APLIKASI METODE MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION UNTUK IDENTIFIKASI MUTASI PROMOTER inhA, GEN inhA DAN GEN katG PADA ISOLAT MULTIDRUG RESISTANCE Mycobacterium tuberculosis
Skripsi
LUH KETUT BUDI MAITRIANI 1108505022
JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA 2015
i
ii
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, Ida Sang Hyang Widhi Wasa, karena berkat rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan Skripsi yang berjudul “APLIKASI METODE MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION UNTUK IDENTIFIKASI MUTASI PROMOTER inhA, GEN inhA DAN GEN katG PADA ISOLAT MULTIDRUG RESISTANCE Mycobacterium tuberculosis”. Skripsi ini diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar sarjana farmasi (S.Farm.) di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. Penulisan Skripsi ini tentunya tidak terlepas dari dukungan dan bantuan berbagai pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih kepada: 1.
Tuhan Yang Maha Esa atas segala kekuatan yang diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan Skripsi ini.
2.
Ir. A. A. Gde Raka Dalem, M.Sc (Hons), selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.
3.
Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt., selaku Ketua Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana.
4.
Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si., selaku dosen pembimbing I yang telah membantu dalam membimbing serta tak hentinya memberikan semangat dan dukungan hingga akhir penyusunan Skripsi ini.
5. Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si., selaku dosen pembimbing II yang telah membimbing demi kelancaran penyusunan Skripsi ini. 6.
Seluruh dosen pengajar beserta staf/pegawai di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana yang telah membantu penulis, terutama dalam hal pengurusan surat dan kelengkapan administratif lainnya.
7.
Kedua orang tua penulis, I Wayan Nerta dan Ni Nyoman Wedei yang tak pernah berhenti memberikan dukungan, doa dan semangat.
8.
Saudara penulis (Eka, Dewi, Nerdi, Ayu dan De Oka) yang selalu mendukung dan memberikan semangat bagi penulis. iii
9.
Tim MDR-TB (Indra dan Cipta) yang telah menjadi teman diskusi dan berbagi suka duka selama pembuatan Skripsi.
10. Teman-teman mahasiswa Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana, khususnya Lumiere Onze Vauquelin yang telah berjuang bersama penulis. 11. Laboran di Laboratorium Biologi Molekuler (Mbok Nanik, Kak Echi, Bu Komang, Bu Wahyu dan Pak Ketut) yang telah banyak membantu penulis dalam pekerjaan penelitian. 12. Semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu. Penulis sepenuhnya menyadari bahwa penulisan Skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari semua pihak demi karya yang lebih baik di masa yang akan datang. Semoga Skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.
Bukit - Jimbaran, 13 Juli 2015
Penulis
iv
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL.................................................................................
i
LEMBAR PENGESAHAN.......................................................................
ii
KATA PENGANTAR...............................................................................
iii
DAFTAR ISI.............................................................................................
v
DAFTAR SINGKATAN...........................................................................
viii
DAFTAR ISTILAH...................................................................................
x
DAFTAR TABEL.....................................................................................
xiii
DAFTAR GAMBAR.................................................................................
xiv
DAFTAR LAMPIRAN..............................................................................
xv
ABSTRAK.................................................................................................
xvi
ABSTRACT...............................................................................................
xvii
BAB I
BAB II
PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang....................................................................
1
1.2 Rumusan Masalah...............................................................
4
1.3 Tujuan Penelitian................................................................
4
1.4 Manfaat Penelitian..............................................................
5
1.4.1 Manfaat Keilmuan....................................................
5
1.4.2 Manfaat Praktis….....................................................
5
TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Mycobacterium tuberculosis................................................
6
2.1.1 Genomik....................................................................
8
2.1.2 Mekanisme dan Faktor-faktor Virulensi ..................
9
2.2 Multidrug Resistance Tuberculosis (MDR-TB).................
11
2.3 Isoniazid.............................................................................
12
2.4 Gen Resisten Isoniazid.......................................................
13
2.4.1 inhA…......................................................................
13
2.4.2 katG….....................................................................
