 immunfestés humán endometriális szöveteken

Az immunfestés során a claudin 4 és claudin 7 fehérjéket anti-claudin 4 monoklonális egér (329400, Zymed) és anti-claudin 7 poliklonális nyúl (349100, Zymed) antitestekkel detektáltuk. A primer antitesteket 1:100 hígításban egy éjszakán át 4 oCon vittük fel a mintákra, majd a másodlagos antitesttel és a sztreptavidin-biotinperoxidáz reagenssel (ABC kit, Novocastra) való inkubációt a gyártó utasításai szerint hajtottuk végre. A festés láthatóvá tételéhez acetil-karbazolium (Biogenex) kromogént használtunk. Az antigén feltárás során a mintákat a feltáró oldatban (Dako K5205) húsz percen keresztül mikrohullámú sütőben többször forráspontig hevítettük. Az endogén peroxidáz aktivitást 3% hidrogén-peroxid oldattal blokkoltuk. Negatív kontrollként, a nem specifikus festés kimutatására, a primer antitesttel nem inkubált mintákat használtunk, amelyek nem mutattak festődést. Az endometriális mirigyek festődésének intenzitását, a Florell és társai által ismertetett módon, szemikvantitativen értékeltük. A morfológiai paraméterek közül vizsgáltuk a (1) sejtmag és a (2) citoplazma részleteinek kivehetőségét, (3) a H&E metszeteken a szövetek általános prezervációját, (5) az immunfestés intenzitását, valamint (6) a minták diagnosztikus értékét. A kvantitálás során az egyes paramétereket a következő képen osztályoztuk: 1 (gyenge, nem megfelelő), 2 (közepes, elfogadható), 3 (jó, megfelelő). 5.4.2.2

Angiogenetikus markerek vizsgálata HCC mintákban

A humán c-Met receptor és az endoteliális sejtekre jellemző CD34 antigén fehérje szintű kifejeződését a humán májkarcinóma mintákban immunhisztokémiai festéssel vizsgáltuk. A MET+ és a MET- csoportokból 12 mintát festettünk meg. A kiválasztott formalin fixált és rutin módon paraffinba ágyazott blokkokból 5 µ vastagságú metszeteket vágtunk. A deparaffinációt követően az endogén peroxidáz aktivitást 3% H2O2 oldattal 20 percig blokkoltuk, majd a metszeteket, az antigén feltárása végett, 20 percen keresztül citrát pufferben (pH 6.0) többször forráspontig hevítettük. A nem specifikus kötődést okozó fehérjéket 30 percig 10%-os bovin szérummal blokkoltuk. A metszeteket, ezt követően, egy éjszakén át 4 oC-on inkubáltuk az 1:100 arányban higított CD34 (Zymed Laboratories) illetve c-Met

(Santa Cruz Biotechnology) primer antitestekkel. Az biotin jelölt másodlagos antitest és avidin-peroxidáz komplex felvitele a VECTASTAIN ABC Elite kit (Vector Laboratories) alapján történt. A specifikus festést végül DAB kromogénnel (Dako) tettük láthatóvá. Kontrollként a primer antitesttel nem inkubált metszeteket használtunk. A festést 10 darab 200-szoros nagyítású látótér vizsgálata után szemikvantitativen negatív (-), gyenge (+), közepes (++) és erős (+++) kategóriákba sorolással értékeltük ki. A mikrovaszkuláris denzitást a CD34 festés alapján határoztuk meg. A mintákban öt, CD34-gyel erőteljes pozitív festést mutató úgynevezett érképződési forró pontban az Image-Pro Plus v3 (MediaCybernetics) program segítségével vizsgáltuk a kapilláris sűrűséget. Az MVD-t mint az egy látótérre eső optikai denzitás (OD) átlagát (± standard hiba) fejeztük ki. Az MVD csoportok közötti összehasonlitáshoz Studen-t próbát használtunk, ahol a szignifikancia küszöböt p<0.01 határértéknél állapítottuk meg.

5.4.3

Valós idejű kvantitatív RT-PCR analízis A paraffinba ágyazott endometrium mintákból öt 10 µ vastagságú metszetet

vágtunk, majd ezekből a deparaffinizációt követően teljes a High Pure RNA Paraffin kit (Roche 3270289) felhasználásával teljes RNS-t izoláltunk. Az izolátumokból 0.5 µg teljes RNS-t (10 µl térfogatban) Mmulv reverz transzkriptáz (Applied Biosystems N8080127) enzimmel cDNS-re irtunk át. Az átírás során a mintákat tíz percig 42 oCon, ötven percig 42 oC-on és öt percig 95 oC-on inkubáltuk. A GAPDH és β-globin gének átíródásának (Táblázat 4) kvantitatív elemzése során, a PCR reakciókhoz 2 µl cDNS templátot használtunk. A 25 µl térfogatú reakcióelegy a 12.5 µl 2-szeres SYBR Green (Biorad 1708882) puffer hozzáadása után a két

primert 300 nmol/l

koncentrációban tartalmazta. Két perc 95 oC-on történt denaturáció után, minden mintával 40 PCR ciklust (60 másodperc 95 oC–on, 60 másodperc 60 oC-on, 120 másodperc 72 Co-on futtatunk le a Biorad iCyler Real-time PCR berendezésen. Az olvadáspont analízis során a mintákat 55 oC-ról 95 oC-ra hevítettük és a termékeket a jellegzetes disszociációs csúcs alapján azonosítottuk. A relatív kvantifikáció során a legkisebb amplikon hosszúságú GAPDH termék amplifikációját használtuk referenciaként. Az PCR reakciókat triplikátumban megismételtük és az egyes termékekre jellemező CT értékeket az ismételt mérések átlagából számítottuk ki. A

különböző módon fixált minták közötti relatív expressziós értékeket a Pfaffl és társai által kidolgozott Pairwise Fixed Reallocation Randomisation teszt alapján állapítottuk meg.

Gén (bp) GAPDH 121 GAPDH 225 GAPDH 406 B globin 166 B globin 310 B globin 536

Sense primer

Anti-sense primer

Amplicon hossz (bp)

cat tga cct caa cta cat gg

gaa gat ggt gat ggg att tc

121

gaa ggt gaa ggt cgg agt

gaa gat ggt gat ggg att tc

225

atg acc aca gtc cat gcc atc a

gct tga caa agt ggt cgt tga g

406

ccc ttg gac cca gag gtt c

gct cac tca gtg tgg caa agg

166

cac aac tgt gtt cac tag caa c

gct cac tca gtg tgg caa agg

310

ggt tgg cca atc tac tcc cag g

gct cac tca gtg tgg caa agg

536

Táblázat 4 : Az endometriális minták elemzéshez használt primerek. A paraffin beágyazott endometrium mintákon végzett RT-PCR elemzéshez használt primerek szekvenciái.

A mikroarray elemzésen átesett primer májsejt mintákban tíz gén átíródását kvantitatív PCR felhasználásával is ellenőriztük. Az RNS mintákban jelen lévő esetleges DNS szennyezést először a DNA-free (Ambion) kit útmutatásai alapján emésztettük el. A SuperScript (Invitrogen) kit segítségével húsz mikroliteres reakcióban három mikrogramm teljes RNS-t cDNS-re irtunk át. A kvantitatív PCR reakciókat egy ABI 7900HT (Applied Biosystems) készülékben futtattuk le. Minden 25 µl össztérfogatú reakció 12.5 µl kétszeres SYBR Green (Applied Bisosystems) PCR reakció elegyet, kétszer 400 nM primert és 1 µl cDNS mintát tartalmazott. A reakciókat tíz percig 95 oC–on, majd 40 cikluson keresztül 30 másodpercig 95 oC –on illetve 60 másodpercig 60

o

C–on inkubáltuk. A keletkezett PCR termékek

specificitását a reakció végén a specifikus olvadáspont meghatározásával is ellenőriztük. Az egér primer májsejtek esetén belső kontrollként a β2-mikroglobulin gén expresszióját vettük alapul. A minták közötti relatív expressziós hányadosokat, pedig a 2-ΔΔCT metodika alapján számítottuk ki (223).

5.4.4

Lineáris RNS amplifikáció Az RNS amplifikáció első körében a mikrodisszektált szövetekből nyert RNS

mintákhoz 1 μl, 100 ng/μl koncentrációjú, T7oligo(d)T24 primert mértünk. A minták térfogatát 10 μl-re egészítettük ki, és az RNS-t 70 oC-on tíz percig denaturáltuk, majd jégen lehűtöttük. A cDNS szintézis során az RNS mintákhoz 10 μl reverz transzkripciós reakcióelegyet (2 μl 5 x reverz transzkripciós puffer, 1 μl 10 mM dNTP mix, 2 μl ditiothreitol, 2 μl SuperScript reverz transzkriptáz és 1 μl Superase Inhibitor) adtunk, és a mintákat 42 oC-on két órát inkubáltuk. A komplementer szál szintézise során a cDNS mintákhoz 43 μl RNáz mentes vizet, 20 μl 5 x T4 DNS polimeráz puffert, 2 μl 10 mM dNTP mixet, 3 μl E.coli DNS polimeráz I-t és 1 μl Ribonukleáz H-t adtunk és a reakciót 16 oC-os vízfürdőbe helyeztük. Két óra elteltével mintákhoz 2 μl T4 DNS polimerázt adtunk, és tíz percig tovább inkubáltuk. Végül a reakciót 10 μl 0.5 M etilendiamin-tetraecetsavval (EDTA) állítottuk le. A kettős szálú cDNS-t 100 μl fenol:kloroform eleggyel tisztítottuk fel. A mintákat Mikrocon Y-30 oszlopon koncentráltuk be. Az első amplifikációs lépés során a cDNS templátról, T7 enzimmel, a MegaScript T7 kit-et használva, 37 oC-on hat órán át aRNS-t szintetizáltunk. Minden reakció 4 μl 10 x T7 puffert, 16 μl 75 mM nukelotid mixet, valamint 4 μl T7 enzimet tartalmazott. Az aRNS-t a MeagaClear oszlopon tisztítottuk meg, majd 50 μl RNáz mentes vízben leoldottuk, és SpeedVac segítségével bekoncentráltuk. A második amplifikációs körben az első körben szintetizált aRNS minta szolgált a cDNS szintézis templátjául. A második cDNS szintézis mindenben megegyezett az első reakcióval kivéve, hogy itt 1 μl 500 ng/ μl T3N9 primert használtunk. A második cDNS szál létrehozása azonos volt az első körben leírtakhoz. A második RNS amplifikáció során a reakcióelegyben a T7 enzimet T3 virális RNS polimerázzal helyettesítettük. Végül az aRNS mintákat 50 μl 5 M ammónium acetát oldattal és 275 μl jéghideg etanollal kicsaptuk és 20 μl vízben feloldottuk.

5.5

5.5.1

Mikroarray alapú transzkripciós analízis

Felhasznált mikroarray platformok

5.5.1.1

Egér oligonukleotid mikroarrayk

A Compugen által gyártott egér oligonukleotid könyvtár 21997, 65 bp hosszúságú próbát tartalmaz, amelyek 19140 egyedi gént és expresszált szekvenciát reprezentálnak. Az egér mikroarrayk gyártása a National Cancer Institute Advanced Technology Centerben történt, ahol a Compugen könyvtárat üveg tárgylemezre nyomtatták. 5.5.1.2

Humán oligonukleotid mikroarrayk

Az Operon V2 humán hosszú oligonukleotid próba szett 21329 egyedi, 70 bp hosszúságú próbát tartalmazott (http://www.operon.com/). Az oligonukleotid próbák 384 zsebes mikrotiter lemezen 3 x SSC pufferben, 20-30 µM koncentrációban lettek feloldva. A próbák 160 µ denzitással kerültek az amino-szilán bevont üveg tárgylemezeken nyomtatásra. A mikroarrayket az NCI Advaced Technology Centerben nyomtatták.

5.5.2 RNS minták jelölése és a mikroarrayk hibridizációja A primer egér májsejtekből, illetve a humán szövetekből izolált teljes RNS mintákat fluoreszcens jelölésére indirekt aminoallyl metodikát alkalmaztunk. Ennek során minden egyes mintából 20 µg teljes RNS-t 70 oC-on 4 µg (d)T20 primer jelenlétében 5 percig denaturáltunk. A mintákat jégen lehűtöttük, majd mindegyikhez 10 µl 10 x cDNS szintézis puffert, 2.5 µl 20 x nukleotid mixet (10 mM dATP, dGTP, dCTP és 4 mM dTTP és 6 mM aminoallyl dUTP), 5 µl 0.1 M DTT-t és 2 µl SuperScript (Invitrogen) reverz-transzkriptázt adtunk, majd a reakció térfogatot 50 µlre kiegészítve a mintákat 1 órán át 42 oC-on inkubáltuk. Az így szintetizált aminoallyl módosított cDNS mintákat a feltisztítást követően SpeedVac készülékben (ThermoSavant) bekoncentráltuk, majd 20 µl 0.1 M nátrium hidrokarbonát oldatban oldottuk fel. Az oldat magas PH értékén az aminoallyl gyökök aktiválódtak, és fél óra sötétben történt inkubáció során a cDNS minták a hozzáadott Cy3 és Cy5

fluoreszcens festékeket megkötötték. A jelölt cDNS-t ismét a MinElute (Qiagen) kittel tisztítottuk meg. Az ellentétes fluoreszcens festékkel jelölt kísérleti és referencia mintákat ezután összekevertük és együtt vittük fel a mikroarraykre.

A mikroarrayk

hibridizációja során az összes humán, illetve egér mintát egy-egy közös referencia mintával szemben hibridizáltunk. Minden egyes minta analíziséhez két arrayt használtunk fel, amelyek között a kísérleti és a referencia minták fluoreszcens jelölését megcseréltük. A hibridizációt megelőzően az arrayket 5xSSC, 1 % BSA és 0.1% SDS-t tartalmazó oldattal egy órán át 42 oC-on blokkoltuk. A jelölt cDNS mintákat 50 µl térfogatú 25% formamidot, 0.1% SDS-t és 5 x SSC-t tartalmazó hibridizációs oldatban vittük fel az arraykre. A Az mikroarray hibridizáció egy éjszakán át 42 Co zajlott, majd az arrayket tartalmazó tárgylemezeket először 0.1% SSC és 0.1% SDS oldatban mostuk két percig, majd 1 x SSC végül 0.2 x SSC oldattal történő mosással távolítottuk el a nem specifikus hibridizációt mutató molekulákat. A mosási lépesek után az arrayket centrifugálással megszárítottuk majd a szkennelésig fénytől elzárt helyen, legfeljebb pár órán át tároltuk. A hibridizált után a próbák fluoreszcens jelét a GenePix 4000A (Molecular Devices) floureszcens szkennerrel detektáltuk 5 µm-es soronkénti felbontással. A szkenneren a fotoelektronsokszorozó érzékenységét úgy változtattuk, hogy mind a 635 nm (Cy5m) mind 532 nm-es (Cy3) hullámhossz tartományokban a szaturált pixelek száma a teljes arrayre vonatkoztatva ne haladja meg az 1%-ot, valamint úgy hogy a két hullámhossz tartományban mért jelintenzitások hányada összességében ± 10%-os tűréshatárral közelítsen az egyhez. A beszkennelt arrayken a próbák beazonosítását az médián jelintenzitások kalkulációját a lokális háttér szubsztrakcióját Gene Pix szoftverrel végeztül el.

5.5.3 Expressziós adatok statisztikai elemzése Az amplifikációs kísérletek során a nyers adatok filtrációja és normalizációja a MadB (http://nciarray.nci.nih.gov) array analízis platform segítségével történt. Azokat a próbákat, amelyek valamelyik fluoreszcens csatornán nem érték el a minimum 200-as intenzitás értéket, illetve ahol a jel/háttér arány nem haladta meg az egyet, valamint ahol a próba átmérője kisebb volt, mint 10 μm, automatikusan kiszűrtük. A gén expressziós hányadosokat log2 alapra transzformáltuk, továbbá azokat a géneket, ahol a minták több mint 30%-ában nem állt rendelkezésre expressziós adat, kizártuk a további elemzésből. A kísérleti duplikátumok, illetve az

amplifikált és nem amplifikált minták közötti korrelációt a Pearson koeficienssel kvantitáltuk, amelyet azon génekre számoltunk ki, amelyek legalább kétszeres expressziós eltérést mutattak a referencia mintához képest. A hierarchikus klaszter analizishez a Cluster és a TreeView (http://rana.lbl.gov) programokat használtuk. A nyers expressziós adatok a National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus adatbázisában érhetőek el.

5.5.3.1

A HGF/c-Met szabályozott transzkripciós mintázat meghatározása

A mikroarrayken a 10 µm-nél kisebb és a 300 µm-nél nagyobb átmérővel biró próbákat, valamint azokat probákat, ahol a fluoreszcens jelintenzitás akár a Cy3, akár a Cy5 csatornán a lokális háttér jelintezitásánál alacsonyabb volt, automatikusan kizártuk a további analizisből. Valós expressziót azon gének esetében tételeztünk fel, amelyeknél a csoportonkénti hat hibridizációs értékből négy detektálható volt, bármely két kezelési csoportban. Az egyes próbákhoz tartozó expressziós szinteket a kisérleti minta és a referenciához tartozó hányados logaritmikus transzformációjával kaptuk. A logaritmikusan transzfromált expressziós értékeket az összes hibridizáció során kapott átlagos expressziós hányados levonásával normalizáltuk. A c-Met knock out és a Cre transzgén májsejtek között a HGF kezelés hatására differenciált átiródást mutató géneket a BRB ArrayTools 3.3 programok segitségével t-teszttel azonosítottuk. A szignifikancia küszöböt az expressziós értékek random permutációja segitségével, úgy állapitottuk meg, hogy a kiválasztott gének között az ál-pozitivak becsült aránya ne haladja meg a 10%-ot. A kiválasztásra került gének ezen felül az univarians t-tesztben p<0.001 szignifikanciát és legalább 1.5-szeres abszolút expressziós különbséget mutattak. Azon géneket, amelyek a kezeletlen és legalább egy korai (fél vagy 2 óra) és egy késői (12 vagy 24 óra) időpontban is p<0.005 szignifkancia szintet meghaladó expressziós különbséget mutattak a kontoll és a cMet hiányos májsejtek között, az adaptiv választ mutató gének csoportjába soroltuk. A fennmaradó géneket pedig az expressziós különbség maximuma alapján rendszereztük korai és késői válasz csoportokba.

5.5.3.2

Predikciós modell

A humán HCC génexpressziós adatokat két független forrásból nyertük. A LEC (Laboratory of Experimental Carcinogenesis) adathalmaz 139 primer HCC, míg a

Stanford

Egyetem

adatbázisából

elérhető

adatok

(http://genome-

www5.stanford.edu/) 103 primer HCC és 7 májmetasztázis expressziós adatait tartalmazták. A adatbázisban található tumor minták részletes leírása, és a hozzájuk tartozó klinikai információk pedig korábbi publikációkban lelhetők fel (212, 224). Az egér és humán mintákból származó expressziós adatok kombinációját a Jackson Laboratory által közölt és ellenőrzött orthológ gének listája tette lehetővé. Az primer hepatociták és az LEC májrák minták között 440, míg a Stanford adatbázisban 303 közös c-Met szabályozott ortholog gént sikerült beazonositani. A különféle eredetű adatok standardizácója során az egyes gének expressziós hányadosait úgy transzformáltuk, hogy azok mediánja a nullához, standard deviációja pedig az egyhez közelítsen. A c-Met szabályozott géneken alapuló predikciós modell megalkotása során hatféle statisztikai algoritmust használtunk (CCP, NN1, NN3, NC, SVM és LDA). A LEC adatbázisából származó májkarcinóma mintákat, ahol a túlélési adatok elérhetőek voltak, random két csoportra osztottuk. A teszt csoportba harminc-harminc MET+ és MET-, míg az ellenőrző csoportba 79 minta került. A teszt mintákon határoztuk meg a LOOCV során optimális klasszifikációs hatékonyságot mutató gének csoportját, majd ezt az osztályozó mintázatot az ellenőrző csoporton validáltuk. Az osztályozót alkotó gének számát úgy módositottuk, hogy a teszt mintákon a legjobb predikciós értéket érjük el. Az LOOCV során a minták jelöléseit 1,000 permutáción keresztül randomizáltuk. A predikciós modell szignifikancia szintjét a random permutációk alapján és valós jelölésekkel elért sikeres predikciók aránya alapján számoltuk ki. Az ellenőrző mintákon a predikciós modell által generált csoportok szerint vizsgáltuk a betegek túlélését, valamint a Stanford adatbázis esetén metasztatikus tumorok arányát. Az egyes csoportokba tartozó betegek túlélésének statisztikai elemzése Kaplan-Meyer diagramm és log-rank teszttel történt az R (http://www.r-project.org) programcsomag segitségével.

