PhD értekezés tézisei
A nitrogén monoxid és az angiotenzin II szerepe a submandibularis nyálmirigy véráramlásának szabályozásában
szerző:
dr. Vág János
Budapest 2002
1. HÁTTÉR A nyálmirigyek fő funkciója a nyál elválasztása. A szekréciót elsősorban a vegetatív idegrendszer szabályozza. Az idegek részben az acinus és a ductus sejteken, részben az ereken végződnek, tehát az autonóm idegrendszer nem csak a szekréciót, hanem a véráramlást is szabályozza.
A
véráramlás
jelentős
fokozódása
lényeges
eleme
a
nyálszekréció
fenntartásának. Emberben a maximálisan stimulált nyálmirigy 10 percenként képes a saját súlyának megfelelő mennyiségű nyálat elválasztani. Ekkora szekréciós ráta esetén fontos a tápanyag, az oxigén, az elektrolit és a víz megfelelő utánpótlása, ami a véráramlás útján történik. A nyálelválasztás és a nyálmirigyek véráramlásának szoros kapcsolatát mind állatokban,
mind
emberben
kimutatták.
Sjögren
szindrómában
szenvedő
betegek
nyálmirigyének vérellátását vizsgálva azt találták, hogy jelentősen eltér a normálistól. Feltételezhető, hogy más nyálmirigy betegségek hátterében is állhat a véráramlás nem megfelelő működése, különösen olyan esetben, ahol a nyálmirigy funkcionális zavara keringési betegséggel hozható összefüggésbe. Számos vizsgálat szerint összefüggés van a hypertonia és a hyposalivatio között. Ezért kísérleteinkben olyan, a keringésszabályozásban szerepet játszó rendszerek hatását tanulmányoztuk a submandibularis nyálmirigyben, amelyekről jelen ismereteink alapján feltételezhető, hogy a hypertonia kialakulásában jelentőségük van. Így munkánk során a renin-angiotenzin és a nitrogén monoxid (NO) rendszerekkel foglalkoztunk. Irodalmi adatok szerint az elégtelen NO termelés egyik tényezője lehet a hypertonia kialakulásának. A NO hiány a nyálmirigyben is érvényesülhet, és annak funkcionális zavarát okozhatja, mivel a NO-nak fontos és összetett szerepe van a nyálmirigy értónusának szabályozásában: Irodalmi adatok szerint a NO donor 3-morpholinosydnonimin intravénás adagolása nagymértékben csökkenti, a NO szintetázt (NOS) gátló NG-nitro-L-arginin pedig növeli a nyálmirigyek nyugalmi érellenállását macskában. A NO részt vesz a nyálmirigyhez futó idegek ingerlésekor tapasztalt véráramlás fokozódás közvetítésében is. A véráramlás növekedése figyelhető meg paraszimpatikus ingerlés esetén, részben kolinerg, részben nem kolinerg (atropin rezisztens) mediáción keresztül. Az atropin rezisztens vasodilatatiót a vasoactiv intestinalis polypeptid (VIP) és bradykinin közvetíti. Újabb vizsgálatok szerint a VIP hatásáért – legalábbis vadászmenyétben, macskában, patkányban és disznóban – a NO felszabadulása a felelős. A bradykinin hatás közvetítésben ugyancsak a NO-nak ill. a prostaglandin E2-nek tulajdonítanak szerepet. A szimpatikus idegek megfelelő erősségű és intermittáló ingerlése esetén a kezdeti vasoconstrictiót tartós vasodilatatio és véráramlás 1
fokozódás követi. A vasoconstrictiót az α-adrenerg (és a neuropeptid Y), a vasodilatatiót a βadrenerg receptorok közvetítik. Ugyanakkor szimpatikus ingerléskor is megfigyelhető egy β blokkoló rezisztens dilatáció, amelyért patkányban és macskában ugyancsak a NO-t teszik felelőssé. A hypertonia és hyposalivatio összefüggésének másik lehetséges mechanizmusa, hogy a magas keringő angiotenzin II (Ang II) plazmaszint a nyálmirigyekben értónus fokozódást okozva csökkenti a nyálszekréciót. Emberben és macskában végzett vizsgálatok szerint a keringő Ang II hatásának blokkolása – angiotenzin konvertáz enzim (ACE) inhibitorral – fokozza a nyálelválasztást, de nem tudjuk, hogy ez az értónus csökkenés következménye-e. Patkány SMG-ben az Ang II receptorok jelenlétére utal, hogy jelentős véráramlás csökkenés figyelhető meg Ang II lokális intraarteriális infúziójakor. Ugyankkor nem ismert, hogy van-e szerepe az endogén Ang II-nek a nyálmirigyek véráramlásának szabályozásában. A reninangiotenzin rendszert leggyakrabban