Doktori (Ph.D.) értekezés
A Tinuvin 770 kardiovaszkuláris hatásainak állatkísérletes vizsgálata Dr. Sótonyi Péter Semmelweis Egyetem, Transzplantációs és Sebészeti Klinika Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Patológiai Tudományok (Multidiszciplináris Orvostudományok) Program: 8/2. Program és témavezető: Prof. Dr. Kádár Anna, MTA doktora Szigorlati Bizottság: Prof. Dr. Kerényi Tibor, Ph.D. Prof. Dr. Selmeci László, MTA doktora Dr. Bobek Ilona, Ph.D. Dr. Vecsey Tibor, Ph.D. Hivatalos bírálók: Prof. Dr. Magyar Éva, MTA doktora - opponens Prof. Dr. Kalász Huba, MTA doktora - opponens Prof. Dr. Kollai Márk, MTA doktora – bizottság elnöke Dr. Makó János, Ph.D. – bizottság titkára Dr. Entz László, Ph.D. – bizottság tagja Budapest 2003.
1
„Minden ismereted csupán arra jó, hogy a változók közt eligazítson, de a változatlanról nem nyújt semmi bizonyosságot.” Weöres Sándor: A Teljesség
2
Tartalomjegyzék 1.
Összefoglalás ...................................................................................................................................... 5
1.1 Magyar nyelvű összefoglaló ..................................................................................................... 5 1.2 Angol nyelvű összefoglaló........................................................................................................ 6 2. Rövidítések jegyzéke.......................................................................................................................... 7 3.
Irodalmi áttekintés............................................................................................................................. 8
3.1 Bevezetés .................................................................................................................................. 8 3.2 A műanyagok fotodegradációja ................................................................................................ 8 3.3 Fénystabilizátorok..................................................................................................................... 9 3.3.1 UV-abszorbensek ................................................................................................................. 9 3.3.2 Kvencserek......................................................................................................................... 10 3.3.3 Hidroperoxidbontó fénystabilizátorok ............................................................................... 10 3.3.4 Gyökfogók ......................................................................................................................... 10 3.4 Tinuvin 770 /bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)szebacainsav/ ......................................... 11 3.4.1 Tinuvin 770 kémiai tulajdonságai...................................................................................... 11 3.4.2 Tinuvin 770 toxikológiai tulajdonságai.............................................................................. 14 3.4.3 Tinuvin 770 biológiai tulajdonságai................................................................................... 15 3.4.3.1 L-típusú Ca2+ csatorna blokkoló hatás........................................................................... 15 3.4.3.2 Acetil-kolin receptor blokkoló hatás ............................................................................. 16 3.4.3.3 Antioxidáns hatás .......................................................................................................... 16 3.5 Az orvostechnikában alkalmazott polimerek .......................................................................... 16 3.5.1 Hőre lágyuló, általános használatú polimerek.................................................................... 17 3.5.2 Hőre lágyuló, műszaki műanyagok.................................................................................... 17 3.5.3 Elasztomerek...................................................................................................................... 18 3.5.4 Biokompatibilitás ............................................................................................................... 18 3.6 Műanyag-szervezet kölcsönhatás a hemodialízis során .......................................................... 19 3.6.1 Hemodialízis ...................................................................................................................... 19 3.6.2. Hemodializátor................................................................................................................... 20 3.6.3. Hemodializátor – szervezet kölcsönhatás .......................................................................... 22 3.6.4. Hemodialízis szövődményei .............................................................................................. 22 3.6.4.1. Heveny szövődmények ................................................................................................. 23 3.6.4.2. Krónikus szövődmények ............................................................................................... 23 3.6.4.3. Hemodialízis membrán újrafelhasználás ....................................................................... 24 4. Célkitűzések...................................................................................................................................... 29 5.
Tinuvin 770 analitikai vizsgálata .................................................................................................... 30
5.1 Bevezetés ................................................................................................................................ 30 5.2 Módszerek .............................................................................................................................. 30 5.2.1 Kémiai anyagok, reagensek ............................................................................................... 30 5.2.2 HPLC rendszer................................................................................................................... 31 5.2.3 Minta előkészítés HPLC analízishez.................................................................................. 31 5.2.4 Kromatográfiás mérési paraméterek .................................................................................. 32 5.3 Eredmények ............................................................................................................................ 33 5.3.1 Specificitás......................................................................................................................... 33 5.3.2 Linearitás ........................................................................................................................... 35 5.3.3 Ismételhetőség.................................................................................................................... 36 5.3.4 Megbízhatóság ................................................................................................................... 36 5.3.5 Kimutatási és a mennyiségi meghatározás határa .............................................................. 36 5.4 Az eredmények megbeszélése ................................................................................................ 37 6. Tinuvin 770 hatása izolált szívizomsejt modellen in vitro............................................................. 38
3
6.1 Bevezetés ................................................................................................................................ 38 6.2 Módszerek .............................................................................................................................. 38 6.2.1 Általános beavatkozások.................................................................................................... 38 6.2.2 Morfológiai módszerek ...................................................................................................... 41 6.2.2.1 Fénymikroszkópia ......................................................................................................... 41 6.2.2.2 Elektronmikroszkópia ................................................................................................... 41 6.2.3 Biokémiai módszerek......................................................................................................... 41 6.2.4 Citokémiai módszerek........................................................................................................ 42 6.3 Eredmények ............................................................................................................................ 42 6.3.1 Kontroll csoport ................................................................................................................. 42 6.3.2 30 perces inkubáció............................................................................................................ 43 6.3.3 60 perces inkubáció............................................................................................................ 44 6.3.4 120 perces inkubáció.......................................................................................................... 45 6.4 Az eredmények megbeszélése ................................................................................................ 48 7. Tinuvin 770 hemodinamikai hatásainak vizsgálata kutya modellen ........................................... 53 7.1 Bevezetés ................................................................................................................................ 53 7.2 Módszerek .............................................................................................................................. 54 7.2.1 Általános beavatkozások.................................................................................................... 54 7.2.1 Statisztikai analízis............................................................................................................. 56 7.3 Eredmények ............................................................................................................................ 56 7.3.1 A vérnyomás változása ...................................................................................................... 57 7.3.1.1 Szisztolés artériás vérnyomás értékek ........................................................................... 57 7.3.1.2 Diasztolés vérnyomás értékek ....................................................................................... 57 7.3.1.3 Közép vérnyomás értékek ............................................................................................. 60 7.3.2 A szív kontraktilitásának változásai................................................................................... 60 7.3.2.1 Pozitív dp/dt értékek...................................................................................................... 60 7.3.2.2 Negatív dp/dt értékek .................................................................................................... 60 7.3.3 A szívfrekvencia változása................................................................................................. 62 7.3.4 Pitvar-kamrai átvezetés változása ...................................................................................... 62 7.3.5 A végdiasztolés balkamrai nyomás változása .................................................................... 63 7.3.6 A perctérfogat változása..................................................................................................... 63 7.4 Az eredmények megbeszélése ................................................................................................ 64 8. Tinuvin 770 kardiotoxikus hatásainak vizsgálata patkány modellen in vivo.............................. 67 8.1 8.2
Bevezetés ................................................................................................................................ 67 Módszerek .............................................................................................................................. 67 8.2.1 Általános beavatkozások.................................................................................................... 67 8.2.2 Morfológiai módszerek ...................................................................................................... 68 8.2.2.1 Fénymikroszkópia ......................................................................................................... 68 8.2.2.2 Elektronmikroszkópia ................................................................................................... 68 8.2.3 Citokémiai módszerek........................................................................................................ 69 8.3 Eredmények ............................................................................................................................ 69 8.3.1 I. kontroll csoport.............................................................................................................. 70 8.3.1 II. és III. csoport................................................................................................................. 70 8.3.3. IV. csoport ......................................................................................................................... 71 8.3.4. V. csoport........................................................................................................................... 71 8.4 Az eredmények megbeszélése ................................................................................................ 77 9. Eredményeink, összefoglalás........................................................................................................... 81 10.
Összefüggések humán kísérletes eredményeinkkel ................................................................... 83
11.
Irodalmi háttér............................................................................................................................. 84
12.
Köszönetnyilvánítás ..................................................................................................................... 93
13.