15
2.5 Mutasi Gen........................................................................
15
v
2.6 Isolasi DNA......................................................................
18
2.7 Polymerase Chain Reaction (PCR)...................................
19
2.7.1 Tahapan Siklus PCR ……..…..................................
19
2.7.2 Komponen Reaksi PCR ….......................................
21
2.7.3 Multiplex PCR..........................................................
23
2.8 Desain Primer….................................................................
24
2.9 Analisis Produk PCR….....................................................
27
2.9.1 Elektroforesis…........................................................
27
2.9.2 Sekuensing…............................................................
29
BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian..........................................................
30
3.2 Waktu dan Lokasi Penelitian..............................................
30
3.3 Bahan Penelitian..................................................................
31
3.4 Alat Penelitian.....................................................................
31
3.5 Prosedur Penelitian.............................................................
32
3.5.1 Analisis Primer.........................................................
32
3.5.2 Desain Primer...........................................................
33
3.5.3 Isolasi DNA M. tuberculosis....................................
34
3.5.4 Amplifikasi Promoter inhA, Gen inhA dan Gen katG M. tuberculosis dengan Multiplex PCR.........
35
3.5.5 Deteksi Produk PCR.................................................
35
3.5.6 Sekuensing Produk PCR...........................................
36
3.5.7 Analisis Data Penelitian dan Deteksi Mutasi…........
36
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Analisis dan Desain Primer ...............................................
37
4.2 Isolasi DNA M. tuberculosis...............................................
42
4.3 Optimasi Proses Multiplex PCR untuk Amplifikasi Promoter inhA, Gen inhA dan Gen katG M. tuberculosis....
44
4.4 Amplifikasi Promoter inhA, Gen inhA dan Gen katG M. tuberculosis dengan Multiplex PCR dan Deteksi Produk PCR….....................................................................
vi
47
4.5 Sekuensing Produk PCR dan Analisis Data…....................
49
4.5.1 Sekuensing Regio Promoter inhA, Fragmen Gen
BAB V
inhA dan Gen katG…................................................
49
4.5.2 Analisis Homologi….................................................
50
4.5.3 Analisis Mutasi.….....................................................
52
KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan………..............................................................
55
5.2 Saran……..………..............................................................
56
DAFTAR PUSTAKA................................................................................
57
LAMPIRAN..............................................................................................
64
vii
DAFTAR SINGKATAN
ACP
: Enoil asil carrier protein
AG
: Arabinogalaktan
ahpC
: gen pengkode Alkil hidroperoksida reduktase
BLASTn
: Basic Local Alignment Search Tool nucleotide
bp
: base pairs
BSC
: Biological Safety Cabinet
C
: Cytosine (Sitosin)
CoA
: Co-enzim A
dATP
: Deoksiadenosin trifosfat
dCTP
: Deoksisitidin trifosfat
ddNTP
: Dideoksiribonukleotida
dGTP
: Deoksiguanosin trifosfat
dTTP
: Deoksitimidin trifosfat
DNA
: Deoxyribonucleic acid
dNTP
: Deoxynukleotida trifosfat
EDTA
: Ethylenediaminetetraacetic acid
ETH
: Ethionamide
FabG/mabA : gen pengkode 3-ketoacyl-acyl carrier protein reductase FAS I
: Fatty Acid Synthases type I
FAS II
: Fatty Acid Synthases type II
G
: Guanin
GuSCN
: Guanidinium thiocyanate
HCl
: Hidroklorida
INH
: isoniazid
