*Aplikace mikroorganismů

27.10.2016

Přehled základních biotechnologických výrob ve farmacii

* Aplikace mikroorganismů v biotechnologii

antibiotika antimykotika alkaloidy aminokyseliny cytokiny enzymy

Výroba antibiotik, vitaminů a jiných látek pro farmaceutické účely

hormony polysacharidy protilátky steroidy vakcíny vitamíny

Technologické požadavky

Number of new biotech drugs and vaccines approved

Ekonomické požadavky možnost využití levných a snadno dostupných substrátů

snadné uchovávání kmene

dostatečně vysoká specifická rychlost tvorby produktu po dlouhou

stabilita technologických vlastností v průběhu konzervace

část kultivačního procesu

vysoká rychlost růstu (menší riziko kontaminace)

vysoká produktivita procesu vztažená na:

možnost kultivace na relativně jednoduchých mediích

• spotřebovaný substrát

snadná regulace (řízení) růstu a produkce (nadprodukce)

• dobu kultivace

minimální tvorba vedlejších produktů (strukturních analogů)

• pracovní objem zařízení

vysoká koncentrace produktu

• dodanou energii (míchání, aerace, chlazení ap.)

snadná izolace produktu (extracelulární vs. intracelulární)

minimální náklady na izolaci a purifikaci produktu (povaha mikrobní

minimální nároky na design, a materiál technologického zařízení

populace, vedlejší produkty ap.) celková minimalizace vstupních a provozních nákladů

Antibiotika

Ekologické požadavky nepatogenní kmeny (závisí na typu procesu) možnost využití netoxických substrátů omezení vzniku toxických meziproduktů a vedlejších produktů minimalizace aplikace organických rozpouštědel minimalizace odpadů (plynných, kapalných, pevných) snadná likvidace vzniklých odpadů snadná kontrolovatelnost procesu

 sekundární metabolity mikroorganismů tvořené v určitých vývojových fázích z primárních metabolitů  v malých koncentracích potlačuji životni procesy jiných mikroorganismů  jako producenti antibiotik jsou využívaný mikromycety (plísně) a bakterie (aktinomycety – rod Streptomyces; G+ sporulujicí - Bacillus)  semisyntetická antibiotika – část syntetizována mikroorganismem a část dokončena chemicky  působení antibiotik • bakteriostatické (zabraňující množení bakterií) • baktericidní (usmrcují bakterie)  ideální antibiotikum má velký antimikrobiální účinek s minimální toxicitou (vysoká selektivita)

1

27.10.2016

-laktamy

Mechanismy účinku 1. narušení syntézy buněčné stěny 2. porušení funkce cytoplazmatické membrány 3. inhibice syntézy proteinů 4. inhibice syntézy nukleových kyselin (inhibice DNA gyrasy, inhibice syntézy mRNA)

5. kompetitivní inhibice

• penicilín, cefalosporiny, cefamyciny, monobaktamy, karbapenemy • mechanismus účinku spočívá v inhibici syntézy buněčné stěny

Penicilín  první průmyslově vyráběné antibiotikum (1941)

(inhibice syntézy kyseliny

 Penicillium notatum - kmen izolovaný Flemingem – 1mg/l

listové)

 nový producent (submerzní výroba) – Penicillium chrysogenum – 50mg/l  podle molekulárně fylogenetických studií oba kmeny patří do druhu

Penicillium rubens – jeden z 8 druhu produkujících penicilín  přírodní penicilíny G a V nahrazený semisyntetickými  penicilín G nemůže být podávaný ústně (rozkládaný v žaludku, jen injekce), penicilín V není tak labilní

-laktamy

-laktamy

Cefalosporiny

Monobactamy

 poprvé objevený náhodou v 1948 ve splaškách na Sardinii – cefalosporin C

 produkované Chromobacterium violaceum

a penicilín N

 aztreonam (Azactam®), aerocyanidine, aerocavin

 Acremonium chrysogenum (původně Cephalosporium)

 působí jen na G- bakterie

 malá aktivita – produkce derivátů cefalosporinu C (5 generaci) • Cefalotin (I-generace – 1964 Keflin®) - široké spektrum aktivity

Karbapenemy  široké spektrum antibakteriální aktivity

Cefamyciny

 rezistentní na -laktamasy

 Streptomyces sp.  obecně semisyntetické nebo syntetické  rezistentní na -laktamasy

-laktamy

 původně odvozena od thienamycinu - Streptomyces cattleya  jsou jedním z druhů antibiotik „poslední záchrany“ u mnoha bakteriálních infekcí (E. coli, Klebsiella)

Deriváty penicilínu G

Inhibitory -laktamas  kyselina klavulanová (1974/75) - Streptomyces clavuligerus  váže se na serinové zbytky β-laktamáz – suicide inhibitor  stačí v malém množství  kyselina klavulanová + amoxicilin = Augmentin /+ tikarcilin = Timentin

Penicilín acylasa  aminohydrolasa (PA, EC 3.5.1.11), štěpí amidovou vazbu v penicilínu  produkovaná mnoha bakteriemi, kvasinkami a vláknitými houbami  1950 E. coli (AcPA), obecně zdrojem je rekombinantní E. coli  produkce semisyntetických β-laktamů a chirálních sloučenin