6.

6.1

Eredmények

A kinyerhető RNS és a szöveti morfológia integritásának vizsgálata fixált

paraffinba ágyazott patológiai mintákban

Az endometrium minták szöveti morfológiájának prezervációja mindhárom fixálószer esetén elfogadható volt. Míg a formalin fixálás a sejtmag finomabb strukturális részleteit is láthatóvá tette (Ábra 8A), az aceton használata viszonylag gyengébb prezervációt tett lehetővé (Ábra 8B). Az RNAlater-rel látott morfológia minősége pedig az előbbi két fixalószer között helyezkedett el (Ábra 8C). A citoplazmatikus részletek pedig a formalinnal egyértelműen jobban kivehetőek voltak, mint a másik két szer esetén.

Ábra 8 : A különböző fixálószerek hatása az endometriális morfológiára. A szöveti morfológia prezervációja különböző fixáloszerek használat esetén. Reprezentativ hematoxilin-eosin festett endometrium metszetek (A) formalin, (B) aceton, (C) RNAlater fixálást követően.(250 X nagyitás) (225). Az endometriális szövetekkel a claudin 4 (Ábra 9) és claudin 7 (Ábra 10) antitestek

mindhárom

fixálás

esetén

elfogadható

reaktivitást

muattak.

A

legerőteljesebb és legjobban körülirható festés a formalin fixált minták estében láttuk. Ez a szemikvantitativ elemzés során 52 pont átlagot (az egyes minták 51-54 pont

között váltakoztak) jelentett, ami szignifikánsan (p<0.01) több volt, mint az aceton fixálás után kapott 46 (34-48) vagy a RNAlater-rel elért 43 (37-46) pont. Ez utóbbi két fixálószer között az immunhisztokémiai festés alapján ugyanakkor nem láttunk szignifikáns különbséget. Az RNAlater esetén azonban a festés gyakran egyenetlen, a claudin 4 antitesttel igen erős míg a claudin 7 antitesttel igen gyenge volt. Az antitestek optimális higítása minden fixatív esetén egységesen 1:100 volt.

Ábra 9 : Claudin 4 immunfestés. Claudin 4 immunohisztokémiai festés (A) formalin, (B) aceton és (C) RNAlater fixált paraffinba ágyazott endometrium mintákon. (200 X nagyitás) (225).

Ábra 10 : Claudin 7 immunfestés.

Claudin 7 immunohisztokémiai festés (A) formalin, (B) aceton és (C) RNAlater fixált paraffinba ágyazott endometrium mintákon. (200 X nagyitás) (225). A mintákból kinyerhető RNS integritásának meghatározásához a GAPDH és β-globin

gének transzkriptumainak különböző hosszúságú szakaszainak PCR

amplifikációs hatékonyságát teszteltük. A kvantitativ real-time PCR reakciók során 121, 225, 406 bp hosszúságú GAPDH és 166, 310, 536 bp hosszúságú β-globin termékek amplifikációját a CT értékek alapján elemeztük. A termékek relativ amplifikációs rátájának megállapitásához a legrövidebb termék (GAPDH 121) amplifikációs értékeit használtuk belső referenciaként. Ahogy az várható volt, a növekvő hosszúságú PCR termékek amplifikációs hatékonysága fokozatosan csökkent, amit a egyre magasabb CT értékek jellemeztek. Az 536 bp-os β-globin termék egyik minta estében sem mutatott amplifikációt (Ábra 11).

A 406 bp

hosszúságú GAPDH és 310 bp nagyságú β-globin amplikonokat a tizenöt minta közül tizenegyben tudtuk detektálni, míg 225 és 121 bp-os GAPDH, valamint 166 bp-os βglobin termékek minden mintában megtalálhatóak voltak. A PCR termékek amplifikációja nem mutatott szignifikáns különbséget a háromféle fixálás között, bár az aceton kezelt mintákban az RNS integritása némileg jobb volt. A GAPDH 225 bp és a β-globin 166 bp amplikonok relativ amplifikációja hasonló volt a GAPDH 121 bp-os kontrolléhoz. A GAPDH 406 valamint a β-globin 310 és 536 bp termékek viszont, szignifikánsan rosszabb hatékonyságot mutattak. Az egyes pirmer párokhoz tartozó, a kontroll termékhez viszonyitott relativ expressziós értékeket táblázatban (Táblázat 5) foglaltuk össze.

Ábra 11: A növekvő hosszúságú termékek amplfikációja a beágyazott mintákban. Külöböző hosszúságú cDNS szakaszok PCR amplfikációja paraffinba ágyazott endometrium mintákban. A formalin, aceton és RNAlater fixált mintákból felamplifikált 121, 225, 406 bp GAPDH és 166, 310, 536 bp β-globin RT-PCR termékek agaróz gélelektroforézise (225).

GAPDH 121

GAPDH 225

GAPDH 406

b Globin 166

b Globin 310

b Globin 536

RNAlater

28.4 ± 3.3

31.2 ± 2.8

40.3 ± 9.0

30.1 ± 4.2

39.6 ± 9.6

-

Aceton

26.9 ± 2.7

29.7 ± 3.4

36.9 ± 7.5

29.1 ± 3.4

35.0 ± 8.8

-

Formalin

27.8 ± 3.0

33.9 ± 5.8

39.6 ± 9.4

30.9 ± 3.3

38.0 ± 7.5

-

Táblázat 5 : A GAPDH és β-globin szakaszok amplfikációjának hatásfoka. A különböző hosszúságú GAPDH és β-globin termékek real-time PCR-rel mért CT küszöbértékei. A táblázat a triplikátumok CT értékeinek átlagát és standard deviációját mutatja az RNAlater, aceton és formalin fixált mintákban.

6.2 Új két körös lineáris RNS amplifikációs eljárás kifejlesztése szensze szálú RNS minták szintézisére A kis mennyiségű szövettani minták expressziós analízisét elősegítendő olyan két körös lineáris RNS amplifikációs eljárást dolgoztunk ki, amely lehetővé teszi az RNS amplifikáció és a jól bevált indirekt aminoallyl cDNS jelölés együttes alkalmazását. Mivel az oligonukleotid mikroarrayk egyszálú szensze próbákat tartalmaznak, rájuk csak anti-szensz szálú cDNS minták hibridizálhatók. Tehát először szensze szálú amplifikált RNS-t kell létrehoznunk, amihez a második körben meg kell változtatni a hagyományos T7 alapú amplifikáció szálirányát.

A fenti

probléma megoldása érdekében olyan új metodikát fejlesztettünk ki, ahol a második amplifikációs körben a T7 RNS polimerázt T3 RNS polimerázzal helyettesítettük (Ábra 12).

Ábra 12 : A T7T3 lineáris RNS amplifikáció folyamata. A szensz szálú RNS minták szintézisére használt két körös lineáris amplifikáció folyamatának demonstrációja. A második amplifikációs kör során a T7 virális RNS polimerázt T3 polimeráz és T3N9 primer felhasználásával helyettesítettük (226). A módosított T7T3 eljárás tesztelése során Myc/Tgf-α kettős transzgén egerekből származó két-két HCC és környező máj mintát amplifikáltunk fel. A reakciók során 100 ng kiindulási RNS mennyiség estén 22, 23, 27 és 23 μg aRNS-t nyertünk, ami átlagban 2.3 x 104–szeres amplifikációs rátának felel meg. Az amplifikáció konzisztensen magas hatékonysága egyértelműen jelzi a módszer reprodukálhatóságát. A második kör végén az amplifikált termékek méretének eloszlását gélelektroforézissel ellenőriztük. A termék átlagos mérete 150 bp és 1,350 bp között mozgott, ami megegyezik a hagyományos RNS amplifikációval kapott értékkel. Az eredmények reprodukálhatósága szempontjából még érdekesebb azonban, az azonos mintákból származó teljes RNS és amplifikált RNS felhasználásával nyert gén expressziós értékek korrelációja. A duplikált teljes RNS tumor mintákban az 1135 és 888 gén mutatott legalább kétszeres eltérést a normál referenciához képest, míg az amplifikált mintáknál ez az érték 1136 és 1036 között változott. Az expressziós adatok a teljes RNS mintákkal végzett duplikált hibridizációk esetén igen magas (r=0.92) korrelációt mutattak. Ugyancsak

szignifikáns korrelációt (r=0.9) találtunk az ugyanazon mintából történt független amplifikációk esetében is. Még lényegesebb azonban, hogy az amplifikált és a teljes RNS mintákból készült arrayk összevetése eseténestén is magas (r=0.79) reprodukálhatóságot tudtunk kimutatni (Ábra 13). Tehát bizonyítottuk, hogy a T7T3 módosított RNS amplifikációs technikával reprodukálhatóan, a kiindulási gén expressziós arányokat megőrizve tudjuk elvégezni igen kis mennyiségű minták transzkripciós analízistét.

Ábra 13 : A T7T3 amplifikált és a teljes RNS minták összehasonlitása. A teljes és a T7T3 eljárással felamplifikált RNS mintákkal nyert gén expressziós értékek közötti korreláció bemutatása. (A) A teljes RNS mintákkal végrehajtott duplikált hibridizációk esetén értük el a legmagasabb (R =0.92) korrelációt, a szignifikáns regulációt mutató 4337 génre vonatkoztatva. (B) Hasonló értéket mértünk (R = 0.9) megismételt amplifikációk között is. (C) Az amplifikált és a teljes RNS minták direkt összevetése ugyancsak szignifikáns (R=0.79) korrelációt mutat.(D) A

T7T3 amplifikált minták egyenletesen jelölődnek, mind a Cy3 mind a Cy5 fluoreszcens és a (E) teljes RNS mintákkal jól összevethető (F) hibridizációs képet mutatnak (226).

6.3

T7T3 amplifikáció alkalmazása lézer mikrodisszektált minták expressziós

analízisére A T7T3 módosított RNS amplifikációt felhasználtuk lézer mikrodisszekciós minták elemzésére is. A lézer mikrodisszekció során három Myc transzgenikus és három Myc/Tgf-α kettős transzgén egérből származó tumor mintákból egyenként 3000-4000 tumor sejtet izoláltunk. Az így nyert RNS mennyisége 60 és 80 ng között változott, az amplifikáció során pedig 16-25 μg aRNS keletkezett. A tumor mintákat közös, ugyancsak mikrodisszektált és több reakcióból összevont normál referencia minta ellen hibridizáltuk. A statisztikai elemzés során azon gének értékeit vettük figyelembe, amelyek legalább két esetben kétszeres expressziós különbséget mutattak a tumor és a normál minták között. A minták kétdimenziós hierarchikus cluster és MDS analízise során egybehangzóan beigazolódott, hogy a két transzgenikus vonalból származó tumorok expressziós profilja lényegesen különbözik egymástól. Ennek megfelelően a Myc és a Myc/Tgf-α tumorok a hierarchikus cluster analizis során a genotipikus különbségeknek megfelelően, egyértelműen beazonosítható csoportokban rendeződtek. Az azonos elváltozásokból származó teljes RNS, amplifikált RNS és lézer mikrodisszektált minták expressziós profiljának egybevetése ugyanakkor igazolta a mikrodisszekcióval nyert eredmények megbízhatóságát (Ábra 13). Ugyankor az elemzés során azonosítottunk néhány olyan gént is, amelyeknél az amplifikációból eredő hibák jól láthatóan eltorzították az eredeti expressziós értékeket.

6.4

A HGF/c-Met célgének azonosítása primer egér hepatocytákban Kísérleteink során először a májsejtekben fellelhető gének azon csoportját

kívántuk meghatározni, amelyek expresszióját a HGF/c-Met jelátviteli útvonal közvetlenül szabályozza. Ezért a kísérleti modellben, a laboratóriumunkban létrehozott c-Met kondicionális knock-out egerekből és a Cre rekombinázra

heterozygota kontroll állatokból kollegenáz perfúzió és percoll gradiens szeparáció segítségével primer májsejteket izoláltunk. Tizenhat órás szérum megvonás után mind a vad típusú mind a c-Met knock-out májsejteket 50 ng/ml rekombináns humán HGFel párhuzamosan kezeltük, fél, két, tizenkét, illetve huszonnégy órán keresztül.

Ábra 14 : A c-Met expressziós mintázat elemzésének lépései. A statisztikai elemzés lépéseit bemutató folyamatábra. A HGF/c-Met útvonal szabályozott célgének azonosítását, ami a HGF kezelt c-Met knock-out és kontroll sejtek expressziós profiljának összehasonlítása útján történt, követte az orthológus célgének expressziós mintázatának feltétképzése az emberi májrákokban. Végül a c-

Met aktiváción alapuló perdikciós modell megalkotása és validálása független mintákban (227). Minden kísérletet három független soraszatban megismételtünk. A mintákból a kezelést követően RNS-t izoláltunk, és a génexpressziós változásokat, a minták fluoreszcens jelölését követően, oligonukleotid mikroarrayvel elemeztük. A felhasznált mikroarray platfom 21997 próbát tartalmazott, amelyek együttesen 19140 egyedi egér gént, illetve EST-t reprezentálnak. A nyers adatok normalizációja, és a nem expresszálódó gének kiszűrése után 13477 gén rendelkezett megfelelő számú valós expressziós értékkel, ezért a további analízist ezzel a géncsoporttal végeztük el. A HGF/c-Met szabályozott gének csoportját a kezelés előtt, illetve a HGF-fel különböző ideig kezelt KO és WT májsejtek páronkénti összehasonlításával határoztuk meg. A statisztikai szignifikancia meghatározásához kétmintás t-tesztet használtunk, ahol a fals pozitív gének számát multivariáns permutáció segítségével becsültük meg. Az eredményeket összegezve 730 gén mutatott szignifikáns (P<0.001), legalább 1.5-szeres expressziós eltérést az eltérő genotípusú sejtek között. Mivel a fent említett összehasonlítások során az egyetlen kísérletes változó a c-Met receptor aktivációjának jelenléte, illetve hiánya volt ezért feltételezhetjük, hogy a szignifikáns gének expresszióját a c-Met aktiváció befolyásolja. Az adatelemzés során követett stratégiát folyamatábrán (Ábra 14) is összegeztük. A genotípusok között szignifikáns differenciát mutató géneket két alapvető osztályba csoportosítottuk. Az egyik osztályba azon gének tartoznak, amelyek kifejeződése permanens különbséget mutatott a Met KO és WT minták között. Hatvan olyan gént azonositottunk, amelyek mind a kezeletlen, mind a huszonnégy órás HGF kezelés során végig szignifikáns (P<0.005) eltérést mutattak. Ezen állandósult expressziós eltérések pedig arra engednek következtetni, hogy a c-Met szignál hiányában a májsejtek tartós transzkripciós adaptáción mennek keresztül. Mint azt előzetesen vártuk, a szignifikáns különbséget mutató gének többsége (672/730) a HGF kezelés megkezdése után vált láthatóvá, egyértelműen jelezve, hogy a HGF indukált transzkripciós válasz csak a kontroll májsejtekben van jelen. A HGF szabályozott géneket a transzkripciós indukció kinetikája alapján is csoportosíthattuk. Az úgynevezett korai válasz gének fél, illetve két órás HGF kezelés után mutatták a legmarkánsabb expressziós szintkülönbséget a két genotípus között, míg a késői válasz géneknél ez az időpont kitolódott tizenkét, illetve huszonnégy órára.

Összegezve, ahogy az átlaghoz normalizált log2 transzformált expressziós értékekből megalkotott ábrán (Ábra 15) is látható, a HGF indukált transzkripciós válasz specifikusan és reprodukálhatóan csak a vad-típusú májsejtekben jelentkezett és az indukciós csúcs időbeni eloszlása alapján a korai és késői válasz gének jól elkülöníthetők voltak.

Ábra 15 : A HGF célgének expressziós mintázata az egér májsejtekben. A HGF szabályozott gének expressziós mintázata az egér primer májsejtekben. A két log2 transzformált expressziós hányadosokat tartalmazó expressziós mátrix a (A) perzisztens és (B) HGF indukált expressziós különbséget mutató géneket reprezentálja a kontroll ( Met WT) és c-Met hiányos (Met KO) egér májsejtekben. A színkódban a zöld árnyalat a kontrol mintához képest alacsonyabb, míg a piros a magasabb expressziós szintet jelzi. Minden oszlop egy mintát, minden sor egy gént reprezentál. (C) Az oszlopdiagramok a korai (C1, C4) és későbbi (C2,C3,C5,C6) csúcsot mutató gének átlagos expressziós értékeit ábrázolják (227).

Elvárható, hogy a valóban a c-Met receptor által szabályozott gének necsak a kontroll és a knock-out sejtek között mutassanak expressziós különbséget, hanem e gének változása egyértelműen jelen legyen a HGF kezelt és nem kezelt kontroll minták összehasonlítása során is. Az utóbbi összehasonlítást elvégezve 1383 szignifikáns gént (legalább 1.5-szeres szintkülönbség, p<0.001) találtunk. Meg kell jegyeznünk, hogy az így detektáltak közül számos gén nemcsak a HGF kezelés hatására változtatja meg expresszióját. Jól ismert jelenség, hogy a primer májsejt kultúrákban a sejtek idővel elvesztik differenciált állapotukat, ami jelentős transzkripciós változásokat is eredményez az egymást követő időpontokban gyűjtött minták (0, ½, 2, 12 és 24 óra) esetében. Ezért nélkülözhetetlen a c-Met knock-out sejtekhez történő korrekció. Mégis megnyugtató, hogy 353 célgént mind a lineáris, mind a genotípusok közötti vertikális összehasonlítások során azonosítani tudtunk, méghozzá úgy, hogy az indukciós csúcs mindkét elemzés szerint azonos időpontra esett, megerősítve, hogy ezek a gének egyértelműen HGF specifikus választ mutatnak.

Ábra 16 : A c-Met célgének PCR validációja. Az oszlopdiagram a mikroarray és a kvantitativ RT-PCR által mért expressziós különbségek közötti korrelációt mutatja be tiz c-Met szabályozott gén esetében (227).

A mikroarray elemzés segítségével azonosított expressziós különbségeket kvantitativ RT-PCR esszével ellenőriztük le. A mikroarray és a PCR adatok között, mind a tíz kiválasztott célgén esetében, jó korrelációt találtunk (Ábra 16).

