Doktori értekezés tézisei
Az autofágia szerepe a Myc-indukálta sejtnövekedésben
Nagy Péter
Biológia Doktori Iskola, iskolavezető: Prof. Erdei Anna Molekuláris Sejt- és Neurobiológia Doktori Program, programvezető: Prof. Sass Miklós Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar
Témavezető: dr. Juhász Gábor, tudományos főmunkatárs Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Anatómiai, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszék Budapest, 2013
Bevezetés Az autofágia evolúciósan konzervált lizoszómális lebontó útvonal, melynek során a citoplazma egyes elemei kettős membránnal határolt autofagoszómákba csomagolódnak. Az autofagoszómák lizoszómákkal fúzionálnak, így létrehozva az autolizoszómákat, ahol a savas környezetben működő különböző emésztőenzimek hatására a körülzárt anyag építőköveire bomlik. Ezek az anyagok újrahasznosulnak energiatermelő és szintetikus folyamatokban. A lebontásra kerülő anyagok „kijelölése”, vagyis az autofágia degradatív folyamatának szelektivitása széles körben vitatott téma. Ismerünk azonban néhány fehérjét (pl.: p62, Alfy/blue cheese), melyek a lebontásra ítélt anyagok kijelölését végzik. A p62 olyan, több doménből felépülő fehérje, mely egyrészt ubiquitinilált fehérjéket köt, másrészt képes az Atg8a fehérjéhez kötődni. A lebontás szelektivitásának kialakításán kívül a p62 egyéb funkciókkal is rendelkezik természetesen. A p62 köt a Keap1 fehérjéhez is, ami ennek hatására disszociál az Nrf2/cnc fehérjétől, és ez utóbbi ilyenkor a sejtmagban az antioxidáns válaszhoz szükséges gének transzkripcióját aktiválja. Az autofágia alapszinten minden sejtben működik és központi szerepet játszik sérült, elöregedett sejtorganellumok (pl.: mitokondrium) eltávolításában. A hosszú féléletidejű, hibás konformációjú valamint nagyméretű vagy hosszú féléletidejű fehérjék is autofág lebontás által távolítódnak el a sejtből. Számos patológiás elváltozásban és humán betegségben igazolták az autofágia szerepét. Autofágia hiányában toxikus fehérjeaggregátumok halmozódnak fel az idegrendszer bizonyos sejtjeiben, különböző neurondegenerációs kórképek kialakulásához vezetve (Alzheimer-kór, Parkinson-kór). A sérült, elöregedett mitokondriumok oxidatív stresszt idéznek elő a sejtekben. Autofágia defektus esetében ezek a mitokondriumok nem eliminálódnak a sejtekből, és az ilyenkor felszabaduló reaktív oxigén gyökök rendkívül genotoxikusak, mutációkat okozhatnak, melyek gyakran tumor progresszióhoz vezetnek. Rengeteg tumoros betegség (prosztatarák, gyomorrák, melanoma, vastagbélrák, mellrák stb.) esetén kimutatták, hogy kialakulásuk kapcsolatba hozható a Myc onkogénnel. Ezekben a tumor típusokban megnőtt a Myc transzkripciós faktor expressziójának szintje. A Myc aktív transzkripciós komplexet alkot a Max fehérjével, és a genom különböző pontjain a gének promóter régiójában található E-boxokhoz köt, így aktiválja célgénjeinek transzkripcióját. Az autofágia tumor szuppresszor funkciójával ellentétesen szerepet játszhat a tumorigenezis kezdeti lépéseiben is. Az autofágia energiatermelést és bioszintézist elősegítő funkciója által segítheti a tumoros sejtek növekedését és túlélését a 2|
vaszkularizáció bekövetkezte előtt. Későbbi stádiumú tumorokban az egészséges sejtekhez képest megnövekedett glikolízishez (Warburg effektus) a megemelkedett szintű autofág lebontás szolgáltathat megfelelő mennyiségű alapanyagot. A sejtek homeodinamikájában és stresszhatásokra kialakuló túlélési válaszában betöltött központi szerepe alapján az autofágia molekuláris mechanizmusainak megértése nélkülözhetetlen a jövőbeni esetleges terápiás kezelések alkalmazásának, fejlesztésének szempontjából. Autofágiában szerepet játszó gének nagyléptékű keresése többféle módon történhet: 1. Microarray chipen vizsgálhatjuk gének expressziójának változását, amiből korrelációs elven következtethetünk a gén autofágiában betöltött esetleges szerepére. A módszer előnye a gyors kivitelezés lehetősége, ám a vizsgálat eredményeként kapott eredmények nem feltétlenül jelentenek funkcionális kapcsolatot. 