Cefalosporin C acylasa

1960

1967 1961

 Pseudomonas sp.; produkce semisyntetických cefalosporinů

2

27.10.2016

Tetracykliny

Makrolidy

 širokospektrální antibiotika (také v zemědělské a veterinární praxi)

 účinek spočívá v narušení procesů translace (vazba na P místo v

 účinek spočívá ve vazbě na ribozomy a inhibici syntézy proteinů v buňce

ribozomální 50S podjednotce, ovlivnění funkce peptidyltransferasy)

 chlortetracyklin, 1945 - Streptomyces aureofaciens

 uplatňují se jako náhrada v případě alergie na penicilinová antibiotika

 oxytetracyklin, 1950 - Streptomyces rimosus

 erytromycin - Saccharopolyspora erythraea

 tetracyklin - Streptomyces sp.

 spiramycin (toxoplasmosa), 1952 - Streptomyces ambofaciens

 rezistenci producentů vůči vlastním produktům lze zvyšovat jejich

 fidaxomycin - Dactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenesis  tylosin (veterinární medicina) – Streptomyces fradiae

dlouhodobou kultivací v selekčním tlaku chlortetracyklinu

 oleandomycin - Streptomyces antibioticus

 dvojmocné kationty (Ca2+, Mg2+, Sr2+) vyvazují antibiotikum z roztoku a

 midecamycin - Streptomyces mycarofaciens

tím snižují inhibiční vliv na producenta

 kitasamycin - Streptomyces kitasatoensis

 výroba chlortetracyklinu vyžaduje potřebnou dávku Cl- iontů; naopak ostatní halogenidy blokují vazbu chloridového iontu a zvyšuje se podíl

 josamycin - Streptomyces narbonensis var. josamyceticus var. nova

vyprodukovaného tetracyklinu na úkor chlortetracyklinu

 carbomycin - Streptomyces halstedii

Sm

Aminoglykosidy

Hyg

Gen

Aminoglykosidy Par

 jedná se o látky tvořené 2 až 4 (amino)sacharidy, resp. (amino)cyklitoly  produkty bakterií Streptomyces (-mycin) nebo Micromonospora (-micin)  inhibice proteosyntézy  streptomycin, 1943 Waksman - Streptomyces griseus  neomycin, 1949 Waksman - Streptomyces fradie  kanamycin, 1956 - Streptomyces kanamyceticus  gentamicin, 1963 - Micromonospora purpurea nebo M. echinospora  sisomicin - Micromonospora inyonensis  tobramycin - Streptomyces tenebrarius  hygromycin - Streptomyces hygroscopicus  paromomycin (monomycin) - Streptomyces krestomuceticus

Glykopeptidy  inhibují syntézu buněčné stěny bakterií  účinné pouze na G+ (stafylokoky rezistentní k meticilinu, enterokoky)  vankomycin, 1954 - Amycolatopsis orientalis (ototoxicita, nefrotoxicita)  teicoplanin, ramoplanin - Actinoplanes teichomyceticus

Polypeptidová antibiotika  inhibují syntézu buněčné stěny bakterií  bacitracin, 1945 - Bacillus subtilis var Tracy (nefrotoxicita)  kolistin, polymyxin B – Bacillus polymyxa  tyrotricin (tyrocidin+gramicidin) – Bacillus brevis

 nejčastěji jsou nasazovány na léčbu rozsáhlých septických infekcí, komplikovaných infekcí probíhajících v dutině břišní či močovém ústrojí, v léčbě nozokomiálních infekcí dýchacích cest  mají mírně zvýšenou toxicitu také pro člověka (nekrosa ledvinových tubulů, závratě, postižení sluchových funkcí) – ototoxicita, nefrotoxicita  užívají se jen nitrožilně nebo intramuskulárně  májí značnou toxicitu též pro samotného producenta  v průběhu kultivačního procesu vzniká komplex strukturních analogů požadovaného produktu, což negativně ovlivňuje následný izolační a purifikační proces (např. gentamicin je směsí 3 strukturních analogů a několika dalších minoritních složek)

Streptograminy  vancomycin-resistant S. aureus (VRSA) a Enterococcus (VRE)  streptogramin A a B – zvlášť bakteriostatický, spolu baktericidní

(Synercid™)

 streptogramin A – S. virginiae  pristinamycin – Streptomyces pristinaespiralis

Lipopeptidy  porušení funkce cytoplazmatické membrány  daptomycin - Streptomyces roseosporus

Linkosamidy  inhibují syntézu bílkovin vazbou na 50S podjednotku ribozomu  linkomycin – Streptomyces lincolnensis, derivát - klindamycin

3

27.10.2016

Amfenikolová antibiotika  chloramfenikol, 1949 - Streptomyces venezuelae, obecně syntetický (toxicita pro kostní dřeň!)