6.4.1

A c-Met útvonal aktivációjának szerepe a sejt motilitás szabályozásában

Számos, a korábbiakban azonosított c-Met szabályozott gén. mint például a Hmga1, Spp1 (228), Itgβ1 (229), Egr1 (230) és Cldn2 (231) jól detektálható átíródási szintkülönbséget mutattak a HGF kezelés után. A célgének további funkcionális elemzése részletes betekintést engedett a HGF indukálta fenotipus molekuláris hátterébe. A tizenkettő, illetve huszonnégy óránál észlelt szignifikáns gének jelentős hányada a sejtmotilitásban (Cxcl10, Capn2, Spp1, Fn1), az angiogenezisben (Vcam1, Anptl4, Ctgf, Neo1, Robo1), a cell adhézióban (Cldn2, Tjp3, Cdh17), vagy a sejtváz kialakításában (Hspa5, Arpc1b, Cap1, Nck2, Tpm2, Msn, Mid1, Vim, Dnm3, Tubb3, Tubb6, Krt2-8. Tuba1) játszik szerepet. Ezen géneket feltételezett fiziológiás funkciójuk szerint rendszereztük. A korai időpontokban észlelt HGF célgének között viszont inkább transzkripciós faktorokat találtunk (Hmga1, Egr1, JunB, MafF). Ezeknek az úgynevezett. nagyon korai válasz géneknek szerepe lehet a másodlagos transzkripciós válasz (12 és 24 óra) beindításában. Jó példa lehet erre a HGF-Egr1fibronektin expressziós kaszkád, amit korábbi publikációkban részletesen jellemeztek (232). Külön ki kell emelnünk a c-Met indukció szerepét az aktin citoszeleton elrendeződésének és a lamellopodiumok kialakulásának szabályozásában. A HGF kezelés hatására az Arcp1b és az Nck2 gének expressziója szignifikánsan megemelkedett. Ezeknek a géneknek az Arp2/3 komplex működésében van szerepe, ami az aktin fehérje intracelluláris polimerizációját és a diapedezist irányítják (233). A HGF szabályozott gének listáján megtaláljuk még a Ras indukált adenil-cikláz fehérjét (Cap1), amely az aktin és kofillin beépülést (234), és a moesint (Msn), ami az aktin filamentumok membránkötődését

(235) mediálják.

Az intracelluláris

mikrotubulusok alkotói közül a tubulin α1, β1 és β6 gének mutattak magasabb átíródást a c-Met aktivációt követően. A sejtmotilitásban részt vállaló gének expressziója legalább 12 és 24 órás HGF kezelést követően változott jelentősen. Ez egybeesett a sejtek fenotipusának megváltozásával és a sejtek motilitásának megnövekedésével (Ábra 17 A-F).

Ábra 17 : A c-Met KO májsejtekben észlelt citoszkeletális és redox eltérések. A citoszkeleton és az oxidativ homeosztázis változása a kontroll (WT) és c-Met hiányos (KO) primer májsejtekben. Huszonnégy órás HGF kezelést követően phalloidin (A,B), α-tubulin (C, D) és vinculin (E,F) festéssel demonstráltuk az citoszkeleton és a sejtadhéziós struktúrák(nyíl) változását. A oxidál- redukált glutation (GSH/GSH) arányának lecsökkenése knock-out sejtekben (G) együtt járt az intracelluáris reaktiv oxigén gyökök megnövekedett koncentrációjával (H), ami jól nyomon követhető az oxidáció aktivált fluoreszcens festéssel. Mind

a

metasztázisképzésben

jelentékeny

szekretált

glikoprotein,

oszteopontin (Spp1), mind annak membrán receptora, a CD44v6 fehérje kapcsolatba hozható a c-Met útvonallal (228, 230). Bár a CD44 gén nem mutatott expressziós

eltérést az általunk vizsgált modellben az Spp1 és az integrin családba tartozó integrin αV, α3 és β1 transzkripciója emelkedett volt. Figyelemre méltó, hogy az integrin αVβ3 komplexnek az oszteopontinnal való kötődése elősegiti a tumorsejtek migrációját és a tumor angiogenezist (236). Tehát a génexpressziós adatok egyértelműen megerősítik, hogy a HGF/c-Met útvonal a metasztázisképzésben és a tumor angiogenezis szabályozásában meghatározó szerepet tölt be.

6.4.2

A c-Met útvonal szerepe a sejten belüli oxidativ homeosztázis szabályozásban

A mikroarray adatok elemzése során a legmeglepőbb eredményt az oxidativ stressz válaszhoz kapcsolható géneknek a c-Met hiányos sejtekben észlelt, fokozott mértékű átíródása jelentette.

Elsőként írtuk le, hogy az Nrf2 transzkripciós faktor, az

intracelluláris glutation körforgalom központi regulátora, és az általa szabályozott stressz válasz (Aldh1a1, Aldh1a7, Adh1, Ephx1, Ephx2), a glutation transzferáz (Gsta1, Gsta3, Gstm6, Mgst1, Gstm2, Gstm3) és glutation-cisztein ligáz (Gclc) gének (237) szintje szignifikánsan megemelkedett a c-Met knock-out sejtekben. A mikroarray adatokkal összhangban emelkedett Nrf2 fehérje- mennyiség is detektálható volt, mind a primer májsejtekben, mind a teljes májszövet mintákban. Érdekes, hogy ezzel párhuzamosan az Nrf2 faktor dimerizációs partnerei és inhibitorai (238) a MafK és MafF gének expessziója alacsonyabb volt, mint a kontroll sejtekben. Feltételezzük, hogy a fent leirt transzkripciós eltérések a c-Met hiányos sejtekben megváltozott oxidativ homeosztázishoz köthetők, amit a lecsökkent oxidáltredukált glutation hányados és az oxidáció aktivált 2’7’ difloureszcin festés is megerősít (Ábra 17 G-H). 6.5

6.5.1

A humán HCC minták komparatív genomikai elemzése

A c-Met expressziós mintázat azonosítása humán májkarcinómákban Korábbi komparatív funkcionális genetikai elemzések alapján feltételeztük,

hogy az egér primer májsejtekben azonosított c-Met specifikus expressziós mintázat egy része az egér és az emberi sejtek között az evolúció során konzerválódott (216, 239). Tehát, ugyanaz az expressziós mintázat, ami differenciálni képes a kontroll és c-

Met knock-out sejtek között, felhasználható a c-Met aktivációt mutató humán májcarcinomák detektálására is. E cél érdekében a fajok között egyezést mutató ortholog gének párosítása után, az egér primer májsejtekben, valamint 242 humán májrákban összevetettük a c-Met aktivált gének expressziós mintázatát. Az orthológ gének

listáját

a

UniGene

adatbázis

alapján

állítottuk

össze

(www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/). A humán májrák minták két, egymástól független forrásból származtak: 139 HCC minta a saját laboratóriumunk (LEC) korábban már elemzett eseteiből (198, 212), 103 minta pedig a Stanford Egyetem adatbázisából (224) került felhasználásra. Ez utóbbi adatbázis egyben tartalmazta hét vastagbél carcinoma eredetű májmetasztázis expressziós adatait is, amelyek ugyancsak elemzésre kerültek. Elsőként a különböző eredetű expressziós adatokat standardizáltuk, amely folyamat során a három adathalmazt (egér hepatociták, LEC és Stanford HCC minták) úgy transzformáltuk, hogy az egyes gének standard deviációja egy, átlagos expressziós hányadosa pedig nulla legyen (217). Ezt követően a humán és egér adatokat kombináltuk

és két adathalmazt alkottunk. Ezek HGF kezelt primer

májsejtek expresziós adatait az LEC, vagy a Stanford HCC mintákkal együtt tartalmazták. Az első adatsor 440 olyan, a hepatocitákban c-Met szabályozás alatt álló gén expressziós profilját tartalmazta, amelyekhez humán orthologokat tudtunk párositani az LEC adatbázisból. A Stanford adatbázisban pedig 303, az egér mintákkal közös gént sikerült beazonosítani. Így, a fent leirt, az egér-humán hibrid expressziós adatsorokat elkövetkezőkben egy egységként tudtuk tovább elemezni. A hierarchikus klaszter analízis két jól megkülönböztethető csoportot azonosított mindkét adatsorban (Ábra 18). Az egyik csoportban a HGF kezelt kontroll májsejtek és azok a májcarcinoma minták tartoztak, amelyek domináns c-Met indukált expressziós mintázatot mutattak (MET+), a másik csoportban pedig a c-Met knock-out májsejteket és azokat a carcinoma mintákat találtuk, ahol ez a mintázat hiányzott (MET-). Ki kell emelnünk, hogy számos májcarcinóma mellett mind a hét vizsgált vastagbél tumor metasztázis is a MET+ expressziós mintázatot mutatta (Ábra 19). A komparatív genomikai analízis segítéségével tehát sikerült a humán májcarcinómákon között beazonosítani azokat a tumorokat, amelyekben a génexpressziós mintázat alapján a HGF/c-Met jelátviteli útvonal aktivációja feltételezhető.

Ábra 18 : A c-Met célgének átiródása az LEC májrák mintákban. A c-Met útvonal által szabályozott gének experessziója a LEC adatbázisban található primer májrákokban. (A) A 139 primer HCC mintából és HGF kezelt egér primer májsejtekből álló kombinált adathalmazban az expressziós profilok hasonlóságát hierarchikus klaszter elemzés során demonstráltuk. A kluszterezés során 440 ortológ az egér hepatocitákban c-Met szabályozott átiródást mutató gént vettünk figyelembe. A diagramm az expressziós log2 transzformált hányadosokat tartalmazza egy olyan kétdimenziós mátrixban, ahol a sorok a mintákat, az oszlopok az egyes géneket reprezentálják. (B) A korrelációs fa a minták transzkripciós mintázatai közötti hasonlóságot szemlélteti. Jól látható, hogy a MET+ csoportba tartozó humán májkarcinómák (Met+ HCC) a HGF kezelt vad-tipusú egér mintákhoz (WT hepatocytes) igen hasonló expressziós mintázattal rendelkeznek. Ugyanakkor az emberi májtumorok másik csoportjában (Met-HCC) valamint a c-Met knock-out primer májsejtekben (Met KO hepatocytes) a c-Met aktivációs mintázat hiányzik. Az ábrán feltüntettük a korábban ugyanezeken a humán mintákon leirt jó (cluster B) és rossz (cluster A) prognózist mutató májkarcinómák eloszlását is.

Ábra 19 : A c-Met célgének átiródása a Stanford májrák mintákban. A c-Met útvonal által szabályozott gének experessziója a Stanford adatbázisban található primer és metasztatikus májrákokban. (A) A 103 primer HCC mintából 7 májmetasztázisból és HGF kezelt egér primer májsejtekből álló kombinált adathalmazban az expressziós profilok hasonlóságát hierarchikus klaszter elemzés során demonstráltuk. A kluszterezés során 303 ortológ, az egér hepatocitákban c-Met szabályozott átiródást mutató és mindkét adatbázisban jelen lévő gént vettünk figyelmebe. A diagramm az expressziós log2 transzformált hányadosokat tartalmazza egy olyan kétdimenziós mátrixban, ahol a sorok a mintákat az oszlopok az egyes géneket reprezentálják. (B) A korrelációs fa a minták transzkripciós mintázatai közötti hasonlóságot szemlélteti. Jól látható, hogy a MET+ csoprotba tartozó humán májkarcinómák (Met+ HCC) valamint az összes metasztatikus tumor (Metastasis) a HGF kezelt vad-tipusú egér mintákhoz (WT hepatocytes) igen hasonló expressziós mintázattal rendelkeznek. Ugyanakkor az emberi májtumorok másik csoportjában (Met-HCC), valamint a c-Met knock-out primer májsejtekben (Met KO hepatocytes) a c-Met aktivációs mintázat hiányzik.

6.5.2

A c-Met aktivált expressziós mintázat összefüggése a tumor fenotípussal A Kaplan-Meyer görbe és a túlélést log-rank statisztikai elemzése is azt

demonstrálta (Ábra 20 A), a MET+ csoportba tartozó betegek átlagos túlélési ideje (35.1 ± 7.1 hónap) szignifikánsan rövidebb volt, mint a MET- csoportba tartozóké

(70.3 ± 9.6 hónap). Ez egybevág azzal,hogy, amint a klaszter elemzés során láttuk, a MET+ tumorok többsége egyben a korábban leirt rossz prognózist mutató májcarcinómák csoportjának („A klaszter”) is tagja volt (212).

A többi

klinikopatológiai változó eloszlását a MET+ és MET- csoportok között a táblázatban összegeztük (Táblázat 6). A c-Met receptor aktivációját régóta, mint a tumor invázió és angiogenezis egyik meghatározó faktorát tartják számon. Ezért, külön is vizsgáltuk a vaszkuláris invázió jelenlétét az elérhető HCC mintákban. Mint azt vártuk, a vaszkuláris invázió aránya jóval magasabb volt MET+ mintázatot mutatókban, mint a többi tumorban (χ2=4.01, p<0.05). Korábbi tanulmányokban ugyancsak leírták, hogy a HGF és c-Met receptor expressziós szintje pozitív korrelációt mutat a mikro-vaszkuláris sűrűséggel. A mikro-vaszkuláris sűrűséget az endotél sejteket kimutató CD34 immunfestés segítségével értékeltük. A MET+ karcinómákban az átlagos mikro-vaszkuláris sűrűség szignifikánsan (p<0.001) magasabb volt (90.8 ± 6.7), mint a METcsoportban

(44.5

±

6.2),

megerősítve

a

c-Met

receptornak

a

tumorok

vaszkularizációjában betöltött szerepét (Ábra 20 B-E) Érdekes módon, a Met receptor átlagos expressziós szintje nem mutatott lényeges különbséget a két csoport között, akár a mikroarray akár adatokat össze. A kontrol normál májakhoz képest a c-Met receptor expressziójának legalább kétszeres növekedését viszont gyakrabban láttuk a MET+ (5/54), mint a MET- (2/85) tumoroknál. Ezek az adatok azt a feltevést erősítik, hogy a MET+ májkarcinómák egy részében magának a c-Met receptornak a fokozott kifejeződése áll a specifikus expressziós mintázat hátterében.

Klinikai paraméter

Met +

Met -

Összesen

Nem Férfi Nő

43 12

59 25

102 37

Életkor Átlag (évek) SD

52.7 12.5

58.6 13.9

111.3 26.4

Májcirrhozis igen nem

30 24

39 46

69 70

Etiológia HBV hepatitis HCV hepatitis Alkoholos májbetegség HBV + HCV hepatitis Alkohol + HBV Alkohol + HCV Nem alkoholos szteatohepatitis Autoimmun hepatitis Hemokromatózis Alpha-1-antitripszin hiány Primer biliáris cirrhózis Wilson kór Ismeretlen

34 4 3 1 0 0 0 1 0 0 0 1 11

22 10 13 3 1 3 2 1 3 1 1 0 24

56 14 16 4 1 3 2 2 3 1 1 1 35

Tumor méret > 5 cm < 5 cm

33 15

34 26

67 41

AFP szint > 300 U < 300 U

27 17

23 37

50 54

Edmondson grade (I-IV) Grade I Grade II Grade III Grade IV

0 13 39 3

2 44 35 3

2 57 74 6

Táblázat 6 : A klinikai paraméterek eloszlása a MET+ és MET- betegek között.

Ábra 20 : A MET+ tumorok fenotipusa. (A) Kaplan-Meyer görbe és log-rank statisztikai teszt alapján a MET+ csoportba tartozó betegek várható túlélése szignifikánsan rosszabb, mint a METbetegeké. (B) A vaszkuláris inváziót mutató tumorok aránya, (C) és az átlagos mikrovaszkuláris denzitás egyaránt magasabb volt a MET+ betegek csoportjában. (E) A MET+ és a (F) MET- tumorokban CD34 festődését reprezentáló terület 200szoros nagyitás mellett.

6.5.2

A c-Met indukált expressziós mintázaton alapuló prognosztikai modell létrehozása Látva a túlélés és a c-Met szabályozott expressziós mintázat közötti

szignifikáns összefüggést, megkíséreltünk egy olyan, a génexpresszión alapuló perdikciós modellt létrehozni, ami képes a májkarcinóma betegek túlélését megjósolni. Ehhez a 139 LEC beteget random módon kétfelé, egy 60 mintából álló

teszt, és egy 79 mintát tartalmazó ellenőrző csoportra osztottuk. Hatféle predikciós statisztikai algoritmust (CCP, NN1, NN3, NC, SVM, és LDA) használtunk fel arra, hogy c-Met szabályozott génekből megalkossuk azt az ideális osztályozót („classifier”), amely nagy biztonsággal képes a HCC betegek túlélését megjósolni. Az osztályozót alkotó 111 gén kiválasztása a teszt mintákon, a hat algoritmussal kapott eredmények összegzése alapján a LOOCV metódus szerint történt. Az osztályozó predikciós hatékonyságát és megbízhatóságát pedig, az ellenőrző csoport mintáin validáltuk. Az ellenőrző csoportban mind a hatféle predikciós algoritmus 83-95% pontossággal volt képes beazonosítani a MET+ tumorokat (Táblázat 7). Ezen felül, mint azt a Kaplan-Meyer görbe és a log-rank teszt eredményei is megerősítették, azon estekben, amikor a hat predikciós algoritmus alapján a HGF/c-Met aktiváció valószínűsíthető volt, a betegek túlélése jelentősen lecsökkent (Ábra 21). A Stanford Egyetem mintáin is vizsgáltuk a predikciós rendszer hatékonyságát. A genetikai osztályozóban ezúttal azon géneket használtuk, melyek mindkét humán mikroarray platformon jelen voltak. Ezekhez a mintákhoz a túlélési adatok nem voltak elérhetők, ezért a gén expressziós mintázat prognosztikai erejét nem tudtuk elemezni. Az osztályozási rendszer azonban a metasztatikus tumorokat 100%-os pontossággal be tudta azonosítani. További érdekes eredményeket hozott a prediktiv gének funkcionális elemzése. Ezek a a c-Met szabályozott gének a különbőz fajok között evolucionálisan konzervált expressziós mintázatot mutatnak. Ezért feltételezhetjük, hogy döntő szerepük van a c-Met aktivált celluláris fenotipus kialakításában. Számos osztályozó gén szerepe jól felismerhető a metasztázis képzés HIG2, EPHA2, MAPK3, P85α, ITGαV és ITGβ1 vagy a sejt motilitás CAP1, ARPC1B, NCK2 szabályozásában, ezért potenciális terápiás célpontként kezelhetjük őket.

Ábra 21 : A c-Met célgéneken alapuló predikciós modell validálása. A c-Met aktivált transzkripciós mintázat jelntősége a humán HCC betegek prognózisának meghatározásában. A Kaplan-Meyer diagrammok a hatféle: (A) CCP, (B) NN1, (C) NN3, (D) NC, (E) SVM, és (F) LDA algoritmussal MET+ illetve METcsoportokba sorolt HCC betegek túlélését szemléltetik. A MET+ csoportba sorolt betegek átlagos túlélése a log-rank teszt szerint mind a hat klasszifikácós modellben szignifikánsan rosszabb volt.

CCP

NN1

NN3

NC

SVM

LDA

Jósolt csoport

Met+

Met-

Met+

Met-

Met+

Met-

Met+

Met-

Met+

Met-

Met+

Met-

LEC tumorok Teszt szet Klaszter Met+ (n=30) Klaszter Met- (n=30) Helyes (%)

27

3

27

3

27

3

27

3

29

1

27

3

28

1

29

1

29

2

28

2

28

2

Ellenőrző Szet Klaszter Met+ (n=28) Klaszter Met- (n=51) Helyes (%)

2 92

93

93

92

95

29 92

23

5

23

5

24

4

22

6

24

4

23

5

1

50

1

50

0

51

1

50

2

49

1

50

92

92

95

91

92

92

Stanford tumorok Humán HCC Klaszter Met+ (n=22) Klaszter Met- (n=81) Helyes (%)

21

1

11

10

9

13

21

1

15

7

21

1

11

70

8

73

10

71

12

69

11

70

11

70

Metasztázis Klaszter Met+ (n=7) Klaszter Met- (n=0) Helyes (%)

7 0

LVOOCV szignifikancia

88

82

0 0

7 0

78

0 0

7 0

87

0 0

7 0

83

0 0

6 0

88

1 0

7 0

0 0

100

100

100

100

86

100

p<5 x 10-4

p<5 x 10-4

p<5 x 10-4

p<5 x 10-4

p<5 x 10-4

p<5 x 10-4

Táblázat 7 : A c-Met alapú predikciós modell hatékonysága.

7.

