Az autofágia kapcsolata a sejt más lebontó rendszereivel: a Rab11 fehérje szerepének vizsgálata Doktori értekezés Szatmári Zsuzsanna
Biológia Doktori Iskola, iskolavezető: Prof. Erdei Anna Molekuláris Sejt- és Neurobiológia Doktori Program, Programvezető: Prof. Sass Miklós Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar
Témavezető: Prof. Sass Miklós Készült: Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Anatómiai, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszék Budapest, 2014
1
Tartalomjegyzék
1.
Rövidítésjegyzék .................................................................................................................... 4
2.
Bevezetés .............................................................................................................................. 7 2.1.
Az autofágia................................................................................................................... 7
2.1.1.
Az autofágia és jelentősége .................................................................................. 7
2.1.2.
Az autofágia molekuláris mechanizmusa ............................................................ 10
2.1.3.
A szelektív és nem-szelektív autofágia ................................................................ 14
2.2.
Az endo-lizoszomális rendszer .................................................................................... 16
2.2.1.
Az endocitózis...................................................................................................... 16
2.2.2.
Minden út a korai endoszómákba vezet ............................................................. 18
2.2.3.
Az endoszóma-érés ............................................................................................. 22
2.3.
Az autofágia és az endo-lizoszomális rendszer kapcsolatai ........................................ 27
2.3.1.
Az autofág és endocitotikus útvonalak konvergenciája ...................................... 27
2.3.2. Az autofág és az endocitotikus útvonal molekuláris mechanizmusának közös résztvevői ............................................................................................................................ 28
3.
2.4.
A Rab fehérjék ............................................................................................................. 31
2.5.
Az ubiquitin-proteaszóma rendszer ............................................................................ 34
2.6.
Az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) mint modellrendszer .............................. 37
Eredmények ........................................................................................................................ 44 3.1. Az autofágia és az endo-lizoszómális rendszer kapcsolatának vizsgálata: a Rab11 szerepe .................................................................................................................................... 44 3.1.1.
A Rab11 fehérje szerepet játszik az autofágiában .............................................. 44
3.1.2.
A Rab11 fehérje szükséges az autofagoszóma-éréshez ...................................... 48
3.1.3.
Rab11 hiányában késői endoszómák halmozódnak föl a sejtekben ................... 53
3.1.4.
A Rab11 szükséges az amfiszóma képződéshez .................................................. 58
3.1.5.
A Rab11 autofagoszómákra lokalizál .................................................................. 60
3.1.6.
A Rab11 kölcsönhatásba lép a Hook fehérjével .................................................. 62
3.1.7.
A Rab11 és a Hook fehérjék eltérő szerepet látnak el az autofágiában ............. 65
3.1.8. A Rab11 a Hook lokalizációjának szabályozásán keresztül segíti az endoszóma érés folyamatát ................................................................................................................... 67 3.2.
Az autofágia és az ubiquitin-proteaszóma rendszer kapcsolatának vizsgálata .......... 74
3.2.1.
A proteaszóma-működés hibája a sejtméret csökkenéséhez vezet ................... 74
2
3.2.2. A proteaszóma alegységek csendesítése P62-tartalmú granulumok felhalmozódásához vezet .................................................................................................... 76 3.2.3. 4.
5.
A proteaszómák hibás működése felerősíti az autofágiát .................................. 78
Az eredmények megvitatása ............................................................................................... 79 4.1.
Az autofágia kapcsolata az endo-lizoszómás rendszerrel: a Rab11 közvetítő szerepe79
4.2.
Az autofágia kapcsolata az ubiquitin-proteaszóma rendszerrel ................................. 83
Anyagok és módszerek ........................................................................................................ 85 5.1.
Drosophila törzsek és fenntartásuk ............................................................................ 85
5.2.
Sejttenyészet és konstrukciók ..................................................................................... 89
5.3.
Ko-immunprecipitáció ................................................................................................. 90
5.4.
Western blot és immunhisztokémia ........................................................................... 91
5.5.
Ellenanyagok ............................................................................................................... 92
5.6.
Hisztológia és képalkotás ............................................................................................ 94
5.7.
Kvantifikálás és statisztikai elemzés ............................................................................ 94
5.8.
Elektronmikroszkópia.................................................................................................. 96
6.
Összefoglaló ........................................................................................................................ 98
7.
Summary ............................................................................................................................. 99
8.
Köszönetnyilvánítás........................................................................................................... 100
9.
Irodalomjegyzék ................................................................................................................ 101
3
1. Rövidítésjegyzék Rövidítés
Magyarázat és feloldás
AEL
peterakás után (after egg laying)
Alfy
autofágiához köthető FYVE-doménes fehérje (autophagy-linked FYVE protein)
AMBRA1
a Beclin1-szabályozta autofágia aktiváló molekulája 1 (activating molecule in Beclin1-regulated autophagy 1)
AP
alkalikus foszfatáz (alkaline phosphatase)
atg
autofágiához kapcsolt gén vagy fehérje (autophagy related)
CI-MPR
kation-független mannóz-6-foszfát receptor (cation-independent mannose-6-phosphate receptor)
CLIC/GEEC
klatrin-független szállítóval és GPI-horgonyos fehérjékben gazdag korai endoszómával rendelkező endocitózis útvonal (clathrin-independent carrier and GPI-anchored protein-enriched early endosomal compartment)
CMA
chaperon-mediált autofágia (chaperone-mediated autophagy)
CORVET
C-típusú Vps „maggal” rendelkező vakuóla-endoszóma pányvázó komplex (class C core vacuole/endosome tethering)
CQ
chloroquine
DAPI
4',6-diamidino-2-fenil-indol (4',6-diamidino-2-phenylindole)
DN
domináns negatív
EEA1
korai endoszóma antigén 1 (early endosome antigen 1)
EGFP
a zöld fluoreszcens fehérje egyik változata (enhanced green fluorescent protein)
EGFR
epidermális növekedési faktor receptor (epidermal growth factor receptor)
ER
endoplazmás retikulum
ESCRT
szállításhoz szükséges endoszómális válogató komplex (endosomal sorting complex required for transport)
FIP200
a fokális adhéziós kinázokkal kölcsönható 200kDa molekulatömegű fehérje (focal adhesion kinase family interacting protein of 200kD)
Flp
flippáz enzim
FRT
az Flp által felismert szekvencia (Flp recognition target) 4
FYCO1
FYVE és coiled-coil domént tartalmazó fehérje (FYVE and coiled-coil domain containing 1)
GAP
GTPáz aktiváló fehérje (GTPase activating protein)
GDF
GDI-t eltávolító faktor (GDI displacement factor)
GDI
GDP disszociációt gátló fehérje (GDP dissociation inhibitor)
GDP
guanozin-difoszfát (guanosine diphosphate)
GEF
guanin nukleotidot cserélő faktor (guanine nucleotide exchange factor)
GFP
zöld fluoreszcens fehérje (green fluorescent protein)
GPI
glikozil-foszfatidil-inozitol (glycosylphosphatidylinositol)
GTP
guanozin-trifoszfát (guanosine triphosphate)
HA
hemagglutinin
HIF-1α
Hipoxia-indukált faktor 1α
HOPS
homotipikus fúziós és vakuóláris fehérjeválogató komplex (homotypic fusion and vacuole protein sorting)
ILV
intralumenáris vezikulum
KA
konstitutívan aktív
ktrl
kontroll
Lamp
lizoszómához kötött membránfehérje (lysosomal-associated membrane protein)
LC3
mikrotubulus asszociált fehérje 1 könnyű lánc 3 ((MAP1)light chain 3)
LE
késői endoszóma (late endosome)
LIR
LC3 interakciós régió (LC3 intercating region)
Lsp2
lárvális szérum fehérje 2 (larval serum protein 2)
LTR
LysoTracker Red
mCh
mCherry
MVB
multivezikuláris test (multivesicular body)
NBR1
a BRCA1 gén szomszédjáról képződő fehérje (neighbor of BRCA1 gene 1)
OATL1
ornitin-aminotranszferáz-szerű fehérje 1 (ornithine aminotransferase-like 1)
ORP1L
az oxiszterol-kötő fehérje rokona 1L (oxysterol-binding protein related protein 1L)
PAS
preautofág struktúra vagy fagofór összeszerelő hely (pre-autophagosomal structure or phagophore assembly site)
PBS
foszfát puffer (phosphate buffered saline)
PE
foszfatidil-etanolamin (phosphatidylethanolamine) 5
PI3K
foszfatidil-inozitol-3-kináz (phosphatidylinositol 3 kinase)
PI3P
foszfatidil-inozitol-3-foszfát (phosphatidylinositol 3 phosphate)
PI(3,5)P2
foszfatidil-inozitol-3,5-biszfoszfát (phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate)
PI(4)P5K
foszfatidil-inozitol-4-foszfát-5-kináz (phosphatidylinositol 4-phosphate 5 kinase)
PI(4,5)P2
foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate)
Rbsn5
Rabenozin-5 (Rabenosin-5)
RE
reciklizáló endoszóma (recycling endosome)
Ref(2)P
Refractory to sigma P
REP
Rab kísérő fehérje (Rab escort protein)
RILP
Rab-kölcsönható lizoszómális fehérje (Rab-interacting lysosomal protein)
RISC
RNS-indukált géncsendesítő komplex (RNA-induced silencing complex)
RNSi
RNS interferencia
SE
korai vagy válogató endoszóma (sorting endosome)
siRNS
rövid, interferáló (small interfering) RNS
SNARE
SNAP (Soluble NSF Attachment Protein) receptor
TBS
Tris puffer (Tris buffered saline)
TfR
transzferrin receptor
TRA
Texas Red-Avidin
TRAPP III
transzport fehérje komplex (Transport Protein Particle III)
UAS
Upstream Activating Sequence
Ub
ubiquitin
ULK
unc51-szerű kináz (unc-51-like kinase)
UPS
ubiquitin-proteaszóma rendszer (ubiquitin-proteasome system)
UVRAG
UV sugárzás rezisztenciához kapcsolódó gén (UV radiation resistance associated gene)
VHL
Von Hippel-Lindau betegség génjéről átíródó fehérje
VMP1
vakuóláris membránfehérje 1 (vacuolar membrane protein 1)
Vps
vakuóláris fehérjeválogatásban részt vevő fehérjék (vacuolar protein sorting)
VT
vadtípusú
YFP
sárga fluoreszcens fehérje (yellow fluorescent protein)
6
2. Bevezetés 2.1. Az autofágia 2.1.1. Az autofágia és jelentősége
Az autofágia az eukaritóta sejtek evolúciósan konzervált folyamata, melynek során a sejt különböző anyagai a lizoszómába – vagy növényi és gombasejtek esetében a vakuólumba – szállítódnak, és ott lebontásra kerülnek. Három fő típusa van: a makroautofágia, a mikroautofágia és a chaperon-mediált autofágia (1. ábra). A chaperon-mediált autofágia (CMA) a szolubilis fehérjék szelektív lizoszomális lebontásának egyik módja (Cuervo, 2010). A KFERQ aminosav motívumot tartalmazó, hibás konformációjú vagy elöregedett fehérjéket citoplazmás dajkafehérjék (chaperonok) ismerik föl, és kitekert állapotban a lizoszomális membrán Lamp2A transzporteréhez szállítják. A fehérje ezen a csatornán keresztül a lizoszómába jut, ahol lebontásra kerül. Az autofágia másik két típusa képes nagyméretű citoplazmás struktúrákat is a lizoszómába juttatni, mind szelektív, mind nem-szelektív módon. A mikroautofágia során a lizoszómát határoló membrán betűrődésével a citoplazma egyes részletei közvetlenül a lizoszómába jutnak. A makroautofágia során egy izoláló membrán (fagofór) alakul ki, amely növekedésnek indul, és körülzárja a citoplazma egyes részleteit, organellumait, majd önmagával záródva egy jellegzetes, kettős membránnal határolt struktúrát hoz lére, amelyet autofagoszómának nevezünk. Az autofagoszóma később lizoszómákkal fúzionál, és a tartalma degradálódik (Klionsky, 2005). A továbbiakban az autofágia kifejezést csak a makroautofágiára használjuk. Bár az autofágia jelenségét emlős sejtekben fedezték föl, a folyamat mögött húzódó molekuláris mechanizmus alapjait először sörélesztőben (Saccharomyces cerevisiae) írták le (Levine és Klionsky, 2004). Mára köztudottá vált, hogy az autofágia, mint stresszhatásokra és patológiás helyzetekre adott citoprotektív válasz, fontos szerepet játszik többsejtű eukarióta szervezetekben is (Mizushima és mtsai, 2008; Levine és Kroemer, 2008). Az autofágia a sejtek homeosztázisának fenntartásában is nélkülözhetetlen: a folyamat aktivitásának csökkenése számos humán betegség kialakulásának, illetve progressziójának a hátterében áll. Megfelelő szintű autofág aktivitás hiányában a sejtekben hibás vagy elöregedett organellumok, vagy nem megfelelő konformációjú fehérjék halmozódnak fel, ami különböző neurodegenerációs betegségek kialakulásához vezethet (Juhász és mtsai, 2007; Levine és Kroemer, 2008;
7
Mizushima és mtsai, 2008; Simonsen és mtsai, 2008; Winslow és Rubinsztein, 2008). Több Drosophila és emlős modellrendszerben kivitelezett tanulmány is igazolta, hogy az autofágia fontos szerepet játszik a Huntington-kór megelőzésében. Eltávolítja ugyanis az idegsejtekből a poliglutamin fehérjeaggregátumokat, amelyek felhalmozódása a betegség egyik jellegzetes tünete (Ravikumar és mtsai, 2004; Williams és mtsai, 2006; Ravikumar és mtsai, 2008). Emellett igazolták, hogy az autofágia hibájának szerepe van más ismert neurodegeneratív betegségek, például az Alzheimer- és Parkinson-kór kialakulásában is (Ling és Salvaterra, 2009; Winslow és mtsai, 2010).
1. ábra. Az autofágia fő típusai. A makro-, mikro- és chaperon-mediált autofágia különböző mechanizmusok révén juttatja el a sejt saját anyagait a lizoszómákba, ahol azokat lizoszomális hidrolázok degradálják. A lebontás során keletkezett kis molekulákat permeázok juttatják vissza a citoplazmába, építőköveket szolgáltatva az anabolikus folyamatok számára. Az ábrát Mizushima és munkatársai (Mizushima és mtsai, 2008) nyomán a Szerző módosította.
A neurodegeneratív betegségek mellett az autofágia a tumorképződésben és progresszióban is fontos, bár ellentmondásos szerepet játszik. A sérült, elöregedett mitokondriumok eltávolításával az autofágia csökkenti az oxidatív stresszt és ezzel együtt a különböző, többek között a tumorprogressziót is elősegítő mutációk kialakulásának valószínűségét (Kongara és Karantza, 2012; Bellot és mtsai, 2013). Az autofágia tumorszuppresszor hatását tovább erősíti, hogy mell-, prosztata- és petefészek tumorok 4075%-ában kimutatták egy fontos autofág fehérje, az Atg6/Beclin1 génjének monoallélikus delécióját (Aita és mtsai, 1999; Mizushima és mtsai, 2008). Ráadásul kimutatták olyan onkogén fehérjék létezését is, amelyek a TOR kináz (részletesebb ismertetését lásd később) aktivitását fokozva állandó gátlás alatt tartják az autofágiát (Maiuri és mtsai, 2009). Ezzel ellentétben más 8
tanulmányok az autofágia szerepét épp a tumorprogresszió elősegítésében hangsúlyozzák (Wei és mtsai, 2011; Kimmelman, 2011). Ezek a munkák azt igazolják, hogy az autofágia energia-megtakarító folyamatként - főként a vaszkularizáció lejátszódása előtt – segít a tumorigenezis kezdeti lépéseiben, a későbbi stádiumú tumorokban pedig a megnövekedett szintű
glikolízishez
szolgáltat
elegendő
alapanyagot
(Lock
és
mtsai,
2011).
A
tumorképződésben, illetve a neurodegenerációban megismert hatásai mellett az autofágia hibái számos más betegségben is közrejátszhatnak (2. ábra). A patológiás vonatkozások mellett az autofágia aktivitása az élethossz szabályozásában is fontos szerepet játszik. A hibás és elöregedett sejtalkotók eltávolítása, a sejt homeosztázisának fenntartása, valamint az oxidatív stressz csökkentése révén az autofágia növeli az élethosszt (Vellai és mtsai, 2009; Rubinsztein és mtsai, 2011). Ezt támasztják alá azok a megfigyelések is, melyek szerint az életkor előre haladtával csökken mind a makroautofágia, mind a chaperonmediált autofágia aktivitása (Cuervo és mtsai; Del Roso és mtsai, 2003). Az autofágiát citoprotektív szerepe mellett - elsősorban az egyedfejlődés különféle folyamataiban - II. típusú programozott sejtpusztulásként is számon tartják, bár napjainkban sok erre vonatkozó tanulmány eredményeit egyre inkább vitatják (Denton és mtsai, 2012). Mindezek alapján nyilvánvaló, hogy az autofágia molekuláris részleteinek, működésének felderítése igen időszerű és szükséges. Kiemelten fontos, hogy megismerjük az autofágia szerepét a különböző fiziológiás folyamatokban és patológiás elváltozásokban egyaránt, hiszen ez háttérismeretet biztosít újabb terápiás célpontok azonosításához, és hatékonyabb, célzottabb kezelések kidolgozásához .
9
2. ábra. Az autofágia kettős szerepe különböző emberi betegségekben. Mizushima és munkatársai (Mizushima és mtsai, 2008) nyomán a Szerző módosította.
2.1.2. Az autofágia molekuláris mechanizmusa
Az autofágia folyamatát fémjelző struktúrák, az autofagoszómák kialakulásának hátterében bonyolult molekuláris mechanizmussal rendelkező szabályozó folyamatok bújnak meg. A folyamatban központi szerepet betöltő körülbelül 20 atg gént (autophagy related gene) élesztőben azonosították először (Tsukada és Ohsumi, 1993; Thumm és mtsai, 1994; Harding és mtsai, 1995). Az atg génekről kifejeződő fehérjék különböző komplexeket alkotnak, majd meghatározott sorrendben az autofagoszóma kialakulásának helyére, a pre-autofág struktúrára (PAS) toborzódnak (3. ábra) (Suzuki és mtsai, 2007; Suzuki és Ohsumi, 2010; Mizushima és mtsai, 2011). Az Atg fehérjék hierarchikus kapcsolatrendszerét már többsejtű modellszervezetekben, így a fonálféreg Caenorhabditis elegansban, ecetmuslicában és emlős sejttenyészetekben is feltérképezték (Itakura és Mizushima, 2010; Lu és mtsai, 2011; Nagy és mtsai, 2013). Autofágia-indukció során elsőként az úgynevezett indukciós komplex, más néven Atg1vagy ULK1/2-komplex jelenik meg a PAS-on (Chan és Tooze, 2009; Mizushima, 2010). A
10
fehérjekomplex névadó tagja az Atg1 (Unc-51-like kináz 1/2, vagyis ULK1/2 emlősökben), amely az egyetlen kináz az Atg fehérjék között (Matsuura és mtsai, 1997; Yan és mtsai, 1998; Chan és mtsai, 2007). A komplex összeszerelődéséhez elengedhetetlen az Atg17 (emlősökben és ecetmuslicában FIP200) állványfehérje jelenléte (Kabeya és mtsai, 2005; Hara és mtsai, 2008; Ragusa és mtsai, 2012; Nagy és mtsai, 2014). A komplexhez tartozik még az Atg13 (Funakoshi és mtsai, 1997; Chang és Neufeld, 2009; Tian és mtsai, 2009) és az Atg101 is (Mercer és mtsai, 2009; Hosokawa és mtsai, 2009; Liang és mtsai, 2012). Az Atg1 (ULK1/2) aktív állapotában foszforilálja az Atg13-t és a FIP200-at is, de ennek még nem ismerik a pontos fiziológiai jelentőségét (Chan és mtsai, 2009; Chang és Neufeld, 2009; Jung és mtsai, 2009). A közelmúltban mutatták ki, hogy emlős sejtekben az aktív ULK1 foszforilálja a hierarchiában utána következő úgynevezett nukleációs komplex tagjait, az AMBRA1 és Atg6/Beclin1 fehérjéket is (Di Bartolomeo és mtsai, 2010; Russell és mtsai, 2013), és ezzel hozzájárul az egész nukleációs komplex aktivitásának növeléséhez. Egy másik tanulmány szerint pedig az ULK1 egy miozin könnyű lánc-szerű fehérje foszforilálásán keresztül a miozin II motorfehérje működését is szabályozza, és így befolyásolja az autofagoszóma növekedéséhez membrán forrást biztosító vezikulumok szállítását a PAS-hoz (Tang és mtsai, 2011). A komplex hasonló szerepét élesztősejtekben is leírták: ott azt találták, hogy az Atg17 közvetlenül köti az Atg9 fehérjét, és ezzel segíti PAS-ra történő toborzását (Sekito és mtsai, 2009; Reggiori és mtsai, 2004). Az Atg9 az Atg csoport egyetlen transzmembrán fehérjéje; kulcsszerepet tölt be a Golgieredetű vezikulumoknak az autofagoszóma képződés helyére történő szállításában, ami membránforrást szolgáltat a növekvő fagofór számára (Young és mtsai, 2006; Webber és mtsai, 2007; Yamamoto és mtsai, 2012). Az Atg9 különböző membránforrások és PAS közötti ciklizálását az Atg2 és Atg18 fehérjék segítik (Munakata és Klionsky, 2010). A már említett nukleációs komplex az Atg1 komplexszel együtt az autofágia korai szakaszában, a fagofór növekedésében játszik fontos szerepet (Funderburk és mtsai, 2010). A komplex katalitikus tagja a III. típusú foszfatidilinozitol-3-kináz (PI3K) Vps34, amely a regulációs alegységgel, a Vps15-tel együtt az autofág membrán foszfatidilinozitol-3-foszfát- (PI3P-) tartalmának kialakításáért felelős (Juhász és mtsai, 2008; Lindmo és mtsai, 2008). A komplex „magjához” tartozik az Atg6/Beclin1 fehérje is (Zeng és mtsai, 2006; Furuya és mtsai, 2005). Ez a három fehérje élesztőben és emlősökben is két különböző összetételű komplexet alakít ki, amelyek közül csak a negyedik tagként Atg14-et (emlősökben Atg14L) is tartalmazónak van szerepe az autofágiában (Kihara és mtsai, 2001; Itakura és mtsai, 2008; Itakura és Mizushima, 2009; Matsunaga és mtsai, 2009; Zhong és mtsai, 2009). Az Atg14L elsődleges szerepe valószínűleg a komplexnek az autofagoszóma-képződés helyszínére történő toborzása (Matsunaga és mtsai, 2010). A komplexhez kötődhetnek egyéb járulékos fehérjék is, ilyen 11
például az AMBRA1, a VMP1 (vakuoláris membrán protein 1) vagy a kis G-fehérje Rab5 (Di Bartolomeo és mtsai, 2010; Molejon és mtsai, 2013; Ravikumar és mtsai, 2008). Ezek elsősorban a komplex aktivitását szabályozzák. Az autofagoszóma-képződéshez szükséges két ubiquitin-szerű fehérjekonjugációs rendszer is: az Atg8- és az Atg12-konjugációs rendszer (Geng és Klionsky, 2008). Az Atg7 fehérje mindkét rendszerben az E1, azaz az ubiquitin aktiváló enzim feladatát látja el (Tanida és mtsai, 1999, 2001). Ezután az Atg10 E2-szerű fehérje segítségével az ubiquitin-szerű Atg12 fehérje kovalensen kapcsolódik az Atg5-höz (Shintani és mtsai, 1999; Mizushima és mtsai, 2002). Végül az Atg5-12 konjugátum egy nagyméretű, Atg16-ot is tartalmazó fehérjekomplexbe szerelődik (Kuma és mtsai, 2002). Ez az Atg5-12-16 komplex E3-szerű (ubiquitin-ligáz) aktivitású, és az E2szerű enzimként funkcionáló Atg3 fehérje (Tanida és mtsai, 2002) közreműködését követően az ubiquitin-szerű Atg8 (emlősökben LC3) fehérjét kovalensen foszfatidil-etanolaminhoz (PE) kapcsolja (Hanada és mtsai, 2007; Romanov és mtsai, 2012; Walczak és Martens, 2013). Azonban ahhoz, hogy az Atg8/LC3 lipidálódhasson, előbb az Atg4 cisztein proteáznak kell azt egy meghatározott helyen hasítania (Fujita és mtsai, 2008; Satoo és mtsai, 2009). Ezen összetett folyamat végén keletkező lipidált Atg8/LC3 (Atg8/LC3-II forma) a fagofór, majd később az autofagoszóma mindkét membránjához kapcsolódik (Kabeya és mtsai, 2000). A záródott autofagoszómák külső membránjáról az Atg8/LC3 képes reciklizálódni, a belső membránban található fehérjék viszont bekerülnek az autofagoszóma belsejébe, és a lizoszómával való fúziót követően degradálódnak (Chen és Klionsky, 2011). Mivel az Atg8/LC3 az autofágia kezdeti lépéseitől egészen az autolizoszomális degradációig jelen van az autofág struktúrákon, széles körben alkalmazzák általános autofágia markerként (Klionsky és mtsai, 2012).
12
3. ábra. Az autofágia folyamatát bemutató sematikus ábra. A rajz balról jobbra haladva időrendi sorrendben mutatja be az autofágia legfontosabb lépéseit. Emellett feltünteti az autofágiát szabályozó legismertebb jelátviteli útvonal (az inzulin-szignalizáció) tagjainak és az eukarióta sejtek anabolikus és katabolikus folyamatait reguláló TORC1 (Target of Rapamycin Complex1) komplexnek az autofágia-indukcióra gyakorolt hatását. Az ábra továbbá szemlélteti az autofagoszóma képződés lépéseiben, illetve a lizoszómával történő fúzió során szerepet játszó fehérjekomplexeket is. Nagy Péter ábrája.
13
2.1.3. A szelektív és nem-szelektív autofágia
Az autofágia a legtöbb eukarióta sejttípusban állandóan működik, ezt nevezzük alapszintű vagy bazális autofágiának. A folyamat során - a már bemutatott molekuláris mechanizmussal - a citoplazmában autofagoszómák képződnek, majd keresztülmennek egy érési fázison , melynek
végén
lizoszómákkal
fuzionálnak
és
tartalmukat
savas
pH-n
működő
emésztőenzimek degradálják. Az alapszintű autofágia olyan alacsony szinten működik, hogy fiziológiás körülmények között szinte lehetetlen detektálni. Különböző stresszhatásokra, például az aminosavak megvonására a sejtek heves, úgynevezett stressz-indukált autofágiával válaszolnak. Ennek során élesztősejtekben a citoplazma egy kitüntetett helyén (PAS), emlőssejtekben pedig egyszerre több helyen autofagoszómák formálódnak, és nagy mennyiségű citoplazmatikus anyagot szállítanak lebontásra a vakuólumba vagy lizoszómákba. A stressz-indukált autofágia ezáltal a stressz túlélését biztosító építőanyagokat és energiát szolgáltat a sejtek számára. Míg a stressz-indukált autofágia valószínűleg nem specifikus (azaz válogatás nélkül szállít lebontásra különböző sejtalkotókat és citoplazmatikus fehérjéket), addig az alapszintű autofágiának ismert egy szelektív változata is (Reggiori és mtsai, 2012; Nezis, 2012). A szelektív autofágia során különböző receptorfehérjék jelölik ki a lebontásra szánt kargót. Ilyenek például a P62 (Drosophilában Ref(2)P) (Pankiv és mtsai, 2007), az NBR1 (Kirkin és mtsai, 2009a; Deosaran és mtsai, 2012), a Nix (Novak és mtsai, 2010) és az Alfy (Drosophilában Blue Cheese) (Simonsen és mtsai, 2004; Isakson és mtsai, 2013). Ezeknek a fehérjéknek közös jellemzőjük, hogy LIR (LC3 interacting region) motívumukon keresztül az autofagoszómák membránjához rögzült Atg8/LC3-hoz kötődnek, ezzel a lebontásra szánt fehérjéket vagy organellumokat közvetlenül az autofág membránhoz kapcsolják (4. ábra). A P62 fehérje a LIR motívum mellett ubiquitin-kötő domént is tartalmaz, így igen fontos szerepet játszik az ubiquitinált fehérjék és aggregátumaik eltávolításában. Ráadásul a P62 kölcsönhatásait kimutatták más autofág fehérjékkel, köztük néhány központi Atg-vel is (például Atg101, Atg18, Atg14, Vps34), így valószínűsíthető, hogy az autofagoszómák kialakításában is szerepe van (Guruharsha és mtsai, 2011; Nagy és mtsai, 2014).
14
4. ábra. A szelektív autofágia. A szelektív és nem-szelektív autofágia hasonló molekuláris mechanizmussal, azonos résztvevőkkel zajlik. A két folyamat között a legfőbb különbség a fagofór növekedési stádiumában zajló szelektív, irányított kargó-toborzás. A folyamat során autofág receptorfehérjék különböző doménjeikkel egyszerre kapcsolódnak a lebontásra szánt kargóhoz és a fagofór membránjához kötött LC3-hoz (az interakciót csillagok jelölik). Az ábrát Birgisdottir és munkatársai munkája (Birgisdottir és mtsai, 2013) nyomán a Szerző módosította.
15
2.2. Az endo-lizoszomális rendszer 2.2.1. Az endocitózis
Az autofágia mellett az endocitózis a másik fő útvonal, amely energiát és építőköveket szolgáltat a sejteknek. Az endocitózis rendkívül komplex folyamat, mely során a sejt képes folyadék, valamint kolloid vagy annál nagyobb mérettartományba eső anyagok – például makromolekulák, oldott anyagok, lipidek, sejttörmelék, membránfehérjék, baktériumok vagy vírusok – szelektív és nem-szelektív felvételére. Az endocitózis a felvett anyag természetétől és méretétől függően eltérő útvonalakon, különböző molekuláris mechanizmusok segítségével valósulhat meg (Doherty és McMahon, 2009) (5. ábra).
5. ábra. Az endocitózis főbb típusai. Az ábra a legismertebb endocitotikus útvonalakat mutatja be, feltüntetve az útvonalakat fémjelző legfontosabb fehérjéket is. Az önálló kaveoszómák létezését néhány, az utóbbi időben született tanulmány megkérdőjelezi. A CLIC/GEEC útvonalat az azt fémjelző klatrin-független vezikuláris szállítás és GPI-horgonyos fehérjékben gazdag korai endoszómák után nevezték el. Az ábrát Parton és munkatársai (Parton és Simons, 2007) munkája nyomán a Szerző módosította.
16
A fagocitózis egy speciális, az aktinváz átszerveződését is igénylő endocitotikus folyamat, amire soksejtűekben csak a professzionális fagocita sejtek képesek (Caron és Hall, 1998; Chimini és Chavrier, 2000; Castellano és mtsai, 2000). Fagocitózissal a sejtek 0,25µm-nél nagyobb átmérőjű szilárd részecskéket vesznek föl, például az Fc-receptorok által megkötött opszonizált patogéneket vagy apoptózissal elpusztult sejtek maradványait (Massol és mtsai, 1998; Doherty és McMahon, 2009). Az útvonal érdekessége, hogy bár a kanonikus endoszomális útvonalra jellemző (később ismertetett) molekuláris változások végbemennek a fagoszómákon is, azok mégis egy független, közvetlen útvonalon szállítódnak a lizoszómákhoz és fuzionálnak velük. Egyes baktériumok – például a Listeria és a Salmonella – képesek arra, hogy nem-fagocita sejtekben fagocitózist váltsanak ki, és ezen az úton a sejt belsejébe jussanak (Greenberg, 2001). A makropinocitózis során a sejtek lamellipódiumaik segítségével vesznek fel oldott anyagokat 1µm-nél nagyobb átmérőjű vezikulumokba. Ez a folyamat jellegzetessége, hogy nagy mennyiségű koleszterin jelenlétét igényli a plazmamembránban, illetve a vezikulák lefűződése általában nem igényel dinamint (lásd később), de az aktinváz átszervezésével jár (Grimmer és mtsai, 2002; Doherty és McMahon, 2009). A legismertebb endocitotikus útvonal a klatrin-függő endocitózis, mely kb. 120nm átmérőjű, klatrin burokfehérjével borított vezikulumok képződését eredményezi (Mousavi és mtsai, 2004). A vezikulumok alakját, méretét, illetve a belsejükbe kerülő kargó mennyiségi és minőségi válogatását maga a burokfehérje határozza meg (6. ábra). A felvételre szánt transzmembrán receptorok citoplazmatikus szegmense és a klatrin fehérje között az AP-2 adaptor fehérjekomplex, illetve az Epsin fehérjecsalád tagjai teremtenek kapcsolatot (Page és Robinson, 1995; Aguilar és mtsai, 1997; Chen és mtsai, 1998; Ford és mtsai, 2002). A vezikulumok lefűződésében kulcsszerepe van a dinamin GTPáznak (Hinshaw, 2000). A lefűződést követően a burokfehérje disszociál a vezikulumról, amely így alkalmas lesz a sejtváz komponensei mentén történő szállításra. A kaveolin-függő endocitotikus útvonal során a kaveolin burokfehérje közreműködésével 50-60nm átmérőjű vezikulumok keletkeznek. A kaveolin molekulák hajtűt formálva integrálódnak a membránba oly módon, hogy N- és C-terminusuk is a citoplazma felé néz; majd ezután 14-16 monomerből álló komplexeket alkotnak. A kaveolin emellett koleszterinhez és zsírsavakhoz is kötődik (Sargiacomo és mtsai, 1995), ezért elsősorban lipidraftok területén fordul elő, és az itt található molekulák internalizációjáért felelős (Parton és mtsai, 2006; Lajoie és Nabi, 2010). Ez az endocitózis-útvonal gyakran nem a lizoszomális lebontás irányába szállítja a felvett anyagokat, hanem az internalizált receptorokat átmeneti 17
raktározás után visszajuttatja a plazmamembránba. Ezen kívül a folyamat fontos szerepet tölt be a potocitózisban (vezikulum-lefűződés nélkül végbemenő molekula- és ionfelvétel), a transzcitózisban, illetve a GPI-horgonnyal rendelkező fehérjék felvételében és a polarizált sejtek különböző membrándoménjei között történő lipid-szortírozásban is (Bathori és mtsai, 2004; Bastiani és Parton, 2010; Parton és del Pozo, 2013).
6. ábra. A klatrin-függő endocitózis lépései. A klatrin-burokkal borított vezikulumot a dinamin GTPáz fűzi le a plazmamembránról. A burokfehérje disszociációját citoplazmatikus fehérjék (auxilin, Hsc70) segítik. Az ábrát (Doherty és McMahon, 2009) nyomán a Szerző módosította.
A közelmúlt eredményei egyértelművé tették, hogy egyes eukarióta sejtek rendelkeznek egyéb, specifikus klatrin- és kaveolin-független endocitózis-útvonalakkal is (Sandvig és mtsai, 2011). Ezeket elsősorban elektronmikroszkópos morfológiai megfigyelések, illetve a kanonikus
útvonalakhoz
képest
szokatlan
molekuláris
mechanizmusaik
alapján
csoportosíthatjuk (Doherty és McMahon, 2009). A legismertebbek közülük az Arf6-függő és flotillin-függő endocitotikus mechanizmusok, valamint az úgynevezett CLIC/GEEC – a klatrinfüggetlen módon történő és GPI-horgonyos fehérjékben gazdag korai endoszómák által fémjelzett – útvonal.