Postup výroby penicilínu 1) naočkování suspenze spor P. chrysogenum do nutričně bohatého média 2) kultivace 1 týden při teplotě 24°C (aktinomycety 25-30°C)

 širokospektré bakteriostatické antibiotikum

3) převedení do inokulačního fermentoru - malé vsádkové fermentory

 inhibuje proteosyntézu, váže se na 50S podjednotku ribozomu

4) aerobní kultivace 1 až 2 dny -> nárůst mycelia

Ansamyciny  rifampicin (rifampin) - Amycolatopsis rifamycinica

5) naočkování inokula do produkčního fermentoru („fed-batch“) - 7 dní zdroj C - glukosa, sacharosa, hydrolyzované škroby zdroj N - kukuřičné výluhy, kvasničný extrakt, (NH4)2SO4

 mechanismus účinku spočívá v inhibici RNA-polymerázy

antifoam – oleje (sójový, palmový, triacylglycerol, sádlo, PPG, silikonové prod.)

 léčba mykobakteriálních nemoci – tuberkulózy a lepry

prekurzor - kyselina fenyloctová/fenoxyoctová (G/V) – dávkování kontinuálně

Kyselina fusidová

pH – kontrola do 0,1 jednotky - kyselina sírová/hydroxid nebo amoniak fermentor - typu air-lift, resp. míchaný turbínový fermentor, objem 100-200m3

 1960 - Fussidium coccineum, také Mucor ramannianus a Isaria kogana

produkční kmen se uchovává ve formě lyofilizovaných spor, resp. vegetativního

 bakteriostatický, inhibuje syntézu proteinů

mycelia v ochranném mediu (např. glycerol) v hluboko mrazících boxech (-70°C)

Růstová křivka výroby penicilínu G

Izolace penicilinu 1) ochlazení kultivačního media na teplotu 0-4°C (kvůli β-laktamasam) 2) odstranění mikrobiálních buněk pomocí rotační vakuové filtrace 3) snížení pH na hodnoty 3 až 4 (rozklad vedlejších produktů, převedení molekuly na nedisociovanou formu) 4) extrakce penicilinu do organického rozpouštědla (amylacetát, cyklické ketony) 5) odstranění barviv a dalších nečistot na koloně s aktivním uhlím 6) zvýšení pH na 5-7 a následná krystalizace v podobě sodné/draselné soli 7) izolace, promytí a sušení krystalů 8) purifikační kroky zahrnují rekrystalizaci, sterilní filtraci a sterilní azeotropickou vakuovou destilaci

Antimykotika místa zásahu

Antimykotika

amfotericin B

griseofulvin, 1939 – Penicillium griseofulvum (výroba - P. patulum) • má malou toxicitu • narušuje mikrotubuly během buněčného dělení • akumulace v kůži, vlasech a nehtech – léčba povrchových dermatomykóz • také jako systémový fungicid proti houbovým patogenům rostlin nystatin, 1950 – Streptomyces noursei • léčba povrchových kandidóz kůže a sliznic, včetně střevní (perorální podání), kandidózy dutiny ústní a vaginální; nevstřebává se • narušuje plasmatickou membránu (váže se na ergosterol) amfotericin B, 1955 – Streptomyces nodosus • hlavně na kvasinky, jen u závažných mykóz, podávání pouze intravenózní • spolu s nystatinem patři mezi polyeny - vysoce účinné, ale také vysoce toxické - obzvlášť pro ledviny a CNS

4

27.10.2016

Antimykotika validamycin - Streptomyces hygroscopicus

Kancerostatika - výroba  výroba vyžaduje velmi sofistikované technologické procesy a kvalitativně

• inhibitor trehalasy • pro kontrolu Rhizoctonia solani na rýži a okurcích (vločkovitost) natamycin (pimaricin) - Streptomyces natalensis, S. gilvosporeus,

S. lydicus, S. chattanoogensis a další • makrolidové antimykotikum • narušuje plasmatickou membránu (váže se na ergosterol) • nevstřebává se, účinný už v malých dávkách (<10 ppm) • aplikace lokální (krém, kapky – zánět rohovky) • v potravinářství se používá jako protiplísňový konzervant sýrů a uzenin, aplikuje se jako sprej nebo prášek na celé, dělené nebo měkké sýry, případně na voskový obal některých sýrů - E 235

Kancerostatika antracykliny - protinádorová antibiotika, inhibují topoizomerasu II  daunarubicin, 1950s - Streptomyces peucetius var. caesius - léčba leukemii, neuroblastomu; mnoho derivátů aktinomyciny – polypeptidová protinádorová atb, inhibují transkripci  daktinomycin (aktinomycin D), 1940 – Streptomyces sp. – trofoblastická nemoc, Erwingův sarkom, zásněť hroznová, aj bleomyciny – indukují rozbití DNA řetězce  bleomycin A2, 1966 - Streptomyces verticillus – léčba rakoviny varlat, vaječníku, děložního hrdla, Hodgkinův lymfom  pingyangmycin (bleomycin A5), 1969 – Streptomyces verticillus var

pingyangensis n.sp. – léčba rakoviny prsou, jater, menší poškození plic

Antivirové látky

vyšší stupeň zabezpečení - tzv. uzavřené technologie (úplné oddělení výrobního procesu od vnějšího prostředí)  hlavní důvody odlišného přístupu jsou:  vysoká toxicita produktů - limitující prvek procesu  velmi nízké koncentrace produktu ve značně komplexních mediích (komplikovaná izolace a purifikace)  požadavek dokonalé ochrany personálu a vnějšího prostředí (typy používaných producentů, vysoká biologická aktivita produktů, vysoká toxicita intermediátů a odpadů)  menší rozměry experimentálních a produkčních zařízení