Megbeszélés

7.1 A rutin szöveti fixáció hatása a patológiai minták molekuláris analizisére Korábbi tanulmányok az mutatják, hogy alternatív szöveti fixálószerek, mint a például az RNAlater használata a hagyományos formalin fixációval szemben jelentősen javíthatja a patológiai mintákból molekuláris analízisre kinyerhető nukleinsavak mennyiségét és minőségét (240). Az új, jobb hatékonyságú RNS izolációs metódusok elterjedése további segítséget nyújthat a paraffinba ágyazott archivált szövetekben rejlő genetikai információ feltárásában. A szöveti RNS mennyiségét mérni képes valósidejű PCR elemzések során relatív rövid szekvenciák kerülnek felamplifikálásra, ezért ez a technika különösen alkalmas olyan minták elemzésére, ahol az RNS fragmentált. Ugyanakkor bármilyen fixáció esetén alapkövetelmény a szöveti morfológia, illetve az immunhisztokémiai markerek reaktivitásának mind tökéletesebb megőrzése. Ezek ugyanis nélkülözhetetlenek a pontos patológiai diagnózis felállításához. Vizsgáltuk a kinyerhető RNS integritását és a szöveti struktúra prezervációját rutin módon paraffinba ágyazott endometrium mintákon, formalin, aceton, vagy RNAlater fixálást követően. Az átlagos RNS fragment

hosszúságot

amplifikációja

során,

különböző míg

a

hosszúságú

fehérje

termékek

antigének

kvantitatív

detektálhatóságát

PCR claudin

immunhisztokémiával ellenőriztük (225). Széles körben elterjedt nézet, hogy bár a formalin fixálás kiválóan alkalmas a morfológia vizsgálatára, ez a módszer a nukleinsavak és a fehérjék között kovalens keresztkötéseket eredményez, amelyek meggátolhatják a további molekuláris analízist (225). Más prezervativok használata esetén a szöveti autolizis és a fiziko-kémiai paraméterek megváltozása jelenthet komoly problémát. Szerves oldószerekkel, mint az etanol, a metanol és az aceton ugyanakkor a genomiális DNS PCR amplifikációjának hatékonysága jobb volt, mint formalin használat esetén (241). Korábbi közlések azt mutatták, hogy a formalin-fixált szövetekből izolált RNS alkalmas lehet gén expresszió RT-PCR alapú detektálására (242). A szövettani vizsgálatra kerülő minták döntő többsége, még mindig a rutin protokol szerint kerül feldolgozásra és automatikusan formalin fixáláson és paraffin beágyazáson megy keresztül. Ezért a molekuláris információ limitált elérhetősége különösen fontos

probléma,

hiszen

az

archivumokban

fellelhető

jól

karakterizált

minták

nélkülözhetetlenek a retrospektív patológiai vizsgálatokhoz. A minták kezelésének standardizálása ugyancsak megoldást kíván. Budhevi és Weinstock arra az eredményre jutottak, hogy formalin fixálás esetén a hosszabb fixációs idő elteltével az RT-PCR elemzés során mért CT értékek jelentősen megnövekednek, és ennek következtében a transzkriptumok detektálhatósága lecsökkent (243). Más szerzők adatai alapján 3 és 6 óra közötti fixációs idő nyújt optimális eredményt (244). Általánosságban a kinyerhető RNS mennyisége két évnél hosszabb tárolás után jelentősen lecsökkent, de egyes esetekben virális RNS detektálható volt hét éves paraffinba ágyazott mintákban is (245). Specht és társai sikerrel izoláltak RNS-t 20 évnél régebbi paraffinba ágyazott mintákból. RNAlater fixálás esetében ez az időtartam a relativ rövid ideje történt bevezetés miatt még nem ismert (246). Jelentős érdeklődés mutatkozik tehát új molekuláris és hisztológiai elemzést egyaránt lehetővé tevő fixálószerek kifejlesztése iránt. Az RNAlater úgy tűnik ígéretes alternativát jelenthet a formalinnal szemben, de paraffin beágyazott mintákon nyújtott teljesítménye nem teljesen ismert. Ezért humán endometrium mintákon teszteltük három fixálószer hatását, a kinyerhető RNS mennyiségére, integritására, valamint a szöveti antigének és struktúra prezervációjára. Az RNS mennyiség és a felamplifikálható RNS hosszúsága szempontjából nem találtunk szignifikáns különbséget az aceton, formalin vagy RNAlater fixált minták között. Bár a hematoxilin-eosin festéssel a morfológia mindhárom esetben felismerhető volt, a formalin fixálással a finomabb strukturális részletek jobban láthatóak voltak. Az immunhisztokémiai reakciók megbízhatóan működtek mind az aceton, mind a formalin fixált mintákon, de az RNAlater fixált mintákban a festődés intenzitása alacsonyabb volt és gyakran egyenetlen eloszlást mutatott. Korábbi közlések sem a morfológiában, sem a szövetek immunreaktivitásában nem talált különbséget az RNAlater és a formalin között (247). Meg kell jegyeznünk azonban, hogy bár a RNAlater fixáció ideje megegyezik a mi általunk használttal, Florell és mukatársai a mintákat két lécsőben kezelték, melynek során az RNAlater kezelést minden esetben formalin fixálás is követte (248). A két tanulmány adatainak direkt összehasonlítása tehát nem lehetséges, mivel nyilvánvaló, hogy a formalin megváltozatta a RNAlater kezelt szövet tulajdonságait. A PCR termékek amplfikációs hatékonysága a termék nagyságával egyenes arányban csökkent, és 225 bp-nál hosszabb termék esetén gyenge eredményt adott. Mint ahogy az várható, az RNS fragmentációja

következtében a hosszabb szakaszok aránya relativ alacsonyabb a rövidebb szakaszokéhoz képest. ezért a hosszabb termékek amplifikációja nehézségekbe ütközik. Specht és társai hasonló eredményre jutottak amikor megállapították, hogy formalin fixált minták esetében 374 bp-nál hosszabb termék amplifikációja nem lehetséges, az optimális hatékonyságot pedig a 122 bp hosszúságú termék érte el. Saját eredményeink alapján, a 100 bp-nél rövidebb termékek vizsgálata esetén az aceton, illetve formalin fixált minták kezelése nem igényel további módósítást. Nagyszámú minta esetén azonban a fixálási idő, valamint a szöveti penetráció standardizálása is szükséges a kinyerhető RNS uniformitásának biztosításához. Az egyes antigének immunhisztokémiai reaktivitását minden fixálószer esetén külön kell vizsgálni. Az antigén feltárásra használt új protokollok ezen felül tovább növelhetik a fixált szöveteken is használható markerek számát. Összegzésképpen megállapíthatjuk, hogy a 300 bp-nál hosszabb PCR termékek nem alkalmasak paraffinban ágyazott mintákon a génexpresszió vizsgálatára. Rövidebb fragment hossz estén ugyanakkor az eredmények biztatóak. Szükséges azonban, hogy az eredményeket az endometriumon kívül más szövetekben is validálni tudjuk, mivel ezek fixációs és gén expressziós paraméterei eltérőek lehetnek. Kézenfekvő, hogy az RNS integritását ezekben az esetekben a háztartási gének változó hosszúságú szakaszainak amplifikációs hatékonysága alapján állapítsuk meg. A formalin-fixált, archivált szöveti minták elérhetővé tétele a molekuláris analízis számára tehát jelentős előrelépést jelentene a patológia kutatások számára. 7.2 A T7T3 lineáris RNS amplifikáció alkalmazása a hepatikus léziók transzkripciós elemzésére A komplex illetve kisméretű elváltozások elemzése során gyakran felmerülő probléma, hogy az eltérő szöveti alkotóelemek, a morfológiailag jelentősen különböző sejtcsoportokban bekövetkező transzkripciós elváltozások csak egymást átfedve, esetenként zavarva értékelhetők. A mikroarray alapú gén expresszió analízis a lézer mikrodisszekció és a mágnesgyöngyös vagy áramlási citometriás sejtszétválasztási technikák kombinációjával lehetővé vált, hogy az egyes komplex elváltozásokon belül csak egy meghatározott sejtpopulációt vizsgáljunk (249). Például egy tumoron belül külön elemezhetjük az epiteliális és a kötőszöveti komponenst. A kinyert minta mennyisége azonban sok esetben nem teszi lehetővé a hagyományos cDNS jelölési

módszerek alkalmazását, amelyekhez legalább 100 ng ploy(A) szeparált mRNS vagy 10-20 μg totál RNS szükséges. Ilyenkor az RNS minta amplifikációjára van szükség, amire számos PCR alapú és lineáris amplifikációs technika került leírásra. Van Gelder és munkatársai fejlesztették ki azt metódust, ahol az RNS-ről készülő cDNS szál szintézisét egy T7 promótert tartalmazó oligo(d)T primer iniciálja, ami lehetővé teszi, hogy a cDNS templátról a T7 virális RNS polimeráz aRNS-t amplifikáljon (250). A mikrodisszektált minták esetében megfelelő RNS mennyiség biztosításához gyakran szükséges egy második amplifikációs kör is. Mind az egykörös, mind a kétkörös T7 amplifikáció az mRNS szállal ellentétes, anti-sense irányú aRNS terméket eredményez. Az ezt követő indirekt fluoreszcens jelölés során az aRNS-ről sense cDNS készülne, amit nem lehetne az ugyancsak sense szálú próbákat tartalmazó oligonukleotid arraykhez hibridizálni. Az egyik lehetséges alternatíva a rövid oligonukleotid próbákat tartalmazó arrayk esetén szokványosan alkalmazott megoldás, az aRNS termék indirekt jelölése. A rövid oligonukleotid próbákat tartalmazó arraykkel kapott expressziós értékek kevésbé érzékenyek az aRNS esetleges degradációjával szemben, mivel ezeken a platformokon egy gént több tiling próba reprezentál. A hosszabb oligonukleotid próbákat (65-70 bp) tartalmazó arrayken azonban az aRNS minta degradációja jelentős jelveszteséget eredményez. Az

RNS

minták

amplifikációjára

PCR

alapú

amplifikációs

technikák

is

felhasználhatók. Az egyik leggyakrabban alkalmazott módszer a templát váltó (template-switching) PCR (TS-PCR) (251). A TS-PCR és a T7 lineáris amplifikáció összehasonlítása a azt mutatta, hogy a két körös lineáris amplifikáció jobb korrelációt mutat az amplifikált RNS mintákkal illetve magasabb kitermeléssel működik. A PCR technikára jellemző exponenciális termékamplifikáció azt is jelenti, hogy az eredeti expressziós arányok megtartásához a ciklusszám szigorú optimalizálása szükséges. Az általunk javasolt T7T3 RNS amplifikációs metodika előnye, hogy sikeresen kombinálja az igen hatékony és virális RNS polimeráz alapú RNS amplifikációt és a cDNS minták aminoallyl jelölését hosszú oligonukleotid arrayk alkalmazása esetén (226). A T7T3 amplifikáció során sense szálú aRNS keletkezik, ami cDNS-re direkt átírható. Így elkerülhető az aRNS degradációjából eredő jelcsökkenés, valamint a PCR amplifikációknál lehetséges aránytorzulás. Kísérleti eredményeink igazolják, hogy a T7T3 reakció során az amplifikációs ráta megegyezik a hagyományos, kétkörös T7 amplifikációéval. A mintákat hosszú oligonukleotid arraykhez hibridizálva kitűnő jelintenzitás volt detektálható. Emellett demonstráltuk,

hogy az amplifikáció után az expressziós arányok megtartottak, és kiváló korrelációt mutatnak az amplifikáció előtti értékkel. A T3T7 módszert sikeresen alkalmaztuk lézer mikrodisszektált minták elemzésére is. A transzgenikus egér tumorok klasszifikációja bemutatta, hogy a genotípusra jellemző expressziós különbségek a mikrodisszekció és a T7T3 amplikációt követően is megtartottak. Ezen eredmények pedig a T7T3 technika felhasználási lehetőségét bizonyítják a máj és más eredetű tumorok transzkripciós elemzésében.

7.3

A c-MET útvonal által aktivált génexpressziós mintázat felhasználása a

májtumorok molekuláris klasszifikációjára Kísérleteink során genetikailag módosított egér primer májsejtek globális expressziós analízisét végeztük el, melynek során azonosítottuk a HGF/c-Met jelátviteli útvonal által transzkripciós szinten szabályozott gének csoportját. Ezen gének funkcionális elemzése felfedte a c-Met receptor eddig nem ismert szerepét a májsejtek oxidativ homeosztázisának szabályozásában. Az egér májsejtekben megfigyelt c-Met indukált expressziós mintázatot humán májkarcinómákból származó adatokkal kombinálva kimutattuk, hogy a humán tumorok egy jól meghatározott csoportjában a jellegzetes transzkripciós profil alapján, a c-Met jelátviteli útvonal aktivációja feltételezhető. Korábbi kutatások alapján jól kimutatható az összefüggés a májkarcinómák kialakulása és néhány etológiai faktor (HBV, HCV hepatitis, etanol abuzus) és a HCC kialakulása között (252), viszont a folyamat molekuláris háttere ez idáig csak kevéssé ismert. Olyan új módszerek, mint nagy felbontású expressziós metódusok alkalmazása,

azonban

jelentősen

megnövelheti

a

hepatokarcinogenezisről

rendelkezésünkre álló genetikai információ mennyiségét. A mikroarray technológia segítségével sikerült olyan géncsoportokat beazonosítani, amelyek expressziója összefüggést mutat a májtumorok kiújulásával (211), a metasztázisképzéssel (192), vagy a virális infekció típusával (206). Ezen felül, a génexpresszió globális elemzése lehetővé tette, hogy a HCC betegeket a túlélés és a betegség várható kimenetele szerint, a terápiát és prognózist meghatározó csoportokba soroljuk (212). A humán májtumorok esetében az expressziós profilok komplexitása miatt, nehéz kiszűrni a sokféle szabályozó tényező közül azokat, amelyek döntő befolyással bírnak a

betegség kimenetelére. Ezt a problémát úgy próbáltuk feloldani, hogy a genetikai elváltozások

által

generált

transzkripciós

eltéréseket

jól

kontrollálható

állatmodellekben azonosítottuk be. Az így detektált mintázatok segítségével pedig egy komplex funkcionális genomikai elemzés során határoztuk meg a hasonló elváltozást mutató (c-Met aktivált) emberi májrákok csoportját. A HGF növekedési faktor és sejtmembránba integrált tirozin kináz receptora, a c-Met, egyaránt részt vesznek a sejtosztódás, a sejtmotilitás, a differenciálódás, a tubulusképződés és az angiogenezis szabályozásában (253, 254). A c-Met jelátviteli útvonal nélkülözhetetlen az embriogenezis során. Állatmodellekben mind a HGF (255), mind a c-Met gén (256) homozigota deléciója a májtelep és a méhlepény elégtelen fejlődése miatt letális. A HGF knock-out egerekben a máj alulfejlett (257), míg a c-Met útvonal aktivációja meggátolja a kémiai ágensek által kiváltott májfibrózis kialakulását (258), és védi a májsejteket a CD95 ligand mediált apoptozistól (259, 260). A HGF adagolása elősegíti a parciális hepatektomiát követő májregenerációt és megnöveli a májsejtek és a heptikus progenitor sejtek osztódási rátáját (261).

A HGF/c-Met jelátviteli útvonal szerepe az emberi májrák

kialakulásában is jól ismert. A c-Met receptort ezen felül, összefüggésbe hozták az áttétképzés, a tumorok szöveti inváziója és az érképződés szabályozásával (254, 262). Nem meglepő tehát, hogy a c-Met receptor a metasztázis ellenes új terápiás próbálkozások egyik legígéretesebb célpontja (129). Az emberi májrákokban a c-Met fokozott átíródása, illetve mutációja intrahepatikus áttétképződéshez és vaszkuláris invázióhoz vezet, ezáltal döntően befolyásolja a betegség klinikai lefolyását (263, 264). A HCC betegeknek az expressziós mintázat alapján MET+ és METcsoportokba rendeződése tehát egybevág a korábbi megfigyelésekkel. A c-Met aktivált expressziós mintázat jelenléte olyan agresszív tumorok kialakulását eredményezte, amelyekre a magas mikro-vaszkuláris denzitás és a gyakori vaszkuláris invázió volt jellemző (262). A MET+ betegek prognózisa a többi betegnél lényegesen rosszabb volt. Ezt megerősítette a túlélés független, teszt és ellenőrző, elemzése is, melyre hatféle predikciós algoritmust használtunk. A c-Met indukált gének jelentős része evolucionárisan konzervált expressziós mintázatot mutatott (227). Ezen gének tehát, a c-Met mediált fenotípus kialakításában, és ez által a malignus transzformációban meghatározóak. Ezért, a sejtek közötti fokális adhézió és az aktin citoszkeleton szerveződésében szerepet játszó gének, mint ígéretes terápiás célpontok

jönnek számításba. Az a megfigyelés pedig, hogy a májmetasztázist adó tumorok is a MET+ csoporthoz tartoztak, alátámasztja, hogy a c-Met indukált áttétképzés genetikus programja jelentős hasonlóságot mutat a különböző szöveti eredetű tumorok között. Kísérleteink során bebizonyosodott, hogy a genetikailag módosított egerekből izolált primer májsejtek majdnem kiváló modellként szolgáltak, a mutáció- specifikus expressziós program vizsgálatához.

A HGF kezelésre a primer sejtekben adott

transzkripciós válasz lényegében megegyezett az in vivo megfigyelt reakcióval. A cMet kiütött sejtek esetében ráadásul kizárhatjuk a receptor esetleges HGF független, a semaphorin/plexin B1 (265) vagy EGF/EGFR által létrejött aktivációjának lehetőségét (266), ami a célgének specifikusságát igazolja. Ugyanakkor valószínűleg MET+ humán karcinómák esetében a specifikus expressziós profil nem mindig a c-Met receptort közvetlenül érintő elváltozás eredménye. A HGF/c-Met útvonal különböző szintjein bekövetkezett hibák hasonló transzkripciós mintázatot hozhatnak létre. Más, de funkciójukban a c-Met-tel átfedő jelátviteli útvonalak aktivációja is elvezethet a közös effektor gének átíródásához. Ezekben, a tumorokban az egységes transzkripciós mintázat hasonló fenotipust jelez, de a kiváltó genetikai mechanizmus eltérő lehet. Az EGF és TGF-α növekedési faktorok mimikálhatják a HGF transzkripciós hatását, hiszen jól ismert, hogy a c-Met aktivációjához hasonló intracelluláris jelátviteli kaszkádot és fenotipikus választ aktiválnak (266). Korábbi összehasonlítások során hasonlóságot figyeltünk meg a rossz prognózist mutató humán májkarcinóma minták és a MYC/ TGF-α kettős transzgén tumorok expressziós mintázata között. A genomikai adatok alapján tehát ezekben a mintákban a TGF-α/EGFR útvonal aktivációja is kimutatható (217). A funkcionálisan hasonló növekedési faktor/tirozin kináz receptor jelátviteli útvonalak által aktivált transzkripciós mintázatok közötti átfedés mértéke egyenlőre nem ismert. Az EGFR receptorral kapcsolatban azonban leírták, hogy transzformált sejtekben képes a c-Met receptor direkt transzaktiválására is (267). Joggal feltételezhetjük tehát, hogy a c-Met célgének indukciója a vizsgált esetek egy részében az EGFR útvonal aktivációjával is összefüggésben van. Ugyanakkor endoteliális sejtekben nem sikerült hasonlóságot kimutatni a HGF és a VEGF növekedési faktor által kiváltott expressziós mitázatok között (268), jelezve, hogy további vizsgálatok szükségesek az egyes útvonalak közötti összefüggések pontos meghatározásához.

A transzkripciós eltérések magyarázatot adhatnak a c-Met knock-out sejtekben megfigyelt rendellenességek nagy részére is. A knock-out sejtek esetén leirt migrációs és proliferatív defektusok jól korrelálnak a sejtmotilitás és citoszkeleton csatolt gének csökkent indukciójával (222). Vizsgálataink ezen felül először derítettek fényt a c-Met útvonalnak az oxidativ homeosztázis szabályozásában betöltött szerepére. A xenobiotikus és oxidativ stressz válasz (Ephx1, Aldh1a1, Aldh1a7) és a glutation metabolizmus (Gsta3, Gstm3, Gclc) génjeinek fokozott expressziója jelentős metabolikus eltérést valószínűsitett a c-Met knock-out sejtekben.

