AZ ANGIOTENZIN II HATÁSÁRA BEKÖVETKEZŐ "PARADOX" RENIN TRANSZKRIPCIÓ FOKOZÓDÁS INTRACELLULÁRIS JELÁTVITELE Doktori (Ph.D.) értekezés Dr. Terebessy Tamás Témavezető
Konzulens
Dr. Rosivall László
Dr. Mucsi István
Egyetemi tanár
Egyetemi adjunktus
Semmelweis Egyetem Kórélettani Intézet 2005. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Elméleti orvostusdományok Tudományági Doktori Iskola
Szigorlati Bizottság: Dr. Monos Emil
Dr. Szabó Attila
Dr. Vörös Péter
Egyetemi tanár
Egyetemi adjunktus
Osztályvezető főorvos
Hivatalos bírálók: Dr. Rácz Károly
Dr. Kiss István
Egyetemi tanár
Osztályvezető főorvos
Tartalomjegyzék 1. Összefoglalás / Summar y…………………………… …………………
4
2 . Áb rák és tá bl áza tok jeg yz éke… ……… …… ……… …… ……… …… ……… … .
6
3 . R ö vi d ítések je g yzéke ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… ……… … .
7
4 . Be veze tés ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… ……… … ..
8
4 .1 . A ren in -an gi o tenz in r endsze r……… …… ……… …… ……… …… …… .
8
4 . 2 . Sz ö ve ti r e ni n-an gi o te nz i n r en ds z er ek …… ……… …… ……… …… … .
9
4 .3 . A ren in sz ekréc ió sz abá l yozás a…… …… ……… …… ……… …… ……
10
4 .4 . A ren in sz ekréc ió par ado x sza bá lyozása ……… …… ……… …… … ..
11
4.5. A R enin gén tr anszkr ipc iójának sz abályoz ása……………………….
12
4 . 6 . Az A ng I I A T1 r ec e p tor ál t al k öz v etített intr acelluláris jelátvitele..
14
4 .6 .1 . M AP k ináz ak tivác ió ………… ……… …… ……… …… ……… … .
16
4.6.1.1. Az ER K kaszkád…………………………………………..
17
4.6.1.2. A JN K kaszkád…………………………………………….
19
4 . 6 .1 .3 . A p 38 MA P k in áz r e nds z e r ……… …… ……… …… … . .
21
4 .6 .2 . T ir oz in k ináz ak ti vác ió…… ……… …… ……… …… ……… ……
21
4 .6 .2 .1 . Az Src k ináz ok… ……… …… ……… …… ……… …… … .
22
4 .6 .2 .2 . A Ja nus k ináz csa lá d…… ……… …… ……… …… …… .
22
4 .6 .2 .3 . A F oká l is Adh ézi ós Ki náz ……… …… ……… …… …… .
23
4 . 6 .2 .4 . A k a lc iu m dep end ens p r o t ei n k i náz… ……… …… … . .
23
4 . 6 .2 .5 . A r ec ep to r t ir oz in k in áz ok … ……… …… ……… …… …
23
4 . 6 .2 .6 . Tov á bb i ti r oz in k in áz ok … ……… …… ……… …… …… .
24
4 . 7 . Az A ng I I k éső i i ntrac e ll ul áris h a tása i…… ……… …… ……… …… … .
25
4 .8 . Kís ér le tei nk ter vez ése… …… ……… …… ……… …… ……… …… …… ..
27
5 . C élk i tűzés ek , h ipo téz isek ……… ……… …… ……… …… ……… …… ……… … .
28
6 . Alka lm azo tt an ya gok és mó dsze rek… …… ……… …… ……… …… ……… … ..
29
6 .1 . El mé leti há ttér …… ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… ……
29
6 .1 .1 . A tranz ie ns tra nsz fekc ió …… ……… …… ……… …… ……… … .
29
6 .1 .2 . A más od lag os r ip or ter plazmidok h aszn ála ta… …… ……… .
30
6 .2 . An ya gok ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… …… .
31
6 .3 . Sej tek… ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… …… .
31
6 .4 . Plaz m id ok…… …… ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… …… .
32
2
6 .5 . Mó dsze rek… ……… ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… …… .
34
6 .5 .1 . Pl azm i d pre pará lás ………… ……… …… ……… …… ……… … ..
34
6 .5 .2 . T ranz iens tr ansz fekc ió ……… ……… …… ……… …… ……… …
35
6 .5 .3 . Wester n b lo t…… ……… …… ……… …… ……… …… ……… ……
36
6 .5 .4 . Sta tisz tika i ér téke lés ………… ……… …… ……… …… ……… ..
36
7 . Kísé rl e ti er ed mén yek ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… ……… … .
37
7 . 1 . Az A ng I I A T1 r ec e p tor on k er es z t ü l f ok oz z a a c - fos pr om ó ter transzkr ipciós ak tivitásá t………………………………… ……………………. 7 .2 . Az Ang II fokozza a k o transzfek tált máso dlagos ripo rter p laz midok β -ga lak tozid áz ak ti vi tás á t…… …… ……… …… ……… …… …… 7 .3 . A sz éru m fokozz a a k o transzfek tált máso dlagos ripo rter p laz midok β -ga lak tozid áz ak ti vi tás á t…… …… ……… …… ……… …… …… 7.4. Az AngII fokozza a β-g alak toz id áz ak tivitás t az ön álló an TK β r ip or terr el tr ansz fek tált se jtek ben… ……… …… ……… …… ……… …… … 7 .5 . A PI3-k ináz és a PKC enz imek ne m be fo lyás olják az Ang II ok oz ta c- fos pr om ó ter ak ti vác ió t… ……… …… ……… …… ……… …… ……
37 38 39 39 41
7 . 6 . Az ERK k as z k á d s z e r ep e a c - fos pro mó t er ak t i vá ló dásá ban … … .
42
7 .7 . A p21Rac 1 feh érje r észt vesz a c- fos p romó ter ak tivác iób an… …
43
7 . 8 . Az A ng I I A T1 r ec e p tor on k er es z t ü l f ok oz z a a p r oxi m ál is r e ni n promóter transzkr ipc iós ak tivitását…………… …………………………….. 7.9. Az AngII fokozza a k ülönböző hosszúságú proximális renin promóter ek transzkr ipc iós ak tivitás á t………………………………………..
44 45
7 .10 . Az An g II fokozza az ER K és JN K enz imek ak tivitás á t…… …… …
45
7 .11 . A JNK rész t vesz a r en in pr omó ter aktivá lásb an , d e az ER K kaszk ád n em j átsz ik sze rep e t a fo l ya ma tban ……… …… ……… …… ……
46
7 .12 . A PKC sze rep e… ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… …… .
48
7 . 13 . A ti r oz in k ináz ok g á tl ás a r és z leg es en k i véd i az An g I I ha t ás át …
49
7 .14 . A ti roz in k ináz ok és a JNK vi szon ya … ……… …… ……… …… ……
50
8 . Meg beszé lés ………… ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… ……… … ..
52
8 .1 . Me tod ika i k ísér l e te ink me gbesz élése…… ……… …… ……… …… … .
52
8 .2 . A c - fos pr omó ter An gII ha tásá ra b ekö ve tk ez ő transzkr ipc iós ak ti vi tás fokoz ódás ának je lá tvi tel e… ………… ……… …… ……… …… … .. 8.3. Az AngII által k i váltott „ par adox” renin transzkr ipció fok ozódás je lá tvite lének vizsg álata ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… ……
54 57
9. Következ tetések…………… ……..……………………………… ……………......
60
1 0 . Köszö ne tn yi l vá n ítás ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… ……… … .
62
1 1 . S a já t k öz le mé n yek jeg yz ék e
63
1 3 . Irod a lom j eg yzék …… ……… …… ……… …… ……… …… ……… …… ……… … .
64
3
1. Összefoglalás A renin-angiotenzin rendszer (RAS) több mint 100 éves története ellenére jelenleg is a kutatások középpontjában áll. Az utóbbi két évtizedben
felfedezett
szöveti
RAS
és
az
angiotenzin
II
(AngII)
növekedési faktorszerű hatásainak szabályozása és biológiai jelentősége korántsem ismert teljesen. Újabb megfigyelés, hogy állatkísérletes modellekben az AngII bizonyos körülmények között a jellegzetes hatásával ellentétben serkentheti a renin termelődését. Vizsgálataink során az AngII géntranszkripcióra kifejtett hatásait, és az AngII hatására bekövetkező ezen paradox renin stimulációt kívántuk tanulmányozni in vitro körülmények között. Tranziens transzfekció és western blot módszerek segítségével in vitro modellt hoztunk létre az AngII géntranszkripciót szabályozó hatásainak megfigyelésére. Kísérleteink során az AngII c-fos és renin promóterek transzkripciós
aktivitására
kifejtett
hatását,
valamint
a
hatás
intracelluláris szabályozó mechanizmusait vizsgáltuk. Eredményeink szerint az AngII az Extracelluláris szignál Regulálta Kináz
(ERK)
enzimről
elnevezett
jelátviteli
kaszkád
aktiválásán
keresztül stimulálja a c-fos promótert és a folyamatban részt vesz a Rac1 nevű kis G-fehérje. A renin promóter AngII általi paradox stimulációja pedig a c-Jun-N-terminális Kináz (JNK) enzim és tirozin kinázok útján valósul meg. Kísérletes modellünkben a JNK és a tirozin kinázok egyazon jelátviteli út elemei, amelyben vélhetőleg a tirozin kinázok játszanak szerepet a JNK enzim aktiválásában. Megítélésünk
szerint
eredményeink
a
lokális
RAS
aktivitásának
növekedésével járó progresszív szöveti fibrotikus folyamatok állandó fenntartásának egy lehetséges mechanizmusát körvonalazzák.
4
Summary Despite its more than 100 year history the renin angiotensin system (RAS) still stand sin the focus of investigations. The biological inportance and the regulation of the lately discovered tissue RAS and the growth factor like effects of Angiotensin II (AngII) are yet not clarified. It has recently been observed in animal models that contrary to its tipicall effect AngII may increase renin production in certain conditions. In our experiments the regulatory effects of AngII in gene transcription and the AngII induced paradox reni nstimulation has been studied using transient transfection and western blot methods in in vitro models. The effect of AngII on the transcriptional activity of c-fos and renin promoters and the intracellular regulatory mechanisms of this effect has been examined. Our results indicate that AngII stimulates c-fos promoter through the activation of the Extracellular Signal Regulated Kinase (ERK) cascade and that the Rac-1 smal G-protein is involved int he process. The paradox stimulation of the renin promoter due to AngII is performed through c-jun-N-terminal kinase (JNK) enzyme and tyrosin kinases. In our experimental model the JNK and the tyrosin kinases seem to be elements of the same signaling pathway, where tyrosin kinases contribute to the activation of the JNK enzyme. Our result suggest a possible mechanism for the maintenance of progressive tissue fibrosis with increased local RAS activity.
5
2. Ábrák és táblázatok jegyzéke 1. ábra:
A renin promóter szerkezete (12. oldal)
2. ábra:
Az AngII azonnali intracelluláris hatásai (14. oldal)
3. ábra:
Az AT1 receptor által aktivált jelátviteli utak (23. oldal)
4. ábra:
A c-fos promóter szerkezete és a kapcsolódó transzkripciós
faktorok (24. oldal) 5. ábra:
Az AngII hatása a c-fos promóter transzkripciós aktivitására
(36. oldal) 6. ábra:
Az
AngII
és
szérum
hatása
a
c-fos
promóter
mellé
kotranszfektált másodlagos riporter plazmidok aktivitására (38. oldal) 7. ábra:
Gátlószerek hatása a 10-7 M AngII hatására bekövetkezett c-
fos promóter aktivációra(40. oldal) 8. ábra:
Gátló
fehérjéket
kódoló
expressziós
vektorok
kotranszfekciójának hatása az AngII okozta c-fos aktiválódásra (41. oldal) 9. ábra:
Az AngII hatása a proximális renin promóter transzkripciós
aktivitására (42. oldal) 10. ábra:
Az AngII hatása az ERK és JNK enzimek aktivitására (44.
oldal) 11. ábra:
Az ERK kaszkád gátlásának hatása az AngII hatására
bekövetkező renin promóter stimulációra (45. oldal) 12. ábra:
A c-Src és a JNK kaszkád gátlásának hatása a paradox renin
promóter aktivációra (46. oldal) 13. ábra:
Gátlószerek
hatása
az
AngII
okozta
renin
promóter
stimulációra (48. oldal) 14. ábra:
A tirozin kináz gátlás hatása az AngII hatására bekövetkező
JNK aktivációra (49. oldal) 1. táblázat: A
kísérleteinkhez
használt
csoportosítva (31. oldal)
6
plazmidok
funkció
szerint
3. Rövidítések jegyzéke RAS
Renin Angiotenzin Rendszer
ERK
Extracelluláris szignál Regulálta Kináz
MAPK(KK) Mitogén Aktiválta Protein Kináz (kináz kináz) JNK
c-Jun-N-terminális Kináz
ACE
Angiotenzin Konvertáló Enzim
AT 1 , AT 2
Angiotenzin 1-es (2-es) típusú receptora
PDGF
Platelet Derived Growth Factor
EGF
Epidermal Growth Factor
FGF
Fibroblast Growth Factor
cAMP
Ciklikus Adenozin Monofoszfát
PCR
Polimeráz láncreakció
HEK
Human Embrional Kidney
Calu-6
Tüdő karcinóma sejtvonal
As4.1
Egér vesetumor sejtvonal
CRE
cAMP Response Element
CREB
CRE Binding Protein
Pit-1
Pituitary Transacting Factor
TNFα
Tumor Necrosis Factor α
IP 3
Inozitol triszfoszfát
PIP 2
Foszfoinozitol difoszfát
DAG
Diacilglicerol
PKC
Protein Kináz C
PLC
Foszfolipáz C
GTP
Guanozin Trifoszfát
CHO
Kínai hörcsög ovárium sejtvonal
LLC-PK1
Sertés proximális tubulushám sejtvonal
IGF
Insulin like Growth Factor
DRE
Directly Repeated Sequence
SIE
Sis Inducible Element
SRE
Serum Response Element
7
4. Bevezetés 4.1. A renin-angiotenzin rendszer A renin-angiotenzin rendszer (RAS) több mint 100 éves története Tigerstedt és Bergman nevével kezdődik, akik a veséből egy presszor hatású
anyagot
vontak
ki,
amelyet
reninnek
neveztek
el[1].
Az
angiotenzin azonosítására, szerkezetének pontos megismerésére, illetve a szisztémás
renin-angiotenzin
rendszer
funkcionális
feltárására
több
évtizedet kellett várni[2]. Az utóbbi két évtizedben derült fény a szisztémás
RAS
mellett
paralel
működő
szöveti
renin-angiotenzin
rendszerek létezésére. A szöveti szintű, parakrin és endokrin működés összetettsége az egyik oka annak, hogy a több mint egy évszázados intenzív kutatás ellenére a RAS működésének még mindig számos részlete nem ismert[3]. A
renin-angiotenzin
rendszer
a
vérnyomás
és
só-víz
háztartás
szabályozásának egyik legfontosabb tényezője. Működését befolyásoló gyógyszerek a magas vérnyomás betegség gyógyításának mindennapos eszközei. A renin-angiotenzin rendszer első eleme a májban szintetizált polipeptid, az
angiotenzinogén.
Az
angiotenzinogén
N
terminálisáról
a
vese
juxtaglomeruláris sejtjeiben termelődő renin (aszpartil proteáz enzim), a folyamat „rate limiting” lépéseként lehasítja az angiotenzin I nevű dekapeptidet. A tüdőben az angiotenzin konvertáló enzim – ACE (dipeptidil karboxipetidáz) tovább hasítja a molekulát, így képződik a biológiailag aktív angiotenzin II (AngII) nevű oktapeptid. Az AngII enzimatikusan angiotenzin
továbbhasad, IV
(angiotenzin
angiotenzin 3-8),
III
(angiotenzin
2-8),
illetve
angiotenzin
(1-7)
metabolitokra[4, 5]. Az AngII, az egyik leghatékonyabb vazopresszor, az érfali simaizomra hatva gyors és erős vazokonstrikciót okoz. A mellékvesekéregben az aldoszteron szekrécióját fokozva közvetett úton növeli a Na + - és vízvisszatartást, továbbá közvetlenül befolyásolja a vese proximális
8
tubulusaiban
a
Na +
transzportot.
A
postganglionáris
szimpatikus
neuronokon facilitálja a noradrenalin felszabadulást, továbbá az agyi cirkumventirkuláris magok révén serkenti a vízfelvételt. Fenti hatásaival az angiotenzin II (AngII) a szisztémás vérnyomás és az extracelluláris folyadék volumen állandó szinten tartásának döntő faktora[6]. Az AngII metabolitjainak biológiai hatásai kevésbé ismertek. Ferrario és mtsai. az angiotenzin (1-7) molekulát az AngII természetes kompetitív gátlószereként írja le, mivel vazodepresszor és antihipertenzív hatása van, továbbá vazodilatátor prosztaglandinokat és NO-t szabadít fel, valamint potencírozza a bradikinin hatásait[7]. A részletes leírás ellenére az angiotenzin II metabolitjainak pontos fiziológiai és patofiziológiai szerepe további tisztázásra szorul.
4.2. Szöveti renin-angiotenzin rendszerek Az utóbbi két évtized kutatásai tették egyértelművé, hogy a reninangiotenzin rendszer elemei számos szövetben lokálisan is előfordulnak. Szöveti ACE a legtöbb szervben - a szívben, az agyban, az erekben, a mellékvesékben, reproduktív
a
vesékben,
szervekben
–
a
májban,
egyaránt
a
hasnyálmirigyben
megtalálható[8-11].
és
a
Továbbá
felfedeztek ACE független AngII termelést is, ahol az AngI → AngII enzimatikus
lépést
a
katepszin
G,
különböző
karboxi
peptidázok,
kimázok is katalizálhatják. Az alternatív AngII termelődésnek a szöveti renin-angiotenzin rendszerek szintjén, valamint patológiás körülmények között tulajdonítanak jelentőséget[12-14]. A szövetekben képződő AngII AT 1 receptor által közvetítve gyors és erős simaizom összehúzódást, vazokonstrikciót okoz, amit a receptor - ligand kapcsolat létrejötte után másodpercekkel bekövetkező ún. azonnali intracelluláris szignaling mechanizmusok aktiválódásával magyaráznak (a sejten belüli jelátviteli utak részletes leírása a 4.6 fejezet témaköre). A
szöveti
renin-angiotenzin
rendszerek
működésének
részletesebb
megismerésekor derült fény arra, hogy az AngII a növekedési faktorokra jellemző
módon
az
AT 1
receptoron
9
keresztül
serkenti
a
tirozin
foszforillációt[15], aktiválja a MAP kináz jelátviteli utakat[16] és protoonkogének
(mint
pl.
a
c-fos
gén)
transzkripciós
aktivitását
fokozza[17]. A szövetekben keletkezett AngII-nek AT 1 receptoron keresztül az értónus fokozásán túlmenően ún. hosszú-távú hatásai is vannak.
Serkenti
kontraktilis
a
elemek
fehérjeszintézist,
ami
felszaporodásához
sejthipertrófiához
vezet.
A
TGFß
és
a
rendszer
aktiválásával az AngII fokozza az extracelluláris mátrix elemeinek (pl. kollagén, fibronektin) termelődését[18, 19]. A NADPH oxidáz enzim aktiválásán keresztül oxigén szabadgyökök keletkezését fokozza az AngII. Az oxidatív stressz az érfai simaizomsejtek trofikus válaszát generálja[20], gyulladáskeltő hatása van[21], valamint hozzájárul a magas vérnyomás betegség fenntartásához[22]. Az AngII más növekedési faktorok (pl. Platelet Derived Growth Factor (PDGF), Epidermal Growth Factor
(EGF),
Fibroblast
Growth
Factor
(FGF))
termelődésének
fokozásán keresztül szintén sejtproliferációt és hipertrófiát okoz[23]. AT 2 receptoron keresztül a fentiekkel részben ellentétesen apoptózist indukál, gátolja a proliferációt és a hipertrófiát[24].
4.3. A renin szekréció szabályozása A keringő renint a vese juxtaglomeruláris apparátusának módosult simaizom sejtjei termelik. A szekréciót a vese szimpatikus idegi aktivitása, az alacsony vese perfúziós nyomás, a plazma Na + szintjének csökkenése
stimulálhatja[25]. Élettani körülmények között a renin
elválasztást sejtszinten a cAMP, valamint a csökkent intracelluláris Ca + + szint serkenti[26]. A renin-angiotenzin rendszer fő terméke az AngII az endokrin
rendszereknél
megszokott
módon
negatív
feedback
mechanizmussal gátolja a vese juxtaglomeruláris sejtjeiben a renin elválasztását. megvalósul. közvetítésével szabályozás
A
negatív
feedback
Juxtaglomeruláris gátolja az
AngII
a
renin
direkt
sejteken gén
az
és
indirekt AngII
AT 1
expresszióját[27].
hemodinamikai
hatásainak
módon Az
is
receptor indirekt
következménye
(vérnyomásemelés, Na + visszatartás)[28]. A juxtaglomeruláris renin
10
expresszió szabályozása mellett számos szerző foglalkozik a lokális renin-angiotenzin
rendszerek
regulációjával
is.