Kancerostatika romidepsin (istodax) – blokuje histondeacetylasy = apoptóza  1994 - Chromobacterium violaceum - lymfomy T-buněk violacein - vyvolává apoptózu nádorových buněk - Chromobacterium

violaceum – léčba rakoviny tlustého střeva, také účinný proti Plasmodium falciparum (malárie),Trypanosoma cruzi, Leishmania amazonensis migrastatin, isomigrastatin – inhibuje metastazi nádorových buněk -

Streptomyces platensis bestatin (ubenimex) - inhibuje proteasy – Streptomyces olivoreticuli L-asparaginasa - E. coli, Erwinia chrysanthemi (E. carotovora) katalyzuje hydrolýzu L-asparaginu na kyselinu asparagovou a NH3, leukemické buňky umírají

Immunosupresiva

gliotoxin – Aspergillus fumigatus, také Penicillium, Trichoderma -

cyklosporin, 1976 – Tolypocladium inflatum (syn.T. niveum),

inhibuje multiplikaci RNA virů, rovněž účinný jako immunosupresivum

také Trichoderma polysporum a Cylindrocarpon lucidum

(zabraňuje jistým imunitním buňkám množit se, transplantace orgánů

• dovede selektivně inhibovat dělení lymfocytů (hlavně T)

nebo kostní dřeně)

• při transplantacích kostní dřeně, jater a slinivky

chaetomin - Chaetomium cochliodes - inhibuje multiplikaci RNA virů

• působí efektivně i proti revmatické artritidě

funikulosin - Penicillium funiculosum - inhibuje DNA a RNA viry

sirolimus (rapamycin), 1972 – Streptomyces hygroscopicus

boromycin – Streptomyces antibioticus - makrolidové antibiotikum –

• redukuje produkci interleukinu-2 (inhibice aktivaci B- a T-buněk)

inhibuje replikaci klinických izolátu HIV-1, také in vitro

• snižuje riziko odmítnutí transplantovaných orgánů (hlavně ledvin) • jako povlak srdečních stentů tacrolimus, 1987 – Streptomyces tsukubaensis • redukuje produkci interleukinu-2 • při transplantacích orgánů

gliotoxin boromycin

• léčba nemoci spojených s T-buňkami (např. atopický ekzém, vitiligo)

5

27.10.2016

Statiny

Námelové alkaloidy

léčiva fungující jako hypolipidemika

produkty fytopatogenní houby rodu Claviceps známé už ve starověku

léčí se jimi tedy zvýšená hladina některých lipidů a cholesterolů v krvi

houba tvoří mycelium v semeníku lipnicovitých rostlin – sklerocium

(hypercholesterolémie, dyslipidémie)

ve středověku byly extrakty z námele (sušené sklerocium) používány k

inhibuje enzym HMG-CoA reduktasu – dochází k poměrně účinnému

vyvolaní porodu a k regulaci poporodního krvácení

poklesu LDL cholesterolu v krvi (až o 30%), ale i k mírnému vzestupu HDL

první chemicky čistá sloučenina ergotinin izolována z námele v roce 1875

mírně snižují i sérovou koncentraci VLDL a triacylglycerolů

v roce 1918 byl izolován klinicky využitelný ergotamin

mohou být použity i ke snižování krevního tlaku a k léčbě některých

v polovině minulého století byly položeny základy průmyslové produkce

autoimunitních onemocnění

námelových alkaloidů

lovastatin – Aspergillus terreus, přirozeně v „red yeast rice“ (Monascus

v léčebných dávkách působí na nervová zakončení a hladké

ruber, M. purpureus ), Pu-erh, hlíva ústřičná

svaly krevních cév - zastavují krvácení

mevastatin, 1976 – Penicillium citrinum, „red yeast rice“

využívají se v gynekologii, porodnictví a interním lékařství

pravastatin – Nocardia autotrophica

při těžké otravě zapříčiňují silné křeče, zvracení, bolesti

simvastatin, mevinolin – Aspergillus terreus

hlavy, pomatenost a dokonce i smrt - ergotismus

Námelové alkaloidy existují 4 hlavní strukturální skupiny: klavinové alkaloidy, lysergové kyseliny, jednoduché amidy lysergové kyseliny, peptidy lysergové kyseliny

Produkce námel. alkaloidů Polní produkce: o infekce obilí se provádí suspenzí spor o infekce probíhá v době uvolnění klasu z posledního listu s využitím speciálních strojů (jehlami infikuji obilky žita)

produkčními mikroorganismy jsou Claviceps purpurea tvořící při patogenním růstu tmavě fialová sklerocia obsahující převážně peptidové deriváty a Claviceps fusiformis – C. paspali tvořící šedá sférická sklerocia obsahující převážně jednoduché amidy kyseliny lysergové a klaviny průmyslově byly alkaloidy vyráběny původně izolací z námele pěstovaného na úmyslně infikovaném obilí (polní produkce), později byly vyvinuty technologické procesy založené na saprofitické (bez hostitele) kultivaci produkčních kmenů v povrchovém, respektive submersním uspořádání