Saját közlemények ....................................................................................................................... 95
4
1. Összefoglalás 1.1 Magyar nyelvű összefoglaló A Tinuvin 770 kardiovaszkuláris hatásainak állatkísérletes vizsgálata Szerző: dr. Sótonyi Péter Témavezető: Prof. Dr. Kádár Anna Ph.D. program: 8/2 A
Tinuvin
770
[bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)sebacate]
egy
világszerte
alkalmazott műanyag fénystabilizátor adalékanyag, mely farmakológiai aktivitással rendelkezik. Az irodalomban leírt korábbi in vitro kísérletek azt mutatták, hogy a Tinuvin 770 kifejezetten hatékony L típusú Ca2+ csatornablokkoló, valamint antagonistaként viselkedik a neuronális acetil-kolin receptorokon is. A Tinuvin 770 széles körben kerül felhasználásra orvosi gyakorlatban és az élelmiszeriparban alkalmazott műanyagok komponenseként. A hipotenzió és a vegetatív diszfunkciók gyakran megfigyelt mellékhatásai a hemodialízis kezelésnek. A beavatkozások során a műanyagok nagy felületen, hosszú ideig kapcsolatba kerülhetnek a keringéssel. Feltételezésünk szerint elképzelhető, hogy a hemodialízis kezelés alatt kioldódó Tinuvin 770-nek szerepe lehet a klinikai tünetek kialakulásában. Tanulmányunkban vizsgáltuk: 1. a négy különböző típusú és felépítésű hemodialízis membrán Tinuvin 770 tartalmát és kioldhatóságát, 2. a Tinuvin 770 izolált szívizomsejtekre kifejtett in vitro hatását, 3. a Tinuvin 770-el kezelt kutyákban kialakuló heveny hemodinamikai hatásokat, és 4. A Tinuvin 770 krónikus kardiotoxikus hatását in vivo patkány modellben. Eredmények: 1. Tinuvin 770 kimutatható mind a négy általunk vizsgált membránból. 2. A Tinuvin 770 irreverzibilis, hiperkontrakcióval és a ATP szint jelentős csökkenésével járó károsodást okoz az izolált szívizomsejteken. 3. A Tinuvin 770 i.v. adagolása keringési elégtelenséggel járó kardiodepresszíót és vazodilatációt okoz. 4. A krónikus modellben a morfológiai kép katekolamin indukálta szívizom károsodásnak felel meg. Az irodalmi adatok és a kísérleti eredményeink egyaránt felvetik, hogy a Tinuvin 770 részletes toxikológiai
elemzésének
orvostudományban
szükségességét.
alkalmazott
Az
műanyagokkal
eredményeink felhasználhatóak.
5
élelmiszeriparban kapcsolatos
és
az
szabályozásban
1.2 Angol nyelvű összefoglaló Cardiovascular effects of Tinuvin 770 in animal model Author: Péter Sótonyi, M.D. Tutor: Prof. Dr. Anna Kádár, M.D., Ph.D., D.Sc. Ph.D. programme: 8/2 Tinuvin 770 [bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)sebacate] is a pharmacologically active agent used world wide as a light stabiliser for plastic materials. In vitro studies show that It is an L-type Ca2+ channel and neuronal nicotic acethyl-choline receptor blocker. Tinuvin 770 is a widely applied component of plastic materials used in the medical field and also in the food industry. Hypotension, vegetative dysfunction and neurological symptoms are frequently observed during a haemodialysis treatment. During the haemodialysis the plastic materials can come to direct contact with the circulation on huge surface and long exposure time. The release of Tinuvin 770 from plastic materials applied in haemodialysis may play a part in the development of clinical symptoms. The present studies investigate: 1. the Tinuvin 770 content and release of four different commonly used haemodialysis membranes, 2. in vitro effect of Tinuvin 770 on isolated myocardial cells, 3. acute haemodynamic changes in Tinuvin 770 treated dogs and 4. the chronic cardiotoxicity of Tinuvin-770 in vivo in rat model. Results: 1. Tinuvin 770 release was detected from all examined membranes. 2. The Tinuvin 770 causes irreversible cell damage of isolated myocytes with hypercontraction and decreased level of high energy phosphates. 3. Intravenous administration of Tinuvin 770 results expressed cardiodepression and vasodilatation leading to cardio-vascular insufficiency. 4. In chronic model the morphological results correspond to catecholamine induced myocardial damage. Current literature as well as our research indicates that more detailed toxicological analysis of Tinuvin-770 should be required and current regulations in medical and food industries should adopt the new results.
6
2. Rövidítések jegyzéke ABS ACE ATP CO CP DBP DEMP DHP EC EDP HALS HPLC HR i.p. i.v. ID LD LOD LOQ PA PAC PAN PC PDE PE per os PET PMMA PP PQ PS PSU PTFE PUR PVC S.D. SPE TIC
Akrinitril-butadién-sztirol Angiotenzin konvertáló enzim(angiotensine converting ensime) Adenozin-trifoszfát Perctérfogat (cardiac output) Kreatinin-foszfát Di-butilftalát Di-2-etil-hexiftalát Dihidropiridin Hatásos dózis (effective concentration) Végdiasztólés nyomás ( end diastolic pressure) Sztérikusan gátolt aminok (Hindered Amines Light Stabilisers) High-Performance Liqiud Chromatography Szívfrekvencia (heart rate) Intraperitonealis Intravénás Interkaláris diszkusz Halálos dózis (lethal concentration) Kimutatási határ (limit of detection) Mennyiségi meghatározás határa (limit of quantitaion) Poliamid Poliacetil Poli-acrilo-nitril Polikarbonát Foszfodiészeráz Polietilén Szájon át (peroralis) Polibutil-tetraftalát Polimetil-metakrilát Polipropilén PQ távolság (pitvar-kamrai átvezetés) Polisztirol Poliszulfon Politetra-fluoretilén Poliuretán Poli-vinil-klorid Standard deviáció Szilárd fázisú extrakció (solid phase extraction) Total Ion Chromatography
7
3. Irodalmi áttekintés 3.1 Bevezetés A
műanyagokat
a
mindennapi
életben
széles
körben
alkalmazzuk.
A
csomagolástechnikától az autógyártásig számtalan helyen kerül felhasználásra az egyszerűen
műanyagoknak
nevezett,
igen
változatos
vegyületcsoport.
Az
orvostudomány rohamos fejlődésével, a vizsgálatok és különféle beavatkozások számának exponenciális emelkedésével szükségessé vált a sokrétű felhasználásnak jobban megfelelő, nagy mennyiségben gyártható új anyagok kifejlesztése és ipari méretű előállítása. Napjainkra a polimerek nélkülözhetetlen elemeivé váltak a korszerű orvoslásnak. Mára a diagnosztika, a terápia és a kutatás elképzelhetetlen műanyagok felhasználása nélkül. Egy adott területen alkalmazott polimer a kémiai-, fizikai- és biológiai tulajdonsága mellett a költségvonzata is meghatározó. Hatékony és lehetőleg olcsón előállítható műanyagokra van szükség. Bizonyos tulajdonságok javításával fényérzékenység, szakítószilárdság, éghetetlenség, ütésszilárdság, hajlékonyság, stb. – a műanyagok élettartama megnő, valamint alkalmassá tehetők speciális területeken történő felhasználásra is. Ezt a célt szolgálják a műanyag adalék anyagok, melyeket különböző arányban a polimerekhez keverve a kívánt tulajdonságot kiemelik. Ezek közé tartoznak a hőre lágyuló műanyagok fénystabilizátorai is.
3.2 A műanyagok fotodegradációja A fény és a levegő oxigénje olyan bomlási folyamatokat indít el a műanyagokban, amelyeknek következtében a külső tulajdonságok mellett (szín, felület, folytonosság), számos mechanikai (szilárdság, hajlékonyság) és fizikai paraméterük is megváltozik. A műanyagok öregedésében a fény, az oxigén, a nedvesség és a hőmérséklet együttesen játszik szerepet [23, 29]. A fotodegradációért a napfény 290 – 400 nm hullámhossz tartománya tehető elsősorban felelőssé. A fényhatás kapcsán a fotonok a polimerek megfelelő csoportjait magasabb energiaszintre emelik. A gerjesztett állapotban felhalmozott energia különféle fizikai folyamatok (fluoreszcencia, foszforeszcencia, sugárzásmentes bomlás) révén szabadulhat fel, vagy arra alkalmas akceptor molekulákra adódhat át. A fotokémiai folyamatban keletkezett szénhidrogéngyökök (láncindító lépés) gyorsan reagálnak az oxigénnel. Az így keletkezett alkil-
8
peroxidgyökök hidrogént szakítanak le a polimerből és ezzel az oxidáció előrehaladásához szükséges polimer gyököket állítják elő (láncvivő lépés). A bomlástermék rekombinációja (lánczáró lépés) a kismolekulájú anyagokéhoz képest nagy, a kalitka effektus következtében
Láncindítás: Hidroperoxidok Karbinilvegyületek Katalizátormaradványok Töltésátvivõ komplexek Láncnövekedés: P + O2 POO. + PH
Lánczáródás: P +
POOH +
P
P
+
POO.
