DOKTORI ÉRTEKEZÉS TÉZISEI
A MITOGÉN AKTIVÁLTA PROTEIN KINÁZ KASZKÁDOK SZEREPE AZ ANGIOTENZIN II INTRACELLULÁRIS JELÁTVITELÉBEN
Dr. Huszár Tamás
Témavezető: Dr. Rosivall László egyetemi tanár
Konzulens: Dr. Mucsi István Ph.D. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, 8.sz Ph.D. Program Budapest 2001.
1
1. BEVEZETÉS Ismert, hogy a renin-angiotenzin (RAS) rendszer kulcsfontosságú szerepet játszik a vérnyomás- és a szervezet só- vízháztartásának szabályozásában. Az utóbbi évek kutatásai során vált nyílvánvalóvá, hogy az angiotenzin II (Ang II) növekedési faktorként hatva befolyásolja a sejtek növekedését, osztódását valamint az extracelluláris mátrix (ECM) képződését. Mai ismereteink az Ang II növekedési faktor-szerű hatásait szerint főként AT1 receptoron keresztül fejti ki különböző intracelluláris fehérjék tirozin foszforilációjának fokozása-, a mitogén aktiválta protein kináz (MAPK) kaszkádok aktiválás-, illetve a sejtek növekedésében és osztódásában szerepet játszó ún. korai fehérjék (pl. c-fos, c-jun, c-myc, egr-1) transzkripciójának fokozása révén. E folyamatok kóros mértékű aktivációja szerepet játszik több kórfolyamat patogenezisében, is többek között az ateroszklerózis, szívhipertófia, glomeruloszklerózis, hipertenzió kialakulásában. Az Ang II bizonyos körülmények mellett antiproliferatív, apoptótikus hatássokkal is rendelkezik. Antiproliferatív hatását főként AT2 receptoron keresztül fejti ki, míg apoptótikus hatásában mind az AT1 mind az AT2 receptornak fontos szerepet tulajdonítanak. Az Ang II AT2 receptoron keresztül kiváltott antiproliferatív hatását részben a MAP-kinázok gátlásán keresztül fejti ki. Ang II fokozza az ECM felépítésében fontos szerepet játszó I és IV típusú kollagén, a fibronektin, a laminin, biglican molekulák termelődését. Az Ang II a mátrix fehérjék szintézisének fokozásán túl gátolja azok lebomlásának ütemét is a mátrix fehérjék lebontásában szerepet játszó plazmin nevű enzim aktivitásának gátlásával. A legújabb kutatások adatai szerint az Ang II növekedési faktor-szerű hatásait feltehetően más citokinekkel való kölcsönhatásokon keresztül fejti ki. Ezen kölcsönhatások közül a mai ismeretek alapján a legjelentősebb a TGFb-val való kölcsönhatása. A TGFb fiziológiás regulátor fehérjeként részt vesz a sejtproliferáció és -differenciálódás, az általános kötőszöveti reparáció, az ECM protein termelés, az angiogenezis és a különböző immunfolyamatok szabályozásában. Jelen ismereteink alapján e citokin a progresszív szöveti fibrózissal járó állapotok központi regulátora A TGFb és az Ang II kölcsönhatásának első bizonyítékaként Hahn és mtsai 1991-ben kimutatták, hogy vaszkuláris simaizomsejtekben Ang II hatására fokozódik a TGFb mRNS szintje. Ezután hasonló eredményekről számoltak be endothel sejtekben és szív eredetű fibroblasztokban. A jelenség hátterében valószínűleg a TGFb gén promóter szakaszán 2
található AP1 konszenzus szekvencia áll, mely régióhoz képes kötődni az Ang II stimulus hatására fokozottan expresszálódó c-Fos és c-Jun transzkripciós faktorok által alkotott ún. AP1 (Activating Protein-1) transzkripciós faktor. Az in vitro vizsgálatok eredményeit az in vivo kutatások is alátámasztották. Számos olyan betegség esetén, melyek kialakulásában a RAS szerepe bizonyított (diabéteszes nefropátia, glomeruloszklerózis, egyoldali uréter obstrukció) ACE inhibitorokkal vagy AT1 receptor blokkolókkal történő gátlás csökkentette a TGFb expresszió és a szöveti fibrózis mértékét. A kutatások eredményeként általánosan elfogadottá vált az a munkahipotézis, mely szerint az Ang II a TGFb-val kölcsönhatásban, hatásukat összehangolva fejtik ki. Az Ang II TGFb-án túl más citokinekkel is képes együttműködni. Ismert, hogy képes fokozni a PDGF (platelet derived growth factor) A- és B láncainak és a bFGF (basic fibroblast growth factor) transzkripcióját vaszkuláris simaizomsejtekben. Újabb kutatások beszámolnak arról, hogy vaszkuláris simizomsejtekben az Ang II képes közvetlenül aktiválni a tirozin kináz aktivitással rendelkező PDGF receptort és ezen keresztül a sejtproliferációban szerepet játszó intracelluláris MAP kináz kaszkádot. Ezen transzaktivációs mechanizmusok részleteiben még kevéssé ismertek és a pontos mechanizmus tisztázására még további vizsgálatok szükségesek. Az angiotenzin képződés helye alapján megkülönböztethetünk szisztémás (ún. klasszikus) és lokális (szöveti) renin-angiotenzin rendszert. A szisztémás RAS szabályozása nagyon összetett folyamat, melynek során az Ang II gátolja a renin expressziót a juxtaglomeruláris sejtekben vagy közvetlenül AT1 receptoron keresztül vagy indirekt úton, a vese hemodinamikájának megváltoztatásán keresztül. A lokális RAS szabályozása még kevéssé ismert folyamat, de több adat is arra utal, hogy eltér a szisztémás szabályozástól. Az Ang II több szövetben is képes fokozni a renin expressziót, mely fokozódás ACE gátlóval kivédhető. Szívizomszövetben a renin szintézis nemcsak Ang II kezelés hatására, hanem mechanikai nyújtással is fokozható. A renin expressziót vizsgáló kísérletek eredményei alapján feltételezik, hogy a szöveti fibrózissal járó kórfolyamatok kialakulásában jelentős szerepe van a szöveti RAS Ang II általi, kóros „feedback” mechanizmuson alapuló aktivációjának. Mai tudásunk szerint az Ang II főként heterotrimér G-fehérjéhez kötött AT1 receptor aktiváláson keresztül fejti ki hatásait a humán szervezetben. Az Ang II hatásainak intracelluláris jelátviteli folyamatai nagyon összetett, sokrétű rendszert alkotnak.
3
Az Ang II sejtproliferációt, sejtnövekedést fokozó hatását –hasonlóan más citokinekhez– főként foszforilációs kaszkádok aktiválásán keresztül fejti ki. Elfogadottá vált az a nézet, mely szerint az Ang II géntranszkripciót fokozó hatásának közvetítésében főszerepet játszanak a MAP-kináz jelátviteli kaszkádok. Az emlősökben ezidáig három különböző MAP kináz kaszkádot írtak le. A kaszkádokat a transzkripciós faktorokat közvetlenül foszforiláló effektor enzimjeik alapján nevezték el, így megkülönböztetünk: 1) Extracellular Signal Regulated Kinase (ERK1/ERK2 vagy p42/44 MAPK), 2) c-Jun NH2-Terminal Kinase/Stress Activated Protein Kinase (JNK/SAPK vagy p54 MAPK) és 3) p38 MAP kináz kaszkádokat mely kaszkádok más intracelluláris jelátviteli mechanizmusokkal együttműködve, azokkal mintegy információt közvetítő hálót alkotva szabályozzák a különböző növekedési faktorok illetve külső stresszhatások kiváltotta géntranszkripciót. A MAP kinázok olyan szerin/treonin protein kináz rendszerek, melyek citokin receptorok, receptor tirozin kinázok illetve a heterotrimér G-fehérjéhez kötött szerpentin receptorok által érzékelt extracelluláris jelek hatását közvetítik a sejtmagba Az enzimrendszer aktiválása hierarchikus felépítésű. A receptorhoz legközelebb elhelyezkedő tag a MAP kináz kináz kináz (MAPKKK), melynek aktiválását általában valamilyen Ras fehérje szupercsaládba tartozó GTP-áz aktivitással rendelkező G-fehérje végzi. A MAPKKK szerin foszforilálással aktiválja a kaszkád következő elemét a MAP kináz kinázt (MAPKK), ami ezután treonin/tirozin foszforilációval aktiválja az effektor MAP kinázt (MAPK). A MAPK bejut a sejtmagba és ott foszforiláció útján aktivál olyan fehérjéket (transzkripciós faktorokat) melyek képesek kötődni a DNS-hez, szabályozva a transzkripciós folyamatokat A MAP kinázok aktiválásában fontos szerepet játszanak a Ras szupercsaládba tartozó 21 kDa molekulatönegű GTP-áz fehérjék (Ras, Rho, Rac, Cdc42), ám a pontos mechanizmus nem ismert.