Produkce námel. alkaloidů Reaktorové technologie: o vzhledem k tomu, že produkce alkaloidů probíhá v odlišném fyziologickém stavu mikroorganismu, je nezbytné v průběhu kultivace takovou změnu navodit - kromě změny a optimalizace zastoupení jednotlivých nutrientů

o v rozmezí asi 4 týdnů proběhne vegetativní část životního cyklu houby o výsledkem jsou námelová zrna, která se uvolňují z klasů o v tomto období se provádí tzv. sklizeň, pro kterou byly opět vyvinuty speciální zemědělské stroje o výtěžek bývá asi 200 kg námele/ha o tento typ produkce lze provádět bez hlubších znalostí regulace syntézy alkaloidů (podmínky přirozené pro patogena) o nevýhodou je vliv podnebí a počasí na výrobní proces

Produkce námel. alkaloidů Reaktorové technologie: o Claviceps můžeme kultivovat na minerálním médiu obsahujícím glukosu, amonné ionty (nebo močovinu, glutamát, aspartát, dusičnany jsou využívány zřídka) a anorganické sole

je možné tohoto stavu dosáhnout výrazným zvýšením osmotického tlaku

o je vyžadována přítomnost biotinu a zvýšená tenze oxidu uhličitého

media (vhodná hodnota - cca 300g/l sacharosy, nebo až ⅔ sacharosy je

o růst probíhá optimálně při teplotě blízké 30°C, produkce alkaloidů v

možné nahradit např. chloridem sodným) o kultivační proces trvá 2 až 3 týdny o zařízení musí splňovat parametry pro dlouhodobé udržení sterility o produkční kmeny snadno ztrácí schopnost hyperprodukce alkaloidů, jsou citlivé k mechanickému stresu a celkovému designu fermentorů

rozmezí teplot 21 – 24°C o hodnota pH 5 – 6  alternativně k submersním kultivacím byly vypracovány technologie na bázi imobilizovaného mycelia Claviceps v alginátu, respektive syntéza alkaloidů pomocí hrubého směsného enzymového preparátu (extrakt buněčného obsahu) z tryptofanu, methioninu a isopentenylpyrofosfátu

6

27.10.2016

Produkce námel. alkaloidů

Vitaminy Exogenní esenciální biokatalyzátory heterotrofních organismů, látky nezbytné

Izolace

v malých množstvích, které si organismus není schopen sám syntetizovat a musí

o alkaloidy jsou intracelulární produkty, peptidove alkaloidy jsou rozpustné v organických rozpouštědlech, paspalová kyselina je rozpustná ve vodě o výchozí materiál (sklerocium, mycelium) se převede do alkalického vodného roztoku a dále se provádí extrakce organickým rozpouštědlem o extrakční operace a zahuštění ve vakuové odparce se používají pro další přečištění alkaloidů o krystalizaci je možné provádět z methanolového roztoku o paspalová kyselina se transformuje na lysergovou kyselinu v prostředí hydroxidu amonného za zvýšené teploty

je přijímat s potravou.

Výroba • chemická syntéza • izolace z přírodního materiálu • mikrobiální biosyntéza • biotransformace

Vitamíny vyráběné biotechnologicky riboflavin (B2) kobalamin (B12) kyselina L-askorbová (C) β-karoten (provitamin A) ergosterol (provitamin D2)

Riboflavin chemická struktura v 1934; teplotně stabilní; částečně odolný vůči oxidaci v živých organismech je převážně ve formě FMN a FAD (60 až 90 %) produkuje celá řada mikroorganismů, průmyslové kmeny - askomycety

Ashbya gossypii, Eremothecium ashbyi a Candida flareri kultivační media: zdroj uhlíku - glukosa, sacharosa, maltosa, rostlinné oleje zdroj dusíku - peptony, kukuřičný výluh, kvasničný extrakt; glycin - stimulátor produkce (stimulace syntézy GTP); biotin, inositol, thiamin - stimulátory růstu aerobní kultivační proces (teplota 26-29°C, cca 120 hodin) – 10-15g/l  pokles pH z 6,5 na 4,5, tvorba mycelia, ojediněle vznikají sporangia  rychlá spotřeba C-zdroje, tvorba spor, počátek flavigeneze  C-zdroj je spotřebován, vzrůst pH, maximální produkce riboflavinu  lyze populace, tvorba dalšího riboflavinu – objevují se krystalky B2

Izolace

Riboflavin

Pro farmaceutické účely lze zvolit následující postupy:

Kobalamin molekula poměrně složitá - základem je komplexní vazba

pH kultivačního media se upraví na 4,5 a zahřívá se při 121 °C, 1 hodinu

centrálního atomu kobaltu se čtyřmi atomy dusíku

pro dosažení rozpuštění riboflavinu

pyrrolových jader, vázaných spolu do porfyrinového skeletu

centrifugace (oddělení nerozpustného podílu), redukce riboflavinu TiCl 3

jedině bakterie a archea obsahují enzymy nutné pro biosyntézu

za vzniku nerozpustné formy

1948 - poprvé izolován z živočišných tkání; 1954 - chemická struktura

filtrace sraženiny a následná reoxidace vzduchem

velkou část denní potřeby vitaminu pro člověka pokrývá jeho produkce

rozpuštění v 10% HCl, 60°C, neutralizace, krystalizace

přirozenou střevní mikroflórou, a dále živočišné produkty: vejce, mléko,

Zbytkový riboflavin lze z mycelia extrahovat vodní parou; z media lze

sýry, maso a vnitřností

alternativně extrahovat do butanolu (po převedení na redukovanou formu).