2.2.2. Minden út a korai endoszómákba vezet
A különböző endocitotikus útvonalakon keletkezett primer endoszómák legtöbbje a korai vagy válogató endoszómák szintjén találkozik. Ezek a sejtalkotók kiemelten fontos szerepet töltenek be az endocitózissal felvett anyagok további sorsának meghatározásában. Ahogy azt
18
a nevük is mutatja, a válogató (sorting) endoszómák (röviden SE) területén születik meg a döntés arról, hogy egy adott molekula milyen utat fog bejárni a sejtben (Spang, 2009). A korai endoszómák identitásának meghatározása más, membránnal határolt sejtalkotókéhoz hasonlóan két módon, lipidek és fehérjék segítségével történik. A SE-k legfontosabb fehérjemarkere a Rab5 kis G-fehérje (sörélesztőben Vps21) (Spang, 2009). Aktív állapotában a membránfelszínre toborozza a SE különböző funkcióihoz nélkülözhetetlen fehérjéket. A Rab5 segíti például a lipid-kináz Vps34 – és szabályozó alegysége, a Vps15 – endoszomális membránhoz kötődését (Christoforidis és mtsai, 1999b; Murray és mtsai, 2002). A Vps34 kináz szintetizálja a korai endoszómák legfontosabb lipidmarkerét, a PI3P-t, amely a Rab5-höz hasonlóan fontos szerepet játszik a korai endoszóma fehérjéinek toborzásában. Végül a Rab5 maga is kötődik a PI3P-hez, és saját aktivátor fehérjéjét is a SE membránjára toborozva kialakít egy pozitív visszacsatolási kört (Stenmark és mtsai, 1995; Horiuchi és mtsai, 1997; Lippé és mtsai, 2001), mely lehetővé teszi, hogy a korai endoszóma membránján aktív Rab5 fehérjék halmozódjanak föl. Ez a mechanizmus felfüggeszti az endoszóma további érését, ezzel időt biztosít az SE-ben végbemenő reciklizáló folyamatok számára. A Rab5 toborzó aktivitása határozza meg a korai endoszómák fúziós kapacitását és sejten belüli mozgását is. A SE-k homotipikus fúzió révén képesek más korai endoszómákkal egyesülni,
illetve
heterotipikus
módon
összeolvadhatnak
primer
endocitotikus
vezikulumokkal is. Az előbbi folyamatot a Rab5 effektoraként működő, több alegységből álló CORVET komplex (Peplowska és mtsai, 2007; Balderhaar és mtsai, 2013), az endocitotikus vezikulumok és korai endoszómák heterotipikus fúzióját pedig az EEA1 (élesztőben Vac1) fehérje pányvázó funkciója közvetíti (Simonsen és mtsai, 1998; Christoforidis és mtsai, 1999a; Cabrera és
mtsai, 2013). Rab5
effektorok
jelenlétében, kinezin, illetve
dinein
motorfehérjékhez kapcsolódva a SE-k a mikrotubuláris váz mentén mindkét irányban mozoghatnak (Loubéry és mtsai, 2008). A korai endoszómák vezikuláris és tubuláris doménekből állnak, utóbbi területeken történik meg a sejt számára még hasznos anyagok reciklizációja. A SE-k tubuláris doménjébe kerülő anyagok különböző útvonalakra terelődnek, visszajuthatnak a plazmamembránba, illetve a korai endoszómák és a transz-Golgi hálózat között is kétirányú a kapcsolat (7. ábra). A plazmamembránba két eltérő újrahasznosító folyamat révén kerülhet vissza fehérje (Sheff és mtsai, 1999; Grant és Donaldson, 2009). Az úgynevezett gyors reciklizáló útvonalon - a Rab4 kis G-fehérje segítségével - a kargó közvetlenül, átmeneti kompartimentum érintése nélkül a plazmamembránba jut (van der Sluijs és mtsai, 1992). A folyamathoz más fehérjék is szükségesek, például a Rabaptin-5 és a Rabenozin-5 (de Renzis és mtsai, 2002; Deneka és 19
mtsai, 2003). A lassú reciklizáló útvonalon a receptorok egy endoszomális reciklizáló központon (reciklizáló endoszóma, RE) keresztül érnek vissza a plazmamembránba. Ezen folyamat központi koordinátora egy másik kis G-fehérje, a Rab11, ezért gyakran használják ezt a fehérjét a reciklizáló endoszómák markereként (Hsu és Prekeris, 2010). A Rab11 kötőpartnerével, a Rab11-FIP2-vel együtt miozinVb-t toboroz a RE-k membránjára, ezzel segíti a plazmamembrán irányába történő szállítást (Gidon és mtsai, 2012). A Rab11 az Exocyst komplex toborzása révén azt is lehetővé teszi, hogy ezek a vezikulumok a plazmamembránnal fuzionálhassanak (Zhang és mtsai, 2004; Heider és Munson, 2012). A korai endoszómákból retrográd, a transz-Golgi hálózat (TGN) felé irányuló újrahasznosító transzport is zajlik. Ezt a több alegységből álló Retromer komplex közvetíti (Johannes és Popoff, 2008; Attar és Cullen, 2010; McGough és Cullen, 2011). A szállítandó kargó válogatása és toborzása mellett a komplex fontos szerepet tölt be a korai endoszómák tubuláris doménjeinek kialakításában és a szállítást végző vezikulumok lefűződésében is: a WASH fehérjével való kapcsolatán keresztül aktiválja az aktinváz lokális átszervezését végző Arp2/3 proteint (Derivery és mtsai, 2009). A reciklizáló folyamatok végén csak a korai endoszóma lebontásra szánt anyagokat tartalmazó, vezikuláris doménje marad vissza, amely ezután egy bonyolult érési folyamaton megy keresztül, mielőtt lizoszómákkal összeolvadva tartalma degradálódhatna.
20
7. ábra. A korai vagy válogató endoszóma (SE) kapcsolatai más sejtalkotókkal. A különböző endocitózis-útvonalakról érkező primer endocitotikus vezikulumok a korai endoszómákba olvadnak. A SE-k tubuláris doménjéből gyors, illetve lassú útvonalon is visszaszállítódhatnak a membránfehérjék a plazmamembránba; tipikusan ilyen kargó a transzferrin receptor (TfR). A kation-független mannóz-6foszfát receptor (CI-MPR) kétirányú utat jár be a korai endoszómák és a transz-Golgi hálózat (TGN) között. A reciklizáló folyamatok lejátszódása után a SE-k vezikuláris doménje egy érési folyamat során késői endoszómává alakul, majd ez utóbbi lizoszómákkal fuzionál és a tartalma degradálódik. Általában erre a lebontó útvonalra terelődik az epidermális növekedési faktor receptora (EGFR). Az ábrát Cullen munkája (Cullen, 2008) nyomán a Szerző módosította.
21
2.2.3. Az endoszóma-érés
A korai endoszóma lebontásra szánt anyagokat tartalmazó vezikuláris doménje komplex szabályozási mechanizmusok által vezérelt érési folyamaton megy keresztül, melynek eredményeképpen késői endoszómává (late endosome, LE) alakul át. Az érés során megváltoznak a sejtalkotó membránjának jellemzői, ennek megfelelően funkciói és képességei is. Az érési folyamat egyik legfontosabb lépése a Rab-ok kicserélődése (Rab-konverzió), mely során inaktiválódik a korai endoszómák membránján kialakult, Rab5-központú pozitív visszacsatolási folyamat. A Rab5 és effektorai disszociálódnak az endoszóma membránjáról, és helyüket a késői endoszómák identitását meghatározó Rab7, illetve az általa toborozott végrehajtó fehérjék veszik át (Huotari és Helenius, 2011). A Rab-csere kivitelezésében kulcsszerepet tölt be a dimert képző Mon1 (emlősökben SAND1) és Ccz1 fehérje (8. ábra). A Mon1-Ccz1 dimer gátolja a Rab5-öt aktiváló Rabex-5 fehérjét, ezzel segítve a Rab5 membránról való eltávolítását, ugyanakkor kiemelt szerepe van a Rab7 toborzásában is (Poteryaev és mtsai, 2010). Ezen felül sörélesztő sejtekben a Mon1-Ccz1 komplex aktiválja is a Rab7 homológját, az Ypt7 fehérjét, és segít átalakítani a CORVET komplexet a Rab7 legfontosabb effektorává, a HOPS komplexszé (Nordmann és mtsai, 2010). A CORVET és a HOPS fehérjekomplexek ugyanis négy közös alegységet tartalmaznak, a Vps11, Vps16, Vps18 és Vps33 fehérjéket, amelyek az úgynevezett C-típusú Vps komplexszet alkotják (Bröcker és mtsai, 2010; Nickerson és mtsai, 2009; Solinger és Spang, 2013; Balderhaar és Ungermann, 2013). Ezekhez kapcsolódhat két CORVET-specifikus alegység, a Vps3 és a Vps8. Ez utóbbiakat cseréli le a Mon1-Ccz1 dimer két HOPS-specifikus alegységre, a Vps39-re és Vps41-re (Nordmann és mtsai, 2010). Emlőssejtekben – és egyes adatok szerint sörélesztőben is – a HOPS Vps39 alegysége tölti be a SAND1-Ccz1 komplex helyett a Rab7 aktivátor szerepét (Wurmser és mtsai, 2000; Poteryaev és mtsai, 2010; Peralta és mtsai, 2010).
22
8. ábra. A Rab-csere molekuláris mechanizmusa élesztőben. A Mon1-Ccz1 komplex eltávolítja az endoszóma membránjáról a Rab5 (élesztőben Vps21) fehérjét, majd toborozza és aktiválja a Rab7 élesztőbeli homológját, az Ypt7-et. Ezt követően a CORVET komplex két specifikus alegységét, a Vps3at (piros) és Vps8-at (narancssárga) lecseréli a HOPS-specifikus Vps39 (zöld) és Vps41 (kék) alegységekre. Az ábrát Nordmann és munkatársai (Nordmann és mtsai, 2010) munkája nyomán a Szerző módosította.
A Rab-cserét követően - a Rab5-höz hasonlóan - a Rab7 is kialakít egy pozitív visszacsatolási kört. Ebben részt vesz a Vps34-Atg6/Beclin1 endoszóma-specifikus komplexe, mely Atg14L helyett (amely csak az autofagoszóma-specifikus Vps34-komplex tagja) az UVRAG fehérjét tartalmazza (Itakura és mtsai, 2008; Shravage és mtsai, 2013). Alapesetben a Vps34-komplex működését gátolja a Rubicon/PLEKHM1 fehérje, azáltal, hogy az UVRAG-ot magához köti (Matsunaga és mtsai, 2009; Zhong és mtsai, 2009; Sun és mtsai, 2011). Az aktív Rab7 azonban eltávolítja a Rubicont, felszabadítva az UVRAG-tartalmú Atg6/Beclin1 komplexet a gátlás alól (Sun és mtsai, 2010; Lin és Zhong, 2011; Tabata és mtsai, 2010). Az így működőképessé váló komplex pedig aktiválja a már összeszerelődött HOPS komplexet, a Rab7 aktivátorát (Liang és mtsai, 2008). A fehérjemarkerek lecserélődésével párhuzamosan - a Fab1/PIKfyve lipid kináz működésének következtében - a korai endoszómákra jellemző PI3P is átalakul foszfatidilinozitol-3,5-biszfoszfáttá (PI(3,5)P2) (Gary és mtsai, 1998; Odorizzi és mtsai, 1998). Az endoszóma-érés folyamatának szembetűnő morfológiai jele az endoszóma membránjából az üreg felé lefűződő kisméretű intraluminális vezikulumok (ILV-k) megjelenése. Ezen jellegzetes, mikroszkóposan jól azonosítható képletek miatt a késői endoszómákat gyakran multivezikuláris testnek (MVB) is nevezik. Az ILV-k kialakításának célja a lebontásra szánt transzmembrán fehérjék bejuttatása az endoszóma belsejébe, az emésztőenzimek számára hozzáférhető térrészbe. Ezt az igen fontos, de topológiailag bonyolult feladatot megvalósító eseménysorozatot négy, egymással kooperáló komplex, az 23
ESCRT-ok végzik (Raiborg és Stenmark, 2009) (9. ábra). A citoplazma felé néző részükön monoubiquitin jellel ellátott, ezzel lebontásra kijelölt receptorokat az ESCRT-0 komplex Hrs alegysége ismeri föl és gyűjti össze a membrán egy klatrinnal burkolt mikrodoménjébe (Raiborg és mtsai, 2002; Lloyd és mtsai, 2002; Bache és mtsai, 2003). Az ESCRT-0 ezt követően az endoszóma-membránhoz toborozza a szintén több alegységből álló ESCRT-I és -II komplexeket, amelyek a kargó szelektív gyűjtését, illetve az ubiquitin-jel levágását irányítják (Henne és mtsai, 2011). Az ESCRT-II részt vesz az ESCRT-III komplex összeszerelésében is (Teis és mtsai, 2010). Végül az ESCRT-III komplex Snf7/Vps32 alegységei spirálszerűen körbeveszik a leendő ILV „nyakát”, és a polimer szétszerelése közben a vezikulum lefűződik (Wollert és mtsai, 2009). Az ESCRT-III komplex szétszerelését a Vps4 ATPáz végzi (Lata és mtsai, 2008). Az érési folyamat során lizoszomális membrán glikoproteinek (Lamp) halmozódnak föl a késői endoszómák membránjában. Ezek elsődleges feladata, hogy nagy kiterjedésű, rigid cukor-oldalláncaik segítségével távol tartsák a hidrolázokat a membrántól, és így megvédjék azt a lebontástól (Schwake és mtsai, 2013). Ezzel párhuzamosan vakuoláris típusú protonpumpák jelennek meg a membránban, és hatásukra fokozatosan elsavasodik az endoszóma lumene: a pH 6,8-ról kb. 4,8-ra csökken (Maxfield és Yamashiro, 1987; Lafourcade és mtsai, 2008). A Rab-cserének köszönhetően megváltozik az endoszómák citoplazmán belüli mozgásának iránya is. Míg a korai endoszómákat elsősorban kinezin motorfehérjék mozgatták a sejt perifériája felé, addig a LE-k dominánsan dinein motorok segítségével szállítódnak beljebb, a sejtközpont felé. A Rab7 két olyan fehérjét is toboroz a LE membránjához, amelyek elengedhetetlenek ehhez a folyamathoz: a RILP-et és az ORP1L-t (Johansson és mtsai, 2005, 2007; Jordens és mtsai, 2001). Ezek egyszerre kötnek az aktív Rab7-hez, és lépnek interakcióba a βIII spektrinnel, valamint a dinein-dinaktin komplexszel. Ez utóbbi a membránhoz kapcsolódva a mikrotubulusok mínusz-vége, azaz a sejt belseje felé mozgatja az endoszómát.
24
9. ábra. Az ESCRT-komplexek működése. (A) A kargó válogatása az endoszóma-membrán klatrinburkos mikrodoménjeibe. Az ubiquitinált kargót az ESCRT-0 imseri fel, majd toborozza a membránhoz az ESCRT-I komplexet, amely az ESCRT-II megkötését segíti. (B) A membrán deformálása. Az ESCRT-II komplex a membránhoz toborozza az ESCRT-III-t, amelynek Snf7/Vps32 alegységei spirálalakú filamentumokat alkotnak a leendő vezikulum „nyakán”. Ezzel párhuzamosan megtörténik a kargó deubiquitinálása is. (C) A vezikulum lefűződése. A Vps4 belép a membrán-invaginációba, és szétszereli az ESCRT-III filamentumokat. Ezzel megtörténik az intraluminális vezikulumok (ILV-k) lefűződése. Az ábrát Raiborg és Stenmark munkája (Raiborg és Stenmark, 2009) nyomán a Szerző módosította.
25
Mindezekkel összefüggésben változások állnak be a endoszómák fúzió-specificitásában is. Míg a SE-k egymással és primer endocitotikus vezikulumokkal voltak képesek egyesülni, addig a késői endoszómák homotipikus és lizoszómákkal (valamint autofagoszómákkal) történő heterotipikus fúziós kapacitással rendelkeznek. A lizoszómákkal történő fúziót megelőzően a LE-kból is zajlik reciklizáció a TGN felé: elsősorban a lizoszomális hidrolázok endoszómákba szállításáért felelős, már felszabadult mannóz-6-foszfát receptorok kerülnek vissza Rab9függő mechanizmussal (Lombardi és mtsai, 1993; Barbero és mtsai, 2002; Carroll és mtsai, 2001). A késői endoszómák fúziós folyamatainak specificitásáért a HOPS komplex által toborzott SNARE fehérjék felelősek. A SNARE-k α-helikális szerkezetű fehérjék, melyek közös sajátossága, hogy 60-70 aminosavból álló, rendezett heptádokban ismétlődő hidrofób motívumaik segítségével alakítanak ki stabil kölcsönhatást más SNARE fehérjékkel. A kötés specificitását a meghatározott pozícióban található konzervált arginin (R), illetve glutamin (Q) aminosavak biztosítják, a fehérjecsalád csoportosítása is ezek alapján történik. Az akceptor membránon általában Q-SNARE-k találhatók, míg a donor membránban R-SNARE-k; a megfelelő
R-
és
Q-SNARE-k
összekapcsolódása
olyan
közelségbe
hozza
a
két
membránfelszínt, hogy közöttük megtörténhet az összeolvadás (Jahn és Scheller, 2006). A késői endoszómák membránjához jellemzően három Q-SNARE – a Syntaxin7, a Vti1b és a Syntaxin8 – kapcsolódik (Kim és mtsai, 2001). A specificitást a másik membránban található R-SNARE biztosítja: homotipikus fúzió esetén ez a VAMP-8, lizoszómákkal történő, heterotipikus fúzió esetén pedig a VAMP-7 (Pryor és mtsai, 2004). A késői endoszómák és lizoszómák összeolvadásával hibrid organellumok, úgynevezett endolizoszómák keletkeznek, amelyekben a már aktiválódott lizoszomális hidrolázok elkezdik a lumenbe került anyagok bontását.
26
2.3. Az autofágia és az endo-lizoszomális rendszer kapcsolatai 2.3.1. Az autofág és endocitotikus útvonalak konvergenciája
Az 1980-as évek végére nyilvánvalóvá vált, hogy a izoláló membrán záródása után létrejött autofagoszómák érési folyamatuk során nemcsak lizoszómákkal képesek fuzionálni, hanem az endoszomális rendszer tagjainak különböző populációival is. Az autofagoszómák endoszómákkal történő fúziójának eredményeként hibrid organellumok, úgynevezett amfiszómák jönnek létre (Gordon és Seglen, 1988; Gordon és mtsai, 1992). Ezek a struktúrák később maguk is fuzionálhatnak lizoszómákkal, így kettős eredetű tartalmuk lebomlik. Ez tehát azt jelenti, hogy az autofagoszóma-érés két úton is végbemehet: a lizoszómákkal történő közvetlen fúzió során degradáló autolizoszómák jöhetnek létre, vagy beiktatódhat egy köztes lépés, az amfiszóma-képződés (10. ábra). Mai ismereteink alapján úgy tűnik, hogy sejt- és szövettípustól függ, hogy melyik érési útvonal játszódik le. Az autofagoszómák az endoszomális rendszer különböző tagjaival olvadhatnak össze. A legtöbb ismeret eddig a késői endoszómákkal történő fúzióról gyűlt össze (Lucocq és Walker, 1997; Köchl és mtsai, 2006; Filimonenko és mtsai, 2007), de vannak arra vonatkozó eredmények is, hogy a két útvonal már a korai endoszómák szintjén is konvergálhat (Tooze és mtsai, 1990; Razi és mtsai, 2009). Egyre több tanulmány utal arra, hogy az amfiszómaképződés számos sejttípusban megkerülhetetlen lépés az autofagoszómák érése során (Punnonen és mtsai, 1993; Liou és mtsai, 1997; Berg és mtsai, 1998; Strømhaug és mtsai, 1998; Fengsrud és mtsai, 2000; Oeste és mtsai, 2012). Ezt támasztják alá azok a megfigyelések is, melyek szerint az endoszóma-érés gátlása az autofág útvonalban is hibákat okoz.
Közismert
például,
hogy
különböző
ESCRT-komponensek
hiánya
éretlen
autofagoszómák felhalmozódásához, illetve neurodegenerációhoz vezet több emlős sejttípusban és ecetmuslicában is (Lee és mtsai, 2007a; Rusten és mtsai, 2007; Filimonenko és mtsai, 2007). Az endoszóma-érésben fontos szerepet játszó Fab1 lipid-kináz jelenléte hasonlóképpen szükséges az autofágia zavartalan működéséhez (Rusten és mtsai, 2007; de Lartigue és mtsai, 2009).
27
10. ábra. Az autofagoszóma-érés folyamata. A kettős membránnal határolt autofagoszómák fuzionálhatnak közvetlenül lizoszómákkal, vagy megtörténhet az érés közvetetten, az endoszómákkal való összeolvadás, azaz az amfiszóma-képződés lépésén keresztül is. Az ábrát Klionsky munkája (Klionsky, 2007) nyomán a Szerző módosította.
2.3.2. Az autofág és az endocitotikus útvonal molekuláris mechanizmusának közös résztvevői
Az autofág és az endocitotikus útvonal szoros kapcsolatát az is jelzi, hogy számos fehérje mindkét folyamat működését segíti, hasonló funkciót betöltve. Nemrégiben fedezték föl, hogy a primer endocitotikus vezikulumok kialakulásában nélkülözhetetlen klatrin nehéz lánca és az AP-2 komplex fizikai kölcsönhatást létesít az autofágia korai lépéseiben szerepet játszó Atg16L fehérjével (Ravikumar és mtsai, 2010). Ez vezetett el ahhoz a felismeréshez, hogy az endocitózis során kialakuló vezikulumok nemcsak a korai endoszómákkal képesek összeolvadni, hanem a formálódó autofagoszómák számára is szolgáltathatnak membránalapanyagot. Ezt tovább erősítette egy tanulmány, amely kimutatta, hogy az ilyen vezikulumok homotipikus fúziója az autofagoszómák kialakulásához is szükséges. Ezt a folyamatot az endocitotikus SNARE fehérjék, a már említett VAMP7, Syntaxin7 és Syntaxin8 mediálják (Moreau és mtsai, 2011).
28
A plazmamembrán és a korai endoszómák közötti szállító folyamatokban részt vevő Arf6 kis G-fehérje aktivitását szintén igényli az autofágia folyamata is (Moreau és mtsai, 2012), bár elképzelhető, hogy ebben az esetben az Arf6 hatását csak effektorán, a foszfatidilinozitol-4foszfát-5-kinázon (PI(4)P5K) keresztül fejti ki. Ez a fehérje foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfátot (PI(4,5)P2) generál, ami segíti az endocitózishoz szükséges AP2 és dinamin toborzását a plazmamembránhoz (Jost és mtsai, 1998). Az autofágia korai lépéseinek szabályozásában szerepet játszanak a korai endoszómák működését kivitelező fehérjék is. Az endoszóma-éréshez szükséges Atg6/Beclin1-Vps34Vps15 fehérjeegyüttes egyúttal az autofagoszóma nukleációját végző komplex „magja” is (Itakura és mtsai, 2008). Érdekes módon egyes kísérletekből az derült ki, hogy a komplex endocitózis-specifikus tagja, az UVRAG is érintett az autofágia szabályozásában (Takahashi és mtsai, 2007; Liang és mtsai, 2008), de elképzelhető, hogy ez a fehérje csak közvetve, az endoszomális útvonalban betöltött szerepe révén, a két útvonal konvergenciája miatt befolyásolja az autofágiát. Egy, a Huntington-kór Drosophila modelljén végzett tanulmány szerint a SE-k legfontosabb fehérjemarkere, a Rab5 képes az autofágia-specifikus Atg6/Beclin1-Vps34-Vps15 komplexhez is kötni, és ez az interakció szükséges a betegségre jellemző poliglutamin fehérje-aggregátumok autofágiával történő eltávolításához (Ravikumar és mtsai, 2008). Egy friss tanulmány szerint a gyors reciklizáló útvonal központi tagjának, a Rab4-nek is fontos szerepe van az autofagoszómák kialakulásában (Talaber és mtsai, 2014). Ez a munka azt is bizonyítja, hogy emellett a Rab4 egyúttal elősegíti a mitokondriumok fúzióját, az úgynevezett mitokondriális hálózat kialakulását is – védve ezáltal a mitokondriumokat az autofágia indukcióját követő lebontástól. A késői endoszómák életében igen fontos Rab7-nek is tulajdonítottak már autofág szerepet. Több tanulmány is azt mutatta, hogy a Rab7 aktivitása elengedhetetlen az autofagoszómák érésének zavartalan lezajlásához (Gutierrez és mtsai, 2004; Jäger és mtsai, 2004). Ráadásul - az általa aktivált FYCO1 fehérjén keresztül - a Rab7 szerepet játszik az autofagoszómák mikrotubulusok mentén történő mozgatásában is (Pankiv és mtsai, 2010). Idegsejtekben végzett vizsgálatok pedig kimutatták, hogy a Rab7 nemcsak a mikrotubulusok plusz-vége felé képes autofagoszómákat irányítani, hanem ellentétes transzportjukat is biztosítja (Maday és mtsai, 2012). Ezeken felül a Rab7-et Phafin1 nevű effektora révén kapcsolatba hozták az autofágia korai lépéseivel is (Lin és mtsai, 2012). A korai és késői endoszómák mellett a reciklizáló endoszómák jellemző fehérjéi, sőt maguk a reciklizáló endoszómák is fontosak az autofágia folyamatában. A Rab11-gyel kapcsolatban korábban két tanulmány is úgy találta, hogy szükséges az autofágia érési 29
szakaszához (Fader és mtsai, 2008; Richards és mtsai, 2011). Nemrégiben pedig kimutatták, hogy a reciklizáló endoszómák fontos membránforrást jelentenek a képződő autofagoszómák számára, és ezzel összefüggésben a Rab11 szerepet játszik az autofagoszóma formálódása során is (Longatti és mtsai, 2012). A Rab11 hasonló funkciója ecetmuslica-modellen végzett kísérletek alapján is felmerült: kimutatták, hogy az SNX18 fehérje Drosophila homológja a Rab11-gyel együtt vesz részt a RE-kból a PAS-hoz történő membrán-szállításban (Knævelsrud és mtsai, 2013). Érdekes adalék, hogy Puri és munkatársai szerint a RE-k területén konvergálnak az autofágia számára membránforrásként szolgáló, különböző eredetű vezikulumok; eszerint a RE-k és a plazmamembrán-eredetű endocitotikus vezikulák fúziója éppen emiatt nélkülözhetetlen az autofagoszómák kialakulásához (Puri és mtsai, 2013). Mindezek alapján egyértelmű, hogy az autofág és endoszomális útvonalak szoros kapcsolatban állnak egymással, és ez a kapcsolat kölcsönösen fontos mindkét folyamat zavartalan működéséhez. Fölmerült egy, a két útvonal szabályozását összehangoló „molekuláris átszólás” elméleti lehetősége is (Lamb és mtsai, 2013). Ez idáig azonban nem sikerült kimutatni ilyen molekuláris mechanizmusokat. Az autofágia és az endocitózis fontossága azonban szükségessé teszi kapcsolatrendszerük és közös szabályozási pontjaik behatóbb vizsgálatát.
30
2.4. A Rab fehérjék
A már eddig is sokat hivatkozott Rab fehérjék a Ras kis G-fehérjék családjába tartozó GTPázok. Mindannyian fontos résztvevői a különböző sejten belüli membrán-szállítási és fúziós eseményeknek (Stenmark, 2009). A Rabok működését többféle regulátor gondosan összehangolt munkája szabályozza (11. ábra). A Rab fehérjék közös szerkezeti jellemzője egy evolúciósan konzervált nukleotidkötő zseb, amely egyaránt képes GDP és GTP megkötésére. Ezek a fehérjék működésük során GTPkötött, aktív és GDP-kötött inaktív állapotban lehetnek. Az aktív Rabok sokféle effektor fehérjét toboroznak arra a membránfelszínre, amelyhez maguk is kapcsolódnak. Bár a Rabok is rendelkeznek a GTP-hidrolízis képességével, de ezt csak igen alacsony aktivitással végzik. Ezért GTP-hidrolízisük rátája erősen függ a GTPáz aktiváló fehérjék (GAP-ok) működésétől. A GAP-ok kiegészítik a Rabok katalitikus helyét, és ezzel nagymértékben elősegítik a GTP GDPvé és szervetlen foszfáttá történő hidrolízisét (Bos és mtsai, 2007; Barr és Lambright, 2010). A GAP-ok jellegzetes szerkezeti eleme a TBC domén, mely nevét a szintén ilyen motívumot tartalmazó TRE2, Bub2 és CDC16 fehérjékről kapta (Pan és mtsai, 2006). A hidrolízis után immár GDP-t kötő Rab konformációja megváltozik, ezzel a fehérje működésképtelenné válik. Az inaktív Rabokat a GDP disszociációját gátló GDI fehérjék tartják szolubilis állapotban a citoplazmában. A GDI-k lefedik a Rabok nukleotidkötő zsebét, ezzel lehetetlenné teszik a GDP leválását a fehérjéről. Ezzel egy időben a Rabok membránba való integrálódásáért felelős geranil-horgonyával
is
interakcióba
lépnek,
így
biztosítják
diffúz
citoplazmatikus
lokalizációját. Az aktivációs folyamat során a GDI-ket eltávolító faktorok, úgynevezett GDF-ek (GDI displacement factor) mozdítják el a Rabokról. Az még nem tisztázott, hogy a GDF-ek valóban szükségesek-e minden Rab fehérje aktivációjához (Numrich és Ungermann, 2013). A GDI-k eltávolítása után a guanin nukleotid cserélő faktorok, azaz GEF-ek léphetnek működésbe, amelyek a GDP távozását teszik lehetővé a Rab nukleotidkötő zsebéből (Itzen és Goody, 2011). Mivel a sejtekben a GDP-hez viszonyítva jóval nagyobb a GTP koncentrációja, a megüresedett zsebbe rövid időn belül GTP kötődik be. A GTP-kötés hatására bekövetkező konformációs változások a Rab fehérje újbóli aktiválódásához vezetnek. Az aktív Rab geranilhorgonya segítségével ahhoz a membránhoz kapcsolódik, amelynek felszínén aktiválódott, majd oda toborozza változatos funkciókkal rendelkező effektor fehérjéit is. A Rabokra a 31
membrán-lokalizációt biztosító lipidhorgonyt a Rab eszkort fehérjék (REP) kapcsolják rá (Alexandrov és mtsai, 1994). Az eddig bemutatott Rab4, Rab5, Rab7, Rab11 fehérjéken kívül más Raboknak is tulajdonítottak már szerepet az autofágia különböző lépéseiben (Chua és mtsai, 2011; Bento és mtsai, 2013). Az endoplazmás retikulum (ER) és a Golgi-készülék közötti vezikuláris transzportban működő Rab1 (Moyer és mtsai, 2001) például fontos résztvevője az autofagoszóma formálódásának is (Zoppino és mtsai, 2010). Több tanulmányban is leírták, hogy a Rab1 és egyik GEF-je, a TRAPPIII komplex részt vesz az Atg1 (ULK1/2) kináz komplex PAS-ra való toborzásában és aktiválásában, valamint effektorán, a COG komplexen keresztül az Atg9-tartalmú vezikulumok szállításában is (Wang és mtsai, 2013; Nazarko és mtsai, 2005; Meiling-Wesse és mtsai, 2005; Lynch-Day és mtsai, 2010; Lipatova és mtsai, 2012; Yorimitsu és Klionsky, 2005; He és mtsai, 2006; Yen és mtsai, 2010). A Golgi és az ER közötti retrográd transzportban szereplő Golgi-rezidens Rab33 fehérje is rendelkezik autofág funkciókkal (Valsdottir és mtsai, 2001). Leírták, hogy az egyik emlős homológ, a Rab33B képes fizikai kölcsönhatásba lépni az Atg16L fehérjével, ráadásul konstitutívan aktív (állandóan GTP-t kötő) formája gátolja az autofágiát (Itoh és mtsai, 2008). Ezzel összhangban egyik ismert GAP-járól, az OATL1/TBC1D25 fehérjéről kimutatták, hogy az Atg8/LC3-hoz kapcsolódik, és részt vesz az autofagoszómák érésének szabályozásában (Itoh és mtsai, 2011). Más tanulmányok pedig bizonyították a Rab24 (Olkkonen és mtsai, 1993; Munafó és Colombo, 2002) és a Rab32 (Hirota és Tanaka, 2009; Wang és mtsai, 2012) fehérjék autofágiában betöltött szerepét, bár a pontos molekuláris mechanizmus még további vizsgálatokat igényel.
32
11. ábra. A Rab fehérjék GDP-GTP kicserélődési ciklusa. A Rabok konformációja GTP-kötött aktív és GDP-kötött inaktív forma között váltakozik. Aktív állapotban membránhoz kapcsolódnak, és oda toborozzák effektor fehérjéiket is. GTPáz aktiváló fehérjéik (GAP-jaik) segítik a GTP GDP-vé és szervetlen foszfáttá történő hidrolízisét, ezzel inaktiválják a Rabokat. Az inaktív Rab fehérjéket a GDPdisszociációt gátló GDI-k tartják a megkötve a citoplazmában. Az aktiválódás során GDI eltávolító faktorok (GDF-ek) segítik a GDI disszociációját a Rabról. Ezt követően guanin nukleotid cserélő faktorok (GEF-ek) segítségével megtörténik a GDP GTP-re cserélése, és így újra aktiválódik a Rab. A Szerző ábrája.
33
2.5. Az ubiquitin-proteaszóma rendszer
A proteaszóma egy több alegységből álló, proteáz aktivitással rendelkező hatalmas fehérjekomplex, amely egyes baktériumokban, valamint az eukarióták citoplazmájában és sejtmagjában egyaránt megtalálható (Tanaka, 2009). A 26S proteaszómát egy 20S katalitikus alegység és két 19S szabályozó alegység építi föl (Peters és mtsai, 1994). A 20S alegységet négy, egyenként hét tagból álló fehérjegyűrű alkotja, amelyek a szerkezeti jellegű α- és a katalitikus aktivitású β-alegységekből állnak. Az α- és β-gyűrűk egy üreget zárnak közre, melynek be- és kijáratait az α-alegységek N-terminális régiói zárják le. A β-alegységek rendelkeznek tripszin-, kimotripszin- és kaszpáz-szerű aktivitással is. Ennek köszönhetően a proteaszóma a kitekert állapotban belejutó fehérjéket rövid peptidekre, aminosavakra képes lebontani (Tomko és Hochstrasser, 2013).
12. ábra. Az ubiquitin-proteaszóma rendszer működése. Az E1, E2 és E3 enzimek a szubsztrát fehérjére kovalensen kapcsolják az ubiquitin (Ub) módosító molekulát. A poliubiquitin jellel ellátott fehérjéket a citoplazmában ubiquitin receptorok ismerik fel és szállítják a proteaszómához. Ott a 19S alegység megköti, deubiquitinálja, letekeri és a 20S alegységbe juttatja a szubsztrátot. A 20S alegységben megtörténik az enzimatikus hasítás, majd az aminosavak, peptidek a citoplazmába távoznak. Az ábrát Kaiser és Huang munkája (Kaiser és Huang, 2005) nyomán a Szerző módosította.
34
A fehérjék bejutását a 20S alegységbe a hozzá kapcsolódó 19S „sapkák” szabályozzák. Ezeket is kétféle fehérje építi fel: a nem-ATPáz egységek a lebontásra szánt kargó felismerésében és megkötésében játszanak szerepet, az ATPáz aktivitású alegységek pedig a szubsztrát letekerését végzik. Ugyanezen fehérjék hatására mozdulnak el a 20S alegységet lezáró fehérjeszakaszok is, ami lehetővé teszi a lebontandó fehérje bejutását az enzimaktivitással rendelkező üregbe (Smith és mtsai, 2007; Finley, 2009). Az ubiquitin (Ub) egy kisméretű – 76 aminosavból álló, nagyjából 8,5kDa molekulatömegű – fehérje, amely, ahogy a neve is mutatja, az eukarióta szervezet minden sejtjében megtalálható. Ez a fehérje képes kovalensen más fehérjékhez kapcsolódni. A fehérjék ilyen módon történő poszttranszlációs módosításához három fehérje egymást követő aktivitása szükséges. Az első az ubiquitin-aktiváló, úgynevezett E1 típusú enzim, amely ATP-felhasználás mellett kovalensen köti az ubiquitin molekulát, és továbbadja azt a szállító vagy konjugáló fehérjének, az E2 enzimnek. Az E2 komplexet képez az E3 ubiquitin-ligázzal, amely szubsztrátsepcifikus módon rákapcsolja az Ub-jelet a módosítandó fehérje egy lizin csoportjára (Pickart és Eddins, 2004). Az ubiquitinnel történő poszttranszlációs módosítás lehet mono-ubiquitiniláció, ekkor a célfehérje egyetlen Ub-jelet kap. A multi-ubiquitiniláció során egy adott fehérje több lizinjére is kapcsolnak egy-egy ubiquitint az E3 enzimek. A poli-ubiquitiniláció pedig azt jelenti, hogy a ligáz több Ub molekulát kapcsol egymáshoz láncszerűen, majd ezt az ubiquitin láncot rögzíti kovalensen a célfehérjéhez. Míg az első két folyamatnak általában az ubiquitinált fehérje működésének vagy lokalizációjának módosításában van szerepe, addig a fehérjére kerülő poliubiquitin jel a proteaszóma általi lebontásra irányítja az adott fehérjét. Az ubiquitinált fehérje a proteaszómához szállítódik, majd a 19S alegység felismeri, kitekeri és a 20S alegység belsejébe juttatja. A lebontást megelőzően a poli-ubiquitin jelet deubiquitináló enzimek vágják le a szubsztrátról, ezután az ubuquitint újra fel lehet használni. Az ubiqiutin-proteaszóma rendszer (UPS) a sejtek rövid féléletidejű, illetve hibás konformációjú fehérjéinek lebontására szolgáló szelektív degradációs útvonal (12. ábra). A folyamatnak fontos szerepe van különböző sejtélettani folyamatok, például a sejtciklus, a transzkripció, egyes anyagcsere-folyamatok és a sejtek differenciálódásának szabályozásában (Ciechanover, 2005). Míg korábban az UPS-t az autofágiától teljesen függetlenül működő lebontó mechanizmusnak tekintették, mára nyilvánvalóvá vált, hogy a két útvonal kapcsolatban áll egymással (Lamark és Johansen, 2010; Korolchuk és mtsai, 2010). A fehérjéken található ubiquitin jel nemcsak proteaszomális lebontásra irányító szignálként szolgálhat, hanem több 35
szelektív autofágia receptor – például a P62 – is képes felismerni és megkötni (Kirkin és mtsai, 2009b). Ezzel összhangban több független tanulmány szerint (különböző Drosophila és emlős modellekben) az autofágia alulműködése ubiquitinált fehérjéket is tartalmazó aggregátumok felhalmozódásához, majd neurodegenerációhoz vezet (Juhász és mtsai, 2007; Simonsen és mtsai, 2008; Hara és mtsai, 2006; Komatsu és mtsai, 2006, 2007). A két folyamat összehangolt szabályozási mechanizmusára utal az a tanulmány, amely kimutatta, hogy az UPS működési zavarai az autofág aktivitás növekedését okozzák (Pandey és mtsai, 2007).