Ezen gének

átíródását, a promóter régióban található stressz válasz elemen keresztül, az Nrf2 transzkripciós faktor szabályozza (269). Az Nrf2 és célgénjeinek aktivációja nélkülözhetetlen a metabolizmus során keletkező köztes termékek detoxifikációjához, ugyanakkor permanens túltermelésük egyben letális is (270). A c-Met és az Nrf2 regulált útvonalak közötti interakció pontos mechanizmusa nem ismert, bár több alternatív kapcsolódási pont is elképzelhető. Az ERK kináz útvonal c-Met indukált aktivációja a retinoic-X-receptor α (RXRα) inhibiciójához vezet (271), és így az nem képes a PPARγ transzkripciós faktorral komplexet képezve az Nrf2 célgének átíródását serkenteni (272). A c-Met receptor hiánya esetleg a metabolikus egyensúly felbomlásához is vezethet, mely együtt járhat az oxidativ stressz és toxikus metabolitok felhalmozódásával. Így az Nrf2 célgének fokozott átíródása a metabolikus adaptáció részének felfogható. Összegzésképpen megállapíthatjuk, hogy a jelátviteli útvonalak, illetve a genetikai eltérésekre specifikus expressziós mintázatokat sikeresen meghatározhatjuk olyan kísérleti modellekben, ahol a genetikai változók száma jól kontrolálható. Az így nyert mintázatokat a humán tumorokból nyert expressziós adatokkal összevetve pedig a humán tumorok új, molekuláris klasszifikációs rendszerét alkothatjuk meg, aminek szerepe lehet az egyedi prognózis felállításában és a legmegfelelőbb terápiás alternatívák kiválasztásában.

8.

Megállapítások

Vizsgálataim során a következő megállapításokat tettem: 5.1. A paraffinba ágyazott mintákból kinyerhető szöveti RNS integritása formalin, aceton és RNAlater fixálószerekkel azonos mértékű. A 225 bp-nál rövidebb RNS szakaszok az archivált mintából hatékonyan felamplifikálhatók. Az immuhisztokémiai festések a formalin fixált mintákon megbízhatóbban működnek, mint a két másik fixálószer használata esetén. 5.2

A lineáris amplifikáció átlagos mértéke a T7T3 módszer használata estén

átlagosan 2 x 104 , az átlagos termékhossz 150 és 1,350 bp között tálható. Az aRNS termékből anti-sense szálú, aminoallyl jelölt cDNS minta szintetizálható. 5.3 Mikroarray elemzés során a T7T3 amplifikált minták jó korrelációt mutatnak mind a technikai replikátumokkal (Pearson r=0.9), mind a nem amplifikált mintákkal (Pearson r=0.78).

Az amplifikáció során a májtumorok genotípusára jellemző

expressziós mintázatok megőrződnek. 5.4 A HGF/c-Met útvonal aktivációja egér primer májsejtekben a korai válasz gének mellet a sejtadhézióban, a sejtmotilitásban és a sejtváz felépítésében részt vevő gének expresszióját indukálja. A c-Met útvonal meghatározó szerepet játszik az oxidativ stressz válasz gének regulációjában. A c-Met knock-out hepatocitákban 67 gén expressziója permanens adaptációs különbséget mutat. 5.5 Az orthológ HGF indukált gének expressziója a humán májkarcinómákban illetve májmetasztázisok egy csoportjában a c-Met aktivációjával megegyező mintázatot mutat. Ezen tumorokban a mikrovaszkuláris denzitás (átlagosan 90.8 ± 6.7 vs. 44.5 ± 6.2, p<0.001) és a vaszkuláris invázió frekvenciája (χ2=4.0, p<0.05) szignifikánsan megemelkedett. 5.6 A c-Met aktivált mintázaton alapuló predikciós modell 83-95% százalékos pontossággal képes a humán HCC betegek prognózisának megbecslésére. A c-Met

aktivációt mutató betegek túlélése (átlagosan 35.1 ± 7.15 hónap) mint a többi betegé (70.3 ± 9.7 hónap).

9.

Conclusions

Our investigations revealed the following significant findings: 9.1

There was no difference in the integrity of RNA obtained from the formalin,

acetone or RNAlater fixed specimens. Short, less than 225 bp products could be efficiently amplified from archived tissues. Consistency of immunohistochemical stains was superior with formalin than with the other two fixatives. 9.2 The T7T3 method achieves on average 2x104 linear RNA amplification rate, while the average product length ranges between 150 and 1,350 bp. The aRNA product from the T7T3 amplification could be reversed transcribed into anti-sense strand, aminoallyl modified cDNA. 9.3 Microarray profiles of T7T3 amplified samples show strong correlation with nonamplified controls (Pearson r=0.9) as well as with experimental replicates (Pearson r=0.78). The linear RNA amplification preserves the genotype specific expression patterns of the transgenic mouse liver tumors. 9.4 Activation of the HGF/c-Met signal transduction pathway in mouse primary hepatocytes, in addition to the activation of immediate early response genes, induces expression of genes involved in cell motility, adhesion and cytoskeleta organization. The c-Met pathway controls transcriptional activation of oxidative stress response genes. Adaptation of c-Met knock-out hepatocytes permanently alters expression levels of 67 genes. 9.5 Presence of the HGF induced expression signature suggests activation of c-Met signaling in a set of primary human liver tumors and metastases. In these lesions microvessel density (90.8 ± 6.7 vs. 44.5 ± 6.2, p<0.001) and microvascular invasion rate (χ2=4.0, p<0.05) are significantly higher than in other tumors.

9.6 A genomic prediction model constructed from the HGF/c-Met signature genes predicts prognosis of HCC patients with 83-95% accuracy. The average survival with c-Met signature positive tumors is significantly shorter (35.1 ± 7.15 months) than the rest of the HCC patient’s (70.3 ± 9.7 months).

10. Összefoglalás A génexpresszió mikroarray alapú globális elemzése sikeresen alkalmazható a humán tumorok, közöttük a primer májrákok karakterizációjára. A mikroarray technológia elősegítheti a rákbetegek korai diagnózisát, prognosztikus és terápiás klasszifikációját. Annak érdekében, hogy az archivált patológia mintákban elrejtett genomikai

információhoz

jobb

hozzáférést

biztosítsunk,

három

különböző

fixálószerrel kezelt, paraffin beágyazott szöveteken vizsgáltuk az RT-PCR reakciók hatékonyságát.

Minden

fixálószer

estén

megbízható

amplifikációt

kaptunk,

amennyiben az amplikon mérete nem haladta meg 225 bp-t. A termékhossz további növekedésével azonban, a reakció hatékonysága és reprodukálhatósága gyorsan csökkent. A legjobb szöveti morfológiát és a legegyenletesebb claudin-4 és claudin-7 immunhisztokémiai festést ugyanakkor a formalin fixált minták estén láttuk. A konvencionális lineáris RNS amplifikációs protokollt egy random nonamer T3 polimeráz lépéssel módosítottuk. A T7T3 amplifikáció olyan sense szálú terméket hozott létre, ami indirekt jelölt cDNS templátá volt konvertálható. Az fagyasztott és mikrodisszektált Myc és Myc/Tgf-α egér tumorok mikroarray elemzése során, amplifikációt

követően

jól

reprodukálható

expressziós

profilokat

(r=0.9)

eredményezett, az eredeti expessziós mintázatok megtartottak (r=0.79) voltak. HGF kezelt, c-Met kondiconális knock-out és kontrol egér májsejtek expressziós profiljainak összehasonlításával 690 a HGF/c-Met útvonal által azonosítottunk. A szignifikáns gének funkcionális elemzése azt mutatta, hogy a c-Met receptor a májsejtek oxidativ homeosztázisának fontos regulátora. A c-Met indukált expressziós mintázat kifejeződését humán HCC-kben is vizsgáltuk, és beazonosítottuk a humán tumorok egy csoportját, amelyekben c-Met útvonal aktivációja valószínűsíthető (MET+). Ezen tumorokra a gyakori vaszkuláris invázió, a magas mikrovaszkuláris sűrűség és a többi képest rövidebb túlélés volt jellemző. Egy a 111 evolúcionálisan konzervált c-Met célgén expresszióján alapuló predikciós modell pedig 83-95% pontossággal volt képes a májkarcinóma betegeket a jó és a rossz túlélést mutató csoportokba szétválogatni. Összességében kutatásaink megmutatták, hogy a gondos kísérlet tervezés és a legkorszerűbb molekuláris metodikák felhasználása mellett archivált és kis méretű mintákon is lehetővé válik a globális génexpresszió elemzése. A komparatív genomikai segítségével pedig olyan új molekuláris klasszifikációs

rendszereket hozhatunk létre, amelyek nélkülözhetetlenek az egyénre szabott terápiák bevezetéséhez.

11. Summary

11. Summary

Global transcriptome analysis has been successfully applied to characterize various human tumors, including hepatocellular carcinomas. This novel technology can facilitate early discovery as well as prognostic and therapeutic diversification of cancer patients. To enhance access to the genomic information buried in archived pathology samples, we assessed RT-PCR amplification rates in paraffin embedded tissues preserved in three different fixálószeres. Reliable amplification could be achieved from all paraffin embedded specimens, when the amplicon size did not exceed 225 bp. A longer amplicon size resulted in rapid decrease of yield and reproducibility. In addition, formalin provided superior morphology and better reactivity with claudin-4 and -7 immunohistochemistry. Amplification of the initial sample is often required before transcriptome analysis of clinical specimens could be performed. We introduced a random nonamer primed T3 polymerase reaction into the conventional linear RNA amplification protocol. The modified T3T7 method generated a sense strand product ideal for synthesizing indirectly labeled cDNA templates. Microarray analysis of amplified frozen and laser micro-dissected Myc and Myc/Tgfα mouse liver tumors confirmed good reproducibility (r=0.9) of the reaction and conservation of original transcriptional patterns (r=0.79). Finally, we tested the utility of expression profiling for the classification of human HCC samples. By comparing expression data from HGF treated c-Met conditional knock-out and control primary mouse hepatocytes, we identified 690 HGF/c-Met target genes. Functional analysis of the significant gene set implicated c-Met as key regulator of hepatocyte motility and oxidative homeostasis. Cross comparison of the c-Met induced transcription signature with human HCC expression profiles revealed a group of tumors (27%) with potentially activated c-Met signaling (MET+). These tumors were characterized by higher vascular invasion rate, increased microvessel density, and shortened survival.

A prediction model based on 111 cross-species conserved c-Met

signature genes was able to diversify HCC patients into good and bad prognostic groups with 83-95% accuracy. Our results therefore demonstrate that careful experimental design and state-of-the-art laboratory methods could open the way

for global expression profiling of archived and limited availability pathologic samples. While comparative functional genomics based analysis of the cancer transcriptome could lead to novel molecular classification systems which are essential for the introduction of individualized cancer therapeutics.

14. Köszönetnyilvánitás

12. Táblázatok és ábrák jegyzéke

12.1 Táblázatok jegyzéke TÁBLÁZAT 1: A MÁJRÁKOKBAN ELŐFORDULÓ LEGGYAKORIBB LOH ÉS KROMOSZÓMA ELTÉRÉSEK. .....21 TÁBLÁZAT 2 : A LEGGYAKORIBB MUTÁCIÓK ÉS LOH-K FREKVENCIÁJA A HUMÁN MÁJRÁKOKBAN. .......26 TÁBLÁZAT 3 : A MIKROARRAY PRÓBÁK JELÖLÉSÉRE HASZNÁLT MÓDSZEREK ÖSSZEHASONLÍTÁSA........40 TÁBLÁZAT 4 : AZ ENDOMETRIÁLIS MINTÁK ELEMZÉSHEZ HASZNÁLT PRIMEREK.SZEKVENCIÁI...............67 TÁBLÁZAT 5 : A GAPDH ÉS β-GLOBIN SZAKASZOK AMPLFIKÁCIÓJÁNAK HATÁSFOKA. .........................76 TÁBLÁZAT 6 : A KLINIKAI PARAMÉTEREK ELOSZLÁSA A MET+ ÉS MET- BETEGEK KÖZÖTT..................91 TÁBLÁZAT 7 : A C-MET ALAPÚ PREDIKCIÓS MODELL HATÉKONYSÁGA...................................................95

12.2 Ábrák jegyzéke ÁBRA 1: A MÁJKARCINÓMÁK TERMÉSZETES TÚLÉLÉSE...........................................................................11 ÁBRA 2: GENETIKAI ELTÉRÉSEK FOKOZÓDÓ FREKVENCIÁJA A HCC PROGRESSZIÓJA SORÁN..................17 ÁBRA 3 : A C-MET RECEPTOR ÉS LIGANDJA, A HGF, STRUKTURÁLIS FELÉPÍTÉSE. ..................................31 ÁBRA 4 : A MIKROARRAY ADATOK INTENZITÁSFÜGGŐ NORMALIZÁCIÓJA. .............................................48 ÁBRA 5 : SELF-ORGANIZING MAP (SOM) KLASZTER ELEMZÉS. ...............................................................50 ÁBRA 6 : A C-MET INDUKÁLHATÓ DELÉCIÓJÁT LEHETŐVÉ TÉVŐ GÉNKONSTRUKT FELÉPÍTÉSE...............62 ÁBRA 7 : A C-MET INDUKÁLT SPECIFIKUS DELÉCIÓJA AZ ÉRETT MÁJSEJTEKBEN. ...................................63 ÁBRA 8 : A KÜLÖNBÖZŐ FIXÁLÓSZEREK HATÁSA AZ ENDOMETRIÁLIS MORFOLÓGIÁRA..........................73 ÁBRA 9 : CLAUDIN 4 IMMUNFESTÉS. .......................................................................................................74 ÁBRA 10 : CLAUDIN 7 IMMUNFESTÉS. .....................................................................................................74 ÁBRA 11: A NÖVEKVŐ HOSSZÚSÁGÚ TERMÉKEK AMPLFIKÁCIÓJA A BEÁGYAZOTT MINTÁKBAN. ............76 ÁBRA 12 : A T7T3 LINEÁRIS RNS AMPLIFIKÁCIÓ FOLYAMATA. .............................................................77 ÁBRA 13 : A T7T3 AMPLIFIKÁLT ÉS A TELJES RNS MINTÁK ÖSSZEHASONLITÁSA...................................78 ÁBRA 14 : A C-MET EXPRESSZIÓS MINTÁZAT ELEMZÉSÉNEK LÉPÉSEI. ....................................................80 ÁBRA 15 : A HGF CÉLGÉNEK EXPRESSZIÓS MINTÁZATA AZ EGÉR MÁJSEJTEKBEN. .................................82 ÁBRA 16 : A C-MET CÉLGÉNEK PCR VALIDÁCIÓJA.................................................................................83 ÁBRA 17 : A C-MET KO MÁJSEJTEKBEN ÉSZLELT CITOSZKELETÁLIS ÉS REDOX ELTÉRÉSEK. ..................85 ÁBRA 18 : A C-MET CÉLGÉNEK ÁTIRÓDÁSA AZ LEC MÁJRÁK MINTÁKBAN. ...........................................88 ÁBRA 19 : A C-MET CÉLGÉNEK ÁTIRÓDÁSA A STANFORD MÁJRÁK MINTÁKBAN.....................................89 ÁBRA 20 : A MET+ TUMOROK FENOTIPUSA............................................................................................92 ÁBRA 21 : A C-MET CÉLGÉNEKEN ALAPULÓ PREDIKCIÓS MODELL VALIDÁLÁSA. ...................................94

13. Irodalomjegyzék 1.

El-Serag HB, Rudolph KL. Hepatocellular carcinoma: epidemiology and

molecular carcinogenesis. Gastroenterology 2007;132:2557-2576. 2.

Parkin DM. Global cancer statistics in the year 2000. Lancet Oncol

2001;2:533-543. 3.

Tan A, Yeh SH, Liu CJ, Cheung C, Chen PJ. Viral hepatocarcinogenesis: from

infection to cancer. Liver Int 2008;28:175-188. 4.

Lotz G, Kiss A, Novak PK, Sobel G, Schaff Z. Hepatitis viruses and

hepatocarcinogenesis. J Physiol Paris 2001;95:417-422. 5.

Buendia MA. Genetics of hepatocellular carcinoma. Semin Cancer Biol

2000;10:185-200. 6.

Feitelson MA, Lee J. Hepatitis B virus integration, fragile sites, and

hepatocarcinogenesis. Cancer Lett 2007;252:157-170. 7.

Kane MA. Global control of primary hepatocellular carcinoma with hepatitis

B vaccine: the contributions of research in Taiwan. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003;12:2-3. 8.

Camma C, Giunta M, Andreone P, Craxi A. Interferon and prevention of

hepatocellular carcinoma in viral cirrhosis: an evidence-based approach. J Hepatol 2001;34:593-602. 9.

Avila MA, Berasain C, Sangro B, Prieto J. New therapies for hepatocellular

carcinoma. Oncogene 2006;25:3866-3884. 10.

Feitelson MA, Sun B, Satiroglu Tufan NL, Liu J, Pan J, Lian Z. Genetic

mechanisms of hepatocarcinogenesis. Oncogene 2002;21:2593-2604. 11.

Garner RC, Miller EC, Miller JA. Liver microsomal metabolism of aflatoxin B

1 to a reactive derivative toxic to Salmonella typhimurium TA 1530. Cancer Res 1972;32:2058-2066. 12.

Turner PC, Sylla A, Diallo MS, Castegnaro JJ, Hall AJ, Wild CP. The role of

aflatoxins and hepatitis viruses in the etiopathogenesis of hepatocellular carcinoma: A basis for primary prevention in Guinea-Conakry, West Africa. J Gastroenterol Hepatol 2002;17 Suppl:S441-448. 13.

Kiss

A,

Lotz

G,

Kaposi

NP,

Schaff

hepatocarcinogenesis]. Orv Hetil 2002;143:83-86.

Z.

[Hepatitis

viruses

and

14.

Hassan MM, Frome A, Patt YZ, El-Serag HB. Rising prevalence of hepatitis C

virus infection among patients recently diagnosed with hepatocellular carcinoma in the United States. J Clin Gastroenterol 2002;35:266-269. 15.

Yoshizawa H. Hepatocellular carcinoma associated with hepatitis C virus

infection in Japan: projection to other countries in the foreseeable future. Oncology 2002;62 Suppl 1:8-17. 16.

Donato F, Tagger A, Gelatti U, Parrinello G, Boffetta P, Albertini A, Decarli

A, et al. Alcohol and hepatocellular carcinoma: the effect of lifetime intake and hepatitis virus infections in men and women. Am J Epidemiol 2002;155:323-331. 17.

Hashizume H, Sato K, Takagi H, Hirokawa T, Kojima A, Sohara N, Kakizaki

S, et al. Primary liver cancers with nonalcoholic steatohepatitis. Eur J Gastroenterol Hepatol 2007;19:827-834. 18.

Bruix J, Boix L, Sala M, Llovet JM. Focus on hepatocellular carcinoma.

Cancer Cell 2004;5:215-219. 19.

Llovet JM, Fuster J, Bruix J. Prognosis of hepatocellular carcinoma.

Hepatogastroenterology 2002;49:7-11. 20.

Pang RW, Poon RT. From molecular biology to targeted therapies for

hepatocellular carcinoma: the future is now. Oncology 2007;72 Suppl 1:30-44. 21.

Llovet JM, Bustamante J, Castells A, Vilana R, Ayuso Mdel C, Sala M, Bru C,

et al. Natural history of untreated nonsurgical hepatocellular carcinoma: rationale for the design and evaluation of therapeutic trials. Hepatology 1999;29:62-67. 22.

Feitelson MA. Parallel epigenetic and genetic changes in the pathogenesis of

hepatitis virus-associated hepatocellular carcinoma. Cancer Lett 2006;239:10-20. 23.

Szabo E, Paska C, Kaposi Novak P, Schaff Z, Kiss A. Similarities and

differences in hepatitis B and C virus induced hepatocarcinogenesis. Pathol Oncol Res 2004;10:5-11. 24.