4
STIMULUS
RECEPTOR
- RECEPTOR TIROZIN KINÁZ - HETEROTRIMER GFEHÉRJÉHEZ KAPCSOLT RECEPTOR - CITOKIN RECEPTOR
G-FEHÉRJE, EXCHANGE FAKTOR
MAPKKKK
Rho, Rac-1, Cdc42, SOS, GEF
PAK
Ras
MAPKKK
MEKK1-5
MEKK1
Raf
MAPKK
SEK MKK4,7
MKK3,4,6
MEK1,2
MAPK
JNKSAPK
p38MAPK
ERK1,2
TRANSZKRIPCIÓS FAKTOR
c-jun, Elk1, ATF2 Sap1
ATF1,2 MAPKAPK1,2
c-fos, Elk1, c-myc,Ets1
GÉNEXPRESSZIÓ
A MAP kináz kaszkádok felépítésének és működésének fontosabb elemei Az Ang II AT1 receptorhoz kötött hatásai számos intracelluláris jelátviteli út közreműködésével alakulnak ki. Sok információval rendelkezünk a Ca2+ szignál-, a protein kináz C- (PKC) és a tirozin kinázok szerepéről az Ang II jelátvitelében. Ezen folymatok
5
bonyolult hálózatot alkotnak, számos átfedés fedezhető fel közöttük, és aktiválásuk valószínűleg szövetspecifikus módon történik.
2. HIPOTÉZISEK, CÉLKITŰZÉSEK A MAP kináz rendszerek Ang II jelátvitelében betöltött szerepének pontosabb megismerését célzó kísérleteinkben a következő hipotéziseket vizsgáltuk: 1. Az ERK és JNK szerepet játszik az Ang II által aktivált géntranszkripciós változásokban 2. Az Ang II Ras-Raf aktiváláson keresztül aktiválja az ERK-et 3. A GTP kötő p21Rac fehérje részt vesz az Ang II kiváltotta géntranszkripciós változások szabályozásában 4. A PI3-kináz részt vesz az Ang II kiváltotta géntranszkripciós változások szabályozásában 5. A PKC részt vesz az Ang II kiváltotta géntranszkripciós változások szabályozásában Kísérleteink folytatásaként az Ang II renin transzkripciót fokozó hatásának intracelluláris mechanizmusát kívántuk vizsgálni.. Az Ang II renin transzkripcióra gyakorolt hatásának jelátvitelére vonatkozóan a következő hipotéziseket vizsgáltuk: 1. Az ERK kaszkád és a JNK szerepet játszik az Ang II által aktivált géntranszkripciós változásokban 2. A GTP kötő p21Rac fehérje részt vesz az Ang II kiváltotta renin transzkripció aktiválásában 3. A PKC részt vesz az Ang II kiváltotta renin transzkripció aktiválásában 4. A tirozin kinázok részt vesznek az Ang II kiváltotta renin transzkripció aktiválásában Az Ang II jelátviteli mechanizmusait vizsgáló kísérleteink során meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az Ang II kezelés hatással van a kontrollként használt másodlagos riporter vektorok expressziójára, ami kérdésessé tette alkalmazhatóságukat. A felmerült probléma pontosabb körüljárására kísérleteket végeztünk, melyekben a következő feltételezésekre kerestünk választ: 1. Az Ang II AT1 receptoron keresztül fokozza a másodlagos riportergén transzkripcióját 2. Más agonisták is fokozhatják a másodlagos riporter gének transzkripcióját 3. A másodlagos riportergént vezérlő promóter meghatározó az agonista kiváltotta hatásban
6
4. A kotranszfektált plazmidok közötti interakciók is befolyásolják a másodlagos riportergének transzkripcióját