A
vese
proximális
tubulus sejtekben renin mRNS-t tudtak kimutatni[29, 30]. Heinrich és mtsai. vizsgálatában az ACE gátlás, azaz az AngII csökkent szintje serkentette a renin mRNS termelődését, tehát feltételezhető az AngII negatív feedback hatása. A szerzők azonban felvetik, hogy lokálisan a proximális tubulusban a renin expressziójának szabályozása fiziológiás körülmények között is eltér attól, ami a juxtaglomeruláris rendszerben működik[31].
Patkányok
streptozotocin
indukálta
korai
cukorbetegségében a vese proximális tubulusában fokozódik a renin mRNS termelődése, ami azt sugallja, hogy patológiás körülmények között
a
renin-angiotenzin
rendszer
és
benne
a
renin
gén
rendszer
több
transzkripciójának regulációja tovább módosulhat[32].
4.4. A renin szekréció paradox szabályozása Az
angiotenzin
kórfolyamat,
II
és
többek
a
szöveti
között
a
renin-angiotenzin szívizom
hipertrófia[33],
az
ateroszklerózis[34], a vesefibrózis[35] kialakulásában és fenntartásában is jelentős szerepet játszik. A fenti kórfolyamatokban közös, hogy valamilyen szöveti sérülés vagy tartós kóros állapot következtében (pl. érfal sérülés, tartós falfeszülés, glomerulus pusztulás) megindult normál szöveti regenerációs (repair) folyamat túlburjánzása révén progresszív jellegűvé válnak, aminek szabályozásáról azonban keveset tudunk. Több publikáció közöl azonban olyan direkt, vagy indirekt bizonyítékokat, amelyek
arra
körülmények
utalnak, között
egy
hogy
bizonyos
paradox
–
pozitív
elsősorban feedback
patológiás szabályozást
fenntartva az AngII stimulálhatja a renin képződését. Lou és mtsai. patkány hipotalamusz renin mRNS szintjét PCR módszerrel mérték. Vizsgálataikban azt a meglepő eredményt kapták, hogy ACE gátló kezelés következtében, azaz csökkent AngII szint mellett a patkány hipotalamusz renin mRNS szintje csökken. Az észlelt szabályozás
11
ellentétes volt az ACE gátló kezelés vesében jól ismert renin mRNS termelést serkentő hatásával[36]. Újszülött patkány szívizomsejtekben in vitro körülmények között nyomás túlterhelés következtében kialakult mechanikai stressz, illetve AngII kezelés direkt módon fokozta a RAS elemeinek termelődését, így a renin gén expresszióját is[37]. A proximális tubulus renin expressziója szignifikánsan növekedett szubtotális nefrektómián átesett patkányokban, továbbá a megfigyelt renin expresszió fokozódást ACE gátló kivédte, azaz feltételezhető, hogy a renin termelődés serkentését az AngII okozta[38]. A fenti eredmények felvetik a lehetőségét annak, hogy bizonyos körülmények között, a szöveti RAS szabályozásában „pozitív feedback” mechanizmus érvényesülhet. Sigmund és mtsai. beszámoltak arról, hogy transzgenikus egérmodellben, ahol a humán renin promóter 900 bp hosszú szakasza által vezérelt humán renin gént hordozott a kísérleti állat, az AngII presszor dózisban mintegy kétszeres humán renin mRNS termelődést eredményezett. Ez a vizsgálat említi elsőként a proximális renin promóter AngII általi „paradox” szabályozásának lehetőségét, valamint
felveti
a
molekuláris
részletek
további
vizsgálatának
szükségességét[39].
4.5. A Renin gén transzkripciójának szabályozása A vese juxtaglomeruláris sejtjeinek nehezen kivitelezhető tenyésztése miatt in vitro körülmények között humán chorio-decidualis szövetből-, illetve humán embrionális veséből (HEK)[40] származó sejttenyészetet, tüdőkarcinóma
sejtvonalat
(Calu-6)[41],
illetve
egér
vesetumorból
származó sejtvonalat (As4.1)[42] használnak a renin transzkripciójának vizsgálataihoz. Több kutatócsoport is beszámolt arról, hogy chorion sejtekben a renin gén transzkripciót a cAMP stimulálja[43]. Pinet és mtsai. a proximális renin promóter két régióját a -226/-219 bázis pozícióban elhelyezkedő cAMP response element (CRE)-, valamint a -79/-61 bázis elhelyezkedésű
12
pituitary-specific
trans-acting
factor
(Pit-1)
kötési
helyet
tartják
felelősnek a renin géntranszkripció cAMP okozta stimulációjáért. A promóter CRE helyéhez a CRE-binding protein (CREB) kacsolódik, és ezáltal fokozza a promóter aktivitását. A Pit-1 kötődési helyhez a vizsgált sejtvonalban a Pit-1 transzkripciós faktortól különböző szöveti transzaktiváló faktor képes kapcsolódni, amely a promóter további aktiválódását működése
is
okozza. cAMP
Kísérleteikben függő
a
két
transzkripció
promóter
régió
fokozódást
külön
okozott
de
eredményeik igazolták, hogy a Pit-1 kötődési hely, illetve az oda kötődő faktorok
szerepet
játszanak
a
CRE
lókusz
pozitív
hatásának
modulálásában, és a két transzkripciós faktor kötési hely stimuláló hatása összegződik[44]. Tamura és mtsai. HEK sejtekben transzfekciós kísérletekben azt találták, hogy a c-Jun transzkripciós faktor túltermelése fokozta a sejtekben a renin promóter transzkripciós aktivitását. Ehhez az aktivitásfokozáshoz elegendő volt a proximális renin promóter egy igen rövid (-47/+16) szakasza. Meglepő módon a transzkripciós starthelyhez szintén közeli cJun és c-Fos fehérje komplexét kötő AP-1 kötődési hely mutációja vizsgálataikban nem befolyásolta a c-Jun túltermelés okozta renin promóter aktiválódást. A TATA boxot is magába foglaló renin core promóter régió (-36/-20) mutációja viszont kivédte a c-Jun túltermelés okozta aktivitásfokozódást. Mindezekből azt a következtetést vonták le, hogy a c-Jun fehérje részt vesz a humán renin gén transzkripciójának szabályozásában[40]. Szintén Pinet munkacsoportja a fenti két szabályozó régión kívül további négy transzkripciós faktor kötési hely lehetséges szerepét vetette fel a proximális renin promóter aktivitásának szabályozásában. Közvetlenül a transzkripciós starthely közelében találták az Ets-1 nevű transzkripciós faktor kapcsolódási helyét, -29/-6 pozícióban található Ets-domént. A -259/-245 helyzetben az ARP nevű faktor kötődését lehetővé tevő ARP-1 régiót írták le. -293/-245 bázispár távolságban AGE3 kötőhelyet találtak,
13
továbbá a -107/-83 pozícióban egy ismeretlen konszenzus régiót element C-nek neveztek el[45]. Több
kutatócsoport
foglalkozott
a
renin
promóter
transzkripciós
starthelytől távolabb található szabályozó régióival is. Kobori és mtsai. a renin promóteren -1111/-953 bázispár távolságban egy lehetséges thyroid hormon response element (THRE) jelenlétéről számolnak be Calu-6 sejtekben. Eredményeik szerint a tiroid hormonok a humán renin promóter transzkripciós aktivitását fokozzák[46]. Más vizsgálatok szerint a promóter -3915/-2822 szakaszán egy TNFα kötési hely található, amely a géntranszkripcióra silencer hatású[47]. A transzkripciós
starthelytől
még
távolabb
elhelyezkedő
-5777/-5552
szakaszon vélhetőleg többszörös AP-1, vagy leucin zipper családba tartozó transzkripciós faktor kötési helyek által szabályozott enhancer régió található[48]. Ismert, hogy a renin gén első intronjának (Intron A) transzkripciós
faktor
kötődési
helye
silencer
hatású
a
gén
transzkripcióára[49]. -1111
TNFα kötési hely
THRE
-293 AGE3
-3915
-259 ARP-1
-5777 AP-1, Leu zipp
-226 CRE
5’
-107
-79
Element C
Pit-1
-47 AP-1
-29 Ets
start //
3’
Intron A
1. ábra A ren in p romó ter szerkezete
4.6. Az AngII AT 1 receptor által közvetített intracelluláris jelátvitele Az AngII - AT 1 receptor kötődés intracelluláris következményeit az irodalom azonnali, korai és késői jelátviteli mechanizmusokként tárgyalja. Az azonnali hatások másodperceken, a koraiak perceken, míg a késői hatások órákon belül következnek be[50]. Az AngII klasszikus presszor hatásának intracelluláris közvetítése az azonnal jelentkező jelátviteli mechanizmusok sorába tartozik és az IP 3 ,
14
Ca + + jelátviteli úton keresztül valósul meg. A hét transzmembrán doménnel rendelkező heterotrimer G-fehérjéhez kapcsolt receptorok családjába tartozó receptorok, mint az AngII AT 1 receptora is, agonista hatására
a
foszfolipáz
Cß
nevű
enzimet
aktiválják,
ami
a
foszfatidilinozitol 4,5 biszfoszfát (PIP 2 ) hidrolízisét katalizálja inozitol (1,4,5) triszfoszfátra (IP 3 ) és diacilglicerolra (DAG)[51, 52]. Az IP 3 az endoplazmatikus retikulum membránján található receptorához kötődve a Ca + + beáramlását triggereli a citoszolba, amely miozin könnyű lánc Ca + + dependens
kalmodulin
aktiválta
foszforillációjához
és
celluláris
kontrakcióhoz vezet[53, 54]. A PIP 2 hidrolízis során keletkező DAG aktiválja a protein kináz C enzimet (PKC). Az enzim AngII hatására bekövetkező membrán kötődése és aktivációja a szakirodalom gyakori témája. Az aktiválódott szerin/treonin kináznak (PKC) más fehérjék foszforillálása
révén
szerepet
tulajdonítanak
a
vazokonstrikció
fenntartásában és az érfali simaizom hipertrófia létrejöttében[55]. A PKC fenti hatásait többféle mechanizmussal és intracelluláris jelátviteli útvonal közvetítésével is létrehozhatja. A Na + /H + antiport aktiválásával a PKC
intracelluláris
alkalinizációt
okoz,
ami
az
aktin-miozin
kölcsönhatás egyik fontos szabályozó eleme[56]. A PKC enzim továbbá részt vesz citoplazmatikus tirozin kinázok és a mitogén aktiválta protein kináz (MAP kináz) rendszerek aktiválásában (2. ábra)[57-59]. Az AngII hatására aktiválódó korai és késői intracelluláris jelátviteli mechanizmusok
az
AngII
növekedési
faktor
szerű
hatásait
(sejtnövekedés, migráció, extracelluláris mátrix felszaporodás, egyéb növekedési faktorok termelődésének serkentése) közvetítik. A korai jelátviteli
mechanizmusok
a
kontrakció
regulációjával
összefüggő
azonnal aktiválódó szignaling utak mellett perceken belül működésbe lépnek és magukba foglalják a tirozin kinázok-, a MAP kinázok-, foszfolipáz A 2 és az arachidonsav metabolizmus-, valamint a foszfolipáz D aktivációját. A fentieken kívül az AngII korai intracelluláris hatásának tartják a ciklikus nukleotidok működésének modulálását.
15
ANGII
H+
Mg++ AT1 Gq
c-Src +
Na+
Na
Y
↑pH
PLCß
P IP3
DAG
↑[Ca++]
↑[Na+] ↓[Mg++]
PKC
Kontrakció
2. ábra Az Ang II a zonna li in tracellu láris ha tá sa i
4.6.1. MAP kináz aktiváció A MAP kinázok megnevezés a szerin/treonin protein kináz szupercsalád tagjainak összefoglaló neve. A foszforillációs kaszkádszerű rendszerben működő MAP kinázok számos intracelluláris jelátviteli út szereplői. Három az irodalom által részletesen tárgyalt MAP kináz rendszer (ERK1/2, JNK/SAPK, p38 MAP kináz) mellett az elmúlt években további MAP
kináz
rendszerekről
is
beszámoltak.
Az
újonnan
felfedezett
rendszerek (ERK3-, ERK5-, p38- szerű ERK6 rendszer) működése és biológiai funkciója egyelőre bizonytalan[60]. Az ERK, JNK, p38 MAP kináz rendszerek ismerten a sejtnövekedés, a proliferáció, az apoptózis, a sejt differenciálódás és transzformáció intracelluláris jelátviteli útjai. Az AngII különböző sejttípusokban mind az ERK[61, 62], JNK[63-65] és a p38 MAP kináz[66] növekedési
és
rendszereket aktiválja. Az ERK kaszkádot a
differenciációs
faktorokra
adott
celluláris
reakciók
jelátviteli útjának tartják. A JNK és p38 MAP kináz rendszereket inkább
16
a celluláris stresszre és a gyulladásos citokinekre adott sejtszintű válasz közvetítésében
találták
fontosnak.
A
fent
említett
foszforillációs
kaszkádok első lépése a MAP kináz kináz kináz (MAPKKK) aktiválása rendszerit egy kis GTP-áz aktivitású fehérje (G fehérje) által közvetített folyamatban. A MAPKKK általában szerin aminósavon foszforillálja és ezáltal aktiválja a MAP kináz kinázt (MAPKK). A MAPKK enzim egy „dual” kináz, amely a MAP kinázt treonin és tirozin aminósavjain foszforillálva aktiválja. Az aktivált MAP kináz ezután a sejtmagba transzlokálódik
és
ott
bizonyos
fehérjék
foszforillációja
révén
befolyásolja a géntranszkripciót. 4.6.1.1. Az ERK kaszkád Az Extracelluláris szignál Regulálta Kináz kaszkád működését Touyz és Schiffrin összefoglaló dolgozata alapján mutatom be[50]. Az ERK kaszkádot
a
növekedési
és
differenciálódási
stimulusok
közvetítő
rendszereként ismerjük, elsősorban az endogén tirozin kináz aktivitással rendelkező növekedési faktorok és citokinek receptorainak intracelluláris jelátviteli útjaként[60]. A tirozin kináz receptorok a receptor ligand kölcsönhatás következtében autofoszforillálódnak és hozzákapcsolódnak a Grb2 nevű adapter fehérje SH2
doménjéhez
jelátvitelben
(Src
fontos
homology
enzimek
domain).
megkötésével
Az és
adapter
fehérjék
egymáshoz
a
közeli
helyzetben tartásával, az ún. jelátviteli komplexek kialakításával vesznek részt az intracelluláris folyamatokban. A Grb2 molekulához szintén SH2 doménen keresztül kapcsolódik az Shc adapter fehérje, illetve a Sos (son of seventhless) nevű nukleotid csere faktor, amely a p21Ras kis Gfehérje GDP molekuláját GTP-re cseréli. A p21Ras kis G-fehérje a kaszkádszerű foszforillációs folyamat első eleme, amely a Raf-1 kinázzal (MAPKKK
kináz)
közösen
aktiválja
a
cRaf-1
nevű
enzimet.
Az
aktivációban a foszforilláció mellett az is szerepet játszik, hogy a Ras fehérje a Raf enzimet a plazmamembránhoz köti. Az aktivált cRaf-1 ezután szerin molekulán foszforillálja a MEK enzimet. A MEK „dual”
17
kináz treonin és tirozin csoportjain foszforillálja az ERK enzimet[67]. A felvázolt folyamattól eltérően ismert a Raf-1 enzimtől független ERK aktiváció[68], továbbá a Raf p21Ras nélküli aktiválásáról is beszámoltak már[69]. Az ERK aktivitását több tényező befolyásolhatja. Az a MAP kináz
foszfatáz
(MKP-1/CL-100)
nevű
enzim
az
aktivált
ERK
foszfotirozin és foszfotreonin csoportjait defoszforillálja, de a Ras/Raf rendszer negatív feedback szabályozásáról is vannak adatok már[70, 71]. Az AngII AT 1 receptora szintén aktiválja az ERK kaszkádot. Az utóbbi évek intenzív vizsgálatai az aktiváció mechanizmusaként egyre inkább a receptor
tirozin
kinázok
transzaktivációját
jelölik
meg[72].
A
transzaktiváció vagy a tirozin kináz receptor foszforillációjával[73] vagy
ligandjának
(pl.
HB-EGF)
metalloproteáz
függő
stimulált
termelődésével valósulhat meg (juxtakrin szabályozás)[16]. Alternatív mechanizmusként felmerült, hogy az AT1 receptor Gq-fehérjéjének ßγ alegysége aktiválja a receptor közeli protein tirozin kinázt, az Src enzimet. Az Src ezután az Shc fehérjéhez kapcsolódva azt foszforillálva aktiválja az Shc-Grb2-Sos jelátviteli komplexet. A Sos ezt követően elvégzi a Ras molekula GDP-GTP nukleotid cseréjét és ezután a folyamat a fent leírt módon a tirozin kináz receptoroknál ismert úton megy végbe[74]. Az aktivált ERK a sejtmagba helyeződik, ahol transzkripciós faktorok foszforillációja révén szabályozza a transzkripciót és a sejtciklust. Az ERK aktiválja a „serum respons element”-et, amely számos gén, így a cfos protoonkogén promóterjének alkotóeleme[75]. Az ERK aktiválja a PHAS-1 transzlációt szabályozó fehérjét, így közvetve befolyásolja a fehérjeszintézist is[76], valamint az AP-1 transzkripciós faktort, amely a sejtciklus szabályozásának egyik legfontosabb faktora[77]. Vizsgálataink
során
az
ERK
enzim
aktiválódásának
„upstream”
szabályozását vizsgáltuk. Az ERK aktivitás mérésére az anti-foszfo-ERK western blot segítségével történt. A direkt módszer mellett indirekt módon az enzimhez képest „downstream” helyzetű folyamatok által
18
regulált c-fos és renin promóter transzkripciós aktivitását határoztuk meg. 4.6.1.2. A JNK kaszkád A
c-Jun
N-terminális
kinázt
mintegy
10
éve
egy
érdekes
kísérletsorozatban fedezték fel. A c-jun protoonkogén promóterének AP1 helyéhez kapcsolódó c-Jun fehérjét aktiváló kinázt keresték. Azt a megfigyelést tették, hogy a keresett kináz UV besugárzás hatására aktiválódik. A kísérletsorozat végén két kinázt találtak, amelyek a c-Jun fehérje
N-terminális
63.
és
73.
helyén
lévő
szerin
csoportot
foszforillálja. A 46kDa tömegű enzimnek a JNK1 (c-Jun-N-terminális Kináz), míg a másik 55kDa tömegűnek a JNK2 nevet adták[78]. További kutatócsoportok is kimutatták az ERK és p38 MAP kinázoktól független MAP kináz enzimeket és mivel ezek a kinázok döntő mértékben a sejtet érő stressz (hősokk, fehérjeszintézist gátló szerek, tumor nekrózis faktor, UV besugárzás) hatására aktiválódnak ezért Stressz Aktiválta Protein Kinázoknak (SAPK) nevezték el őket, azzal a megjegyzéssel, hogy ezeket a kinázokat is aktiválhatják az ERK rendszerben megismert mitogének (pl. EGF, PDGF, AngII), valamint más MAP kináz rendszerek is aktiválódhatnak a sejtet ért stressz hatására[78, 79]. A két elnevezés JNK/SAPK jelenleg is használatos bár a JNK név használata van inkább elterjedőben. A JNK kaszkád aktivációja és biológiai szerepe az ERK kaszkádhoz képest
kevéssé
ismert.
Az
utóbbi
években
több
kutatócsoport
is
intenzíven foglalkozott az AngII hatására aktiválódó JNK kaszkád működésével.
A
vizsgálatok
tárgya
elsősorban
a
JNK
rendszer
aktiválódásának mechanizmusa volt. A PAK enzim aktiválásában a Rho családba tartozó p21Rac és Cdc42 kis G-fehérjéket tartják fontosnak[79, 80]. A folyamat hasonló a Raf kináz p21Ras általi aktivációjához. A Rac G-fehérje és a PAK enzim aktiválásában számos jelátviteli faktor szerepet játszhat. Egyes szerzők a tirozin kinázok és a PKC-[81], mások a tirozin kináz receptorok és citokinek szerepét emelték ki[82-84].