Matsubara K, Tokino T. Integration of hepatitis B virus DNA and its

implications for hepatocarcinogenesis. Mol Biol Med 1990;7:243-260. 25.

Zou SQ, Qu ZL, Li ZF, Wang X. Hepatitis B virus X gene induces human

telomerase reverse transcriptase mRNA expression in cultured normal human cholangiocytes. World J Gastroenterol 2004;10:2259-2262. 26.

Herath NI, Leggett BA, MacDonald GA. Review of genetic and epigenetic

alterations in hepatocarcinogenesis. J Gastroenterol Hepatol 2006;21:15-21.

27.

Yu X, Mertz JE. Differential regulation of the pre-C and pregenomic

promoters of human hepatitis B virus by members of the nuclear receptor superfamily. J Virol 1997;71:9366-9374. 28.

Elgui de Oliveira D. DNA viruses in human cancer: an integrated overview on

fundamental mechanisms of viral carcinogenesis. Cancer Lett 2007;247:182-196. 29.

Tennant BC, Gerin JL. The woodchuck model of hepatitis B virus infection.

Ilar J 2001;42:89-102. 30.

Feitelson MA, Duan LX. Hepatitis B virus X antigen in the pathogenesis of

chronic infections and the development of hepatocellular carcinoma. Am J Pathol 1997;150:1141-1157. 31.

Diamantis ID, McGandy CE, Chen TJ, Liaw YF, Gudat F, Bianchi L.

Hepatitis B X-gene expression in hepatocellular carcinoma. J Hepatol 1992;15:400403. 32.

Koike K, Moriya K, Iino S, Yotsuyanagi H, Endo Y, Miyamura T, Kurokawa

K. High-level expression of hepatitis B virus HBx gene and hepatocarcinogenesis in transgenic mice. Hepatology 1994;19:810-819. 33.

Benn J, Schneider RJ. Hepatitis B virus HBx protein deregulates cell cycle

checkpoint controls. Proc Natl Acad Sci U S A 1995;92:11215-11219. 34.

Su F, Schneider RJ. Hepatitis B virus HBx protein activates transcription

factor NF-kappaB by acting on multiple cytoplasmic inhibitors of rel-related proteins. J Virol 1996;70:4558-4566. 35.

Benn J, Su F, Doria M, Schneider RJ. Hepatitis B virus HBx protein induces

transcription factor AP-1 by activation of extracellular signal-regulated and c-Jun Nterminal mitogen-activated protein kinases. J Virol 1996;70:4978-4985. 36.

Lee YH, Yun Y. HBx protein of hepatitis B virus activates Jak1-STAT

signaling. J Biol Chem 1998;273:25510-25515. 37.

Shih WL, Kuo ML, Chuang SE, Cheng AL, Doong SL. Hepatitis B virus X

protein inhibits transforming growth factor-beta -induced apoptosis through the activation of phosphatidylinositol 3-kinase pathway. J Biol Chem 2000;275:2585825864. 38.

Benn J, Schneider RJ. Hepatitis B virus HBx protein activates Ras-GTP

complex formation and establishes a Ras, Raf, MAP kinase signaling cascade. Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91:10350-10354.

39.

Cha MY, Kim CM, Park YM, Ryu WS. Hepatitis B virus X protein is essential

for the activation of Wnt/beta-catenin signaling in hepatoma cells. Hepatology 2004;39:1683-1693. 40.

Maguire HF, Hoeffler JP, Siddiqui A. HBV X protein alters the DNA binding

specificity of CREB and ATF-2 by protein-protein interactions. Science 1991;252:842-844. 41.

Antunovic J, Lemieux N, Cromlish JA. The 17 kDa HBx protein encoded by

hepatitis B virus interacts with the activation domains of Oct-1, and functions as a coactivator in the activation and repression of a human U6 promoter. Cell Mol Biol Res 1993;39:463-482. 42.

Wang XW, Forrester K, Yeh H, Feitelson MA, Gu JR, Harris CC. Hepatitis B

virus X protein inhibits p53 sequence-specific DNA binding, transcriptional activity, and association with transcription factor ERCC3. Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91:2230-2234. 43.

Barnabas S, Hai T, Andrisani OM. The hepatitis B virus X protein enhances

the DNA binding potential and transcription efficacy of bZip transcription factors. J Biol Chem 1997;272:20684-20690. 44.

Lee SG, Rho HM. Transcriptional repression of the human p53 gene by

hepatitis B viral X protein. Oncogene 2000;19:468-471. 45.

Sun BS, Zhu X, Clayton MM, Pan J, Feitelson MA. Identification of a protein

isolated from senescent human cells that binds to hepatitis B virus X antigen. Hepatology 1998;27:228-239. 46.

Wentz MJ, Becker SA, Slagle BL. Dissociation of DDB1-binding and

transactivation properties of the hepatitis B virus X protein. Virus Res 2000;68:87-92. 47.

Livezey KW, Simon D. Accumulation of genetic alterations in a human

hepatoma cell line transfected with hepatitis B virus. Mutat Res 1997;377:187-198. 48.

Forgues M, Difilippantonio MJ, Linke SP, Ried T, Nagashima K, Feden J,

Valerie K, et al. Involvement of Crm1 in hepatitis B virus X protein-induced aberrant centriole replication and abnormal mitotic spindles. Mol Cell Biol 2003;23:52825292. 49.

Liu J, Lian Z, Han S, Waye MM, Wang H, Wu MC, Wu K, et al.

Downregulation of E-cadherin by hepatitis B virus X antigen in hepatocellullar carcinoma. Oncogene 2006;25:1008-1017.

50.

Dandri M, Lutgehetmann M, Volz T, Petersen J. Small animal model systems

for studying hepatitis B virus replication and pathogenesis. Semin Liver Dis 2006;26:181-191. 51.

Yang F, Yan S, He Y, Wang F, Song S, Guo Y, Zhou Q, et al. Expression of

hepatitis B virus proteins in transgenic mice alters lipid metabolism and induces oxidative stress in the liver. J Hepatol 2008;48:12-19. 52.

Bruix J, Barrera JM, Calvet X, Ercilla G, Costa J, Sanchez-Tapias JM, Ventura

M, et al. Prevalence of antibodies to hepatitis C virus in Spanish patients with hepatocellular carcinoma and hepatic cirrhosis. Lancet 1989;2:1004-1006. 53.

Levrero M. Viral hepatitis and liver cancer: the case of hepatitis C. Oncogene

2006;25:3834-3847. 54.

Sherlock S. The hepatic flaviviridae: summary. J Viral Hepat 1999;6 Suppl

1:1-5. 55.

Gerber MA, Shieh YS, Shim KS, Thung SN, Demetris AJ, Schwartz M, Akyol

G, et al. Detection of replicative hepatitis C virus sequences in hepatocellular carcinoma. Am J Pathol 1992;141:1271-1277. 56.

Spaziani A, Alisi A, Sanna D, Balsano C. Role of p38 MAPK and RNA-

dependent protein kinase (PKR) in hepatitis C virus core-dependent nuclear delocalization of cyclin B1. J Biol Chem 2006;281:10983-10989. 57.

Moriya K, Fujie H, Shintani Y, Yotsuyanagi H, Tsutsumi T, Ishibashi K,

Matsuura Y, et al. The core protein of hepatitis C virus induces hepatocellular carcinoma in transgenic mice. Nat Med 1998;4:1065-1067. 58.

Kawamura H, Govindarajan S, Aswad F, Machida K, Lai MM, Sung VM,

Dennert G. HCV core expression in hepatocytes protects against autoimmune liver injury and promotes liver regeneration in mice. Hepatology 2006;44:936-944. 59.

Ghosh AK, Steele R, Meyer K, Ray R, Ray RB. Hepatitis C virus NS5A

protein modulates cell cycle regulatory genes and promotes cell growth. J Gen Virol 1999;80 ( Pt 5):1179-1183. 60.

Pan Y, Wei W, Kang L, Wang Z, Fang J, Zhu Y, Wu J. NS5A protein of HCV

enhances HBV replication and resistance to interferon response. Biochem Biophys Res Commun 2007;359:70-75. 61.

Severi T, Vander Borght S, Libbrecht L, VanAelst L, Nevens F, Roskams T,

Cassiman D, et al. HBx or HCV core gene expression in HepG2 human liver cells

results in a survival benefit against oxidative stress with possible implications for HCC development. Chem Biol Interact 2007;168:128-134. 62.

Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell

1990;61:759-767. 63.

Midorikawa Y, Yamamoto S, Ishikawa S, Kamimura N, Igarashi H, Sugimura

H, Makuuchi M, et al. Molecular karyotyping of human hepatocellular carcinoma using single-nucleotide polymorphism arrays. Oncogene 2006;25:5581-5590. 64.

Libbrecht L, Desmet V, Roskams T. Preneoplastic lesions in human

hepatocarcinogenesis. Liver Int 2005;25:16-27. 65.

Thorgeirsson

SS,

Grisham

JW.

Molecular

pathogenesis

of

human

hepatocellular carcinoma. Nat Genet 2002;31:339-346. 66.

Jorgenson E, Witte JS. A gene-centric approach to genome-wide association

studies. Nat Rev Genet 2006;7:885-891. 67.

Nagai H, Pineau P, Tiollais P, Buendia MA, Dejean A. Comprehensive

allelotyping of human hepatocellular carcinoma. Oncogene 1997;14:2927-2933. 68.

Sheu JC, Lin YW, Chou HC, Huang GT, Lee HS, Lin YH, Huang SY, et al.

Loss of heterozygosity and microsatellite instability in hepatocellular carcinoma in Taiwan. Br J Cancer 1999;80:468-476. 69.

Ding SF, Habib NA. Loss of heterozygosity in liver tumours. J Hepatol

1995;22:230-238. 70.

Laurent-Puig P, Legoix P, Bluteau O, Belghiti J, Franco D, Binot F, Monges

G, et al. Genetic alterations associated with hepatocellular carcinomas define distinct pathways of hepatocarcinogenesis. Gastroenterology 2001;120:1763-1773. 71.

Villanueva A, Newell P, Chiang DY, Friedman SL, Llovet JM. Genomics and

signaling pathways in hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis 2007;27:55-76. 72.

Tannapfel A, Wittekind C. Genes involved in hepatocellular carcinoma:

deregulation in cell cycling and apoptosis. Virchows Arch 2002;440:345-352. 73.

Poon TC, Wong N, Lai PB, Rattray M, Johnson PJ, Sung JJ. A tumor

progression model for hepatocellular carcinoma: bioinformatic analysis of genomic data. Gastroenterology 2006;131:1262-1270. 74.

Luo JH, Ren B, Keryanov S, Tseng GC, Rao UN, Monga SP, Strom S, et al.

Transcriptomic and genomic analysis of human hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas. Hepatology 2006;44:1012-1024.

75.

Macdonald GA, Greenson JK, Saito K, Cherian SP, Appelman HD, Boland

CR. Microsatellite instability and loss of heterozygosity at DNA mismatch repair gene loci occurs during hepatic carcinogenesis. Hepatology 1998;28:90-97. 76.

Hussain SP, Schwank J, Staib F, Wang XW, Harris CC. TP53 mutations and

hepatocellular carcinoma: insights into the etiology and pathogenesis of liver cancer. Oncogene 2007;26:2166-2176. 77.

Ito T, Nishida N, Fukuda Y, Nishimura T, Komeda T, Nakao K. Alteration of

the p14(ARF) gene and p53 status in human hepatocellular carcinomas. J Gastroenterol 2004;39:355-361. 78.

Bressac B, Kew M, Wands J, Ozturk M. Selective G to T mutations of p53

gene in hepatocellular carcinoma from southern Africa. Nature 1991;350:429-431. 79.

Jia L, Wang XW, Harris CC. Hepatitis B virus X protein inhibits nucleotide

excision repair. Int J Cancer 1999;80:875-879. 80.

Otsuka M, Kato N, Lan K, Yoshida H, Kato J, Goto T, Shiratori Y, et al.

Hepatitis C virus core protein enhances p53 function through augmentation of DNA binding affinity and transcriptional ability. J Biol Chem 2000;275:34122-34130. 81.

Bourdon JC. p53 and its isoforms in cancer. Br J Cancer 2007;97:277-282.

82.

Tannapfel A, Wasner M, Krause K, Geissler F, Katalinic A, Hauss J, Mossner

J, et al. Expression of p73 and its relation to histopathology and prognosis in hepatocellular carcinoma. J Natl Cancer Inst 1999;91:1154-1158. 83.

Giacinti C, Giordano A. RB and cell cycle progression. Oncogene

2006;25:5220-5227. 84.

Conner EA, Lemmer ER, Omori M, Wirth PJ, Factor VM, Thorgeirsson SS.

Dual functions of E2F-1 in a transgenic mouse model of liver carcinogenesis. Oncogene 2000;19:5054-5062. 85.

Choi BH, Choi M, Jeon HY, Rho HM. Hepatitis B viral X protein overcomes

inhibition of E2F1 activity by pRb on the human Rb gene promoter. DNA Cell Biol 2001;20:75-80. 86.

Higashitsuji H, Itoh K, Nagao T, Dawson S, Nonoguchi K, Kido T, Mayer RJ,

et al. Reduced stability of retinoblastoma protein by gankyrin, an oncogenic ankyrinrepeat protein overexpressed in hepatomas. Nat Med 2000;6:96-99. 87.

Nishida N, Fukuda Y, Komeda T, Kita R, Sando T, Furukawa M, Amenomori

M, et al. Amplification and overexpression of the cyclin D1 gene in aggressive human hepatocellular carcinoma. Cancer Res 1994;54:3107-3110.

88.

Yao YJ, Ping XL, Zhang H, Chen FF, Lee PK, Ahsan H, Chen CJ, et al.

PTEN/MMAC1 mutations in hepatocellular carcinomas. Oncogene 1999;18:31813185. 89.

Chung TW, Lee YC, Ko JH, Kim CH. Hepatitis B Virus X protein modulates

the expression of PTEN by inhibiting the function of p53, a transcriptional activator in liver cells. Cancer Res 2003;63:3453-3458. 90.

Hamada K, Sasaki T, Koni PA, Natsui M, Kishimoto H, Sasaki J, Yajima N, et

al. The PTEN/PI3K pathway governs normal vascular development and tumor angiogenesis. Genes Dev 2005;19:2054-2065. 91.

Qin LF, Ng IO, Fan ST, Ng M. p21/WAF1, p53 and PCNA expression and

p53 mutation status in hepatocellular carcinoma. Int J Cancer 1998;79:424-428. 92.

Kwun HJ, Jang KL. Dual effects of hepatitis C virus Core protein on the

transcription of cyclin-dependent kinase inhibitor p21 gene. J Viral Hepat 2003;10:249-255. 93.

Han HJ, Jung EY, Lee WJ, Jang KL. Cooperative repression of cyclin-

dependent kinase inhibitor p21 gene expression by hepatitis B virus X protein and hepatitis C virus core protein. FEBS Lett 2002;518:169-172. 94.

Sheahan S, Bellamy CO, Treanor L, Harrison DJ, Prost S. Additive effect of

p53, p21 and Rb deletion in triple knockout primary hepatocytes. Oncogene 2004;23:1489-1497. 95.

Anzola M, Cuevas N, Lopez-Martinez M, Saiz A, Burgos JJ, Martinez de

Pancorboa M. P14ARF gene alterations in human hepatocellular carcinoma. Eur J Gastroenterol Hepatol 2004;16:19-26. 96.

Prochownik EV, Li Y. The ever expanding role for c-Myc in promoting

genomic instability. Cell Cycle 2007;6:1024-1029. 97.

Abou-Elella A, Gramlich T, Fritsch C, Gansler T. c-myc amplification in

hepatocellular carcinoma predicts unfavorable prognosis. Mod Pathol 1996;9:95-98. 98.

Nambu S, Inoue K, Saski H. Site-specific hypomethylation of the c-myc

oncogene in human hepatocellular carcinoma. Jpn J Cancer Res 1987;78:695-704. 99.

Sansom OJ, Meniel VS, Muncan V, Phesse TJ, Wilkins JA, Reed KR, Vass

JK, et al. Myc deletion rescues Apc deficiency in the small intestine. Nature 2007;446:676-679.

100.

Terradillos O, Billet O, Renard CA, Levy R, Molina T, Briand P, Buendia

MA. The hepatitis B virus X gene potentiates c-myc-induced liver oncogenesis in transgenic mice. Oncogene 1997;14:395-404. 101.

Fujiwara Y, Hoon DS, Yamada T, Umeshita K, Gotoh M, Sakon M, Nishisho

I, et al. PTEN / MMAC1 mutation and frequent loss of heterozygosity identified in chromosome 10q in a subset of hepatocellular carcinomas. Jpn J Cancer Res 2000;91:287-292. 102.

Nelson WJ, Nusse R. Convergence of Wnt, beta-catenin, and cadherin

pathways. Science 2004;303:1483-1487. 103.

Lee JO, Kwun HJ, Jung JK, Choi KH, Min DS, Jang KL. Hepatitis B virus X

protein represses E-cadherin expression via activation of DNA methyltransferase 1. Oncogene 2005;24:6617-6625. 104.

Giles RH, van Es JH, Clevers H. Caught up in a Wnt storm: Wnt signaling in

cancer. Biochim Biophys Acta 2003;1653:1-24. 105.

van Es JH, Barker N, Clevers H. You Wnt some, you lose some: oncogenes in

the Wnt signaling pathway. Curr Opin Genet Dev 2003;13:28-33. 106.

de La Coste A, Romagnolo B, Billuart P, Renard CA, Buendia MA, Soubrane

O, Fabre M, et al. Somatic mutations of the beta-catenin gene are frequent in mouse and human hepatocellular carcinomas. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95:8847-8851. 107.

Kim YD, Park CH, Kim HS, Choi SK, Rew JS, Kim DY, Koh YS, et al.

Genetic alterations of Wnt signaling pathway-associated genes in hepatocellular carcinoma. J Gastroenterol Hepatol 2008;23:110-118. 108.

Satoh S, Daigo Y, Furukawa Y, Kato T, Miwa N, Nishiwaki T, Kawasoe T, et

al. AXIN1 mutations in hepatocellular carcinomas, and growth suppression in cancer cells by virus-mediated transfer of AXIN1. Nat Genet 2000;24:245-250. 109.

Mao TL, Chu JS, Jeng YM, Lai PL, Hsu HC. Expression of mutant nuclear

beta-catenin correlates with non-invasive hepatocellular carcinoma, absence of portal vein spread, and good prognosis. J Pathol 2001;193:95-101. 110.

Feig LA, Buchsbaum RJ. Cell signaling: life or death decisions of ras proteins.

Curr Biol 2002;12:R259-261. 111.

Kim YC, Song KS, Yoon G, Nam MJ, Ryu WS. Activated ras oncogene

collaborates with HBx gene of hepatitis B virus to transform cells by suppressing HBx-mediated apoptosis. Oncogene 2001;20:16-23.

112.

Riedemann J, Macaulay VM. IGF1R signalling and its inhibition. Endocr

Relat Cancer 2006;13 Suppl 1:S33-43. 113.

Scharf

JG,

Dombrowski

F,

Ramadori

G.

The

IGF

axis

and

hepatocarcinogenesis. Mol Pathol 2001;54:138-144. 114.

Kim SO, Park JG, Lee YI. Increased expression of the insulin-like growth

factor I (IGF-I) receptor gene in hepatocellular carcinoma cell lines: implications of IGF-I receptor gene activation by hepatitis B virus X gene product. Cancer Res 1996;56:3831-3836. 115.

Hopfner M, Huether A, Sutter AP, Baradari V, Schuppan D, Scherubl H.

Blockade of IGF-1 receptor tyrosine kinase has antineoplastic effects in hepatocellular carcinoma cells. Biochem Pharmacol 2006;71:1435-1448. 116.