PO. +
POO.
P
POO.
Nem gyökös termékek
3.3 Fénystabilizátorok A fénystabilizátorok olyan vegyületek, melyek képesek a fény hatására bekövetkező fizikai és kémiai folyamatokba beavatkozni, azok káros hatását megakadályozni. A fénystabilizátorokat általában 0,05-2,0 tömeg %-ban keverik a ploimerekhez [65]. A legalkalmasabb koncentrációt a stabilizálandó műanyag fényérzékenysége, előrelátható alkalmazási területe, az egyidejűleg használt egyéb adalékanyagok, és a költségvonzat határozzák meg. A fénystabilizátorok a fenti reakciósor valamelyik lépését változtatják meg, ezáltal gátolva a fény okozta degradációt. A fénystabilizátorok csoportosítása a támadáspontjuk alapján történik
3.3.1 UV-abszorbensek Az UV abszorbensek az UV sugarakat elnyelik, majd ártalmatlan hőenergiává alakítják át azokat. Ezek a vegyületek nagy abszorbeáló képességük mellett erősen fénystabilak. Az UV abszorbensek alkalmazásának hátránya, hogy megfelelő rétegvastagságra van
9
szükségük a kívánt UV-adszorbeáló hatás kifejtéséhez. Fontosabb képviselőik: a hidroxi-benzofenonok, és a hidroxi-fenil-benzotriazolok.
3.3.2 Kvencserek Azokat a fénystabilizátorokat, melyek a műanyagokban található kromoforok által elnyelt energiát képesek átvenni, és oly módon semlegesíteni, hogy meggátolják a bomlási folyamatokat, kvencsereknek nevezzük. Az ilyen módon elnyelt energia hő-, fluoreszcencia- vagy foszforeszcencia-sugárzás formájában szabadul fel. Jelentőségük abban áll, hogy védőhatásuk független a stabilizálandó műanyag rétegvastagságától. Alkalmasak fóliák és szálak stabilizálására. Ebbe a csoportba tartoznak a különböző nikkel tartalmú fénystabilizátorok.
3.3.3 Hidroperoxidbontó fénystabilizátorok Ebbe a csoportba tartozó vegyületek a hiperoxidok elbontásán keresztül fejtik ki hatásukat. Ilyen hatásmechanizmussal gátolják a fotodegradációt egyes kénvegyületek fémkomplexei, mint például a dialkil-dikarbamátok, dialkil-ditiofoszfátok, és a tiobiszfenolátok.
3.3.4 Gyökfogók A gyökfogók működésének lényege, hogy a fény hatására képződött szabad gyököket befogják, ezáltal a láncreakciót ideális esetben rögtön a láncindító lépés után megállítják.
Nagy előnyük
az
UV-abszorberekkel
szemben,
hogy már
kis
rétegvastagságú polimerek fénystabilizálására is alkalmasak. Nem változatják meg a műanyagok színét. Ebbe a csoportba tartoznak a kiemelkedő jelentőségű sztérikusan gátolt aminok (Hindered Amines Light Stabilizer – HALS) [27]. A sztérikusan gátolt aminok fotooxidatív körülmények között részlegesen a megfelelő nitroxilgyökké alakulnak át [42]. A nitril gyököket tekinthetjük a tulajdonképpeni stabilizáló egységeknek, ami az alábbi reakcióegyenletből jól látszik:
10
R
R
+
R
N
N
O
OR
A reakcióban keletkezett hidroxil-amin-éternek is van gyökfogó hatása. A folyamat során visszaalakulnak az előző reakció kiindulási vegyületévé, vagyis egy ciklus alakul ki, melynek mindkét lépésben gyökfogóként viselkednek a sztérikusan gátolt aminok. R
R
+
+
ROO.
N
N
OR
O
ROOR
A HALS vegyületcsoport számos, szerkezetében különböző sztérikusan gátolt amint tartalmaz. Egyik legkorábban kifejlesztett, kiváló fénystabilizáló tulajdonságokkal bíró képviselőjük a bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)szebacainsav /Tinuvin 770/.
3.4 Tinuvin 770 /bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)szebacainsav/ 3.4.1 Tinuvin 770 kémiai tulajdonságai A Tinuvin 770 kémiai nevén bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)szebacainsav /SANKYO Co. Ltd., Japan; licensed: CIBA-Geigy Co. Ltd., Basel, Switzerland; CASReg. No.: 52829-9/ a kis molekulasúlyú sztérikusan gátolt aminok csoportjába tartozó magas hatékonyságú fénystabilizátor [22, 49]. A Tinuvin 770 kémiai szerkezetét a 3/1. ábrán szemléltetjük. A Tinuvin 770 szinonimáit az 3/I Táblázatban adjuk meg.
11
3/1. ábra: A Tinuvin 770, bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)szebacainsav képlete.
Tinuvin 770
Decanedioic acid bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)ester ADK Stab LA 77 HALS 1 HALS 770 LS 770 Mark LA 77 Sanol Sanol 770 Sanol LS 700 Sanol LS 770 Sumisorb 577 T 770 TIN 770 Tinuvin 770 DF Tinuvin 770 LS TK-10665 3/I
Táblázat:
A
Tinuvin
770
szinonímái:
A
bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-
piperidinyl)szebacainsav gyári elnevezései (CAS Number: 52829-07-9)
12
A Tinuvin 770 sárgás-fehér kristályos granulátum formájában kerül kereskedelmi forgalomba. Kémiai tulajdonságaira vonatkozó adatait a 3/II Táblázat tartalmazza.
Tulajdonság
Érték
Alak
Fehér – tört fehér granulátum
Szag
Nincs
Olvadáspont
81 – 85 ºC
Forráspont
Nem alkalmazható
Relatív sűrűség
1,05 g/cm3 20 ºC –on
Gyulladáspont
> 150 ºC DIN 20 ºC –on
Robbanáspont
330 ºC BAM
Oxidációs tulajdonság
Nem tesztelt
Öngyulladás
Nem tesztelt
Vízoldékonyság
<1 mg/L 20 ºC –on
Gáznyomás
1.3 x 10-8 Pa 20 ºC –on
Elválasztási koefficiens ( n-octanol/víz )
0,35
PH
9,67 ( 1% -os vizes oldat )
Robbanékonysági tulajdonságok
Nem tesztelt
3/II Táblázat: A Tinuvin 770 fizikai és kémiai tulajdonságai (Material Safety Data
Sheet Directive 91/155/EEC, CIBA Speciality Chemicals Inc., Additive Division, Basle Switzerland). Magas hatékonyságuk mellett monomer típusú fénystabilizátorok nagy hátránya a polimerekkel szemben, hogy a műanyagból könnyebben oldódnak ki [29]. Ennek a tulajdonságnak két káros hatása is lehet: csökkent koncentrációban a stabilizátor nem képes kifejteni a kívánt stabilizáló hatást, továbbá, a kioldódott adalékanyag a környezetével kölcsönhatásba léphet. A nagyfokú extrakcióhoz két tényező együttes jelenléte szükséges: •
Olyan oldószer, ami az adott polimert jól duzzasztja, ezáltal könnyen átjárhatóvá teszi.
•
Olyan oldószer, ami az alkalmazott stabilizátort jól oldja. A Tinuvin 770-re vonatkozó oldékonysági jellemzőket a 3/III Táblázatban tüntetjük fel.
13
Oldékonyság
Súly %
Aceton
19
Benzol
46
Kloroform
45
Etil-acetát
24
Hexán
5
Metanol
38
Diklór-metán
56
Víz
< 0,01
3/III Táblázat: A Tinuvin 770 oldékonysága 20 ºC –on ( Material Safety Data Sheet
Directive 91/155/EEC, CIBA Speciality Chemicals Inc., Additive Division, Basle Switzerland). A Tinuvin 770 széles körben alkalmazott fénystabilizátor. Magas fénystabilitást biztosít olyan polimereknek, mint a polipropilén, polietilén, polisztirén, poliuretán, poliamid és poliacetál. Más fénystabilizátorokkal szemben nagy előnye, hogy a hatékonysága nem függ a polimer vastagságától, hőstabil és nem befolyásolja a polimer színét. Kiválóan alkalmas speciális felületek, filmek, membránok és szálak fénystabilizálására [64]. Alkalmazástól függően a Tinuvin 770 jó eredménnyel kombinálható egyéb HALS, valamint más vegyületcsoportba tartozó UV stabilizátorokkal is.