19
Eguchi és mtsai. szerint a JNK aktivációban nem játszik szerepet az ERK aktivációnál
ismert
metalloproteináz
függő
EGF
receptor
transzaktiváció[16], így a Rac-PAK aktiváció vélhetően más úton valósul meg. Murasawa és mtsai. szív eredetű fibroblasztokban az AngII okozta JNK aktivációt a Ca + + dependens protein kináz Pyk2 függőnek találták és szintén kizárták az EGF receptor szerepét a folyamatban. Noha direkt módon nem vizsgálták a Rac aktivációt egy Pyk2-Rac1-Pak aktivációs hipotézisét állították fel[85]. Schmitz és mtsai. a PAK aktiváció újabb mechanizmusát ismertették. Kimutatták, hogy érfali simaizom sejtekben az AngII aktiválja a JNK enzimet és a Rac1 kis G-fehérjét, valamint azt hogy az Nck nevű adapter fehérje AngII hatására a plazmamembránhoz közeli helyzetbe hozza a PAK enzimet. Az Nck fehérje gátlásával az AngII
hatására
bekövetkező
PAK
és
JNK
aktiváció
elmaradt[64].
Eredményeik megbeszélésében felvetik annak lehetőségét, hogy az Nck adapter fehérje hasonló módon a Grb2 fehérje viselkedéséhez az ERK aktivációjában, egy jelátviteli komplexet képez (Rac-Nck-PAK) a JNK kaszkád szignalingjának egyik kezdő lépéseként. A JNK rendszer foszforillációs kaszkádjának működése hasonló az ERK kaszkádéhoz.
Első
eleme
a
p21-aktiválta
kináz
(PAK),
amelynek
aktivációja a MEKK1-SEK1 rendszer és végül a JNK kaszkádszerű aktivációjához vezet[86]. Az aktivált JNK enzim szintén az ERK működéséhez hasonlóan transzlokálódik a sejtmagba, ahol transzkripciós faktorokat (c-Jun, ATF-2, Elk-1) aktivál[87]. Vizsgálataink során a JNK enzim aktiválódásának szerepét vizsgáltuk az AngII hatására bekövetkező renin promóter stimulálásban, továbbá azt, hogy a tirozin kinázok milyen szerepet töltenek be a folyamatban. Végül megvizsgáltuk a tirozin kinázok és a JNK egymáshoz képesti helyzetét a renin aktiválásában. 4.6.1.3. A p38 MAP kináz rendszer A p38 MAP kinázok szerepét eddigi kísérleteink során egyelőre nem vizsgáltuk ezért ezt a rendszert csak röviden ismertetem, Zarubin és Han
20
közelmúltban
megjelent
összefoglalója
alapján.
A
p38
rendszer
aktivációját az ERK és a JNK rendszerekéhez hasonlóan extracelluláris stimulusok okozhatják. A szerzők a JNK kaszkádhoz hasonlóan a p38 rendszer aktiválódása esetében is inkább a celluláris stressztényezőket tartanak fontosnak, mint az UV besugárzás, a hősokk, ozmotikus sokk, gyulladásos citokinek, de megemlítik a növekedési faktorok szerepét is. A rendszer által szabályozott biológiai folyamatok is hasonlóak a másik két MAP kináz rendszeréhez, amelyek közül a gyulladás befolyásolása a COX 2 enzim és bizonyos citokinek termelődésének stimulációjával, az apoptózis szabályozása, a szöveti differenciáció és a tumorigenezis modulálása kiemelendő. A kaszkád intracelluláris aktiválódása a Rac1/Cdc42-PAK-MEKK4MKK3-p38 MAP kináz úton valószínű. A receptor által közvetlenül aktivált folyamatok, amelyek a Rac1 aktiválódáshoz vezetnek kevéssé ismertek, a JNK és ERK rendszerek esetében látott adapter fehérjék szerepe egyelőre nem igazolódott. Az p38 enzim szubsztrátjainak két nagy csoportjaként a protein kinázokat és a transzkripciós faktorokat említik. Transzkripciós faktorok közül az ATF1,2,6; a p53; az Elk1; az AP-1 jön szóba. Protein kinázok közül a MAP kináz aktiválta protein kináz 2, az MNK1, a p38 regulálta kináz (PRAK), valamint a mitogén és stressz aktiválta protein kináz (MSK1) lehetséges szerepét emelik ki. A részletes összefoglaló ellenére a szerzők a p38 rendszer további, részletes tanulmányozását javasolják[88].
4.6.2. Tirozin kináz aktiváció Berk és Corson egy korábbi összefoglaló tanulmányban az érfali simaizom
sejtekben
öt
jelentős
tirozin
kinázok
által
szabályozott
jelátviteli utat tárgyal. A szerzők megjegyzik, hogy a jövőbeli kutatások egyik lehetséges irányvonala az igen szerteágazó tirozin kináz jelátviteli utak
élettani
változatosságának
meghatározása[89].
21
és
szöveti
specifikációinak
4.6.2.1. Az Src kinázok A felismerés, hogy az AngII az Src tirozin kináz család szubsztrátjának ismert PLCγ enzimet is tirozin foszforillálja a Src család kinázait az AT 1 receptor jelátvitelében szerepet játszó szignaling molekulák sorába emelte[90]. A család legjobban ismert tagja az általában növekedési faktorok jelátvitelében szerepet kapó c-Src enzim. Berstein és mtsai. a cSrc enzim anti-c-Src antitesttel történt gátlásával a PLCγ foszforilláció és
a
következményes
IP 3
keletkezés
szignifikáns
csökkenését
észlelték[91], amely azt valószínűsíti, hogy az AngII okozta PLCγ aktiváció Src függő módon megy végbe. 4.6.2.2. A Janus kináz család Ismert, hogy az AT 1 receptor aktiváció a citokin receptor aktivációhoz hasonló intracelluláris folyamatokat vált ki. A citokin receptorok a protoonkogének
(„early
growth
response
genes”)
transzkripciós
aktivitásának fokozását protein tirozin kinázok, pl. a Janus kináz család tagjai által végzik. A Janus kináz család tagjai (JAK és TYK) a STAT fehérjéket
tirozin
faktorok,
amelyek
foszforillálják. a
A
sejtmagba
STAT
fehérjék
transzkripciós
transzlokálódva
fokozzák
a
protoonkogének, így a c-fos és c-jun gén tarnszkripcióját[92]. Több szerző is igazolta, hogy az AngII aktiválja a Janus kináz család egyes tagjait. Érfali simaizomban a JAK 2 és TYK 2 gyors aktiválását és a STAT 1 1 3 fehérje tirozin foszforillációját találták[90], míg fibroblaszt tenyészetben a STAT 9 1 stimulálásáról számoltak be[93] AngII hatására. A fenti eredmények megerősítik az AngII növekedési működésének hipotézisét.
22
faktorszerű
4.6.2.3. A Fokális Adhéziós Kináz Az AngII az utóbbi évek felismerései szerint szerepet játszik a simaizom sejtek alakjának, volumenének változásában és migrációjában[94] ezért felmerült, hogy a citoszkeleton és mátrix fehérjék interakciói részt vesznek
az
AngII
szignalingjában.
Tisztázódott,
hogy
a
folyamat
katalizálásában tirozin kinázokat is magukba foglaló fokális adhéziós komplexek játszanak közre. A legismertebb fokális adhéziós koplexhez kötött tirozin kinázt fokális adhéziós kináznak (FAK) nevezték el[95]. Érfali simaizom sejtekben az AngII stimulálja a FAK enzimet[96], ami tovább
erősíti
az
AngII
szerepét
a
fokális
adhéziós
komplexek
aktiválásában. 4.6.2.4. A kalcium dependens protein kináz A kalcium dependens protein tirozin kinázok csoportjába tartozó Pyk 2 fehérje szintén aktiválódhat AngII hatására és a citoszkeletonhoz kötődik[97]. A Pyk 2 AngII általi aktivációja Ca + + és PKC függő folyamat, az aktivált Pyk 2 az EGF receptor transzaktivációján keresztül szerepet
játszik
az
ERK
kaszkád
aktivációjában.
Murasawa
és
munkatársai kardiális fibroblasztokban Pyk 2 dependens JNK aktivációt talált, amely azonban független volt az EGF receptortól és a JNK enzimaktivációjában más rendszerekben ismerten részt vevő Ras és RhoA kis G fehérjéktől. Rendszerükben a Rac-PAK-MEKK-SEK MAP kináz kaszkád a Pyk 2 enzimhez képest „downstream” helyzetű volt[85]. 4.6.2.5. A receptor tirozin kinázok Az aktivált G fehérjét kötő receptorok és a receptor tirozin kinázok kölcsönhatását Daub és mtsai. 1996-ban publikálták elsőként[73]. Azóta számos közlemény számolt be a receptor tirozin kinázok G fehérjét kötő receptorok általi transzaktivációjáról. Eguchi és mtsai. közölték, hogy az AngII stimulus AT 1 receptoron keresztül intracellulárisan transzaktiválja az EGF receptort, amely folyamat Ca + + függő és szerepet játszik az
23
AngII indukálta MAP kináz aktivációban[72]. A szerzők az EGF receptor transzaktivációt
megelőző
lehetséges
mechanizmusoknak
a
protein
tirozin kináz aktivációt, reaktív oxigén gyökök keletkezését, illetve az EGF receptor juxtakrin aktivációját jelölik meg[98]. A transzaktivált EGF receptor komplexet képez az Shc/Grb 2 adapter fehérjékkel, a komplex ezután megköti a Sos-t, amely a Ras kis G fehérje számára biztosítja a GDP-GTP cserét, majd a Ras Raf-MEK dependens úton az ERK aktiválását indítja el. Az ERK aktiváció pedig a jól ismert módon a protoonkogének (c-fos, c-jun) transzkripciós aktivitásának fokozásához vezet.
Néhány
éve
ismert,
hogy
az
AngII
általi
EGF
receptor
transzaktiváció a p70S6K és az Akt/PKB szerin/treonin kinázokat is aktiválja[99], amely mechanizmus a fehérjeszintézis indukciójában, azaz az AngII közvetítette hipertófiában kap szerepet. Az EGF receptor transzaktivációjához hasonló módon az AngII biológiai hatásainak közvetítésében az irodalom más tirozin kináz receptor transzaktivációját is ismeri, pl. PDGF receptor[100], Axl receptor. 4.6.2.6. További tirozin kinázok A fentieken kívül egyéb tirozin kinázok részvétele is felmerült az AngII intracelluláris jelátvitelében. A p130Cas molekulát a citoszkeleton átrendeződésében tartják fontosnak. A p130Cas egy olyan tirozin kináz, amely egyúttal adapter fehérjeként is működik. „Prolin rich”-, valamint SH2 és SH3 doménjével különféle a citoszkeleton reorganizációjában fontos jelátviteli molekulákat köt meg, mint a FAK, a paxillin, a tensin, a Crk és az Src[101, 102]. Az AngII érfali simaizom sejtekben a p130Cas aktivációját fokozza, az aktivációban a Ca + + , a c-Src és a PKC szerepét valószínűsítik[103]. A
foszfatidilinozitol-3-kináz
(PI 3
kináz)
számos
sejt
szignaling
mechanizmusában jelentős szerepet tölt be. A fehérje a foszfoinozitokat képes
a
3’
helyen
foszforillálni,
ezáltal
a
jelátvitel
számára
aktiválni[104]. Az enzim számos molekuláris célpontját leírták már, amelyek közül vizsgálataink szempontjából kiemelendő a PKC, PLCy,
24
Rac1 és a JNK[105]. Saward és Zahradka megfigyelésében a PI 3 kináz gátlása wortmanninnal, patkány simaizom sejtekben tökéletesen kivédte az AngII által okozott proliferációs választ[106], amely felveti a PI 3 jelentős
szerepét
az
AngII
növekedési
faktor
szerű
hatásának
közvetítésében. ANGII TYR kináz receptor
AT1
JAK2 TYK2
Nck c-Src FAK
Grb2
Rac
Ras
SOS
PAK
Raf-1
Pyk2
MEKK-1 MEKK-1
P130 CAS
MEK MEKK-1
PI3 kináz
JNK p38
ERK
3. ábra Az AT 1 recep tor á lta l a k tivá lt jelá tv iteli u ta k
4.7. Az AngII késői intracelluláris hatásai A fentiekben részletesen ismertettem az AngII celluláris hatásait, amelyek a receptor aktivációt követően perceken, órákon belül zajlanak le. Az AngII biológiai hatásaiként az értónus fokozása mellett, ami valóban a keringő hormonra adott gyors válasznak tekintendő, olyan folyamatokat
szokás
emlegetni
(sejthipertrófia,
proliferáció,
extracelluláris mátrix felszaporodás, kardiális remodelling), amelyek hetek, vagy hosszú hónapok alatt jönnek létre. A hosszú távú hatások létrejöttének magyarázata az lehet, hogy a receptor-ligand kölcsönhatás következtében
aktiválódó
kinázok,
25
olyan
molekulákat
aktiválnak,
amelyek a krónikus vagy elhúzódó sejtszintű válaszok szabályozásában vesznek részt. Az AngII régóta ismert hosszú távú hatásai között szerepel több protoonkogén működésének aktiválása. A leggyakrabban emlegetet AngII által aktivált protoonkogének a c-fos, c-jun, c-myc, erg-1[107, 108]. A protoonkogén aktiváció lehetséges mechanizmusát a kísérleteinkben is vizsgált c-fos gén példáján keresztül mutatom be. Mára szinte tankönyvi ismeret, hogy a c-fos protoonkogén terméke a c-Fos fehérje, amely a cJun fehérjével közösen az ún. Aktivátor protein-1 (AP-1) komplexet alkotja. Az AP-1 komplex számos gén (többek között maga c-fos gén) promóterének ún. AP-1 kötőhelyéhez képes kapcsolódni és ezáltal a gén transzkripcióját aktiválni. -320
-350 SIE
5’
SIF STAT
-60
SRE
AP-1
TCF SRF
DRE
AP-1
start
-30 CRE
TATA
FIRE
CREB
+5000
//
3’
ERE Ösztrogén
4. ábra: A c- fo s p romóter szerkezete és a kap c so lódó transzkripció s faktoro k
A c-fos gén promóterének felépítése viszonylag jól feltérképezett (4. ábra). A promóter több olyan transzkripciós faktor kötési helyet tartalmaz, amelyek a gén átíródását képesek befolyásolni. Közvetlenül a transzkripciós starthelynél található a TATA boksz, amelyet -60 bázis távolságban a cAMP Response Element (CRE) és egy ún. Directly Repeated Sequence (DRE)[109], majd az AP-1 kötőhely követ. -350 és 250 bázis távolságban található a Sis Inducible Element (SIE) és a Serum Response Element (SRE). Egyes
szerzők
a
-1900
bázis
upstream
(5’)
pozícióban
egy
ún.
hypersensitive site-ról számoltak be[109], míg más szerzők az átíródó génszakaszon belül elhelyezkedő Fos Intragenic Regulatory Element (FIRE), illetve +5000 bázis downstream (3’) pozícióban egy Estrogen Response Element (ERE) létezését közölték[110]. A promóteren és a génen lévő regulációs elemeknek megfelelően a SIE elemhez a Sis
26
Inducible Factor (SIF)[111] és a STAT fehérjék, a SRE helyhez a Ternary Complex Factor (TCF)[112] és a Serum Response Factor (SRF), az AP-1 kötö helyhez a c-Fos és c-Jun fehérjék alkotta AP-1 komplex, a CRE régióhoz a cAMP Response Element Binding Protein (CREB), a 3’ pozícióban levő ERE helyhez pedig ösztrogén képes kötődni[113].
4.8. Kísérleteink tervezése Az
AngII
sejtszintű
hatásai
a
szakirodalom
szerint
igen
széleskörűen vizsgált. A bekövetkezett hatások létrejöttéért felelős intracelluláris jelátviteli utak azonban csak részben feltérképezettek. Az egyes szignaling rendszerek szerepét különböző kutatócsoportok más és más
megközelítésben,
nemritkán
egymással
ellentmondó
módon
tárgyalják. Szintén nem tisztázott a Sigmund és munkacsoportja által felvetett
paradox
renin
promóter
AngII
hatására
bekövetkező
aktivációjának sejten belüli jelátviteli folyamata sem. Vizsgálataink tervezésekor célul tűztük ki egy kísérleti modellrendszer kidolgozását, amelyben az AngII géntranszkripcióra kifejtett hatásainak intracelluláris szignaling
mechanizmusai
modellezhetők.
A
kidolgozott
in
vitro
rendszerben az AngII c-fos és renin promóterekre kifejtett hatásainak sejten belüli jelátviteli folyamatait tanulmányoztuk.
27
5. Célkitűzések, hipotézisek Vizsgálataink során arra kerestünk választ, hogy az AngII kiváltotta géntranszkripciós változások milyen intracelluláris jelátviteli utakon keresztül
valósulnak
meg.
Az
AngII
géntranszkripcióra
gyakorolt
hatásának jelátvitelére az alábbi hipotéziseink voltak: •
alkalmazott modellünkben az AngII AT 1 receptoron keresztül aktiválja a c-fos promótert
•
rendszerünkben
az
AngII
hatására
a
MAP
kináz
kaszkádok
aktiválódnak, •
a PI 3 kináz és a PKC enzimek szerepet játszanak az AngII által indukált c-fos promóter aktivitás fokozódás szabályozásában,
•
a MAP kináz rendszerek részt vesznek az AngII hatására létrejövő c-fos promóter aktivitás fokozódás regulációjában.
Kísérleteink
tervezésekor
nagyon
kevés
és
indirekt
információval
rendelkeztünk a korábban felvázolt (4.4. fejezet) kísérletes eredmények alapján felmerült, AngII által indukált renin géntranszkripció pozitív feedback szabályozásának mechanizmusáról. Célul tűztük ki olyan kísérleti
modell
kidolgozását,
amelyben
a
fenti
pozitív
feedback
reguláció vizsgálható. Az AngII „paradox” renin transzkripciót fokozó hatásának
intracelluláris
jelátvitelére
vonatkozóan
a
következő
hipotéziseket állítottuk fel: •
az AngII aktiválja a proximális renin promótert és ez a stimuláció AT 1 receptoron keresztül valósul meg,
•
az ERK és JNK kaszkádok részt vesznek az AngII által kiváltott renin promóter aktiválás szabályozásában,
•
a PKC enzim szerepet játszik a renin promóter transzkripciós aktivitásfokozódásának regulációjában,
•
a tirozin kinázok aktiválódása szerepet játszik a vizsgált folyamat intracelluláris szabályozásában.
28
6. Alkalmazott anyagok és módszerek 6.1. Elméleti háttér 6.1.1. A tranziens transzfekció A sejtek különböző agonisták által kiváltott géntranszkripciós változásának, valamint a változás szabályozási mechanizmusainak egyik elterjedt vizsgáló módszere a tranziens transzfekció[114]. A módszer során a megfigyelni kívánt gént, vagy annak egy szakaszát a sejtbe juttatjuk (transzfektáljuk) ezáltal vizsgálhatóvá válik a bejuttatott gén agonisták
hatására
bekövetkező
transzkripciós
válasza.
Az
ismert
jelátviteli utak manipulálásával pedig a transzkripció szabályozása tanulmányozható. A
géntranszkripció
változásának
detektálására
a
riporter
plazmid
konstrukciók transzfektálása alkalmas. A riporter plazmidban a vizsgálni kívánt gén promóteréhez egy promótert nem tartalmazó riporter gén van kapcsolva. Riporter génnek olyan, emlőssejtekben nem előforduló enzim génje használatos, amelynek aktivitása könnyen detektálható. Az egyik leggyakrabban használt riporter gén a szentjánosbogár luciferáz enzimjét kódoló gén. Az enzim által katalizált reakcióban a szubsztrát (luciferin) az enzim, ATP, Mg 2 + és molekuláris O 2 jelenlétében fényvillanás kíséretében bomlik, amely luminométer felhasználásával mérhető. A mért lumineszcencia, azaz a riporter gén működése így csak a gén elé kapcsolt és
vizsgálni
kívánt
promóter
transzkripciós
aktivitásától
függ.
A
módszerrel megfigyelhető a vizsgált promóter különböző agonisták hatására bekövetkező transzkripciós aktivitásának változása[115-117]. A
géntranszkripció
szabályozása
az
intracelluláris
szignaling
utak
befolyásolásával vizsgálhatók. A vizsgálat során a riporter plazmiddal együtt
egy
olyan
(kotranszfekció), molekula
expressziós
amelynek
aktivitását.
A
plazmidot
terméke
gátlás
a
gátolja
juttatunk
a
sejtbe
valamelyik
jelátviteli
szignáltranszdukcióban
résztvevő
molekulát közvetlenül inaktiváló fehérjét-, vagy a kérdéses jelátviteli molekula kompetitív antagonistájaként működő domináns negatív (DN)
29
mutáns
fehérjét
expresszáló
plazmiddal
érhető
el[118].