Scharf JG, Schmidt-Sandte W, Pahernik SA, Ramadori G, Braulke T,

Hartmann H. Characterization of the insulin-like growth factor axis in a human hepatoma cell line (PLC). Carcinogenesis 1998;19:2121-2128. 117.

Claussen M, Kubler B, Wendland M, Neifer K, Schmidt B, Zapf J, Braulke T.

Proteolysis of insulin-like growth factors (IGF) and IGF binding proteins by cathepsin D. Endocrinology 1997;138:3797-3803. 118.

Schmierer B, Hill CS. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular

specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol 2007;8:970-982. 119.

Yakicier MC, Irmak MB, Romano A, Kew M, Ozturk M. Smad2 and Smad4

gene mutations in hepatocellular carcinoma. Oncogene 1999;18:4879-4883. 120.

Damdinsuren B, Nagano H, Kondo M, Natsag J, Hanada H, Nakamura M,

Wada H, et al. TGF-beta1-induced cell growth arrest and partial differentiation is related to the suppression of Id1 in human hepatoma cells. Oncol Rep 2006;15:401408. 121.

Kishimoto Y, Morisawa T, Kitano M, Shiota G, Horie Y, Suou T, Ito H, et al.

Loss of heterozygosity of the mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor and p53 genes in human hepatocellular carcinoma. Hepatol Res 2001;20:6883. 122.

Benvenuti S, Comoglio PM. The MET receptor tyrosine kinase in invasion

and metastasis. J Cell Physiol 2007;213:316-325. 123.

Naldini L, Vigna E, Narsimhan RP, Gaudino G, Zarnegar R, Michalopoulos

GK, Comoglio PM. Hepatocyte growth factor (HGF) stimulates the tyrosine kinase

activity of the receptor encoded by the proto-oncogene c-MET. Oncogene 1991;6:501-504. 124.

Schoedel KE, Tyner VZ, Kim TH, Michalopoulos GK, Mars WM. HGF,

MET, and matrix-related proteases in hepatocellular carcinoma, fibrolamellar variant, cirrhotic and normal liver. Mod Pathol 2003;16:14-21. 125.

Weidner KM, Di Cesare S, Sachs M, Brinkmann V, Behrens J, Birchmeier W.

Interaction between Gab1 and the c-Met receptor tyrosine kinase is responsible for epithelial morphogenesis. Nature 1996;384:173-176. 126.

Schaeper U, Gehring NH, Fuchs KP, Sachs M, Kempkes B, Birchmeier W.

Coupling of Gab1 to c-Met, Grb2, and Shp2 mediates biological responses. J Cell Biol 2000;149:1419-1432. 127.

Paranjpe S, Bowen WC, Bell AW, Nejak-Bowen K, Luo JH, Michalopoulos

GK. Cell cycle effects resulting from inhibition of hepatocyte growth factor and its receptor c-Met in regenerating rat livers by RNA interference. Hepatology 2007;45:1471-1477. 128.

Pennacchietti S, Michieli P, Galluzzo M, Mazzone M, Giordano S, Comoglio

PM. Hypoxia promotes invasive growth by transcriptional activation of the met protooncogene. Cancer Cell 2003;3:347-361. 129.

Corso S, Comoglio PM, Giordano S. Cancer therapy: can the challenge be

MET? Trends Mol Med 2005;11:284-292. 130.

Simon RM. Design and analysis of DNA microarray investigations. New

York: Springer, 2003: x, 199. 131.

Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO. Quantitative monitoring of gene

expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995;270:467470. 132.

Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, Huard C, Gaasenbeek M, Mesirov JP,

Coller H, et al. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 1999;286:531-537. 133.

Khan J, Wei JS, Ringner M, Saal LH, Ladanyi M, Westermann F, Berthold F,

et al. Classification and diagnostic prediction of cancers using gene expression profiling and artificial neural networks. Nat Med 2001;7:673-679. 134.

Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R, Aas T, Geisler S, Johnsen H, Hastie T, et al.

Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98:10869-10874.

135.

Dressman HK, Berchuck A, Chan G, Zhai J, Bild A, Sayer R, Cragun J, et al.

An integrated genomic-based approach to individualized treatment of patients with advanced-stage ovarian cancer. J Clin Oncol 2007;25:517-525. 136.

Potti A, Mukherjee S, Petersen R, Dressman HK, Bild A, Koontz J, Kratzke R,

et al. A genomic strategy to refine prognosis in early-stage non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 2006;355:570-580. 137.

Yeoh EJ, Ross ME, Shurtleff SA, Williams WK, Patel D, Mahfouz R, Behm

FG, et al. Classification, subtype discovery, and prediction of outcome in pediatric acute lymphoblastic leukemia by gene expression profiling. Cancer Cell 2002;1:133143. 138.

Weinstock KG, Kirkness EF, Lee NH, Earle-Hughes JA, Venter JC. cDNA

sequencing: a means of understanding cellular physiology. Curr Opin Biotechnol 1994;5:599-603. 139.

Adams MD, Kelley JM, Gocayne JD, Dubnick M, Polymeropoulos MH, Xiao

H, Merril CR, et al. Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project. Science 1991;252:1651-1656. 140.

Lennon GG, Lehrach H. Hybridization analyses of arrayed cDNA libraries.

Trends Genet 1991;7:314-317. 141.

Pietu G, Alibert O, Guichard V, Lamy B, Bois F, Leroy E, Mariage-Sampson

R, et al. Novel gene transcripts preferentially expressed in human muscles revealed by quantitative hybridization of a high density cDNA array. Genome Res 1996;6:492503. 142.

Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature

2004;431:931-945. 143.

Diatchenko L, Lau YF, Campbell AP, Chenchik A, Moqadam F, Huang B,

Lukyanov S, et al. Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93:6025-6030. 144.

Suchyta SP, Sipkovsky S, Halgren RG, Kruska R, Elftman M, Weber-Nielsen

M, Vandehaar MJ, et al. Bovine mammary gene expression profiling using a cDNA microarray enhanced for mammary-specific transcripts. Physiol Genomics 2003;16:818. 145.

Feolo M, Helmberg W, Sherry S, Maglott DR. NCBI genetic resources

supporting immunogenetic research. Rev Immunogenet 2000;2:461-467.

146.

Hegde P, Qi R, Abernathy K, Gay C, Dharap S, Gaspard R, Hughes JE, et al.

A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques 2000;29:548-544, 556. 147.

Hager J. Making and using spotted DNA microarrays in an academic core

laboratory. Methods Enzymol 2006;410:135-168. 148.

Kothapalli R, Yoder SJ, Mane S, Loughran TP, Jr. Microarray results: how

accurate are they? BMC Bioinformatics 2002;3:22. 149.

Kuo WP, Whipple ME, Sonis ST, Ohno-Machado L, Jenssen TK. Gene

expression profiling by DNA microarrays and its application to dental research. Oral Oncol 2002;38:650-656. 150.

Kreil DP, Russell RR, Russell S. Microarray oligonucleotide probes. Methods

Enzymol 2006;410:73-98. 151.

Relogio A, Schwager C, Richter A, Ansorge W, Valcarcel J. Optimization of

oligonucleotide-based DNA microarrays. Nucleic Acids Res 2002;30:e51. 152.

McCann JA, Muro EM, Palmer C, Palidwor G, Porter CJ, Andrade-Navarro

MA, Rudnicki MA. ChIP on SNP-chip for genome-wide analysis of human histone H4 hyperacetylation. BMC Genomics 2007;8:322. 153.

Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Follettie MT, Gallo MV, Chee MS,

Mittmann M, et al. Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nat Biotechnol 1996;14:1675-1680. 154.

Kane MD, Jatkoe TA, Stumpf CR, Lu J, Thomas JD, Madore SJ. Assessment

of the sensitivity and specificity of oligonucleotide (50mer) microarrays. Nucleic Acids Res 2000;28:4552-4557. 155.

Nuwaysir EF, Huang W, Albert TJ, Singh J, Nuwaysir K, Pitas A, Richmond

T, et al. Gene expression analysis using oligonucleotide arrays produced by maskless photolithography. Genome Res 2002;12:1749-1755. 156.

Chou CC, Chen CH, Lee TT, Peck K. Optimization of probe length and the

number of probes per gene for optimal microarray analysis of gene expression. Nucleic Acids Res 2004;32:e99. 157.

Auburn RP, Kreil DP, Meadows LA, Fischer B, Matilla SS, Russell S. Robotic

spotting of cDNA and oligonucleotide microarrays. Trends Biotechnol 2005;23:374379. 158.

Shchepinov MS, Case-Green SC, Southern EM. Steric factors influencing

hybridisation of nucleic acids to oligonucleotide arrays. Nucleic Acids Res 1997;25:1155-1161.

159.

Ramakrishnan R, Dorris D, Lublinsky A, Nguyen A, Domanus M, Prokhorova

A, Gieser L, et al. An assessment of Motorola CodeLink microarray performance for gene expression profiling applications. Nucleic Acids Res 2002;30:e30. 160.

Dalma-Weiszhausz DD, Warrington J, Tanimoto EY, Miyada CG. The

affymetrix GeneChip platform: an overview. Methods Enzymol 2006;410:3-28. 161.

Barone AD, Beecher JE, Bury PA, Chen C, Doede T, Fidanza JA, McGall GH.

Photolithographic synthesis of high-density oligonucleotide probe arrays. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2001;20:525-531. 162.

Stengele KP, Buhler J, Buhler S, Kvassiouk E, Green R, Prykota T, Pfleiderer

W. Recent highlights on photolithic oligonucleotide array in situ synthesis. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2005;24:891-896. 163.

Lausted C, Dahl T, Warren C, King K, Smith K, Johnson M, Saleem R, et al.

POSaM: a fast, flexible, open-source, inkjet oligonucleotide synthesizer and microarrayer. Genome Biol 2004;5:R58. 164.

Wolber PK, Collins PJ, Lucas AB, De Witte A, Shannon KW. The Agilent in

situ-synthesized microarray platform. Methods Enzymol 2006;410:28-57. 165.

Shmulevich I, Astola J, Cogdell D, Hamilton SR, Zhang W. Data extraction

from composite oligonucleotide microarrays. Nucleic Acids Res 2003;31:e36. 166.

Jobs M, Fredriksson S, Brookes AJ, Landegren U. Effect of oligonucleotide

truncation on single-nucleotide distinction by solid-phase hybridization. Anal Chem 2002;74:199-202. 167.

George RA. The printing process: tips on tips. Methods Enzymol

2006;410:121-135. 168.

Michael KL, Taylor LC, Schultz SL, Walt DR. Randomly ordered addressable

high-density optical sensor arrays. Anal Chem 1998;70:1242-1248. 169.

Gunderson KL, Steemers FJ, Lee G, Mendoza LG, Chee MS. A genome-wide

scalable SNP genotyping assay using microarray technology. Nat Genet 2005;37:549554. 170.

Dobbin KK, Kawasaki ES, Petersen DW, Simon RM. Characterizing dye bias

in microarray experiments. Bioinformatics 2005;21:2430-2437. 171.

van de Rijke FM, Heetebrij RJ, Talman EG, Tanke HJ, Raap AK.

Fluorescence properties, thermal duplex stability, and kinetics of formation of cyanin platinum DNAs. Anal.Biochem. 2003;321:71-78.

172.

Kimura N, Tamura TA, Murakami M. Evaluation of the performance of two

carbodiimide-based cyanine dyes for detecting changes in mRNA expression with DNA microarrays. Biotechniques 2005;38:797-806. 173.

Laayoun A, Kotera M, Sothier I, Trevisiol E, Bernal-Mendez E, Bourget C,

Menou L, et al. Aryldiazomethanes for universal labeling of nucleic acids and analysis on DNA chips. Bioconjug Chem 2003;14:1298-1306. 174.

Assersohn L, Gangi L, Zhao Y, Dowsett M, Simon R, Powles TJ, Liu ET. The

feasibility of using fine needle aspiration from primary breast cancers for cDNA microarray analyses. Clin Cancer Res 2002;8:794-801. 175.

DeRisi J, Penland L, Brown PO, Bittner ML, Meltzer PS, Ray M, Chen Y, et

al. Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nat Genet 1996;14:457-460. 176.

Hedenfalk I, Duggan D, Chen Y, Radmacher M, Bittner M, Simon R, Meltzer

P, et al. Gene-expression profiles in hereditary breast cancer. N Engl J Med 2001;344:539-548. 177.

Altman N. Replication, variation and normalisation in microarray experiments.

Appl Bioinformatics 2005;4:33-44. 178.

Yauk CL, Williams A, Boucher S, Berndt LM, Zhou G, Zheng JL, Rowan-

Carroll A, et al. Novel design and controls for focused DNA microarrays: applications in quality assurance/control and normalization for the Health Canada ToxArray. BMC Genomics 2006;7:266. 179.

Kuo WP, Liu F, Trimarchi J, Punzo C, Lombardi M, Sarang J, Whipple ME, et

al. A sequence-oriented comparison of gene expression measurements across different hybridization-based technologies. Nat Biotechnol 2006;24:832-840. 180.

Gwinn MR, Keshava C, Olivero OA, Humsi JA, Poirier MC, Weston A.

Transcriptional signatures of normal human mammary epithelial cells in response to benzo[a]pyrene exposure: a comparison of three microarray platforms. Omics 2005;9:334-350. 181.

Brazma A, Sarkans U, Robinson A, Vilo J, Vingron M, Hoheisel J, Fellenberg

K. Microarray data representation, annotation and storage. Adv Biochem Eng Biotechnol 2002;77:113-139. 182.

Bilban M, Buehler LK, Head S, Desoye G, Quaranta V. Normalizing DNA

microarray data. Curr Issues Mol Biol 2002;4:57-64.

183.

Bolstad BM, Irizarry RA, Astrand M, Speed TP. A comparison of

normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics 2003;19:185-193. 184.

Yang YH, Dudoit S, Luu P, Lin DM, Peng V, Ngai J, Speed TP.

Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res 2002;30:e15. 185.

Leung YF, Cavalieri D. Fundamentals of cDNA microarray data analysis.

Trends Genet 2003;19:649-659. 186.

Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D. Cluster analysis and display

of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95:1486314868. 187.

Aronow BJ, Richardson BD, Handwerger S. Microarray analysis of

trophoblast differentiation: gene expression reprogramming in key gene function categories. Physiol Genomics 2001;6:105-116. 188.

Henson DB, Spenceley SE, Bull DR. Artificial neural network analysis of

noisy visual field data in glaucoma. Artif Intell Med 1997;10:99-113. 189.

Korn LM, Reichert S, Simon T, Halm EA. Improving physicians' knowledge

of the costs of common medications and willingness to consider costs when prescribing. J Gen Intern Med 2003;18:31-37. 190.

Simon R, Radmacher MD, Dobbin K, McShane LM. Pitfalls in the use of

DNA microarray data for diagnostic and prognostic classification. J Natl Cancer Inst 2003;95:14-18. 191.

Lemmer ER, Friedman SL, Llovet JM. Molecular diagnosis of chronic liver

disease and hepatocellular carcinoma: the potential of gene expression profiling. Semin Liver Dis 2006;26:373-384. 192.

Ye QH, Qin LX, Forgues M, He P, Kim JW, Peng AC, Simon R, et al.

Predicting hepatitis B virus-positive metastatic hepatocellular carcinomas using gene expression profiling and supervised machine learning. Nat Med 2003;9:416-423. 193.

Velculescu VE, Madden SL, Zhang L, Lash AE, Yu J, Rago C, Lal A, et al.

Analysis of human transcriptomes. Nat Genet 1999;23:387-388. 194.

Yamashita T, Hashimoto S, Kaneko S, Nagai S, Toyoda N, Suzuki T,

Kobayashi K, et al. Comprehensive gene expression profile of a normal human liver. Biochem Biophys Res Commun 2000;269:110-116.

195.

Coulouarn C, Lefebvre G, Derambure C, Lequerre T, Scotte M, Francois A,

Cellier D, et al. Altered gene expression in acute systemic inflammation detected by complete coverage of the human liver transcriptome. Hepatology 2004;39:353-364. 196.

Yano N, Habib NA, Fadden KJ, Yamashita H, Mitry R, Jauregui H, Kane A,

et al. Profiling the adult human liver transcriptome: analysis by cDNA array hybridization. J Hepatol 2001;35:178-186. 197.

Wong LY, Hafeman A, Boyd VL, Bodeau J, Lazaruk KD, Liew SN, Casey P,

et al. Assessing gene expression variation in normal human tissues using GeneTag, a novel, global, sensitive profiling method. J Biotechnol 2003;101:199-217. 198.

Lee JS, Heo J, Libbrecht L, Chu IS, Kaposi-Novak P, Calvisi DF, Mikaelyan

A, et al. A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells. Nat Med 2006;12:410-416. 199.

Honda M, Kaneko S, Kawai H, Shirota Y, Kobayashi K. Differential gene

expression between chronic hepatitis B and C hepatic lesion. Gastroenterology 2001;120:955-966. 200.

Shackel NA, McGuinness PH, Abbott CA, Gorrell MD, McCaughan GW.

Insights into the pathobiology of hepatitis C virus-associated cirrhosis: analysis of intrahepatic differential gene expression. Am J Pathol 2002;160:641-654. 201.

Smith MW, Yue ZN, Korth MJ, Do HA, Boix L, Fausto N, Bruix J, et al.

Hepatitis C virus and liver disease: global transcriptional profiling and identification of potential markers. Hepatology 2003;38:1458-1467. 202.

Su AI, Pezacki JP, Wodicka L, Brideau AD, Supekova L, Thimme R, Wieland

S, et al. Genomic analysis of the host response to hepatitis C virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:15669-15674. 203.

Sreekumar R, Rosado B, Rasmussen D, Charlton M. Hepatic gene expression

in histologically progressive nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 2003;38:244251. 204.

Younossi ZM, Gorreta F, Ong JP, Schlauch K, Giacco LD, Elariny H, Van

Meter A, et al. Hepatic gene expression in patients with obesity-related non-alcoholic steatohepatitis. Liver Int 2005;25:760-771. 205.

Younossi ZM, Baranova A, Ziegler K, Del Giacco L, Schlauch K, Born TL,

Elariny H, et al. A genomic and proteomic study of the spectrum of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2005;42:665-674.

206.

Okabe H, Satoh S, Kato T, Kitahara O, Yanagawa R, Yamaoka Y, Tsunoda T,

et al. Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellular carcinomas using cDNA microarray: identification of genes involved in viral carcinogenesis and tumor progression. Cancer Res 2001;61:2129-2137. 207.

Nam SW, Park JY, Ramasamy A, Shevade S, Islam A, Long PM, Park CK, et

al. Molecular changes from dysplastic nodule to hepatocellular carcinoma through gene expression profiling. Hepatology 2005;42:809-818. 208.

Bruix J, Sherman M, Llovet JM, Beaugrand M, Lencioni R, Burroughs AK,

Christensen E, et al. Clinical management of hepatocellular carcinoma. Conclusions of the Barcelona-2000 EASL conference. European Association for the Study of the Liver. J Hepatol 2001;35:421-430. 209.

Iizuka N, Oka M, Yamada-Okabe H, Mori N, Tamesa T, Okada T, Takemoto

N, et al. Comparison of gene expression profiles between hepatitis B virus- and hepatitis C virus-infected hepatocellular carcinoma by oligonucleotide microarray data on the basis of a supervised learning method. Cancer Res 2002;62:3939-3944. 210.

Smith MW, Yue ZN, Geiss GK, Sadovnikova NY, Carter VS, Boix L, Lazaro

CA, et al. Identification of novel tumor markers in hepatitis C virus-associated hepatocellular carcinoma. Cancer Res 2003;63:859-864. 211.

Iizuka N, Oka M, Yamada-Okabe H, Nishida M, Maeda Y, Mori N, Takao T,

et al. Oligonucleotide microarray for prediction of early intrahepatic recurrence of hepatocellular carcinoma after curative resection. Lancet 2003;361:923-929. 212.

Lee JS, Chu IS, Heo J, Calvisi DF, Sun Z, Roskams T, Durnez A, et al.

Classification and prediction of survival in hepatocellular carcinoma by gene expression profiling. Hepatology 2004;40:667-676. 213.