két módszer egyikével vizsgálják. Az egyik lehetőség, hogy gátló szer alkalmazásával vagy az Ang II-t előállító enzimet (ACE), vagy az Ang II receptorait blokkoljuk. A renin-angiotenzin rendszer vizsgálatának másik lehetősége, hogy a szervezet Na+ bevitelét (továbbiakban sóbevitel) változtatjuk, miután a szervezet sófelvételének a megváltozása a renin termelés megváltozását eredményezi. Az Ang II és a NO között számos kapcsolatot fedeztek fel. A vesében az NO feltehetően hozzájárul a vasocontstrictor hatás közvetítéséért felelős, az Ang II 1-es típusú receptorának (AT1) blokkolásakor kialakuló vasodilatatióhoz és egyre inkább a NO-nak is szerepet tulajdonítnak a szervezet sótöbbletének eltávolításában. A hypertonia mellett az arteria carotis communis szűkülete ill. elzáródása miatt kialakuló ischaemiának is súlyos következményei lehetnek a fej-nyak képletek vérkeringésében. Kísérleteinkben ezért tanulmányoztuk az arteria carotis communis kísérletes leszorítással kiváltott okklúziójának hatását a leszorítástól distalisan mérhető perfúziós nyomására és a nyálmirigyek véráramlására patkányban. Feltételeztük, hogy a leszorításkor a fej-nyak szervekben
(pl.
nyálmirigyek)
csökken
a
perfúziós
nyomás,
ami
vasodilatator
mechanizmusokat – pl. NO felszabadulást – aktivál. Ezért kísérleteinket olyan állatokon is elvégeztük, amelyekben előzetesen a NOS blokkoltuk.
2
2. CÉLKITŰZÉSEK Munkánk során a következő kérdésekre kívántunk választ kapni: Mi a szerepe az angiotenzin II-nek és a nitrogén monoxidnak a submandibularis nyálmirigy (SMG) véráramlásának szabályozásában? Változik-e a NO függő értónus az AT1 receptorok blokkolása esetén az SMG-ben? Befolyásolja-e a szervezet Na+(só-)bevitelének a változása az SMG vérkeringését? A vérkeringési változásokban – ha van ilyen – van-e szerepe a NO-nak? Hogyan változnak a szisztémás vérkeringési paraméterek (vérnyomás, perctérfogat, teljes perifériás ellenállás, szívfrekvencia) az alkalmazott kezelések (AT1 receptorok blokkolása, NO szintézis blokkolása, sóbevitel változása) esetén? Van-e szerepe a NO-nak az SMG véráramlásának fenntartásában lokálisan csökkent perfúziós nyomás (arteria carotis communis elzáródása) esetén? A kísérleteinkben alkalmazott két véráramlás mérőmódszerrel – a Rb akkumulációs technikával és a lézer Doppler áramlásméréssel – mért értékek korrelálnak-e? 3. MÓDSZEREK Kísérleteinket altatott nőstény Wistar patkányokon végeztük. Kezelések: Az Ang II hatásának vizsgálatára az Ang II vasoconstrictor hatásának közvetítéséért felelős AT1 receptorokat candesartan (iv. 0,5 mg/kg) adásával gátoltuk. Mivel a NO féléletideje igen rövid (3-5 s) ezért kísérleteinkben úgy tanulmányoztuk a NO szerepét, hogy annak szintézisét N###-nitro-L-arginin-metilészter (L-NAME) alkalmazásával blokkoltuk. Az L-NAME-t akuttan (10 mg/kg iv. bolus vagy 10 mg/kg
3
bolus + 5 mg/kg/15min iv. infúzió) vagy szubkrónikussan (az állatok ivóvízében feloldva kb. napi 10 mg/kg 4 napon keresztül) adagoltuk. A szív szimpatikus denerválására a β1-adrenerg receptorokat metoprolollal (iv. 15 mg/kg) blokkoltuk. A szív paraszimpatikus denerválására kétoldali vagotomiát alkalmaztunk. Az alacsony sófelvételt 4 héten át tartó búza etetéssel és desztillált víz itatással hoztuk létre. A sóterhelés kiváltásához az állatok standard táp mellett fiziológiás sóoldatot ittak 4 hétig. Mért ill. számított vérkeringési paraméterek: Artériás vérnyomás (elektromanométerrel az artéria carotis communisban vagy az a. femoralisban), SMG perfúziós vérnyomása (elektromanométerrel az artéria carotis communisba helyezett T-kanül segítségével) Szívfrekvencia (EKG, pulzus görbe) Perctérfogat (Stewart-Hamilton elv, 86-Rb izotóppal) SMG véráramlása, perctérfogat frakciója (Sapirstein elv, 86-Rb izotóppal) SMG véráramlása lézer Doppler áramlásmérővel Teljes perifériás ellenállás (TPR) SMG érellenállása Kísérleteinkben az SMG véráramlásának meghatározására két módszert