A
gátló
expressziós vektorok használhatóságát befolyásolhatja, ha a gátolni kívánt molekula nem minden hatását gátolják teljesen, valamint ha egyéb a vizsgált hatás szempontjából sem közömbös molekulák működését is megváltoztatják. A
jelátviteli
utak
vizsgálata
lehetséges
a
fenti
gátló
expressziós
plazmidok kotranszfekciója nélkül is. Ebben az esetben a sejtekbe csak a vizsgálni kívánt promótert tartalmazó riporter plazmidot transzfektáljuk, a
jelátviteli
utak
farmakológiai
egyes
molekuláinak
gátlószerrel
gátoljuk.
aktivitását A
pedig
farmakológiai
specifikus gátlószerek
alkalmazását több tényező is nehezíti. A gátlószerek a legtöbb esetben toxikusak ezért a sejtek életképességének befolyásolásával nehezítik az eredmények értékelését. Másrészt a gátlószerek általában nem teljesen specifikusak a vizsgált molekulára és végül számos a jelátvitelben fontos molekula esetében nem rendelkezünk specifikus gátlószerrel.
6.1.2. A másodlagos riporter plazmidok használata A tranziens transzfekció hatékonysága a módszer igen körültekintő standardizálása ellenére, sok esetben az egyes kísérleten belül is igen nagy szóródást mutat. A nagy szóródás normalizálására elterjedt metódus a másodlagos riporter plazmidok belső kontrollként való használata. A módszer
lényege,
hogy
a
kotranszfektált
másodlagos
riporter
gén
expressziója állandó, az alkalmazott agonistáktól és gátlószerektől nem, csak a transzfektált sejtek arányától függ. A kísérletben így a vizsgálni kívánt
riporter
gén
termékének
aktivitását
a
másodlagos
riporter
aktivitására normalizálni lehet, ezáltal kiküszöbölhető a transzfekciós hatékonyság
eltéréséből
adódó
hiba[117].
Másodlagos
riporter
plazmidnak leggyakrabban virális- vagy minimál promóter által vezérelt E.
Coli
β-galaktozidáz
gént
tartalmazó
expressziós
vektorokat
alkalmaznak. Vizsgálataink kezdetén a tranziens transzfekciós kísérletek során a luciferáz
eredmények
normalizálására
30
β-galaktozidáz
gént
kódoló
másodlagos
riporter
plazmidokat
használtunk.
Az
eredmények
értékelésekor azonban következetesen felmerült az a probléma, hogy a belső kontrollra való normalizálás szisztematikusan megváltoztatta a kísérletek eredményét. A szakirodalom csekély számú közleményt ismer a belső kontroll használatával kapcsolatban felmerülő problémákról[119, 120], ezért külön kísérletet terveztünk a probléma tisztázására. A másodlagos
riporter
plazmidok
használatára
vonatkozó
metodikai
kísérleteink eredményeit a „Kísérleti eredmények” fejezetben mutatom be.
6.2. Anyagok A kísérletekben használt anyagok közül az F/12-HAM médium, az FBS
(fetal
bovine
etanolsulfonsav)
a
serum) Life
és
a
HEPES
Technilogies-,
az
(hidroxietil-piperazinangiotenzin
II,
a
bisindolylmaleimid, a dithiotreitol (DTT), a Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), a geneticin, a genistein, a phorbol-12-myristate-13acetát, a luciferin és a wortmannin, és a Sigma. A PD98059 a Calbiochem cég terméke, a candesartan az Astra-Zeneca cég ajándéka. A P-ERK antitest (E-4) a Santa Cruz Biotechnology-, a SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) antitest a New England Biolabs cég terméke.
6.3. Sejtek Vizsgálatainkhoz kínai hörcsög ovárium (CHO), illetve sertés proximális tubulus hám (LLC-PK1) sejttenyészeteket használtunk. A CHO sejtek a patkány AT 1 A receptort, az LLC-PK1 sejtek a nyúl AT 1 receptort stabilan expresszáló sejtvonalak voltak. A sejteket állandó hőmérsékletű 37ºC-os, 5% CO 2 tartalmú párásított levegőjű inkubátorban tenyésztettük. A CHO/AT 1 A sejteket Thomas J. Thekkumkara (University of Colorado, USA)[121], az LLC-PK1/AT 1 sejteket Raymond C. Harris (Vanderbilt
University,
USA)[122]
bocsátotta
rendelkezésünkre.
A
CHO/AT 1 A sejteket F/12-HAM-, az LLC-PK1/AT 1 sejteket 100 NE/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin és 0,6 mg/ml geneticin tartalmú
31
DMEM
médiumban,
cm 2 -es
75
tenyésztő
flaskákban
(Cornig)
tenyésztettük. A tranziens transzfekciós- és Western blot kísérletekhez a sejteket 60 mm-es petri csészékbe (Cornig) osztottuk. A transzfekciót a sejtek 50%-os sűrűségénél, a western blot kísérletekhez a kezelést és mintagyűjtést a sejtek közel konfluens sűrűségénél végeztük.
6.4. Plazmidok A tranziens transzfekciós kísérletek során az AngII által indukált géntranszkripciós változások vizsgálatára a c-fos promótert használtuk. Az
AngII
paradox,
renin
géntranszkripciót
fokozó
hatásának
vizsgálatához a renin gén promóterének különböző hosszúságú szakaszait tartalmazó
riporter
plazmid
konstrukciókat
alkalmaztuk.
A
c-fos
promóter a szentjánosbogár luciferáz enzimét kódoló pA 3 Luc vektorba van
klónozva[62],
míg
a
különböző
hosszúságú
renin
promóter
szakaszokat a szintén luciferáz enzimet kódoló gént tartalmazó pGL 3 vektorba inzertálták[49]. A riporter konstrukciókban a luciferáz gén transzkripciója az előtte helyet foglaló un. polilinker régióba illesztett cfos, illetve renin promóter szakaszok transzkripciós aktivitásától függ. A c-fos promótert tartalmazó riporter plazmid Howard J. Goldberg-, a renin promóter szakaszokat tartalmazó riporter plazmidok Florence Pinet ajándékai voltak (l. 1. táblázat). A belső standardként használt másodlagos riporter plazmidok kereskedelmi forgalomban beszerezhető β-galaktozidáz enzimet kódoló expressziós vektorok (Clontech, Palo Alto, CA) voltak. Az általunk használt plazmidokban az enzim transzkripcióját timidin kináz minimál promóter (TKβ), vagy vírus promóterek úgymint a. Rous sarcomavírus promótere (RSVβ) és a citomegalovírus promótere (CMVβ) szabályozzák (l. 1. táblázat). A vizsgálni kívánt intracelluláris jelátviteli utakat különböző expressziós vektorok transzfekciójával befolyásoltuk. Az expressziós vektorok esetében a pcDNA 3 nevű üres vektorba inzertálták a sejtbe bejuttatni
kívánt
fehérje
cDNS-ét.
32
A
plazmidokban
a
folyamatos
génexpressziót
a
citomegalovírus
magas
alapaktivitású
promótere
biztosítja, ezáltal a sejtekbe transzfektált expressziós vektorban lévő gének,
a
sejt
termelődését intracelluláris
saját
génjeinek
eredményezi. jelátviteli
A
expresszióját használt
folyamatokban
meghaladó
plazmidok vizsgált
egy
fehérjék
mértékű része
az
domináns
negatív (DN) mutáns verziójának cDNS-ét tartalmazták. A sejtben a DN mutáns fehérje megköti a neki megfelelő jelátviteli fehérje szubsztrátját és kompetitíven gátolja annak működését. Kísérleteinkben az ERK kaszkád elemeit inaktiváló DNRas, DNRaf, DNMEK, valamint a JNK kaszkád elemeit gátló DNRac1 és DNJNK domináns negatív fehérjéket kódoló plazmidokat használtuk[123-126]. A MAP kináz kaszkádok szerepének tisztázására az ERK és JNK enzimeket
direkt
módon
gátló
fehérjéket
kódoló
plazmidokat
is
alkalmaztunk. A CL100 plazmid az ERK-et defoszforilláló MAP kináz foszfatáz (MKP1) nevű enzim teljes szekvenciáját kódoló cDNS-t tartalmazza pcDNA 3 vektorban. A JNK-t gátló JIP plazmid az egér JNK interacting proteinjének JNK kötő doménjét tartalmazza szintén a pcDNA 3 vektorba inzertálva. A c-Src tirozin kináz szerepét az enzimet gátló c-Src-N-terminális kinázt (Csk) kódoló expressziós vektorral vizsgáltuk. A Csk plazmid az enzim teljes hosszát (1350 bp) tartalmazza pcDNA 3 vektorban a polilinker régió HindIII és Xba1 hasítási helyei közé klónozva. Az expressziós vektorokat többségében Howard J. Goldberg és Dr. Mucsi István készítették, a DNJNK plazmid Dr. P. Andreka ajándéka volt. Név
Vektor
Nulkleotid/aminósav Funkció
c-fos
pA 3 Luc
Humán (-732/-44)
Riporter gén
Renin (pGL 3 -145)
pGL 3
Humán (-145/+16)
Riporter gén
Renin (pGL 3 -582)
pGL 3
Humán (-582/+16)
Riporter gén
Renin (pGL 3 -892)
pGL 3
Humán (-892/+16)
Riporter gén
Renin (pGL 3 -2824)
pGL 3
Humán (-2824/+16)
Riporter gén
Riporter plazmidok
33
Másodlagos riporter plazmidok TKβ
Riporter gén
RSVβ
Riporter gén
CMVβ
Riporter gén
Expressziós vektorok DNRas
pcDNA 3
Humán (teljes hossz)
Ras gátlás
DN Raf
pcDNA 3
AA 1-257
Raf gátlás
DNMEK
pcDNA 3
CL100
pcDNA 3
Egér (teljes hossz)
ERK gátlás
Csk
pcDNa 3
Egér (teljes hossz)
c-Src gátlás
DN Rac1
pcDNA 3
Humán (teljes hossz)
Rac1 gátlás
DN JNK
pcDNA 3
MEK gátlás
JNK gátlás Egér JIP JNK
JIP
pcDNA 3
kötődési hely (AA
JNK gátlás
127-281) 1. táb láza t: A kísérletein khez ha szná lt p la zm ido k fun kció szerin t csoporto sítva.
6.5. Módszerek 6.5.1. Plazmid preparálás A kísérletekhez szükséges plazmidokat megfelelően előkészített E. Coli (DH5α) kompetens sejtekbe juttattuk „hősokk” baktérium transzformáció módszerével. A plazmidot tartalmazó klónokat 100 mg/ml ampicillin tartalmú LB baktérium táptalajon szelektáltuk, restrikciós emésztéssel a plazmidok jelenlétét igazoltuk. A plazmid DNS-t fenol-kloroformos extrakciót követő cézium-klorid grádiensen történő ultracentrifugálással preparáltuk.
6.5.2. Tranziens transzfekció Sejtjeinket precipitációs
(CHO/AT 1 A ;
módszerrel
LLC-PK1/AT 1 )
transzfektáltuk.
34
A
kalcium
sejttenyésztés
foszfát során
a
transzfekciót megelőző napon a sejteket 60 mm-es petri csészékbe osztottuk. A transzfekciót 50%-os sejtsűrűség mellett végeztük összesen 12 µg DNS-sel. Az intracelluláris jelátvitelt vizsgáló kísérletekben a 12 µg DNS-t 2,5 µg riporter plazmid, 7,5 µg expressziós vektor vagy pcDNA 3 és 2 µg pcDNA 3 adta ki. A belső kontroll használhatóságának megítélésekor 2 µg c-fos riporter plazmidot, 1 µg RSVβ, vagy 0,1 µg CMVβ, vagy 2 µg TKβ másodlagos riportert transzfektáltunk, oly módon hogy az összesen felhasznált DNS mennyisége itt is 12 µg legyen. A
transzfekció
során
a
DNS-eket
10
mM-os
CaCl 2
oldatban
összekevertük, HEPES oldattal kiegészítettük (pH 7,1), majd 20-30 perc inkubációs idő után a sejtekre pipettáztuk. A sejteket 16 óráig 35ºC-os, 3% CO 2 tartalmú inkubátorban tartottuk, majd PBS-sel mostuk. Újabb 46 óra szérum mentes médiumban történő inkubálást követően a sejteket agonistával, vagy annak vehikulumával kezeltük. 21 óra elteltével a sejteket ismételt PBS-sel történő mosás után 300 ml 1mM DTT tartalmú 100 mM-os KH 2 PO 4 oldatba (pH 7,8) kapartuk. A sejteket ezután fagyasztás-olvasztás módszerrel szétroncsoltuk és a sejttörmeléket mikrocentrifugával eltávolítottuk. A sejtlizátumot ATP-t tartalmazó reakciópufferhez adtuk (15mM MgSO 4 , 1mM DTT, 5mM ATP, 100mM KH 2 PO 4 , pH 7,8) és az oldatba 0,9 mg/ml luciferin oldatot injektálva a luciferáz aktivitást luminométerrel mértük. Ahol szükséges volt a sejtek β-galaktozidáz aktivitását lumineszcens βgalaktozidáz riporter rendszer (Clontech, PT2106-2,Palo Alto, CA) felhasználásával szintén luminométerrel mértük[62].
6.5.3. Western blot A 60mm átmérőjű petri csészékbe osztott sejteket közel 100%-os konfluenciánál 4 óra szérummegvonást követően valamely gátlószerrel, vagy annak vehikulumával előkezeltük, majd 15 perc inkubációs idő után további 15 perces AngII kezelést alkalmaztunk. A sejteket ezután Tryton lízis pufferba kapartuk (30mM HEPES (pH 7,4), 100 mM NaCl, 10 mM
35
EDTA, 1 mM EGTA, 50 mM NaF, 1% Triton X*100, 1 mM PMSF, 20 µg/ml leupeptin, 20 µg/ml aprotinin, 5 mM benzamidin, 1 mM sodium orthovanadate) és a mintákat Laemmli pufferben 5 percig főztük. A minták azonos fehérjetartalmú porcióját (~10 µg) 8%-SDS-polyacrilmid gélen elektroforetizáltuk, majd nitrocellulóz membránra transzferáltuk. A blottokat blokkolás után (5% zsírszegény tejpor, vagy 5% albumin 0,1% Tween20-at tartalmazó TBS oldat) intenzív mosást követően inkubáltuk a megfelelő elsődleges antitesttel, amelyet ismételt intenzív mosás követett. Utolsó lépésként a blottot tormaperoxidázzal konjugált másodlagos antitesttel inkubáltuk és un. „enhanced chemiluminescense” (ECL, Amersham) oldattal előhívtuk. A blottokról készült felvételt szkenneltük, és szemikvantitatívan értékeltük a Scion image software segítségével. A dolgozatban bemutatott blottok legalább 3 hasonló eredményű kísérlet eredményeit reprezentálják.
6.5.4. Statisztikai értékelés A transzfekciós kísérleteket duplikátumokban végeztük, az eredményeket legalább
három
egymástól
független
kísérlet
mérési
eredményéből
számoltuk. Az intracelluláris jelátviteli utak vizsgálatakor a mérési eredményeket a lizátum fehérjekoncentrációjára normalizáltuk[127]. Az eredményeket
átlag±szórás
formában
mutatjuk
be,
a
statisztikai
értékelést Student t próbával, vagy 1 utas ANOVA módszerrel végeztük.
36
7. Kísérleti eredmények 7.1. Az AngII AT 1 receptoron keresztül fokozza a c-fos promóter transzkripciós aktivitását Az AngII sejtosztódást és sejtnövekedést fokozó hatása mára tankönyvi ismeretanyagnak számít[51, 128]. Az AngII a proliferatív hatást részben a sejtosztódásban szerepet játszó gének transzkripciós aktivitásának fokozása által fejti ki. Ismert, hogy a c-fos protoonkogén transzkripciója AngII hatására több sejttípusban is fokozódik[129, 130]. Kísérleti rendszerünkben ezért az AngII által kiváltott géntranszkripciós válasz
intracelluláris
szabályozásának
vizsgálatára
az
AngII
c-fos
promóterre kifejtett hatását vizsgáltuk. Vizsgálatainkhoz a patkány AT 1 receptorával
stabilan
transzfektált
CHO
sejteket
(T 3 CHO/AT 1 A )
használtunk[121]. T 3 CHO/AT 1 A sejteket tranziensen transzfektáltuk a c-fos promótert (-732/+44)
tartalmazó
luciferáz
riporter
plazmid
konstrukcióval
(pA 3 Luc), majd a sejteket AngII-vel kezeltük. Az AngII dózisfüggő módon fokozta a c-fos promóter transzkripciós aktivitását (10 - 1 0 M: 1,15±0,13; 10 - 9 M: 1,5±0,16; 10 - 8 M: 2,28±0,12; 10 - 7 M: 2,71±0,13; 10 - 6 M: 3,08±0,27; 10 - 5 M: 3,03±0,11; p<0,05; 5. ábra). A legmagasabb aktivációt a 10 - 6 M AngII koncentráció mellett kaptunk, további kísérleteinkhez azonban az irodalomban általánosan használt 10 - 7 M AngII koncentrációt használtunk. Az AngII AT 1 receptorának specifikus gátlószerével, 10 - 7 M Candesartannal előkezelve a sejteket az AngII okozta c-fos promóter aktiválódás elmaradt (1,43±0,13; p: ns; 5. ábra). A fentihez hasonló c-fos promóter aktivációt találtuk LLC-PK1/AT 1 sejtekben is. A legnagyobb aktiváció ebben a sejtvonalban 10 - 7 M AngII kezelés hatására jelentkezett (3,81±0,68; p<0,01).
37
Relatív luciferáz aktivitás
4
*
*: p <0,05
*
*
3
* 2
1
0 Vehikulum 10-10 M
AngII Cand.
-
-
10-9 M
10-8 M
10-7 M
10-6 M
10-7 M
10-7 M
-
-
-
-
-
10-7 M
5. ábra Az Ang II ha tá sa a c- fo s p romó ter transzkrip c iós aktivitá sára
7.2. Az AngII fokozza a kotranszfektált másodlagos riporter plazmidok β-galaktozidáz aktivitását Az AngII géntranszkripciót befolyásoló hatásainak vizsgálatára végzett
tranziens
transzfekciós
kísérleteinkben
a
transzfekciós
hatékonyság változásából eredő hiba kiküszöbölésére a c-fos riporter mellé a humán timidin kináz minimál promóter által vezérelt βgalaktozidáz gént tartalmazó másodlagos riporter plazmidot (TKβ) kotranszfektáltuk.
Eredményeink
értékelése
során
a
β-galaktozidáz
aktivitás következetes emelkedését észleltük az AngII-vel kezelt sejtek esetében az angiotenzin vehikulumával kezelt sejtekhez képest. A hatás a c-fos
promóternél
megfigyeltekhez
hasonlóan
dózisfüggő
volt,
a
legnagyobb aktiváció szintén 10 - 7 M AngII kezeléssel volt elérhető (2,57±0,04; p<0,01; 6/A. ábra). Annak eldöntésére, hogy az észlelt hatás csak a TKβ plazmid esetében jelentkezik-e kísérletünket további két másodlagos eredményt
riporter kaptuk,
plazmid hogy
a
használatával c-fos
38
luciferáz
megismételtük. riporter
Azt
az
konstrukcióval
kotranszfektálva 10 - 7 M AngII fokozza mind a Rous sarcomavírus (RSVβ) és a citomegalovírus (CMVβ) promóterével vezérelt β-galaktozidázt expresszáló másodlagos riporter plazmid aktivitását (RSVβ: 1,74±0,26; CMVβ: 3,77±1,4; p<0,05; 6/A. ábra). A specifikus AT 1 receptor blokkoló Candesartan az AngII okozta aktivitás fokozódást mindhárom promóter esetében kivédte (10 - 7 M AngII + 10 - 7 M Candesartan: TKβ: 1,4±0,22; RSVβ: 1,17±0,25; CMVβ 1,43±0,55; p:ns, minden esetben), ami arra utal, hogy mind a timidin-kináz minimál promóter, mind pedig a virális promóterek transzkripciós aktivitását az AngII AT 1 receptoron keresztül fokozza.
7.3. A szérum fokozza a kotranszfektált másodlagos riporter plazmidok β-galaktozidáz aktivitását A következő kísérletsorozatban arra kerestük a választ, hogy a másodlagos riporter plazmidok β-galaktozidáz expresszió fokozódása specifikusan az AngII kezelés eredménye, vagy más agonisták is hasonló hatást váltanak ki. Sejtjeinket a c-fos riporter konstrukcióval, valamint a különböző
másodlagos
riporter
plazmidokkal
transzfektáltuk.