inhA
: gen pengkode enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase
kasA
: gen pengkode keto-acyl-ACP synthase
katG
: gen pengkode katalase peroksidase
LAM
: Lipoarabinomannan
LM
: Lipomannan
viii
mAGP
: mycolyl arabinogalactan-peptidoglikan
MDR
: Multidrug Resistance
MEGA4
: Moleculer Evoluationary Genetics Analysis version 4.0
MIC
: Minimum Inhibitor Concentration
mRNA
: messenger Ribonucleic acid
Ndh
: gen pengkode NADH dehidrogenase
OAT
: obat antituberkulosis
ORF
: open reading frame
pb
: pasang basa
PBS
: Phosphate buffered saline
PCR
: Polymerase Chain Reaction
pH
: power of Hydrogen
PG
: peptidoglikan
PIMs
: Phosphatidylmyo inositol mannosides
PMN
: Polymorphonuclear
R (Arg)
: lambang asam amino Arginin
ROI
: Reactive Oxygen Intermediate
RNA
: Ribonucleic acid
T
: Timin
Taq
: Thermus aquaticus
TAE
: Tris-asetat-EDTA
TB
: Tuberculosis
TBE
: Tris-Borat-EDTA
Tm
: Temperature melting
UV
: ultraviolet
W (Trp)
: lambang asam amino Triptofan
ix
DAFTAR ISTILAH
Alignment
: membandingkan
sekuens
DNA
berdasarkan
homologi
sekuens tersebut terhadap subjek untuk mengidentifikasi sekuens yang memiliki kesamaan Amplifikasi DNA : perbanyakan DNA Amplikon
: produk amplifikasi DNA
Asam amino
: unit monomer penyusun protein
Building block
: unit monomer penyusun komponen
CDC1551
: salah satu jenis galur M. tuberculosis yang berhubungan dekat dengan H37Rv namun merupakan galur yang lemah
Comb
: alat menyerupai sisir yang digunakan untuk membentuk sumur (well) pada gel agarosa
Chamber
: wadah untuk meletakkan gel agarosa
Dimer
: primer hibridisasi secara bersama-sama
DNA polimerase : enzim yang berperan sebagi katalis dalam proses polimerisasi DNA Elektroferogram
: grafik hasil analisis elektroforesis kapiler
Elektroforegram
: pita hasil analisis elektroforesis gel
False priming
: penempelan primer yang tidak sesuai dengan tempat menempelnya pada suhu tertentu, diluar suhu annealing
Gen
: urutan DNA yang menyandi suatu protein
GenBank
: data base utama dalam biologi molekuler yang dikelola oleh NCBI
H37Rv
: galur standar yang dijadikan wild type M. tuberculosis
H37Ra
: salah satu galur yang berhubungan dekat dengan H37Rv namun merupakan galur yang lemah
In vitro
: percobaan yang dilakukan dalam tabung yang menyerupai sistem in vivo sehingga memberikan hasil yang mendekati proses in vivo
In silico
: menggunakan komputerisasi
x
Kodon
: triplet nukleotida berurutan dalam rantai RNA messenger yang mengkode asam amino spesifik dalam sintesis protein
Lokus
: letak suatu gen pada kromosom
MIC
: konsentrasi minimum obat yang dapat menghambat 99% pertumbuhan bakteri
Mismatch
: kesalahan pemasangan basa pada primer
Mispriming
: penempelan primer di tempat yang tidak diinginkan pada suhu annealing
Mutan
: agen yang mengalami mutasi
Mutasi
: terjadinya perubahan basa dari urutan nukleotida yang lazim dari suatu sekuens DNA organisme yang dapat menyebabkan perubahan sifat fenotip
Nukleotida
: unit monomer pembentuk DNA
ORF
: segmen pada sekuens nukleotida yang diawali dengan kodon start dan diakhiri oleh kodon stop serta memiliki panjang yang cukup untuk mengkode protein
Pelet
: endapan DNA yang berwarna putih pada dasar tabung setelah proses sentrifugasi
PCR
: teknik amplifikasi sekuens DNA dengan menggunakan reaksi enzimatis
pF-inhA
: primer forward gen inhA pada fragmen 31-460
pR-inhA
: primer reverse gen inhA pada fragmen 31-460
Polimerisasi
: reaksi pembentukan polimer
Primer
: rantai polinukleotida untai tunggal yang digunakan untuk menyalin template DNA berperan dalam amplikasi DNA dengan PCR
Prodrug
: senyawa yang tidak aktif namun di dalam tubuh dapat menjadi aktif karena proses enzimatik
Promoter
: regio DNA yang berperan dalam pengendalian transkripsi gen struktural
xi
Resistensi
: kapasitas suatu organisme, jaringan atau sel dalam menahan efek dari agen fisik atau lingkungan yang berbahaya.