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Sejtek Kísérleteinkben patkány AT1A receptort stabilan expresszáló Chinese Hamster Ovarium valamint nyúl AT1 receptort szintén stabilan expresszáló disznó proximális tubulus (LLC-PK1) sejteket használtunk Tranziens transzfekció A sejteket kalcium foszfát precipitációs módszerrel transzfektáltunk. Szérummegvonás után a sejteket 21 órán keresztül agonistával vagy vehikulummal kezeltük majd lízis pufferbe kapartuk. A sejtlizátum luciferáz aktivitását illetve b-galaktozidáz aktivitását luminometriás eljárással mértük. Western blot A jelzett ideig, jelzett koncentrációjú Ang II-vel történt kezelést követően a sejteket lízis pufferbe kapartuk, majd a mintákat 2% merkaptoetanolt tartalmazó Laemmli pufferben 5 percig forraltuk. A mintákból 10 mg fehérjét tartalmazó mennyiséget SDS-poliakrilamid gélen futtattuk, majd nitrocellulóz membránra transzferáltuk. A membránt blokkoltuk amit megfelelő antitesttel történő inkubáció követett. Utolsó lépésként a blottot tormaperoxidázzal konjugált másodlagos antitesttel inkubáltuk, Az előhívást „enhanced chemiluminescense” (EC) oldattal végeztük. A blottokat scan-neltük és szemikvantitatíven kiértékeltük Scion 4.0.2 software segítségével. [125I-Sar1, Ile8]angiotenzin II - intakt sejt kötés mérése A radioligand vizsgálatokhoz a sejteket 24-lyukú lemezekre osztottuk. Az AT1 receptor expresszió mértékének meghatározásához mértük a jód izotóppal jelölt [125I-Sar1, Ile8]-angiotenzin
II
(0,05-01
mCi/minta)
ligand-receptor
kötés
számot
emelkedő
koncentrációjú, jelöletlen [Sar1, Ile8]-angiotenzin II hozzáadás mellett 6 órán keresztül, 4 °Con, 199 (HEPES) pufferben történő inkubáció után. Az inkubációt követően a sejteket lízis
7
pufferbe kapartuk és g-spektrometerrel mértük a sejtek radioaktivitását. A receptor expresszió szintet a Bradford szerint mért (Bio-Rad) teljes sejtfehérje koncentrációra normalizáltuk. A receptor expressziót jellemző leszorítási görbét Ligand számítógépes program segítségével analizáltuk one-site modelt használva.
4. AZ EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE A MAP kinázok szerepe a c-fos transzkripció angiotenzin II által kiváltott aktiválódásában Kísérleteinkben az Ang II kiváltotta c-fos transzkripció fokozódást az ERK gátló MAP kináz foszfatáz CL100 (MKP-1) overexpresszió, illetve a MEK gátló PD98059 szinte teljesen kivédte. Az eredmények alátámasztották azokat a kutatásokat, amik az Ang II ERK közvetítésével kiváltott c-fos promóter aktivációjáról számoltak be. Következő lépésben vizsgáltuk az Ang II által ERK aktivációhoz vezető mechanizmusokat. Domináns gátló (DN) mutáns változatok kotranszfektálásával gátoltuk az ERK aktivációban résztvevő