A
transzfekciót követően a kezelést a c-fos promótert biztosan aktiváló 10% szérummal végeztük, majd 21 óra elteltével mértük a luciferáz és βgalaktozidáz aktivitásokat. Kontrollcsoportként a 10% szérummentes médiummal kezelt sejtek szolgáltak. A szérum minden esetben kiváltotta a várt c-fos promóter aktivációt és az AngII kezeléshez hasonlóan minden β-galaktozidáz expressziót szabályzó promóter esetében aktivitás fokozódást
okozott
(TKβ:
2,62+0,28;
RSVβ:
4,15+0,82;
CMVβ:
7,41+2,58; p<0,05; 6/B. ábra).
7.4. Az AngII fokozza a β-galaktozidáz aktivitást az önállóan TKβ ritporterrel transzfektált sejtekben Következő kísérletsorozatunkat annak eldöntésére terveztük, hogy az
agonisták
kiváltotta
β-galaktozidáz
39
aktivitás
fokozódást
befolyásolják-e a kotranszfektált riporter plazmidok. Sejtjeinkbe az üres expressziós plazmid (pcDNA 3 ) mellé csak TKβ, vagy csak RSVβ, vagy csak
CMVβ
követően
riporter
10 - 7 M
plazmidokat transzfektáltunk.
AngII,
illetve
10%
A transzfekciót
szérumkezelést
alkalmaztunk.
Érdekes módon az AngII csak a TKβ plazmiddal transzfektált sejtekben fokozta a β-galaktozidáz aktivitást, az RSVβ és CMVβ vektorokkal transzfektált sejtekben az aktiváció elmaradt (10 - 7 M AngII: TKβ: 1,79±0,8; p<0,05; RSVβ: 1,1±0,67; p:ns; CMVβ 1,24±0,17; p:ns).
A
10% szérummal kezelt csoport kissé eltérő eredményt adott. A szérum fokozta a TKβ és CMVβ vektorok esetében a β-galaktozidáz termelés, az RSVβ plazmid esetében az aktiváció itt is elmaradt (10 - 7 M AngII: TKβ: 2,3±0,28; p<0,05; RSVβ: 1,02±0,31; p:ns; CMVβ 2,52±0,36; p<0,05).
A.
B.
ß-galaktozidáz aktivitás fokozódás
5,5
*
5
*
*: p<0,05
10
4,5
8
4 3,5 3
6
*
2,5
*
2
4
1,5
* *
2
1 0,5
0
0 TKß
RSVß
CMVß
AngII 6. áb ra
Az
AngII
és
szérum
TKß
RSVß
CMVß
serum ha tása
a
má sod lagos ripo rter p lazm idok a k tivitásá ra.
40
c-fos p romó ter m e llé
ko tran szfektált
A fenti eredmények arra engednek következtetni, hogy a transzfekciós hatékonyság megítélésére használt β-galaktozidázt expresszáló riporter konstrukciók transzkripciós aktivitását, különböző stimulusok, valamint a kotranszfektált vektorok befolyásolják. Egy ideális, belső standardnak használható
másodlagos
riporter
plazmid
transzkripciós
aktivitása
állandó, független a sejtet ért stimulusoktól és a transzfekció egyéb körülményeitől. Eredményeink ezért a fenti β-galaktozidázt termelő riporter
plazmidok
belső
standardként
történő
használhatóságát
megkérdőjelezik.
7.5. A PI 3 -kináz és a PKC enzimek nem befolyásolják az AngII okozta c-fos promóter aktivációt Ismert, hogy az AngII „klasszikus”, hatásainak intracelluláris regulációjában a PI 3 -kináz és PKC enzimek jelentős szerepet játszanak. Szintén irodalmi adat, hogy az ERK aktivációban a MAP kináz kaszkádokon kívül a PKC és az PI 3 -kináz is szerepet játszhat, és az is igazolt, hogy az AngII több sejttípusban képes aktiválni a PKC-t és a PI 3 -kinázt[131,
132].
Következő
kísérletünket
annak
megítélésére
terveztük, hogy a PI 3 -kináz és a PKC enzimek részt vesznek-e az AngII által
kiváltott
c-fos
promóter
transzkripciós
aktivitás
változás
szabályozásában. CHO/AT 1 A sejteket tranziensen transzfektáltuk a c-fos promótert tartalmazó riporter plazmiddal. Az AngII kezelést megelőzően a PI 3 –kinázt specifikusan blokkoló wortmaninnal, vagy a PKC működését gátló bisindolyl-maleimiddel végeztünk előkezelést. A wortmannint 10 - 7 M, a bisindolyl-maleimidet 5x10 - 7 M koncentrációban használtuk. Az előkezelést követően a sejteket 10 - 7 M AngII-vel vagy vehikulumával kezeltük. Sem a PI 3 kináz gátlás sem a PKC blokkolás nem befolyásolta az AngII okozta c-fos promóter transzkripció fokozódását (AngII: 2,67±1,02 vs. wortmannin + AngII: 4,39±2,64; p:ns; AngII: 2,12±0.6 vs. bisindolylmaleimid
+
AngII
2,31±0,63;
p:ns;
7.
ábra).
A
fenti
eredmények arra utalnak, hogy a PI 3 -kináz és a PKC enzimek nem vesznek részt a c-fos transzkripció stimulálásában.
41
8
Bis: Bisindolyl maleimid Wort: Wortmannin PD: PD 98059
Relatív luciferáz aktivitás
7 6 5
*: p < 0,05
4 3
*
2 1 0
veh 1Bis
veh PD
veh Wort
7. ábra Gátló szerek ha tá sa a 10 - 7 M AngI I ha tá sára b e következett c- fos promó ter a k tivá cióra
7.6. Az ERK kaszkád szerepe a c-fos promóter aktiválódásában Következő kísérletünkben arra kerestünk választ, hogy a korábban bemutatott ERK aktiváció szerepet játszik-e az AngII általi c-fos promóter
aktivációban.
A
kérdés
megítélésére
az
ERK
enzimet
specifikusan defoszforilláló MAP kináz foszfatáz termelő expressziós vektort
(CL-100)
kotranszfektáltuk
a
c-fos
luciferáz
riporter
konstrukcióval CHO/AT 1 A sejtekbe. A CL-100 vektor kotranszfekciója teljesen kivédte a 10 - 7 M AngII okozta c-fos promóter aktivációt (AngII: 3,17±0,93 vs. AngII + CL-100: 1,06±0,2; p<0,01; 8. ábra). Következő lépésként az ERK-et aktiváló MAP kináz rendszer szerepét vizsgáltuk. Az ERK-et közvetlenül aktiváló MEK enzimet gátló PD98059[133] előkezelés részlegesen kivédte az AngII által kiváltott c-fos promóter aktivációt (AngII: 2,36±093 vs. AngII + PD98059: 1,44±0,32; p<0,05; 7. ábra).
Annak
megítélésére,
hogy
az
AngII
milyen
intracelluláris
jelátviteli utakon keresztül fokozza az ERK és rajta keresztül a c-fos promóter transzkripciós aktivitását, az ERK aktiválásában ismerten szerepet játszó Ras G-fehérje, valamint a MAPKK-kináz csoportba tartozó
Raf
enzim
felhasználásával
domináns
végeztünk
negatív
formáját
transzfekciót
42
kódoló
CHO/AT 1 A
plazmidok
sejteken.
A
domináns negatív fehérjék kotranszfekciója mindkét esetben csaknem teljesen kivédte az AngII c-fos aktiváló hatását az üres expressziós vektorral kotranszfektált sejtekhez képest (pcDNA 3 . 3,17±0,93 vs. DNRas: 1,16±0,3 vs. DNRaf 1,36±0,31; p<0,01; 8. ábra). Az eredmények azt igazolják, hogy CHO/AT 1 A sejtekben az ERK rendszer részt vesz az AngII
által
kiváltott
c-fos
promóter
transzkripciós
aktivitásának
fokozásban.
Relatív luciferáz aktivitás
7
*: p < 0,01
6 5 4 3 2
*
*
*
*
CL-100
DN Rac
1 0 pcDNA3
DN Ras
DN Raf
JIP
8. ábra Gátló feh érjéket kódoló expressziós vektoro k ko tran szfekció jána k ha tása a z Ang II o kozta c- fo s a k tivá lódásra
7.7. A p21Rac1 fehérje részt vesz a c-fos promóter aktivációban A szakirodalomban jó ismert és saját kísérleteinkben is igazoltuk, hogy az AngII aktiválhatja a JNK enzimet (l. 7.10 fejezet). Az is ismert, hogy számos sejttípusban a JNK enzim aktivációja a Rac1 kis G-fehérje részvételével történik[134], ezért további kísérleteinkben a p21Rac1 és a JNK lehetséges szerepét vizsgáltuk a c-fos promóter AngII kiváltotta aktivációjában.
A
sejtekbe
a
Rac1
működését
kompetitíven
gátló
DNRac1 expressziós vektort kotranszfektáltuk, amely gátolta a c-fos promóter aktivációját 10 - 7 M AngII hatására (pcDNA 3 : 3,17±0,93 vs. DNRac1: 1,18±0,31; p<0,01; 8. ábra). Ezt követően a JNK enzimet gátló JNK-interacting protein-1 (JIP) JNK kötő doménjét kódoló expressziós vektorral kotranszfektáltuk a sejteket. Meglepő módon a JNK enzim
43
gátlása nem befolyásolta a c-fos promóter AngII általi aktivációját (pcDNA 3 : 3,17±0,93 vs. JIP: 4,49±1,9; p:ns; 8. ábra). Az eredmények az mutatják, hogy az AT 1 receptortól induló c-fos promóter transzkripciót fokozó jelátviteli folyamatban a p21Rac1 G-fehérje igen, de a JNK enzim nem vesz részt.
7.8. Az AngII AT 1 receptoron keresztül fokozza proximális renin promóter transzkripciós aktivitását
a
Az AngII renin transzkripciót fokozó hatásának modellezésére LLC-PK1/AT 1 sejteket tranziensen transzfektáltuk a proximális renin promótert (-582/+16) tartalmazó luciferáz riporter plazmiddal (pGL 3 ), majd a sejteket AngII-vel kezeltük. Várakozásunknak megfelelően az AngII
dózisfüggő
módon
fokozta
a
proximális
renin
promóter
transzkripciós aktivitását (10 - 1 0 M: 1,9±0,14; 10 - 9 M: 2,63±0,64; 10 - 8 M: 3,01±0,56 ;10 - 7 M: 3,49±1,25; 10 - 6 M: 3,17±0,64; p<0,05; 9. ábra). A legnagyobb
aktivitás-fokozódást
Candesartannal
tökéletesen
okozó
kivédhető
volt
10 - 7 M
AngII -7
(10 M
hatása
Candesartan:
1,52±0,21; 10 - 6 M Candesartan: 0,81±0,31; p:ns; 10.ábra). Hasonló eredményeket
kaptunk
a
kísérleteket
T3CHO/AT 1 A
sejteken
megismételve, a legnagyobb aktiváció ezen a sejtvonalon is 10 - 7 M AngII
Relatív luciferáz aktivitás
kezelés hatására jelentkezett. *
5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
*
*: p < 0,05
*
*
AngII
10-10 M
10-9 M
10-8 M
10-7 M
10-6 M
10-7 M
10-7 M
Cand.
-
-
-
-
-
10-7 M
10-6 M
9. ábra Az Ang II ha tá sa a pro x imális ren in p romó ter trans z kr ip c iós ak tiv itá sára
44
A fenti adatok igazolják, hogy kísérleti rendszerünkben az AngII specifikusan AT 1 receptoron keresztül fokozza a proximális renin promóter aktivitását.
7.9. Az AngII fokozza a különböző hosszúságú proximális renin promóterek transzkripciós aktivitását Előzetes feltevésünknek megfelelően igazoltuk, hogy az AngII fokozza az 582 bp hosszúságú renin promóter aktivitását. A stimuláció dózisfüggő volt, AT 1 receptoron keresztül valósult meg, a legnagyobb aktivitás fokozás 10 - 7 M AngII kezelés hatására volt mérhető (3,49±1,25; p<0,05; 10.ábra). Az AngII „paradox” hatásának további vizsgálatára további
három,
különböző
hosszúságú
renin
promóter
szakaszt
tartalmazó luciferáz-riporter konstrukcióval ismételtük meg a kísérletet. A 145, 892, 2824 bp hosszúságú renin promóterek transzkripciós aktivációja 10 - 7 M AngII hatására rendre 2,18±0,3, 3,59±1,15; 3,29±1,67 volt (p<0,05 mindhárom esetben). A specifikus AT 1 receptor blokkoló Candesartan az AngII hatását ezekben az esetekben is kivédte. További kísérleteinket a renin 582 bp hosszúságú promóter szakaszát tartalmazó plazmiddal folytattuk. A fenti eredmények egyértelműen igazolják, hogy kísérleti modellünkben az AngII fokozza a proximális renin promóter aktivitását,
valamint
azt,
hogy
ez
a
hatás
AT 1
receptor
által
szabályozottan valósul meg.
7.10. Az AngII aktivitását Annak aktiválja-e
fokozza
eldöntésére, a
MAP
kináz
hogy
az
ERK
kísérleti
rendszereket
és
JNK
enzimek
modellünkben western
blot
az
AngII
vizsgálatokat
végeztünk az aktivált (foszforillált) ERK és JNK enzimekkel reagáló antitestekkel LLC-PK1/AT 1 sejteken. Kísérleti rendszerünkben 10 - 7 M AngII kezelés az ERK esetében 16,2±3,3-szoros, JNK esetében 3,84±1,1szeres aktivitásfokozódást okozott (p<0,01 mindkét esetben; 10. ábra). Az AT 1 receptor blokkoló 10 - 7 M candesartan mindkét sejttípusban kivédte az AngII indukálta ERK és JNK aktivációt. Az eredmények azt
45
sejtetik, hogy a fenti enzimek részt vesznek az AngII által kiváltott géntranszkripciós változások regulációjában.
Veh
AngII
Veh
AngII ← p54
p44 → p42 →
← p46
21
Relatív aktivitás
18
4,5
*
4
*:p<0,01
3,5
15
* *:p<0,01
3
12
2,5
9
2 1,5
6
1 3
0,5
0
0
Vehikulum
10-7 M AngII
Vehikulum
p-ERK
10-7 M AngII p-JNK
10. ábra Az Ang II ha tá sa a z ERK és JNK enzimek aktivitásá ra
7.11. A JNK részt vesz a renin promóter aktiválásban, de az ERK kaszkád nem játszik szerepet a folyamatban A MAP kináz rendszerek AngII általi stimulálása felveti lehetséges szerepüket a renin aktivációban. A kérdés megválaszolására újabb transzfekciós vizsgálatokat végeztünk. A MEK antagonista PD98059 6x10 - 5 M koncentrációban, amely a western blot kísérletekben a fenti ERK aktivációt gátolta, nem befolyásolta az AngII renin promóterre gyakorolt hatását (2,88±1,17 vs. 2,4±0,68; p:ns, 13. ábra). Abból a célból, hogy igazoljuk, hogy az ERK kaszkád nem játszik szerepet a vizsgált folyamatban az ERK kaszkád egyes elemeinek domináns negatív mutáns verzióját kódoló plazmidokat kotranszfektáltuk a pGL3-582 luciferáz konstrukció mellé a sejtekbe. A DN-Ras, DN-Raf, DN-MEK gátló plazmidok jelenlétében bekövetkezett renin aktiváció (3,31±0,83;
46
2,83±0,84; 2,93±0,86; p:ns; 11. ábra) nem különbözött attól, ami gátló plazmidok nélkül, az üres expressziós vektor (pcDNA 3 ) jelenlétében volt mérhető. Az eredmények azt erősítik meg, hogy az ERK kaszkád nem játszik szerepet az AngII általi renin promóter aktivációban. 4,5 Relatív luciferáz aktivitás
4
p: ns. minden esetben
3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 pcDNA3
DN-Ras
DN-Raf1
DN-MEK
11. ábra Az ERK kaszkád gá tlá sának ha tása az Ang II ha tá sá ra bekö vetkező ren in p romó te r stimu lá c ióra
A következőkben JNK kaszkád szerepét vizsgáltuk az AngII által kiváltott renin promóter transzkripció fokozásban. A JNK enzimet inaktiváló JIP fehérét, illetve a JNK enzim domináns negatív mutáns verzióját tartalmazó DN JNK plazmidokat kotranszfektáltunk a pGL 3 -582 riporter vektor mellé. Mind a JIP, mind a DN JNK fehérjék jelenléte gátolta az AngII által kiváltott hatást (2,75±0,69 vs. 1,8±0,34 és 1,6±0,23; p<0,01; 12. ábra). Hasonló eredményt kaptunk a JNK enzimet gátló SP600125 használatával is, amely megerősíti azt, hogy a JNK részt vesz a renin aktiváció szabályozásában. Az irodalomban számos utalás található arra vonatkozóan, hogy a p21Rac 1 kis G fehérje szerepet játszik a JNK aktiválásában, ahhoz hasonlóan, ahogy a p21Ras G fehérje részt vesz az ERK kaszkád aktiválásában[64, 85]. Abból a célból, hogy tisztázzuk a renin promóter aktiválódásához vezető intracelluláris jelátviteli út további elemeit a renin-luciferáz riporter konstrukció mellé a p21Rac1 fehérje domináns negatív mutáns verzióját kódoló plazmidot kotranszfektáltuk LLC-
47
PK1/AT 1 sejtekbe. Meglepő módon a DN Rac1 nem befolyásolta az AngII hatását az 582 bp hosszúságú renin promóterre (2,75±0,69 vs. 3,21±0,53; p:ns; 12. ábra), ami azt valószínűsíti, hogy ebben a sejttípusban alternatív jelátviteli útvonal felelős a JNK aktiválásáért.
Relatív luciferáz aktivitás
4
*: p < 0,01
3,5 3
*
2,5
*
*
JIP
JIP + genistein
*
2 1,5 1 0,5 0 pcDNA3
Csk
DN-Rac
DN-JNK
12. ábra A c-Src és a JNK kaszkád gá tlásána k ha tása a paradox ren in p romó ter a k tivá cióra
7.12. A PKC szerepe Az AngII számos sejtben aktiválja a protein kináz C (PKC) jelátviteli rendszert. Az AngII által aktivált renin promóter transzkripció fokozásban a PKC szerepének megítélésére a sejteket az 582 bp hosszúságú renin-luciferáz riporter vektorral transzfektáltuk, majd a 10 - 7 M
AngII
kezelést
megelőzően
a
PKC-t
specifikusan
gátló
bisindolylmaleimeddel (Bis) előkezeltük. 5x10 - 7 M Bis előkezelés nem gátolta az AngII stimuláló hatását (2,88±1,17 vs. 3,83±2,14; p:ns; 13. ábra). Pozitív kontrollként a sejteket a c-fos promótert tartalmazó riporter plazmiddal transzfektáltuk, majd phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) kezelést alkalmaztunk. A kezelés hatására bekövetkezett c-fos transzkripciós
aktivitás
fokozódást
a
Bis
a
fentivel
megegyező
koncentrációban kivédte. Következő lépésként sejtjeinken a PKC összes izoformáját blokkoló (kimerítő) 24 órás PMA (100 nm) inkubációt alkalmaztunk. A Bis előkezeléshez hasonlóan a 24 órás PMA inkubáció
48
sem
védte
ki
a
renin
promóter
AngII
hatására
bekövetkezett
transzkripciós aktiválását. A PKC szerepének teljes kizárása céljából a renin promóter-luciferáz konstrukcióval transzfektált sejteket a PKC-t stimuláló kisebb dózisú (10 - 7 M) PMA-val kezeltük. A PKC stimulálása nem eredményezett szignifikáns növekedést a proximális renin promóter transzkripciós aktivitásában (1,24±0,45; p:ns). A fenti eredmények összességében teljes biztonsággal kizárják a PKC enzim szerepét az AngII által kiváltott renin transzkripció fokozásában.
7.13. A tirozin kinázok gátlása részlegesen kivédi az AngII hatását Az utóbbi években vált ismertté, hogy a citoplazmatikus tirozin kinázok, vagy transzaktiválódó receptor tirozin kinázok szerepet játszhatnak az AT 1
receptor
intracelluláris
kísérleteinkben
a
tirozin
jelátvitelében[135],
kinázok
szerepét
ezért
következő
vizsgáltuk.
A
renin
promóterrel transzfektált sejtek tirozin kináz gátló Genisteinnel (10 - 4 M) történt
előkezelése
az
AngII
stimuláció
közel
50%-os
gátlását
eredményezte (2,88±1,17 vs. 1,57±0,45; p<0.01; 13. ábra), ami arra utal, hogy
a
tirozin
transzkripciót
kinázok
fokozó
részt
hatásának
vesznek
az
AngII
jelátvitelében.
renin
Számos
promóter közlemény
számol be arról, hogy a c-Src tirozin kináz központi szereplője a Gfehérjét kötő receptorok, így az AT 1 receptor intracelluláris jelátviteli folyamatainak. Következő kísérletünkben a c-Src szerepét vizsgáltuk a renin
promóter
aktiválásában.