Resistensi silang : resistensi tehadap satu obat dan berkembang menjadi resistensi terhadap obat lain yang memiliki indikasi terapi yang sama RNA polimerase : enzim yang diperlukan dalam proses sintesis RNA dari DNA Sekuens DNA
: urutan DNA
Sekuensing
: proses penentuan urutan basa nukleotida molekul DNA
Smear
: pita tipis yang tersebar
Template DNA
: DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan
Transkripsi
: proses sintesis RNA dengan menggunakan DNA sebagai template
Tray
: alat yang digunakan untuk mencetak gel agarosa
Well
: kolom yang berfungsi sebagai tempat diletakkannya sampel yang akan di elektroforesis
Wild type
: organisme yang memunculkan karakter dalam populasi aslinya
xii
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 2.1 Kode Genetik Universal……………………………….....
18
Tabel 4.1 Hasil Desain Primer untuk Mengamplifikasi Fragmen Gen inhA………………………………............................
39
Tabel 4.2 Hasil Analisis Homologi Sekuens Regio Promoter inhA Isolat 134………………………………............................
50
Tabel 4.3 Hasil Analisis Homologi Sekuens Fragmen Gen inhA Isolat 134………………………………............................
50
Tabel 4.4 Hasil Analisis Homologi Sekuens Fragmen Gen katG Isolat 134………………………………............................
51
Tabel 4.5 Mutasi pada Isolat 134 MDR-TB………….......................
52
xiii
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 2.1
Struktur Morfologi M. tuberculosis.............................
6
Gambar 2.2
Struktur Dinding Sel M. tuberculosis..........................
8
Gambar 2.3
Struktur Isoniazid........................................................
13
Gambar 2.4
Titik Mutasi pada Promoter dan Gen inhA………….
14
Gambar 2.5
Mutasi Titik……………………………....………….
17
Gambar 2.6
Tahapan Proses Amplifikasi PCR...............................
21
Gambar 2.7
Dimer Primer pada Ujung 3’.......................................
26
Gambar 2.8
Dimer Primer selain pada Ujung 3’.............................
26
Gambar 2.9
Hairpin Primer.............................................................
26
Gambar 4.1
Elektroforegram Produk PCR Hasil Optimasi dengan
Gambar 4.2
Variasi Suhu Annealing…….........................................
46
Elektroforegram PCR dengan Suhu Annealing 58° C
48
xiv
DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Prosedur Penelitian……………………............................... 64 Lampiran 2. Skema Kerja Analisis Primer secara in Silico……................ 65 Lampiran 3. Skema Kerja Desain Primer secara in Silico......................
66
Lampiran 4. Tahapan Isolasi DNA..........................................................
67
Lampiran 5. Sekuens Nukleotida M. tuberculosis H37Rv Promoter inhA 68 Lampiran 6. Sekuens Nukleotida M. tuberculosis H37Rv Gen inhA......
69
Lampiran 7. Sekuens Nukleotida M. tuberculosis H37Rv Gen katG......
70
Lampiran 8. Pembuatan Larutan..............................................................
73
Lampiran 9. Hasil Analisis Primer mabA-inhA-Promoter-FS.................. 74 Lampiran 10. Hasil Analisis Primer mabA-inhA-Promoter-R.................... 75 Lampiran 11. Hasil Desain Primer Fragmen Gen inhA.............................. 76 Lampiran 12. Hasil Analisis Primer KG24F..............................................
77
Lampiran 13. Hasil Analisis Primer KG60R.............................................
78
Lampiran 14. Elektroforegram Hasil Sekuensing Promoter inhA.............
79
Lampiran 15. Elektroforegram Hasil Sekuensing Gen inhA.....................
80
Lampiran 16. Elektroforegram Hasil Sekuensing Gen katG.....................
81
Lampiran 17. Hasil Aligment Sekuens Nukleotida Isolat 134 MDR-TB Regio Promoter inhA dengan Data Base M. tuberculosis...
83
Lampiran 18. Hasil Aligment Sekuens Nukleotida Isolat 134 MDR-TB Fragmen Gen inhA dengan Data Base M. tuberculosis......
85
Lampiran 19. Hasil Aligment Sekuens Nukleotida Isolat 134 MDR-TB Fragmen Gen katG dengan Data Base M. tuberculosis…..