2. Az RNS interferencia általi géncsendesítés révén, különösen az RNS interferencia könyvtárak fejlődésével lehetővé vált gének funkcióvesztésének viszonylag gyors in vivo vizsgálata. Ezt a lehetőséget kihasználva genomszinten is vizsgálható az egyes gének funkcióvesztése által okozott fenotípus. Módszerek Genom szűrés RNS interferencia által történő géncsendesítés során vizsgáltuk a konzervált gének funkcióvesztéses fenotípusát genetikai mozaik állatokban. Microarray, QT-PCR Chipen, valamint PCR reakcióval vizsgáltuk gének expresszióját. Rekombináns DNS technológia Különböző plazmid konstrukciók létrehozása fehérje kölcsönhatások vizsgálata céljából. Sejttenyésztés, immunoprecipitáció Fehérjék kölcsönhatásának vizsgálata in vitro sejttenyészetek alkalmazásával történt. Transzgénikus állatok, genetika A Drosophila-ban elterjedt, széles körben alkalmazott genetikai eszköztár segítségével vizsgáltuk, hogy milyen Fluoreszcens
riporterek,
gének mutánsok
szükségesek és
RNS
a Myc-indukált interferencia
sejtnövekedéshez.
vagy overexpressziók
kombinálásával vizsgáltuk gének/fehérjék kapcsolati viszonyait. Western blot
3|
Immunoprecipitáció után Western blot analízissel vizsgáltuk fehérjék kölcsönhatását. Az autofág aktivitás, valamint a lebontás mértékének meghatározására Western blot-on vizsgáltuk az Atg8a lipidációt valamint az mCherry-Atg8a riporter hasításának mértékét, vagyis a szabad mCherry szintjét. Mikroszkópia Elektronmikroszkóppal végzett ultrastruktúrális vizsgálatokkal igazoltuk az autofágia normális működését vagy hibáját. Fluoreszcens riporterek alkalmazásával vizsgáltuk a sejméret fenotípust valamint autofág struktúrák jelenlétét. Statisztika Megfelelő statisztikai módszerek felhasználásával értékeltük ki a kísérletek eredményeit az eltérések szignifikancia szintjének meghatározása céljából. Célkitűzések Autofág gének expressziójának vizsgálata microarray alapú technikával. Autofágiában szerepet játszó gének keresése in vivo genom szűréssel. A Myc funkcióvesztés hatásának vizsgálata az autofágia során. A Myc overexpresszió autofágiára, UPR-re és antioxidáns válaszra gyakorolt hatásának vizsgálata poliploid lárvális és diploid lárvális és adult szövetekben. Az autofágia, az UPR és az antioxidáns válasz jelentőségének vizsgálata a Myc overexpresszió indukálta sejtnövekedés során. Eredmények Kimutattuk, hogy a központi Atg gének transzkripciója megnövekszik éhezés hatására. Az általunk készíttetett p62 ellenanyag alkalmas az autofág mutánsokban felhalmozódott p62 fehérjeaggregátumok jelölésére. A Drosophila genom szűrése során nagyjából 7400 RNS interferencia vonalat teszteltünk (nagyjából 7100 konzervált gén funkcióvesztésének vizsgálatát jelenti). 213 gént azonosítottunk, melyek csak egy részének van már ismert szerepe az autofág folyamatok során. Kimutattuk,
hogy
az
ubiqutin-proteaszóma
rendszer
hibás
működése
hiperautofágiát okoz a sejtekben. 4|
Számos ígéretes pozitív találata volt az in vivo genom szűrésnek. Kimutattuk, hogy a Syntaxin 17, az Ubisnap (SNAP-29) és a VAMP7 szükségesek az autofagoszómák és lizoszómák fúziójához. A genomszűrés további érdekes találata a Myc gén volt. Myc null mutáns, Myc RNS interferencia valamint a Mad overexpresszió vizsgálata alapján elmondható, hogy a Myc regulált transzkripció szükséges a bazális és az éheztetéssel indukált autofágia normális működéséhez (LysoTracker Red festés, anti-Atg8a és anti-p62 immunhisztokémia, és elektronmikroszkópia alapján). A Myc overexpresszió megnövelte a sejtek méretét, mind diploid mind poliploid lárvális és diploid adult szövetekben egyaránt (1. ábra: A).