A
c-Src-N-terminális
kináz
(Csk)
foszforillálja, ezáltal gátolja az enzim működését. Sejtjeinkbe a riporter mellé a Csk enzimet kódoló expressziós vektort kotranszfektálva az AngII
hatása
a
pGL3-582
promóteren
(2,75±0,69 vs. 2,09±0,42; p<0,01; 12.ábra).
49
mintegy
30%-al
csökkent
7 Relatív luciferáz aktivitás
6
*: p<0,01
5 4 3
*
2 1 0 vehikulum
PD98059
bisindolyl maleimid
genistein
13. ábra Gátlószerek hatása az AngII oko z ta ren in p romó ter s timu lá c iór a
7.14. A tirozin kinázok és a JNK viszonya A közelmúltban több közlemény számolt be arról, hogy az AngII többszörös tirozin kináz jelátviteli utakat használva aktiválja a JNKt[64, 85]. Utolsó kísérletsorozatunkban azt vizsgáltuk, hogy a tirozin kinázok és a JNK egymástól függetlenül, vagy közös jelátviteli úton keresztül szabályozzák a renin AngII általi transzkripciós aktivitás fokozódását. Sejtjeinket ismételten a pGL3-582 riporter, valamint a JIP fehérjét kódoló expressziós plazmiddal kotranszfektáltuk, majd a 10 - 7 M AngII kezelést megelőzően 10 - 4 M Genistein előkezelést alkalmaztunk. A tirozin kinázok és a JNK együttes gátlása az AngII stimulus mintegy 35%-os csökkenését eredményezte (2,75±0,69 vs. 1,75±0,48; p<0,01; 13. ábra), amely nem különbözött szignifikánsan attól a gátlástól, ami külön a Genisteinnel vagy a JIP fehérjével volt észlelhető.
50
Ang II
-
+
-
+
Genistein
-
-
+
+ p54
p-JNK
p46 5
*
Relatív aktivitás
4
*: p<0,01
3 2 1 0
Vehikulum
10-7 M AngII
Vehikulum
Vehikulum
10-7 M AngII
Genistein
14. áb ra A tirozin kináz gá tlás ha tása az AngII ha tásá ra b ekövetkez ő JNK a k tivá cióra
A következőkben anti p-JNK western blot kísérleteket végeztünk, amelyben a Genistein gátolta az AngII hatására bekövetkező JNK aktivációt
(3,84±1,12
vs.
1,31±0,56;
p<0,01;
14.
ábra).
A
fenti
eredmények azt valószínűsítik, hogy a tirozin kinázok és a JNK egyazon jelátviteli útvonalon befolyásolják az AngII renin promóterre gyakorolt hatását,
és
ezen
a
jelátviteli
úton
helyzetűek.
51
a
tirozin
kinázok
„upstream”
8. Megbeszélés 8.1. Metodikai kísérleteink megbeszélése A másodlagos riporterek alkalmazásán alapuló standardizálási eljárást eredetileg olyan vizsgálatokhoz dolgozták ki, ahol különböző promótereknek, egyazon promóter különböző hosszúságú részletének, vagy
egyazon
transzkripciós
promóter
különböző
aktivitását
kívánták
mutációt
hordozó
összehasonlítani.
szakaszainak Ezekben
az
esetekben az eltérő transzfekciós hatékonyság eltérő mennyiségű DNS bejutását eredményezi a sejtekbe, ami nagyban befolyásolja a riporter mérhető
aktivitását,
így
feltétlenül
szükséges
az
eredmények
standardizálása. A standardizálás másodlagos riporterek alkalmazásával valósítható meg. A sejtekbe a vizsgálni kívánt promóterek mellé másodlagos riporter plazmidokat kotranszfektálva, azok transzkripciós aktivitása mérhető. Ideális esetben a másodlagos riporter aktivitása kizárólag
a
transzfekciós
hatékonyságtól
függ[117,
136,
137].
A
vizsgálni kívánt promóterek mért aktivitását a másodlagos riporterek aktivitásával,
mint
a
transzfekciós
hatékonyság
mutatószámával,
normalizálva standardizált eredmények nyerhetők. A tranziens transzfekciós kísérleteket később más típusú kísérletekhez, így
az
intracelluláris
jelátviteli
utak,
vagy
különböző
agonisták
génexpresszióra kifejtett hatásainak vizsgálatához is használták. A másodlagos
riporter
plazmidok
használata,
az
eltérő
transzfekciós
hatékonyságból származó hiba korrekciójához, standardizálás céljából ezekben az esetekben is széleskörűen elterjedt[126]. Kezdeti kísérleteinkben az AngII hatását vizsgáltuk a c-fos promóter transzkripciós
aktivitására.
Az
irodalmi
ajánlásoknak
megfelelően
másodlagos riportert (timidin kináz minimál promóter által vezérelt ßgalaktozidázt kódoló plazmidot) használtunk a mérési eredmények standardizálása céljából. Eredményeink értékelésekor azt tapasztaltuk, hogy a belső standardunk aktivitása nem kizárólag a transzfekciós hatékonyságtól függött, hanem az AngII következetesen stimulálta a mért
52
ß-galaktozidáz aktivitást. A normalizálási számítások elvégzése után az AngII okozta ß-galaktozidáz emelkedés miatt, a c-fos promóteren észlelt transzkripciós aktivitás fokozódás rendre eltűnt. Amennyiben egy agonista a vizsgált promóter és a másodlagos riporter aktivitását is befolyásolja, akkor a standardizálás elvégzésével az eredmények szisztematikusan hibásak lesznek. A kísérleteinkben észlelt helyzethez képest fordított esetben, ha az agonista hatása a vizsgált promóterre és a másodlagos riporterre ellenkező előjelű, akkor a standardizálás a vizsgálni kívánt promóterre kifejtett hatást megnöveli. Így
ebben
az
esetben
előfordulhat,
hogy
egy
statisztikailag
nem
szignifikáns hatás ezáltal válik szignifikánssá. További kísérleteinkben két újabb, általánosan használt másodlagos riporter (CMV és RSV vírus promóterek által vezérelt ß-galaktozidázt kódoló plazmidok) esetében is kimutattuk, hogy az AngII stimulálja a ßgalaktozidáz aktivitást. Következő lépésként igazoltuk, hogy ez a stimuláló hatás nem csak az AngII, hanem más agonisták (szérum) esetében is bekövetkezik. Ismeretes, hogy a kotranszfektált plazmidok befolyásolhatják egymás expresszióját[119], ezért végül a másodlagos riporter plazmidjainkat önállóan transzfektáltuk az üres expressziós vektor mellé, annak megítélésére, hogy a kotranszfektált riporter plazmid befolyásolja-e a másodlagos riporterek transzkripciós aktivitását. Ebben az esetben AngII kezelés hatására a ß-galaktozidáz termelés fokozása a virális promóterek által vezérelt plazmidok esetében elmaradt, azaz feltehető,
hogy
a
kotranszfektált
plazmidok
is
befolyásolják
a
másodlagos riporter transzkripciós aktivitását. A fentiekhez hasonló jelenséget tőlünk függetlenül más kutatócsoport is megfigyelt már[138]. Eredményeinkből azt a következtetést vontuk le, hogy a transzfekciós kísérletek standardizálására elterjedten használt ß-galaktozidázt kódoló plazmidok, bizonyos körülmények között nem felelnek meg egy ideális másodlagos riporter feltételeinek, tekintettel arra, hogy aktivitásukat az alkalmazott
agonisták
és
a
kotranszfektált
plazmidok
egyaránt
befolyásolhatják. Úgy véljük, hogy a másodlagos riporter használatáról a
53
kísérleti körülmények függvényében kell dönteni. Abban az esetben, ha egy promóter különböző agonistákra adott transzkripciós válaszát, vagy az intracelluláris jelátviteli utakat kívánjuk vizsgálni az eredményeket rendszerint, mint relatív luciferáz aktivitás tüntetjük fel. A relatív luciferáz aktivitás az agonistával- és a vehikulummal kezelt csoport luciferáz aktivitásainak hányadosa. Ezekben az esetekben a vizsgált csoportok ugyanazt a DNS keveréket kapják a transzfekció folyamán. Minimális annak a valószínűsége, hogy az agonistával és a vehikulummal kezelt csoportok luciferáz aktivitásának különbözősége szisztematikusan a transzfekciós hatékonyság különbözőségéből ered. Mindezekből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a másodlagos riporter alkalmazásának elhagyása nem befolyásolja oly mértékben a vizsgálni kívánt promóter aktivitásának
értékelhetőségét,
mint
amennyire
az
agonista
által
megváltoztatott másodlagos riporter aktivitások befolyásolják azt. A standardizálás kihagyásából eredő tévedés elhanyagolható ahhoz a következetes
hibához
képest,
amit
az
agonista
által
befolyásolt
másodlagos riporter plazmid aktivitás értékeivel elvégzett korrekció esetén kapnánk. További, az intracelluláris jelátviteli mechanizmusokat vizsgáló transzfekciós kísérleteinkben nem használtunk másodlagos riporter plazmidokat[62].
8.2. A c-fos promóter AngII hatására bekövetkező transzkripciós aktivitás fokozódásának jelátvitele Az
AngII
hatására
bekövetkező
géntranszkripciós
változások
jelátvitelének vizsgálatához az AngII által ismerten aktiválódó c-fos promótert használtuk. Ezres nagyságrendű azon közlemények száma, amelyek a c-fos promóter regulációjával foglalkozik. Kimutatták többek között, hogy az AngII a PKC[139], a MAP kinázok, a PI 3 kináz és a STAT
jelátviteli
utak
aktiválásával
képes
befolyásolni
a
c-fos
in
vitro
transzkripcióját. Kísérleteink
első
lépéseként
kimutattuk,
hogy
az
AngII
rendszerünkben is aktiválja az ERK és JNK enzimeket. Majd azt vizsgáltuk, hogy rendszerünkben a PI 3 kináz és a PKC enzim szerepet
54
játszik-e a c-fos promóter aktiválásában. Több közlemény számol be arról, hogy a PI 3 kináz szerepet játszhat a MAP kináz jelátviteli utak aktiválásában
a
Ras
és
Rac
G-fehérjék
stimulálásával[140,
141].
Ellentmondásos adatok állnak rendelkezésre arra vonatkozólag, hogy az AngII aktiválja-e a PI 3 kinázt[131, 142]. Vizsgálatainkban a PI 3 kináz gátlása wortmanninnal nem befolyásolta az AngII által okozott c-fos promóter aktivációt. A PKC enzim Ras függő és Ras-tól független módon is képes aktiválni az ERK kaszkádot[132, 143]. A PI 3 kinázhoz hasonlóan kísérleti rendszerünkben a PKC gátlása bisindolylmaleimiddel nem védte ki a c-fos promóter stimulálását. Eredményeink azt a hipotézist erősítik, hogy a PI 3 kináz és a PKC enzim nem játszik szerepet az
AngII
hatására
bekövetkező
c-fos
promóter
transzkripciós
aktiválásában. Következő kísérletsorozatunkban a MAP kinázok szerepét kívántuk tisztázni
a
folyamatban.
Ismert,
hogy
az
AngII
az
ERK
enzim
aktivációjával szabályozhatja a c-fos működését[144]. Az aktivált ERK pedig
a
sejtmagba
foszforillálásával rendszerünkben
jutva
transzkripciós
serkenti AngII
a
c-fos
hatására
az
faktorok
átíródását.
ERK
(AP-1,
Elk-1)
Láttuk,
hogy
foszforillálódik,
valamint
fokozódik a c-fos promóter transzkripciója. Az ERK és a c-fos promóter aktiváció közötti összefüggés igazolására a c-fos riporter plazmidunk mellé az ERK enzimet defoszforilláló MAP kináz foszfatázt (Cl-100) kódoló
expressziós
tökéletesen
kivédte
vektort az
kotranszfektáltuk.
AngII
c-fos
promótert
Az
ERK
gátlása
stimuláló
hatását.
Eredményünket megerősítendő ezután az ERK-et aktiváló MEK enzimet gátoltuk. Az ERK ilyen irányú blokkolása is kivédte a c-fos promóter aktiválását,
bár
a
gátlás
nem
volt
100%-os,
aminek
az
lehet
a
magyarázata, hogy az alkalmazott MEK gátló PD98059 viszonylag gyenge gátlószer[133]. Az ERK aktiváció Ras függő vagy Ras-tól független módjának megítélésére a riporter plazmidunk mellé a Ras Gfehérjét és a Raf enzimet kompetitíven gátló domináns negatív mutáns verzióikat
kódoló
(DNRas,
DNRaf)
55
expressziós
vektorokat
kotranszfektáltunk. Mind a Ras és a Raf gátlása kivédte az AngII okozta c-fos promóter transzkripció fokozódást. Az ERK rendszer vizsgálatát célzó
kísérleteink
eredményeiből
azt
állapíthatjuk
meg,
hogy
rendszerünkben AngII hatására az ERK aktiváció a klasszikusnak mondható kaszkádszerű Ras-Raf-MEK jelátviteli úton valósul meg. Eredményeink továbbá egyértelműen igazolják, hogy az AngII kiváltotta c-fos promóter transzkripciós aktiválás ERK függő módon megy végbe. A JNK jelátviteli utat ebben a kísérletsorozatban nem vizsgáltuk olyan részletességgel, mint az ERK utat. Annak ellenére, hogy rendszerünkben az AngII fokozta a JNK aktivitását. A JNK gátlása a JNK-interacting proteint (JIP)[145] kódoló expressziós vektor kotranszfekciójával nem befolyásolta a c-fos promóter AngII hatására bekövetkező aktivitás fokozódását. Megvizsgáltuk a JNK kaszkád aktiválásában ismerten közreműködő Rac-1 kis G-fehérje szerepét is[85, 146, 147]. Meglepő módon a Rac-1 gátlása a fehérje domináns negatív mutáns verziójával (DN-Rac)
gátolta
az
AngII
hatására
bekövetkező
c-fos
promóter
aktivációt. Noha nem vizsgáltuk az összefüggést a Rac-1 fehérje és az ERK
kaszkád
aktivációja
között
eredményeink
felvetik
annak
lehetőségét, hogy a Rac fehérje szerepet játszik az AngII hatására bekövetkező ERK aktivációban. A megfigyelés azért is érdekes mert az utóbbi időben többen is beszámoltak arról, hogy a MAP kináz rendszerek nem teljesen izoláltak és esetleges keresztaktiváció lehetőségét vetették fel[148]. Mucsi és mtsai. beszámoltak arról, hogy a Rac-1 szerepet játszik a TGFß indukálta géntranszkripció fokozásban, amely ERK függő módon megy végbe[126]. Több szerző számol be Rac dependens ERK aktivációról[145, 148], más szerzők azt találták, hogy az ERK rendszer Rac-1 által végzett keresztaktiválása a p21-aktiválta kináz (PAK) közreműködésével
megy
végbe[149].
Kísérletes
eredményeink
megerősítik a fenti keresztaktiválás lehetőségét, a folyamatot ebben a tanulmányban azonban nem vizsgáltuk teljes részletességgel. További vizsgálatok szükségesek annak megítélésére, hogy a Rac-1 G-fehérje milyen mechanizmussal vesz részt az AngII okozta ERK aktiválásban.
56
8.3. Az AngII által kiváltott „paradox” renin transzkripció fokozódás jelátvitelének vizsgálata Sigmund munkacsoportja a humán renin promóter 900 bázispár hosszúságú szakasza által szabályozott humán renin transzgént hordozó egerekben azt a megfigyelést tette, hogy az AngII presszor dózisban mintegy kétszeresére fokozta a renin transzgén mRNS expresszióját, ami független volt a vérnyomástól[39]. Kísérleteinkben in vitro körülmények között mutattuk be az AngII renin promótert stimuláló paradox hatását tranziens transzfekciós modell segítségével. Igazoltuk továbbá, hogy az AngII
AT 1
receptoron
keresztül,
dózis
függő
módon
serkenti
a
proximális renin promóter transzkripciós aktivitását és az aktivációs folyamat tirozin kináz és JNK függő módon megy végbe. Az a tény hogy a proximális renin promóter AngII hatására bekövetkező paradox válasza a transzgenikus egérben és az in vitro rendszerben egyaránt megfigyelhető volt, azt a feltételezést erősíti, hogy a renin promóter aktivitás gátlásáért felelős szabályozó régiók a -900 bázispár helyzetnél távolabb helyezkednek el[39]. Az a kísérleti megfigyelésünk, amely szerint az AngII kifejtette stimuláló hatását a 2824 bp hosszúságú renin promóteren is arra enged következtetni, hogy a renin promóter silencer szabályozó elemei ennél is távolabb helyezkednek el. Több szerző is közölt arra vonatkozó adatokat, hogy a renin gén átíródását gátló szabályozó régiók a transzkripciós starthelytől viszonylag távol mintegy -4000 és -6000 bp távolságban helyezkednek el a promóteren, illetőleg
a
gén
első
intronjában
találhatók[47,
49,
150,
151].
Feltételezhető, hogy ezek a régiók játszanak szerepet az AngII hatására fiziológiás
körülmények
között
bekövetkező
renin
transzkripció
csökkenés szabályozásában. In vitro kísérleteinkben első alkalommal igazoltuk, hogy a PKA/cAMP rendszer mellett a JNK szintén képes stimulálni a transzkripciós aktivitást a proximális renin promóteren. További célzott kísérletek szükségesek annak eldöntésére, hogy az általunk feltárt jelátviteli folyamatok közvetítésével megy-e végbe a renin gén mások által
57
megfigyelt,
paradox
stimulálása[36-39].
Amennyiben
hipotézisünk
igazolódik, akkor többet fogunk tudni a szöveti renin-angiotenzin rendszerek szerepéről a progresszív fibrózissal járó folyamatokban. Müller és mtsai. arról számolnak be, hogy renint szekretáló As4.1 sejtekben az AngII PKC függő módon gátolja a renin promótert. A hatásért felelős szabályozó régió a promóter 2900 bp hosszú szakaszán belül található, a szerzők kiemelik, hogy a gátló hatás nem az első 200 bp
távolságon
belül
elhelyezkedő
AP-1
kötőhellyel
áll
összefüggésben[152]. Másrészről saját megfigyelésünk szerint a PKC gátlása bisindolylmaleimiddel, vagy a PKC összes izoformáját kimerítő 24 órás phorbol észter előkezeléssel, nem befolyásolta az AngII stimuláló hatását a renin promóterre. Meglehetősen nehéz értelmezni a két megfigyelés eltérő eredményeit, talán az eltérő sejttípusok adhatnak magyarázatot a különbségre. Bemutatott eredményeink igazolják, hogy kísérleti rendszerünkben az AngII mind az ERK és a JNK enzimek aktivitását fokozza. Az ERK kaszkád elemeinek több támadáspontú gátlása nem befolyásolta az AngII hatását a renin promóteren, ami arra utal, hogy az ERK kaszkád nem játszik szerepet a vizsgált folyamatban. Ezzel szemben a JNK enzim gátlása akár az enzim domináns negatív mutáns verziójának-, vagy az enzimet
gátló
JNK-interacting
proteint
(JIP)
kódoló
plazmid
kotranszfekciójával az AngII hatására bekövetkező renin promóter aktiválást kb. 40%-al csökkentette. A JNK aktiválódása után számos transzkripciós faktort aktivál, mint a c-jun, ATF-2[85], valamint az Ets doménhez
kötődő
Elk-1
transzkripciós
faktort[153],
ami
a
géntranszkripció stimulálásához vezet. Több lehetséges transzkripciós faktor kötőhely ismert a proximális renin promóteren, amelyek közül kiemelendő az Ets-domén kötő hely, valamint Tamura és mtsai. által leirt kötőhely a -36/-20 pozícióban. Ezek a JNK aktivációra potenciálisan érzékeny transzkripciós faktor kötési helyek magyarázhatják a JNK hatására
bekövetkező
renin
promóter
aktivációt.
mechanizmusának tisztázása további vizsgálatokat igényel.