3.4.2 Tinuvin 770 toxikológiai tulajdonságai A Tinuvin 770 toxikológiai tulajdonságát tekintve korlátozott mennyiségű adat áll rendelkezésünkre. A toxikológiai vizsgálatokat a gyártó és forgalmazó cég végezte a nemzetközi követelményeknek megfelelően [48, 100, 102, 103]. Mutagenitásáról, reprodukciót befolyásoló és tumorgenetikus hatásáról nincs adat. Kiemelendő, hogy az orális adagolás mellett az LD50 értéke 2000 mg/kg. Heveny inhalációs toxicitását patkányokon vizsgálták. 500 mg/m3/4 óra súlyos fokú nehézlégzést, majd légzésleállást okoz. Bőrön, nyálkahártyán iritáló hatást nem írtak le. Nyulakon végzett vizsgálatok konjunktivális izgalmat mutattak. A gastrointastinalis rendszerben a nyálmirigyek morfológiai és funkcionális változását igazolták. A 28 mg-os legalacsonyabb napi
14
dózisban 28 napos per os adagolását követően a harántcsíkolt izmokban rigiditás, súlyosabb esetben katalepsia alakulhat ki [101].
3.4.3 Tinuvin 770 biológiai tulajdonságai Tekintettel arra, hogy a Tinuvin 770 alapvetően ipari alapanyagként alkalmazott vegyület, a biológiai hatásairól csak kis számú, célzott, in vitro vizsgálat számol be. Hatásainak részletes élettani és kórélettani vizsgálata még nem történt meg. A rendelkezésre álló irodalmi adatok közül azonban kiemelkedő fontosságú az L-típusú Ca2+ csatornára valamint az acetil-kolin receptorra kifejtett hatásairól szóló közlemények.
3.4.3.1 L-típusú Ca2+ csatorna blokkoló hatás Glossmann és kutatócsoportja [31, 87] arról számol be, hogy kísérleteikben – ahol Ca2+ csatorna patch clamp vizsgálatokat végeztek - sorozatosan mérési hibákat észleltek. A mérési körülményeket és az alkalmazott eszközöket pontosan analizálták. Megfigyelték, hogy plazma membránok tárolása Falcon Blue Max polypropylene alapanyagú laboratoriumi csövekben a (+)-cis-[3H] diltiazem kötődés teljes eltűnését okozzák anélkül, hogy a befolyásolnák a radioligand interakcióját 1,4-dihydropyridine-kötő doménnel. Kísérleteikben igazolták, hogy a műanyag csövekből vizes- és szerves oldószerrel biológiailag aktív koncentrációban kioldható a bis(2,2,6,6-tetramethyl-4piperidinyl)szebacainsav /Tinuvin 770/. A Tinuvin 770 nagy affinitással (IC50 érték<10 nM) blokkolja a szív- és vázizomzat L-típusú Ca2+ csatornáit, phenylalkylamine és benzothiazepine kötőhely α1 alegységéhez kapcsolódva. Bebizonyosodott, hogy a Tinuvin 770 egy szokatlan, szimmetrikus szerkezetű L-típusú Ca2+ csatorna ligand, mely nem mutat hasonlóságot egyetlen eddig ismert Ca2+ csatornát blokkoló vegyülettel sem. A hipotézis szerint a Tinuvin 770 leginkább a benzothiazepin domen α1 alegységének extracelluláris részéhez kapcsolódva fejti ki hatását. A Ca2+ beáramlás gátlásán keresztül csökkenti a portális véna fázikus kontrakcióját (IC50 érték = 0.6 µM), valamint gátolja az aorta K+ indukálta összehúzódását (IC50 érték = 10 µM). Megjegyzendő, hogy a Tinuvin 765 - csak egy metil csoport hiányában tér el – hatáserősségében egy nagyságrenddel marad el a Tinuvin 770 mögött.
15
3.4.3.2 Acetil-kolin receptor blokkoló hatás Papke és kutatócsoportja tanulmányában [55, 56] ismerteti, hogy a Tinuvin 770 acetilkolin receptorokat használat-függő módon gátolja. A kapott eredményeket úgy értékeli, hogy a Tinuvin 770 non-kompetitív módon gátolja a neuronális típusú acetil-kolin receptorokat. A lassú reverzibilis blokk az agonisták által kiváltott ionáramot követően alakul ki. A muszkuláris típusú acetil-kolin receptorokon a gátlás kifejezetten rövid hatású, rapidan reverzibilis. A non-N-methyl-D-aspartate-típusú, G-protein-kapcsolt (metaborotrop) glutamátreceptorok mGluR3 és mGluR6 receptor családjain nem hatékony. A predominánsan agyban megtalálható α4,β2 alegységekből álló receptor szubtípuson a Tinuvin 770 (IC50 érték ≈ 200 nM) a mecamylaminnál (IC50 érték ≈ 10µM) sokkal hatékonyabb blokkot hoz létre. Minnél nagyobb a receptor aktiváció, annál kifejezettebb a Tinuvin 770 blokkoló hatása. A vizsgálatokat összegezve a Tinuvin 770 egy neuronális típusú acetil-kolin receptor blokkoló, mely kifejezett affintással kötődik a központi idegrendszer nikotinos acetil-kolin receptoraihoz.
3.4.3.3 Antioxidáns hatás A Tinuvin 770 hasonlóan a többi kísérletben alkalmazott alifás nitroxid vegyülethez (2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl,
/TEMPO/,
4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-
piperidine-1-oxyl /TEMPOL/) megakadályozta a 2,2’-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride /AAPH/, Fe(II), és CU(I) okozta DNS oxidatív degradációt. Nem tudta azonban kivédeni tranzicionális fém ionok és hidrogén-peroxid DNS-re kifejtett együttes károsító hatását [14, 15].
3.5 Az orvostechnikában alkalmazott polimerek Az orvosi műanyagok jelentőségének érzékeltetésére egy adatot ismertetnénk. 1990-ben az USA műanyag előállítása 44 millió tonna volt. Ennek a mennyiségnek a 3,2%-a 1,7 millió tonna került orvosi felhasználásra a legkülönbözőbb területeken az infúziós szerelékektől a szívbillentyűkig [13]. Ez a hatalmas mennyiség is érzékelteti a műanyagok feltartóztathatatlan térnyerését a medicinában. Az alkalmazott polimer típusa és az adalékanyagok összetétele függ az alkalmazási területtől. A műanyag végleges szerkezetét és ezzel a kémiai és biológiai tulajdonságait a speciális
16
követelményekhez alkalmazkodva alakítja ki a gyártó. Egy adott műanyag összetételét illetően a kereskedelmi és irodalmi források csak a polimer fajtáját adják meg, nem térnek ki az adalékanyagokra és azok pontos mennyiségi mutatóira. Ezen adatok a gyártási titok kategóriájába esnek.