alkalmaztunk: a 86-Rubidium akkumulációs technikát (Rb módszer) és a lézer Doppler áramlásmérést. A Rb módszer igen nagy előnye, hogy alkalmazásával jól meghatározható az SMG nutritív keringése abszolút értékben kifejezve (pl. ml/perc), ugyanakkor hátránya, hogy egy állatban egyetlen szövet/szerv mintára csak egyetlen véráramlás érték nyerhető, azaz nem alkalmas önkontrolos vizsgálatok elvégzésére. A lézer Doppler áramlásmérés előnye, hogy kevesebb invazív beavatkozásra van szükség, mint a Rb módszernél és folyamatos mérésre ad lehetőséget. Hátránya, hogy az optikai viszonyok különbözősége miatt a mért értékek nagyon eltérnek az egyedek és azon belül a különböző szövetek között, ezért használata során a véráramlást relatív egységben kifejezve adja meg, amelynek univerzális – minden szövetre és vizsgálati körülményre kiterjedő – kalibrációja abszolút értékre nem lehetséges. Kísérleteink során mindig az alkalmazott kezelés szempontjából optimális véráramlásmérő módszert alkalmaztuk. 4
4. EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK Kísérleteink szerint a két módszerrel kontroll körülmények között mért SMG véráramlás értékek között pozitív korreláció van. A lézer Doppler áramlásmérővel mért értékek függetlenek a mérőfej elhelyezkedésétől a mirigy felszínén. A lézer Doppler áramlásmérés tehát alkalmas módszer a patkány SMG vérkeringésének tanulmányozására. Vizsgálataink alátámasztják a NO jelentősségét a nyálmirigyek nyugalmi értónusának szabályozásában, hiszen a NOS gátló L-NAME – akár akut, akár szubkrónikus – adása után a vérnyomás emelkedése mellett az SMG véráramlása csökkent, az érellenállás növekedett. Eredményeink szerint az L-NAME vérnyomást fokozó hatásának hátterében a TPR növekedése áll. NOS blokád esetén a vérnyomás emelkedés mellett perctérfogat csökkenést tapasztaltunk. A perctérfogat csökkenés egyik lehetséges oka a szívfrekvencia csökkenése, ezért megvizsgáltuk az L-NAME egyszeri intravénás adagjának hatását a szívfrekvenciára. Az L-NAME beadása után a gyors vérnyomás emelkedést a szívfrekvencia csökkenése követte, ami a baroreceptor reflex aktiválódására utal. Vagotomizált állatokon mind a vérnyomás emelkedés, mind a bradycardia ugyanolyan mértékű volt, mint a nem-vagotomizált állatokban. Ezzel ellentétben metoprolol kezelés után az L-NAME okozta vérnyomás fokozódást nem követte bardycardia. Ebből arra következtethetünk, hogy az L-NAME hatására kialakuló bradycardia nem a vérnyomás emelkedés következtében reflexesen fokozódó vagus tónussal, hanem inkább a szív szimpatikus “tónusának” csökkenésével magyarázható. Irodalmi adatok szerint a szív szimpatikus innervációjának és a katekolamin release sebészi megszüntetésének hatására az L-NAME provokálta bradycardia csökken, de nem szűnik meg. Ezen adatok és saját eredményeink alapján feltételezhető, hogy az L-NAME-nak esetleg direkt gátló hatása van a szív β-receptoraira. Nem tudtunk választ adni ugyanakkor arra a kérdésre, hogy a vérnyomás kontroll szintre történő visszaállása után a szívfrekvencia miért marad tartósan alacsony. Candesartan csökkentette az SMG érellenállását, azaz az AT1 receptor blokád után az SMG-ben jelentős vasodilatatio jön létre. Úgy tűnik tehát, hogy a vérplazmában keringő Ang II fontos szerepet játszik – legalábbis altatott patkányokban – az SMG értónusának fenntartásában. A candesartan adagolása esetén megfigyelt értónus csökkenés döntően a vasoconstrictor AT1 receptorok kikapcsolása miatt következik be. Újabb vizsgálatok szerint 5