36
2.6. Az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) mint modellrendszer
Az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) a sejtbiológiai és genetikai kutatások kedvelt és elterjedt modellállata. Ennek köszönhetően teljes genomjának nukleotid-szekvenciája ismert. Ezen felül nagy mennyiségű ismeretanyag van birtokunkban az ecetmuslicában kifejeződő fehérjék és RNS-ek szerkezetéről és működéséről, illetve a már leírt és a valószínűsíthető fehérje-fehérje interakciókról. Ez az adathalmaz bárki számára szabadon hozzáférhető online a http://flybase.org/ adatbázisban. A Drosophila nagy előnye, hogy könnyen és olcsón fenntartható és szaporítható, így egyszerűen és viszonylag gyorsan in vivo ismereteket szerezhetünk különböző élettani folyamatokról és az egyes kezelésekre, beavatkozásokra adott sejt- és szervezetszintű válaszról egyaránt. Az ecetmuslica bonyolult anatómiai felépítése lehetővé teszi, hogy ugyanazon
sejttani
jelenséget
eltérő
szervrendszerekben,
szövettípusokban
is
tanulmányozzuk. Ennek köszönhetően komplex folyamatok vizsgálatára is alkalmas: sokféle humán betegség modellezhető általa, illetve viselkedés-genetikai kutatásokra is alkalmas (Bilen és Bonini, 2005; Pandey és Nichols, 2011; Sokolowski, 2001). A Drosophila teljes átalakulással fejlődő rovar, életideje szobahőmérsékleten nagyjából 30 nap. Egyedfejlődése során három lárvastádium (L1-L3) különíthető el. Lárvális életük nagy részében az állatok táplálékot vesznek fel és különböző tápanyagokat raktároznak, elsősorban poliploid lárvális zsírtestjük sejtjeiben. A harmadik lárvastádium végén az állatok táplálkozó életszakasza véget ér, elhagyják a táptalajt, és bábozódásra alkalmas helyre vándorolnak (ezért ezt vándorló stádiumnak nevezik). A peterakást követő (after egg laying, AEL) 120. óra környékén (25⁰C-on) a lárvák bebábozódnak, és a következő négy-öt napban végbemegy a metamorfózis, majd kikelnek a kifejlett állatok (13. ábra).
37
13. ábra. A Drosophila melanogaster életciklusa. Az ábra bemutatja az ecetmuslica egyedfejlődésének legfontosabb stádiumait, az adott életszakaszban eltöltött idővel együtt. Az ábra forrása: http://www.easternct.edu/~adams/Drosophilalifecycle.html
A Drosophilát az autofágia folyamatának vizsgálatára különösen alkalmassá teszi az a sajátsága, hogy a harmadik lárvastádium elején – 25 ⁰C-on tartott 72-86 órás AEL lárvákban – az állatot érő különböző stresszhatásokra, például az aminosavak megvonására zsírtestsejtjeik heves autofág reakciót mutatnak. Ez a könnyen kiváltható stressz-indukált autofág válasz egyszerűen detektálható más modellrendszerekben is alkalmazott módszerekkel (Juhasz és Neufeld, 2008; Neufeld, 2008). Ezen felül a harmadik lárvastádium végén (kb. 108. óra AEL) a vándorló lárvák zsírtestjében intenzív, ún. fejlődési autofágia aktiválódik, amelynek hatására végül a teljes lárvális zsírtest lebomlik. Az így felszabaduló aminosavak, cukrok és zsírsavak szolgáltatnak alapanyagot a kifejlett állatra jellemző (imaginális) szervek kialakulását kísérő energiatermelő és szintetikus folyamatok számára. Ez
38
a külső beavatkozás nélkül, fiziológiás körülmények között is indukálódó autofágia szintén könnyen detektálható (14. ábra).
14. ábra. Stressz-indukált és fejlődési autofágia a Drosophila lárvális zsírtestjében. A fénymikroszkópos felvételeken L3 stádiumú ecetmuslica lárvák zsírtestsejtjei láthatóak, melyekben mCherry-Atg8a fúziós fehérje (piros) jelzi az Atg8 autofágia-marker jelenlétét (az Atg8 fehérje, mint korábban már bemutattam, autofág struktúrákra lokalizál). A jól táplált lárvák zsírtestsejtjeiben a marker diffúz, citoplazmatikus eloszlást mutat. Az aminosav-megvonás (éheztetés) hatására bekövetkező stressz-indukált autofágiát az mCherry-Atg8a granuláris mintázata jelzi. A vándorló állat zsírtestsejtjeiben a fejlődési autofágia során nagyméretű mCherry-Atg8a-pozitív autofág struktúrák alakulnak ki. Skála: 10µm. (A Szerző készítményei és felvételei)
A genetikai módszerek hatékony alkalmazását segíti a fajnál tapasztalható szembetűnő ivari dimorfizmus. A hím állatokat könnyen meg lehet különböztetni a nőstényektől a potrohvég és az első pár láb kutikula-képletei és pigmentáltsága alapján. Ez lehetővé teszi, hogy egyszerűen, két eltérő genotípusú egyed keresztezését követően különböző transzgének és/vagy mutációk együttes hatását tanulmányozzuk egyetlen állatban. A különböző sejtélettani folyamatok genetikai hátterének felderítését nagyban megkönnyíti, hogy az ecetmuslica könnyen mutagenizálható, kevés számú – 4 pár – kromoszómával rendelkezik, és a mutánsok szűrése is egyszerűen kivitelezhető. A különböző transzgénikus állatok létrehozása és törzsbe állítása is rutinszerű folyamat, így a genomjukba épült transzgéneket hordozó populációk hosszútávon is fenntarthatók. Az élesztő-eredetű, de a muslicában is működő UAS-Gal4 kételemű genetikai rendszer alkalmazása lehetővé teszi a térben és/vagy időben szabályozott génexpressziót (Duffy, 2002). A Gal4 transzkripciós faktor kifejeződését tetszőleges, általunk választott promóter szabályozza, az ily módon irányítottan átíródó Gal4 pedig az UAS (upstream activating sequence) régióhoz kötődve az utóbbi által kontrollált gének expresszióját indítja be. A Gal4 39
promótere határozza meg tehát azt, hogy az UAS által szabályozott konstrukció (például teljes vagy részleges, vad vagy mutáns allélt kódoló cDNS, RNS-interferenciát kiváltó szekvencia) milyen szövetben és mikor fejeződjön ki. Az UAS-Gal4 rendszer segítségével genetikai mozaik állatokat is létrehozhatunk, amelyekben normális (kontroll) szöveti háttéren csak kis számú, könnyen azonosítható sejtcsoportokban fejeződik ki a vizsgálni kívánt transzgén. Az általunk használt klonális expressziós rendszerben a Gal4 átírását a szintén élesztő eredetű Flp-FRT helyspecifikus rekombinációra alkalmas genetikai rendszer szabályozza. A flippáz rekombináz enzim (Flp) hősokk promóter szabályozása alatt áll, amely véletlenszerűen, nem túl nagy eséllyel szobahőn is aktiválódhat. Ez lehetővé teszi, hogy szobahőn tartott állatokban a Flp egyes sejtekben átíródjon, másokban viszont ne. Ha képződött Flp, akkor eltávolítja az általa specifikusan felismert FRT szekvenciák között található (a mi esetünkben a CD2 nevű) „távtartó” régiót. A CD2 szakasz a konstitutívan működő – általában aktin – promóter és az általa szabályozott Gal4 kódoló szekvencia közé ékelődik, és megfelelő távolságban tartja őket ahhoz, hogy a Gal4 ne expresszálódhasson. Azokban a sejtekben tehát, amelyekben a hősokk promóter véletlenszerűen bekapcsolódott, és ennek következtében Flp enzim termelődött, a CD2 szakasz kirekombinálódik, és megindulhat a Gal4 transzkripciós faktor átírása. A Gal4 fehérje ezután az UAS szekvenciákhoz kapcsolódik, és aktiválja az általuk szabályozott konstrukció(k) átírását. A transzgént kifejező klónsejtek detektálását az teszi lehetővé, hogy bennük a Gal4 beindítja egy szintén UAS-szabályozott riporter expresszióját is (15. ábra). Az Flp által kivitelezett rekombinációs eseménynek köszönhetően tehát a transzgéneket kifejező klónsejteket az egyébként velük teljesen megegyező genotípusú kontroll sejtek között, azonos környezetben figyelhetjük meg (16. ábra). A rendszer alkalmazása ezért nagymértékben csökkenti az egyes egyedek közötti variabilitásból származó fenotípusos eltérések hatását a genetikai vizsgálatokra. Az egyes gének funkciójának megértéséhez nélkülözhetetlen az adott gén hiányában kialakuló fenotípus elemzése, amit a muslicamodell esetében leggyakrabban különböző Pelem inszerciós és pontmutációs, illetve nagyobb deléciókat tartalmazó allélok vizsgálatával teszünk. Ezt nehezítheti vagy akár meg is gátolhatja, ha az adott mutáció homozigóta formában az állat letalitását okozza a megfelelő fejlődési stádium elérése előtt. Az ilyen mutációk hatásának vizsgálatára nyújt lehetőséget a homozigóta mutáns klónsejtek és az őket körülvevő kontroll sejtek által alkotott genetikai mozaik állatok létrehozása (Theodosiou és Xu, 1998). A rendszer lelke ez esetben is a Flp rekombináz, azonban az általa felismert FRT helyek nem ugyanazon kromoszómán, hanem két homológ kromoszóma azonos pozíciójában vannak. Így ekkor nem egy DNS-szakasz vágódik ki, hanem homológ rekombinációs folyamat 40
eredményeként egy egyébként igen ritka esemény, mitotikus rekombináció következik be. A kísérleti rendszerben az egyik FRT-t tartalmazó kromoszóma a vizsgált mutáns allélt is hordozza, míg a másikon markergén (általában riportergén) található. A heterozigóta állatok tehát életképesek és sejtjeik egy kópiában expresszálják a markert is. A hősokkal indukált, véletlenszerűen bekövetkező mitotikus rekombinációs esemény után 50% a valószínűsége, hogy mitózis után az utódsejtek egyike csak a mutációt, másika csak a markergént hordozó homológ kromoszómákat örökölte. Ily módon néhány sejtből álló ikerfoltok képződhetnek, amelyek közül a markert egyáltalán nem expresszálókról tudhatjuk, hogy a mutációra homozigóták, míg másik részük két kópiában hordozza mind a vadtípusú allélt, mind a riportergént. A környező sejtek pedig a vad fenotípust mutató, kontrollként szolgáló heterozigóta sejtek (17. ábra).
15. ábra. Az UAS-Gal4 szabályozáson alapuló klonális expressziós rendszer működése. A bekapcsoló hősokk promóter (hs) hatása alatt álló Flp átíródik, és az FRT szekvenciák segítségével eltávolítja a CD2 „távtartó” szakaszt. Ennek következtében a konstitutívan aktív aktin promóter (act) szabályozta Gal4 kifejeződik, és az UAS szekvencia által kontrollált célgének, például a GFP riporter átíródását váltja ki. Az ábra forrása: http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/contrib/1997/itok1997a/fig2.html
41
16. ábra. A klonális expressziós rendszer a génműködés vizsgálatának szolgálatában. Az ábrán a GFPt expresszáló (zöld) zsírtestsejtekben RNS interferencia indukálásával csendesítettük a Rab11 fehérje génjét. Ennek hatására a szomszédos, kontroll sejtekhez képest jól láthatóan megváltozott az mCherryAtg8a (piros) autofágia marker mintázata (a második kép csak a piros csatorna képét, a harmadik pedig ennek a kinagyított részletét mutatja). A jelenség további részleteit, illetve magyarázatát az Eredmények fejezetben mutatjuk be. A sejtmagokat kék szín jelöli a képen. Skála: 10µm. (A Szerző készítménye és felvétele)
A modern genetika eszköztárának nélkülözhetetlen eleme az RNS interferenciával történő géncsendesítés. A folyamat a sejt saját szabályozó rendszerét használja ki, amely a már átíródott mRNS-ekről történő fehérjeszintézist gátolja az RNS molekula féléletidejének vagy hozzáférhetőségének módosításán keresztül. Természetes körülmények között a jelenség fontos szerepet játszik az idegen RNS-ekkel szembeni védekezésben, illetve az egyedfejlődés szabályozásában is (Cerutti és Casas-Mollano, 2006; Zhao és Srivastava, 2007). A folyamat során a Dicer fehérje a kettős szálú RNS-eket darabokra hasítva hoz létre rövid RNS szakaszokat, amelyek a RISC komplex részeként a velük komplementer részletet tartalmazó mRNS (target) szekvenciájához kötődnek. A komplex egyik tagja ezt követően hasítja a felismert mRNS-t, és ezzel előidézi degradálódását (Wilson és Doudna, 2013). Ezt a jelenséget használjuk ki, amikor az általunk kiválasztott génről átíródó mRNS-t megcélzó, mesterséges dupla szálú RNS-t kódoló transzgént juttatunk a sejtekbe, ami csökkenti az adott gén fehérjetermékeinek mennyiségét. A módszer széles körű használatának köszönhetően ma már több különböző Drosophila RNS interferencia könyvtárban, nagy választékban érhetők el géncsendesítő konstrukciókat tartalmazó törzsek. Ezek közé tartozik a Vienna Drosophila Research Center (VDRC, Ausztria), ahol egy P-elem inszerciós (GD) és egy phiC31 inszerciós (KK) könyvtár is rendelkezésre áll (Dietzl és mtsai, 2007); a Drosophila Genetic Resource Center (DGRC, Japán); valamint a Transgenic RNAi Project (TRiP) könyvtár (Bloomington, USA).
42
17. ábra. Az Flp-FRT rendszer felhasználása homozigóta mutáns klónsejtek generálására. A hősokk promóter-szabályozta Flp mitotikus rekombinációt indukál. Ennek eredményeként a GFP-t egy kópiában kifejező (zöld) kontrollsejtek között a mutáns allélt homozigóta formában tartalmazó, de GFP-mentes klónsejtek hozhatók létre (kíséretükben megtalálhatjuk a GFP-t erősebben, mert két kópiában kifejező iker-klónsejteket is). Az alsó ábra ezt demonstrálja: a rab11 gén egy mutáns allélja homozigóta formában („sötét” sejtek) hatást gyakorol mCherry-Atg8a marker mintázatára. A jelenség leírása és magyarázata az Eredmények fejezetben található. (A Szerző ábrája és felvétele)
43
3. Eredmények 3.1. Az autofágia és az endo-lizoszómális rendszer kapcsolatának vizsgálata: a Rab11 szerepe 3.1.1.
A Rab11 fehérje szerepet játszik az autofágiában
A Rab11 fehérje autofágiában betöltött szerepéről egymásnak ellentmondó ismeretek jelentek meg az utóbbi néhány évben a szakirodalomban. Egyrészt két tanulmány is azt bizonyítja, hogy a Rab11 az autofagszómák érésében játszik fontos szerepet (Fader és mtsai, 2008; Richards és mtsai, 2011). Másrészt Longatti és munkatársai szerint a Rab11 már az autofágia igen korai lépéseihez is szükséges: részt vesz a reciklizáló endoszómáktól az autofagoszóma-képződés helyére történő membránszállításban, ezáltal alapanyagot szolgáltat a formálódó autofagoszóma számára (Longatti és mtsai, 2012). Mindhárom tanulmány emlős sejttenyészeten végzett munkák eredményeit mutatja be. Munkám során ezzel szemben egy in vivo modellrendszer, az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) lárvális zsírtest sejtjein végzett kísérletek segítségével vizsgáltam a Rab11 autofágiában betöltött szerepét. Először megvizsgáltuk, hogy a Rab11 expressziójának siRNS-sel kiváltott csendesítése okoz-e valamilyen defektust az autofágiában. A kísérlet során három független, RNS interferencia indukálására alkalmas transzgénikus Drosophila vonalat használtunk, a géncsendesítést a klonális expressziót lehetővé tevő Flp-FRT genetikai rendszerben alkalmaztuk. Azt tapasztaltuk, hogy mind táplálkozó, mind éheztetett lárvákban a Rab11csendesített klónsejtekben kisméretű Atg8a-pozitív granulumok halmozódnak föl az őket körülvevő kontroll sejtekhez viszonyítva (18. ábra, A-C és E). Hasonló fenotípusos eltérést mutattak azok a klónsejtek, melyekben a Rab11 fehérje domináns negatív – a GDP-t GTP-re cserélni képtelen, inaktív – formája fejeződik ki nagy mennyiségben (18. ábra, D-E).
44
18. ábra. A működőképes Rab11 fehérje szintjének csökkenése mCherry-Atg8a-pozitív granulumok felhalmozódásához vezet az ecetmuslica lárvális zsírtestsejtjeiben. (A-C) mCherry-Atg8a markert kifejező jól táplált és éheztetett L3 lárvák zsírtestjének kontroll és Rab11-csendesített (GFP-t expresszáló, zöld) sejtjei. A Rab11 csendesítését a párhuzamos kísérletekben három, egymástól független RNSi vonallal (Rab11 RNSi1, 2 és 3) végeztük. (D) mCherry-Atg8a markert kifejező táplálkozó és éheztetett L3 lárvák zsírtestsejtjei. A GFP-t is kifejező, zöld sejtek a Rab11 fehérje domináns negatív formáját overexpresszálják. Őket kontroll sejtek veszik körül. A képhármasok logikai egységeket alkotnak, melyekben az első kép a feltüntetett körülmények között készült háromcsatornás fénykép. A kék csatorna a sejtmagokat mutatja DAPI festéssel, a zöld a GFP-t, a piros pedig az mCherry-Atg8a marker mintázatát. A második kép csak a piros csatornát tartalmazza, a harmadik pedig ennek egy kinagyított részletét mutatja be. Skála: 10µm. (E) Az Anyagok és módszerek fejezetben leírt módon meghatároztuk az mCherry-Atg8a-pozitív granulum/sejtméret arányt, és ezeket az értékeket kétmintás Wilcoxon-teszttel hasonlítottuk össze a különböző transzgéneket kifejező klónok és az őket körülvevő kontroll sejtek csoportjai között (táplálkozó Rab11 RNSi1: N=21, P<0,0001; éheztetett Rab11 RNSi1: N=38, P<0,0001; táplálkozó Rab11 RNSi2: N=13, P=0,0015; éheztetett Rab11 RNSi2: N=19, P=0,0002; táplálkozó Rab11 RNSi3: N=38, P<0,0001; éheztetett Rab11 RNSi3: N=33, P<0,0001; táplálkozó Rab11
45
DN: N=20, P<0,0001; éheztetett Rab11 DN: N=19, P=0,0001). A box plot ábrán az oszlopok az alsó és felső kvartilisek közé eső adatokat szemléltetik, a mediánt egy vízszintes vonal jelöli. A függőleges vonalak az ezeken kívül eső adatok variabilitását mutatják be. **-gal a P<0,01, ***-gal a P<0,001 értékeket jelöltük.
Ezután megvizsgáltuk a Rab11 gén P-elem inszercióval előállított rab11j2D1 mutációjának hatását. Mivel a ez a mutáció homo- és hemizigóta formában is embrió-letalitást okoz, ezért kísérleteinket az FRT-FLP rendszer alkalmazásával generált homozigóta mutáns klónsejteken végeztük. Jól táplált és éheztetett lárvák rab11 mutáns klónsejteiben egyaránt Atg8-pozitív struktúrák felhalmozódását figyeltük meg (19. ábra, A-B). További kísérletekkel azt is igazoltuk, hogy a homozigóta mutáns sejtekben tapasztalt fenotípust valóban a rab11 gén hibája okozza. A génbe épült P-elem remobilizálása visszaállította a vad fenotípust, valamint a Rab11-GFP transzgén konstitutív expressziója teljesen menekítette az autofágia-defektust (19. ábra, C-D) és részlegesen az embrió letalitását is (19. ábra, E). Ezek az eredmények azt igazolják, hogy a fenti kísérletekben az autofágia hibáját valóban a működőképes Rab11 fehérje hiánya okozza. A vándorló lárvák zsírtestjének vizsgálata azt mutatta, hogy a Rab11 nemcsak az alapszintű és az éheztetéssel indukált autofágiában játszik szerepet, hanem a fejlődési autofágiához is szükséges. A Rab11-csendesített sejtekben a környező kontroll sejtekhez képest kisméretű Atg8-pozitív struktúrák halmozódtak föl (20. ábra).
46
19. ábra. A Rab11 fehérje szükséges a stressz-indukált és fejlődési autofágiához. (A) mCherry-Atg8a j2D1 markert kifejező jól táplált és éheztetett L3 lárvák zsírtestjének homozigóta rab11 mutáns és kontroll (GFP-t expresszáló, zöld) sejtjei. (B) Az mCherry-Atg8a-pozitív granulum/sejtméret arányt az Anyagok és módszerek fejezetben leírt módon határoztuk meg, majd ezeket az értékeket kétmintás Wilcoxon-teszttel hasonlítottuk össze a különböző transzgéneket kifejező klónok és az őket körülvevő kontroll sejtek csoportjai között (táplálkozó Rab11 mutáns: N=22, P<0,0001; éheztetett Rab11 mutáns: N=18, P=0,0002). (C) A vadtípusú Rab11 overexpresszióa menekítette az mCherry-Atg8a markert kifejező rab11 mutáns zsírtestsejtek autofágia defektusát. (D) Meghatároztuk az mCherry-Atg8apozitív granulum/sejtméret arányt, és ezeket az értékeket Kruskal-Wallis teszttel hasonlítottuk össze a négy csoport között (P<0,0001, táplálkozó: Nctrl=22, Nmutáns=22, Nmenekített=35; Pkontroll-mutáns=0,0360, Pkontroll-menekített=1,0000, Pmutáns-menekített<0,0001; éheztetett: Nkontroll=18, Nmutáns=18, Nmenekített=20; Pkontrollmutáns<0,0001, Pkontroll-menekített =0,0860, Pmutáns-menekített<0,0001). (E) A vadtípusú Rab11 overexpressziója részlegesen menekítette a rab11 mutáció okozta embrió letalitást. Meghatároztuk az egyes fejlődési stádiumokban elpusztult állatok arányát, és ezt Khi-négyzet próbával hasonlítottuk össze a csoportok között (Nkontroll=2792, Nmutáns=2262, Nmenekített=2662, P<0,0001 minden páronkénti összehasonlításban). A képhármasok logikai egységeket alkotnak, melyekben az első kép a feltüntetett körülmények között készült háromcsatornás fénykép. A kék csatorna a sejtmagokat mutatja DAPI festéssel, a zöld a GFP-t, a piros pedig az mCherry-Atg8a marker mintázatát. A második kép csak a piros csatornát tartalmazza, a harmadik pedig ennek egy kinagyított részletét mutatja be. Skála: 10µm. A box plot ábrán az oszlopok az alsó és felső kvartilisek közé eső adatokat szemléltetik, a mediánt egy vízszintes vonal jelöli. A függőleges vonalak az ezeken kívül eső adatok variabilitását mutatják be. NS-sel a P>0,05, **-gal a P<0,01, ***-gal a P<0,001 értékeket jelöltük.
47
20. ábra. A Rab11 szükséges a fejlődési autofágiához. (A) mCherry-Atg8a markert expresszáló L3 stádiumú vándorló lárvák kontroll és Rab11-csendesített (zöld) sejtjei. A Rab11 csendesítését a párhuzamos kísérletekben két, egymástól független RNSi transzgénnel (Rab11 RNSi1 és 2) végeztük. (B) Meghatároztuk az mCherry-Atg8a-pozitív granulum/sejtméret arányt, majd ezeket az értékeket kétmintás Wilcoxon-teszttel hasonlítottuk össze a klón- és kontroll sejtek csoportjai között (vándorló Rab11 RNSi1: N=18, P<0.0001; vándorló Rab11 RNSi2: N=12, P= 0.0051). A képhármasok logikai egységeket alkotnak, melyekben az első kép a feltüntetett körülmények között készült háromcsatornás fénykép. A kék csatorna a sejtmagokat mutatja DAPI festéssel, a zöld a GFP-t, a piros pedig az mCherry-Atg8a marker mintázatát. A második kép csak a piros csatornához tartozik, a harmadik pedig ennek egy kinagyított részletét mutatja be. Skála: 10µm. A box plot ábrán az oszlopok az alsó és felső kvartilisek közé eső adatokat szemléltetik, a mediánt egy vízszintes vonal jelöli. A függőleges vonalak az ezeken kívül eső adatok variabilitását mutatják be. NS-sel a P>0,05, **-gal a P<0,01, ***-gal a P<0,001 értékeket jelöltük.
3.1.2. A Rab11 fehérje szükséges az autofagoszóma-éréshez
Az autofág struktúrák számbeli növekedését az autofágia-indukció mértékének emelkedése illetve az autofagoszómák érési folyamatának hibája egyaránt okozhatja. Azt feltételeztük, hogy ha a Rab11 csendesítése megnövekedett autofágia-indukcióhoz vezet, akkor az ép Rab11 fehérje ektopikus expressziója gátolhatja az autofágiát. Azonban sem a vadtípusú, sem pedig a konstitutívan aktív – állandóan GTP-t kötő – Rab11 klonális túltermeltetése nem okozott változást az alapszintű és az indukált autofágiában sem (21. ábra). Az autofág flux vizsgálatára széles körben használt eszköz a kettősen floureszcensen jelölt mCherry-GFP-Atg8a transzgén (Kimura és mtsai, 2007). Savas pH-n a GFP gyorsan elveszti a fluoreszcenciáját, ezért a savas beltartalmú autolizoszómákban csak az mCherry vörös jele detektálható. Az éretlen, még nem savas autofág struktúrák esetében a GFP zöld és az 48
mCherry vörös jele egyaránt detektálható (sárga jelet kapunk). A Rab11-csendesített sejtekben sárga, azaz egyszerre mCherry- és GFP-pozitív granulumok akkumulációját tapasztaltuk (22. ábra, A-B). Ezt követően más módszerekkel is igyekeztünk igazolni azt, hogy a tapasztalt autofágia defektust nem fokozott indukció, hanem az érési folyamat hibája okozza. A P62/Ref(2)P fehérje egy szelektív autofágia receptor, amely maga is lebomlik az autolizoszómákban, ezért felhalmozódása információt nyújt az autofág degradáció hibájáról. Megfigyeltük a P62/Ref(2)P felhalmozódását is Rab11 RNS interferencia konstrukciót kifejező klónsejtekben (22. ábra, C). Ezt Rab11-csendesített és kontroll állatok zsírtestjeiből származó fehérjemintákon végzett Western blot analízissel is igazoltuk (22. ábra, D).
21. ábra. A Rab11 túltermelése nem okoz változást az autofágiában. (A) mCherry-Atg8a markert kifejező jól táplált (A) és éheztetett (A’) L3 lárvák zsírtestjének kontroll és vadtípusú Rab11 fehérjét (Rab11 VT) túltermelő (emellett GFP-t is kifejező, zöld) sejtjei. (B) mCherry-Atg8a markert kifejező jól táplált (B) és éheztetett (B’) L3 lárvák zsírtestjének konstitutívan aktív Rab11 fehérjét (Rab11 KA) túltermelő (zöld) és az ezeket körülvevő kontroll sejtjei. Skála: 10µm (C) Az éheztetett állatok zsírtestsejtjeiben meghatároztuk az mCherry-Atg8a-pozitív granulumok száma/sejtterület arányt, és ezeket az értékeket kétmintás Wilcoxon-teszttel hasonlítottuk össze a kontroll és a különböző transzgéneket expresszáló klónsejtek csoportjai között (Rab11 VT túltermeltetés: N=14, P= 0,8613; Rab11 KA túltermeltetés: N=26, P= 0,7509). Az oszlopok az alsó és felső kvartilisek közé eső adatokat szemléltetik, a függőleges intervallumok pedig az ezeken kívül eső adatok variabilitását. A NS jelölés azt jelzi, hogy a csoportok között nincs szignifikáns különbség.
49
22. ábra. A Rab11 szükséges az autofagoszómák éréséhez I. Éheztetett L3 lárvák mCherry-GFP-Atg8a markert expresszáló Rab11-csendesített (A) és kontroll (B) zsírtest sejtjei. A sejtmagokat DAPI-val festettük meg. A Dot-plot ábrák a fő képek zöld (GFP) és piros (mCherry) csatornáinak fluoreszcens intenzitását és a kolokalizációs profilját mutatják. (C) P62 immunhisztokémiai kimutatása anti-P62 ellenanyaggal (piros) jól táplált L3 lárvák Rab11-csendesített (zöld) és az ezeket körülvevő kontroll zsírtestsejtjeiben. A sejtmagokat DAPI-val festettük (kék). Meghatároztuk a P62-pozitív granulum/sejtterület arányt, majd ezeket az értékeket összehasonlítottuk a kontroll és Rab11csendesített klónsejtek csoportjai között kétmintás Wilcoxon-teszttel (N=22, P<0,0001). Az oszlopok az alsó és felső kvartilisek közé eső adatokat szemléltetik, a függőleges intervallumok pedig az ezeken kívül eső adatok variabilitását. A *** P<0,001 értéket jelent. (D) Éheztetett és jól táplált kontroll és Rab11-csendesített lárvák P62, Rab11 és α-tubulin fehérjeszintjét, illetve relatív denzitás-értékeit szemléltető reprezentatív Western blot. A * aspecifikus csíkokat jelöl.
50
A chloroquine (CQ) egy, a lizoszómák elsavasodását és ezáltal az autofagoszómalizoszóma fúziót is gátló lizozmotropikus ágens (Zhou és Wang, 2013). Miután a CQ hatását teljes lárvális zsírtesten lehet csak vizsgálni, ebben az esetben a Rab11 RNS interferenciát is az egész szervben indukáltuk. A táplálkozó lárvák teljes zsírtestjében történő Rab11csendesítés CQ-kezelést követően hasonló mértékű GFP-Atg8a pozitív granulumfelhalmozódást eredményezett, mint CQ hozzáadása nélkül. Azaz a CQ-kezelés már nem növelte tovább az autofág struktúrák számát (23. ábra, A-B). Ez az eredmény is azt támasztja alá, hogy a Rab11 csendesítése valószínűleg nem autofágiát indukál, hanem az autofagoszómák érési folyamatában okoz hibát. Az úgynevezett „GFP-Atg8 processing” módszert is gyakran használják az autofág degradáció vizsgálatára. Az eljárás alapja az, hogy a GFP-Atg8 fúziós fehérje autolizoszómákban
kezdődő
lebontása
a
GFP
(Western
blottal
is
kimutatható)
felszabadulását eredményezi. A Rab11-csendesített lárvális zsírtestekben - mind éheztetett, mind pedig jól táplált állatokból származó fehérjeminták esetében - a kimutatott szabad GFP szintje szignifikánsan kisebb volt, mint kontroll társaik zsírtestjeiben (23. ábra, C-D). Ezeket az eredményeket tovább erősítették elektronmikroszkópos megfigyeléseink: a Rab11 klonális csendesítése a jól táplált lárvák zsírtestsejtjeiben is éretlen, illetve abnormális autofagoszómák felhalmozódásához vezetett (23. ábra, E). Ezek az eredmények tehát mind arra utalnak, hogy az ép Rab11 fehérje szükséges az autofagoszómák érési folyamatához, és hiányában éretlen autofagoszómák halmozódnak fel a lárvális zsírtest sejtjeiben.
51
23. ábra. A Rab11 szükséges az autofagoszómák éréséhez II. (A) A Rab11 teljes lárvális zsírtestben történő csendesítése is GFP-Atg8a-pozitív struktúrák (zöld) felhalmozódásához vezet. A sejtmagokat DAPI jelöli (kék). Skála: 10µm. (B) Meghatároztuk a GFP-Atg8a-pozitív granulum/sejtterület arányt chloroquine (CQ) kezelés hatására és annak hiányában, majd az értékeket Kruskal-Wallis teszttel hasonlítottuk össze a négy csoport között (P<0,0001, Nkontroll=216, Nkontroll+CQ=66, NRNSi=146, NRNSi+CQ=52; Pkontroll-kontrolll+CQ<0,0001, Pkontroll-RNSi=0,0010, Pkontroll-RNSi+CQ=0,0030, Pkontroll+CQ-RNSi=1,0000, Pknntroll+CQRNSi+CQ=1,0000, PRNSi-RNSi+CQ=1,0000). Az oszlopok az alsó és felső kvartilisek közé eső adatokat szemléltetik, a függőleges intervallumok pedig az ezeken kívül eső adatok variabilitását. Az NS jelölés azt mutatja, hogy nincs szignifikáns különbség a csoportok között, a *** a P<0,001 értéket jelöli. (C) A GFP-Atg8a processing vizsgálat során készített reprezentatív Western blot jól táplált, valamint éheztetett kontroll és Rab11-csendesített lárvák GFP-Atg8a, szabad GFP, α-tubulin és Rab11 fehérjeszintjeit szemlélteti. A * aspecifikus csíkokat jelöl. (D) A Western blotokon megmértük a fehérjék relatív denzitás értékeit és GLMM módszerrel hasonlítottuk össze a négy csoport között (N=4,
52
P<0,0001). Az oszlopokon a zöld szakaszok a fehérjemintákban található szabad GFP relatív mennyiségét jelölik, a feketék pedig a GFP-Atg8a mennyiségét. (E) Jól táplált L3 lárvák kontroll és Rab11-csendesített (zöld nyíl) zsírtestsejtjeinek ultrastruktúráját vizsgáltuk komparatív elektronmikroszkópiával. Az (E’) az E ábra kinagyított részleteit mutatja. Nu: sejtmag, L: lipid cseppek, M: mitokondriumok, valamint abnormális (nyílfej) és éretlen (nyíl) autofagoszómák. Skála: 1µm. (Kis Viktor készítménye és felvételei)
3.1.3. Rab11 hiányában késői endoszómák halmozódnak föl a sejtekben Megvizsgáltuk, hogy a Rab11 csendesítése okoz-e változást a zsírtest sejtek LysoTracker Red (LTR) mintázatában. A LTR egy vitális festék, amely a savas beltartalmú kompartimentumokat, például az autolizoszómákat jelöli. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a Rab11-csendesített klónsejtekben - jól táplált és éheztetett lárvák zsírtestjében egyaránt - nagyméretű LTR-pozitív granulumok halmozódnak föl az őket körülvevő kontroll sejtekhez viszonyítva (24. ábra, A és D). Hasonló fenotípust figyeltünk meg a domináns negatív Rab11-et kifejező és a Rab11-deficiens mutáns klónsejtekben is (24. ábra, B-D). A rab11j2D1 mutáció LTR mintázatra gyakorolt hatását a vadtípusú Rab11-GFP overexpressziója menekítette (24. ábra, E-F). A vadtípusú, illetve a konstitutívan aktív Rab11 klonális túltermeltetése várakozásainknak megfelelően nem okozott változást a sejtek LTR mintázatában (25. ábra). Kíváncsiak voltunk arra, hogy a Rab11-csendesítés következtében felszaporodó savas struktúrák autofág eredetűek-e, ezért megvizsgáltuk, hogy a LTR milyen mértékben lokalizál együtt a GFP-Atg8a markerrel. Jól táplált állatok kontroll sejtjeiben 43±1.56%-os kolokalizációt figyeltünk meg. Ez az arány 8±0.83%-ra esett vissza Rab11-csendesített sejtekben (26. ábra, A és D), ami arra utal, hogy a Rab11 fehérje rendellenesen alacsony szintje a késői autofág struktúrák számának csökkenéséhez vezet. A korábbi eredményeinkkel együtt ez azt sugallta, hogy a működő Rab11 fehérje hiányában felhalmozódó LTR-pozitív granulumok nem lehetnek autolizoszómák. Ezért további kísérletekkel igyekeztünk fényt deríteni ezen struktúrák természetére. Először is azt vizsgáltuk meg, hogy a Rab11-csendesített sejtekben a LTR kolokalizál-e a késői endoszómák és lizoszómák ismert markerével, a Lamp1-GFP-vel (Schwake és mtsai, 2013). Jól táplált lárvák Rab11 RNSi sejtjeiben a két marker 90±1.40%-ban kolokalizált, és ez az arány 97±0.73%-ra nőtt éheztetés következtében (26. ábra, B-C). Ráadásul a Rab11csendesítés a zöld csatornán mért expozíciós idő jelentős csökkenése alapján a Lamp1-GFP felhalmozódásával is járt, ami valószínűleg a fehérje lebontásának gátlódása miatt következett be (26. ábra, E-F). 53
24. ábra. Működőképes Rab11 fehérje hiányában LysoTracker Red (LTR)-pozitív granulumk halmozódnak föl. (A) Jól táplált és éheztetett L3 stádiumú lárvák Rab11-csendesített (GFP-t expresszáló, zöld) és környező kontroll zsírtest sejtjei LTR-rel (piros) festve. A sejtmagokat DAPI-val (kék) festettük. (B) Jól táplált és éheztetett L3 lárvák zsírtestjének kontroll, valamint a domináns negatív Rab11 fehérjét (Rab11 DN) túltermelő (zöld) sejtjeit LTR-rel (piros) és DAPI-val (kék) festettük. j2D1 (C) Jól táplált és éheztetett L3 lárvák zsírtestjének homozigóta rab11 mutáns és kontroll (GFP-t expresszáló, zöld) sejtjeit LTR-rel (piros) és DAPI-val (kék) festettük. (D) Meghatároztuk a LTR-pozitív granulumok/sejtterület arányt, majd ezeket az értékeket összehasonlítottuk a kontroll és Rab11-
54
hiányos sejtek csoportjai között kétmintás Wilcoxon-teszttel (táplálkozó Rab11 RNSi1: N=21, P<0,0001; éheztetett Rab11 RNSi1: N=22, P<0,0001; táplálkozó Rab11 DN: N=11, P=0,0277; éheztetett Rab11 DN: N=16, P=0,0004; táplálkozó Rab11 mutáns: N=26, P<0,0001; éheztetett Rab11 mutáns: N=14, j2D1 P=0,0010). (E) A vadtípusú Rab11 túltermeltetése rab11 mutánsokban megakadályozza a LTRpozitív granulumok (piros) felhalmozódását. A sejtmagokat DAPI (kék) jelöli. (F) A LTR-pozitív granulum/sejtterület arány értékeket Kruskal-Wallis teszttel hasonlítottuk össze a csoportok között (P<0,0001, táplálkozó: Nkontroll=26, Nmutáns=26, Nmenekített=25; Pkontroll-mutáns<0,0001, Pkontrollmenekített=1,0000, Pmutáns-menekített<0,0001; éheztetett: Nkontroll=14, Nmutáns=14, Nmenekített=25; Pkontrollmutáns=0,0030, Pkontroll-menekített=0,1070, Pmutáns-menekített<0,0001). A box plot ábrán az oszlopok az alsó és felső kvartilisek közé eső adatokat szemléltetik, a függőleges intervallumok pedig az ezeken kívül eső j2D1 adatok variabilitását. Szürke oszlop jelöli a kontroll csoportot, kék a homozigóta rab11 mutánsokat, a narancssárga pedig a menekített mutánsokat. Az NS jelölés azt mutatja, hogy nincs szignifikáns különbség a csoportok között, a ** a P<0,01 és a *** a P<0,001 értéket jelöli.