3.5.1 Hőre lágyuló, általános használatú polimerek Ebbe a csoportba tartozik az orvosi felhasználásra kerülő polimerek 80 %-a. Sokrétű alkalmazhatóság és alacsony ár jellemzi őket [13, 41, 78]. Polietilén (PE) kissűrűségű változatából fóliákat, tasakokat, csöveket, fecskendőket készítenek, a nagysűrűségű változata pedig protézisek készítésére alkalmas. Képlete: ─[─CH2─CH2─]n─ Polipropilén (PP) a polietilénhez legközelebb álló polimer. Az olvadási hőmérséklete sokkal magasabb 165 °C. Készülnek belőle csomagolóanyagok, katéterek, protézisek. Képlete: ─[─CHCH3─CHCH3─]n─ Polivinilklorid (PVC) jó mechanikai tulajdonságú polimer, mely dioktilftaláttal (DOP) lágyítható. Nagy ellenálló képessége miatt feszültség korrózióra nem érzékeny. Felhasználási területe: tasakok, katéterek, csövek, infúziós és transzfúziós szerelékek, csomagoló anyagok. Képlete: ─[─CHCl─CH2─]n─ Polisztirol (PS) jelentősége kisebb, ütésálló változatainak nagyobb szerepe van. Képlete: ─[─CHC6H11─CH2─]n─
3.5.2 Hőre lágyuló, műszaki műanyagok A műszaki műanyagok különleges képességeikkel célzott felhasználásra alkalmasak. Akrinitril-butadién-sztirol (ABS) rugalmas, ütés- és hőálló polimer. Poli/etilén-tetraftalát/-tból (PET) a Dacron anyagú érprotézisek, szalagpótlások, varróanyagok készülnek. Képlete: ─[─CO─C6H10─CO─O─CH2─CH2─O─]n─ Polikarbonát (PC) nagy szilárdságú, kemény, szívós anyag. Fecskendők, dialízis gépek alkatrészeit gyártják belőle. Képlete: ─[─O─C6H10─C(CH3)2─C6H10─O─CO─]n─
17
Poliamid (PA), kereskedelmi nevén nylon. Jól alakítható, nagy szakítószilárdságú, kopásálló polimer. Felhasználása: csomagolástechnika, mesterséges inak, szalagok. Képlete: ─[─NH─(CH2)6─NH─CO─(CH2)4─CO─]n─ Politetrafluoretilén (PTFE) magas szakítószilárdságú, kiváló biokompatibilitású polimer. Érgraftok kialakítására alkalmas. Képlete: ─[─CF2─CF2─]n─ Felsorolásszerűen megemlítendőek még az akrilát polimerek, poliéterek, éterketonok (PEEK), a poliszulfonok (PSU).
3.5.3 Elasztomerek A polimerekkel szemben az elasztomerek háromdimenziós térhálós szerkezetük miatt rugalmasak, és a hőmérséklet emelkedésekor keménnyé, merevvé válnak. Ebbe a csoportba tartozik a természetes gumi, a szilikon elasztomerek, a termoplasztikus elasztomerek, valamit a poliuretan (PUR) is. A PUR-t az orvostechnikában széles körben alkalmazzák dialízis membránok, infúziós csövek, gyomorszondák, katéterek, perisztaltikus pumpák, szívbillentyűk gyártásánál. Említést érdemel, hogy az úgynevezett kompozit polimereket is alkalmaznak. Ezek a műanyagok több polimer együttes alkalmazásával jönnek létre magukban foglalva az összetevők kívánt előnyös tulajdonságait.
3.5.4 Biokompatibilitás Az orvosi gyakorlatban a technikai paraméterek mellett a felhasználó különös figyelemmel kíséri az adott anyag biológiai viselkedését. Szigorú követelményrendszer szabályozza
a
polimerek
felhasználását,
meghatározva
a
fizikai
és
kémiai
követelmények mellett azokat a kötelező vizsgálatokat, melyek a biofunkcionalitását, bio-, hiszto-, hemo- és celluláris kompatibilitást hivatottak ellenőrizni [41, 75, 78]. A biokompatibilitás kifejezés alatt a biológiai összeférhetőséget, és a biológiai rendszerbe helyezett technikai rendszer zavartalan együttműködését értjük. A polimerek és az emberi szervezet közötti kölcsönhatás a műanyagok felhasználási módjától függ. A kontamináció létrejöhet: 1. Közvetlen kontaktussal bőrön (fóliák, műszálas textilek, kötszerek, stb.), nyálkahártyán (katéterek, szondák, endoszkópos eszközök, stb.), vérrel érintkezve
18
(érkatéterek, érprotézisek, szívbillentyűk, varróanyagok, extrakorporális keringés – művese kezelés, szív-tüdő gép, biopumpa, stb.) vagy a szövetek közé kerülve (beültetett hálók, emlőprotézisek, csípőprotézisek, stb.) 2. Közvetett módon olyan közeg közvetítésével, mely korábban a műanyaggal érintkezett
(élelmiszerek,
infúziós
oldatok,
műanyagfecskendőből
adagolt
gyógyszerek, transzfúzió, stb.) A kialakult biológiai hatást a kontamináció időtartama is jelentősen befolyásolhatja. A kölcsönhatás lehet rövid (egyszeri intravénás gyógyszeradagolás) középhosszú (katéterek, infúziók) és hosszú (beültetett protézisek) időtartamú. A művese kezelés kapcsán a műanyag-szervezetérintkezés nagy intenzitással, de időszakosan ismétlődve jelentkezik.
3.6 Műanyag-szervezet kölcsönhatás a hemodialízis során 3.6.1 Hemodialízis A művese kezelés során a károsodott vese károsodott kiválasztó működését pótoljuk. A beavatkozás során vérben oldott anyagokat és folyadékot távolítunk el. Az eljárás elvi alapját az képzi, hogy a vér és a dializáló oldat közé egy félig áteresztő hártyát iktatunk. Attól függően, hogy a hártya milyen polimerből készül, különböző méretű molekulák számára átjárható. Az eljárás hatékonyságát növelni tudjuk, ha a vért és a dializáló oldatot egymással ellentétes irányban áramoltatjuk. A membrán anyagán kívül megválaszthatjuk az oldatunk optimális összetételét, valamit változtathatunk az áramlási és nyomásviszonyokon is. A kezelés alapformái a következők. A hemodialízisnél a szelektív diffúzió, filtráció, és ozmózis párhuzamosan zajlik, a folyamat mozgató ereje a hidrosztatikus nyomáskülönbség, valamint az ozmotikus nyomás. A hemofiltráció esetében a nagyobb pórusnagyság és a magas hidrosztatikus nyomás biztosítja, hogy nagyobb méretű molekulák is eltávolíthatóak legyenek. A hemodiafiltráció az előzőekben említett két eljárást ötvözi. Itt említünk meg két olyan eljárást, melyek nem tartoznak a vesepótló kezelések közé, de rendszerüket hasonlítanak hozzá. A hemoperfúzió során a vért egy adszorpciós patronon áramoltatjuk keresztül, ami megköti a toxinokat és mérgeket. A plazmaferezis esetében a plazma eltávolításával,
19
majd visszapótlásával tudunk patogén fehérjéket, vagy fehérjéhez kötött anyagokat eltávolítani [33, 37, 54].
3.6.2. Hemodializátor A fent leírt eljárásokban az a közös, hogy a vért egy pumpa segítségével egy extrakorporalis műanyag rendszeren keresztüláramoltatva juttatjuk vissza a keringésbe [37]. A korábban már leírt műanyag-szervezet kölcsönhatás nagy kontaminációs felületen, több órán keresztül zajlik. A hemodialízis kezelés alkalmával a vér 1-1,8 m2 felületű műanyag dializáló membránon 250-300 ml/perc áramlási sebességgel, 3-4 órán keresztül áramlik át. A krónikus veseelégtelenségben szenvedő betegeknél a kezeléseket hetente háromszor ismétlik. Ezek a tényezők megnövelik a műanyagok és az emberi szervezet
között
létrejövő
kölcsönhatások
lehetőségét.
A
dializátor
patron
keresztmetszeti képét a 3/2. ábra szemlélteti. 3/2. ábra. A hemodializátor patron keresztmetszeti képe
A: ragasztóanyag, a kapilláris szálak
rögzítésére, valamint a vértér és a víztér elválasztására, B: dializátor ház, C: dialízis membrán, D-től G-ig: véráramlás iránya, áramlási
F-től
E-ig:
iránya.
A
dializáló vérteret
oldat üresen
hagyott, a vízteret pontozott mezővel jelöltük
A patron háza és záró elemei polikarbonátból (esetleg acrylonitrile-styrene-ből), a beágyazó anyag poliuretánból készül. A membránok alapanyaga mutatja a legnagyobb
20
variabilitást: cellulóz, észterifikált cellulóz acetil csoporttal (cellulóz-acetát, cellulózdiacetát,
cellulóz
triacetát),
észterifikált
cellulóz
anioncserélő
csoportokkal
(Hemophan), szintetikus szubsztituált cellulóz, etilvinil-alkohol polimerek (EVAL), poliakrinitril (PAN), polimetil-metakrilát (PMMA), poliamid, polikarbonát, poliszulfon. A kapillárisok típusánál a féligáteresztő hártya anyagát adják meg, mely általában csak néhány mikrométer vastagságú. A rendszer mechanikai stabilizálását más, kevésbé flexibilis, nagyobb pórusátmérőjű polimerrel (pl.: alacsony denzitású polietilén) végzik. A lap dializátor és a kapilláris dializátor mikro-szerkezetét a 3/3. ábra mutatja.