Ras és Raf enzimeket, ami szinte teljes mértékben kivédte az Ang II c-fos promóterre gyakorolt hatását megerősítve azt az elképzelést, hogy az Ang II kiváltotta c-fos promóter transzkripció fokozódás Ras-Raf-ERK kaszkád függő módon megy végbe rendszerünkben is A PI3-kináz Ang II szignálban betöltött szerepének tisztázására wortmaninnal gátoltuk a PI3-kinázt. Kísérleteinkben a PI3-kináz gátlás nem védte ki az Ang II kiváltotta c-fos transzkripció fokozódást, ami megkérdőjelezi a PI3-kináz szerepét az Ang II kiváltotta ERK aktivációban az általunk használt modellben. Sok sejttípusban a PKC részt vesz mind a Ras-függő és a Ras-független ERK aktivációban. Az általunk végzett kísérletekben a PKC bisindolylmaleimiddel történt gátlása nem volt hatással az Ang II indukálta transzkripciós változásokra, ami arra utal, hogy a PKC az általunk tanulmányozott sejtekben nem vesz részt az Ang II kiváltotta c-fos promóter transzkripciójának aktiválásában. Eredményeinket magyarázhatja, hogy az ERK aktiváció módja sejtspecifikus, illetve lehetséges, hogy a bisindolylmaleimid nem gátolta az összes PKC izoformot, így nem lehet kizárni az esetleges PKCx aktivációt sem. A p21Rac1 gátlása DN mutáns formájának „overexpressziójával” T3CHO/AT1A sejtekben kivédte az Ang II kiváltotta c-fos transzkripciós fokozódást, ami arra utal, hogy a 8
Rac1 fehérje részt vesz az Ang II c-fos transzkripciót aktiváló jelátvitelében, és feltehetően az ERK aktivációban is. A Rac1 fehérje szerepének bizonyítása az Ang II jelátvitelében különösen érdekes eredmény, ugyanis korábban azt tartották, hogy a Rac1 a JNK aktivációban játszik szerepet és az ERK aktiválásban nem. Eredményünk magyarázható azokkal a megfigyelésekkel is, melyek beszámolnak a párhuzamos MAP kináz kaszkádok közötti „cross-talk” lehetőségéről. Ugyanakkor LLC-PK1 sejtekben a DNRac nem befolyásolta szignifikánsan az Ang II kiváltotta c-fos transzkripció fokozódást, ami igazolja azokat a megfigyeléseket, hogy azonos agonisták sejtfüggő módon aktiválják a különböző intracelluláris jelátviteli folyamatokat. A JNK gátlása nem védte ki az Ang II által kiváltott c-fos transzkripció fokozódást sem T3CHO/AT1A sem LLC-PK1 sejtekben, ami azt mutatja, hogy a JNK nem vesz részt az Ang II ezen c-fos-t aktiváló szignáljában. Ang II
GPCR
Gq
Rac1
PI3-kináz
Ras PKC Raf1
SAPK/JNK
MEK
ERK
c-fos transzkripció
Az Ang II által c-fos transzkripció fokozódáshoz vezető jelátviteli utak (eredményeink alapján) 9
A MAP kinázok szerepe a renin transzkripció angiotenzin II által kiváltott aktiválódásában Kísérleteinkben vese proximális tubulus sejtekben (illetve kontrollként T3CHO/AT1A sejtekben) vizsgáltuk az Ang II által aktivált, humán renin promóter transzfekció fokozódáshoz
vezető
jelátviteli
mechanizmusokat.