87
Lampiran 20. Hasil Aligment Asam Amino Isolat 134 MDR-TB Fragmen Gen inhA dengan Data Base M. tuberculosis......
91
Lampiran 21. Hasil Aligment Asam Amino Isolat 134 MDR-TB Fragmen Gen katG dengan Data Base M. tuberculosis......
92
Lampiran 22. Keterangan Kelaikan Etik (Judul Awal).............................
94
Lampiran 23. Keterangan Kelaikan Etik (Revisi Judul)............................
95
xv
ABSTRAK Adanya mutasi pada gen katG (50-95%) dan operon inhA (8-43%) yang bertanggung jawab terhadap resistensi isoniazid merupakan salah satu penyebab terjadinya multidrug resistance tuberculosis (MDR-TB). Untuk penentuan mutasi pada beberapa daerah gen secara bersamaan, diperlukan suatu metode yang dapat dikerjakan secara lebih efisien. Metode yang dapat digunakan untuk keperluan tersebut adalah multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan metode multiplex PCR dalam mengamplifikasi fragmen regio promoter inhA (7-290), gen inhA (31-490) dan gen katG (2437-3160) secara bersamaan serta mengidentifikasi titik dan jenis mutasi ketiga regio tersebut pada isolat 134 MDR-TB. Penelitian dilakukan dalam beberapa tahap, meliputi: desain dan analisis primer; isolasi DNA; amplifikasi fragmen DNA; deteksi produk PCR; sekuensing nukleotida dan deteksi mutasi dengan program MEGA4. Amplifikasi PCR dilakukan pada kondisi predenaturasi (95°C, 15 menit); dengan 45 siklus amplifikasi meliputi, denaturasi (94°C, 1 menit), annealing (58°C, 1 menit 20 detik), dan elongasi (72°C, 2 menit); elongasi akhir (72°C, 10 menit). Hasil deteksi produk PCR menunjukkan tiga pita yang sesuai (+284 bp; +460 bp dan +724 bp) sehingga metode multiplex PCR memiliki kemampuan yang baik dalam mengamplifikasi fragmen regio promoter inhA, gen inhA dan gen katG secara bersamaan. Hasil analisis menunjukkan terjadinya mutasi substitusi pada posisi -15 regio promoter inhA (C→T), gen katG pada basa nukleotida 571 (T→C) dan 701 (C→G). Pada gen katG terjadi perubahan asam amino W191R dan A234G. Namun tidak ditemukan adanya mutasi pada fragmen gen inhA.
Kata kunci : multiplex PCR, MDR-TB, gen inhA, gen katG, promoter inhA
xvi
ABSTRACT Mutations in katG gene (50-95%) and operon of inhA (8-43%), which is responsible for isoniazid resistance is one of the causes of multidrug resistance tuberculosis (MDR-TB). For identification of mutations in several regions of genes simultaneously, we need a method that can be done more efficiently. The method can be used for this purpose is a multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR). This study aims to determine the ability of multiplex PCR method to amplifying fragment of inhA promoter region (7-290), inhA gene (31-490) and katG gene (2437-3160) simultaneously and to identify the point and type of mutation at that regions in 134 MDR-TB isolate. This research was conducted in several steps, e.g.: primer design and analysis; DNA isolation; amplification of fragments; detection of PCR products; sequencing; and mutation detection using MEGA4. Optimum conditions for DNA amplification was predenaturation (95°C, 15 minutes), 45 cycles of amplification, e.g.: denaturation (94°C, 1 minute), annealing (58°C, 1 minute 20 seconds), extension (72°C, 2 minutes); post extension (72°C, 10 minutes). Detection of PCR product showed three bands (+284 bp; +460 bp and +724 bp) therefore, multiplex PCR method had good ability to amplify fragment of inhA promoter region, inhA gene and katG gene simultaneously. The result of mutation analyses showed substitution nucleotides alteration at -15 of inhA promoter region (C→T), at 571 (T→C) and 701 (C→G) nucleotide of katG gene. The amino acid alteration of katG gene were at W191R and A234G. But there was no any mutation in inhA gene.
Key words : multiplex PCR, MDR-TB, inhA gene, katG gene, inhA promoter
xvii