důležitý především pro správnou funkci krvetvorby, podílí se na syntéze

také se pro produkci používá genetický modifikovaný Bacillus subtilis – roste rychleji a má

DNA a ATP a je nezbytný pro správnou funkci nervového systému

vyšší produktivitu

používá se pro léčbu zhoubné chudokrevnosti, je součástí preparátu pro

nebo pomocí mutantu B. subtilis a B. pumilus je možná produkce D-ribosy – výchozí surovina

léčbu onemocnění jater, střev a slinivky břišní, také při otravě kyanidy

následné chemické syntézy riboflavinu (semisyntetická výroba)

7

27.10.2016

Kobalamin

Kobalamin

průmyslově využívanými producenty jsou Pseudomonas denitrificans,

Propionibacterium shermanii a P. freudenrechii (GRAS) a dále fúzí protoplastů získaný kmen Rhodopseudomonas protamicus kultivace probíhá v submersních dokonale míchaných fermentorech

Pseudomonas - aerobní systémy, Propionibacterium – anaerobní klíčovým intermediátem (prekurzorem) je 5,6-dimethylbenzimidazol výhodným zdrojem uhlíku je melasa (obsahuje betain - stimulátor v metabolické dráze 5-aminolevulové kyseliny) je duležité vyhnout se zpětné represi produktem, proto proces je rozdělený na 2 stupně: 1. anaerobní (80h, 30°C, pH 7, přetlak N2, mírné míchání) -> kobinamid 2. aerobní, + 5,6-dimethylbenzimidazol -> kobalamin (cyanokobalamin)

R. protamicus - jednostupňový aerobní proces bez přídavku prekurzoru

Kobalamin

Kyselina L-askorbová

roční světová produkce přes 35 tun (2008)

1912 – objev, 1933 - izolace z citronu a struktura

izolace z media: medium se zahřeje

roční světová produkce přes 50 000 tun (2002)

na 120°C (30 min), po ochlazení se

bílá krystalická látka, dobře rozpustná ve vodě, E300

pH upraví na 8.5; +KCN a médium se

má redukční účinky, v organismů působí jako antioxidant

míchá asi 16h; +AlCl3 a filtrační

účastní se tvorby žlučových kyselin a v metabolismu pojivových tkání

hmota, oddělení nerozpustného

hydroxyluje aminokyseliny lysin a prolin v kolagenu, podporuje začleňování

podílu; několikanásobná extrakce

síranů do mukopolysacharidů, zapojuje se do syntézy karnitinu, derivátu

do kapalin s různou polaritou;

lysinu a metioninu, a ovlivňuje -oxidaci mastných kyselin, zvyšuje aktivitu

chromatografie na alumině a

mikrosomálních enzymů

následné srážení v etheru

je schopna vázat reaktivní formy O2, čímž snižuje rozvoj aterosklerózy a

metylkobalamin je aktivnější formou než levnější kyanokobalamin

zhoršeného prokrvení tkání, omezuje peroxidaci lipidů a profylaktický

všechny formy B12 špatně asimilovány z trávicí soustavy - injekce nebo

působí před cigaretovými oxidanty; podílí se na menší přilnavosti krevních

podjazykové tablety

destiček a bílých krvinek na endotelu stěny cév, podporuje proces hojení

Kyselina L-askorbová mikrobní technologie je využívána pro biotransformaci D-sorbitolu na L-sorbosu pomocí Acetobacter suboxydans nebo A. xylinum (D-sorbitol se připravuje chemickou redukcí D-glukosy na Raneyově niklu)

Kyselina L-askorbová druhý fermentační krok produkuje jiný intermediát – 2-keto-L-gulonovou kyselinu pomoci bakterie Ketogulonicigenium vulgare (a Bacillus megaterium) vysoký výtěžek KGA (výnos 97%) metoda má nižší náklady, nepoužívá toxické

medium pro biotransformaci obsahuje glukosu, kvasničný extrakt nebo

rozpouštědla a produkuje méně odpadu

kukuřičný výluh, mírný přebytek CaCO3, a asi 200g/l D-sorbitolu

přímá konverze glukosy na kyselinu L-askorbovou je možná z využitím řasy

30°C, silná aerace -> 1-2 dny 90-95% konverze

Chlorella pyrenoidosa ATCC 53170 – ve fermentoru, limitovaný zdroj

izolace L-sorbosy z media pomocí filtrace, zahuštění, purifikace na

uhlíku – výtěžek 1,45 g/l kyseliny L-askorbové

ionexech, krystalizace (asi 65%); výtěžek bývá 180g/l, čistota 99% ->

S. cerevisiae a Z. bailii akumuluji k. askorbovou při inkubaci z L-galaktosou

chemická konverze na kyselinu L-askorbovou

Euglena gracilis Z. produkuje současně β-karoten, vitamin C a vitamin E

8

27.10.2016

Kyselina L-askorbová drahá 2-keto-D-glukonové kyseliny – glukosa je přeměňovaná na KGA přes kyselinu D-glukonovou ve 3 krocích  Acetobacter melanogenus a Pseudomonas albosesamae  Bacterium hoshigaki a B. gluconicum  Brevibacterium ketosoreductum (Corynebacterium, Pseudomonas)