3/3. ábra: a: A lapdializátor szerkezeti felépítése.
A: távtartó műanyag lemez, B: dialízis membrán, C: vértér, D: víztér.
b: A kapilláris dializátor szerkezeti
felépítése. A: a kapilláris támasztó rétege, B: a dialízis membrán, C: vértér, D: víztér
A vértérrel közvetlenül a dializáló membrán érintkezik. Azonban olyan molekulák is bekerülhetnek a keringésbe, melyek a támasztó szerepet betöltő szerkezet felépítésében vesznek részt. Ennek feltétele, hogy átférjenek a membrán pórusain. A hemodializátor membrán és a beteg között a műanyag szerelékek teremtik meg a kapcsolatot, melyek PVC, PE, PP, PC, ABS alapanyagúak. Ezek összfelülete lényegesen kisebb, mint az aktív szerepet betöltő dialízis membráné.
21
3.6.3. Hemodializátor – szervezet kölcsönhatás Több közlemény foglalkozik a hemodialízis kapcsán létrejövő, a dialízis módszerével vagy a membránokkal közvetlenül, esetleg közvetve összefüggésbe hozható szövődményekkel. Ezek közé tartozik a membránok sterilizálására használt etilén-oxid [6] és a formalin [39] által okozott anafilaxiás reakció, a klóramin [90] és fluor intoxikáció [3], a különböző baktérium kontamináció okozta pirogén reakciók [68, 88], az AN-69 membrán és az ACE inhibitorok interakciója során létrejövő shock-szindróma [89]. Itt említjük meg a különböző membránok és dializáló oldatok használatakor megfigyelhető kardiopulmonális történések, a cellulóz membránok alkalmazása kapcsán jelentkező látásvesztés, piros szem szindróma, hipotenzió, eozinofil pulmonális infitrátum megjelenése. 2001-ben, több országban (Spanyolország, Horvátország, USA, Olaszország, Németország, Tajvan, Columbia) egymástól függetlenül megfigyeltek a hemodialízis kezelés alatt, vagy közvetlenül azt követően jelentkező, mellkasi fájdalommal, nehézlégzéssel, majd keringés összeomlással járó haláleseteket. A toxikológiai vizsgálatok a szerelékek gyártásakor az áteresztőképesség vizsgálatához használt perfluorohydrocarbon (PF5070) jelenlétét mutatták ki a tüdő kapillárisokból. A vizsgálat megállapította, hogy a rendszerből nem távolították el teljes egészében a tesztfolyadékot, így a normál testhőmérsékleten, alacsony oxigénnyomás mellett a vérrel emulziót képezhetett [11, 71]. A fent említett példákból jól látható, hogy a műanyag és a szervezet kölcsönhatása nem várt szövődmények egész sorát okozhatja.
3.6.4. Hemodialízis szövődményei A dializált betegekben létrejövő szövődményeket csoportosíthatjuk szervrendszerek és a kialakulás időpontja (heveny, krónikus) szerint. A szövődmények kis hányada köthető egyértelműen egy kiváltó patológiai tényezőhöz, többségük multifaktoriális, és csak részben tisztázott eredetű. A kialakult klinikai tünetek és az élettani paraméterekben mért kóros változások csak a beteg anamnézisének, alap- és kísérő betegségeinek pontos ismeretében hozhatóak összefüggésbe a hemodialízis kezeléssel [54, 69, 73, 95].
22
3.6.4.1. Heveny szövődmények A heveny szövődmények közvetlenül a dialízis megkezdése után, kezelés közben, vagy néhány perccel, akár órával a dialízis végét követően alakulnak ki. A heveny szövődmények közé sorolható a diszekvilibrium szindróma, hipotenzió, izomgörcsök, enkefalopátia , mellkasi- és derékfájdalom, viszketés, hidegrázás, anafilaktoid reakció (A típus – specifikus, B típus – nem specifikus), aritmiák, pericardialis folyadékgyülem, intrakraniális vérzések, hemolízis, légembólia, akut hipoxémia. Értekezésünkben kiemelendő a hipotenzió, az izomgörcs a B típusú anafilaktoid reakció, és az aritmiák, melyek kialakulásában szerepe lehet Tinuvin 770 korábban leírt Ca2+csatornákra kifejtett hatásának is. A hemodialízis heveny szövődményei közül 15-20%-os előfordulási gyakorisággal a hipotenzió első helyen áll [16, 72]. Klinikai tünetek a beteg átlag 30-50 Hgmm-el történő szisztolés vérnyomásesésekor alakulnak ki. Ilyenkor a betegeknél hányinger, hányás, szédülés, esetleg eszméletvesztés jelentkezik. A hipotenzió kialakulásáért a vérvolumen csökkenését (fokozott ultrafiltráció, vérzés, dializáló oldat alacsony nátrium tartalma), csökkent perifériás vasokonstrikciót (acetát tartalmú dializáló oldat, hőmérséklet emelkedés, szplanhnikus vazodilatáció, szöveti iszkémia, autonóm neuropátia, antihipertenzív gyógyszerek) és kardiális tényezőket (szív diasztólés funkciócsökkenése, béta-blokkolók, urémiás autonóm neuropátia, időskor, dilatatív kardiomiopátia, hipertenzió, miokardiális kalcifikáció, amiloidózis) tesznek felelőssé. Izomgörcs a betegek 5-10 %-ban jelentkezik. Hátterében a plazma volumen hirtelen csökkenését, hiponatrémiát, szöveti hipoxiát, hipomagneziát és karnitin hiányt írnak le. Mégis leggyakrabban hipotenzióval és hiponatrémiával együtt jelentkezik. Az anafilaktoid reakciók jelentős része ismeretlen etiológiájú. Szokták „first-use” szindrómaként is emlegetni. A B típusú, nem specifikus reakciók gyakorisága 3-5%. Izomgörccsel, derékfájdalommal, hipotenzióval járhat.
3.6.4.2. Krónikus szövődmények A hemodialízis kezelés krónikus szövődményei nehezen választhatóak el az urémiával járó általános klinikai tünetektől. Felsorolás szerűen a következők: anémia, osteodistrófia, pajzsmirigy diszfunkció, szekunder hiperparatireózis, hipertónia, bőrelváltozások, erozív gasztritisz, fekélybetegség, kardiovaszkuláris szövődmények.
23
A kardiovaszkuláris elváltozások közül a legfontosabbak: bal kamrai hipertrófia, ritmuszavarok (pitvarremegés, kamrai ritmuszavarok), iszkémiás szívbetegségek, intrakardiális meszesedés, szívelégtelenség (kardiomiopátia), perikarditis.
3.6.4.3. Hemodialízis membrán újrafelhasználás Külön megemlítendő a hemodializátorok újrafelhasználása (re-use), amikor a membránt nem csak egy alkalommal, hanem sterilizálást (formalin, perecetsav, glutáraldehid) követően többször is felhasználják a művese kezelésnél Klinikai jelentőségét az adja, hogy az újrasterilizált membránokkal végzett kezelés során a melléhatások aránya mérhetően magasabb. Olyan, nem specifikus klinikai tünetek előfordulása is megnő, mint a hidegrázás, láz, hányinger, hipotenzió. Pirogén reakció gyakorisága 4-5% és a szeptikémia is 28%-al gyakoribb, mint az egyszer használt dializátorok esetében [45, 58]. Értekezésünkben nagy jelentőséget tulajdonítunk korábbi megfigyelésünknek [81], mely szerint a resterilizálás folyamata alatt a kapillárisok belfelszíne az erős dezinficiáló oldatok és a mechanikai behatás nyomán megsérül. Az addig sima felszínen szkenning elektrinmikroszkópos felvételeken jól látható hosszanti barázdák jelennek meg, melyet a 3/4. ábra szemléltet.
a
b
3/4. ábra: a: Nem használt kapilláris dilaizátor belfelszíne sima. A: kapilláris, B:
beágyazó anyag (nagyítás 1000X). b: Újrasterilizált kapilláris dializátor belfelszíne. A: kapilláris B: beágyazó anyag, a nyilak az áramlás irányának megfelelően elhelyezkedő barázdákat jelölik (nagyítás: 1000X).