25. ábra. A Rab11 túltermelése nem okoz változást a zsírtest sejtek LTR mintázatában. (A) Jól táplált és éheztetett L3 lárvák zsírtestjének kontroll és a vadtípusú Rab11 fehérjét (Rab11 VT) túltermelő (zöld) sejtjei. (B) Jól táplált és éheztetett L3 lárvák zsírtestjének konstitutívan aktív Rab11 fehérjét (Rab11 KA) túltermelő (GFP-t is kifejező, zöld) és környező kontroll sejtjei. A képhármasok logikai egységeket alkotnak, melyekben az első kép a feltüntetett körülmények között készült háromcsatornás fénykép. A kék csatorna a sejtmagokat mutatja DAPI festéssel, a zöld a GFP-t, a piros pedig az mCherry-Atg8a marker mintázatát. A második kép csak a piros csatornához tartozik, a harmadik pedig ennek egy kinagyított részletét mutatja be. Skála: 10µm
55
26. ábra. Rab11-csendesítés hatására késői endoszómák halmozódnak fel I. (A) Éheztetett L3 lárvák zsírtestjében klonálisan csak GFP-Atg8a-t expresszáló (kontroll), vagy egyszerre GFP-Atg8a-t expresszáló és Rab11-csendesített sejteket (zöld) vizsgáltunk, és a zsírtesteket LTR-rel (piros) és DAPIval (kék) festettük. (B) Jól táplált L3 stádiumú lárvák zsírtestjének Lamp1-GFP-t (zöld) kifejező kontroll és Rab11-csendesített klónsejtjei. A zsírtesteket LTR-rel (piros) és DAPI-val (kék) festettük meg. (C) Éheztetett L3 lárvák LTR-rel (piros) és DAPI-val (kék) festett zsírtestjének Lamp1-GFP-t (zöld) expresszáló kontroll és Rab11-csendesített klónsejtjei. Skála: 10µm. (D) Meghatároztuk a GFP-Atg8a és a LTR kolokalizációjának arányát, és ezeket az értékeket Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a két csoport között (Nctrl=62, nNNAi=44, P<0,0001). (E) Meghatároztuk a Lamp1-GFP-pozitív granulum/sejtterület arányt és Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a kontroll és Rab11csendesített csoportok között (táplálkozó: Nkontroll=34, NRNSi=27, P<0,0001; éheztetett: Nkontroll=14, NRNSi=19, P<0,0001). (F) Lamp1-GFP-t kifejező zsírtest sejtek expozíciós idejét mértük, majd az értékeket Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a két csoport között (Nkontroll=160, NRNSi=150, P<0,0001). A box plot ábrákon az oszlopok az alsó és felső kvartilisek közé eső adatokat jelölik, a függőleges intervallumok pedig az ezeken kívül eső adatokat. A szürke oszlopok a kontroll, a zöldek a Rab11-csendesített csoportokat ábrázolják. A pontok a kiugró adatokat szimbolizálják. A *** P<0,001 értéket jelent.
56
27. ábra. Rab11-csendesítés hatására késői endoszómák halmozódnak fel I. (A) Jól táplált L3 lárvák kontroll és Rab11-csendesített (GFP-t expresszáló, zöld) zsírtest sejtjein anti-Lsp2 ellenanyaggal (piros) végeztünk immunhisztokémiai kimutatást. A sejtmagokat DAPI (kék) jelöli. (B) Táplálkozó L3 lárvák zsírtestjének Rab11-csendesített (zöld) és az ezeket körülvevő kontroll sejtjein végeztünk immunhisztokémiai festést anti-Rab7 ellenanyaggal (piros). A sejtmagokat DAPI-val (kék) festettük. (C) Jól táplált L3 lárvák kontroll és Rab11-csendesített (GFP-t expresszáló, zöld) zsírtest sejtjein antiRabenozin5 (Rbsn5) ellenanyaggal (piros) végeztünk immunhisztokémiai eljárást. A sejtmagokat DAPI (kék) jelöli. A képhármasok logikai egységeket alkotnak, melyekben az első kép a feltüntetett körülmények között készült háromcsatornás fénykép. A második kép csak a piros csatornához tartozik, a harmadik pedig ennek egy kinagyított részletét mutatja be. Skála: 10µm. (D) Meghatároztuk az Lsp2, Rab7- és Rabenozin5-pozitív granulum/sejtterület arányt, és ezeket az értékeket kétmintás Wilcoxonteszttel hasonlítottuk össze a kontroll és Rab11-csendesített klónsejtek csoportjai között (Lsp2: N=18, P=0,0002; Rab7: N=28, P<0,0001; Rbsn5: N=15, P=0,8647). A box plot ábrán az oszlopok az alsó és felső kvartilisek közé eső adatokat, a függőleges intervallumok pedig az ezeken kívül esőket szemléltetik. A szürke oszlopok a kontroll csoportok, a zöldek a Rab11-csendesített csoportok adatait ábrázolják. ***-gal a P<0,001 értékeket jelöltük, az NS jelölés azt jelzi, hogy a csoportok között nem találtunk szignifikáns különbséget. (E) A nyilak egy-egy abnormális szerkezetű késői endoszómát mutatnak egy Rab11-csendesített táplálkozó L3 stádiumos lárva zsírtest sejtjében. Skála: 100nm. (Kis Viktor készítménye és felvétele)
Az Lsp2 az ecetmuslica egyik raktározott fehérjéje, amelyet az L3 stádiumú lárvák zsírtest sejtjei nagy mennyiségben vesznek fel a környező hemolimfából (Mousseron-Grall és mtsai, 1997). Az anti-Lsp2 ellenanyaggal végzett immunhisztokémiai vizsgálataink azt mutatták, hogy a Rab11-csendesített sejtekben nagyméretű, Lsp2-pozitív granulumok halmozódnak föl, és az LTR-hez hasonló festési mintázatot mutatnak (27. ábra, A és D). Ezen felül azt tapasztaltuk, hogy ezeken a felhalmozódó struktúrákon kimutatható a késői endoszóma 57
markereként használt Rab7 fehérje (Wang és mtsai, 2011), de hiányzik róluk a korai endoszómákat jelölő Rabenozin-5 (de Renzis és mtsai, 2002) (27. ábra, B-D). Mindezekkel összhangban elektronmikroszkópos vizsgálataink során a Rab11-csendesített zsírtest sejtekben abnormális késői endoszómák jelenlétét figyeltük meg (27. ábra, E). Ezekből az eredményekből azt a következtetést vontuk le, hogy a Rab11-csendesítés következtében felhalmozódó struktúrák elsavasodott késői endoszómák lehetnek.
3.1.4. A Rab11 szükséges az amfiszóma képződéshez
Az amfiszómák az autofagoszómák endoszómákkal történő fúziójával kialakuló hibrid organellumok (Gordon és Seglen, 1988; Berg és mtsai, 1998; Rusten és mtsai, 2007). Mivel eredményeink azt mutatták, hogy Rab11 hiányában éretlen autofagoszómák és késői endoszómák halmozódnak föl, lehetségesnek tartottuk, hogy a Rab11 fehérje éppen ezek fúziójához szükséges. Ezért
tanulmányoztuk
az
Atg8a
különböző
endoszóma-markerekkel
történő
kolokalizációját Rab11-csendesített és kontroll sejtekben, éheztetéssel indukált autofágia hatására. Azt tapasztaltuk, hogy míg a kontroll lárvák zsírtest sejtjeiben a GFP-Atg8a 43±0.91%-a kolokalizál az endocitotikus eredetű struktúrákat jelölő Texas Red Avidinnel (TRA), addig ez az arány 8±0.15%-ra csökken a Rab11-csendesítés következtében (28. ábra, AB). A Rab11 csendesítése ugyancsak hatott az mCherry-Atg8a két késői endoszómamarkerrel, a Rab7 és Lamp1 fehérjékkel való kolokalizációjára is. Kontroll sejtekben az mCherry-Atg8a 20±1.64%-a kolokalizált az endogén Rab7-tel, míg ez az arány Rab11csendesített sejtekben csak 1.8±0.32% volt (28. ábra, B-C’). Hasonló mértékű csökkenést (75±1.7%-ról 32±1.6%-ra) tapasztaltunk az mCherry-Atg8 és a Lamp1-GFP esetében is (28. ábra, B és D-D’). Fenti eredményeinket megerősítik elektronmikroszkópos vizsgálataink is: Rab11csendesített sejtekben gyakran figyeltünk meg autofagoszómákat anti-Lsp2-vel jelölhető endoszómák közvetlen közelében, de ezek fúziójára utaló jeleket nem találtunk (29. ábra, AB). A Gömöri-féle savas foszfatáz hisztokémiai módszerrel pedig kimutattuk, hogy míg ezek az endoszómák tartalmaznak savas foszfatáz enzimet, az autofág struktúrák nem (29. ábra, C). Ezek az eredmények együttesen arra utalnak, hogy a Rab11 fehérje szükséges az autofagoszómák endoszómákkal történő fúziójához, azaz az amfiszóma-képződéshez.
58
28. ábra. A Rab11 szükséges az amfiszómák kialakulásához I. Éheztetett kontroll (A) és Rab11csendesített (A’) L3 stádiumú lárvák GFP-Atg8a-t (zöld) expresszáló zsírtest sejtjei endocitotikus jelölőanyagot, Texas Red-Avidint (TRA, piros) vettek föl. A sejtmagokat DAPI (kék) jelöli. (B) Meghatároztuk a GFP-Atg8a és TRA, a Rab7 és mCherry-Atg8a, valamint a Lamp1-GFP és mCherryAtg8a kolokalizációjának arányát, és az értékeket Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a kontroll és Rab11-csendesített csoportok között (GFP-Atg8a+TRA: Nkontroll=100, NRNSi=190, P=0,0002; Rab7+mCh-Atg8a: Nkontroll=41, NRNSi=39, P=0,0008; Lamp1-GFP+mCh-Atg8a: Nkontrolll=57, NRNSi=57, P<0,0001). A box plot ábrán a szürke oszlopok a kontroll csoportok, a zöldek a Rab11-csendesített csoportok adatait szemléltetik. A *** P<0,001 értéket jelöl. Éheztetett lárvák kontroll (C) és Rab11csendesített (C’) mCherry-Atg8a-t (piros) expresszáló zsírtest sejtjein immunhisztokémiai kimutatást végeztünk anti-Rab7 ellenanyaggal (zöld). A sejtmagokat DAPI-val (kék) festettük. Éheztetett lárvák kontroll (D) és Rab11-csendesített (D’) zsírtest sejtjei, melyek egyszerre Lamp1-GFP-t (zöld) és mCherry-Atg8a-t (piros) is expresszálnak. A sejtmagokat DAPI (kék) jelöli. Skála: 10µm.
59
29. ábra. A Rab11 szükséges az amfiszómák kialakulásához II. (A) A Rab11-csendesített sejtekben az autofagoszómák (AP) nem képesek késői endoszómákkal (En) fúzionálni. Az endoszómák Lsp2- (nyilak) (B) és savas foszfatáz-pozitívak (nyílhegyek) (C). Skála: 100nm. (Kis Viktor készítményei és felvételei)
3.1.5. A Rab11 autofagoszómákra lokalizál
Eddigi eredményeink alapján a Rab11 fontos szerepet játszik az autofagoszómák és késői endoszómák fúziójában, ezért megvizsgáltuk azt is, hogy a fehérje kimutatható-e az autofág struktúrákon. Éheztetett állatok zsírtest sejtjeiben az ektopikusan expresszált Rab11-GFP-t tartalmazó struktúrák 40±0.44%-a kolokalizált az mCherry-Atg8 jelöléssel (30. ábra, D). Ezt alátámasztja, hogy a későbbiekben az endogén Rab11 és az mCherry-Atg8a kolokalizációját is megfigyelhettük. Az endogén Rab11 immunhisztokémiai kimutatásával azt is kiderítettük, hogy az autofágia-indukció hatására következik-e be a Rab11 és az mCherry-Atg8a kolokalizációja. Ugyanis azt tapasztaltuk, hogy jól táplált állatok zsírtest sejtjeiben a Rab11-pozitív struktúrák 0.46±0.09%-a kolokalizált mCherry-Atg8a-val, míg éheztetés hatására ez az arány 18±1.47%ra nőtt (30. ábra, A-B’ és E). Mindeközben az autofágia-indukció nincs hatással a zsírsejtek Rab11-pozitív struktúráinak mennyiségére (30. ábra, F). A Rab11 autofagoszóma markerrel való kolokalizációja arra utal, hogy az eddig reciklizáló endoszóma markerként használt fehérje az autofág struktúrákon is megtalálható. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy az ESCRT fehérjék szükségesek az amfiszóma képződéséhez, és az ESCRT-komponensek hiánya éretlen autofagoszómák akkumulációjához vezet (Lee és mtsai, 2007b; Filimonenko és mtsai, 2007). A Vps32/Snf7 az endoszómák érési folyamatában fontos szerepet játszó ESCRT-III komplex egyik alegysége (Williams és Urbé, 2007; Hanson és mtsai, 2008; Raiborg és Stenmark, 2009). Mivel azt tapasztaltuk, hogy a 60
Rab11 az autofagoszómák érésében akadályozott Vps32-csendesített sejtekben is kolokalizál az mCherry-Atg8a-val (30. ábra, C-C’), arra következtettünk, hogy a Rab11 fehérje jelen van az éretlen autofagoszómákon.
30. ábra. A Rab11 szubcelluláris lokalizációja I. mCherry-Atg8a-t (piros) expresszáló jól táplált (A) és éheztetett (B) L3 stádiumú lárvák zsírtestjén immunhisztokémiai festést végeztünk anti-Rab11 ellenanyaggal (zöld). A sejtmagokat DAPI-val (kék) festettük. (C) Éheztetett, mCherry-Atg8a-t (piros) kifejező L3 stádiumú lárvák Vps32-csendesített zsírtestsejtjein végeztünk immunhisztokémiai festést anti-Rab11 ellenanyaggal (zöld). A sejtmagokat DAPI (kék) jelöli. Az (A’, B’ és C’) ábrák főképeik kinagyított részletei, a markerek kolokalizációját szemléltetik. A grafikonok a képek kék, zöld és piros csatornájának a nyíl mentén történő pásztázásával készültek. (D) Éheztetett L3 lárvák Rab11-GFP-t (zöld) és mCherry-Atg8a-t (piros) kifejező zsírtest sejtjeit DAPI-val (kék) festettük. Skála: 10µm. (E) Meghatároztuk a Rab11 és az mCherry-Atg8a kolokalizációjának arányát táplálkozó (tápl.), éheztetett (éh.) és Vps32-csendesített (Vps32↓) zsírtest sejtekben, és az értékeket Kruskal-Wallis teszttel hasonlítottuk össze (Ntápl.=72, Néh.=143, NVps32↓=20, P<0,0001, tápl.-éh.: P=0,0140, tápl.-Vps32↓: p<0,0001, éh.-Vps32↓: P=0,1840). (F) Meghatároztuk a Rab11-pozitív granulum/sejtterület arányt és Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a táplálkozó és éheztetett csoportok között (N tápl.=72, Néh.=143, P=1,0000). A box plot ábrákon az oszlopok az alsó és felső kvartilisek közé eső adatokat, a függőleges intervallumok pedig az ezeken kívül esőket szemléltetik. A * P<0,05, a *** P<0,001 értéket jelöl. Az NS jelölés azt jelzi, hogy nincs szignifikáns különbség a csoportok között.
Ahogy azt korábban említettük, a Rab11 fehérjét gyakran használják a reciklizáló endoszómák markereként (Hsu és Prekeris, 2010), a transzferrin receptor (TfR) pedig a Rab11-függő reciklizáló útvonal egyik legtöbbet tanulmányozott kargója (Maxfield és 61
McGraw, 2004). A következőkben azt is megvizsgáltuk, hogy az autofágia-indukció befolyásolja-e a Rab11 és a GFP-vel jelölt TfR kolokalizációját Az éheztetéssel indukált autofágia hatására szignifikánsan csökkent a Rab11 és a TfR-GFP kolokalizációjának mértéke, miközben a TfR-pozitív struktúrák száma nem változott (31. ábra). Ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy a Rab11 fehérje autofágia-indukció hatására a TfR-pozitív reciklizáló endoszómákról autofág struktúrákra transzlokálódik.
31. ábra. A Rab11 szubcelluláris lokalizációja II. GFP-vel jelölt transzferrin receptort (TfR-GFP, zöld) kifejező jól táplált (A) és éheztetett (B) L3 stádiumú lárvák zsírtestjén immunhisztokémiai festést végeztünk anti-Rab11 ellenanyaggal (piros). A sejtmagokat DAPI-val (kék) festettük. Skála: 10µm. Az (A’ és B’) ábrák főképeik kinagyított részletei, a markerek kolokalizációját szemléltetik. A grafikonok a képek kék, zöld és piros csatornájának a nyíl mentén történő pásztázásával készültek. (C) Meghatároztuk a Rab11 és a TfR-GFP kolokalizációjának arányát táplálkozó (tápl.), és éheztetett (éh.) lárvák zsírtest sejtjeiben, és az értékeket Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze (Ntápl.=35, éh.d=34, P<0,0017). (F) Meghatároztuk a TfR-GFP-pozitív granulum/sejtterület arányt és MannWhitney teszttel hasonlítottuk össze a táplálkozó és éheztetett csoportok között (Ntápl.=35, Néh.=34, P=0.9078). A box plot ábrákon az oszlopok az alsó és felső kvartilisek közé eső adatokat, a függőleges intervallumok pedig az ezeken kívül esőket szemléltetik. A ** P<0,01, az NS jelölés azt jelzi, hogy nincs szignifikáns különbség a csoportok között.
3.1.6. A Rab11 kölcsönhatásba lép a Hook fehérjével
Egy korábbi, HEK293T sejteken végzett vizsgálat kimutatta, hogy a Rab11 képes kötődni az endoszóma-érésben szerepet játszó Hook fehérjéhez (Luiro et al., 2004). A két fehérje erős fizikai interakcióját mi is kimutattuk Hook és Rab11 transzgénekkel transzfektált Drosophila D.Mel-2 sejttenyészetben (32. ábra, A), miközben a Rab11 nem volt képes kötni a szintén késői endoszómákra lokalizáló Lamp1-et (32. ábra, B). Emellett az interakciót in vivo is 62
sikerült igazolnunk: az endogén Rab11 kötődik az ektopikusan expresszált Hook-FLAG fehérjéhez (32. ábra, C), ráadásul GTP-függő módon (32. ábra, D). Lárvális zsírtestből származó fehérjeminták vizsgálata során azt is tapasztaltuk, hogy az autofágia éheztetéssel kiváltott indukciójának hatására nőtt a Hookhoz kötődő Rab11 fehérje mennyisége (32. ábra, C). További ko-immunprecipitációs vizsgálataink azt mutatták, hogy a Rab11 a Hook homodimerizációért felelős (Krämer és Phistry, 1999) centrális coiled-coil doménjéhez kötődik (33. ábra).
32. ábra. A Rab11 fizikai interakcióba lép a Hook fehérjével. D.Mel-2 sejteket egyszerre transzfektáltunk teljes hosszúságú Rab11-HA-nal és vagy Hook-FLAG (A), vagy Lamp1-FLAG (B) konstrukciókkal. A sejtlizátumokat anti-HA-konjugált agaróz gyöngyökkel inkubáltuk, majd a gyöngyhöz kötődött fehérjéket Western blottal mutattuk ki. (C) Hook-FLAG-et kifejező és kontroll, éheztetett (éh.) és jól táplált (tápl.) L3 lárvák zsírtestjéből származó fehérjemintákat inkubáltunk antiFLAG ellenanyaggal konjugált agaróz gyöngyökkel. A gyöngyhöz kötött fehérjéket Western blottal mutattuk ki. A Rab11 fehérjéhez tartozó csíkok relatív denzitását megmértük, majd kétmintás Wilcoxon-teszttel hasonlítottuk össze a táplálkozó és éheztetett csoportok között (N=5, P=0,0431). A box plot ábrán az oszlopok az alsó és felső kvartilisek közé eső adatokat ábrázolják, a függőleges intervallumok pedig az ezeken kívül eső adatokat szemléltetik. A * a P<0,05 értéket jelzi. (D) Teljes hosszúságú Hook-FLAG-et és vagy vadtípusú Rab11-GFP-t, vagy YFP-kötött, GTP-hidrolízisre képtelen domináns negatív Rab11 allélt (Rab11DN-YFP) egyszerre expresszáló Drosophila lárvákból származó fehérjemintákat inkubáltunk anti-FLAG ellenanyaggal konjugált agaróz gyöngyökkel. A gyöngyhöz kötött fehérjéket Western blottal mutattuk ki. Jelmagyarázat: IN: input (a gyöngyhöz adott fehérjeminták), IP: a ko-immunoprecipitáció során a gyöngy által kikötött fehérjék, WB: a Western blot készítése során használt ellenanyag.
63
33. ábra. A Rab11-kötőhely térképezése a Hook fehérjén. Az (A) ábra összegzi a következő koimmunprecipitációs kísérletek eredményét. A sávok az első oszlopban megnevezett Hook konstrukciókat jelképezik. D.Mel-2 sejteket transzfektáltunk Rab11-FLAG-gel és teljes hosszúságú vagy N-terminálisan csonkolt (ΔN), HA-fuzionált Hook konstrukciókkal (B), illetve C-terminálisan csonkolt (ΔC) Myc-fuzionált Hook konstrukcióval (C), vagy a Hook fehérje HA-jellel ellátott centrális coiled-coil doménjével (CC) (D), valamint a Hook HA-nal jelölt N- vagy C-terminusával (E és F). A sejtlizátumokat anti-FLAG ellenanyaggal konjugált agaróz gyöngyökkel inkubáltuk, majd a gyöngyhöz kötődött fehérjéket Western blottal mutattuk ki. Az ábrákon a Rab11-nek megfelelő sávhoz közeli, 25kD-nál található csíkok a gyöngyhöz kötött anti-FLAG ellenanyag könnyű láncát mutatják. Jelmagyarázat: IN: 1% input (a gyöngyhöz adott fehérjeminták), IP: a ko-immunoprecipitáció során a gyöngy által megkötött fehérjék, WB: a Western blot készítése során használt ellenanyag.
64
3.1.7. A Rab11 és a Hook fehérjék eltérő szerepet látnak el az autofágiában
Ezután megvizsgáltuk, hogy a hook (hk) null-mutáns fenotípus hasonló-e a rab11 mutáns sejtekéhez. A kontroll heterozigóta lárvákkal ellentétben a homozigóta hk11 mutáns lárvák zsírtest sejtjeiben mCherry-Atg8-pozitív granulumok jelentek meg jól táplált állatokban is (34. ábra, A és E).
Ezen felül a homozigóta hk11 mutáns sejtekben a P62/Ref(2)P is
felhalmozódott (34. ábra, B és F), ami szintén az autofágia folyamatának hibájára utal. A rab11 mutánsokkal ellentétben azonban a hk11 mutáció nem okozott változást sem a LTR, sem pedig a Rab7 festődési mintázatában (34. ábra, C-D és G-H). Ez azt mutatja, hogy a Hook fehérje hiánya nem gátolja az endoszóma-érés folyamatát. Azt is megvizsgáltuk, hogy a hk11 mutáció befolyásolja-e az amfiszóma-képződést. Azt tapasztaltuk, hogy az mCherry-Atg8a-Rab7 kolokalizáció 47±2.29%-ról 15±1.76%-ra csökkent a hk11 mutáció következtében (34. ábra, I-I’’). Ezek az eredmények azt valószínűsítik, hogy a Rab11-hez hasonlóan a Hook is részt vesz az amfiszóma-képződésben, de míg a Rab11 mind az autofagoszómák, mind a késői endoszómák éréséhez szükséges, addig a Hook serkentő szerepet valószínűleg nem játszik az utóbbi folyamatban. Ez a megfigyelésünk összhangban van egy korábbi tanulmányban közölt eredménnyel, mely szerint a Hook negatívan szabályozza az endoszóma-érést (Narayanan és mtsai, 2000).
65
34. ábra. A Hook fehérje szükséges az autofagoszómák éréséhez, de az endoszómákéhoz nem. (A) mCherry-Atg8a-t (piros) kifejező, jól táplált hk11 heterozigóta (kontroll), illetve homozigóta (hk11) mutáns lárvák zsírtest sejtjeit DAPI-val (kék) festettük. (B) Táplálkozó kontroll, valamint homozigóta hk11 mutáns lárvák zsírtestjén immunhisztokémiai festést végeztünk anti-P62 ellenanyaggal (piros). A sejtmagokat DAPI (kék) jelöli. (C) A hk11 mutációra homozigóta (hk) és heterozigóta (kontroll) táplálkozó lárvák zsírtestjeit LTR-rel (piros) és DAPI-val (kék) festettük. (D) Homozigóta (hk) és heterozigóta (kontroll) táplálkozó lárvák zsírtestjein immunhisztokémiai festést végeztünk anti-Rab7 ellenanyaggal (piros). A sejtmagokat DAPI-val (kék) festettük. (E) Meghatároztuk az mCherry-Atg8apozitív granulum/sejtterület arányt, és Mann-Whitney-teszttel hasonlítottuk össze a két csoport között (Nkontroll=60, Nhk11=59, P<0,0001). (F) A P62-pozitív granulum/sejtterület arány értékeket MannWhitney teszttel hasonlítottuk össze a csoportok között (Nkontroll=50, Nhk11=45, P<0,0001). (G) A LTRpozitív granulum/sejtterület arány értékeket Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a csoportok között (Nkontroll=47, Nhk11=45, P=0,5006). (H) A Rab7-pozitív granulum/sejtterület arány értékeket Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a csoportok között (N kontroll=118, Nhk11=92, P=0,3275). mCherry-Atg8a-t (piros) expresszáló hk11 mutáns (I), illetve kontroll (I’) lárvák zsírtestjén immunhisztokémiai festést végeztünk anti-Rab7 ellenanyaggal (zöld). A sejtmagokat DAPI-val (kék) festettük. Skála: 10µm. (I’’) A Rab7 és az mCherry-Atg8a kolokalizációjának arányát a leírt módon határoztuk meg, majd Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a kontroll és homozigóta mutáns csoportok között (Nkontroll=43, Nhk11=57, P=0,0001). A box plot ábrákon az oszlopok az alsó és felső kvartilisek közé, a függőleges intervallumok pedig az ezeken kívül eső adatokat szemléltetik. A pontok a kilógó adatokat ábrázolják. A *** P<0,001 értéket jelöl, az NS jelölés pedig azt mutatja, hogy a csoportok között nem találtunk szignifikáns különbséget.
66
3.1.8. A Rab11 a Hook lokalizációjának szabályozásán keresztül segíti az endoszóma érés folyamatát
További vizsgálataink a Rab11 és a Hook fizikai kölcsönhatására, illetve a kapcsolat autofágiában betöltött szerepére fókuszáltak. Miután sikerült ecetmuslicában in vitro és in vivo is kimutatnunk, hogy a Rab11 képes kötni a Hook fehérjét, kíváncsiak voltunk arra is, hogy a két fehérje valóban együtt lokalizálható-e a lárvális zsírtest sejtjeiben. Jól táplált állatokban az ektopikusan expresszált Rab11-GFP-re pozitív struktúrák 21±1.5%-a bizonyult Hook-pozitívnak is (35. ábra, A és C). Ez az arány éheztetés hatására bekövetkező autofágiaindukció hatására 45±2.2%-ra emelkedett (35. ábra, B és C), miközben sem a sejtekben található Hook-pozitív granulumok száma, sem pedig a Hook fehérje mennyisége nem mutatott szignifikáns változást (35. ábra, D-E). Miután korábbi eredményeink azt mutatták, hogy autofágia-indukció hatására megváltozik a Rab11 sejten belüli lokalizációja, megvizsgáltuk, hogy kötőpartnere, a Hook mutat-e hasonló lokalizáció-változást. Azt tapasztaltuk, hogy míg jól táplált állatok zsírtest sejtjeiben a Hook-pozitív granulumoknak csak 4±0.4%-a kolokalizált az mCherry-Atg8a markerrel, éheztetés hatására ez az arány közel négyszeresére – 16±1%-ra – nőtt (35. ábra, FH). Ezzel párhuzamosan az autofágia-indukciót követően szignifikáns csökkenést (48±0.9%-ról 13±0.6%-ra) figyeltünk meg a Hook és a késői endoszómákat jelölő Rab7 kolokalizációjában (35. ábra,I-J és L). Mindeközben nem tapasztaltunk változást a sejt Rab7-pozitív struktúráinak számában (35. ábra, M), illetve a Rab11 Rab7-tel való kolokalizációjában sem állt be mérhető változás (35. ábra, N-P). Ezek együttesen azt sugallják, hogy a Hook és mCherry-Atg8a megnövekedett kolokalizációja valószínűleg nem az autofág és az endoszomális útvonalak konvergenciájának felerősödése, hanem az autofágia-indukció mértékének emelkedése miatt következett be. Ezt támasztja alá, hogy a Hook-Rab7 kolokalizáció gyakoriságában megfigyelt, éheztetés hatására bekövetkező szignifikáns csökkenést Atg1-csendesített zsírtest sejtekben nem tudtuk detektálni (36. ábra, A-C). Mivel az Atg1 szükséges az autofágia indukciójához (Chan és Tooze, 2009), ebből azt a következtetést vontuk le, hogy a Hook éheztetés hatására bekövetkező lokalizáció-változása valóban összefügg az autofágia-indukcióval. Együttesen ezek az eredmények tehát azt sugallták, hogy az éheztetéssel indukált autofágia a Hooknak a Rab7-pozitív endoszómákról autofág struktúrákra történő transzlokációját eredményezi.
67
35. ábra. A Hook sejten belüli lokalizációja Rab11-től függő módon változik meg éheztetés hatására I. Rab11-GFP (zöld) markert kifejező, táplálkozó (A) és éheztetett (B) L3 stádiumú lárvák zsírtestjén immunhisztokémiai festést végeztünk anti-Hook ellenanyaggal (piros). A sejtmagokat DAPI-val (kék) festettük. (C) Meghatároztuk a Hook és a Rab11-GFP kolokalizációjának arányát, és az értékeket MannWhitney teszttel hasonlítottuk össze a két csoport között (Ntápl.=132, Néh.=64, P<0,0001). (D) Táplálkozó 1118 és éheztetett w (kontroll) lárvákból származó fehérjeminták Hook és α-tubulin fehérjeszintjeit Western blottal mutattuk ki. (E) Az éheztetett és jól táplált lárvák zsírtest sejtjeiben meghatározott Hook-pozitív granulum/sejtterület arányt Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze (Ntápl.=20, Néh.=20, P=0,5121). mCherry-Atg8a (piros) markert kifejező, táplálkozó (F) és éheztetett (G) L3 stádiumú lárvák zsírtestjén immunhisztokémiai festést végeztünk anti-Hook ellenanyaggal (zöld). A sejtmagokat DAPI-val (kék) festettük. (H) Meghatároztuk a Hook és az mCherry-Atg8a kolokalizációjának arányát, és az értékeket Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a két csoport között (Ntápl.=20, Néh.=20, P<0,0001). Klonálisan Rab7-YFP-t (zöld) expresszáló táplálkozó (I), éheztetett (J) és a klónokban Rab11-csendesített (K) lárvák zsírtestjén immunhisztokémiai festést végeztünk antiHook (piros) ellenanyaggal. A sejtmagokat DAPI (kék) jelöli. (L) A Rab7-YFP és a Hook kolokalizáció arányát az Anyagok és Módszerek fejezetben leírt módon határoztuk meg, majd az értékeket összehasonlítottuk a jól táplált, éheztetett és Rab11-csendesített csoportok között, Kruskal-Wallis tesztet alkalmazva (P<0,0001; Ntápl.=40, Néh.=35, NRNSi=24,a páronkénti összehasonlításokban P<0,0001). (M) A Rab7-YFP-pozitív granulum/sejtterület arányokat Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a jól táplált és éheztetett L3 lárvák zsírtest sejtjeinek csoportjai között (Ntápl.=40, Néh.=35, P=0,0601). Rab7-YFP-t (zöld) expresszáló jól táplált (N) és éheztetett (O) L3 stádiumú lárvák zsírtest sejtjein anti-Rab11 ellenanyaggal (piros) végeztünk immunhisztokémiai festést. A sejtmagokat
68
DAPI (kék) jelöli. Skála: 10µm (P) Meghatároztuk a Rab7-YFP és a Rab11 kolokalizációjának arányát jól táplált és éheztetett állatok zsírtest sejtjeiben, majd ezeket az értékeket Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze (Ntápl.=41, Néh.=39, P=0,3213). A box plot ábrákon az oszlopok az alsó és felső kvartilisek közé, a függőleges intervallumok pedig az ezeken kívül eső adatokat szemléltetik. A pontok a kilógó adatokat ábrázolják. A *** P<0,001 értéket jelöl, az NS jelölés pedig azt mutatja, hogy a csoportok között nem találtunk szignifikáns különbséget.
Ezután következő vizsgálataink elsősorban arra irányultak, hogy a Rab11 maga, illetve a Rab11-Hook kölcsönhatás valóban szükséges-e a Hook lokalizációjának megváltozásához. Rab11-csendesített sejtekben a Hook-Rab7 kolokalizáció erőteljes növekedése - 65±1.3%, szemben a kontroll sejtekben tapasztalható 48±0.9%-kal - azt jelezte, hogy Rab11 hiányában a Hook Rab7-tel dekorált késői endoszómákon halmozódik föl (35. ábra, K-L). Sőt, a Rab11csendesített sejtekben a Hook-mCherry-Atg8a kolokalizáció autofágia-indukció hatására bekövetkező változását sem tudtuk kimutatni (36. ábra, D-F). Az éheztetésre adott válasz során a vadtípusú Rab11-et klonálisan túltermelő zsírtest sejtekben ugyanakkor jelentősen megnőtt a Hook-mCherry-Atg8a kolokalizáció aránya (4±4%-ról 52±8.1%-ra) (36. ábra, G-H és O), és ezzel párhuzamosan lecsökkent a Hook-Rab7-YFP kolokalizáció gyakorisága (42±7.9%ról 16±5.1%-ra) (36. ábra, I-J és O). A GDP-kötött, domináns negatív hatású Rab11 fehérjét túltermelő sejtekben viszont az éheztetéssel történt autofágia-indukció nem okozott szignifikáns változást
sem
a Hook-mCherry-Atg8a, sem
pedig a Hook-Rab7-YFP
kolokalizációjában (36. ábra, K-O). Miután tisztáztuk, hogy a Rab11 a Hookkal való kapcsolatán keresztül is befolyásolja az autofágia késői lépéseit, igyekeztünk megvizsgálni, hogy pontosan milyen hatást gyakorol a Hook fehérjére a Rab11-hez való kötődés. Korábbi ko-immunprecipitációs vizsgálataink során a feltérképeztük a Hook fehérje Rab11 kötőhelyét, amely a homodimerizációért felelős, centrális coiled-coil doménben található. Ezért megvizsgáltuk, hogy a Rab11-nek van-e hatása az endogén és a transzgénikus eredetű, FLAG-gel jelölt Hook fehérjék homodimerizációjára. Az endogén Hook (72 kDa) jelenléte a precipitátumban mutatja a dimerek jelenlétét. Azt tapasztaltuk, hogy a Rab11-et kifejező lárvákban éheztetés hatására csökken a Hook és a Hook-FLAG közötti homodimer-képződés. Rab11-csendesített lárvák zsírtestjében azonban nem tapasztaltunk hasonló változást éheztetést követően (37. ábra, A). Ez azt sugallja, hogy az éheztetés hatására a Hook inkább a Rab11-gyel képez heterodimert a homodimer formálás helyett.
69
36. ábra. A Hook sejten belüli lokalizációja Rab11-től függő módon változik meg éheztetés hatására II. Jól táplált (A) és éheztetett (B) L3 stádiumú lárvák zsírtestjének Rab7-YFP-t (zöld) expresszáló Atg1csendesített klónsejtjein immunhiszokémiai festést végeztünk anti-Hook ellenanyaggal (piros). A sejtmagokat DAPI-val (kék) festettük. (C) A Hook és Rab7-YFP-kolokalizáció arányát Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a két csoport között (Ntápl.=48, Néh.=32, P= 0,2932). mCherry-Atg8a-t (piros) kifejező táplálkozó (D) és éheztetett (E) lárvák zsírtestjének Rab11-csendesített klónsejtjeit anti-Hook ellenanyaggal (zöld) festettük. A sejtmagokat DAPI (kék) jelöli. (F) A Hook és mCherry-Atg8akolokalizáció arányát Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a két csoport között (Ntápl.=11, Néh.=16, P=0,5372). mCherry-Atg8a markert (piros) kifejező, a zöld klónsejtekben vadtípusú Rab11 fehérjét túltermelő (Rab11VT↑) jól táplált (G) és éheztetett (H) L3 stádiumú lárvák zsírtestjét immunhisztokémiai eljárással festettük anti-Hook ellenanyaggal (zöld). A sejtmagokat DAPI-val (kék) festettük. mCherry-Atg8a markert (piros) kifejező, a zöld klónsejtekben domináns negatív Rab11 fehérjét túltermelő (Rab11DN↑) jól táplált (I) és éheztetett (J) L3 stádiumú lárvák zsírtestjét immunhisztokémiai eljárással festettük anti-Hook ellenanyaggal (zöld). A sejtmagokat DAPI-val (kék) mutattuk ki. Klonálisan Rab7-YFP markert (zöld) kifejező és ugyanakkor vadtípusú Rab11 fehérjét is túltermelő (Rab11VT↑) jól táplált (K) és éheztetett (L) L3 stádiumú lárvák zsírtestjét immunhisztokémiai eljárással festettük anti-Hook ellenanyaggal (piros). A sejtmagokat DAPI (kék)
70
jelöli. Klonálisan Rab7-YFP markert (zöld) kifejező, emellett domináns negatív Rab11 fehérjét is túltermelő (Rab11DN↑) jól táplált (M) és éheztetett (N) L3 stádiumú lárvák zsírtestjét immunhisztokémiai eljárással festettük anti-Hook ellenanyaggal (piros). A sejtmagokat DAPI (kék) jelöli. A Hook mCherry-Atg8a-val, illetve Rab7-YFP-vel való kolokalizációjának arányát Mann-Whitney teszttel hasonlítottuk össze a táplálkozó (tápl.) és éheztetett (éh.) csoportok között (Hook-Atg8a: Rab11VT↑: Ntápl.=33, Néh.=30, P<0,0001; Rab11DN↑: Ntápl.=10, Néh.=14, P=0,7252; Hook-Rab7: Rab11VT↑: Ntápl.=49, Néh.=36, P<0,0001; Rab11DN↑: Ntápl.=13, Néh.=16, P=0,2729). A box plot ábrákon ***-gal jelöltük a P<0,001 értéket és NS-sel a nem szignifikáns különbségeket.