Bizonyítottuk,
hogy
bizonyos
körülmények között az Ang II fokozhatja a renin gén expresszióját. Kísérleteinkben mi is alátámasztottuk azokat az adatokat, melyek az Ang II renin expressziót fokozó képességéről számoltak be. Első lépésként a c-fos transzkripcióban bizonyítottan szerepet játszó ERK kaszkád szerepét vizsgáltuk a renin transzkripció szabályozásában. Nem várt módon azt tapasztaltuk, hogy sem a Ras sem a Raf vagy MEK illetve CL100 általi ERK gátlás nem befolyásolta az Ang II kiváltotta renin expresszió fokozódást. Ez arra engedett következtetni, hogy az ERK kaszkád nem vesz részt az Ang II renin transzkripció fokozásához vezető szignálban. A JNK gátlása JIP és DNJNK gátló fehérjék overexpressziójával szignifikánsan csökkentette az Ang II hatását a renin transzkripciót fokozó hatását. Ez a JNK szerepére utal az Ang II renin transzkripciót fokozó hatásában. A JNK aktivátorának tartott p21Rac1 fehérje gátlása DN mutáns változatának „overexpressziójával” nem befolyásolta az Ang II kiváltotta renin transzkripció fokozódását, ami azt sugallja, hogy az Ang II általi JNK aktiválódás a Rac1 fehérje nélkül történik rendszerünkben. A tirozin kinázok gátlása csökkentette az Ang II kiváltotta JNK aktiválódás mértékét, és kivédte az Ang II által aktivált renin transzkripció emelkedést. Ebből arra következtettünk, hogy az Ang II p21Rac1-től függetlenül, tirozin kinázok aktiválásán keresztül fokozza a JNK foszforilációját és ezen keresztül a renin transzkripciót. Az Ang II eme hatásában számos mechanizmus lehet felelős. Így a JNK- és a renin transzkripció aktivációja történhet receptor tirozin kinázok (EGF receptor, PDGF receptor) AT1 receptoron keresztüli transzaktivációjával vagy Src nem receptor tirozin kináz AT1 receptor általi aktivációján keresztül illetve a két mechanizmus együttes résztvételével. Kísérleteinkben a PKC aktivitás bisindolylmaleimiddel való gátlása nem befolyásolta az Ang II renin transzkripcióra gyakorolt hatását, ami arra utal, hogy hasonlóan a c-fos transzkripció regulációjához, a PKC valószínűleg nem tölt be szerepet a renin transzkripció Ang II általi szabályozásában.
10
Ang II
GPCR
Gq Rac1
Ras c-Src
PKC Raf1
MEK SAPK/JNK ERK
renin transzkripció Az Ang II által renin transzkripció fokozódáshoz vezető jelátviteli utak (eredményeink alapján)
A tranziens transzfekciók belső kontrolljaként használt másodlagos riporter palzmidok jelentősége A tranziens transzfekció belső standard plazmidokkal történő normalizálását olyan transzfekciós kísérletekben alkalmazták először, ahol különböző promóterek-vagy azonos promóterek különböző hosszúságú szakaszainak vagy mutáns formáinak aktivitását hasonlították össze. Az ilyen típusú kísérletekben a tranziens transzfekció hatékonyságának változása befolyásolja a mért riporter aktivitást, melyet úgy használnak fel, mint a vizsgált promóter aktivitását tükröző adatot. Ebből adódóan a transzfekciós hatékonyság ellenőrzése nagyon fontos az adatok reprodukálhatósága és összehasonlíthatósága szempontjából. Az Ang II géntranszkripcióra gyakorlolt hatásait vizsgáló kísérleteink kiértékelése során azt tapasztaltuk, hogy az általunk alkalmazott belső standard nem felelt meg a az
11
elvártaknak, az aktivitása nem volt független az agonista hatástól, azaz az Ang II fokozta a bgalaktozidáz aktivitást. További vizsgálatainkban kimutattuk, hogy agonista hatására (Ang II és szérum) hasonló aktivitás változás léphet fel aTKb-n kívül más, a kereskedelmi forgalomban kapható, és a transzfekciók belső kontrolljaként használt b-galaktozidáz plazmidok (RSVb, CMVb) esetén is. Eredményeink alapján feltételezzük, hogy a kotranszfektált plazmidok közötti kölcsönhatások szintén hatással vannak a riporter plazmidok aktivitására. Több elméleti lehetőség is van az említett interakciók magyarázatára: 1) A specifikus agonisták
által
aktivált
transzkripciós
faktorok
a
riporter
plazmidok
különböző
szekvenciáihoz kapcsolódhatnak, és plazmid függően különböző mértékű –nem várt– transzkripciót aktiválhatnak. 2) A teljes transzkripciós gépezet aktiválása még a minimal promóterek transzkripcióját is elindíthatja. 3) A transzkripciós faktorok másodlagos riporter plazmidok virális promóterei által történő „felhasználása” befolyásolhatja az elsődleges riporter plazmid alapaktivitását. 4) A plazmid-plazmid interakciók szintén befolyásolhatják a riporter génekbe klónozott promóterek aktivitását. Eredményeink alapján kijelenthetjük, hogy bizonyos körülmények között több, a transzfekciók hatékonyságának ellenőrzésére használt b-galaktozidáz plazmid nem felel meg az ideális belső standard követelményeinek, mivel aktivitásukat különböző agonisták képesek modulálni, így az eredmények feldolgozása során szisztematikus hibaforrást jelenthetnek lehet.