58
A
folyamat
A p21Rac-1 kis G-fehérjét a JNK kaszkád egyik első elemeként tartják számon, illetve ismert az is, hogy tirozin kinázok aktiválhatják a JNK enzimet[64, 85] a Rac-1 vagy a PAK aktiválásán keresztül. Korábbi megfigyeléseink alapján a Rac-1 részt vesz az AngII intracelluláris jelátvitelében. Ebben a kísérletsorozatban a Rac-1 gátlása a domináns mutáns verzió kotranszfekciójával nem befolyásolta az AngII hatását, ami egy Rac-1 független JNK aktivációra enged következtetni. A nem szelektív tirozin kináz gátló genistein szintén gátolta az AngII hatását a renin promóteren, amely AngII hatására bekövetkező protein tirozin
kinázok
aktiválódását,
vagy
receptor
tirozin
kinázok
transzaktiválását veti fel kísérleti rendszerünkben. Az Src protein tirozin kináz gátlását eredményező c-Src-N-terminál kinázt kódoló expressziós vektor kotranszfekciója szintén részlegesen gátolta a renin promóter stimulálását. Az előzetes eredményeink felvetik a c-Src enzim lehetséges szerepét a megfigyelt folyamatban, amelynek tisztázásához további kísérletek szükségesek. Az utolsó kísérletsorozatban a genistein kivédte az
AngII
hatására
bekövetkező
JNK
aktivációt,
valamint
nem
tapasztaltunk további gátló hatást abban az esetben, amikor a JIP enzimet kódoló expressziós vektort és a genistein tirozin kináz gátlót együttesen használtuk. Mindezekből azt a következtetést vontuk le, hogy a tirozin kinázok és a JNK egyazon intracelluláris jelátviteli úton aktiválja
a
renin
promótert
és
a
„upstream” helyzetűek.
59
folyamatban
a
tirozin
kinázok
9. Következtetések Első
metodikai
intracelluláris
kísérletsorozatunkban
jelátviteli
utak
bemutattuk,
meghatározására,
hogy
vagy
az
különböző
agonisták transzkripciós aktivitást befolyásoló hatásainak vizsgálatára tervezett
kísérletekben
kiküszöbölése aktivitását
céljából
az
a
transzfekciós
kotranszfektált
AngII
befolyásolta.
hatékonyságból másodlagos
eredő
riporter
Amennyiben
hiba gének
transzfekciós
eredményeinket az AngII által befolyásolt ß-galaktozidáz aktivitásokra normalizáljuk, úgy eredményeink szisztematikusan hibásak lesznek. Eredményeinket mérlegelve megállapítottuk, hogy azokban az esetekben, amikor a sejtek a transzfekciós eljárás során ugyanazt a DNS keveréket kapják az eltérő transzfekciós hatékonyságból eredő hiba elhanyagolható, így a másodlagos riporter elhagyásával kisebb hibát vétünk, mint amikor az AngII által befolyásolt ß-galaktozidáz értékekkel normalizálunk és esetlegesen téves következtetéseket vonunk le. Következő
kísérletsorozatunkban
igazoltuk,
hogy
in
vitro
rendszerünkben az AngII aktiválja mind az ERK és a JNK enzimeket. A tranziens transzfekció módszerével a sejtjeinkbe juttatott c-fos promóter AngII hatására aktiválódik, és a stimuláció AT 1 receptor közvetítésével valósul meg. A PI 3 és PKC enzimek szerepét kizártuk a folyamatban. A MAP kinázok szerepét vizsgálva az AngII hatására bekövetkezett c-fos promóter transzkripciós aktivitás fokozódás szabályozásában, igazoltuk, hogy
a
c-fos
promóter
aktiváció
Ras-Raf-MEK-ERK
dependens
jelátviteli úton megy végbe. A JNK enzim eredményeink szerint aktiválódik, de nem vesz részt az AngII általi c-fos stimulációban. Végül ismereteink szerint az irodalomban első alkalommal igazoltuk, hogy az AngII okozta c-fos aktiválás a Rac-1 kis G-fehérje közreműködésével jön létre. A
transzfekciós
kísérletekhez
a
proximális
renin
promóter
különböző szakaszait használva demonstratív és ismételhető kísérletes környezetet biztosítottunk az AngII hatására bekövetkező paradox renin
60
stimuláció vizsgálatához. Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a renin promóter transzkripciójának AngII általi regulációja szintén AT 1 receptoron
keresztül
történik.
Eredményeink
szerint
a
vizsgált
sejttípusban AngII hatására aktiválódik az ERK kaszkád, de nem vesz részt a renin stimulációjában. A PKC enzim szintén nem szerepel a vizsgált folyamat intracelluláris jelátvitelében. A JNK enzim in vitro rendszerünkben a p21-Rac1 kis G-fehérjétől függetlenül aktiválódott és vett részt a renin paradox upregulációjában. Előzetes eredményeink alapján feltételezzük, hogy a tirozin kinázok a JNK enzimmel közös jelátviteli szerepet
utat
használva,
játszanak
az
a
JNK-hoz
képest
upstream
AngII
hatására
bekövetkező
pozícióban
renin promóter
transzkripciós aktivitásának paradox fokozásában. Dolgozatomban
bemutatott
kísérletes
eredmények
és
az
irodalomban közölt néhány indirekt bizonyíték arra, hogy az AngII bizonyos,
patológiás
körülmények
között
stimulálhatja
a
renin
termelődését, felveti annak lehetőségét, hogy ez a patológiás pozitív feedback
mechanizmus
fokozásához
és
a
hozzájárul progresszív
a
szöveti
szöveti
RAS
fibrózis
aktivitásának folyamatának
fenntartásához. További vizsgálatok szükségesek ahhoz, hogy ezt a hipotézist kísérleti eredményekkel alátámasszuk.
61
10. Köszönetnyilvánítás Szeretném
megköszönni
mindazok
munkáját,
támogatását,
tanácsait, türelmét, megértését és szeretetét, akik segítettek, abban, hogy PhD tanulmányaimat elvégezzem, dolgozatomat elkészítsem. A laboratóriumi munka nem valósulhatott volna meg Prof. Rosivall László
támogató
tanulmányaimat
segítsége
nélkül,
laboratóriumában,
az
aki
hozzájárult
általa
vezetett
ahhoz, PhD
hogy
program
keretein belül, témavezetői felügyelete mellett végezhessem. Köszönetet mondok Dr. Mucsi Istvánnak, akitől a laboratóriumi módszereket és a tudományos gondolkodást elleshettem, irányításáért és barátságáért, amellyel átvezetett a kísérletes munka szakmai és nemegyszer lelki nehézségein. Köszönet illeti közvetlen munkatársaimat és barátaimat Adamkó Ferencnét, Godó Máriát, Dr. Huszár Tamást, Dr. Masszi Andrást, Dr. Fintha Attilát és Dr. Sebe Attilát, akik sok és nemritkán áldozatos munkával segítették laboratóriumi munkám előrehaladását. Köszönöm Prof. Szollár Lajosnak, hogy lehetővé tette, hogy tanulmányaimat és a laboratóriumi munkát a Semmelweis Egyetem Kórélettani
intézetében
végezhessem,
valamint
Prof.
Szendrői
Miklósnak, aki hozzájárult ahhoz, hogy klinikai munkám mellett időt szakíthassak PhD tanulmányaimra. Köszönetet mondok minden barátomnak, akik az elmúlt évek során tanácsaikkal és kritikáikkal segítették munkámat. Külön támogatásáért,
szeretnék amellyel
hálát
adni
folyamatosan
szüleim mind
állandó nagyobb
és
megható
teljesítményre
buzdítanak. Végül hálás szívvel gondolok kicsi gyermekeim és feleségem nem szűnő türelmére és szeretetére, amely nélkül az egyre növekvő kihívások súlya alatt aligha maradnék talpon.
62
11. Saját közlemények jegyzéke (a megjelenés sorrendjében) 1.
Huszar T, Mucsi I, Antus B, Terebessy T, Jeney C, Masszi A, Hunyady L, Mihalik B, Goldberg HJ, Thekkumkara TJ, Rosivall: Extracellular signal-regulated kinase and the small GTP-binding protein p21Rac1 are involved in the regulation of gene transcription by angiotensin II. Exp Nephrol. 2001 Mar-Apr;9(2):142-9.
2.
Huszar T, Mucsi I, Terebessy T, Masszi A, Adamko S, Jeney C, Rosivall L: The use of a second reporter plasmid as an internal standard to normalize luciferase activity in transient transfection experiments may lead to a systematic error. J Biotechnol. 2001 Jul 12;88(3):251-8.
3.
Terebessy T, Masszi A, Fintha A, Sebe A, Huszar T, Rosivall L, Mucsi I: Angiotensin II activates the human renin promoter in an in vitro model: the role of c-Jun-N-terminal kinase. Nephrol Dial Transplant. 2004 Sep;19(9):2184-91. Epub 2004 Jul 6.
63
12. Irodalomjegyzék 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.
17. 18. 19. 20.
21.
Tigerstedt R, Bergman PG: Niere und Kreislauf. Scand Arch Physiol 1898, 8:223-271. Page IH, Helmer OM: A crystalline pressor substance (angiotonin) resulting from the reaction between renin and renin activator. J Exp Med 1940, 71:29-42. Lavoie JL, Sigmund CD: Minireview: overview of the renin-angiotensin system--an endocrine and paracrine system. Endocrinology 2003, 144(6):2179-2183. Chappell MC, Pirro NT, Sykes A, Ferrario CM: Metabolism of angiotensin-(1-7) by angiotensin-converting enzyme. Hypertension 1998, 31(1 Pt 2):362-367. Troyanovskaya M, Song L, Jayaraman G, Healy DP: Expression of aminopeptidase A, an angiotensinase, in glomerular mesangial cells. Hypertension 1996, 27(3 Pt 2):518-522. Ganong WF: Az orvosi élettan alapjai, Egyetemi tankönyv, Medicina, Budapest. 1990. Ferrario CM, Chappell MC, Tallant EA, Brosnihan KB, Diz DI: Counterregulatory actions of angiotensin-(1-7). Hypertension 1997, 30(3 Pt 2):535-541. Dzau VJ: Multiple pathways of angiotensin production in the blood vessel wall: evidence, possibilities and hypotheses. J Hypertens 1989, 7(12):933-936. Hollenberg NK, Fisher ND, Price DA: Pathways for angiotensin II generation in intact human tissue: evidence from comparative pharmacological interruption of the renin system. Hypertension 1998, 32(3):387-392. Rosivall L, Rinder DF, Champion J, Khosla MC, Navar LG, Oparil S: Intrarenal angiotensin I conversion at normal and reduced renal blood flow in the dog. Am J Physiol 1983, 245(3):F408-415. Navar LG, Rosivall L: Contribution of the renin-angiotensin system to the control of intrarenal hemodynamics. Kidney Int 1984, 25(6):857-868. Antus B, Exton MS, Rosivall L: Angiotensin II: a regulator of inflammation during renal disease? Int J Immunopathol Pharmacol 2001, 14(1):25-30. Rosivall L, Carmines PK, Navar LG: Effects of renal arterial angiotensin I infusion on glomerular dynamics in sodium replete dogs. Kidney Int 1984, 26(3):263-268. Urata H, Kinoshita A, Misono KS, Bumpus FM, Husain A: Identification of a highly specific chymase as the major angiotensin II-forming enzyme in the human heart. J Biol Chem 1990, 265(36):22348-22357. Huckle WR, Prokop CA, Dy RC, Herman B, Earp S: Angiotensin II stimulates protein-tyrosine phosphorylation in a calcium-dependent manner. Mol Cell Biol 1990, 10(12):6290-6298. Eguchi S, Dempsey PJ, Frank GD, Motley ED, Inagami T: Activation of MAPKs by angiotensin II in vascular smooth muscle cells. Metalloprotease-dependent EGF receptor activation is required for activation of ERK and p38 MAPK but not for JNK. J Biol Chem 2001, 276(11):7957-7962. Taubman MB, Berk BC, Izumo S, Tsuda T, Alexander RW, Nadal-Ginard B: Angiotensin II induces c-fos mRNA in aortic smooth muscle. Role of Ca2+ mobilization and protein kinase C activation. J Biol Chem 1989, 264(1):526-530. Kagami S, Border WA, Miller DE, Noble NA: Angiotensin II stimulates extracellular matrix protein synthesis through induction of transforming growth factor-beta expression in rat glomerular mesangial cells. J Clin Invest 1994, 93(6):2431-2437. Wolf G, Haberstroh U, Neilson EG: Angiotensin II stimulates the proliferation and biosynthesis of type I collagen in cultured murine mesangial cells. Am J Pathol 1992, 140(1):95-107. Ushio-Fukai M, Zafari AM, Fukui T, Ishizaka N, Griendling KK: p22phox is a critical component of the superoxide-generating NADH/NADPH oxidase system and regulates angiotensin II-induced hypertrophy in vascular smooth muscle cells. J Biol Chem 1996, 271(38):23317-23321. Touyz RM, Tabet F, Schiffrin EL: Redox-dependent signalling by angiotensin II and vascular remodelling in hypertension. Clin Exp Pharmacol Physiol 2003, 30(11):860866.
64
22.
23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38.
39. 40. 41. 42. 43.
Kimura S, Zhang GX, Abe Y: Malfunction of vascular control in lifestyle-related diseases: oxidative stress of angiotensin II-induced hypertension: mitogenactivated protein kinases and blood pressure regulation. J Pharmacol Sci 2004, 96(4):406-410. Huckle WR, Earp HS: Regulation of cell proliferation and growth by angiotensin II. Prog Growth Factor Res 1994, 5(2):177-194. Siragy HM: The role of the AT2 receptor in hypertension. Am J Hypertens 2000, 13(5 Pt 2):62S-67S. Hackenthal E, Paul M, Ganten D, Taugner R: Morphology, physiology, and molecular biology of renin secretion. Physiol Rev 1990, 70(4):1067-1116. Wagner C, Kurtz A: Regulation of renal renin release. Curr Opin Nephrol Hypertens 1998, 7(4):437-441. Gasc JM, Monnot C, Clauser E, Corvol P: Co-expression of type 1 angiotensin II receptor (AT1R) and renin mRNAs in juxtaglomerular cells of the rat kidney. Endocrinology 1993, 132(6):2723-2725. Shricker K, Holmer S, Kramer BK, Riegger GA, Kurtz A: The role of angiotensin II in the feedback control of renin gene expression. Pflugers Arch 1997, 434(2):166-172. Chen M, Harris MP, Rose D, Smart A, He XR, Kretzler M, Briggs JP, Schnermann J: Renin and renin mRNA in proximal tubules of the rat kidney. J Clin Invest 1994, 94(1):237-243. Moe OW, Ujiie K, Star RA, Miller RT, Widell J, Alpern RJ, Henrich WL: Renin expression in renal proximal tubule. J Clin Invest 1993, 91(3):774-779. Henrich WL, McAllister EA, Eskue A, Miller T, Moe OW: Renin regulation in cultured proximal tubular cells. Hypertension 1996, 27(6):1337-1340. Zimpelmann J, Kumar D, Levine DZ, Wehbi G, Imig JD, Navar LG, Burns KD: Early diabetes mellitus stimulates proximal tubule renin mRNA expression in the rat. Kidney Int 2000, 58(6):2320-2330. Linz W, Wiemer G, Schaper J, Zimmermann R, Nagasawa K, Gohlke P, Unger T, Scholkens BA: Angiotensin converting enzyme inhibitors, left ventricular hypertrophy and fibrosis. Mol Cell Biochem 1995, 147(1-2):89-97. Weiss D, Sorescu D, Taylor WR: Angiotensin II and atherosclerosis. Am J Cardiol 2001, 87(8A):25C-32C. Fogo AB: Mesangial matrix modulation and glomerulosclerosis. Exp Nephrol 1999, 7(2):147-159. Lou YK, Liu DT, Whitworth JA, Morris BJ: Renin mRNA concentration in rat hypothalamus is decreased by enalapril. Clin Exp Pharmacol Physiol 1995, 22(67):493-495. Malhotra R, Sadoshima J, Brosius FC, 3rd, Izumo S: Mechanical stretch and angiotensin II differentially upregulate the renin-angiotensin system in cardiac myocytes In vitro. Circ Res 1999, 85(2):137-146. Gilbert RE, Wu LL, Kelly DJ, Cox A, Wilkinson-Berka JL, Johnston CI, Cooper ME: Pathological expression of renin and angiotensin II in the renal tubule after subtotal nephrectomy. Implications for the pathogenesis of tubulointerstitial fibrosis. Am J Pathol 1999, 155(2):429-440. Keen HL, Sigmund CD: Paradoxical regulation of short promoter human renin transgene by angiotensin ii. Hypertension 2001, 37(2 Part 2):403-407. Tamura K, Umemura S, Nyui N, Yabana M, Toya Y, Fukamizu A, Murakami K, Ishii M: Possible role of c-Jun in transcription of the mouse renin gene. Kidney Int 1998, 54(2):382-393. Lang JA, Yang G, Kern JA, Sigmund CD: Endogenous human renin expression and promoter activity in CALU-6, a pulmonary carcinoma cell line. Hypertension 1995, 25(4 Pt 2):704-710. Petrovic N, Black TA, Fabian JR, Kane C, Jones CA, Loudon JA, Abonia JP, Sigmund CD, Gross KW: Role of proximal promoter elements in regulation of renin gene transcription. J Biol Chem 1996, 271(37):22499-22505. Duncan KG, Haidar MA, Baxter JD, Reudelhuber TL: Regulation of human renin expression in chorion cell primary cultures. Proc Natl Acad Sci U S A 1990, 87(19):7588-7592.
65
44.
45. 46. 47. 48. 49. 50. 51.
52. 53. 54. 55. 56. 57. 58.
59.
60. 61. 62.
Germain S, Konoshita T, Philippe J, Corvol P, Pinet F: Transcriptional induction of the human renin gene by cyclic AMP requires cyclic AMP response elementbinding protein (CREB) and a factor binding a pituitary-specific trans-acting factor (Pit-1) motif. Biochem J 1996, 316 ( Pt 1):107-113. Konoshita T, Germain S, Philippe J, Corvol P, Pinet F: Evidence that renal and chorionic tissues contain similar nuclear binding proteins that recognize the human renin promoter. Kidney Int 1996, 50(5):1515-1524. Kobori H, Hayashi M, Saruta T: Thyroid Hormone Stimulates Renin Gene Expression Through the Thyroid Hormone Response Element. Hypertension 2001, 37(1):99-104. Chen LS, Cuddy MP, LaVallette LA: Regulation of human renin gene promoter activity: a new negative regulatory region determines the responsiveness to TNF alpha. Kidney Int 1998, 54(6):2045-2055. Germain S, Bonnet F, Philippe J, Fuchs S, Corvol P, Pinet F: A novel distal enhancer confers chorionic expression on the human renin gene. J Biol Chem 1998, 273(39):25292-25300. Germain S, Philippe J, Fuchs S, Lengronne A, Corvol P, Pinet F: Regulation of human renin secretion and gene transcription in Calu-6 cells. FEBS Lett 1997, 407(2):177183. Touyz RM, Schiffrin EL: Signal transduction mechanisms mediating the physiological and pathophysiological actions of angiotensin II in vascular smooth muscle cells. Pharmacol Rev 2000, 52(4):639-672. Berk BC, Aronow MS, Brock TA, Cragoe E, Jr., Gimbrone MA, Jr., Alexander RW: Angiotensin II-stimulated Na+/H+ exchange in cultured vascular smooth muscle cells. Evidence for protein kinase C-dependent and -independent pathways. J Biol Chem 1987, 262(11):5057-5064. Berridge MJ, Irvine RF: Inositol phosphates and cell signalling. Nature 1989, 341(6239):197-205. Savineau JP, Marthan R: Modulation of the calcium sensitivity of the smooth muscle contractile apparatus: molecular mechanisms, pharmacological and pathophysiological implications. Fundam Clin Pharmacol 1997, 11(4):289-299. Walsh MP, Horowitz A, Clement-Chomienne O, Andrea JE, Allen BG, Morgan KG: Protein kinase C mediation of Ca(2+)-independent contractions of vascular smooth muscle. Biochem Cell Biol 1996, 74(4):485-502. Rasmussen H, Takuwa Y, Park S: Protein kinase C in the regulation of smooth muscle contraction. Faseb J 1987, 1(3):177-185. Aalkjaer C, Peng HL: pH and smooth muscle. Acta Physiol Scand 1997, 161(4):557566. Sabri A, Govindarajan G, Griffin TM, Byron KL, Samarel AM, Lucchesi PA: Calciumand protein kinase C-dependent activation of the tyrosine kinase PYK2 by angiotensin II in vascular smooth muscle. Circ Res 1998, 83(8):841-851. Zou Y, Komuro I, Yamazaki T, Aikawa R, Kudoh S, Shiojima I, Hiroi Y, Mizuno T, Yazaki Y: Protein kinase C, but not tyrosine kinases or Ras, plays a critical role in angiotensin II-induced activation of Raf-1 kinase and extracellular signalregulated protein kinases in cardiac myocytes. J Biol Chem 1996, 271(52):3359233597. Zou Y, Komuro I, Yamazaki T, Kudoh S, Aikawa R, Zhu W, Shiojima I, Hiroi Y, Tobe K, Kadowaki T et al: Cell type-specific angiotensin II-evoked signal transduction pathways: critical roles of Gbetagamma subunit, Src family, and Ras in cardiac fibroblasts. Circ Res 1998, 82(3):337-345. Robinson MJ, Cobb MH: Mitogen-activated protein kinase pathways. Curr Opin Cell Biol 1997, 9(2):180-186. Duff JL, Berk BC, Corson MA: Angiotensin II stimulates the pp44 and pp42 mitogen-activated protein kinases in cultured rat aortic smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun 1992, 188(1):257-264. Huszar T, Mucsi I, Terebessy T, Masszi A, Adamko S, Jeney C, Rosivall L: The use of a second reporter plasmid as an internal standard to normalize luciferase activity
66
63. 64.