1. ábra Genetikai kölcsönhatások összegzése a Myc-indukált sejtnövekedés során Poliploid és diploid lárvális szövetek vizsgálatával kimutattuk, hogy a Myc overexpresszió növeli az autofágia szintjét (LysoTracker Red festés, mCherryAtg8a, anti-Atg8a immunhisztokémia, Western blot, elektronmikroszkópia).
5|
Fluoreszcensen tandem jelölt Atg8a riporter felhasználásával és chloroquine kezelés során kimutattuk, hogy a Myc overexpresszió indukálja az autofágiát és nincs hatással az autofág lebontás végbemenetelére. A Myc overexpresszió hatására megnőtt az ubiquitinált fehérjék, a p62 valamint a foszfo-eIF2α szintje a lárvák zsírtest sejtjeiben. A Myc overexpresszió hatására megnövekedett mértékű Xbp1-GFP expresszió is az aktiválódó ER stresszre utal. A PERK overexpresszió autofágiát indukál jól táplált harmadik stádiumú lárvák zsírtest sejtjeiben, ahol fiziológiás körülmények között gyakorlatilag nem látni autofág struktúrákat. A Myc overexpresszió megnöveli a sejtekben az antioxidáns aktivitást. A Drosophila p62 tenyésztett sejtekből történő immunoprecipitációja alapján elmondható, hogy emlősökhöz hasonlóan kölcsönhat a Keap1 fehérjével. A PERK funkcióvesztés és a Gadd34 overexpressziója gátolta a Myc-indukálta fokozott sejtnövekedést (1. ábra: B). A Myc overexpresszió indukálta sejtnövekedés chloroquine (nem specifikus autofágia gátlószer) kezeléssel gátolható. Az autofágia genetikai gátlása szuppresszálta a Myc overexpresszió indukálta fokozott sejtnövekedést (1. ábra: B). A p62 és az Nrf2/cnc jelátvitel kiesése gátolta a Myc-indukált sejtnövekedést (1. ábra: B). Az Nrf2/cnc overexpressziója eredményesen menekítette a p62 funkcióvesztést, ezzel szemben nem volt hatása az autofág funkcióvesztésre a Myc-indukált sejtnövekedés során (1. ábra: C).
6|
Tézisek 1. Az autofág struktúrák kialakításában szerepet játszó központi Atg gének transzkripciója megnövekszik éheztetés során. 2. A Myc regulált transzkripció szükséges az alapszintű és az éheztetéssel indukált autofágiához. 3. A Myc overexpressziója nemcsak a sejtek méretét növeli meg, hanem a transzkripció és transzláció serkentése miatt hibás konformációjú ubiquitinált fehérjék által aktivált válaszhoz vezet (Unfolded Protein Response, UPR), aminek része az ER stressz is (1. ábra: D). 4. Az ER stressz autofágiát indukál Drosophila sejtekben, és a Myc overexpresszió ER stressz következtében, a PERK genetikai útvonalon keresztül aktiválja az autofágiát a sejtekben (1. ábra: D). 5. Az UPR miatt megnövekszik a p62 szintje a Myc-et overexpresszáló sejtekben, ami az Nrf2/cnc függő antioxidáns válasz fokozott aktivitásához vezet (1. ábra: D). 6. Az autofágia és az antioxidáns válasz párhuzamosan szükségesek a Myc overexpresszió indukálta sejtnövekedéshez (1. ábra: D). 7. Az autofágia, az UPR, a p62 és az antioxidáns aktivitás is szükséges a Myc-indukálta túlnövekedéshez (1. ábra: B).