Mint fentebb már utaltunk rá, egy korábbi tanulmány felvetette, hogy a Hook fehérje nagy valószínűséggel gátolja az endoszóma-érés folyamatát (Narayanan és mtsai, 2000). Ezzel összhangban sikerült kimutatnunk, hogy Rab7-pozitív struktúrák halmozódnak föl a teljes hosszúságú Hook fehérjét túltermelő klónsejtekben (37. ábra, B és D). Ráadásul ugyanezekben a sejtekben az mCherry-Atg8a-pozitív granulumok számában is tapasztaltunk mérsékelt, de szignifikáns növekedést (37. ábra, C-D). Krämer és Phistry munkája szerint a Hook N-terminális doménje képes kötődni a mikrotubulusokhoz (Krämer és Phistry, 1999). Kimutattuk, hogy a Hook N-terminusa fizikai interakcióba lép az α-tubulinnal (37. ábra, H-I). Az N-terminálisan csonkolt Hook klonális túltermelése pedig nem okozott változást a zsírtest sejtek mCherry-Atg8a- és Rab7mintázatában sem (37. ábra, E-G). Eredményeink együttesen azt támasztják alá, hogy autofágia-indukció hatására megváltozik a Hook fehérje sejten belüli lokalizációja: a késői endoszómákról autofág struktúrákra helyeződik át. Ehhez a folyamathoz szükséges a Rab11 jelenléte, illetve a két fehérje fizikai interakciója. Valószínűsíthető, hogy kölcsönhatásukon keresztül a Rab11 gátolja a Hook endoszóma-érésre gyakorolt gátló hatását, ily módon segítve elő az endoszómák érési folyamatát.
71
37. ábra. A Rab11-Hook interakció endoszóma érésre gyakorolt hatása. (A) Jól táplált és éheztetett kontroll és Rab11-csendesített L3 stádiumú lárvák zsírtestjéből származó fehérjemintákat anti-FLAG ellenanyaggal konjugált agaróz gyöngyökkel inkubáltuk. Az állatok egy csoportja Hook-FLAG transzgént expresszált, a másik csoport nem. A gyöngyhöz kötött fehérjéket, illetve a lizátumok Hook és Rab11 fehérjeszintjeit Western blottal mutattuk ki. (B) Jól táplált L3 stádiumú lárvák zsírtestjének teljes hosszúságú Hook fehérjét túltermelő (GFP-pozitív, zöld) klónsejtjeit és az ezeket körülvevő kontroll sejteket anti-Rab7 ellenanyaggal (piros) festettük. A sejtmagokat DAPI (kék) jelöli. (C) mCherry-Atg8a-t expresszáló, jól táplált L3 stádiumú lárvák kontroll és a teljes hosszúságú Hook fehérjét túltermelő (zöld) zsírtest sejtjeit DAPI-val (kék) festettük. (D) Meghatároztuk a Rab7-, illetve mCherry-Atg8apozitív granulum/sejtterület arányt a teljes hosszúságú Hookot túltermelő klónokban és a szomszédos kontroll sejtekben. Az így kapott értékeket kétmintás Wilcoxon-teszttel hasonlítottuk össze a két csoport között (Rab7: N=18, P=0,0002; Atg8: N=29, P<0,0001). (E) Meghatároztuk a Rab7-, illetve mCherry-Atg8a-pozitív granulum/sejtterület arányt az N-terminálisan csonkolt Hook fehérjét túltermelő klónokban és az őket körülvevő kontroll sejtekben. Az így kapott értékeket kétmintás Wilcoxon-teszttel hasonlítottuk össze a két csoport között (Rab7: N=22, P= 0,8838; Atg8: N=20, P=0,4955). A box plot ábrákon a szürke oszlopok a kontroll sejtek csoportjait jelölik, a zöldek pedig a különböző Hook transzgéneket kifejező klónsejtek csoportjait. Az NS jelölés azt mutatja, hogy nincs
72
szignifikáns különbség a csoportok között, a *** pedig P<0,001 értéket jelent. (F) Jól táplált L3 stádiumú lárvák zsírtestjének N-terminálisan csonkolt Hook fehérjét túltermelő (GFP-pozitív, zöld) klónsejtjeit és az ezeket körülvevő kontroll sejteket anti-Rab7 ellenanyaggal (piros) festettük. A sejtmagokat DAPI (kék) jelöli. (G) mCherry-Atg8a markert kifejező, jól táplált L3 lárvák kontroll és Nterminálisan csonkolt Hook fehérjét túltermelő (zöld) zsírtest sejtjeit DAPI-val (kék) festettük. D.Mel-2 sejteket teljes hosszúságú Hook (H), illetve N-terminálisan csonkolt Hook (I) konstrukciókkal transzfektáltunk. A sejtlizátumokat anti-HA-nal konjugált agaróz gyöngyökkel inkubáltuk, a gyöngyhöz kötődött fehérjéket Western blottal mutattuk ki. IN: 1% input, IP: a gyöngyhöz kötött fehérjék.
73
3.2. Az autofágia és az ubiquitin-proteaszóma rendszer kapcsolatának vizsgálata 3.2.1. A proteaszóma-működés hibája a sejtméret csökkenéséhez vezet
A CL1-GFP fúziós fehérje a proteaszómák mesterséges szubsztrátja. Az alapállapotban stabil GFP-re illesztett degradációs szignál hatására a marker - kifejeződése után röviddel - a proteszomális lebontás útjára terelődik. Ennek köszönhetően a sejtekben mérhető CL1-GFP mennyisége információt nyújt a proteaszómák aktivitásáról (Pandey és mtsai, 2007). 20 különböző proteaszóma alegység csendesítésének a CL1-GFP mintázatára gyakorolt hatását vizsgáltuk jól táplált L3 stádiumú Drosophila lárvák zsírtestsejt-klónjaiban. A CL1-GFP a kontroll sejtekben gyenge, diffúz citoplazmatikus jelet mutatott (38. ábra, A). Ez arra utal, hogy a fúziós fehérje valóban gyorsan lebomlik a jól működő proteaszómákban, így csak alacsony mennyiségben van jelen a sejtekben. A különböző proteaszóma alegységek csendesítésének hatására azonban nagyméretű, CL1-GFP-tartalmú granulumok halmozódtak fel (38. ábra, B-F), ami a proteaszomális lebontás zavarát jelzi. Ezzel párhuzamosan azt is megfigyeltük, hogy a legtöbb proteaszomális gén csendesítése jelentős változást okoz a lárvális zsírtestsejtek méretében. Kimutattuk, hogy a CL1-GFP jel intenzitása és a sejtméret negatív korrelációs viszonyban áll egymással, vagyis a kisebb sejtekben nagyobb mértékű a CL1-GFP felhalmozódása (38. ábra, G). Ez az eredmény azt sugallja, hogy a proteaszomális rendszer megfelelő szintű működése nélkülözhetetlen a lárvális zsírtestsejtek megfelelő növekedéséhez. A további kísérletekhez öt RNS interferencia indukálására alkalmas transzgénikus Drosophila vonalat használtunk, amelyekben lehetőség van a proteaszomális alegységek különböző típusú alegységeinek génjeinek csendesítésére. A 20S komplex Prosα1, Prosα5, Prosβ2 alegységeit, valamint a 19S szabályozó komplex Rpt1, ATPáz típusú és RPn2, nemATPáz típusú alegységeit csendesítő vonalakat választottuk.
74
38. ábra. A proteaszóma-működés korrelál a sejtmérettel. Jól táplált L3 stádiumú lárvák zsírtestjének kontroll (A) illetve a feltüntetett proteaszomális alegységre csendesített klónsejtjei (B-F). A sejtek CL1GFP-t, valamint a (B-F) képeken a megfelelő RNS interferenciát biztosító transzgént is kifejezik (zöld). A sejtmagokat DAPI-val (kék) festettük. Skála: 20µm. (Nagy Péter, Pircs Karolina és Varga Ágnes készítményei és felvételei.) (G) Meghatároztuk a kontroll és proteaszóma alegység-csendesített sejtek területét és a CL1-GFP jel intenzitását, majd ezek korrelációját vizsgáltuk minden rendelkezésre álló adatot felhasználva. A pontok a mért értékeket jelölik, a piros vonal pedig az adatokra illesztett inverz -0.801±0.44 exponenciális görbe, melynek egyenlete 0.613±0.167*e , t= -18,216 és P<0,0001. (A t érték arról informál, mennyire térnek el a pontok az illesztett görbétől, a P érték a szignifikancia-szintet jelzi.)
75
3.2.2. A proteaszóma alegységek csendesítése P62-tartalmú granulumok felhalmozódásához vezet
Anti-P62 ellenanyaggal végzett immunhisztokémiai festéseink azt mutatták, hogy azokban a zsírtestsejtekben, melyekben különböző proteaszóma alegységek génjeit klonálisan csendesítettük, hatalmas, nagy mennyiségű P62 fehérjét is tartalmazó fehérjeaggregátumok halmozódnak föl. Azt is tapasztaltuk, hogy a P62 sosem lokalizálódott együtt a lizoszomális markerként használt Lamp1-GFP-vel (39. ábra, A-E). Ez arra utal, hogy a fehérjeaggregátumok valószínűleg a citoplazmában alakultak ki, és nem autolizoszómák belsejében halmozódnak föl. A P62-pozitív granulumok száma és mérete - a CL1-GFP-hez hasonlóan - negatívan korrelált a sejtmérettel, azaz a kisebb sejtekben nagyobb mértékű P62 felhalmozódást tapasztaltunk (39. ábra, F).
76
39. ábra. A proteaszóma alegység-csendesített sejtek mérete korrelál a P62 fehérje felhalmozódásával. (A-E) Jól táplált L3 stádiumú lárvák Lamp1-GFP-t (zöld) kifejező zsírtestsejtjei, melyekben a feltüntetett proteaszomális alegységek génjeit is csendesítettük. A zsírtesteket anti-P62 ellenanyaggal (piros) és DAPI-val (kék) festettük. A főkép bekeretezett részletei kinagyítva láthatók a kis képeken. Ezek felülről lefelé sorrandben a következőket mutatják: (1) kompozitkép, amely mindárom csatornát tartalmazza, (2) piros csatorna (anti-P62), (3) zöld csatorna (anti-Lamp1). Skála: 20µm. (Nagy Péter, Pircs Karolina és Varga Ágnes készítményei és felvételei.) (F) A sejtek területét és a bennük található P62-pozitív granulumok méretének arányát meghatároztuk, és ezek korrelációját vizsgáltuk, minden csoport rendelkezésre álló adatait felhasználva. A pontok a mért értékeket jelölik, a piros vonal pedig az adatokra illesztett inverz exponenciális görbe, melynek -2.127±0.131 egyenlete 3222.058±2489.397*e , t= 16,225 és P<0,0001. (A t érték arról informál, mennyire térnek el a pontok az illesztett görbétől, a P érték a szignifikancia-szintet jelzi.)
77
3.2.3. A proteaszómák hibás működése felerősíti az autofágiát
A különböző proteaszóma alegységek csendesítésének hatására a LTR-pozitív granulumok száma jelentősen növekedett a lárvális zsírtest klónsejtjeiben. Ezt a számbeli növekedést mind alapszintű, mind éheztetéssel indukált autofágia során megfigyelhettük (40. ábra, A-J). Ezek az eredmények - más autofágia-markerekkel végzett vizsgálatokkal együtt - azt támasztják alá, hogy a proteaszomális működés hibája az autofág folyamatok felerősödéséhez vezet. Kimutattuk, hogy a sejtméret negatív korrelációs viszonyban van a sejtek LTR-pozitív struktúráinak számával: a kisebb méretű sejtekben magasabb autofág aktivitás tapasztalható (40. ábra, K).
40. ábra. A sejtméret változása negatívan korrelál a LTR-pozitív struktúrák számával. (A-J) Jól táplált L3 lárvák zsírtestjének Lamp1-GFP-t (zöld) kifejező klónsejtjei, melyekben a feltüntetett proteaszomális alegységek génjeit is csendesítettük. A zsírtesteket LTR-rel (piros) és DAPI-val (kék) festettük. A főkép bekeretezett részletei kinagyítva láthatók a kis képeken. Ezek felülről lefelé sorrandben a következőket mutatják: (1) kompozitkép, amely mindárom csatornát tartalmazza, (2) piros csatorna (LTR), (3) zöld csatorna (anti-Lamp1). Skála: 20µm. (Nagy Péter, Pircs Karolina és Varga Ágnes készítményei és felvételei.) (F) Meghatároztuk a sejtterület változását és a sejtekben található LTR-pozitív granulumok/sejtterület arányt, és ezek korrelációját vizsgáltuk, az összes csoport rendelkezésre álló adatait felhasználva. A pontok a mért értékeket jelölik, a piros vonal pedig az adatokra illesztett inverz -0.012±0.002 exponenciális görbe, melynek egyenlete 1.015±0.002*e , t= -7,645 és P<0,0001. (A t érték arról informál, mennyire térnek el a pontok az illesztett görbétől, a P érték a szignifikancia-szintet jelzi.)
78
4. Az eredmények megvitatása 4.1. Az autofágia kapcsolata az endo-lizoszómás rendszerrel: a Rab11 közvetítő szerepe Az autofágia és az endo-lizoszomális rendszer több kapcsolódási pontja régóta ismert. A két folyamatot összeköti egymással a közös membránforrás és a közös molekuláris szereplők (Mari és mtsai, 2011; Lamb és mtsai, 2013). Felvetődött az a lehetőség is, hogy létezik egy molekuláris közvetítő mechanizmus, amely megteremti a két útvonal összehangolt finomszabályozásának lehetőségét, de ez idáig nem írtak le ilyet. A Rab11 kis G-fehérje mindkét útvonal ismert résztvevője, de az autofágiában betöltött szerepével kapcsolatos, főként különböző sejttenyészeteken végzett munkákból született eredmények nem egyértelműek. Több tanulmány is arra utal, hogy a Rab11 az autofagoszómák érési folyamata során nélkülözhetetlen (Fader és mtsai, 2008; Richards és mtsai, 2011). Mások szerint az autofagoszóma képződési helyére történő membrán-szállítás egyik kulcsszereplője (Longatti és mtsai, 2012; Knævelsrud és mtsai, 2013). Ennek a kettősségnek a feloldását célozták meg az in vivo modellrendszerben, a Drosophila melanogaster lárvális zsírtestjén kivitelezett vizsgálataink. Kimutattuk, hogy a működőképes Rab11 fehérje hiánya abnormális autofagoszómák és elsavasodott késői endoszómák felhalmozódásához vezet. A jelenség hátterében az amfiszóma-képződés elégtelen működése állhat. Ezen felül megfigyeltük, hogy aminosavmegvonással történő autofágia-indukció során a Rab11 TfR-pozitív reciklizáló endoszómákról Atg8a-pozitív autofagoszómákra helyeződik át. Ez az eredményünk összhangban van azokkal a
korábbi
tanulmányokkal,
melyek
kimutatták,
hogy
a
reciklizáló
endoszómák
membránforrásként szolgálnak a formálódó autofagoszómák számára, és emlőssejtekben a Rab11 részt vesz az RE-kről a PAS-hoz történő vezikula-szállításban (Longatti és mtsai, 2012; Puri és mtsai, 2013). Párhuzamosan egy ecetmuslica modellen végzett tanulmányban is kimutatták a reciklizáló endoszómákról az autofagoszómák képződési helyére történő membránszállítást, amelyben az endocitózisban szerepet játszó SNX18 (sorting nexin 18) Drosophila homológja mellett a Rab11 is részt vesz (Knævelsrud és mtsai, 2013). Ezek a munkák azt támasztják alá, hogy a Rab11 nélkülözhetetlen az autofágia korai lépéseihez, hiszen a fagofór növekedéséhez szükséges membrán-utánpótlásban játszik szerepet. Mindezek ellenére mi mégsem tapasztaltuk autofagoszóma-képződési hibát a Rab11 fehérjét nem vagy csak kis mértékben expresszáló sejtekben. A látszólagos ellentmondás valószínűleg az autofág membrán pontos eredetére irányuló ismereteink hiányával 79
magyarázható. Az autofagoszóma-képződés folyamata mögött meghúzódó pontos molekuláris mechanizmus ugyanis máig ismeretlen. A formálódó autofagoszóma számára membránt szolgáltató forrásokat tekintve pedig a reciklizáló endoszómákon kívül számos kompartimentum szóba jöhet, és az ezeket alátámasztó kísérletes bizonyítékok is napvilágot láttak már (Mari és mtsai, 2011). Például több, különböző emlős sejttípusokat vizsgáló tanulmány szerint az ER nemcsak membránt szolgáltat az autofagoszómák kialakulásához, de speciális helyei, az úgynevezett omegaszómák aktívan részt is vesznek a fagofór felépítésének, formálásának folyamatában (Hayashi-Nishino és mtsai, 2009; Ylä-Anttila és mtsai, 2009). Egy NRK58B sejttenyészeten kivitelezett munka szerint pedig a mitokondriumok is szolgálhatnak autofág membránforrásként (Hailey és mtsai, 2010). Ráadásul COS-7 sejteken nemrégiben megfigyelték, hogy az ER-mitokondrium kontakt helyek is részt vesznek az autofagoszóma képződésében (Hamasaki és mtsai, 2013). Ezekkel a tanulmányokkal párhuzamosan jelentek meg azok az eredmények is, melyek szerint a plazmamembrán szolgáltat alapanyagot a fagofór felépítéséhez (Ravikumar és mtsai, 2010; Moreau és mtsai, 2011). Mindezeken felül pedig HEK293 és sörélesztő sejtekben is leírták, hogy az autofagoszómák kettős membránja a Golgi-készülékből származó, Atg9 segítségével a PAShoz szállított vezikulumokból épül föl (Young és mtsai, 2006; Yamamoto és mtsai, 2012). Mindezek az eredmények azt sugallják, hogy a fagofór membránja egyszerre több különböző forrásból is származhat, és az egyes források hozzájárulásának mértéke sejttípusonként eltérő lehet. Ecetmuslicában sajnos igen kevés információ áll a birtokunkban erről a kérdésről. Elképzelhető, hogy a RE részt vesz az autofagoszóma képződésének folyamatában, de nem a kettős membrán legfőbb forrásaként szolgál. Ez a feltevés magyarázatot adhat arra, hogy kísérleteink során miért nem tapasztatuk az autofagoszóma kialakulásának gátlását elegendő működőképes Rab11 fehérje hiányában. Ugyanakkor kimutattuk, hogy a Rab11 - Drosophila sejttenyészetben és teljes állatban egyaránt - fizikai kontaktust létesít mind az ektopikusan expresszált, mind az endogén Hook fehérjével. Ez az eredmény megerősít egy korábbi, COS-1 emlős sejttenyészeten végzett tanulmányt, amely transzgénikus eredetű Rab11 és Hook fehérjék interakcióját mutatta ki (Luiro és mtsai, 2004). Ezt követően megvizsgáltuk a hook mutáns lárvák fenotípusát. A Rab11-csendesített és mutáns fenotípusú lárvákkal ellentétben hk mutánsokban az amfiszómaképződés hibája nem járt együtt késői endoszómák felhalmozódásával. Ezekkel az eredményeinkkel összhangban van az a régebbi megfigyelés, hogy a Hook szükséges az érett késői endoszómák (MVB-k) fenntartásához, hiszen ugyanezekben a hk11 mutánsokban ezen struktúrák teljesen hiányoztak a sejtekből (Sunio és mtsai, 1999). Miután megfelelő
80
mennyiségű érett késői endoszóma jelenléte viszont szükséges az autofágia érési lépéseihez, így hiányuk az autofagoszómák felhalmozódásához vezet. Eredményeink rávilágítanak az autofagoszómák és endoszómák érésének egy érdekes mozzanatára. A Hook és Rab11 fizikai interakciója ugyanis egyformán szükséges mindkét útvonal érési lépéseihez. Az éheztetéssel történő autofágia-indukció növelte a Hooknak a Rab11 és az Atg8a fehérjékkel való kolokalizációjának arányát, míg ezzel párhuzamosan, hasonló körülmények között a Hook és Rab7 fehérjék kolokalizációjának szignifikáns csökkenését detektáltuk. További eredményeinkkel együtt mindez azt sugallja, hogy autofágia-indukció során a Hook Rab11-függő módon helyeződik át a Rab7-pozitív késői endoszómákról Atg8a-pozitív autofág struktúrákra. Ezt támasztja alá az is, hogy Rab11csendesített sejtekben azt láthattuk, hogy a Hook felhalmozódott a Rab7-jelölt LE-kon. Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a Hook negatívan szabályozza az endoszómák érését (Narayanan és mtsai, 2000). Ráadásul a Hook-szerű Acinus fehérje részt vesz az endoszóma-érés és autofágia folyamatában is (Haberman és mtsai, 2010). Ezekkel a munkákkal összhangban azt találtuk, hogy a teljes hosszúságú Hook fehérje túltermeltetése a Rab11-csendesítéshez nagyon hasonló fenotípusos változást okoz a különböző endocitózisés autofágia-markerek sejten belüli mintázatában. Azt is sikerült kimutatnunk, hogy a Hook N-terminusa szükséges ezen negatív szabályozó hatás kifejtéséhez. Eredményeink együttesen azt erősítik, hogy a Rab11 kulcsszerepet játszik a Hook eltávolításában a késői endoszómák felszínéről, ami lehetővé teszi azok érését és lizoszómákkal való fúzióját. A korábbi ismeretek és saját eredményeink alapján kidolgoztunk egy modellt, amely egy, az endoszomális és autofág útvonalak között közvetítő mechanizmus létét feltételezi (41. ábra). Elméletünk a következő: mivel éheztetés során a felerősödő autofágia-indukció hatására nagyobb számban keletkeznek autofagoszómák, az autofágia további érési lépéseihez az endo-lizoszomális „bemenet" növekedése szükséges. Ezt biztosítja a Rab11 azáltal, hogy eltávolítja a Hook-ot a késői endoszómákról, amivel lehetővé teszi érésüket és autofagoszómákkal való fúziójukat.
81
41. ábra. A Rab11-Hook interakció autofagoszóma-érésre gyakorolt hatásának modellje. Tápanyagban dús körülmények között a Rab11 (11) a reciklizáló endoszómákon (RE) található, a Hook pedig mikrotubulusokhoz (MT) horgonyozza a késői endoszómákat (LE), ezzel gátolva azok érését. Az éheztetés hatására autofágia indukálódik. Ez a Rab11 RE-kről autofagoszómákra (AP) történő áthelyeződéséhez vezet. A Rab11 ezt követően fizikai kötést létesít a Hookkal, és így eltávolítja azt a késői endoszómákról. Ez lehetővé teszi a késői endoszómák érési folymatának befejeződését és autofagoszómákkal történő fúziójukat.
Továbbra is nyitott kérdés marad, hogy miért nem gátolja a Hook az autofagoszómák érését, miközben jelenléte kimutatható a felszínükön. Egy lehetséges választ adhatnak erre a kérdésre a Hook fehérje Rab11-kötőhelyének térképezésére irányuló kísérleteink eredményei. Azt találtuk, hogy a Rab11-kötéshez a Hook 180.-530. aminosavait magában foglaló, centrális helyzetű coiled-coil doménje szükséges. Korábban kimutatták, hogy ez a szerkezeti egység biztosítja a Hook fehérje homodimerizációját, amely valószínűleg szükséges gátló
hatásának
kifejtéséhez
(Krämer
és
Phistry,
1999).
Elképzelhető,
hogy
a
homodimerizáció és a Rab11-kötés a Hook coiled-coil doménjének egymást kölcsönösen kizáró funkciói. Ezt a jelenséget már leírták a Rab11 egy másik kötőpartnere, a FIP2 fehérje esetében (Wei és mtsai, 2006). Sikerült ezt a feltevést alátámasztanunk, mert kimutattunk, hogy a Rab11-kötés csökkenti a sejtben homodimer formában előforduló Hook mennyiségét. Összefoglalva:
eredményeink
azt
sugallják,
hogy
a
Rab11
csökkenti
a
Hook
homodimerizációját és ezzel az endoszóma-érésre gyakorolt gátló hatását; ezen a mechanizmuson keresztül tehát a Rab11 elősegíti az autofágia érési folyamatát.
82
4.2. Az autofágia kapcsolata az ubiquitin-proteaszóma rendszerrel Az autofágia és az ubiquitin-proteaszóma rendszer a sejtek párhuzamosan működő lebontó folyamatai. Az autofágia is részt vesz a fehérjék minőségellenőrzésében és a hibás térszerkezetű, valamint elöregedett proteinek eltávolításában, ezen keresztül is segíti a sejt homeosztázisának szabályozását. Míg az autofág lebontás történhet szelektív és nemszelektív módon, addig az UPS szelektíven degradálja a poliubiquitin jellel ellátott fehérjéket (Finley, 2009). Sok esetben a szelektív autofágia kargóit is ubiquitin jelöli ki és segíti az autofagoszómába való bekerülését (Kirkin és mtsai, 2009b). Citoprotektív szerepükből adódóan mindkét folyamat hibája többféle betegség kialakulásához vezethet. Több neurodegeneratív betegség jellemző tünete az aggregációra hajlamos ubiquitinált fehérjék felhalmozódása, melyeket a proteaszómák képtelenek lebontani (Ciechanover és Brundin, 2003; Layfield és mtsai, 2005). Megfigyelték, hogy ilyen esetekben az autofágia aktivitásának növekedése képes enyhíteni a betegség tüneteit, esetleg gátolni annak progresszióját. Ez a jelenség azt mutatja, hogy bizonyos fehérjék mindkét folyamatnak szubsztrátjai lehetnek (Korolchuk és mtsai, 2010; Lamark és Johansen, 2010; Wong és Cuervo, 2010). Ráadásul több tanulmány is kimutatta, hogy az autofágia alulműködése ubiquitinált fehérjéket is tartalmazó aggregátumok képződéséhez, és ennek következtében neurodegenerációhoz vezet Drosophila és emlős modellekben egyaránt (Juhász és mtsai, 2007; Simonsen és mtsai, 2008; Hara és mtsai, 2006; Komatsu és mtsai, 2006, 2007). Vannak arra utaló eredmények is, hogy a két folyamat nemcsak szubsztrátspecificitásában fed át egymással, hanem szabályozási mechanizmusuk is összefonódik. Pandey és munkatársai kimutatták, hogy emlőssejtekben az UPS elégtelen működése fokozza az autofágia aktivitását (Pandey és mtsai, 2007). Drosophila lárvális zsírtestjén végzett vizsgálataink azt mutatták, hogy a proteaszóma egyes, eltérő funkcióval rendelkező alegységeinek csendesítése egyaránt a sejtméret csökkenésével jár. Azt tapasztaltuk, hogy ugyanakkor a kisebb méretű sejtekben nagyobb mennyiségű CL1-GFP fúziós fehérje halmozódik fel, amelynek mértéke a proteaszomális lebontás hibájának súlyosságáról informál. Ezek az eredmények tehát arra utalnak, hogy minél erősebben csökken a proteaszomális lebontás aktivitása egy sejtben, annál kisebb lesz a mérete. Érdekes összefüggést mutattunk ki a sejtméret és a sejtben található savas (LTR-pozitív) autofág struktúrák száma között. A kisebb sejtekben nagyobb autofág aktivitásra utaló
83
jeleket találtunk. Az előző eredmények fényében ebből arra lehet következtetni, hogy minél nagyobb mértékű a proteaszómák inaktivációja, annál nagyobb az autofágia szintjének emelkedése és annál erősebb a sejtnövekedésben tapasztalható defektus. Ezen kívül - a sejtméret csökkenésével arányosan - a P62-t is tartalmazó fehérjeaggregátumok felhalmozódását is megfigyeltük a lárvális zsírtest sejtjeiben. Ez arra utal, hogy bár a proteaszomális degradáció hibája az autofág aktivitás növekedéséhez vezet, az autofágia mégsem képes maradéktalanul eltávolítani a sejtekből az akkumulálódó fehérjeaggregátumokat. Eredményeink tehát azt mutatják, hogy az autofágia és az ubiquitin-proteaszóma rendszer kölcsönhatását biztosító szabályozási mechanizmusok valószínűleg a Drosophila modellállatban is jelen vannak. Több magyarázat is adható arra, hogy a proteaszóma nem megfelelő szintű működése hogyan vezethet megnövekedett autofág aktivitáshoz. Elképzelhető, hogy az elégtelen proteaszomális lebontás miatt felhalmozódott, a szelektív autofágia számára is felismerhető szubsztrát fehérje erősíti az autofagoszóma-képződés folyamatát. Ennek azonban ellentmond az, hogy korábbi tanulmányok szerint az ubiquitinált kargót felismerő P62 vagy Alfy (ecetmuslicában Ref(2)P, illetve blue cheese) szelektív autofágia receptor túltermelése nem okozott hasonló autofágia-indukciót (Pircs és mtsai, 2012; Simonsen és mtsai, 2004). Egy másik lehetséges magyarázat, hogy a fehérjék proteaszomális degradációja szükséges a sejt megfelelő aminosav-szintjének fenntartásához, és a lebontás csökkenése stresszhatásként autofág reakciót vált ki (Suraweera és mtsai, 2012). Ugyancsak magyarázhatja a jelenséget az is, ha normálisan proteaszomális úton lebomló fehérje vagy fehérjék autofágiát indukáló hatással is rendelkeznek. Ismert proteaszóma szubsztrát a HIF1α, amelyet specifikus ubiquitin ligáza, a VHL tart alacsony szinten. A HIF-1α hipoxia hatására stabilizálódik és a sejtmagba vándorol, ahol hipoxia-indukált gének átírását szabályozza. Ezek a fehérjék segítik a sejt alkalmazkodását és túlélését oxigénszegény környezetben (Benizri és mtsai, 2008). A hipoxiás stressz azonban egyúttal autofágiát is képes indukálni (Bellot és mtsai, 2009; Mazure és Pouysségur, 2010). A folyamat során a HIF-1α az Atg1 (ULK1/2) komplex megkerülésével, különböző autofág gének expressziójának szabályozásán keresztül fejti ki hatását (Zhang és mtsai, 2008). Az is elképzelhető tehát, hogy a proteaszóma működési hibája miatt a sejtekben megnő a HIF-1α mennyisége, és ez okozza az autofágiaindukció felerősödését.
84
5. Anyagok és módszerek 5.1. Drosophila törzsek és fenntartásuk A munkánk során felhasznált RNS interferencia indukálására alkalmas ecetmuslica törzsek (1.
táblázat)
a
Vienna
Drosophila
RNAi
Centre
(Bécs,
Ausztria;
http://stockcenter.vdrc.at/control/main) és a Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington,
Indiana,
USA;
http://flystocks.bio.indiana.edu/)
törzsközpontokból
származnak. Az UAS-Hook-FLAG, UAS-ΔN-Hook-HA és UAS-Rab11-HA transzgéneket hordozó törzseinket a BestGene Inc. (Chino Hills, California, USA; http://www.thebestgene.com/) cég hozta létre a lentebb leírt konstrukciók w[1118] embriókba történt injektálásával. Az állatokat standard élesztő/kukoricaliszt/agar táptalajon tartottuk, 25⁰-on, 50% páratartalom mellett. A termosztátban 12 órás sötét és 12 órás világos periódusok váltották egymást. Ügyeltünk arra, hogy a lárvák ne éljenek zsúfolt körülmények között, ezért a kifejlett állatokat rendszeresen friss táptalajra ráztuk át. A kísérletekben használt jól táplált L3 stádiumú állatok életkora a peterakást követő (after egg laying, AEL) 72-86 óra volt, a vándorlók pedig AEL 96-108 órásak voltak. Éheztetés során jól táplált 72-86 órás lárvákat helyeztünk Eppendorf csövekbe, 20% szacharóz-oldat tetejére. Ezt követően szobahőmérsékleten, ezen körülmények között tartottuk őket 3 órán keresztül, mivel az ilyen hosszú aminosav-megvonás autofágiát indukál a lárvális zsírtest sejtjeiben. Az élethossz-vizsgálatokhoz az eredmények bemutatása során feltüntetett genotípusú törzsekből csövenként 15 nőstény és 10 hím állatot helyeztünk táptalajra, összesen 20 csőben. A szülőket 6 órás, szobahőmérsékleten zajló peterakási periódus után eltávolítottuk, majd a lerakott petéket megszámoltuk. A következő napokban minden jelzett fejlődési stádiumban megszámoltuk az állatokat, és a kapott adatokból meghatároztuk, hogy egy adott fejlődési szakaszban az állatok hány százaléka pusztult el. A csoportokat a lentebb leírt módon hasonlítottuk össze. A homozigóta rab11j2D1 mutáns klónsejtek generálásához a korábban bemutatott Flp-FRT genetikai rendszert használtuk fel, amelynek során a két külön törzsben fenntartott hősokkpromóter-szabályozott Flp helyspecifikus rekombinázt kódoló gént, valamint az enzim FRT nevű célszekvenciáját keresztezéssel ugyanabba az utódba juttatjuk. A munka során létrehoztunk egy törzset, melyben a 3. kromoszómán található rab11j2D1 mutációt egy kromoszómára rekombináltuk a 82B citológiai pozícióban lévő
FRT-hellyel (FRT82B). A 85
rekombináns utódok szelekcióját az FRT82B helyen található neomycin rezisztencia gén és a rab11j2D1 mutációt okozó P-elem tette lehetővé (ez utóbbi úgynevezett „mini-white” szemszín-marker gént is tartalmaz). A szelekcióhoz a válogatni kívánt utódnemzedékeket 25mg/ml G418 antibiotikumot tartalmazó táptalajon tartottuk, amin csak a neomycinre rezisztens állatok voltak képesek túlélni és felnőni, majd a kikelt utódok közül kiválogattuk azokat, amelyek a rab11j2D1 mutánsokra jellemző szemszínt mutatták. Az így létrehozott, az FRT-helyet és a rab11j2D1 mutációt ugyanazon 3. kromoszómán hordozó törzs hímjeit olyan nőstényekkel kereszteztük, amelyek szintén hordoztak a 82B pozícióban FRT-helyet, emellett ugyanazon a kromoszómán egy indukálható
GFP markergént is; ezen kívül az Flp
rekombinázt is expresszálták (lásd 1. táblázat). Az Flp-t kifejező és a homológ kromoszómák ugyanazon pozíciójában FRT helyeket is tartalmazó utódokban véletlenszerűen, és nem túl alacsony gyakorisággal mitotikus rekombináció történhet. Ennek következtében olyan mitotikus klónok jönnek létre, amelynek sejtjeiben a rab11j2D1 mutáció homozigóta formában van jelen, ugyanakkor hiányzik belőlük a GFP-t kódoló gén. Ezek a homozigóta mutáns klónok – miután GFP-t egyáltalán nem expresszálnak -
a zsírtestben jól azonosíthatóak és
vizsgálhatóak, a környező heterozigóta sejteket pedig kontrollként lehet használni. Az Flp-FRT genetikai rendszert klonális expresszióra is felhasználtuk, a térben és/vagy időben irányítható génkifejeződést lehetővé tevő UAS-Gal4 rendszerrel kombinálva. Ekkor az FRT helyek cisz-helyzetben, ugyanazon kromoszómán vannak, és az Flp rekombináz hatására bekövetkező rekombinációs eseménnyel eltávolítható a két FRT-szekvencia közötti DNSszakasz. Ekkor egymás közelébe kerül egy konstitutív promóter és a Gal4 gén kódoló régiója, az expresszálódó Gal4 transzkripciós faktor pedig lehetővé teszi bármely, az UAS szabályozó elem hatása alatt álló gén vagy RNS interferenciát kiváltó konstrukció kifejeződését. A véletlenszerűen aktiválódó Flp rekombináz által random módon létrehozott klónsejtekben az UAS-GAL4 rendszer segítségével a kívánt gén expresszálható vagy RNS interferencia indukálható, míg a környező sejtek, amelyekben az Flp enzim nem aktiválódott, kontrollként használhatóak. Kísérleteink során az Flp-FRT illetve az UAS-Gal4 genetikai rendszer elemeit keresztezéssel kombináltuk össze, és a megfelelő genotípusú utódok zsírtestjét vizsgáltuk. A felhasznált törzseket az 1. táblázat tartalmazza.