azonban a vasodilatatio részben a bradykinin szint fokozódásával magyarázható. A keringő Ang II – az AT1 receptorok gátlása miatt – az AT2 receptorokhoz kötődik, ez beindítja a bradykinin termelődést, ami a vasodilatator NO felszabadulását okozza. Kísérleteinkben jelentősen fokozódott a NO szintézist gátló L-NAME nyálmirigy érellenállását növelő hatása candesartan előkezelést követően, ami arra utal, hogy ez a mechanizmus az SMG-ben is megtalálható. Kísérleteinkben az AT1 receptor blokkoló candesartan dózisfüggő vérnyomás csökkenést okozott. A vérnyomás csökkenést elsősorban a teljes perifériás ellenállás csökkenése okozta. Ez a keringő Ang II vasoconstrictor hatásnak kikapcsolása miatt (AT1 receptor blokád) és az AT2 receptorok mediálta bradykinin-NO rendszer aktiválódásának hatására következik be. Kísérleteinkben a sóterhelt állatokban az SMG érellenállása csökkent, perctérfogat frakciója nőtt, miközben a vérnyomás is fokozódott. A csökkent sóbevitel ugyanakkor nem befolyásolta jelentősen sem a vérnyomást, sem az SMG véráramlását. A sóterhelt csoportban a magasabb vérnyomást a perctérfogat és nem a TPR emelkedett mértéke okozta. A perctérfogat növekedésének mechanizmusa nem ismert pontosan. Feltehetően a többlet sót (Na+) egyes állatok veséje nem képes megfelelően kiválasztani és ez folyadék retenciót és a vértérfogat emelkedését okozza. A Na+ kiválasztásban jelentős tényező a vese véráramlásának fokozódása. Az irodalmi adatok alapján úgy tűnik, hogy ennek hátterében a sóterhelés hatására fokozódó NO termelés áll. Kísérleteinkben a NOS blokád érellenállás növelő hatása ugyanakkora volt az összes sódiétán tartott állatban. Ez arra utal, hogy az SMG-ben a sóterhelés hatására nem fokozódik a NO felszabadulás és így a NO nem okozhatja a sóterheléskor megfigyelhető mirigy véráramlás növekedést. Ugyanakkor tudjuk, hogy az SMG erei a keringő Ang II-vel szemben fokozottan érzékenyek, hiszen kísérleteinkben az AT1 receptor blokád jelentős vasodilatatiót okozott. Ismert az is, hogy a sóterhelés következtében csökken a renin-angiotenzin szint a vérplazmában. Így elképzelhető, hogy a sóterhelés következtében csökkenő Ang II plazmaszint okozza a vasodilatatiót az SMG-ben. A féloldali arteria carotis communis lekötésének/leszorításának hatására az azonos oldali SMG véráramlása 16 %-kal csökkent, míg az ellenoldali SMG véráramlása nem változott. Ha figyelembe vesszük azt a tényt, hogy az SMG-t az arteria facialis nyálmirigyhez futó ága táplálja vérrel, és az arteria facialis az arteria carotis externán keresztül az arteria carotis communisból kapja a vért, akkor meglepő a csökkenés csekély mértéke. Ugyanakkor jól ismert, hogy a fej-nyak régióban az artériás hálózatban igen sok anasztomózis létezik. 6
Eredményeink szerint ezek az anasztomózisok jól helyettesítik a fej-nyak képleteket ellátó 2 pár főér (artéria vertebralis és carotis communis) egyikének a kiesését. Feltételeztük azt is, hogy az SMG véráramlásának fenntartásában a carotis leszorítás alatt nem csak az anasztomózis rendszereknek van szerepük, hanem vasodilatator anyagok felszabadulásának is (autoregulációs mechanizmusok). A perfúziós vérnyomás segítségével kiszámított SMG érellenállás 40 %-os csökkenést mutatott. Ez a tény arra utal, hogy az SMG olyan autoregulációs kapacitással rendelkezik, amely jól kompenzálja a leszorítás során a perfúziós nyomás csökkenése miatt kialakuló véráramlás csökkenést. Az L-NAME-val kezelt állatokon végzett vizsgálatokban a leszorítás alatti érellenállás csökkenés mértéke jelentősen mérséklődött. Ezek szerint a NO vasodilatator hatása nem járul hozzá a véráramlás fenntartáshoz csökkent perfúzió esetén az SMG-ben. 5. MEGÁLLAPÍTÁSOK ÖSSZEFOGLALÁSA Az endogén Ang II-nek és a NO jelentős szerepe van az SMG bazális értónusának fenntartásban. A NO szerepe/hatása az SMG értónusának beállításában nő az AT1 receptorok blokkolását követően. A szervezet sófelvételének fokozása növeli az SMG véráramlását. A véráramlás fokozódásában az NO nem vesz részt. A NO-nak nincs szerepe a féloldali a. carotis communis elzáródását követően az SMGben fellépő vasodilatatióban. A NOS blokkoló L-NAME hatására bekövetkezett vérnyomás emelkedés a TPR fokozódás következménye. A pertérfogat csökkenésének oka részben a bradycardia, ami a szimpatikus tónus β receptorokon keresztüli csökkenése miatt jön létre.