Acetomonas albosesamae může

-karoten významný karotenoid, u mnoha organismů slouží buď jako žlutočervené barvivo, nebo u živočichů jako antioxidant a prekurzor vitaminu A (spolu s -karotenem a lykopenem) nedostatek má projevy nedostatku antioxidantů, zvyšuje se riziko rakoviny a klesá celková obranyschopnost organismu významnou roli hraje při ochraně kůže proti poškození nadměrným sluněním v potravinářství E160a

přímo konvertovat glukosu na 2,5-DKG (2 kroky) chemická přeměna KGA na kyselinu L-askorbovou nebo: Zymomonas

mobilis, E. col, Fusarium oxysporium (hydrolasy, laktonasy)

-karoten karoteny produkuje velké množství mikroorganismů, v průmyslových podmínkách se uplatnily zvláště Phycomyces blakesleanus, Blakeslea

trispora a také jednobuněčná řasa Dunaliella salina houby se vyskytují ve dvou sexuálních formách, pro dosažení vysoké nadprodukce β-karotenu je nezbytná oddělená příprava inokula obou těchto forem, které se na počátku produkčního procesu smíchají

-karoten halofilní biotechnologie - produkce β-karotenu pomoci jednobuněčné řasy Dunaliella salina (extrémní halofil) - fotoautotrofní -

utylizuje CO2 a HCO3 ; zdroj dusíku – dusičnany (amonné sole méně efektivní); K2HPO4; Mg2+:Ca2+ 0.8-20; Fe, vitaminy a stopové prvky (Zn, Co, Cu, Mo, Mn); Cl-:SO42- 3.2 (růst) a 8.6 (produkce) teplota 20-40º, pH 9.0

jiná možnost - inokulace pouze „minus“ formou za současného přídavku trisporových kyselin (sekundární metabolity těchto hub), syntéza je dále stimulována přídavkem látek obsahujících β-iononový kruh medium – vysoká koncentrace živin a vysoká viskozita (lihové výpalky, škrob, rostlinné oleje ap.), antioxidant (zabraňuje rozkladu β-karotenu) kultivace 7 - 8 dnů, výtěžek 2,5 - 3,0g/l

-karoten Izolace Houby produkují β-karoten jako intracelulární produkt. Izolace produktu pro potravinářské a farmaceutické účely zahrnuje: •

permeabilizace buněk (hydrolýza, dehydratace)

•

extrakce lipidického podílu; saponifikace

•

extrakce (petroléter, hexan ap.)

•

purifikace

•

krystalizace

Ergosterol ergosterol je převáděn do aktivního stavu zahříváním, resp. UV zářením vitamin D2 se účastní metabolismu resorpci vápníku a fosforu ze střeva a jejich ukládání v živočišných tkáních, zejména kostech významnými producenty jsou kvasinky rodů Saccharomyces a Candida běžné pekařské droždí obsahuje 1-3% provitaminu D2 v sušině byly připraveny speciální kmeny, případně nalezeny modifikované kultivační podmínky (C-zdroj ethanol ap.), poskytující ještě několikanásobné zvýšení výtěžnosti ergosterolu produkční proces se realizuje v submersních dokonale míchaných systémech známých například z výroby droždí izolace: permeabilizace buněk (roztok amoniaku, dimethylamin) -> odstranění nečistot -> vysušení buněk (methanol) -> extrakce (ether, ethylacetát) -> saponifikace -> reextrakce etherem -> krystalizace.

9

27.10.2016

Vitaminy

Vakcíny

Vakcíny

Vakcíny Toxoid – bakteriální

Tetanus - projevuje se křečemi a ztrátou koordinace svalových pohybů

toxin (obvykle exotoxin),

(toxiny produkované bakteriemi blokují uvolňování svalového stahu). Bez

jehož toxicita byla snížena

lékařské pomoci (antibiotika, sérum) končí zpravidla smrtí v důsledku

nebo odstraněna chemicky

zástavy srdce nebo kolapsu dýchacího systému (křeč mezižeberních a

(formaldehydem) nebo

dalších svalů znemožní dýchání).

tepelně, přičemž jiné vlastnosti (imunogenicita) zůstávají zachovány vyvolává imunitní reakci na původní toxin nebo posiluje reakci na jiný antigen. Adjuvans - látka, která zesiluje imunitní reakci na podaný antigen (Al(OH)3, AlK(SO₄)₂,Ca3(PO4)2, oleje)

Spory bakterie Clostridium tetani (extrémně tvrdé, odolné teplu a většině antiseptik) jsou rozšířeny v půdě, zvláště hnojené. Profylaxe je účinná ve formě tetanické toxoidní vakcíny (toxoid neurotoxinu tetanospasminu). produkce anaerobní fermentaci