Kurokawa Y, Matoba R, Takemasa I, Nagano H, Dono K, Nakamori S,

Umeshita K, et al. Molecular-based prediction of early recurrence in hepatocellular carcinoma. J Hepatol 2004;41:284-291. 214.

Peters LL, Robledo RF, Bult CJ, Churchill GA, Paigen BJ, Svenson KL. The

mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet 2007;8:58-69. 215.

Ellwood-Yen K, Graeber TG, Wongvipat J, Iruela-Arispe ML, Zhang J,

Matusik R, Thomas GV, et al. Myc-driven murine prostate cancer shares molecular features with human prostate tumors. Cancer Cell 2003;4:223-238.

216.

Sweet-Cordero A, Mukherjee S, Subramanian A, You H, Roix JJ, Ladd-

Acosta C, Mesirov J, et al. An oncogenic KRAS2 expression signature identified by cross-species gene-expression analysis. Nat Genet 2005;37:48-55. 217.

Lee JS, Chu IS, Mikaelyan A, Calvisi DF, Heo J, Reddy JK, Thorgeirsson SS.

Application of comparative functional genomics to identify best-fit mouse models to study human cancer. Nat Genet 2004;36:1306-1311. 218.

Thomas MB, Abbruzzese JL. Opportunities for targeted therapies in

hepatocellular carcinoma. J Clin Oncol 2005;23:8093-8108. 219.

Eckel F, von Delius S, Mayr M, Dobritz M, Fend F, Hosius C, Schleyer E, et

al. Pharmacokinetic and clinical phase II trial of imatinib in patients with impaired liver function and advanced hepatocellular carcinoma. Oncology 2005;69:363-371. 220.

Philip PA, Mahoney MR, Allmer C, Thomas J, Pitot HC, Kim G, Donehower

RC, et al. Phase II study of Erlotinib (OSI-774) in patients with advanced hepatocellular cancer. J Clin Oncol 2005;23:6657-6663. 221.

Zhu AX, Blaszkowsky LS, Ryan DP, Clark JW, Muzikansky A, Horgan K,

Sheehan S, et al. Phase II study of gemcitabine and oxaliplatin in combination with bevacizumab in patients with advanced hepatocellular carcinoma. J Clin Oncol 2006;24:1898-1903. 222.

Huh CG, Factor VM, Sanchez A, Uchida K, Conner EA, Thorgeirsson SS.

Hepatocyte growth factor/c-met signaling pathway is required for efficient liver regeneration and repair. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:4477-4482. 223.

Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L. Relative expression software tool

(REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res 2002;30:e36. 224.

Chen X, Cheung ST, So S, Fan ST, Barry C, Higgins J, Lai KM, et al. Gene

expression patterns in human liver cancers. Mol Biol Cell 2002;13:1929-1939. 225.

Paska C, Bogi K, Szilak L, Tokes A, Szabo E, Sziller I, Rigo J, Jr., et al. Effect

of formalin, acetone, and RNAlater fixatives on tissue preservation and different size amplicons by real-time PCR from paraffin-embedded tissue. Diagn Mol Pathol 2004;13:234-240. 226.

Kaposi-Novak P, Lee JS, Mikaelyan A, Patel V, Thorgeirsson SS.

Oligonucleotide microarray analysis of aminoallyl-labeled cDNA targets from linear RNA amplification. Biotechniques 2004;37:580, 582-586, 588.

227.

Kaposi-Novak P, Lee JS, Gomez-Quiroz L, Coulouarn C, Factor VM,

Thorgeirsson SS. Met-regulated expression signature defines a subset of human hepatocellular carcinomas with poor prognosis and aggressive phenotype. J Clin Invest 2006;116:1582-1595. 228.

Medico E, Gentile A, Lo Celso C, Williams TA, Gambarotta G, Trusolino L,

Comoglio PM. Osteopontin is an autocrine mediator of hepatocyte growth factorinduced invasive growth. Cancer Res 2001;61:5861-5868. 229.

Gujdar A, Sipeki S, Bander E, Buday L, Farago A. Protein kinase C modulates

negatively the hepatocyte growth factor-induced migration, integrin expression and phosphatidylinositol 3-kinase activation. Cell Signal 2004;16:505-513. 230.

Recio JA, Merlino G. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces

feedback up-regulation of CD44v6 in melanoma cells through Egr-1. Cancer Res 2003;63:1576-1582. 231.

Lipschutz JH, Li S, Arisco A, Balkovetz DF. Extracellular signal-regulated

kinases 1/2 control claudin-2 expression in Madin-Darby canine kidney strain I and II cells. J Biol Chem 2005;280:3780-3788. 232.

Baron V, Adamson ED, Calogero A, Ragona G, Mercola D. The transcription

factor Egr1 is a direct regulator of multiple tumor suppressors including TGFbeta1, PTEN, p53, and fibronectin. Cancer Gene Ther 2006;13:115-124. 233.

Kempiak SJ, Yamaguchi H, Sarmiento C, Sidani M, Ghosh M, Eddy RJ,

Desmarais V, et al. A neural Wiskott-Aldrich Syndrome protein-mediated pathway for localized activation of actin polymerization that is regulated by cortactin. J Biol Chem 2005;280:5836-5842. 234.

Moriyama K, Yahara I. Human CAP1 is a key factor in the recycling of cofilin

and actin for rapid actin turnover. J Cell Sci 2002;115:1591-1601. 235.

McClatchey AI. Merlin and ERM proteins: unappreciated roles in cancer

development? Nat Rev Cancer 2003;3:877-883. 236.

Wai PY, Kuo PC. The role of Osteopontin in tumor metastasis. J Surg Res

2004;121:228-241. 237.

Dickinson DA, Levonen AL, Moellering DR, Arnold EK, Zhang H, Darley-

Usmar VM, Forman HJ. Human glutamate cysteine ligase gene regulation through the electrophile response element. Free Radic Biol Med 2004;37:1152-1159. 238.

Dhakshinamoorthy S, Jaiswal AK. Small maf (MafG and MafK) proteins

negatively regulate antioxidant response element-mediated expression and antioxidant

induction of the NAD(P)H:Quinone oxidoreductase1 gene. J Biol Chem 2000;275:40134-40141. 239.

Stahl S, Ittrich C, Marx-Stoelting P, Kohle C, Altug-Teber O, Riess O, Bonin

M, et al. Genotype-phenotype relationships in hepatocellular tumors from mice and man. Hepatology 2005;42:353-361. 240.

Wang SS, Sherman ME, Rader JS, Carreon J, Schiffman M, Baker CC.

Cervical tissue collection methods for RNA preservation: comparison of snap-frozen, ethanol-fixed, and RNAlater-fixation. Diagn Mol Pathol 2006;15:144-148. 241.

Benchekroun M, DeGraw J, Gao J, Sun L, von Boguslawsky K, Leminen A,

Andersson LC, et al. Impact of fixative on recovery of mRNA from paraffinembedded tissue. Diagn Mol Pathol 2004;13:116-125. 242.

Masuda N, Ohnishi T, Kawamoto S, Monden M, Okubo K. Analysis of

chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res 1999;27:44364443. 243.

Bhudevi B, Weinstock D. Detection of bovine viral diarrhea virus in formalin

fixed paraffin embedded tissue sections by real time RT-PCR (Taqman). J Virol Methods 2003;109:25-30. 244.

Douglas MP, Rogers SO. DNA damage caused by common cytological

fixatives. Mutat Res 1998;401:77-88. 245.

Mies C. Molecular biological analysis of paraffin-embedded tissues. Hum

Pathol 1994;25:555-560. 246.

Specht K, Richter T, Muller U, Walch A, Werner M, Hofler H. Quantitative

gene expression analysis in microdissected archival formalin-fixed and paraffinembedded tumor tissue. Am J Pathol 2001;158:419-429. 247.

Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on

the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol 2002;161:1961-1971. 248.

Florell SR, Coffin CM, Holden JA, Zimmermann JW, Gerwels JW, Summers

BK, Jones DA, et al. Preservation of RNA for functional genomic studies: a multidisciplinary tumor bank protocol. Mod Pathol 2001;14:116-128. 249.

Peano C, Severgnini M, Cifola I, De Bellis G, Battaglia C. Transcriptome

amplification methods in gene expression profiling. Expert Rev Mol Diagn 2006;6:465-480.

250.

Van Gelder RN, von Zastrow ME, Yool A, Dement WC, Barchas JD,

Eberwine JH. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A 1990;87:1663-1667. 251.

Petalidis L, Bhattacharyya S, Morris GA, Collins VP, Freeman TC, Lyons PA.

Global amplification of mRNA by template-switching PCR: linearity and application to microarray analysis. Nucleic Acids Res 2003;31:e142. 252.

Sherman M. Hepatocellular carcinoma: epidemiology, risk factors, and

screening. Semin Liver Dis 2005;25:143-154. 253.

Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF. Met receptor tyrosine kinase:

enhanced signaling through adapter proteins. Oncogene 2000;19:5582-5589. 254.

Gentile A, Comoglio PM. Invasive growth: a genetic program. Int J Dev Biol

2004;48:451-456. 255.

Schmidt C, Bladt F, Goedecke S, Brinkmann V, Zschiesche W, Sharpe M,

Gherardi E, et al. Scatter factor/hepatocyte growth factor is essential for liver development. Nature 1995;373:699-702. 256.

Bladt F, Riethmacher D, Isenmann S, Aguzzi A, Birchmeier C. Essential role

for the c-met receptor in the migration of myogenic precursor cells into the limb bud. Nature 1995;376:768-771. 257.

Michalopoulos GK, DeFrances MC. Liver regeneration. Science 1997;276:60-

66. 258.

Ueki T, Kaneda Y, Tsutsui H, Nakanishi K, Sawa Y, Morishita R, Matsumoto

K, et al. Hepatocyte growth factor gene therapy of liver cirrhosis in rats. Nat Med 1999;5:226-230. 259.

Schulze-Bergkamen H, Brenner D, Krueger A, Suess D, Fas SC, Frey CR,

Dax A, et al. Hepatocyte growth factor induces Mcl-1 in primary human hepatocytes and inhibits CD95-mediated apoptosis via Akt. Hepatology 2004;39:645-654. 260.

Wang X, DeFrances MC, Dai Y, Pediaditakis P, Johnson C, Bell A,

Michalopoulos GK, et al. A mechanism of cell survival: sequestration of Fas by the HGF receptor Met. Mol Cell 2002;9:411-421. 261.

Stolz DB, Mars WM, Petersen BE, Kim TH, Michalopoulos GK. Growth

factor signal transduction immediately after two-thirds partial hepatectomy in the rat. Cancer Res 1999;59:3954-3960. 262.

Birchmeier C, Birchmeier W, Gherardi E, Vande Woude GF. Met, metastasis,

motility and more. Nat Rev Mol Cell Biol 2003;4:915-925.

263.

Ma PC, Maulik G, Christensen J, Salgia R. c-Met: structure, functions and

potential for therapeutic inhibition. Cancer Metastasis Rev 2003;22:309-325. 264.

Ueki T, Fujimoto J, Suzuki T, Yamamoto H, Okamoto E. Expression of

hepatocyte growth factor and its receptor c-met proto-oncogene in hepatocellular carcinoma. Hepatology 1997;25:862-866. 265.

Giordano S, Corso S, Conrotto P, Artigiani S, Gilestro G, Barberis D,

Tamagnone L, et al. The semaphorin 4D receptor controls invasive growth by coupling with Met. Nat Cell Biol 2002;4:720-724. 266.

Fischer OM, Giordano S, Comoglio PM, Ullrich A. Reactive oxygen species

mediate Met receptor transactivation by G protein-coupled receptors and the epidermal growth factor receptor in human carcinoma cells. J Biol Chem 2004;279:28970-28978. 267.

Jo M, Stolz DB, Esplen JE, Dorko K, Michalopoulos GK, Strom SC. Cross-

talk between epidermal growth factor receptor and c-Met signal pathways in transformed cells. J Biol Chem 2000;275:8806-8811. 268.

Gerritsen ME, Tomlinson JE, Zlot C, Ziman M, Hwang S. Using gene

expression profiling to identify the molecular basis of the synergistic actions of hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor in human endothelial cells. Br J Pharmacol 2003;140:595-610. 269.

Lee JM, Calkins MJ, Chan K, Kan YW, Johnson JA. Identification of the NF-

E2-related factor-2-dependent genes conferring protection against oxidative stress in primary cortical astrocytes using oligonucleotide microarray analysis. J Biol Chem 2003;278:12029-12038. 270.

Motohashi H, Yamamoto M. Nrf2-Keap1 defines a physiologically important

stress response mechanism. Trends Mol Med 2004;10:549-557. 271.

Matsushima-Nishiwaki R, Okuno M, Takano Y, Kojima S, Friedman SL,

Moriwaki H. Molecular mechanism for growth suppression of human hepatocellular carcinoma cells by acyclic retinoid. Carcinogenesis 2003;24:1353-1359. 272.

Park EY, Cho IJ, Kim SG. Transactivation of the PPAR-responsive enhancer

module in chemopreventive glutathione S-transferase gene by the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma and retinoid X receptor heterodimer. Cancer Res 2004;64:3701-3713.

14. Saját publikációk jegyzéke

14.1 A disszertációhoz kapcsolódó saját közlemények.

Kaposi-Novak P, Lee JS, Gomez-Quiroz L, Coulouarn C, Factor VM, Thorgeirsson SS. Met-regulated expression signature defines a subset of human hepatocellular carcinomas with poor prognosis and aggressive phenotype. The Journal of clinical investigation 2006;116(6):1582-95. (IF: 15.754) Kaposi-Novak P, Lee JS, Mikaelyan A, Patel V, Thorgeirsson SS. Oligonucleotide mikroarray analysis of aminoallyl-labeled cDNA targets from linear RNA amplification. Biotechniques 2004;37(4):580, 2-6, 8. (IF: 2.545) Paska C, Bogi K, Szilak L, Tokes A,Szabo E, Sziller I, Rigo J Jr, Sobel G, Szabo I., Kaposi-Novak P, Kiss A, Schaff, Z. Effect of formalin, acetone, and RNAlater fixatives on tissue preservation and different size amplicons by real-time PCR from paraffin-embedded tissue. Diagn Mol Pathol 2004;13(4):234-40. (IF: 2.292) Lotz G, Kiss A, Kaposi Novak P, Sobel G, Schaff Z. Hepatitis viruses and hepatocarcinogenesis. Journal of physiology, Paris 2001;95(1-6):417-22. (IF: 0.862) Szabo E, Paska C, Kaposi Novak P, Schaff Z, Kiss A. Similarities and differences in hepatitis B and C virus induced hepatocarcinogenesis. Pathol Oncol Res 2004;10(1):5-11. Kiss A, Lotz G, Kaposi Novak P, Schaff Z. Hepatitis viruses and hepatocarcinogenesis. Orvosi hetilap 2002;143(2):83-6.

14.2 A disszertációtól független saját közlemények.

Glasz T, Hortovanyi E, Mozes G, Lotz G, Kaposi Novak P, Szik A, Kardos M, Sziller I, Nagy B, Ban Z, Toth A, Kassai I, Horkay F, Dudas G, Kadar A. Chlamydia pneumoniae in coronary bypass grafts of redo patients. The concept of the 'adventitial baseline infection'. Pathology, research and practice 2004;200(9):609-18. (IF: 0.681) Podanyi B, Kiss A, Kaposi-Novak P, Paska C, Lengyel G, Horanyi M, Schaff Z, Horvath A. Hepatitis C virus RNA in the cutaneous eruption but not in the symptomfree skin from patient with prurigo simplex and chronic C hepatitis. J Eur Acad Dermatol Venereol 2005;19(4):520-2. (IF: 1.638) Podanyi B, Kiss A, Kaposi-Novak P, Paska C, Lengyel G, Horanyi M, Schaff Z, Horvath A. Hepatitis C virus RNA in the skin eruption from patients with prurigo and chronic hepatitis C. Orvosi hetilap 2004;145(47):2371-4. Tokes AM, Kulka J, Paku S, Szik A,Paska C, Kaposi Novak P, Szilak L, Kiss A, Bogi K, Schaff Z. Claudin-1, -3 and -4 proteins and mRNA expression in benign and malignant breast lesions: a research study. Breast Cancer Res 2005;7(2):R296-305. (IF: 4.026) Kulka J, Tokes AM, Kaposi-Novak P, Udvarhelyi N, Keller A, Schaff Z. Detection of HER-2/neu gene amplification in breast carcinomas using quantitative real-time PCR - a comparison with immunohistochemical and FISH results. Pathol Oncol Res 2006;12(4):197-204. (IF: 1.241)

15. Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt szeretnék köszönetet mondani Schaff Zsuzsa professzor asszonynak, az International Academy of Pathology magyar szekciója elnökének, a Semmelweis Egyetem II. sz. Patológia Intézet igazgatójának, amiért lehetővé tette, hogy az általa vezetet világszinvonalú alkotó műhelyben, állami ösztöndijas Ph.D. hallgatóként dolgozhassak. Ebben a környezetben megismerkedhettem a rákkutátás kisérletes alapjaival. Bekapcsolódhattam a májkarcinogenezis molekuláris hátterének feltérképezésébe, és olyan korszerű tudományos módszereket sajátithattam el, amelyek lehetővé tették munkám nemzetközi szintű művelését. Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Kiss Andrásnak, a Semmelweis Egyetem II. sz. Patológia Intézet professzorának és a Molekuláris Patológia Laboratórium vezetőjének, aki kutató munkám során végig mellettem állt. Kiváló kutatási ötleteivel, rendkivül hasznos tanácsaival és külföldön szerzett sokrétű tapasztalatával vezette kutatásainkat a lehető legcélszerübb módon. Emelett elérhetővé tette számomra a nemzetközi tudományos életben való részvételt. Tudományos pályámon ő inditott el, amikor segitségével, TDK hallgatóként, bekapcsolódhattam az Intézetben folyó kutatómunkába. Segitségével tanultam meg a tudományos gondolkodás, kérdésfeltevés és adatelemzés módszereit. Végtelen hálával tartozom Dr. Snorri S. Thorgeirssonnak az amerikai National Cancer

Institute,

Laboratory

of

Experimental

Carcinogenesis

világhirű

laborvezetőjének, akinél poszt-doktori kutatásaimat végeztem, és akinek segitsége nélkül e dolgozat nem születhetett volna meg. Dr Thorgeirsson laboratoriumában a genomikai kutatásokat a világon legmagasbb színvonalon művelő tudósok között dolgozhattam. Emellett tevékeny részese lehettem olyan kutatási projekteknek, amelyek jelentős mértékben hozzájárultak az emberi májrák patomechanizmusának megértéséhez.

Olyan

tudományos

módszereket,

modern

technológiákat

és

legelsősorban olyan kutatói szemléletet ismerhettem meg, ami egész további életemet meghatározó módon látja el szellemi útravalóval. Köszönettel tartozom Valentina M. Factornak a National Cancer Institute, Laboratory of Experimental Carcinogenesis állandó kutatójának, aki tapsztalatával, tanácsaival felbecsülhetetlen segitséget nyújtott az egérmodelleken és a primer májsejteken végzett kisérleteim megvalósulásához.

Ugyancsak szeretnék köszöntet mondani Dr. Páska Csillának a II. sz. Patológia Intézet tudományos főmunkatársának, és Dr. Lotz Gábornak az intézet tanársegédjének és Dr Tőkés Annamária tudományos munkatársnak a szakmai útmutatásért és a hasznos tanácsokért, amelyek nagyban hozzájárultak munkám sikeréhez. Köszönöm

a

Laboratory

of

Experimental

Carcinogenesis

minden

munkatársának és poszt doktori kutatójának: Elizabeth Connernek, Ju-Seog Leenek Luis Gomez-Quiroznak és Takami Taronak, hogy munkám során mindig számithattam segitségükre. Végezetül szeretném megkösszönni szüleimenk, hogy tanulmányaim során mindvégig támogattak és minden nehézség között mellettem álltak.