7|
Az eredmények lehetséges felhasználása A ráksejtek függnek a tumoros transzformációt előidéző, megváltozott gén/fehérje működéstől, funkciótól. Ezt nevezzük onkogén addikciónak. Ez a függőség nyilvánvaló és logikus célpontja számos tumorterápiának. A Myc onkogén esetén azonban a tumorsejtekben zajló szabályozatlan Myc expresszió gátlása nehéz, mert a Myc egy transzkripciós faktor, emiatt nincs könnyen célba vehető aktív centruma, továbbá funkciója szükséges a normál sejtek működéséhez is. A tumorterápiák újabb célpontjai lehetnek azonban olyan sejtbiológiai folyamatok, melyek szükségesek a tumoros transzformáció által létrehozott állapot fenntartásához, például a tumorsejtek túléléséhez, de normál sejtekben nélkülözhetőek. Ezt nevezzük a tumorsejtek nem-onkogén függőségének. A Myc-et overexpresszáló sejtek UPR-indukált autofágia és antioxidáns válasz függősége (nem-onkogén addikciója) ígéretes célpontja lehet a jövőben különböző terápiáknak. A malária kezelése során alkalmazott, általános lizoszómális lebontást gátló chloroquine felhasználása a Myc dependens tumorok kezelése esetén ígéretes lehet (Amaravadi és mtsai. 2007; Maclean és mtsai. 2008). Egér embrionális fibroblaszt sejtekben a tranziensen kifejeződő Myc autofágiát aktiváló hatását sikeresen gátolták chaperon aktivitást növelő farmakológiai szerrel (4-PBA), valamint az autofagoszómák és autolizoszómák fúzióját gátló bafilomycin A1 alkalmazásával (Hart és mtsai. 2012). A különböző kópiaszámú Drosophila Myc expressziója által előidézett fokozott sejtnövekedést sikeresen gátoltuk mind genetikai úton, mind chloroquine kezeléssel, ami erősen támogatja a további autofág gátlószerek klinikai tesztelését Myc-asszociált tumorok esetén. A megemelkedett Myc expresszió akár olyan biomarkerként is szolgálhatna a jövőben, mely az UPR-indukált autofágia és antioxidáns válasz gátlószerek kombinált alkalmazását indokolná tumorterápiák esetén.
8|
Publikációk Erdi B*, Nagy P*, Zvara A, Varga A, Pircs K, Menesi D, Puskas LG, Juhasz G. Loss of the starvation-induced gene Rack1 leads to glycogen deficiency and impaired autophagic responses in Drosophila. Autophagy. 2012; 8(7) 1124–1135. *megosztott első szerző
Pircs K, Nagy P, Varga A, Venkei Z, Erdi B, Hegedus K, Juhasz G. Advantages and limitations of different p62-based assays for estimating autophagic activity in Drosophila. PLOS One. 2012; 7(8): e44214.
Takats S, Nagy P, Varga A, Pircs K, Karpati M, Varga K, Kovacs A, Hegedus K, Juhasz G. Autophagosomal Syntaxin17-dependent lysosomal degradation maintains neuronal function in Drosophila. Journal of Cell Biology. 2013; 201(4):531-9.
Low P, Varga A, Pircs K, Nagy P, Szatmari Zs, Sass M, Juhasz G. Impaired proteasomal degradation enhances autophagy via hypoxia signaling in Drosophila. BMC Cell Biology. 2013; 14(1):29
Nagy P, Varga A, Pircs K, Hegedus K, Juhasz G. Myc-Driven Overgrowth Requires Unfolded Protein Response-Mediated Induction of Autophagy and Antioxidant Responses in Drosophila melanogaster. PLoS Genet 2013; 9(8): e1003664.
9|
Referenciák Amaravadi, R. K., D. Yu, et al. (2007). "Autophagy inhibition enhances therapy-induced apoptosis in a Myc-induced model of lymphoma." J Clin Invest 117(2): 326-336. Hart, L. S., J. T. Cunningham, et al. (2012). "ER stress-mediated autophagy promotes Mycdependent transformation and tumor growth." J Clin Invest 122(12): 4621-4634. Maclean, K. H., F. C. Dorsey, et al. (2008). "Targeting lysosomal degradation induces p53dependent cell death and prevents cancer in mouse models of lymphomagenesis." J Clin Invest 118(1): 79-88.
10 |