5. KÖVETKEZTETÉSEK Kísérleteinkkel alátámasztottuk azokat a megfigyeléseket, melyek szerint a c-fos promóter AT1 receptoron keresztül történő aktiválása –legalábbis részben– ERK függő folyamat, valamint az ERK stimulációja az általunk vizsgált rendszerben Ras-Raf-MEK kaszkád dependens folyamat, és független PKC-től és a PI3-kinázoktól. Elsőként mutattuk ki, hogy az Ang II fenti hatásainak kialakulásához intakt Rac1 fehérje szükséges. Eredményeink arra utalnak, hogy az ERK kaszkád és a Rac1 között létezik egy még nem ismert „cross-talk” mechanizmus. Igazoltuk, hogy tubuláris sejtekben az Ang II képes fokozni a renin transzkripciót, és ezen hatását tirozin kináz- és JNK aktiváción keresztül fejti ki. Az Ang II áltrali renin
12
promóter aktiváció –hasonlóan a c-fos aktivációhoz– független volt PKC-től és és a Ras-RafERK kaszkádtól. Rendszerünkben a JNK aktiváció független volt a p21Rac1 fehérjétől. A JNK aktiválásában feltételezhető a tirozin kinázok szabályozó szerepe. Az Ang II hatását vizsgáló kísérleteink során, mintegy mellékleletként tapasztaltuk, hogy a tranziens transzfekciók során általánosan alkalmazott belső standardra való normalizálás szisztematikus módon megváltoztatja eredményeinket. Vizsgálataink azt mutatták, hogy a tradícionálisan alkalmazott másodlagos riporter plazmidok transzkripciós aktivitását különböző agonisták megváltoztathatják, továbbá a különböző expressziós vektorok kotranszfekciója megváltoztathatja a belső standardként használt másodlagos riporter plazmidok expresszióját. Az eredményeinkből azt a következtetést vontuk le, hogy a másodlagos riporter plazmidok használata szisztematikus hibaforrás lehet azon tranziens transzfekciós kísérletek esetében, ahol valamilyen agonista transzkripcióra kifejtett hatását vagy az agonista jelátvitel folyamatát vizsgáljuk. Úgy gondoljuk, hogy a belső standard általános használata megkérdőjelezhető, és használatának szükségességét az adott kísérleti terv szabja meg.
13
A TÉMÁVAL KAPCSOLATOS SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
1. Huszár T, Mucsi I, Antus B, Terebessy T, Jeney Cs, Masszi A, Hunyadi L, Mihalik B, Goldberg HJ, Thekkumkara TJ, Rosivall L: Extracellular Signal Regulated Kinase (ERK) and p21Rac-1 are involved in the regulation of gene transcription by angiotensin II. Experimental Nephrology, 2001;9:142-149 2. Huszár T, Terebessy T, Masszi A, Adamkó S, Jeney Cs, Mucsi I, Rosivall L: The use of a second reporter plasmid as an internal standard to normalize luciferase activity in transient transfection experiments may lead to a systematic error. Journal of Biotechnology, 2001;88:251-258 3. Goldberg HJ, Huszár T, Mózes M, Mucsi I: Overexpression of the type II Transforming Growth Factor-b receptor inhibits fibroblast proliferation and activates Extracellular Signal Regulated Kinase and c-Jun N-Terminal Kinase. Cell Biology International (közlésre elfogadva) 4. Terebessy T, Rosivall L, Masszi A, Huszár T, Fintha A, Mucsi I.: Regulation of the human rennin promoter by angiotensin II in proximal tubular cell Kidney International (közlésre benyújtva)