86
1. táblázat. A kísérletek során felhasznált Drosophila törzsek. A táblázat első oszlopa tartalmazza az eredmények bemutatása során használt törzs-azonosító neveket illetve azt a genetikai rendszert, amelyben felhasználtuk őket. A második oszlopban a törzs származási helyét adtuk meg. A VDRC rövidítés a Vienna Drosophila RNAi Centre törzsközpontot jelenti, a BDSC pedig a Bloomington Drosophila Stock Center-t. A harmadik oszlop a törzsek pontos genotípusát vagy azonosítószámát tartalmazza. Az adatok a Flybase adatbázisból, illetve a törzseket leíró publikációkból származnak.
A törzs neve/alkalmazása
Referencia
Genotípus / Transzformáns ID
kontroll
BDSC
w[1118]
Rab11 RNSi1
BDSC
JF02812
Rab11 RNSi2
VDRC
GD22198
Rab11 RNSi3
VDRC
KK108382
Rab11 DN(↑)
BDSC
y[1] w[*]; P{w[+mC]=UASp-YFP.Rab11.S25N}06
Rab11
j2D1
BDSC
y[1] w[*]; P{w[+mC]=lacW}Rab11[j2D1]/TM3, Sb[1]
Rab11-GFP
BDSC
w[*]; P{w[+mC]=UAS-Rab11-GFP}2
Rab11VT↑
(Szatmári és mtsai, 2013) (Szatmári és mtsai, 2013)
w[1118]; UAS-Rab11-HA
ΔN Hook↑
(Szatmári és mtsai, 2013)
w[1118]; UAS-Hook248-679-HA
hk11
hk11/CyO
TfR-GFP
(Krämer és Phistry, 1999) BDSC
YFP-Rab7
BDSC
y[1] w[*]; P{w[+mC]=UASp-YFP.Rab7}21/SM5
Vps32 RNSi
VDRC
KK106823
Atg1 RNSi
BDSC
y[1] v[1]; P{TRiP.JF02273}attP2
GFP-Atg8a
(Scott és mtsai, 2007)
UAS-GFP-Atg8a
mCh-Atg8a
(Pircs és mtsai, 2012) (Pulipparacharuvil és mtsai, 2005)
r4-mCh-Atg8a
UAS-Dcr2; Act>CD2>Gal4, UAS-GFPnls
klonális expresszió, GFPAtg8a markerrel
(Scott és mtsai, 2004) (Scott és mtsai, 2007)
klonális expresszió, mCh-Atg8a markerrel
(Pircs és mtsai, 2012)
hs-Flp; UAS-Dcr2; Act>CD2>Gal4, UAS-GFPnls, r4mCh-Atg8a
klonális expresszió, Lamp1-GFP markerrel
(Juhász és mtsai, 2008)
hs-Flp; UAS-Lamp1-GFP; Act>CD2>Gal4, UAS-Dcr2
klonális expresszió, GFPmCh-Atg8a markerrel
(Takats és mtsai, 2013)
hs-Flp; UAS-Dcr2; Act>CD2>Gal4, r4-mCh-GFPAtg8a
mitotikus klónok generálására alkalmas törzs
(Juhász és mtsai, 2008)
hs-Flp; +; r4-Gal4, FRT82B, UAS-GFPnls
Hook↑
Lamp1-GFP klonális expresszió
w[1118]; UAS-Hook1-679-FLAG
w1118; snaSco/CyO; P{UAS-hTfR.GFP}3
UAS-Lamp1-GFP
hs-Flp; UAS-GFP-Atg8a; Act>CD2>Gal4, UAS-Dcr2
87
mitotikus klónok,mChAtg8a markerrel
(Juhász és mtsai, 2008)
hs-Flp; +; r4-Gal4, UAS-mCherry-Atg8a, FRT82B, UAS-GFPnls
cgGal4
BDSC
w[1118]; P{w[+mW.hs]=GawB}c564
hsGal4
BDSC
w[*]; P{w[+mC]=GAL4-Hsp70.PB}2
tubGal4 FRT82B Delta2-3
BDSC BDSC BDSC
Df(3R)-7739 Df(3R)-9487 CL1-GFP
BDSC BDSC (Pandey és mtsai, 2007) VDRC VDRC VDRC BDSC VDRC VDRC VDRC VDRC VDRC VDRC VDRC VDRC VDRC VDRC VDRC VDRC VDRC BDSC VDRC VDRC VDRC VDRC VDRC BDSC
y[1] w[*]; P{w[+mC]=tubP-GAL4}LL7/TM3, Sb[1] P{ry[+t7.2]=neoFRT}82B ry[506] TM3, ry[RK] Sb[1] Ser[1] P{ry[+t7.2]=Delta23}99B/Df(3R)C7, ry[506] Df(3R)Exel6272 Df(3R)ED10845 UAS-GFP-CL1
Prosα1 RNSi Prosα3T RNSi Prosα5 RNSi Prosα6 RNSi Prosα7 RNSi Pros25 RNSi Pros28.1 RNSi Pros29 RNSi Prosβ2 RNSi Prosβ3 RNSi Prosβ4 RNSi Prosβ5 RNSi Prosβ7 RNSi Pros26 RNSi Pros45 RNSi Rpt1 RNSi Rpt3 RNSi Rpt4 RNSi Rpn1 RNSi Rpn2 RNSi Rpn5 RNSi Rpn7 RNSi Rpn9 RNSi Rpn11 RNSi
GD49681 GD32889 KK108380 JF02711 KK102016 KK101409 KK105712 KK104373 KK103575 KK100561 GD19079 KK107628 KK101990 KK105673 KK100620 KK108834 KK100681 HMS00661 KK103939 KK106457 GD18676 KK101467 KK103733 HMS00071
88
5.2. Sejttenyészet és konstrukciók A Drosophila D.Mel-2 sejteket Express Five Serum-Free médiumban (Invitrogen) tenyésztettük. A sejtek transzfekcióját TransIT-2020 (Mirus) reagens felhasználásával végeztük a gyártó javaslatait követve. Az általunk felhasznált konstrukciók kifejeződését indukálható metallotionein promóter (ezután röviden csak pMT) szabályozta, a már ismertetett UAS-Gal4 genetikai rendszer közvetítésével. A pMT a Gal4 transzkripciós faktor termelődését tette lehetővé, amely az UAS szabályozó szekvenciához kötődve indukálta az UAS hatása alatt álló gének kifejeződését. A HA2-679hook, HA248-679hook (ΔN-Hook) és hook1-551MYC (ΔC-Hook) konstrukciókat Helmut Krämer (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas, USA;
(Krämer és Phistry, 1999)) bocsátotta a
rendelkezésünkre. A teljes hosszúságú Hook-ot, valamint a Hook N- és C-terminusát és centrális coiled-coil doménjét, illetve a Rab11 és Lamp1 fehérjéket kódoló szekvenciát az LD05265, illetve GM06568 és RE72002 azonosítószámú Drosophila cDNS-ek alapján amplifikáltuk. A cDNS-eket tartalmazó vektorok a Drosophila Genomics Resource Center-ből (DGRC) származnak (Bloomington, Indiana, USA; https://dgrc.cgb.indiana.edu/Home). Az UAS szekvencia által szabályozott konstrukciókat a pMT-GAL4 (DGRC, ID 1042) vektorral együtt juttattuk a D.Mel-2 sejtekbe. A sejteket minden esetben kb. 2500 ng plazmiddal transzfektáltuk. A sejteket 24-48 órával később 1mM CuSO4-ban inkubáltuk (egy éjszakán át, 27⁰C-on), ezzel indukáltuk a pMT promótert - és közvetve az UAS által szabályozott fehérjetermelést. A konstrukciók készítése során a következő primereket használtuk: a teljes hosszúságú Hook esetében 5’-ATGTCCGCGCCCAAGAACGA-3’ és 5’-ATCCCTTTGATTTCATTGCA-3’; a Rab11 esetében 5’-ATGGGTGCAAGAGAAGACGA-3’ és 5’-ATCCCTGACAGCACTGTTTG-3’; a Lamp1 esetében 5’-ATGTTCGCCAACAAATTGTT-3’ és 5’-ATCCGAAGCTCATGTAACCG-3’. A PCRreakciókhoz Phusion DNA Polymerase (Finnzymes) enzimet használtunk. A transzfekcióra alkalmas vektorok előállítására az Invitrogen helyspecifikus rekombináción alapuló Gateway rendszerét használtuk. A PCR-termékeket XmnI és EcoRV restrikciós endonukleázokkal felnyitott pENTR1A vektorba klónoztuk. Az így létrejövő úgynevezett Entry klónokat a megfelelő célvektorokkal rekombináltuk. A reakcióhoz LR Clonase Enzyme Mix-et (Invitrogen) használtunk. C-terminális FLAG-jel esetében a pTWF, C-terminális HA-jel esetében pedig a pTWH elnevezésű vektort használtuk.
89
A Hook fehérje Rab11-kötőhelyének térképezése során a Hook coiled-coil doménjét (180530. aminosav), illetve N- és C-terminusát (2-179. és 531-679. aminosav) kódoló szekvenciát szintén az LD05265 cDNS-ről sokszorosítottuk a következő primereket felhasználva: a coiledcoil
domén
esetében
CTATTGTTTACCAAACTCGCTCTC-3’;
5’-CTGGACAGCAAGGCAGTTCAG-3’ az
N-terminus
esetében
és
5’5’-
TCCGCGCCCAAGAACGAGATG-3’ és 5’-TTGTTTACCAAACTCGCTCTC-3’; a C-terminus esetében pedig 5’-ATCAAACAGTTAATGGAGCTA-3’ és 5’-CTTTGATTTCATTGCACTTAG-3’. Ezeket a primereket az 5’ végen NotI, a 3’ végen Acc65I restrikciós helyekkel is kiegészítettük. A PCRreakciókhoz Phusion DNA Polymerase (Finnzymes) enzimet használtunk. A PCR-termékeket NotI és Acc65I endonukleázokkal emésztettük, és ugyanezekkel az enzimekkel felnyitott UAS3xHA vektorba ültettük. Az UAS-ΔN-Hook-HA transzgént hordozó törzs előállításához az embriókba egy olyan konstrukciót injektáltattunk, amelyet szintén az Invitrogen Gateway rendszerével állítottunk elő. A Helmut Krämertől kapott HA248-679hook-ot tartalmazó vektorból az N-terminálisan csonkolt Hook fehérjét kódoló szekvenciát Acc65I és NotI restrikciós endonukleázok segítségével pENTR1A vektorba klónoztuk. Az így kapott Entry klónokat LR Clonase II Enzyme Mix-et (Invitrogen) felhasználva pTWH célvektorral rekombináltuk, így végül az embriók genomjába UAS-szabályozott HA-fúziós ΔN-Hook transzgén lett bejuttatva. A sejttenyészetek transzfektálásához előállított UAS-Hook-FLAG és az UAS-Rab11-HA konstrukciók embriókba injektálva transzgénikus törzsek létrehozására is alkalmasak voltak, így ezeket használtuk fel erre a célra is.
5.3. Ko-immunprecipitáció A transzfektált D.Mel-2 sejteket összegyűjtöttük, leülepítettük (1000g 3 perc), majd PBSsel kétszer mostuk őket. Az eljárás minden lépését jégen vagy 4⁰C-on, jéghideg reagensekkel végeztük. A sejteket lízis pufferben szuszpendáltuk (0.5% Triton-X100, 150mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM TRIS-HCl pH 7.5 és Complete Protease Inhibitor Cocktail (Sigma)), majd az így létrehozott lizátumot Eppendorf 5430R mikrocentrifugában 10 percig tartó 10000g-s centrifugálással szabadítottuk meg a sejttörmeléktől. Az anti-FLAG vagy anti-HA ellenanyaggal konjugált agaróz gyöngyöket (Sigma), minden kísérletben 30µl-t, háromszor mostuk lízis pufferrel. A mosási lépéseket követő ülepítést 30 másodperces 8000g-vel történő centrifugálással kiviteleztük. Az átmosott agaróz gyöngyöket 2 órán át 4⁰C-on 90
inkubáltuk a sejtlizátumokkal. Ezt követően lízis pufferrel ötször alaposan lemostuk a gyöngyöket. Végül a konjugált ellenanyagot és a kötődött fehérjéket 30µl Laemmli mintafelvivő pufferben (Sigma) 5 percig tartó forralással távolítottuk el a gyöngyökről. A teljes állatokból származó mintán végzett ko-immunprecipitációs kísérletekhez genomjukban UAS-Hook-FLAG és hsGal4 transzgéneket egyaránt tartalmazó jól táplált L3 stádiumú lárvákat használtunk. A Hook-FLAG fehérje expresszióját 1 órás 37⁰C-os hősokkal indukáltuk. Ezt követően a lárvákat 2 órán keresztül szobahőmérsékleten tartottuk, amit 2 órás, 20%-os szacharóz oldatban történő éheztetés vagy további, a táptalajban töltött 2 óra követett. Ezután kb. 100mg-nyi lárvát kétszer mostunk, majd 1ml Protease Inhibitor Cocktailt (Sigma) is tartalmazó RIPA pufferben (Sigma) homogenizáltuk őket. 10 percig tartó, 10000gvel végzett centrifugálást követően a középső frakciót 30µl anti-FLAG ellenanyaggal konjugált agaróz gyöngyökhöz (Sigma) adtuk. 2 órán át tartó 4⁰C-os inkubáció után a gyöngyöket centrifugálással (30 másodperc, 8000g) gyűjtöttük össze, majd 30µl Laemmli mintafelvivő pufferben (Sigma) 5 percig forraltuk. A gyöngyhöz kötött fehérjéket Western blottal mutattuk ki.
5.4. Western blot és immunhisztokémia 10-15mg jól táplált vagy éheztetett L3 stádiumú lárvát PBS-ben kétszer mostunk. Ezután a lárvákat, vagy hasonló tömegű kiboncolt lárvális zsírtestet milligrammonként 10µl Laemmli mintafelvivő puffer (Sigma) és 10µl PBS keverékében homogenizáltunk.
Az így kapott
mintákat 5 percig forraltuk, majd 10 percig 10000g-vel 4⁰C-on centrifugáltuk. A középső frakciót használtuk a kísérletekben. A fehérjemintákat 8-12%-os poliakrilamid gélen szeparáltuk, majd nitrocellulóz membránra (Bio-Rad) vittük át. A membránokat 1 órán át, szobahőmérsékleten blokkoló oldatban (3% BSA és Tween-20/TBS elegyében, ez utóbbit ezután röviden TBST-nek nevezzük) inkubáltuk, majd háromszor 10 percig mostuk TBST-ben. A fehérjéket a kísérletek leírásakor feltüntetett primer ellenanyagokkal és alkalikus foszfatáz enzimmel kapcsolt szekunder ellenanyagokkal mutattuk ki, melyeket a 2. táblázatban megadott koncentrációban adtunk a membránokhoz. Mindkét ellenanyagban 1 órán át, szobahőmérsékleten inkubáltunk, közöttük háromszor 10 percig mostuk a membránokat TBST-ben. Végül a jelet az alkalikus foszfatáz mesterséges szubsztrátját tartalmazó BCIP/NBT oldattal (Sigma) hívtuk elő.
91
Az immunhisztokémiai vizsgálatokhoz jól táplált vagy éheztetett lárvákat használtunk. A lárvális kutikula felnyitása után az állatokat 4%-os, paraformaldehidből frissen depolimerizált formaldehid PBS-oldatában fixáltuk (egy éjszakán át, 4⁰C-on). Rögzítés után a lárvákat háromszor 30 percig mostuk PBST-ben (0.1% Triton X-100 PBS-ben oldva), majd 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk blokkoló oldatban (5% normál kecske szérum PBST-ben). Ezt követően a lárvákat a kísérletek bemutatása során feltüntetett elsődleges ellenanyagok – blokkoló oldatban elkevert – oldatában egész éjszakán át inkubáltuk 4⁰C-on. Háromszor 30 perc PBST-s mosást követően a mintákat fluoreszcens festékhez kapcsolt másodlagos ellenanyagban tartottuk egy éjszakán át, 4⁰C-on. Újabb háromszor 30 perc PBST-mosás után a lárvákat felboncoltuk, és a zsírtesteket a sejtmag festése után mikroszkóppal vizsgáltuk.
5.5. Ellenanyagok A kísérleteinkben használt ellenanyagokat a 2. táblázatban foglaltuk össze. Az anti-GFP ellenanyagot Lippai Mónika készítette. Az ellenanyaghoz az EGFP génjét pIRES2-EGFP vektorról (Clontech) amplifikáltuk, majd közvetlenül a pQE-UA bakteriális expressziós vektorba (Qiagen) klónoztuk. Az N-terminális hexahisztidin jellel ellátott teljes hosszúságú EGFP fehérjét M15 E. coli sejtekben termeltettük. A fehérjetisztításhoz QIAexpressionist kitet (Qiagen) használtunk a gyártó javaslatait követve. A tisztított fehérjével egereket immunizáltunk, és az így kapott poliklonális ellenanyagot használtuk további vizsgálataink során.
92
2. táblázat. A kísérletek során használt ellenanyagok. A táblázat első oszlopában az ellenanyag nevét tüntettük fel, a második oszlopban pedig azt, hogy milyen állatból származik az ellenanyag. A harmadik oszlopban azt írtuk le, hogy milyen hígításban használtuk az adott ellenanyagot Western blot (WB) és immunhisztokémiai (IHC) eljárások során. A negyedik oszlop az ellenanyagok származási helyét sorolja fel. A DSHB rövidítés a Develomental Studies Hybridoma Bank-ot (Iowa City, Iowa, USA; http://dshb.biology.uiowa.edu/) jelöli.
Ellenanyag
Termeltetve
Hígítás
Referencia
anti-Rab11
nyúl
WB: 1:2000, IHC:1:1000
anti-Rab7
nyúl
IHC: 1:1000
anti-Rbsn5
patkány
IHC: 1:1000
anti-Hook
nyúl
WB: 1:2000; IHC: 1:1000
anti-p62 anti-tubulin anti-Lsp2
nyúl egér nyúl
WB: 1:8000; IHC: 1:2000 WB: 1:1000 IHC: 1:150
anti-GFP
egér
WB: 1:700; IHC: 1:100
anti-GFP anti-GFP anti-FLAG tag anti-HA tag anti-MYC tag anti-nyúl, Alexa 568 anti-nyúl, Alexa 488 anti-egér, Alexa 568 anti-egér, Alexa 488 anti-patkány, Alexa 568 anti-csirke, Alexa 488 anti-nyúl, AP anti-egér, AP
nyúl csirke egér nyúl nyúl kecske kecske kecske kecske kecske
WB: 1:2000 IHC: 1000 WB: 1:2000 WB: 1:2000 WB: 1:800 IHC: 1:500 IHC: 1:500 IHC: 1:500 IHC: 1:500 IHC: 1:500
(Tanaka és Nakamura, 2008) (Tanaka és Nakamura, 2008) (Tanaka és Nakamura, 2008) (Krämer és Phistry, 1996) (Pircs és mtsai, 2012) DSHB, AA4.3 (Burmester és mtsai, 1999) (Szatmári és mtsai, 2013) Invitrogen, A6455 Invitrogen, A10262 Sigma, F1804 Sigma, H6908 Millipore, 06-549 Invitrogen, A21069 Invitrogen, A-11070 Invitrogen, A-11031 Invitrogen, A-11017 Invitrogen, A-11077
kecske kecske kecske
IHC: 1:500 WB: 1:5000 WB: 1:5000
Invitrogen, A11039 Sigma, A3687 Sigma, A5153
93
5.6. Hisztológia és képalkotás Jól táplált és éheztetett L3 lárvák zsírtestjeit PBS-ben boncoltuk ki, majd a sejtek savas struktúráinak és sejtmagjának jelöléséhez 2 percig festettük 50 nM LysoTracker Red (Invitrogen) és 1 µM DAPI PBS-ben oldott keverékében, szobahőmérsékleten. A megfestett zsírtesteket PBS-ben mostuk, majd lefedtük, és rögtön megvizsgáltuk mikroszkóppal. A Texas Red-Avidin (TRA) endocitózisának vizsgálata során a lárvákat IMS-t (Insect Medium Supplement, Sigma) tartalmazó M3 médiumban boncoltuk, majd a mintákat 30 percig inkubáltuk az úgynevezett pulse oldatban, amely TRA (Invitrogen) 1:25 arányban oldva 5% FCS-t (foetal calf serum, Sigma) tartalmazó M3/IMS médiumban. Ezt 10 perces inkubáció követte az úgynevezett chase oldatban (5% FCS-t tartalmazó M3/IMS médium). Ezután a lárvákat háromszor mostuk 5% BSA-t tartalmazó PBS-ben, majd 4⁰C-on 20 percig rögzítettük 4%-os formaldehid oldatban. A fixált lárvákat PBS-ben mostuk, zsírtestjüket izoláltuk, majd a sejtmagokat 1µM PBS-ben oldott DAPI-val festettük. A szövetmintákat minden kísérlet során 75% glicerint és 25% PBS-t tartalmazó lefedő folyadékban fedtük le. A képeket ApoTome egységgel és Plan-NeoFluar 40x 0.75 NA objektívvel felszerelt Zeiss Axioimager Z1 típusú mikroszkóppal, AxioCam MRm kamera segítségével készítettük, melyeket AxioVision 4.82 szoftverrel vezéreltünk.
5.7. Kvantifikálás és statisztikai elemzés Az általunk kiválasztott sejtekben detektálható granulumok számát Image J szoftverrel határoztuk meg. Ezeket az adatokat minden esetben súlyoztuk a sejtmérettel, hogy elkerülhessük a lárvák eltérő korából és testméretéből adódó variabilitás okozta hibákat. A sejtek területét szintén Image J szoftverrel mértük. Ezzel a módszerrel granulum/sejtterület arány értékeket generáltunk. A kolokalizációs vizsgálatok során az egyszeresen és kettősen jelölt granulumok számát az Image J szoftver kiegészítőjével (Red and Green Puncta Colocalization Macro) mértük, majd meghatároztuk a kolokalizáció százalékos arányát [(kettősen jelölt granulumok/egyszeresen jelölt granulumok száma)*100]. A CL1-GFP jel intenzitását a fényképfájlokhoz tartozó metadata adatokból olvastuk ki, a hozzájuk tartozó sejtméret-értékeket Adobe Photoshop CS5 szoftverrel mértük. Az ubiquitin-proteaszóma rendszer vizsgálata során végzett többi
94
kísérletben a sejtek és granulumok méretét Image J szoftverrel határoztuk meg. A LTRsejtméret korreláció vizsgálatához mind az LTR-pozitív granulum/sejtterület, mind pedig a sejtméret-értékeket súlyoztuk a kontroll sejtek esetében mért értékekkel, így kaptuk meg a sejtméret változását. Ha egy kísérletet klonális rendszerben végeztünk, igyekeztünk a klónsejthez legközelebb eső, jobb alsó irányban és hasonló helyzetben (a szövet belsejében vagy perifériáján) található sejtet kontrollként használni. Ha ez nem volt lehetséges, az óramutató járásával megegyező irányban következő sejtet vettük kontrollként. A teljes zsírtesteken végzett kísérletek értékelése során lárvánként 8-10 sejtben mértük meg a granulumok számát a már leírt módon, és ezen értékek felhasználásával egy, a lárvát
jellemző átlagos
granulum/sejtterület arányt állapítottunk meg. A Western blotok kvantifikálása is Image J szoftverrel történt: megmértük a P62, Rab11, GFP-Atg8a, illetve szabad GFP fehérjéknek megfelelő csíkok denzitását, és ezt az értéket a minta relatív fehérjetartalmával (azaz az α-tubulint jelölő csíkok denzitásával) súlyoztuk. A GFP-Atg8a processing módszer statisztikai elemzését GLMM (generalized linear mixed models) eljárással végezte Faragó Tamás. Az elemzéshez egy lineáris modellt alkalmaztunk, de mivel az eljárás megköveteli az adatok normál eloszlását, négyzetgyök transzformációval normalizáltuk őket. Három fő hatást vizsgáltunk: a csoport hatását (két csoport: Rab11 RNSi és kontroll), a kezelés hatását (két kezelés: jól táplált és éheztetett) és a mérés hatását (a GFP-Atg8a és szabad GFP relatív denzitása), valamint ezek páros és hármas interakcióját. A modell a következő eredményeket mutatta: szignifikáns különbség mérhető a két csoport (F(1,24)=37,426; P<0,001) és a két mérés (F(1,24)=7,336; P=0,012) között, és ezek szignifikáns interakcióban vannak egymással (F(1,24)=8,552; P=0,007). Az eltérő kezelések nem okoztak szignifikáns különbséget a mért adatokban (F(1,24)=0,235; P=0,632). A post-hoc teszt azt mutatta, hogy a Rab11-csendesített lárvákban a szabad GFP szintje szignifikánsan alacsonyabb, mint a GFP-Atg8a fehérjéé (t(24)=5,603; p<0,001), míg a kontroll állatokban nem találtunk különbséget a két fehérje szintje között (t(24)=-0,125; p=0,902). A Rab11 és a Hook fehérjék szintjét ugyancsak Image J-vel mértük, és a Hook-FLAG-nek megfelelő csíkok denzitásával súlyoztuk. A statisztikai elemzést IBM SPSS Statistics szoftverrel végeztük, az eredmények bemutatása során feltüntetett teszteket alkalmazva. A box plot ábrákat szintén ezzel a programmal készítettük. Az ábrákon oszlop jelöli az alsó és felső kvartilisek közé eső adatokat, a függőleges intervallumok pedig az ezeken kívül esőket szemléltetik. A medián vízszintes vonalként van ábrázolva. A pontok és csillagok a kilógó adatokat jelzik. P<0,05 értéket tekintettünk szignifikánsnak. Az ábrákon a * jelölés P<0,05, a ** P<0,01, a *** pedig 95
P<0,001 értékeket jelöl. A NS jelölés azt mutatja, hogy nem találtunk szignifikáns különbséget a csoportok között. Az együtt lokalizálható struktúrák elemzését Matlab (R2012b) szoftverrel végeztük. Az elemzéshez használt scriptet Elek János írta.
5.8. Elektronmikroszkópia Transzmissziós Elektronmikroszkópia (TEM). Az elektronmikroszkópos vizsgálatokat Kis Viktor végezte. A lárvákat jéghideg PBS-ben boncoltuk, és a zsírtestjüket immunrögzítő oldatban (2% formaldehid, 0.5% glutáraldehid, 3mM CaCl2 és 1% szacharóz 0.1M nátriumkakodilátban oldva, pH=7,4) fixáltuk 30 percig, szobahőmérsékleten. Ezt egy szintén 30 percig tartó, szobahőmérsékleten végzett utórögzítés követte uranil-acetát 2%-os vizes oldatában. A szokásos ozmiumos utórögzítést kihagytuk, mert tapasztalataink szerint az autofág struktúrák belső szerkezete jobban látható maradt enélkül. A mintákat ezután felszálló alkoholsorban víztelenítettük, majd LR White műgyantába ágyaztuk be a gyártó javaslatait követve. A beágyazott szöveteket 36 órán keresztül 60⁰C-on tartottuk, hogy a műgyanta megfelelően polimerizálódjon. A beágyazott blokkokból készült félvékony metszeteket toluidinkékkel festettük. Az ultravékony metszeteket félig telített uranilacetáttal kontrasztosítottuk 10 percen keresztül. A metszeteket tartalmazó grideket 60kV feszültséggel működő JEOL JEM 1011 típusú transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgáltuk. A képeket Olympus Morada 11 megapixel kamera és iTEM szoftver (Olympus) segítségével készítettük. Az elektronmikroszkópos vizsgálatok során használt anyagokat és reagenseket a Sigma-Aldrich-tól szereztük be (a kivételeket külön jelöljük). A korrelatív fény- és elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz a zsírtesteket fedőlemezekre terítettük, és a fent leírt módon fixáltuk. Ezt követően fluoreszcens mikroszkóppal
lefényképeztük, majd a leírt
módon LR White műgyantába ágyaztuk, metszettük, és a fénymikroszkóppal vizsgált területet tanulmányoztuk elektronmikroszkóppal is. LR
White
műgyantába
ágyazott
anyag
metszetein
végzett
posztembedding
immuncitokémia. Az ultravékony metszeteket 300-as nikkel gridre helyeztük, majd a gridet Parafilmmel borított 96 lyukú plate-re helyezett cseppekben inkubáltuk, sorrendben a következő oldatokban: (1) 5% H2O2-ban 5 percig; (2) desztillált vízben háromszor 5 percig; (3) PBS-ben 5 percig; (4) 3% tejport és 1% BSA-t tartalmazó PBS-ben 45 percig; (5) anti-Lsp2 ellenanyagban (1:25 arányban hígítva 1% BSA-t tartalmazó PBS-ben) egy éjszakán át 4⁰C-on; (6) 1/ BSA-t tartalmazó PBS-ben kétszer 5 percig; (7) 1% BSA-t tartalmazó TBS-ben kétszer 5 96
percig; 18nm méretű aranyszemcséhez kapcsolt anti-nyúl ellenanyagban (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania, USA), melyet 1:100 arányban hígítottunk 1% BSA-t tartalmazó TBS-ben, 90 percig szobahőmérsékleten; (9) TBS-ben háromszor 5 percig. Ezt követően a grideket 5ml kétszer desztillált vízben alaposan lemostuk, majd megszárítottuk. Végül uranil-acetát vizes oldatában kontrasztosítottuk a mintákat 10 percen keresztül. Savas foszfatáz citokémia. A zsírtestlebenyeket a fentebb említett eljárással rögzítettük, majd szobahőmérsékleten háromszor 5 percig mostuk 0,05M nátrium-acetát pufferben (pH=5,0).
Ezt követően 30 percig inkubáltuk őket Gömöri-féle médiumban (5mM β-
glicerofoszfát
és
4mM
ólom-citrát
0,05M
acetát
pufferben
oldva),
szintén
szobahőmérsékleten. A szöveteket végül háromszor 5 percig mostuk acetát pufferben, majd a fentebb leírt eljárásokkal dolgoztuk fel őket elektronmikroszkópos vizsgálataink számára. Végeztünk kontroll kísérleteket is, melyek során szubsztrátmentes médiumot használtunk.
97
6. Összefoglaló Az autofágia az eukarióta sejtek evolúciósan konzervált lebontó útvonala. A folyamat során egy kettős membránnal határolt struktúra jön létre, amelyet autofagoszómának nevezünk. A autofagoszóma körülzárja a citoplazma egyes részleteit, majd az endolizoszomális rendszer különböző tagjaival fuzionálva érési folyamaton megy keresztül. Végül tartalmát savas pH-n működő lizoszomális hidroláz enzimek bontják le. Az autofagoszómák érési folyamatának részletes és pontos molekuláris mechanizmusa mindmáig tisztázatlan. Korábbi, emlős sejttenyészet vizsgálatán alapuló tanulmányok szerint a Rab11 kis Gfehérjének szerepe lehet az autofágia érési szakaszában. Más eredmények viszont arra utalnak, hogy a Rab11 az autofagoszóma kezdeti lépéseinél, a fagofór növekedés szakaszában nélkülözhetetlen. Ezt a kettősséget igyekeztünk egy in vivo modellrendszerben, az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) lárvális zsírtestjében végzett vizsgálatainkkal feloldani. Azt tapasztaltuk, hogy Drosophilában a Rab11 szükséges az autofágia érési folyamatához, pontosabban az amfiszóma-képződéshez. A működőképes Rab11 fehérje hiánya abnormális szerkezetű autofagoszómák és elsavasodott késői endoszómák felhalmozódásához vezetett. Megfigyeltük, hogy éheztetéssel történő autofágia-indukció hatására a Rab11 a reciklizáló endoszómákról autofagoszómákra helyeződik át. Kimutattuk, hogy a Rab11 fizikai kölcsönhatásban van a Hook fehérjével, amely az endoszóma-érés egy ismert negatív regulátora. Kísérletes bizonyítékokat szolgáltattunk arra, hogy a Hook mikrotubulusokhoz horgonyozza a késői endoszómákat, akadályozva ezáltal további érésüket és mind az autofagoszómákkal, mind a lizoszómákkal történő fúziójukat. Azt tapasztaltuk, hogy a Rab11 kötődése eltávolítja a Hookot a késői endoszómákról és egyben gátolja homodimerizációját. Valószínűleg ez teszi lehetővé az endoszóma-érés befejeződését és az érett késői endoszómák autofagoszómákkal történő fúzióját. Eredményeink együttesen tehát azt támasztják alá, hogy a Rab11 fehérje molekuláris közvetítő szerepet tölt be autofág és endoszomális útvonalak között: az autofágia felerősödésekor biztosítja az autofág és endoszomális útvonalak konvergenciájának fokozódását, így zavartalanná teszi az autofágia utolsó lépéseinek lezajlását.
98
7. Summary Autophagy is an evolutionary conserved degradative process of eukaryotic cells. Doublemembrane vesicles called autophagosomes sequester portions of cytoplasm and undergo fusion with distinct members of the endo-lysosomal pathway in order to degrade their content. The exact molecular mechanism of autophagosome maturation remains unclear. Previous studies, performed in cultured mammalian cells revealed a role for the small GTPase Rab11 in the maturation process of autophagosomes. However, recent results showed that Rab11 participates in the early stages of autophagy, during phagophore expansion. To solve this seeming contradiction, we investigated the function of this protein in vivo, in the larval fat body of Drosophila melanogaster. We found that Rab11 is required for the amphisome formation step of the maturation process: loss of Rab11 causes the accumulation of abnormal autophagosomes and late endosomes. We observed that, in response to autophagy induction, Rab11 translocates from recycling compartments to autophagosomes. Rab11 also interacts physically with Hook, a negative regulator of endosome maturation. Furthermore, we found that Hook anchors endosomes to microtubules, thereby inhibiting their further maturation and subsequent fusion with autophagosomes or lysosomes. We showed that Rab11 binding removes Hook from the late endosomes and also inhibits its homodimerisation. By this, Rab11 prevents Hook to inhibit the fusion of endosomes with immature autophagosomes. Thus, our results suggest that Rab11 facilitates molecular crosstalk between autophagy and endosomal route: upon autophagy induction, it promotes autophagic flux by increased convergence of the two pathways.
99
8. Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom témavezetőmnek és tanszékünk korábbi vezetőjének, Sass Miklósnak a támogatásáért, illetve azért, hogy lehetővé tette, hogy munkámat az Anatómiai, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszéken végezzem, illetve, hogy teljes mértékben biztosította a kutatásom anyagi hátterét. Köszönöm Juhász Gábornak, hogy tanácsaival és a laborja nyújtotta lehetőségekkel segítetett munkámat. Köszönöm neki, hogy laborjuk munkájába belevont, és ezzel lehetővé tette, hogy teljesíthessem a doktori fokozatszerzéshez szükséges követelményeket. Köszönöm barátomnak, Lippai Mónikának soha nem szűnő szakmai és emberi támogatását. Nélküle egészen biztosan nem készülhetett volna el ez a munka, és nem lennék az az ember, aki ma vagyok. Ezekért mindig hálás leszek neki. Köszönöm doktorandusz- és munkatársaimnak, Kis Viktornak, Lőrincz Péternek és Maruzs Tamásnak (szigorúan betűrendben), akikre munkám során mindig számíthattam, és soha nem haboztak egy kis jókedvet csempészni időnként szürke hétköznapjaimba. Kis Viktornak külön köszönöm, hogy elektronmikroszkópos tapasztalatával és határtalan lelkesedésével segítette kísérleteimet. Köszönöm Nagy Péternek, hogy mindig meghallgatott, és beszélgetéseink során gyakran mutatott új nézőpontot szakmai és magánéleti szempontból egyaránt. Köszönöm Hegedűs Krisztinának, hogy bevezetett a sejttenyésztési munka és koimmunprecipitáció rejtelmeibe. Köszönöm szakmai beszélgetéseinket Takáts Szabolcsnak, többször segített átlendülni kisebb-nagyobb holtpontokon a munkám során. Köszönöm a tanszék minden munkatársának, akik közvetve vagy közvetlenül elősegítették a munkámat. Kiemelt köszönet illeti Kováts Zsófiát az elektronmikroszkópos munka során nyújtott technikai segítségéért. Köszönöm Helmut Krämernek és Akira Nakamurának, hogy Drosophila törzseiket, konstrukcióikat és ellenanyagaikat rendelkezésemre bocsátották, ezzel segítve munkámat. Köszönöm Édesanyámnak, hogy egész életem során tanúsított áldozatos munkájával lehetővé tette, hogy eljussak idáig. Köszönet illeti kedvesemet, Elek Jánost és jóbarátomat, Faragó Tamsát türelmükért, minden segítségért, amit munkám során nyújtottak, és azért, hogy a szép és nehéz pillanatokban is mellettem állnak és feltétel nélkül szeretnek.