65. 66.
67. 68. 69.
70. 71.
72.
73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80.
in transient transfection experiments may lead to a systematic error. J Biotechnol 2001, 88(3):251-258. Schmitz U, Ishida T, Ishida M, Surapisitchat J, Hasham MI, Pelech S, Berk BC: Angiotensin II stimulates p21-activated kinase in vascular smooth muscle cells: role in activation of JNK. Circ Res 1998, 82(12):1272-1278. Schmitz U, Thommes K, Beier I, Wagner W, Sachinidis A, Dusing R, Vetter H: Angiotensin II-induced stimulation of p21-activated kinase and c-Jun NH2terminal kinase is mediated by Rac1 and Nck. J Biol Chem 2001, 276(25):2200322010. Terebessy T, Masszi A, Fintha A, Sebe A, Huszar T, Rosivall L, Mucsi I: Angiotensin II activates the human renin promoter in an in vitro model: the role of c-Jun-Nterminal kinase. Nephrol Dial Transplant 2004, 19(9):2184-2191. Kusuhara M, Takahashi E, Peterson TE, Abe J, Ishida M, Han J, Ulevitch R, Berk BC: p38 Kinase is a negative regulator of angiotensin II signal transduction in vascular smooth muscle cells: effects on Na+/H+ exchange and ERK1/2. Circ Res 1998, 83(8):824-831. Force T, Bonventre JV: Growth factors and mitogen-activated protein kinases. Hypertension 1998, 31(1 Pt 2):152-161. Chao TS, Foster DA, Rapp UR, Rosner MR: Differential Raf requirement for activation of mitogen-activated protein kinase by growth factors, phorbol esters, and calcium. J Biol Chem 1994, 269(10):7337-7341. van Biesen T, Hawes BE, Luttrell DK, Krueger KM, Touhara K, Porfiri E, Sakaue M, Luttrell LM, Lefkowitz RJ: Receptor-tyrosine-kinase- and G beta gamma-mediated MAP kinase activation by a common signalling pathway. Nature 1995, 376(6543):781-784. Hughes PE, Renshaw MW, Pfaff M, Forsyth J, Keivens VM, Schwartz MA, Ginsberg MH: Suppression of integrin activation: a novel function of a Ras/Raf-initiated MAP kinase pathway. Cell 1997, 88(4):521-530. Liu Y, Gorospe M, Yang C, Holbrook NJ: Role of mitogen-activated protein kinase phosphatase during the cellular response to genotoxic stress. Inhibition of c-Jun N-terminal kinase activity and AP-1-dependent gene activation. J Biol Chem 1995, 270(15):8377-8380. Eguchi S, Numaguchi K, Iwasaki H, Matsumoto T, Yamakawa T, Utsunomiya H, Motley ED, Kawakatsu H, Owada KM, Hirata Y et al: Calcium-dependent epidermal growth factor receptor transactivation mediates the angiotensin II-induced mitogenactivated protein kinase activation in vascular smooth muscle cells. J Biol Chem 1998, 273(15):8890-8896. Daub H, Weiss FU, Wallasch C, Ullrich A: Role of transactivation of the EGF receptor in signalling by G-protein-coupled receptors. Nature 1996, 379(6565):557560. Schieffer B, Drexler H, Ling BN, Marrero MB: G protein-coupled receptors control vascular smooth muscle cell proliferation via pp60c-src and p21ras. Am J Physiol 1997, 272(6 Pt 1):C2019-2030. Treisman R: Regulation of transcription by MAP kinase cascades. Curr Opin Cell Biol 1996, 8(2):205-215. Brunn GJ, Hudson CC, Sekulic A, Williams JM, Hosoi H, Houghton PJ, Lawrence JC, Jr., Abraham RT: Phosphorylation of the translational repressor PHAS-I by the mammalian target of rapamycin. Science 1997, 277(5322):99-101. Watson MH, Venance SL, Pang SC, Mak AS: Smooth muscle cell proliferation. Expression and kinase activities of p34cdc2 and mitogen-activated protein kinase homologues. Circ Res 1993, 73(1):109-117. Hibi M, Lin A, Smeal T, Minden A, Karin M: Identification of an oncoprotein- and UVresponsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain. Genes Dev 1993, 7(11):2135-2148. Force T, Pombo CM, Avruch JA, Bonventre JV, Kyriakis JM: Stress-activated protein kinases in cardiovascular disease. Circ Res 1996, 78(6):947-953. Karin M: The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. J Biol Chem 1995, 270(28):16483-16486.
67
81. 82. 83. 84.
85.
86. 87. 88. 89. 90. 91.
92. 93.
94. 95. 96.
97.
98. 99.
Matsubara H, Inada M: Molecular insights into angiotensin II type 1 and type 2 receptors: expression, signaling and physiological function and clinical application of its antagonists. Endocr J 1998, 45(2):137-150. Logan SK, Falasca M, Hu P, Schlessinger J: Phosphatidylinositol 3-kinase mediates epidermal growth factor-induced activation of the c-Jun N-terminal kinase signaling pathway. Mol Cell Biol 1997, 17(10):5784-5790. Minden A, Lin A, McMahon M, Lange-Carter C, Derijard B, Davis RJ, Johnson GL, Karin M: Differential activation of ERK and JNK mitogen-activated protein kinases by Raf-1 and MEKK. Science 1994, 266(5191):1719-1723. Morooka H, Bonventre JV, Pombo CM, Kyriakis JM, Force T: Ischemia and reperfusion enhance ATF-2 and c-Jun binding to cAMP response elements and to an AP-1 binding site from the c-jun promoter. J Biol Chem 1995, 270(50):3008430092. Murasawa S, Matsubara H, Mori Y, Masaki H, Tsutsumi Y, Shibasaki Y, Kitabayashi I, Tanaka Y, Fujiyama S, Koyama Y et al: Angiotensin II initiates tyrosine kinase Pyk2dependent signalings leading to activation of Rac1-mediated c-Jun NH2-terminal kinase. J Biol Chem 2000, 275(35):26856-26863. Manser E, Leung T, Salihuddin H, Zhao ZS, Lim L: A brain serine/threonine protein kinase activated by Cdc42 and Rac1. Nature 1994, 367(6458):40-46. Ip YT, Davis RJ: Signal transduction by the c-Jun N-terminal kinase (JNK)--from inflammation to development. Curr Opin Cell Biol 1998, 10(2):205-219. Zarubin T, Han J: Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway. Cell Res 2005, 15(1):11-18. Berk BC, Corson MA: Angiotensin II signal transduction in vascular smooth muscle: role of tyrosine kinases. Circ Res 1997, 80(5):607-616. Marrero MB, Schieffer B, Paxton WG, Heerdt L, Berk BC, Delafontaine P, Bernstein KE: Direct stimulation of Jak/STAT pathway by the angiotensin II AT1 receptor. Nature 1995, 375(6528):247-250. Marrero MB, Schieffer B, Paxton WG, Schieffer E, Bernstein KE: Electroporation of pp60c-src antibodies inhibits the angiotensin II activation of phospholipase Cgamma 1 in rat aortic smooth muscle cells. J Biol Chem 1995, 270(26):1573415738. Darnell JE, Jr., Kerr IM, Stark GR: Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins. Science 1994, 264(5164):1415-1421. Bhat GJ, Thekkumkara TJ, Thomas WG, Conrad KM, Baker KM: Angiotensin II stimulates sis-inducing factor-like DNA binding activity. Evidence that the AT1A receptor activates transcription factor-Stat91 and/or a related protein. J Biol Chem 1994, 269(50):31443-31449. Howe A, Aplin AE, Alahari SK, Juliano RL: Integrin signaling and cell growth control. Curr Opin Cell Biol 1998, 10(2):220-231. Guan JL: Role of focal adhesion kinase in integrin signaling. Int J Biochem Cell Biol 1997, 29(8-9):1085-1096. Polte TR, Naftilan AJ, Hanks SK: Focal adhesion kinase is abundant in developing blood vessels and elevation of its phosphotyrosine content in vascular smooth muscle cells is a rapid response to angiotensin II. J Cell Biochem 1994, 55(1):106119. Brinson AE, Harding T, Diliberto PA, He Y, Li X, Hunter D, Herman B, Earp HS, Graves LM: Regulation of a calcium-dependent tyrosine kinase in vascular smooth muscle cells by angiotensin II and platelet-derived growth factor. Dependence on calcium and the actin cytoskeleton. J Biol Chem 1998, 273(3):1711-1718. Eguchi S, Inagami T: Signal transduction of angiotensin II type 1 receptor through receptor tyrosine kinase. Regul Pept 2000, 91(1-3):13-20. Eguchi S, Iwasaki H, Ueno H, Frank GD, Motley ED, Eguchi K, Marumo F, Hirata Y, Inagami T: Intracellular signaling of angiotensin II-induced p70 S6 kinase phosphorylation at Ser(411) in vascular smooth muscle cells. Possible requirement of epidermal growth factor receptor, Ras, extracellular signalregulated kinase, and Akt. J Biol Chem 1999, 274(52):36843-36851.
68
100. 101. 102. 103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110. 111. 112. 113. 114. 115. 116. 117. 118. 119. 120. 121. 122.
Linseman DA, Benjamin CW, Jones DA: Convergence of angiotensin II and plateletderived growth factor receptor signaling cascades in vascular smooth muscle cells. J Biol Chem 1995, 270(21):12563-12568. Cary LA, Han DC, Polte TR, Hanks SK, Guan JL: Identification of p130Cas as a mediator of focal adhesion kinase-promoted cell migration. J Cell Biol 1998, 140(1):211-221. Rozengurt E: Convergent signalling in the action of integrins, neuropeptides, growth factors and oncogenes. Cancer Surv 1995, 24:81-96. Sayeski PP, Ali MS, Harp JB, Marrero MB, Bernstein KE: Phosphorylation of p130Cas by angiotensin II is dependent on c-Src, intracellular Ca2+, and protein kinase C. Circ Res 1998, 82(12):1279-1288. Leevers SJ, Vanhaesebroeck B, Waterfield MD: Signalling through phosphoinositide 3-kinases: the lipids take centre stage. Curr Opin Cell Biol 1999, 11(2):219-225. Wymann MP, Pirola L: Structure and function of phosphoinositide 3-kinases. Biochim Biophys Acta 1998, 1436(1-2):127-150. Saward L, Zahradka P: Angiotensin II activates phosphatidylinositol 3-kinase in vascular smooth muscle cells. Circ Res 1997, 81(2):249-257. Reiss K, Capasso JM, Huang HE, Meggs LG, Li P, Anversa P: ANG II receptors, cmyc, and c-jun in myocytes after myocardial infarction and ventricular failure. Am J Physiol 1993, 264(3 Pt 2):H760-769. Rosenberg ME, Hostetter TH: Effect of angiotensin II and norepinephrine on early growth response genes in the rat kidney. Kidney Int 1993, 43(3):601-609. Herrera RE, Nordheim A, Stewart AF: Chromatin structure analysis of the human cfos promoter reveals a centrally positioned nucleosome. Chromosoma 1997, 106(5):284-292. Hyder SM, Stancel GM, Nawaz Z, McDonnell DP, Loose-Mitchell DS: Identification of an estrogen response element in the 3'-flanking region of the murine c-fos protooncogene. J Biol Chem 1992, 267(25):18047-18054. Wagner BJ, Hayes TE, Hoban CJ, Cochran BH: The SIF binding element confers sis/PDGF inducibility onto the c-fos promoter. Embo J 1990, 9(13):4477-4484. Treisman R: Ternary complex factors: growth factor regulated transcriptional activators. Curr Opin Genet Dev 1994, 4(1):96-101. Hill CS, Treisman R: Differential activation of c-fos promoter elements by serum, lysophosphatidic acid, G proteins and polypeptide growth factors. Embo J 1995, 14(20):5037-5047. Chen C, Okayama H: High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol 1987, 7(8):2745-2752. Alam J, Cook JL: Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription. Anal Biochem 1990, 188(2):245-254. Borras T, Peterson CA, Piatigorsky J: Evidence for positive and negative regulation in the promoter of the chicken delta 1-crystallin gene. Dev Biol 1988, 127(1):209219. Gould SJ, Subramani S: Firefly luciferase as a tool in molecular and cell biology. Anal Biochem 1988, 175(1):5-13. Kitamura M, Ishikawa Y: Functional inactivation of signalling molecules via transdominant negative mutants. Exp Nephrol 1997, 5(5):435-438. Bergeron D, Barbeau B, Leger C, Rassart E: Experimental bias in the evaluation of the cellular transient expression in DNA co-transfection experiments. Cell Mol Biol Res 1995, 41(3):155-159. Howcroft TK, Kirshner SL, Singer DS: Measure of transient transfection efficiency using beta-galactosidase protein. Anal Biochem 1997, 244(1):22-27. Thekkumkara TJ, Du J, Dostal DE, Motel TJ, Thomas WG, Baker KM: Stable expression of a functional rat angiotensin II (AT1A) receptor in CHO-K1 cells: rapid desensitization by angiotensin II. Mol Cell Biochem 1995, 146(1):79-89. Burns KD, Harris RC: Signaling and growth responses of LLC-PK1/Cl4 cells transfected with the rabbit AT1 ANG II receptor. Am J Physiol 1995, 268(4 Pt 1):C925-935.
69
123. 124. 125. 126. 127.
128. 129. 130. 131.
132. 133. 134. 135. 136. 137. 138. 139. 140. 141.
Andreka P, Zang J, Dougherty C, Slepak TI, Webster KA, Bishopric NH: Cytoprotection by Jun kinase during nitric oxide-induced cardiac myocyte apoptosis. Circ Res 2001, 88(3):305-312. Chang E, Goldberg H: Requirements for transforming growth factor-beta regulation of the pro-alpha 2(I) collagen and plasminogen activator inhibitor-1 promoters. J Biol Chem 1995, 270(9):4473-4477. Mucsi I, Goldberg HJ: Dominant-negative SMAD-3 interferes with transcriptional activation by multiple agonists. Biochem Biophys Res Commun 1997, 232(2):517521. Mucsi I, Skorecki KL, Goldberg HJ: Extracellular signal-regulated kinase and the small GTP-binding protein, Rac, contribute to the effects of transforming growth factor-beta1 on gene expression. J Biol Chem 1996, 271(28):16567-16572. Mukhopadhyay D, Knebelmann B, Cohen HT, Ananth S, Sukhatme VP: The von Hippel-Lindau tumor suppressor gene product interacts with Sp1 to repress vascular endothelial growth factor promoter activity. Mol Cell Biol 1997, 17(9):5629-5639. Ruiz-Ortega M, Egido J: Angiotensin II modulates cell growth-related events and synthesis of matrix proteins in renal interstitial fibroblasts. Kidney Int 1997, 52(6):1497-1510. Baudouin-Legros M, Paquet JL, Brunelle G, Meyer P: Role of nuclear protooncogenes in the proliferation of aortic smooth muscle cells in spontaneously hypertensive rats. J Hypertens Suppl 1989, 7(6):S114-115. Naftilan AJ, Pratt RE, Eldridge CS, Lin HL, Dzau VJ: Angiotensin II induces c-fos expression in smooth muscle via transcriptional control. Hypertension 1989, 13(6 Pt 2):706-711. Ge C, Anand-Srivastava MB: Involvement of phosphatidylinositol 3-kinase and mitogen-activated protein kinase pathways in AII-mediated enhanced expression of Gi proteins in vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun 1998, 251(2):570-575. Ueda Y, Hirai S, Osada S, Suzuki A, Mizuno K, Ohno S: Protein kinase C activates the MEK-ERK pathway in a manner independent of Ras and dependent on Raf. J Biol Chem 1996, 271(38):23512-23519. Alessi DR, Cuenda A, Cohen P, Dudley DT, Saltiel AR: PD 098059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo. J Biol Chem 1995, 270(46):27489-27494. Frost JA, Steen H, Shapiro P, Lewis T, Ahn N, Shaw PE, Cobb MH: Cross-cascade activation of ERKs and ternary complex factors by Rho family proteins. Embo J 1997, 16(21):6426-6438. Yin G, Yan C, Berk BC: Angiotensin II signaling pathways mediated by tyrosine kinases. Int J Biochem Cell Biol 2003, 35(6):780-783. Queen C, Stafford J: Fine mapping of an immunoglobulin gene activator. Mol Cell Biol 1984, 4(6):1042-1049. Widen SG, Papaconstantinou J: Liver-specific expression of the mouse alphafetoprotein gene is mediated by cis-acting DNA elements. Proc Natl Acad Sci U S A 1986, 83(21):8196-8200. Adam GI, Miller SJ, Ulleras E, Franklin GC: Cell-type-specific modulation of PDGF-B regulatory elements via viral enhancer competition: a caveat for the use of reference plasmids in transient transfection assays. Gene 1996, 178(1-2):25-29. Takeuchi K, Nakamura N, Cook NS, Pratt RE, Dzau VJ: Angiotensin II can regulate gene expression by the AP-1 binding sequence via a protein kinase C-dependent pathway. Biochem Biophys Res Commun 1990, 172(3):1189-1194. Bokoch GM, Vlahos CJ, Wang Y, Knaus UG, Traynor-Kaplan AE: Rac GTPase interacts specifically with phosphatidylinositol 3-kinase. Biochem J 1996, 315 ( Pt 3):775-779. Lopez-Ilasaca M, Crespo P, Pellici PG, Gutkind JS, Wetzker R: Linkage of G proteincoupled receptors to the MAPK signaling pathway through PI 3-kinase gamma. Science 1997, 275(5298):394-397.
70
142.
143. 144. 145. 146. 147. 148. 149. 150. 151. 152. 153.
Folli F, Kahn CR, Hansen H, Bouchie JL, Feener EP: Angiotensin II inhibits insulin signaling in aortic smooth muscle cells at multiple levels. A potential role for serine phosphorylation in insulin/angiotensin II crosstalk. J Clin Invest 1997, 100(9):2158-2169. Marais R, Light Y, Mason C, Paterson H, Olson MF, Marshall CJ: Requirement of RasGTP-Raf complexes for activation of Raf-1 by protein kinase C. Science 1998, 280(5360):109-112. Huang XC, Deng T, Sumners C: Angiotensin II stimulates activation of Fosregulating kinase and c-Jun NH2-terminal kinase in neuronal cultures from rat brain. Endocrinology 1998, 139(1):245-251. Dickens M, Rogers JS, Cavanagh J, Raitano A, Xia Z, Halpern JR, Greenberg ME, Sawyers CL, Davis RJ: A cytoplasmic inhibitor of the JNK signal transduction pathway. Science 1997, 277(5326):693-696. Coso OA, Chiariello M, Yu JC, Teramoto H, Crespo P, Xu N, Miki T, Gutkind JS: The small GTP-binding proteins Rac1 and Cdc42 regulate the activity of the JNK/SAPK signaling pathway. Cell 1995, 81(7):1137-1146. Minden A, Lin A, Claret FX, Abo A, Karin M: Selective activation of the JNK signaling cascade and c-Jun transcriptional activity by the small GTPases Rac and Cdc42Hs. Cell 1995, 81(7):1147-1157. Frost JA, Xu S, Hutchison MR, Marcus S, Cobb MH: Actions of Rho family small G proteins and p21-activated protein kinases on mitogen-activated protein kinase family members. Mol Cell Biol 1996, 16(7):3707-3713. Clark EA, King WG, Brugge JS, Symons M, Hynes RO: Integrin-mediated signals regulated by members of the rho family of GTPases. J Cell Biol 1998, 142(2):573586. Germain S, Bonnet F, Fuchs S, Philippe J, Corvol P, Pinet F: Dissection of silencer elements in first intron controlling the human renin gene. J Hypertens 1999, 17(7):899-905. Pan L, Xie Y, Black TA, Jones CA, Pruitt SC, Gross KW: An Abd-B class HOX.PBX recognition sequence is required for expression from the mouse Ren-1c gene. J Biol Chem 2001, 276(35):32489-32494. Muller MW, Todorov V, Kramer BK, Kurtz A: Angiotensin II inhibits renin gene transcription via the protein kinase C pathway. Pflugers Arch 2002, 444(4):499-505. Whitmarsh AJ, Yang SH, Su MS, Sharrocks AD, Davis RJ: Role of p38 and JNK mitogen-activated protein kinases in the activation of ternary complex factors. Mol Cell Biol 1997, 17(5):2360-2371.
71