7
6. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN Vág J, Hably Cs, Csabai Zs, Hilda T, Bartha J, Fazekas Á: Blood flow of the submandibular gland in sodium-depleted and loaded rats: effect of nitric oxide synthase inhibition. Research in Experimental Medicine 198: 101-108, 1998.
IF:
0,400 Vág J, Hably Cs, Fazekas Á, Bartha J: Blood flow of the right and left submandibular gland during unilateral carotid artery occlusion in rat: role of nitric oxide. Acta Physiologica Hungarica 86/2: 139-145, 1999. Vág J, Hably Cs, Kerémi B, Kovács E, Bartha J, Fazekas Á: Role of nitric oxide in the regulation of blood flow in the rat submandibular gland during carotid artery occlusion. Archives of Oral Biolology 46/3: 261-267, 2001.
IF: 0,845*
Vág J, Hably Cs, Bartha J: Inhibition of beta-1 receptor but not vagotomy can abolish the L-NAME evoked bradycardia in anaesthetized rat. Physiological Research (2002/3 közlésre elfogadva)
IF: 1,366*
Vág J, Kerémi B, Hably Cs, Bartha J, Fazekas Á: Angiotensin II type 1 (AT1) receptor blockade enhances the L-NAME induced vasoconstriction in rat submandibular gland. Experimental Physiology (2002/873 nyomdában).
IF: 1,057*
*2000. évi impact factor 7. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK MÁS TÉMÁBAN Bartha J, Vág J, Hably Cs: Intrarenal distribution of renal blood flow after acute and chronic administration of nitric oxide-synthase inhibitor. Acta Physiologica Hungarica. 83: 403-410, 1995. Hably Cs, Vág J, Bartha J: Nitric oxide synthase inhibition increase vascular resistance in sodium and water loaded rats. Research in Experimental Medicine 198: 145-156, 1998. IF: 0,400 Csempesz F, Vág J, Kerémi B, Györfi A, Fazekas Á: A szájüregi képletek keringésének vizsgálata lézer Doppler-áramlásmérõvel humán egyedekben. Fogorvosi Szemle 93: 115120, 2000.
8
Kerémi B, Csempesz F, Vág J, Györfi A, Fazekas Á: A marginális gingiva véráramlásának vizsgálata lézer Doppler-áramlásmérõvel. Fogorvosi Szemle 93: 163-168, 2000. /a Vág J, Fazekas Á: A koronaszél kialakításának hatása a marginális parodontiumra (esetismertetés). Fogorvosi Szemle 93: 35-44, 2000. /b Vág J, Fazekas Á: Influence of restorative manipulations on the blood perfusion of human marginal gingiva as measured by laser Doppler flowmetry. Journal of Oral Rehabilitation 29: 58-63, 2002.
IF: 0,565*
a/ Fazekas Á, Csabai Zs, Csempesz F, Vág J: Az ínybarázda feltárására használt anyagok hatása a marginális gingiva vérkeringésére. Fogorvosi Szemle 93: 289-296, 2000. /b Fazekas Á, Csabai Zs, Csempesz F, Vág J: Effects of Pre-Soaked Retraction Cords on the Microcirculation of the Human Gingival Margin Operative Dentistry
(elfogadva)
IF: 1,411* Hably Cs, Vág J, Tost H, Csabai Zs, Bartha J: Intrarenal distribution of blood flow in sodium depleted and sodium loaded rats: role of nitric oxide. Kidney and Blood Pressure Research 24: 166-175, 2001.
IF: 1,378*
Hably Cs, Vág J, Bartha J: Comparative studies of resting and active skeletal muscle in anaesthetised rats: role of nitric oxide. Acta Physiologica Hungarica 88: 25-33, 2001. Csempesz F, Vág J, Fazekas Á: In vitro kinetic study of absorbency of retraction cords. Prosthetic Dentistry (accepted for publication) IF: 0,787*
* 2000. évi impact factor
9