100
9. Irodalomjegyzék Aguilar, R.C., H. Ohno, K.W. Roche, és J.S. Bonifacino. 1997. Functional domain mapping of the clathrin-associated adaptor medium chains mu1 and mu2. J. Biol. Chem. 272:27160–6. Aita, V.M., X.H. Liang, V. V Murty, D.L. Pincus, W. Yu, E. Cayanis, S. Kalachikov, T.C. Gilliam, és B. Levine. 1999. Cloning and genomic organization of beclin 1, a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21. Genomics. 59:59–65. doi:10.1006/geno.1999.5851. Alexandrov, K., H. Horiuchi, O. Steele-Mortimer, M.C. Seabra, és M. Zerial. 1994. Rab escort protein-1 is a multifunctional protein that accompanies newly prenylated rab proteins to their target membranes. EMBO J. 13:5262–73. Attar, N., és P.J. Cullen. 2010. The retromer complex. Adv. Enzyme Regul. 50:216–36. doi:10.1016/j.advenzreg.2009.10.002. Bache, K.G., A. Brech, A. Mehlum, és H. Stenmark. 2003. Hrs regulates multivesicular body formation via ESCRT recruitment to endosomes. J. Cell Biol. 162:435–42. doi:10.1083/jcb.200302131. Balderhaar, H.J.K., J. Lachmann, E. Yavavli, C. Bröcker, A. Lürick, és C. Ungermann. 2013. The CORVET complex promotes tethering and fusion of Rab5/Vps21-positive membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110:3823–8. doi:10.1073/pnas.1221785110. Balderhaar, H.J.K., és C. Ungermann. 2013. CORVET and HOPS tethering complexes coordinators of endosome and lysosome fusion. J. Cell Sci. 126:1307–1316. doi:10.1242/jcs.107805. Barbero, P., L. Bittova, és S.R. Pfeffer. 2002. Visualization of Rab9-mediated vesicle transport from endosomes to the trans-Golgi in living cells. J. Cell Biol. 156:511–8. doi:10.1083/jcb.200109030. Barr, F. a, és D.G. Lambright. 2010. Rab GEFs and GAPs. Curr. Opin. Cell Biol. 22:461–70. doi:10.1016/j.ceb.2010.04.007. Di Bartolomeo, S., M. Corazzari, F. Nazio, S. Oliverio, G. Lisi, M. Antonioli, V. Pagliarini, S. Matteoni, C. Fuoco, L. Giunta, M. D’Amelio, R. Nardacci, A. Romagnoli, M. Piacentini, F. Cecconi, és G.M. Fimia. 2010. The dynamic interaction of AMBRA1 with the dynein motor complex regulates mammalian autophagy. J. Cell Biol. 191:155–68. doi:10.1083/jcb.201002100. Bastiani, M., és R.G. Parton. 2010. Caveolae at a glance. J. Cell Sci. 123:3831–6. doi:10.1242/jcs.070102.
101
Bathori, G., L. Cervenak, és I. Karadi. 2004. Caveolae--an alternative endocytotic pathway for targeted drug delivery. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 21:67–95. Bellot, G., R. Garcia-Medina, P. Gounon, J. Chiche, D. Roux, J. Pouysségur, és N.M. Mazure. 2009. Hypoxia-induced autophagy is mediated through hypoxia-inducible factor induction of BNIP3 and BNIP3L via their BH3 domains. Mol. Cell. Biol. 29:2570–81. doi:10.1128/MCB.00166-09. Bellot, G.L., D. Liu, és S. Pervaiz. 2013. ROS, autophagy, mitochondria and cancer: Ras, the hidden master? Mitochondrion. 13:155–62. doi:10.1016/j.mito.2012.06.007. Benizri, E., A. Ginouvès, és E. Berra. 2008. The magic of the hypoxia-signaling cascade. Cell. Mol. Life Sci. 65:1133–49. doi:10.1007/s00018-008-7472-0. Bento, C.F., C. Puri, K. Moreau, és D.C. Rubinsztein. 2013. The role of membrane-trafficking small GTPases in the regulation of autophagy. J. Cell Sci. 126:1059–69. doi:10.1242/jcs.123075. Berg, T.O., M. Fengsrud, P.E. Strømhaug, és P.O. Seglen. 1998. Isolation and characterization of rat liver amphisomes. Evidence for fusion of autophagosomes with both early and late endosomes. J. Biol. Chem. 273:21883–92. Bilen, J., és N.M. Bonini. 2005. Drosophila as a model for human neurodegenerative disease. Annu. Rev. Genet. 39:153–71. doi:10.1146/annurev.genet.39.110304.095804. Birgisdottir, Å.B., T. Lamark, és T. Johansen. 2013. The LIR motif - crucial for selective autophagy. J. Cell Sci. 126:3237–47. doi:10.1242/jcs.126128. Bos, J.L., H. Rehmann, és A. Wittinghofer. 2007. GEFs and GAPs: critical elements in the control of small G proteins. Cell. 129:865–77. doi:10.1016/j.cell.2007.05.018. Bröcker, C., S. Engelbrecht-Vandré, és C. Ungermann. 2010. Multisubunit tethering complexes and their role in membrane fusion. Curr. Biol. 20:R943–52. doi:10.1016/j.cub.2010.09.015. Burmester, T., C. Antoniewski, és J.-A. Lepesant. 1999. Ecdysone-regulation of synthesis and processing of fat body protein 1, the larval serum protein receptor of Drosophila melanogaster. Eur. J. Biochem. 262:49–55. Cabrera, M., H. Arlt, N. Epp, J. Lachmann, J. Griffith, A. Perz, F. Reggiori, és C. Ungermann. 2013. Functional separation of endosomal fusion factors and the class C core vacuole/endosome tethering (CORVET) complex in endosome biogenesis. J. Biol. Chem. 288:5166–75. doi:10.1074/jbc.M112.431536. Caron, E., és A. Hall. 1998. Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. Science. 282:1717–21. Carroll, K.S., J. Hanna, I. Simon, J. Krise, P. Barbero, és S.R. Pfeffer. 2001. Role of Rab9 GTPase in facilitating receptor recruitment by TIP47. Science (80-. ). 292:1373–6. doi:10.1126/science.1056791.
102
Castellano, F., P. Montcourrier, és P. Chavrier. 2000. Membrane recruitment of Rac1 triggers phagocytosis. J. Cell Sci. 113 ( Pt 1:2955–61. Cerutti, H., és J.A. Casas-Mollano. 2006. On the origin and functions of RNA-mediated silencing: from protists to man. Curr. Genet. 50:81–99. doi:10.1007/s00294-006-0078-x. Chan, E.Y.W., S. Kir, és S. a Tooze. 2007. siRNA screening of the kinome identifies ULK1 as a multidomain modulator of autophagy. J. Biol. Chem. 282:25464–74. doi:10.1074/jbc.M703663200. Chan, E.Y.W., A. Longatti, N.C. McKnight, és S. a Tooze. 2009. Kinase-inactivated ULK proteins inhibit autophagy via their conserved C-terminal domains using an Atg13-independent mechanism. Mol. Cell. Biol. 29:157–71. doi:10.1128/MCB.01082-08. Chan, E.Y.W., és S.A. Tooze. 2009. Evolution of Atg1 function and regulation. Autophagy. 5:758–65. Chang, Y., és T.P. Neufeld. 2009. An Atg1/Atg13 complex with multiple roles in TOR-mediated autophagy regulation. Mol. Biol. Cell. 20:2004–14. doi:10.1091/mbc.E08-12-1250. Chen, H., S. Fre, V.I. Slepnev, M.R. Capua, K. Takei, M.H. Butler, P.P. Di Fiore, és P. De Camilli. 1998. Epsin is an EH-domain-binding protein implicated in clathrin-mediated endocytosis. Nature. 394:793–7. doi:10.1038/29555. Chen, Y., és D.J. Klionsky. 2011. The regulation of autophagy - unanswered questions. J. Cell Sci. 124:161–70. doi:10.1242/jcs.064576. Chimini, G., és P. Chavrier. 2000. Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment. Nat. Cell Biol. 2:E191–6. doi:10.1038/35036454. Christoforidis, S., H.M. McBride, R.D. Burgoyne, és M. Zerial. 1999a. The Rab5 effector EEA1 is a core component of endosome docking. Nature. 397:621–5. doi:10.1038/17618. Christoforidis, S., M. Miaczynska, K. Ashman, M. Wilm, L. Zhao, S.C. Yip, M.D. Waterfield, J.M. Backer, és M. Zerial. 1999b. Phosphatidylinositol-3-OH kinases are Rab5 effectors. Nat. Cell Biol. 1:249–52. doi:10.1038/12075. Chua, C.E.L., B.Q. Gan, és B.L. Tang. 2011. Involvement of members of the Rab family and related small GTPases in autophagosome formation and maturation. Cell. Mol. Life Sci. 68:3349–58. doi:10.1007/s00018-011-0748-9. Ciechanover, A. 2005. Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasome. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6:79–87. doi:10.1038/nrm1552. Ciechanover, A., és P. Brundin. 2003. The ubiquitin proteasome system in neurodegenerative diseases: sometimes the chicken, sometimes the egg. Neuron. 40:427–46. Cuervo, A.M. 2010. Chaperone-mediated autophagy: selectivity pays off. Trends Endocrinol. Metab. 21:142–50. doi:10.1016/j.tem.2009.10.003.
103
Cuervo, A.M., E. Bergamini, U.T. Brunk, W. Dröge, M. Ffrench, és A. Terman. Autophagy and aging: the importance of maintaining „clean” cells. Autophagy. 1:131–40. Cullen, P.J. 2008. Endosomal sorting and signalling: an emerging role for sorting nexins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9:574–82. doi:10.1038/nrm2427. Deneka, M., M. Neeft, I. Popa, M. van Oort, H. Sprong, V. Oorschot, J. Klumperman, P. Schu, és P. van der Sluijs. 2003. Rabaptin-5alpha/rabaptin-4 serves as a linker between rab4 and gamma(1)-adaptin in membrane recycling from endosomes. EMBO J. 22:2645–57. doi:10.1093/emboj/cdg257. Denton, D., S. Nicolson, és S. Kumar. 2012. Cell death by autophagy: facts and apparent artefacts. Cell Death Differ. 19:87–95. doi:10.1038/cdd.2011.146. Deosaran, E., K.B. Larsen, R. Hua, G. Sargent, Y. Wang, S. Kim, T. Lamark, M. Jauregui, K. Law, J. Lippincott-Schwartz, A. Brech, T. Johansen, és P.K. Kim. 2012. NBR1 acts as an autophagy receptor for peroxisomes. J. Cell Sci. doi:10.1242/jcs.114819. Derivery, E., C. Sousa-Blin, J.J. Gautier, B. Lombard, D. Loew, és A. Gautreau. 2009. The Arp2/3 activator WASH controls the fission of endosomes through a large multiprotein complex. Dev. Cell. 17:712–23. doi:10.1016/j.devcel.2009.09.010. Dietzl, G., D. Chen, F. Schnorrer, K.-C. Su, Y. Barinova, M. Fellner, B. Gasser, K. Kinsey, S. Oppel, S. Scheiblauer, A. Couto, V. Marra, K. Keleman, és B.J. Dickson. 2007. A genomewide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448:151–6. doi:10.1038/nature05954. Doherty, G.J., és H.T. McMahon. 2009. Mechanisms of endocytosis. Annu. Rev. Biochem. 78:857–902. doi:10.1146/annurev.biochem.78.081307.110540. Duffy, J.B. 2002. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34:1– 15. doi:10.1002/gene.10150. Fader, C.M., D.G. Sánchez, M. Furlán, és M.I. Colombo. 2008. Induction of autophagy promotes fusion of multivesicular bodies with autophagic vacuoles in k562 cells. Traffic. 9:230–50. doi:10.1111/j.1600-0854.2007.00677.x. Fengsrud, M., E.S. Erichsen, T.O. Berg, C. Raiborg, és P.O. Seglen. 2000. Ultrastructural characterization of the delimiting membranes of isolated autophagosomes and amphisomes by freeze-fracture electron microscopy. Eur. J. Cell Biol. 79:871–82. doi:10.1078/0171-9335-00125. Filimonenko, M., S. Stuffers, C. Raiborg, A. Yamamoto, L. Malerød, E.M.C. Fisher, A.M. Isaacs, A. Brech, H. Stenmark, és A. Simonsen. 2007. Functional multivesicular bodies are required for autophagic clearance of protein aggregates associated with neurodegenerative disease. J. Cell Biol. 179:485–500. doi:10.1083/jcb.200702115. Finley, D. 2009. Recognition and processing of ubiquitin-protein conjugates by the proteasome. Annu. Rev. Biochem. 78:477–513. doi:10.1146/annurev.biochem.78.081507.101607.
104
Ford, M.G.J., I.G. Mills, B.J. Peter, Y. Vallis, G.J.K. Praefcke, P.R. Evans, és H.T. McMahon. 2002. Curvature of clathrin-coated pits driven by epsin. Nature. 419:361–6. doi:10.1038/nature01020. Fujita, N., M. Hayashi-Nishino, H. Fukumoto, H. Omori, A. Yamamoto, T. Noda, és T. Yoshimori. 2008. An Atg4B mutant hampers the lipidation of LC3 paralogues and causes defects in autophagosome closure. Mol. Biol. Cell. 19:4651–9. doi:10.1091/mbc.E08-030312. Funakoshi, T., a Matsuura, T. Noda, és Y. Ohsumi. 1997. Analyses of APG13 gene involved in autophagy in yeast, Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192:207–13. Funderburk, S.F., Q.J. Wang, és Z. Yue. 2010. The Beclin 1-VPS34 complex--at the crossroads of autophagy and beyond. Trends Cell Biol. 20:355–62. doi:10.1016/j.tcb.2010.03.002. Furuya, N., J. Yu, M.P. Byfield, S. Pattingre, és B. Levine. 2005. The evolutionarily conserved domain of Beclin 1 is required for Vps34 binding, autophagy and tumor suppressor function. Autophagy. 1:46–52. Gary, J.D., a E. Wurmser, C.J. Bonangelino, L.S. Weisman, és S.D. Emr. 1998. Fab1p is essential for PtdIns(3)P 5-kinase activity and the maintenance of vacuolar size and membrane homeostasis. J. Cell Biol. 143:65–79. Geng, J., és D.J. Klionsky. 2008. The Atg8 and Atg12 ubiquitin-like conjugation systems in macroautophagy. „Protein modifications: beyond the usual suspects” review series. EMBO Rep. 9:859–64. doi:10.1038/embor.2008.163. Gidon, A., S. Bardin, B. Cinquin, J. Boulanger, F. Waharte, L. Heliot, H. de la Salle, D. Hanau, C. Kervrann, B. Goud, és J. Salamero. 2012. A Rab11A/myosin Vb/Rab11-FIP2 complex frames two late recycling steps of langerin from the ERC to the plasma membrane. Traffic. 13:815–33. doi:10.1111/j.1600-0854.2012.01354.x. Gordon, P.B., H. Høyvik, és P.O. Seglen. 1992. Prelysosomal and lysosomal connections between autophagy and endocytosis. Biochem. J. 283 ( Pt 2:361–9. Gordon, P.B., és P.O. Seglen. 1988. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem. Biophys. Res. Commun. 151:40–7. Grant, B.D., és J.G. Donaldson. 2009. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10:597–608. doi:10.1038/nrm2755. Greenberg, S. 2001. Diversity in phagocytic signalling. J. Cell Sci. 114:1039–40. Grimmer, S., B. van Deurs, és K. Sandvig. 2002. Membrane ruffling and macropinocytosis in A431 cells require cholesterol. J. Cell Sci. 115:2953–62. Guruharsha, K.G., J.-F. Rual, B. Zhai, J. Mintseris, P. Vaidya, N. Vaidya, C. Beekman, C. Wong, D.Y. Rhee, O. Cenaj, E. McKillip, S. Shah, M. Stapleton, K.H. Wan, C. Yu, B. Parsa, J.W. Carlson, X. Chen, B. Kapadia, K. VijayRaghavan, S.P. Gygi, S.E. Celniker, R. a Obar, és S. Artavanis-Tsakonas. 2011. A protein complex network of Drosophila melanogaster. Cell. 147:690–703. doi:10.1016/j.cell.2011.08.047. 105
Gutierrez, M.G., D.B. Munafó, W. Berón, és M.I. Colombo. 2004. Rab7 is required for the normal progression of the autophagic pathway in mammalian cells. J. Cell Sci. 117:2687–97. doi:10.1242/jcs.01114. Haberman, A.S., M.A. Akbar, S. Ray, és H. Krämer. 2010. Drosophila acinus encodes a novel regulator of endocytic and autophagic trafficking. Development. 137:2157–66. doi:10.1242/dev.044230. Hailey, D.W., A.S. Rambold, P. Satpute-Krishnan, K. Mitra, R. Sougrat, P.K. Kim, és J. Lippincott-Schwartz. 2010. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141:656–67. doi:10.1016/j.cell.2010.04.009. Hamasaki, M., N. Furuta, A. Matsuda, A. Nezu, A. Yamamoto, N. Fujita, H. Oomori, T. Noda, T. Haraguchi, Y. Hiraoka, A. Amano, és T. Yoshimori. 2013. Autophagosomes form at ER– mitochondria contact sites. Nature. 1–3. doi:10.1038/nature11910. Hanada, T., N.N. Noda, Y. Satomi, Y. Ichimura, Y. Fujioka, T. Takao, F. Inagaki, és Y. Ohsumi. 2007. The Atg12-Atg5 conjugate has a novel E3-like activity for protein lipidation in autophagy. J. Biol. Chem. 282:37298–302. doi:10.1074/jbc.C700195200. Hanson, P.I., R. Roth, Y. Lin, és J.E. Heuser. 2008. Plasma membrane deformation by circular arrays of ESCRT-III protein filaments. J. Cell Biol. 180:389–402. doi:10.1083/jcb.200707031. Hara, T., K. Nakamura, M. Matsui, A. Yamamoto, Y. Nakahara, R. Suzuki-Migishima, M. Yokoyama, K. Mishima, I. Saito, H. Okano, és N. Mizushima. 2006. Suppression of basal autophagy in neural cells causes neurodegenerative disease in mice. Nature. 441:885–9. doi:10.1038/nature04724. Hara, T., A. Takamura, C. Kishi, S.-I. Iemura, T. Natsume, J.-L. Guan, és N. Mizushima. 2008. FIP200, a ULK-interacting protein, is required for autophagosome formation in mammalian cells. J. Cell Biol. 181:497–510. doi:10.1083/jcb.200712064. Harding, T.M., K.A. Morano, S. V Scott, és D.J. Klionsky. 1995. Isolation and characterization of yeast mutants in the cytoplasm to vacuole protein targeting pathway. J. Cell Biol. 131:591–602. Hayashi-Nishino, M., N. Fujita, T. Noda, A. Yamaguchi, T. Yoshimori, és A. Yamamoto. 2009. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat. Cell Biol. 11:1433–7. doi:10.1038/ncb1991. He, C., H. Song, T. Yorimitsu, I. Monastyrska, W.-L. Yen, J.E. Legakis, és D.J. Klionsky. 2006. Recruitment of Atg9 to the preautophagosomal structure by Atg11 is essential for selective autophagy in budding yeast. J. Cell Biol. 175:925–35. doi:10.1083/jcb.200606084. Heider, M.R., és M. Munson. 2012. Exorcising the exocyst complex. Traffic. 13:898–907. doi:10.1111/j.1600-0854.2012.01353.x. Henne, W.M., N.J. Buchkovich, és S.D. Emr. 2011. The ESCRT pathway. Dev. Cell. 21:77–91. doi:10.1016/j.devcel.2011.05.015. 106
Hinshaw, J.E. 2000. Dynamin and its role in membrane fission. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16:483–519. doi:10.1146/annurev.cellbio.16.1.483. Hirota, Y., és Y. Tanaka. 2009. A small GTPase, human Rab32, is required for the formation of autophagic vacuoles under basal conditions. Cell. Mol. life Sci. 66:2913–32. doi:10.1007/s00018-009-0080-9. Horiuchi, H., R. Lippé, H.M. McBride, M. Rubino, P. Woodman, H. Stenmark, V. Rybin, M. Wilm, K. Ashman, M. Mann, és M. Zerial. 1997. A novel Rab5 GDP/GTP exchange factor complexed to Rabaptin-5 links nucleotide exchange to effector recruitment and function. Cell. 90:1149–59. Hosokawa, N., T. Sasaki, S. Iemura, T. Natsume, T. Hara, és N. Mizushima. 2009. Atg101, a novel mammalian autophagy protein interacting with Atg13. Autophagy. 5:973–9. Hsu, V.W., és R. Prekeris. 2010. Transport at the recycling endosome. Curr. Opin. Cell Biol. 22:528–34. doi:10.1016/j.ceb.2010.05.008. Huotari, J., és A. Helenius. 2011. Endosome maturation. EMBO J. 30:3481–500. doi:10.1038/emboj.2011.286. Isakson, P., P. Holland, és A. Simonsen. 2013. The role of ALFY in selective autophagy. Cell Death Differ. 20:12–20. doi:10.1038/cdd.2012.66. Itakura, E., C. Kishi, K. Inoue, és N. Mizushima. 2008. Beclin 1 forms two distinct phosphatidylinositol 3-kinase complexes with mammalian Atg14 and UVRAG. Mol. Biol. Cell. 19:5360–72. doi:10.1091/mbc.E08-01-0080. Itakura, E., és N. Mizushima. 2009. Atg14 and UVRAG: mutually exclusive subunits of mammalian Beclin 1-PI3K complexes. Autophagy. 5:534–6. doi:10.1091/mbc.E08-01Addendum. Itakura, E., és N. Mizushima. 2010. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy. 6:764–76. Itoh, T., N. Fujita, E. Kanno, A. Yamamoto, T. Yoshimori, és M. Fukuda. 2008. Golgi-resident small GTPase Rab33B interacts with Atg16L and modulates autophagosome formation. Mol. Biol. Cell. 19:2916–25. doi:10.1091/mbc.E07-12-1231. Itoh, T., E. Kanno, T. Uemura, S. Waguri, és M. Fukuda. 2011. OATL1, a novel autophagosome-resident Rab33B-GAP, regulates autophagosomal maturation. J. Cell Biol. 192:839–53. doi:10.1083/jcb.201008107. Itzen, A., és R.S. Goody. 2011. GTPases involved in vesicular trafficking: structures and mechanisms. Semin. Cell Dev. Biol. 22:48–56. doi:10.1016/j.semcdb.2010.10.003. Jäger, S., C. Bucci, I. Tanida, T. Ueno, E. Kominami, P. Saftig, és E.-L. Eskelinen. 2004. Role for Rab7 in maturation of late autophagic vacuoles. J. Cell Sci. 117:4837–48. doi:10.1242/jcs.01370.
107
Jahn, R., és R.H. Scheller. 2006. SNAREs--engines for membrane fusion. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7:631–43. doi:10.1038/nrm2002. Johannes, L., és V. Popoff. 2008. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135:1175–87. doi:10.1016/j.cell.2008.12.009. Johansson, M., M. Lehto, K. Tanhuanpää, T.L. Cover, és V.M. Olkkonen. 2005. The oxysterolbinding protein homologue ORP1L interacts with Rab7 and alters functional properties of late endocytic compartments. Mol. Biol. Cell. 16:5480–92. doi:10.1091/mbc.E05-030189. Johansson, M., N. Rocha, W. Zwart, I. Jordens, L. Janssen, C. Kuijl, V.M. Olkkonen, és J. Neefjes. 2007. Activation of endosomal dynein motors by stepwise assembly of Rab7RILP-p150Glued, ORP1L, and the receptor betalll spectrin. J. Cell Biol. 176:459–71. doi:10.1083/jcb.200606077. Jordens, I., M. Fernandez-Borja, M. Marsman, S. Dusseljee, L. Janssen, J. Calafat, H. Janssen, R. Wubbolts, és J. Neefjes. 2001. The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors. Curr. Biol. 11:1680–5. Jost, M., F. Simpson, J.M. Kavran, M. a Lemmon, és S.L. Schmid. 1998. Phosphatidylinositol4,5-bisphosphate is required for endocytic coated vesicle formation. Curr. Biol. 8:1399– 402. Juhász, G., B. Erdi, M. Sass, és T.P. Neufeld. 2007. Atg7-dependent autophagy promotes neuronal health, stress tolerance, and longevity but is dispensable for metamorphosis in Drosophila. Genes Dev. 21:3061–6. doi:10.1101/gad.1600707. Juhász, G., J.H. Hill, Y. Yan, M. Sass, E.H. Baehrecke, J.M. Backer, és T.P. Neufeld. 2008. The class III PI(3)K Vps34 promotes autophagy and endocytosis but not TOR signaling in Drosophila. J. Cell Biol. 181:655–66. doi:10.1083/jcb.200712051. Juhasz, G., és T.P. Neufeld. 2008. Experimental control and characterization of autophagy in Drosophila. Methods Mol. Biol. 445:125–33. doi:10.1007/978-1-59745-157-4_8. Jung, C.H., C.B. Jun, S. Ro, Y.-M. Kim, N.M. Otto, J. Cao, M. Kundu, és D. Kim. 2009. ULKAtg13-FIP200 complexes mediate mTOR signaling to the autophagy machinery. Mol. Biol. Cell. 20:1992–2003. doi:10.1091/mbc.E08-12-1249. Kabeya, Y., Y. Kamada, M. Baba, H. Takikawa, M. Sasaki, és Y. Ohsumi. 2005. Atg17 functions in cooperation with Atg1 and Atg13 in yeast autophagy. Mol. Biol. Cell. 16:2544–53. doi:10.1091/mbc.E04-08-0669. Kabeya, Y., N. Mizushima, T. Ueno, A. Yamamoto, T. Kirisako, T. Noda, E. Kominami, Y. Ohsumi, és T. Yoshimori. 2000. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19:5720–8. doi:10.1093/emboj/19.21.5720. Kaiser, P., és L. Huang. 2005. Global approaches to understanding ubiquitination. Genome Biol. 6:233. doi:10.1186/gb-2005-6-10-233.
108
Kihara, A., T. Noda, N. Ishihara, és Y. Ohsumi. 2001. Two distinct Vps34 phosphatidylinositol 3-kinase complexes function in autophagy and carboxypeptidase Y sorting in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 152:519–30. Kim, B.Y., H. Krämer, a Yamamoto, E. Kominami, S. Kohsaka, és C. Akazawa. 2001. Molecular characterization of mammalian homologues of class C Vps proteins that interact with syntaxin-7. J. Biol. Chem. 276:29393–402. doi:10.1074/jbc.M101778200. Kimmelman, A.C. 2011. The dynamic nature of autophagy in cancer. Genes Dev. 25:1999– 2010. doi:10.1101/gad.17558811. Kimura, S., T. Noda, és T. Yoshimori. 2007. Dissection of the autophagosome maturation process by a novel reporter protein, tandem fluorescent-tagged LC3. Autophagy. 3:452– 60. Kirkin, V., T. Lamark, Y.-S. Sou, G. Bjørkøy, J.L. Nunn, J.-A. Bruun, E. Shvets, D.G. McEwan, T.H. Clausen, P. Wild, I. Bilusic, J.-P. Theurillat, A. Øvervatn, T. Ishii, Z. Elazar, M. Komatsu, I. Dikic, és T. Johansen. 2009a. A role for NBR1 in autophagosomal degradation of ubiquitinated substrates. Mol. Cell. 33:505–16. doi:10.1016/j.molcel.2009.01.020. Kirkin, V., D.G. McEwan, I. Novak, és I. Dikic. 2009b. A role for ubiquitin in selective autophagy. Mol. Cell. 34:259–69. doi:10.1016/j.molcel.2009.04.026. Klionsky, D.J. 2005. The molecular machinery of autophagy: unanswered questions. J. Cell Sci. 118:7–18. doi:10.1242/jcs.01620. Klionsky, D.J. 2007. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8:931–7. doi:10.1038/nrm2245. Klionsky, D.J., F.C. Abdalla, H. Abeliovich, R.T. Abraham, A. Acevedo-Arozena, K. Adeli, L. Agholme, M. Agnello, P. Agostinis, J.A. Aguirre-Ghiso, H.J. Ahn, O. Ait-Mohamed, S. AitSi-Ali, T. Akematsu, S. Akira, H.M. Al-Younes, M.A. Al-Zeer, M.L. Albert, R.L. Albin, J. Alegre-Abarrategui, M.F. Aleo, M. Alirezaei, A. Almasan, M. Almonte-Becerril, A. Amano, R. Amaravadi, S. Amarnath, A.O. Amer, N. Andrieu-Abadie, V. Anantharam, D.K. Ann, S. Anoopkumar-Dukie, H. Aoki, N. Apostolova, G. Arancia, J.P. Aris, K. Asanuma, N.Y.O. Asare, H. Ashida, V. Askanas, D.S. Askew, P. Auberger, M. Baba, S.K. Backues, E.H. Baehrecke, B.A. Bahr, X.-Y. Bai, Y. Bailly, R. Baiocchi, G. Baldini, W. Balduini, A. Ballabio, B.A. Bamber, E.T.W. Bampton, G. Bánhegyi, C.R. Bartholomew, D.C. Bassham, R.C. Bast, H. Batoko, B.-H. Bay, I. Beau, D.M. Béchet, T.J. Begley, C. Behl, C. Behrends, S. Bekri, B. Bellaire, L.J. Bendall, L. Benetti, L. Berliocchi, H. Bernardi, F. Bernassola, S. Besteiro, I. Bhatia-Kissova, X. Bi, M. Biard-Piechaczyk, J.S. Blum, L.H. Boise, P. Bonaldo, D.L. Boone, B.C. Bornhauser, K.R. Bortoluci, I. Bossis, F. Bost, J.-P. Bourquin, P. Boya, M. BoyerGuittaut, P. V Bozhkov, N.R. Brady, C. Brancolini, A. Brech, J.E. Brenman, A. Brennand, E.H. Bresnick, P. Brest, D. Bridges, M.L. Bristol, P.S. Brookes, és mtsai. 2012. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8:445– 544. Knævelsrud, H., K. Søreng, C. Raiborg, K. Håberg, F. Rasmuson, A. Brech, K. Liestøl, T.E. Rusten, H. Stenmark, T.P. Neufeld, S.R. Carlsson, és A. Simonsen. 2013. Membrane remodeling by the PX-BAR protein SNX18 promotes autophagosome formation. J. Cell Biol. 202:331–49. doi:10.1083/jcb.201205129. 109
Komatsu, M., S. Waguri, T. Chiba, S. Murata, J. Iwata, I. Tanida, T. Ueno, M. Koike, Y. Uchiyama, E. Kominami, és K. Tanaka. 2006. Loss of autophagy in the central nervous system causes neurodegeneration in mice. Nature. 441:880–4. doi:10.1038/nature04723. Komatsu, M., S. Waguri, M. Koike, Y.-S. Sou, T. Ueno, T. Hara, N. Mizushima, J.-I. Iwata, J. Ezaki, S. Murata, J. Hamazaki, Y. Nishito, S.-I. Iemura, T. Natsume, T. Yanagawa, J. Uwayama, E. Warabi, H. Yoshida, T. Ishii, A. Kobayashi, M. Yamamoto, Z. Yue, Y. Uchiyama, E. Kominami, és K. Tanaka. 2007. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice. Cell. 131:1149–63. doi:10.1016/j.cell.2007.10.035. Kongara, S., és V. Karantza. 2012. The interplay between autophagy and ROS in tumorigenesis. Front. Oncol. 2:171. doi:10.3389/fonc.2012.00171. Korolchuk, V.I., F.M. Menzies, és D.C. Rubinsztein. 2010. Mechanisms of cross-talk between the ubiquitin-proteasome and autophagy-lysosome systems. FEBS Lett. 584:1393–8. doi:10.1016/j.febslet.2009.12.047. Köchl, R., X.W. Hu, E.Y.W. Chan, és S.A. Tooze. 2006. Microtubules facilitate autophagosome formation and fusion of autophagosomes with endosomes. Traffic. 7:129–45. doi:10.1111/j.1600-0854.2005.00368.x. Krämer, H., és M. Phistry. 1996. Mutations in the Drosophila hook gene inhibit endocytosis of the boss transmembrane ligand into multivesicular bodies. J. Cell Biol. 133:1205–15. Krämer, H., és M. Phistry. 1999. Genetic analysis of hook, a gene required for endocytic trafficking in Drosophila. Genetics. 151:675–84. Kuma, A., N. Mizushima, N. Ishihara, és Y. Ohsumi. 2002. Formation of the approximately 350-kDa Apg12-Apg5.Apg16 multimeric complex, mediated by Apg16 oligomerization, is essential for autophagy in yeast. J. Biol. Chem. 277:18619–25. doi:10.1074/jbc.M111889200. Lafourcade, C., K. Sobo, S. Kieffer-Jaquinod, J. Garin, és F.G. van der Goot. 2008. Regulation of the V-ATPase along the endocytic pathway occurs through reversible subunit association and membrane localization. PLoS One. 3:e2758. doi:10.1371/journal.pone.0002758. Lajoie, P., és I.R. Nabi. 2010. Lipid rafts, caveolae, and their endocytosis. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 282:135–63. doi:10.1016/S1937-6448(10)82003-9. Lamark, T., és T. Johansen. 2010. Autophagy: links with the proteasome. Curr. Opin. Cell Biol. 22:192–8. doi:10.1016/j.ceb.2009.11.002. Lamb, C.A., H.C. Dooley, és S.A. Tooze. 2013. Endocytosis and autophagy: Shared machinery for degradation. Bioessays. 35:34–45. doi:10.1002/bies.201200130. De Lartigue, J., H.E.J. Polson, M. Feldman, K. Shokat, S.A. Tooze, S. Urbé, és M.J. Clague. 2009. PIKfyve Regulation of Endosome-Linked Pathways. Traffic. 10:883–893. doi:10.1111/j.1600-0854.2009.00915.x. 110
Lata, S., G. Schoehn, A. Jain, R. Pires, J. Piehler, H.G. Gottlinger, és W. Weissenhorn. 2008. Helical structures of ESCRT-III are disassembled by VPS4. Science (80-. ). 321:1354–7. doi:10.1126/science.1161070. Layfield, R., J. Lowe, és L. Bedford. 2005. The ubiquitin-proteasome system and neurodegenerative disorders. Essays Biochem. 41:157–71. doi:10.1042/EB0410157. Lee, J.-A., A. Beigneux, S.T. Ahmad, S.G. Young, és F.-B. Gao. 2007a. ESCRT-III dysfunction causes autophagosome accumulation and neurodegeneration. Curr. Biol. 17:1561–7. doi:10.1016/j.cub.2007.07.029. Lee, J.-A., A. Beigneux, S.T. Ahmad, S.G. Young, és F.-B. Gao. 2007b. ESCRT-III dysfunction causes autophagosome accumulation and neurodegeneration. Curr. Biol. 17:1561–7. doi:10.1016/j.cub.2007.07.029. Levine, B., és D.J. Klionsky. 2004. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6:463–77. Levine, B., és G. Kroemer. 2008. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132:27–42. doi:10.1016/j.cell.2007.12.018. Liang, C., J. Lee, K. Inn, M.U. Gack, Q. Li, E.A. Roberts, I. Vergne, V. Deretic, P. Feng, C. Akazawa, és J.U. Jung. 2008. Beclin1-binding UVRAG targets the class C Vps complex to coordinate autophagosome maturation and endocytic trafficking. Nat. Cell Biol. 10:776– 87. doi:10.1038/ncb1740. Liang, Q., P. Yang, E. Tian, J. Han, és H. Zhang. 2012. The C. elegans ATG101 homolog EPG-9 directly interacts with EPG-1/Atg13 and is essential for autophagy. Autophagy. 8:1426– 33. doi:10.4161/auto.21163. Lin, M.G., és Q. Zhong. 2011. Interaction between small GTPase Rab7 and PI3KC3 links autophagy and endocytosis: A new Rab7 effector protein sheds light on membrane trafficking pathways. Small GTPases. 2:85–88. doi:10.4161/sgtp.2.2.15256. Lin, W.-J., C. Yang, L. Li, Y. Yi, K. Chen, Y.-C. Lin, C. Liu, és C. Lin. 2012. Lysosomal targeting of phafin1 mediated by Rab7 induces autophagosome formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417:35–42. doi:10.1016/j.bbrc.2011.11.043. Lindmo, K., A. Brech, K.D. Finley, S. Gaumer, D. Contamine, T.E. Rusten, és H. Stenmark. 2008. The PI 3-kinase regulator Vps15 is required for autophagic clearance of protein aggregates. Autophagy. 4:500–6. Ling, D., és P.M. Salvaterra. 2009. A central role for autophagy in Alzheimer-type neurodegeneration. Autophagy. 5:738–40. Liou, W., H.J. Geuze, M.J. Geelen, és J.W. Slot. 1997. The autophagic and endocytic pathways converge at the nascent autophagic vacuoles. J. Cell Biol. 136:61–70. Lipatova, Z., N. Belogortseva, X.Q. Zhang, J. Kim, D. Taussig, és N. Segev. 2012. Regulation of selective autophagy onset by a Ypt/Rab GTPase module. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109:6981–6. doi:10.1073/pnas.1121299109. 111
Lippé, R., M. Miaczynska, V. Rybin, A. Runge, és M. Zerial. 2001. Functional synergy between Rab5 effector Rabaptin-5 and exchange factor Rabex-5 when physically associated in a complex. Mol. Biol. Cell. 12:2219–28. Lloyd, T.E., R. Atkinson, M.N. Wu, Y. Zhou, G. Pennetta, és H.J. Bellen. 2002. Hrs regulates endosome membrane invagination and tyrosine kinase receptor signaling in Drosophila. Cell. 108:261–9. Lock, R., S. Roy, C.M. Kenific, J.S. Su, E. Salas, S.M. Ronen, és J. Debnath. 2011. Autophagy facilitates glycolysis during Ras-mediated oncogenic transformation. Mol. Biol. Cell. 22:165–78. doi:10.1091/mbc.E10-06-0500. Lombardi, D., T. Soldati, M. a Riederer, Y. Goda, M. Zerial, és S.R. Pfeffer. 1993. Rab9 functions in transport between late endosomes and the trans Golgi network. EMBO J. 12:677–82. Longatti, A., C.A. Lamb, M. Razi, S. Yoshimura, F.A. Barr, és S.A. Tooze. 2012. TBC1D14 regulates autophagosome formation via Rab11- and ULK1-positive recycling endosomes. J. Cell Biol. 197:659–75. doi:10.1083/jcb.201111079. Loubéry, S., C. Wilhelm, I. Hurbain, S. Neveu, D. Louvard, és E. Coudrier. 2008. Different microtubule motors move early and late endocytic compartments. Traffic. 9:492–509. doi:10.1111/j.1600-0854.2008.00704.x. Lu, Q., P. Yang, X. Huang, W. Hu, B. Guo, F. Wu, L. Lin, A.L. Kovács, L. Yu, és H. Zhang. 2011. The WD40 repeat PtdIns(3)P-binding protein EPG-6 regulates progression of omegasomes to autophagosomes. Dev. Cell. 21:343–57. doi:10.1016/j.devcel.2011.06.024. Lucocq, J., és D. Walker. 1997. Evidence for fusion between multilamellar endosomes and autophagosomes in HeLa cells. Eur. J. Cell Biol. 72:307–13. Luiro, K., K. Yliannala, L. Ahtiainen, H. Maunu, I. Järvelä, A. Kyttälä, és A. Jalanko. 2004. Interconnections of CLN3, Hook1 and Rab proteins link Batten disease to defects in the endocytic pathway. Hum. Mol. Genet. 13:3017–27. doi:10.1093/hmg/ddh321. Lynch-Day, M. a, D. Bhandari, S. Menon, J. Huang, H. Cai, C.R. Bartholomew, J.H. Brumell, S. Ferro-Novick, és D.J. Klionsky. 2010. Trs85 directs a Ypt1 GEF, TRAPPIII, to the phagophore to promote autophagy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107:7811–6. doi:10.1073/pnas.1000063107. Maday, S., K.E. Wallace, és E.L.F. Holzbaur. 2012. Autophagosomes initiate distally and mature during transport toward the cell soma in primary neurons. J. Cell Biol. 196:407– 17. doi:10.1083/jcb.201106120. Maiuri, M.C., E. Tasdemir, A. Criollo, E. Morselli, J.M. Vicencio, R. Carnuccio, és G. Kroemer. 2009. Control of autophagy by oncogenes and tumor suppressor genes. Cell Death Differ. 16:87–93. doi:10.1038/cdd.2008.131. Mari, M., S.A. Tooze, és F. Reggiori. 2011. The puzzling origin of the autophagosomal membrane. F1000 Biol. Rep. 3:25. doi:10.3410/B3-25. 112
Massol, P., P. Montcourrier, J.C. Guillemot, és P. Chavrier. 1998. Fc receptor-mediated phagocytosis requires CDC42 and Rac1. EMBO J. 17:6219–29. doi:10.1093/emboj/17.21.6219. Matsunaga, K., E. Morita, T. Saitoh, S. Akira, N.T. Ktistakis, T. Izumi, T. Noda, és T. Yoshimori. 2010. Autophagy requires endoplasmic reticulum targeting of the PI3-kinase complex via Atg14L. J. Cell Biol. 190:511–21. doi:10.1083/jcb.200911141. Matsunaga, K., T. Saitoh, K. Tabata, H. Omori, T. Satoh, N. Kurotori, I. Maejima, K. ShirahamaNoda, T. Ichimura, T. Isobe, S. Akira, T. Noda, és T. Yoshimori. 2009. Two Beclin 1binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell Biol. 11:385–96. doi:10.1038/ncb1846. Matsuura, a, M. Tsukada, Y. Wada, és Y. Ohsumi. 1997. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192:245–50. Maxfield, F.R., és T.E. McGraw. 2004. Endocytic recycling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5:121–32. doi:10.1038/nrm1315. Maxfield, F.R., és D.J. Yamashiro. 1987. Endosome acidification and the pathways of receptor-mediated endocytosis. Adv. Exp. Med. Biol. 225:189–98. Mazure, N.M., és J. Pouysségur. 2010. Hypoxia-induced autophagy: cell death or cell survival? Curr. Opin. Cell Biol. 22:177–80. doi:10.1016/j.ceb.2009.11.015. McGough, I.J., és P.J. Cullen. 2011. Recent advances in retromer biology. Traffic. 12:963–71. doi:10.1111/j.1600-0854.2011.01201.x. Meiling-Wesse, K., U.D. Epple, R. Krick, H. Barth, A. Appelles, C. Voss, E.-L. Eskelinen, és M. Thumm. 2005. Trs85 (Gsg1), a component of the TRAPP complexes, is required for the organization of the preautophagosomal structure during selective autophagy via the Cvt pathway. J. Biol. Chem. 280:33669–78. doi:10.1074/jbc.M501701200. Mercer, C. a, A. Kaliappan, és P.B. Dennis. 2009. A novel, human Atg13 binding protein, Atg101, interacts with ULK1 and is essential for macroautophagy. Autophagy. 5:649–62. Mizushima, N. 2010. The role of the Atg1/ULK1 complex in autophagy regulation. Curr. Opin. Cell Biol. 22:132–9. doi:10.1016/j.ceb.2009.12.004. Mizushima, N., B. Levine, A.M. Cuervo, és D.J. Klionsky. 2008. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451:1069–75. doi:10.1038/nature06639. Mizushima, N., T. Yoshimori, és Y. Ohsumi. 2002. Mouse Apg10 as an Apg12-conjugating enzyme: analysis by the conjugation-mediated yeast two-hybrid method. FEBS Lett. 532:450–4. Mizushima, N., T. Yoshimori, és Y. Ohsumi. 2011. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27:107–32. doi:10.1146/annurev-cellbio-092910154005.