A TÉMÁVAL KAPCSOLATOS KONGRESSZUSI SZEREPLÉSEK 1. T. Huszár, I. Mucsi, B. Antus, Cs Jeney, A. Masszi, L. Rosivall: Extracellular signal regulated kinase (ERK) and p21Rac-1 are involved in the regulation of gene transcription by angiotensin II. Journal of American Society of Nephrology 1998. 9:424A 2. I. Mucsi, T. Huszár, H. Goldberg: Involvement of c-jun N-terminal kinase in the treshold effects of the type II transforming growth factor-â receptor on fibroblast proliferation Journal of American of Society of Nephrology 1998. 9:427A 3. Huszár T, Antus B, Masszi A, Jeney Cs, Mucsi I, Rosivall L: A rac-1 és az erk fehérjék szerepet játszanak az angiotenzin II által kiváltott géntranszkripció szabályozásban. Magyar Élettani Társaság vándorgyûlése, Debrecen, 1998 4. Huszár T, Antus B, Jeney Cs, Masszi A, Mucsi I, Rosivall L: Az angiotenzin II intracelluláris jelátviteli mechanizmusainak vizsgálata. Magyar Nephrológiai Társaság Nagygyûlése, Debrecen, 1998 Hypertonia és Nephorologia S2 (3): 70 1998 5. Mucsi I, Huszár T, HJ Goldberg: A c-jun-NH2-terminal kináz (JNK) és a Smad3 fehérje részt vesz a Transforming Growth Factor-beta II-típusú receptor fokozott expressziója által kiváltott antiproliferatív hatás létrehozásában. Magyar Élettani Társaság Vándorgyülése, Debrecen, 1998
14
6. Mucsi I, Huszár T, HJ Goldberg: A c-jun-NH2-terminal kináz (JNK) és a Smad3 fehérje részt vesz a Transforming Growth Factor-beta II típusú receptor fokozott expressziója által kiváltott antiproliferatív hatás létrehozásában.. Magyar Nephrológiai Társaság Nagygyûlése, Budapest, 1998 Hypertonia és Nephrologia S2 (3): 74 1998 7. T Huszár, I Mucsi, B Antus, Cs Jeney, A Masszi, I Novák, T Terebessy, L Rosivall: Angiotensin II stimulates c-fos promoter activity via extracellular signal regulated kinase (ERK) independent of protein kinase C. International Congress of Nephrology 1999 (73) 8. I Mucsi, A Masszi, T Terebessy, T Huszár, A Fintha, S Adamko, L Buday, L Rosivall: The Adaptor Protein Nck Participates in the Intracellular Signaling Processes by Angiotensin II (AngII) Journal of the American Society of Nephrology. 2000;11:425A 9. Huszár T, Mucsi I, Antus B, Terebessy T, Masszi A, Jeney Cs, Rosivall L: Az angiotenzin II által kiváltott c-fos promoter transzkripció fokozódás protein kináz C-től függetlenül, extracelluláris szignál regulálta kináz (ERK) aktiváláson keresztül történik. Magyar Élettani Társaság Vándorgyűlése, Budapest 1999 10. T Terebessy, A Masszi, T Huszár, A Fintha, TJ Thekkumkara, S Adamkó, L Rosivall, I Mucsi: Regulation of the human renin promoter by angiotensin II (AII) MXXXVII congress of the European Renal Association and the European Kidney Research Associaion Nizza, 2000. 10. T. Terebessy, A. Masszi, T. Huszár, A. Fintha, T. Thekkumkara, S. Adamkó, L. Rosivall, I. Mucsi: Regulation of the human renin promoter by angiotensin II (AII) Magyar Nephrológiai Társaság Nagygyűlése Budapest 2000. 12. A Masszi, I. Mucsi, T. Terebessy, T. Huszár, A. Fintha, S. Adamkó, L. Buday, L. Rosivall: The Adaptor Protein Nck Participates in the Intracellular Signaling Processes by Angiotensin II (AngII) Magyar Nephrológiai Társaság Nagygyűlése Budapest 2000. 13. Terebessy T, Huszár T, Masszi A, Fintha A, Rosivall L, Mucsi I: ”Az angiotenzin (AngII) hatása a human renin promoterre” Magyar Élettani Társaság Vándorgyûlése Szeged 2001. 14. Terebessy T, Fintha A, Masszi A, Huszár T, Mucsi I, Rosivall L: ”C-Jun-N-Terminal Kinase (JNK) contributes to the regulation of the humen reni promoter by angiotensin II (AngII)” XXXVIII congress of the European Renal Association, Vienna, 2001
15