24
A véráramlás irányával párhuzamos barázdák jól azonosíthatóak transzmissziós elektronmikroszkópos felvételeken is (3/5. ábra).
a
b
3/5. ábra: a: Nem használt dializátor kapilláris keresztmetszeti képén a felület sima a
transzmissziós elektronmikroszkópos képen (nagyítás: 20000X) b: Újrasterilizált dializátor kapilláris keresztmetszeti képén a barázdáknak megfelelően nyíllal jelölve egyenetlenség látható (nagyítás: 20000X) A durva kémiai behatás nyomán a polimerben jellegzetes ultrastruktúrális változások jönnek létre. A morfológiai és kémiai vizsgálatok a műanyag szerkezeti változásai mellett kimutatták, hogy a felületen vér eredetű anyagok rakódhatnak le (3/6. ábra). Az átlagosan 7-8 alkalommal ismételt dialízis kezelés - újrasterilizálás ciklus egyértelműen kimutatható szerkezeti változásokat okoz a hemodializátor membránban. Az eljárás folyamán a dezinficiáló oldatok károsítják a membrán felszínét. Ezek, a kapilláris belső felületén diffúzan elhelyezkedő barázdák a „locus minoris resistencie”nek tekinthetőek, melyeken a vérből sejtes és nem sejtes elemek csapódnak ki részben az élettani hemosztatikus folyamatok, részben az újrasterilizáló eljárás eredménye képpen.
25
a
b
3/6. ábra: a: Hemodializátor kapilláris keresztmetszeti képe (nagyítás 300X), a
lerakódott fibrinszerű anyagot nyíllal jelöltük. b: lerakódott sejtes jellegű anyag (nagyítás 2000X) Az elváltozás számos klinikai tünet magyarázataként szolgálhat: csökkenő dialízis hatásfok, anafilaxiás reakciók magas aránya, pirogén reakció, infekciók arányának növekedése. A hemodialízis kapcsán kialakult szövődmények pontos leírása és etiológiájának tisztázása intenzív kutatás tárgyát képezi. Az egyik lehetséges irány a biokompatibilitás és a szervezet – membrán kölcsönhatásában kialakuló reakciók vizsgálata.
26
Az értekezés szerkezeti felépítése A Tinuvin 770-ről /bis(2,2,6,6-tetramethyl-piperidinyl)szebacainsav/ túlnyomóan kémiai valamint in vitro kísérletek eredményei állnak rendelkezésünkre. Az irodalomban fellelhető korábbi kutatások fő irányvonalát a Tinuvin 770 polimerkémiai és gyártástechnológiai kérdései határozták meg. A biológiai hatásairól csak kevés, speciális problematikával foglalkozó közlemény tesz említést. Kutatásaink során viszonylag kis számú irodalmi adatra építve alakítottuk ki a kísérleti tervünket. A „Célkitűzések” fejezetben leírt kérdésfelvetésekből kitűnik, hogy a Tinuvin 770 in vivo hatásainak pontos leírásához többféle, egymástól alapvetően eltérő módszert kellett alkalmaznunk. A kutatásainkban kémiai kimutatás, in vivo és in vitro toxikológiai vizsgálatok és hemodinamikai monitorizálás szerepel:
1. A Tinuvin 770 kémiai analíziséhez SPE és HPLC-MS módszer fejlesztése volt szükséges, melyben a módszer nem választható szét az eredményekkel tárgyalható validálási folyamattól. 2. Az izolált patkány szívizomsejten végzett kísérleteikben sejtkultúrát és ehhez kapcsolódó patomorfológiai vizsgálatokat alkalmaztuk a Tinuvin 770 in vitro toxikus hatásainak kimutatásához. 3. A Tinuvin 770 in vivo akut keringési hatásainak leírásához komplex hemodinamikai monitorizálást végeztünk kutya kísérletben. 4. A Tinuvin 770 krónikus toxikus hatását in vivo patkány modellen vizsgáltuk. A változásokat morfológiai módszerek segítségével írtuk le.
A fentiekből jól látható, hogy az egyes kísérletek egymásra épülnek, de önálló egységenként kezelhetőek. A különálló kísérletek módszereinek, eredményeinek és következtetéseinek együttes ismertetése jelentősen megnehezítené a szövegben való
27
tájékozódást, valamint zavaró lehetne a szerkezetileg egységesnek tűnő, de sokszorosan tagolt szöveg az olvasó számára. A szerkezetről azért láttam szükségesnek, hogy beszéljek, mert az értekezés egy jelentős része a polimerekre vonatkozó kémiai analízisre alapul, míg a további fejezetek ettől eltérően biológiai jellegű vizsgálatok, melyek zömében a kémiai eredményekre épülnek. Megítélésem szerint ezzel a felosztással válik a munka olvasmányossá és érthetővé. A jobb áttekinthetőség érdekében az értekezést a fent vázolt kísérletek szerinti felbontásban tárgyalom, megtartva az értekezés felépítésével szemben támasztott követelményeket
(bevezetés-módszer-eredmények-megbeszélés).
Az
értekezés
fejezeteiben egymásra hivatkozva jól érzékelhető azok kapcsolata és egymásra épülése. A keretet az összes fejezetre vonatkozó bevezetés, célkitűzések, összefoglalás, összefüggések humán kísérletes vizsgálatainkkal, irodalmi hivatkozások című fejezetek adják meg.
28
4. Célkitűzések Az értekezésben egy széles körben alkalmazott, a felhasználási területén kiváló tulajdonságokkal rendelkező, Ca2+ csatorna és acetil-kolin receptor blokkoló hatású műanyag adalékanyag, a Tinuvin 770 analitikai, in vitro és in vivo morfológiai, valamint hemodinamikai vizsgálatával foglalkozunk. 1.
A műanyag – szervezet kölcsönhatás alapmodelljéül a magas kontaminációs lehetőség (nagy felület, hosszú kezelési időtartam), és bizonyos klinikai tünetek (hipotenzió, izomgörcs, anafilaktoid reakció) jelenléte miatt a művese kezelést választottuk. Célunk egy olyan korszerű, nagy érzékenységű analitikai módszer kidolgozása volt, mely képes a dializátor membrán esetleges Tinuvin 770 tartalmának kimutatására. Az eljárással szemben támasztott követelményeink közé tartozott a kvalitatív meghatározás mellett a kvantitatív analitikai eljárás kifejlesztése.
2.
Az irodalmi adatok alapján a Tiuvin 770 in vitro kifejezett Ca2+csatorna és acetilkolin receptor blokkoló hatással rendelkezik. Ennek ismeretében terveztük a Tinuvin 770 patomorfológiai vizsgálatihoz kísérleti modell felépítését. Célunk a Tinuvin 770 direkt kardiopatogén hatásának vizsgálata izolált szívizomsejteken, melyben a szívizomsejtekre kifejtett hatás szelektíven tanulmányozható a humorális
és
egyéb
szisztémás
(neuronális
szabályozás
–
acetil-kolin
neurotranszmisszió) hatás kiiktatása mellett. 3.
Az in vitro erős Ca2+csatorna blokkoló képessége alapján feltételezhető volt, hogy Tinuvin 770 rendelkezhet kardiovaszkuláris hatással. Célunk egy olyan in vivo állatkísérletes modell felépítése volt, mely alkalmas a Tinuvin 770 heveny hemodinamikai hatásainak leírására.
4.
A hemodinamikai vizsgálatok igazolták, hogy a Tinuvin 770 in vivo is kifejezetten hatékony Ca2+csatorna blokkoló (erős vazodilatátor, és negatív kronotróp hatású). Célunk egy olyan állatkísérletes modell kialakítása volt, melyben in vivo tanulmányozhatóak a Tinuvin 770 krónikus kardiotoxikus hatásai.
29
5. Tinuvin 770 analitikai vizsgálata 5.1 Bevezetés Az irodalom áttekintése alapján valószínűsíthető, hogy a művese kezelésnél alkalmazott műanyag rendszerben Tinuvin 770 található [31, 47, 55]. Erre enged következtetni a dialízis szerelékek gyártásakor felhasznált polimerek típusa, valamit a felhasználás során velük szemben támasztott speciális követelmények is. Ez utóbbival kapcsolatban kiemelnék azt a korábban már ismertetett adatot, hogy a vékony filmek, fóliák, szálak fénystabilizálására kimondottan alkalmas a Tinuvin 770 [64]. A dializátor membránok felépítése – akár lap- akár kapilláris dialízátorról beszélünk – megköveteli, hogy kis rétegvastagságú, ellenálló, nagy szakítószilárdságú polimereket alkalmazzanak [37]. A kromatográfiás eljárások, ezen belül a HPLC (high performance liqid, chromatography) széles körben alkalmazott műanyag alkotórész vizsgálatában [10, 74]. A módszer kvalitatív és kvantitatív kimutatást is lehetővé tesz. A kísérleteink célja az volt, hogy egy olyan analitikai eljárást dolgozzunk ki, mellyel a hemodializátor membránok Tinuvin 770 tartalmát bizonyítsuk, vagy elvessük. Ehhez ki kellett fejlesztenünk egy szilárd fázisú extrakción alapuló minta izolációs módszert valamint egy megfelelő érzékenységű kimutatási eljárást.