Steroidy

Steroidy prekurzory biotransformace jsou relativně levné, nerozpustné ve vodě, jen v rozpouštědlech (methanol, ethanol, aceton) rozpouštědla nebo substráty bývají toxické, proto se přidává pouze 2-5 g/l – konverze 100% využívá se mikromycety (Rhizopus, Curvularia, Fusarium, Aspergillus) a mykobakterie – suspenze nebo imobilizované rostoucí buňky, klidové buňky, spory a extrakty bez buněk provádí klíčové reakce modifikující základní steroidovou strukturu

 prednisolon – léčba zánětlivých a autoimunitních onemocnění (astma, revmatoidní artritida, ulcerózní kolitida, Crohnova nemoc aj.)  11 α-Hydroxyprogesterone – antiandrogen (léčba onemocnění spojených z androgeny např. akné, Seboroická dermatitida), také léčba lupénky

vegetativní buňky: jednoduché medium (ulehčení purifikace); substrat se přidává až po nárůstu biomasy nebo biomasa může být sklizená a použitá v imobilizovaném kolonovém systému

 hydrokortizon - kortikosteroidní hormon s protizánětlivými účinky

spory: ještě jednodušší media, není potřeba přidávat antifoam

 androstadienedione - prekurzor steroidových hormonů

izolace – extrakce rozpouštědly nemísitelnými s vodou (např. chloroform)

10

27.10.2016

Enzymy kolagenasa – Clostridium histolyticum • proteasa, která hydrolyzuje peptidové vazby v kolagenu • podporuje hojení • léčba Dupuytrenove kontraktury a Peyronieove nemoci urát-oxidasa – Aspergillus flavus • katalyzuje oxidaci kyseliny močové na 5-hydroxyisourát • léčba „neléčitelné“ dny (forma z PEG - PEGylated) • rasburikasa – rekombinantní urát-oxidasa (S. cerevisiae), metabolizuje kyselinu močovou na allantoin – používaná v léčbě dny, rhabdomyolýzy se selháním ledvin a hyperurikemie (během chemoterapie)

Enzymy cholesterol esterasa – Pseudomonas fluorescens • katalizuje přeměnu mezi sterylem a sterolem • sledování hladiny cholesterolu v séru kreatininasa – Pseudomonas putida, rekombinantní E.coli • katalyzuje přeměnu kreatininu na kreatin • stanovení koncentrace kreatininu v séru streptokinasa - β-hemolytické streptokoky • katalyzuje přeměny neaktivního plazminogenu na aktivní plazmin • léčba různých projevů tromboembolického onemocněni diastasa (amylasa) – Aspergillus oryzae • katalyzuje štěpení škrobu na maltosu

Enzymy laktasy – Kluyveromyces fragilis, K. lactis, Aspergillus niger, A. oryzae • katalyzují štěpení laktosy na jednoduché sacharidy D-glukózu a Dgalaktózu • léčba intolerancí laktosy • potravinové doplňky určené pro doplnění laktasy během konzumace mléčných výrobků obsahujících laktosu (Lacteeze, Lactaid®) • přidává se do zmrzlin a nanuku ureasa – Lactobacillus fermentum • katalyzuje hydrolýzu močoviny na NH3 a CO2 • odstraňování močoviny z krve při selhání ledvin

Jiné látky kyselina glukonová - Gluconobacter oxydans, Aspergillus niger,

Penicillium chrysogenum, Saccharomycopsis sp., Aerobasidium pullulans • biosyntéza zahrnuje přímou oxidací glukosy • submersní aerobní kultivace, 30°C, pH 6,5 a 5,5 (růst a produkce) • léčba hypokalcemie a popálení kyselinou fluorovodíkovou (glukonát vápenatý, injekce), malárie (glukonát chinonový, injekce do svalu), potravinové doplňky, kastrace psu (zinečnatá sůl) • E574 - jako okyselující látka, antioxidant zvyšující účinnost dalších antioxidantů (v sirupech, ve vínu - zabraňuje vzniku zákalů), jako kypřící látka (ve směsích na výrobu sladkých těst) • čisticí prostředky

• normalizace trávení

Jiné látky kyselina arachidonová – Mortierella alpina • je důležitou složkou fosfolipidů u živočichů a prekursorem biosyntézy biologicky důležitých sloučenin, tzv. eikosanoidů (prostaglandiny atd.) • její přítomnost v potravě má pozitivní vliv na zdraví dětí • submersní aerobní kultivace, výtěžek 5,8 g/l • SSF na rýžových otrubách – 122,2 mg PUFA (54,5 mg ARA)/g substrátu

Pythium oligandrum (Chytrá houba) - druh mykoparazitické řasovky, která napadá mnoho druhů hub včetně příbuzných • netoxická pro člověka • přípravky vhodné pro potlačování mykózy kůže nohou, snižování potivosti a odstraňování pachových symptomů • nemocí nemykotického původu (bércové vředy, atopický ekzém, lupénka) • kosmetické přípravky vhodné pro lidi s poševní mykózou či paradontózou

Jiné látky fusafungin – Fusarium lateritium • antibakteriální léčivá látka s protizánětlivým a fungistatickým účinkem • k lokální léčbě infekcí horních dýchacích cest (rýma, katar/zánět hltanu a nosohltanu, zánět vedlejších nosních dutin nebo angína) (Bioparox) ivermektin, 1981 – Streptomyces avermitilis (S. avermectinius) • širokospektrální antiparazitikum používané proti parazitickým hlísticím a některým ektoparazitům jako (vši, střečci či zákožky) • léčba říční slepoty (onchocerciázy) a elefantiázy • jako krém pro léčbu zanícených zranění růžovky filipin (komplex) – Streptomyces filipinensis • patří mezí polyenové makrolidové antimykotika

filipin III

• vysoce fluorescenční, váže se specifický na cholesterol – používaný jako histochemické barvivo

11