113
Molejon, M.I., A. Ropolo, és M.I. Vaccaro. 2013. VMP1 is a new player in the regulation of the autophagy-specific phosphatidylinositol 3-kinase complex activation. Autophagy. 9:1–3. Moreau, K., B. Ravikumar, C. Puri, és D.C. Rubinsztein. 2012. Arf6 promotes autophagosome formation via effects on phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and phospholipase D. J. Cell Biol. 196:483–96. doi:10.1083/jcb.201110114. Moreau, K., B. Ravikumar, M. Renna, C. Puri, és D.C. Rubinsztein. 2011. Autophagosome precursor maturation requires homotypic fusion. Cell. 146:303–17. doi:10.1016/j.cell.2011.06.023. Mousavi, S.A., L. Malerød, T. Berg, és R. Kjeken. 2004. Clathrin-dependent endocytosis. Biochem. J. 377:1–16. doi:10.1042/BJ20031000. Mousseron-Grall, S., J. Kejzlarová-Lepesant, T. Burmester, C. Chihara, M. Barray, E. Delain, R. Pictet, és J.-A. Lepesant. 1997. Sequence, structure and evolution of the ecdysoneinducible Lsp-2 gene of Drosophila melanogaster. Eur. J. Biochem. 245:191–8. Moyer, B.D., B.B. Allan, és W.E. Balch. 2001. Rab1 interaction with a GM130 effector complex regulates COPII vesicle cis--Golgi tethering. Traffic. 2:268–76. Munafó, D.B., és M.I. Colombo. 2002. Induction of autophagy causes dramatic changes in the subcellular distribution of GFP-Rab24. Traffic. 3:472–82. Munakata, N., és D.J. Klionsky. 2010. „Autophagy suite”: Atg9 cycling in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Autophagy. 6:679–85. Murray, J.T., C. Panaretou, H. Stenmark, M. Miaczynska, és J.M. Backer. 2002. Role of Rab5 in the recruitment of hVps34/p150 to the early endosome. Traffic. 3:416–27. Nagy, P., K. Hegedűs, K. Pircs, A. Varga, és G. Juhász. 2013. Different effects of Atg2 and Atg18 mutations on Atg8a and Atg9 trafficking during starvation in Drosophila. FEBS Lett. 18–23. doi:10.1016/j.febslet.2013.12.012. Nagy, P., M. Kárpáti, A. Varga, K. Pircs, Z. Venkei, S. Takáts, K. Varga, B. Erdi, K. Hegedűs, és G. Juhász. 2014. Atg17/FIP200 localizes to perilysosomal Ref(2)P aggregates and promotes autophagy by activation of Atg1 in Drosophila. Autophagy. 10. Narayanan, R., H. Krämer, és M. Ramaswami. 2000. Drosophila endosomal proteins hook and deep orange regulate synapse size but not synaptic vesicle recycling. J. Neurobiol. 45:105–19. Nazarko, T.Y., J. Huang, J. Nicaud, D.J. Klionsky, és A.A. Sibirny. 2005. Trs85 is required for macroautophagy, pexophagy and cytoplasm to vacuole targeting in Yarrowia lipolytica and Saccharomyces cerevisiae. Autophagy. 1:37–45. Neufeld, T.P. 2008. Genetic manipulation and monitoring of autophagy in Drosophila. Methods Enzymol. 451:653–67. doi:10.1016/S0076-6879(08)03236-9. Nezis, I.P. 2012. Selective autophagy in Drosophila. Int. J. Cell Biol. 2012:146767. doi:10.1155/2012/146767. 114
Nickerson, D.P., C.L. Brett, és A.J. Merz. 2009. Vps-C complexes: gatekeepers of endolysosomal traffic. Curr. Opin. Cell Biol. 21:543–51. doi:10.1016/j.ceb.2009.05.007. Nordmann, M., M. Cabrera, A. Perz, C. Bröcker, C.W. Ostrowicz, S. Engelbrecht-Vandré, és C. Ungermann. 2010. The Mon1-Ccz1 complex is the GEF of the late endosomal Rab7 homolog Ypt7. Curr. Biol. 20:1654–9. doi:10.1016/j.cub.2010.08.002. Novak, I., V. Kirkin, D.G. McEwan, J. Zhang, P. Wild, A. Rozenknop, V. Rogov, F. Löhr, D. Popovic, A. Occhipinti, A.S. Reichert, J. Terzic, V. Dötsch, P. a Ney, és I. Dikic. 2010. Nix is a selective autophagy receptor for mitochondrial clearance. EMBO Rep. 11:45–51. doi:10.1038/embor.2009.256. Numrich, J., és C. Ungermann. 2013. Endocytic Rabs in membrane trafficking and signaling. Biol. Chem. doi:10.1515/hsz-2013-0258. Odorizzi, G., M. Babst, és S.D. Emr. 1998. Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95:847–58. Oeste, C.L., E. Seco, W.F. Patton, P. Boya, és D. Pérez-Sala. 2012. Interactions between autophagic and endo-lysosomal markers in endothelial cells. Histochem. Cell Biol. doi:10.1007/s00418-012-1057-6. Olkkonen, V.M., P. Dupree, I. Killisch, a Lütcke, M. Zerial, és K. Simons. 1993. Molecular cloning and subcellular localization of three GTP-binding proteins of the rab subfamily. J. Cell Sci. 106 ( Pt 4:1249–61. Page, L.J., és M.S. Robinson. 1995. Targeting signals and subunit interactions in coated vesicle adaptor complexes. J. Cell Biol. 131:619–30. Pan, X., S. Eathiraj, M. Munson, és D.G. Lambright. 2006. TBC-domain GAPs for Rab GTPases accelerate GTP hydrolysis by a dual-finger mechanism. Nature. 442:303–6. doi:10.1038/nature04847. Pandey, U.B., és C.D. Nichols. 2011. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63:411–36. doi:10.1124/pr.110.003293. Pandey, U.B., Z. Nie, Y. Batlevi, B.A. McCray, G.P. Ritson, N.B. Nedelsky, S.L. Schwartz, N.A. DiProspero, M.A. Knight, O. Schuldiner, R. Padmanabhan, M. Hild, D.L. Berry, D. Garza, C.C. Hubbert, T.-P. Yao, E.H. Baehrecke, és J.P. Taylor. 2007. HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS. Nature. 447:859–63. doi:10.1038/nature05853. Pankiv, S., E. a Alemu, A. Brech, J.-A. Bruun, T. Lamark, A. Overvatn, G. Bjørkøy, és T. Johansen. 2010. FYCO1 is a Rab7 effector that binds to LC3 and PI3P to mediate microtubule plus end-directed vesicle transport. J. Cell Biol. 188:253–69. doi:10.1083/jcb.200907015. Pankiv, S., T.H. Clausen, T. Lamark, A. Brech, J.-A. Bruun, H. Outzen, A. Øvervatn, G. Bjørkøy, és T. Johansen. 2007. p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation
115
of ubiquitinated protein aggregates by autophagy. J. Biol. Chem. 282:24131–45. doi:10.1074/jbc.M702824200. Parton, R.G., M. Hanzal-Bayer, és J.F. Hancock. 2006. Biogenesis of caveolae: a structural model for caveolin-induced domain formation. J. Cell Sci. 119:787–96. doi:10.1242/jcs.02853. Parton, R.G., és M.A. del Pozo. 2013. Caveolae as plasma membrane sensors, protectors and organizers. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14:98–112. doi:10.1038/nrm3512. Parton, R.G., és K. Simons. 2007. The multiple faces of caveolae. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8:185–94. doi:10.1038/nrm2122. Peplowska, K., D.F. Markgraf, C.W. Ostrowicz, G. Bange, és C. Ungermann. 2007. The CORVET tethering complex interacts with the yeast Rab5 homolog Vps21 and is involved in endo-lysosomal biogenesis. Dev. Cell. 12:739–50. doi:10.1016/j.devcel.2007.03.006. Peralta, E.R., B.C. Martin, és A.L. Edinger. 2010. Differential effects of TBC1D15 and mammalian Vps39 on Rab7 activation state, lysosomal morphology, and growth factor dependence. J. Biol. Chem. 285:16814–21. doi:10.1074/jbc.M110.111633. Peters, J.M., W.W. Franke, és J.A. Kleinschmidt. 1994. Distinct 19 S and 20 S subcomplexes of the 26 S proteasome and their distribution in the nucleus and the cytoplasm. J. Biol. Chem. 269:7709–18. Pickart, C.M., és M.J. Eddins. 2004. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochim. Biophys. Acta. 1695:55–72. doi:10.1016/j.bbamcr.2004.09.019. Pircs, K., P. Nagy, Á. Varga, Z. Venkei, B. Erdi, K. Hegedűs, és G. Juhász. 2012. Advantages and limitations of different p62-based assays for estimating autophagic activity in Drosophila. PLoS One. 7:e44214. doi:10.1371/journal.pone.0044214. Poteryaev, D., S. Datta, K. Ackema, M. Zerial, és A. Spang. 2010. Identification of the switch in early-to-late endosome transition. Cell. 141:497–508. doi:10.1016/j.cell.2010.03.011. Pryor, P.R., B.M. Mullock, N. a Bright, M.R. Lindsay, S.R. Gray, S.C.W. Richardson, A. Stewart, D.E. James, R.C. Piper, és J.P. Luzio. 2004. Combinatorial SNARE complexes with VAMP7 or VAMP8 define different late endocytic fusion events. EMBO Rep. 5:590–5. doi:10.1038/sj.embor.7400150. Pulipparacharuvil, S., M.A. Akbar, S. Ray, E.A. Sevrioukov, A.S. Haberman, J. Rohrer, és H. Krämer. 2005. Drosophila Vps16A is required for trafficking to lysosomes and biogenesis of pigment granules. J. Cell Sci. 118:3663–73. doi:10.1242/jcs.02502. Punnonen, E.L., S. Autio, H. Kaija, és H. Reunanen. 1993. Autophagic vacuoles fuse with the prelysosomal compartment in cultured rat fibroblasts. Eur. J. Cell Biol. 61:54–66. Puri, C., M. Renna, C.F. Bento, K. Moreau, és D.C. Rubinsztein. 2013. Diverse autophagosome membrane sources coalesce in recycling endosomes. Cell. 154:1285–99. doi:10.1016/j.cell.2013.08.044.
116
Ragusa, M.J., R.E. Stanley, és J.H. Hurley. 2012. Architecture of the Atg17 complex as a scaffold for autophagosome biogenesis. Cell. 151:1501–12. doi:10.1016/j.cell.2012.11.028. Raiborg, C., K.G. Bache, D.J. Gillooly, I.H. Madshus, E. Stang, és H. Stenmark. 2002. Hrs sorts ubiquitinated proteins into clathrin-coated microdomains of early endosomes. Nat. Cell Biol. 4:394–8. doi:10.1038/ncb791. Raiborg, C., és H. Stenmark. 2009. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458:445–52. doi:10.1038/nature07961. Ravikumar, B., S. Imarisio, S. Sarkar, C.J. O’Kane, és D.C. Rubinsztein. 2008. Rab5 modulates aggregation and toxicity of mutant huntingtin through macroautophagy in cell and fly models of Huntington disease. J. Cell Sci. 121:1649–60. doi:10.1242/jcs.025726. Ravikumar, B., K. Moreau, L. Jahreiss, C. Puri, és D.C. Rubinsztein. 2010. Plasma membrane contributes to the formation of pre-autophagosomal structures. Nat. Cell Biol. 12:747– 57. doi:10.1038/ncb2078. Ravikumar, B., C. Vacher, Z. Berger, J.E. Davies, S. Luo, L.G. Oroz, F. Scaravilli, D.F. Easton, R. Duden, C.J. O’Kane, és D.C. Rubinsztein. 2004. Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nat. Genet. 36:585–95. doi:10.1038/ng1362. Razi, M., E.Y.W. Chan, és S.A. Tooze. 2009. Early endosomes and endosomal coatomer are required for autophagy. J. Cell Biol. 185:305–21. doi:10.1083/jcb.200810098. Reggiori, F., M. Komatsu, K.D. Finley, és A. Simonsen. 2012. Autophagy: more than a nonselective pathway. Int. J. Cell Biol. 2012:219625. doi:10.1155/2012/219625. Reggiori, F., K. a Tucker, P.E. Strømhaug, és D.J. Klionsky. 2004. The Atg1-Atg13 complex regulates Atg9 and Atg23 retrieval transport from the pre-autophagosomal structure. Dev. Cell. 6:79–90. De Renzis, S., B. Sönnichsen, és M. Zerial. 2002. Divalent Rab effectors regulate the subcompartmental organization and sorting of early endosomes. Nat. Cell Biol. 4:124–33. doi:10.1038/ncb744. Richards, P., C. Didszun, S. Campesan, A. Simpson, B. Horley, K.W. Young, P. Glynn, K. Cain, C.P. Kyriacou, F. Giorgini, és P. Nicotera. 2011. Dendritic spine loss and neurodegeneration is rescued by Rab11 in models of Huntington’s disease. Cell Death Differ. 18:191–200. doi:10.1038/cdd.2010.127. Romanov, J., M. Walczak, I. Ibiricu, S. Schüchner, E. Ogris, C. Kraft, és S. Martens. 2012. Mechanism and functions of membrane binding by the Atg5-Atg12/Atg16 complex during autophagosome formation. EMBO J. 31:4304–17. doi:10.1038/emboj.2012.278. Del Roso, A., S. Vittorini, G. Cavallini, A. Donati, Z. Gori, M. Masini, M. Pollera, és E. Bergamini. 2003. Ageing-related changes in the in vivo function of rat liver macroautophagy and proteolysis. Exp. Gerontol. 38:519–27.
117
Rubinsztein, D.C., G. Mariño, és G. Kroemer. 2011. Autophagy and aging. Cell. 146:682–95. doi:10.1016/j.cell.2011.07.030. Russell, R.C., Y. Tian, H. Yuan, H.W. Park, Y.-Y. Chang, J. Kim, H. Kim, T.P. Neufeld, A. Dillin, és K.-L. Guan. 2013. ULK1 induces autophagy by phosphorylating Beclin-1 and activating VPS34 lipid kinase. Nat. Cell Biol. 15:1–12. doi:10.1038/ncb2757. Rusten, T.E., T. Vaccari, K. Lindmo, L.M.W. Rodahl, I.P. Nezis, C. Sem-Jacobsen, F. Wendler, J.P. Vincent, A. Brech, D. Bilder, és H. Stenmark. 2007. ESCRTs and Fab1 regulate distinct steps of autophagy. Curr. Biol. 17:1817–25. doi:10.1016/j.cub.2007.09.032. Sandvig, K., S. Pust, T. Skotland, és B. van Deurs. 2011. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23:413–20. doi:10.1016/j.ceb.2011.03.007. Sargiacomo, M., P.E. Scherer, Z. Tang, E. Kübler, K.S. Song, M.C. Sanders, és M.P. Lisanti. 1995. Oligomeric structure of caveolin: implications for caveolae membrane organization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92:9407–11. Satoo, K., N.N. Noda, H. Kumeta, Y. Fujioka, N. Mizushima, Y. Ohsumi, és F. Inagaki. 2009. The structure of Atg4B-LC3 complex reveals the mechanism of LC3 processing and delipidation during autophagy. EMBO J. 28:1341–50. doi:10.1038/emboj.2009.80. Schwake, M., B. Schröder, és P. Saftig. 2013. Lysosomal Membrane Proteins and their central role in physiology. Traffic. doi:10.1111/tra.12056. Scott, R.C., G. Juhász, és T.P. Neufeld. 2007. Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death. Curr. Biol. 17:1–11. doi:10.1016/j.cub.2006.10.053. Scott, R.C., O. Schuldiner, és T.P. Neufeld. 2004. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Dev. Cell. 7:167–78. doi:10.1016/j.devcel.2004.07.009. Sekito, T., T. Kawamata, R. Ichikawa, K. Suzuki, és Y. Ohsumi. 2009. Atg17 recruits Atg9 to organize the pre-autophagosomal structure. Genes Cells. 14:525–38. doi:10.1111/j.1365-2443.2009.01299.x. Sheff, D., E. a Daro, M. Hull, és I. Mellman. 1999. The receptor recycling pathway contains two distinct populations of early endosomes with different sorting functions. J. Cell Biol. 145:123–39. Shintani, T., N. Mizushima, Y. Ogawa, a Matsuura, T. Noda, és Y. Ohsumi. 1999. Apg10p, a novel protein-conjugating enzyme essential for autophagy in yeast. EMBO J. 18:5234– 41. doi:10.1093/emboj/18.19.5234. Shravage, B. V, J.H. Hill, C.M. Powers, L. Wu, és E.H. Baehrecke. 2013. Atg6 is required for multiple vesicle trafficking pathways and hematopoiesis in Drosophila. Development. 140:1321–9. doi:10.1242/dev.089490.
118
Simonsen, A., H.C.G. Birkeland, D.J. Gillooly, N. Mizushima, A. Kuma, T. Yoshimori, T. Slagsvold, A. Brech, és H. Stenmark. 2004. Alfy, a novel FYVE-domain-containing protein associated with protein granules and autophagic membranes. J. Cell Sci. 117:4239–51. doi:10.1242/jcs.01287. Simonsen, A., R.C. Cumming, A. Brech, P. Isakson, D.R. Schubert, és K.D. Finley. 2008. Promoting basal levels of autophagy in the nervous system enhances longevity and oxidant resistance in adult Drosophila. Autophagy. 4:176–84. Simonsen, A., R. Lippé, S. Christoforidis, J.M. Gaullier, A. Brech, J. Callaghan, B.H. Toh, C. Murphy, M. Zerial, és H. Stenmark. 1998. EEA1 links PI(3)K function to Rab5 regulation of endosome fusion. Nature. 394:494–8. doi:10.1038/28879. Van der Sluijs, P., M. Hull, P. Webster, P. Mâle, B. Goud, és I. Mellman. 1992. The small GTPbinding protein rab4 controls an early sorting event on the endocytic pathway. Cell. 70:729–40. Smith, D.M., S.-C. Chang, S. Park, D. Finley, Y. Cheng, és A.L. Goldberg. 2007. Docking of the proteasomal ATPases’ carboxyl termini in the 20S proteasome's alpha ring opens the gate for substrate entry. Mol. Cell. 27:731–44. doi:10.1016/j.molcel.2007.06.033. Sokolowski, M.B. 2001. Drosophila: genetics meets behaviour. Nat. Rev. Genet. 2:879–90. doi:10.1038/35098592. Solinger, J. a, és A. Spang. 2013. Tethering complexes in the endocytic pathway: CORVET and HOPS. FEBS J. doi:10.1111/febs.12151. Spang, A. 2009. On the fate of early endosomes. Biol. Chem. 390:753–9. doi:10.1515/BC.2009.056. Stenmark, H. 2009. Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10:513–25. doi:10.1038/nrm2728. Stenmark, H., G. Vitale, O. Ullrich, és M. Zerial. 1995. Rabaptin-5 is a direct effector of the small GTPase Rab5 in endocytic membrane fusion. Cell. 83:423–32. Strømhaug, P.E., T.O. Berg, M. Fengsrud, és P.O. Seglen. 1998. Purification and characterization of autophagosomes from rat hepatocytes. Biochem. J. 335 ( Pt 2:217– 24. Sun, Q., W. Westphal, K.N. Wong, I. Tan, és Q. Zhong. 2010. Rubicon controls endosome maturation as a Rab7 effector. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107:19338–43. doi:10.1073/pnas.1010554107. Sun, Q., J. Zhang, W. Fan, K.N. Wong, X. Ding, S. Chen, és Q. Zhong. 2011. The RUN domain of rubicon is important for hVps34 binding, lipid kinase inhibition, and autophagy suppression. J. Biol. Chem. 286:185–91. doi:10.1074/jbc.M110.126425. Sunio, A., A.B. Metcalf, és H. Krämer. 1999. Genetic dissection of endocytic trafficking in Drosophila using a horseradish peroxidase-bride of sevenless chimera: hook is required for normal maturation of multivesicular endosomes. Mol. Biol. Cell. 10:847–59. 119
Suraweera, A., C. Münch, A. Hanssum, és A. Bertolotti. 2012. Failure of amino acid homeostasis causes cell death following proteasome inhibition. Mol. Cell. 48:242–53. doi:10.1016/j.molcel.2012.08.003. Suzuki, K., Y. Kubota, T. Sekito, és Y. Ohsumi. 2007. Hierarchy of Atg proteins in preautophagosomal structure organization. Genes Cells. 12:209–18. doi:10.1111/j.13652443.2007.01050.x. Suzuki, K., és Y. Ohsumi. 2010. Current knowledge of the pre-autophagosomal structure (PAS). FEBS Lett. 584:1280–6. doi:10.1016/j.febslet.2010.02.001. Szatmári, Z., V. Kis, M. Lippai, K. Hegedus, T. Faragó, P. Lorincz, T. Tanaka, G. Juhász, és M. Sass. 2013. Rab11 facilitates crosstalk between autophagy and endosomal pathway through regulation of Hook localization. Mol. Biol. Cell. doi:10.1091/mbc.E13-10-0574. Tabata, K., K. Matsunaga, A. Sakane, T. Sasaki, T. Noda, és T. Yoshimori. 2010. Rubicon and PLEKHM1 negatively regulate the endocytic/autophagic pathway via a novel Rab7binding domain. Mol. Biol. Cell. 21:4162–72. doi:10.1091/mbc.E10-06-0495. Takahashi, Y., D. Coppola, N. Matsushita, H.D. Cualing, M. Sun, Y. Sato, C. Liang, J.U. Jung, J.Q. Cheng, J.J. Mulé, W.J. Pledger, és H. Wang. 2007. Bif-1 interacts with Beclin 1 through UVRAG and regulates autophagy and tumorigenesis. Nat. Cell Biol. 9:1142–51. doi:10.1038/ncb1634. Takats, S., P. Nagy, a. Varga, K. Pircs, M. Karpati, K. Varga, a. L. Kovacs, K. Hegedus, és G. Juhasz. 2013. Autophagosomal Syntaxin17-dependent lysosomal degradation maintains neuronal function in Drosophila. J. Cell Biol. 201:531–539. doi:10.1083/jcb.201211160. Talaber, G., G. Miklossy, Z. Oaks, Y. Liu, S. a Tooze, D.M. Chudakov, K. Banki, és A. Perl. 2014. HRES-1/Rab4 Promotes the Formation of LC3(+) Autophagosomes and the Accumulation of Mitochondria during Autophagy. PLoS One. 9:e84392. doi:10.1371/journal.pone.0084392. Tanaka, K. 2009. The proteasome: Overview of structure and functions. Proc. Japan Acad. Ser. B. 85:12–36. doi:10.2183/pjab.85.12. Tanaka, T., és A. Nakamura. 2008. The endocytic pathway acts downstream of Oskar in Drosophila germ plasm assembly. Development. 135:1107–17. doi:10.1242/dev.017293. Tang, H.-W., Y.-B. Wang, S.-L. Wang, M.-H. Wu, S.-Y. Lin, és G.-C. Chen. 2011. Atg1-mediated myosin II activation regulates autophagosome formation during starvation-induced autophagy. EMBO J. 30:636–51. doi:10.1038/emboj.2010.338. Tanida, I., N. Mizushima, M. Kiyooka, M. Ohsumi, T. Ueno, Y. Ohsumi, és E. Kominami. 1999. Apg7p/Cvt2p: A novel protein-activating enzyme essential for autophagy. Mol. Biol. Cell. 10:1367–79. Tanida, I., E. Tanida-Miyake, M. Komatsu, T. Ueno, és E. Kominami. 2002. Human Apg3p/Aut1p homologue is an authentic E2 enzyme for multiple substrates, GATE-16, GABARAP, and MAP-LC3, and facilitates the conjugation of hApg12p to hApg5p. J. Biol. Chem. 277:13739–44. doi:10.1074/jbc.M200385200. 120
Tanida, I., E. Tanida-Miyake, T. Ueno, és E. Kominami. 2001. The human homolog of Saccharomyces cerevisiae Apg7p is a Protein-activating enzyme for multiple substrates including human Apg12p, GATE-16, GABARAP, and MAP-LC3. J. Biol. Chem. 276:1701–6. doi:10.1074/jbc.C000752200. Teis, D., S. Saksena, B.L. Judson, és S.D. Emr. 2010. ESCRT-II coordinates the assembly of ESCRT-III filaments for cargo sorting and multivesicular body vesicle formation. EMBO J. 29:871–83. doi:10.1038/emboj.2009.408. Theodosiou, N.A., és T. Xu. 1998. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14:355–65. doi:10.1006/meth.1998.0591. Thumm, M., R. Egner, B. Koch, M. Schlumpberger, M. Straub, M. Veenhuis, és D.H. Wolf. 1994. Isolation of autophagocytosis mutants of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 349:275–80. Tian, E., F. Wang, J. Han, és H. Zhang. 2009. epg-1 functions in autophagy-regulated processes and may encode a highly divergent Atg13 homolog in C. elegans. Autophagy. 5:608–15. Tomko, R.J., és M. Hochstrasser. 2013. Molecular architecture and assembly of the eukaryotic proteasome. Annu. Rev. Biochem. 82:415–45. doi:10.1146/annurevbiochem-060410-150257. Tooze, J., M. Hollinshead, T. Ludwig, K. Howell, B. Hoflack, és H. Kern. 1990. In exocrine pancreas, the basolateral endocytic pathway converges with the autophagic pathway immediately after the early endosome. J. Cell Biol. 111:329–45. Tsukada, M., és Y. Ohsumi. 1993. Isolation and characterization of autophagy-defective mutants of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 333:169–74. Valsdottir, R., H. Hashimoto, K. Ashman, T. Koda, B. Storrie, és T. Nilsson. 2001. Identification of rabaptin-5, rabex-5, and GM130 as putative effectors of rab33b, a regulator of retrograde traffic between the Golgi apparatus and ER. FEBS Lett. 508:201–9. Vellai, T., K. Takács-Vellai, M. Sass, és D.J. Klionsky. 2009. The regulation of aging: does autophagy underlie longevity? Trends Cell Biol. 19:487–94. doi:10.1016/j.tcb.2009.07.007. Walczak, M., és S. Martens. 2013. Dissecting the role of the Atg12-Atg5-Atg16 complex during autophagosome formation. Autophagy. 9:424–5. doi:10.4161/auto.22931. Wang, C., Z. Liu, és X. Huang. 2012. Rab32 Is Important for Autophagy and Lipid Storage in Drosophila. 7:1–9. doi:10.1371/journal.pone.0032086. Wang, J., S. Menon, a. Yamasaki, H.-T. Chou, T. Walz, Y. Jiang, és S. Ferro-Novick. 2013. Ypt1 recruits the Atg1 kinase to the preautophagosomal structure. Proc. Natl. Acad. Sci. 1–6. doi:10.1073/pnas.1302337110.
121
Wang, T., Z. Ming, W. Xiaochun, és W. Hong. 2011. Rab7: role of its protein interaction cascades in endo-lysosomal traffic. Cell. Signal. 23:516–21. doi:10.1016/j.cellsig.2010.09.012. Webber, J.L., A.R.J. Young, és S. a Tooze. 2007. Atg9 trafficking in Mammalian cells. Autophagy. 3:54–6. Wei, H., S. Wei, B. Gan, X. Peng, W. Zou, és J.-L. Guan. 2011. Suppression of autophagy by FIP200 deletion inhibits mammary tumorigenesis. Genes Dev. 25:1510–27. doi:10.1101/gad.2051011. Wei, J., S. Fain, C. Harrison, L.A. Feig, és J.D. Baleja. 2006. Molecular dissection of Rab11 binding from coiled-coil formation in the Rab11-FIP2 C-terminal domain. Biochemistry. 45:6826–34. doi:10.1021/bi052655o. Williams, A., L. Jahreiss, S. Sarkar, S. Saiki, F.M. Menzies, B. Ravikumar, és D.C. Rubinsztein. 2006. Aggregate-prone proteins are cleared from the cytosol by autophagy: therapeutic implications. Curr. Top. Dev. Biol. 76:89–101. doi:10.1016/S0070-2153(06)76003-3. Williams, R.L., és S. Urbé. 2007. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8:355–68. doi:10.1038/nrm2162. Wilson, R.C., és J.A. Doudna. 2013. Molecular mechanisms of RNA interference. Annu. Rev. Biophys. 42:217–39. doi:10.1146/annurev-biophys-083012-130404. Winslow, A.R., C. Chen, S. Corrochano, A. Acevedo-arozena, D.E. Gordon, A.A. Peden, M. Lichtenberg, F.M. Menzies, B. Ravikumar, S. Imarisio, S. Brown, C.J.O. Kane, és D.C. Rubinsztein. 2010. Alpha -Synuclein impairs macroautophagy: implications for Parkinson’s disease. 190:1023–1037. doi:10.1083/jcb.201003122. Winslow, A.R., és D.C. Rubinsztein. 2008. Autophagy in neurodegeneration and development. Biochim. Biophys. Acta. 1782:723–9. doi:10.1016/j.bbadis.2008.06.010. Wollert, T., C. Wunder, J. Lippincott-Schwartz, és J.H. Hurley. 2009. Membrane scission by the ESCRT-III complex. Nature. 458:172–7. doi:10.1038/nature07836. Wong, E., és A.M. Cuervo. 2010. Integration of clearance mechanisms: the proteasome and autophagy. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a006734. doi:10.1101/cshperspect.a006734. Wurmser, a E., T.K. Sato, és S.D. Emr. 2000. New component of the vacuolar class C-Vps complex couples nucleotide exchange on the Ypt7 GTPase to SNARE-dependent docking and fusion. J. Cell Biol. 151:551–62. Yamamoto, H., S. Kakuta, T.M. Watanabe, A. Kitamura, T. Sekito, C. Kondo-Kakuta, R. Ichikawa, M. Kinjo, és Y. Ohsumi. 2012. Atg9 vesicles are an important membrane source during early steps of autophagosome formation. J. Cell Biol. 198:219–33. doi:10.1083/jcb.201202061.
122
Yan, J., H. Kuroyanagi, a Kuroiwa, Y. Matsuda, H. Tokumitsu, T. Tomoda, T. Shirasawa, és M. Muramatsu. 1998. Identification of mouse ULK1, a novel protein kinase structurally related to C. elegans UNC-51. Biochem. Biophys. Res. Commun. 246:222–7. Yen, W.-L., T. Shintani, U. Nair, Y. Cao, B.C. Richardson, Z. Li, F.M. Hughson, M. Baba, és D.J. Klionsky. 2010. The conserved oligomeric Golgi complex is involved in doublemembrane vesicle formation during autophagy. J. Cell Biol. 188:101–14. doi:10.1083/jcb.200904075. Ylä-Anttila, P., H. Vihinen, E. Jokitalo, és E.-L. Eskelinen. 2009. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5:1180– 5. Yorimitsu, T., és D.J. Klionsky. 2005. Atg11 Links Cargo to the Vesicle-forming Machinery in the Cytoplasm to Vacuole Targeting Pathway. 16:1593–1605. doi:10.1091/mbc.E04. Young, A.R.J., E.Y.W. Chan, X.W. Hu, R. Köchl, S.G. Crawshaw, S. High, D.W. Hailey, J. Lippincott-Schwartz, és S.A. Tooze. 2006. Starvation and ULK1-dependent cycling of mammalian Atg9 between the TGN and endosomes. J. Cell Sci. 119:3888–900. doi:10.1242/jcs.03172. Zeng, X., J.H. Overmeyer, és W. a Maltese. 2006. Functional specificity of the mammalian Beclin-Vps34 PI 3-kinase complex in macroautophagy versus endocytosis and lysosomal enzyme trafficking. J. Cell Sci. 119:259–70. doi:10.1242/jcs.02735. Zhang, H., M. Bosch-Marce, L. a Shimoda, Y.S. Tan, J.H. Baek, J.B. Wesley, F.J. Gonzalez, és G.L. Semenza. 2008. Mitochondrial autophagy is an HIF-1-dependent adaptive metabolic response to hypoxia. J. Biol. Chem. 283:10892–903. doi:10.1074/jbc.M800102200. Zhang, X.-M., S. Ellis, A. Sriratana, C. a Mitchell, és T. Rowe. 2004. Sec15 is an effector for the Rab11 GTPase in mammalian cells. J. Biol. Chem. 279:43027–34. doi:10.1074/jbc.M402264200. Zhao, Y., és D. Srivastava. 2007. A developmental view of microRNA function. Trends Biochem. Sci. 32:189–97. doi:10.1016/j.tibs.2007.02.006. Zhong, Y., Q.J. Wang, X. Li, Y. Yan, J.M. Backer, B.T. Chait, N. Heintz, és Z. Yue. 2009. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell Biol. 11:468–76. doi:10.1038/ncb1854. Zhou, M., és R. Wang. 2013. Small-molecule regulators of autophagy and their potential therapeutic applications. ChemMedChem. 8:694–707. doi:10.1002/cmdc.201200560. Zoppino, F.C.M., R.D. Militello, I. Slavin, C. Alvarez, és M.I. Colombo. 2010. Autophagosome formation depends on the small GTPase Rab1 and functional ER exit sites. Traffic. 11:1246–61. doi:10.1111/j.1600-0854.2010.01086.x.
123