5.2 Módszerek 5.2.1 Kémiai anyagok, reagensek Az oldószereket, kémiai anyagokat és reagenseket kereskedelmi forgalomból szereztük be az elérhető legmagasabb tisztaságban. A HPLC tisztaságú vizet és acetonitrilt a Riedel de Haen-től (Seelze, Németország), az ammonium acetátot és ammónia oldatot a Reanaltól (Budapest, Magyarország), a sósavat a Carlo Erba-tól (Rodani, Olaszország) és a 0.09%-os nátrium-klorid oldatot (Salson) a Humán Gyógyszergyár Rt-től (Gödöllő, Magyarország)
rendeltünk.
A
Tinuvin
770-t
/bis(2,2,6,6-teramethyl-4-
piperidinyl)sebacate, molekula súlya : 408,73) a Ciba-Geigy Konszerntől (Basel, Svájc) szereztük be.
30
5.2.2 HPLC rendszer Kísérletünkben Shimadzu HPLC készüléket alkalmaztunk. A rendszer a következő elemekből épült fel: duál pumpa (LC-10ADVP), oszlop termosztát (CTO-10ASVP), gáztalanító (DGU-14A), rendszer kontroll panel (SCL-10AVP), és tömeg spektrométer (LCMS-2010). A mért adatokat Compaq (Dskpro) számítógépben tároltuk és értékeltük ki Labsolution LCMS program (Shimadzu, Japán) felhasználásával.
5.2.3 Minta előkészítés HPLC analízishez Kísérleteinkben négyféle hemodialízis membránt vizsgáltunk. A tanulmányozott patronok kereskedelmi forgalomban elérhetőek. Az alapanyagok következők voltak: polisulfon (UF 5.5, kapilláris dializátor, Fresenius Medical Care, Bad Homburg, Németország), kuprofán (Lundia Alfa lapdializátor, Gambro, Lund, Svédország), és kétféle hemofán (Lundia Aria, lapdializátor, Gambro, Lund, Svédország; Hospal HG 600 kapilláris dializátor, Gambro-Hospal, Lund, Svédország). Tekintettel arra, hogy a művese kezelés alatt a patronon átáramló vér a membrán anyagával érintkezik legnagyobb felületen, ezért a dializátor házat és a záró réteget képező beágyazó anyagot eltávolítottuk. A dializátor sematikus szerkezeti ábráját illetően utalunk az előző fejezet 3/1 és 3/2 ábrájára. (Megjegyzés: ugyan keringéssel közvetlen kapcsolatba kerül a dilazátor ház, és a beágyazó anyag is, de elhanyagolhatóan kis felületen. Későbbiekben ezek szelektív vizsgálatát is tervezzük) A dializátorból így a membrán hozzáférhetővé vált. Mindegyik membránból 4 grammot áztattunk 72 órán keresztül 100 ml 0,9%-os nátrium-klorid oldatban. Ezt követően szolid fázisú extrakciót alkalmaztunk a Tinuvin 770 izolálásához. Az izolálást 50 ml mennyiségű oldatból végeztük Waters Oasis MCX 3 ml-es (60mg) SPE oszloppal. Az oszlopok 2 ml metanollal kondicionáltuk és 2 ml desztillált vízzel ekvilibráltuk. A mintákat az oszlopokra ráengedve 2 ml 0.1M HCl-al fixáltuk, 2 ml metanollal mostuk, majd 3 ml metanol és 1 ml NH4OH-dal (25%) oldottuk le. Az eluátumot szobahőmérsékleten nitrogénnel bepároltuk, majd 1 ml metanolban visszaoldottuk. A kapott oldatból 20 µl mennyiséget injektáltunk a HPLC rendszerbe.
31
5.2.4 Kromatográfiás mérési paraméterek A kromatográfiás elválasztást 125 mm x 2 mm i.d. Superspher® 60 RP-select B oszlopon (Merck, Darmstadt, Németország) végeztük. A mobil fázis 20:80 (ν/ν) arányban volt keveréke pufferolt ammonium-acetátnak (pH 4,05) és acetonitrilnek. Az áramlási sebesség 0,3 ml/perc volt. Az LC-MS rendszert pozitív inonizációs módban használtuk és figyeltük a protonált molekuláris iont (m/z 481). 5/1. ábra szemlélteti a Tinuvin HPLC-MS kromatogrammját és MS spektrumát. A méréshez és a rendszer alkalmassági teszt elvégzéséhez szükséges idő 12 perc volt. 5/1. ábra: Tinuvin 770 minta vizsgálata HPLC-MS-sel.
a: MS Kromatogramm
32
b: MS Spektrum:
5.3 Eredmények 5.3.1 Specificitás A szilárd fázisú extrakció, melyet korábban ismertettünk a Tinuvin 770 kitűnő elválasztását eredményezte. A negatív kontrollban, ahol HPLC tisztaságú vizet és fiziológiás sóoldatot injektáltunk a rendszerbe, Tinuvin 770-nek megfelelő csúcsot nem detektáltunk (5/2. ábra).
5/2. ábra: Fiziológiás sóoldat esetén a Tinuvin 770-nel interferáló csúcsot sem a TIC,
sem a specifikus ionok (m/z 481, 282 illetve 262) detektálása nem muatott.
33
A megadott mérési feltételek mellett mind a pozitív kontrollban (5/3. ábra), mind a vizsgálat mintákban (5/4. ábra) egyértelmű HPLC-MS csúcs volt detektálható a Tinuvin 770 fajlagos tömegének megfelelően.
5/3. ábra: A standard Tinuvin 770 tartalmú minta MS kromatogrammja. A 0,9% NaCl
tartalmú vizes oldat Tinuvin 770-el van spike-olva (1µg/ml) A detektálás során a TIC és a specifikus ionok (m/e 481, 282, illetve 262) kimutatását végeztük el.
5/4. ábra: A cuprofán alapanyagú membrán mosóoldatának MS kromatogrammja SPE-t
követően. Az ábrán jól látható a Tinuvin 770-t jellemző csúcs mind a TIC, mind pedig a specifikus ionok (m/e 481, 282, illetve 262) detektálásával.
34
A csúcs jól meghatározható és szimmetrikus volt, reprodukálható retenciós idővel. A kapott HPLC kromatogram lehetővé teszi a Tinuvin 770 mintáinkból történő kvalitatív és kvantitatív analízisét is (5/I Táblázat). A kvalitativ eredmények alapján mind a négy vizsgált mintában kimutatható volt a Tinuvin 770 jelenléte. Membrán típusa
ng/g
Polysulphon
484 ± 7,3
Curophan
73,3 ± 1,2
Hemophan, HG
37,3 ± 0,7
Hemophan, Lundia
31,0 ± 0,6
5/I Táblázat: A Tinuvin 770 koncentráció a mintában 72 órás fiziológiás sóoldattal
történt áztatást követően. A mérést HPLC-MS módszerrel végeztük (mintánként n=3). A kvantitaív analízis egyértelművé tette, hogy a vizsgált membránokban detektálható és mennyiségileg mérhető a Tinuvin 770 jelenléte. A legnagyobb mennyiségben a poliszulfon alapanyagú membránból oldódik ki, a legkisebb mennyiséget pedig a hemofán lap dializátorban tudtunk mérni.
5.3.2 Linearitás A linearitás validáláshoz ismert mennyiségű Tinuvin 770-t tartalmazó mintákat (4 ng, 40 ng, 400 ng) injektáltunk. A mennyiségi meghatározáshoz a HPLC kromatogram csúcsainak görbe alatti területét mértük le. Az eredmény jó linearitást (r2 ≥ 0.9985) mutatott széles koncentráció tartományban (5/5. ábra).
35
35000 y = 73,915x - 443,18 R2 = 0,9984
30000 25000
Terület
20000 15000 10000 5000 0 0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
-5000
injektált mennyiség
5/5. ábra: A linearitást a regressziós egyenes felvételével vizsgáltuk
5.3.3 Ismételhetőség A kromatográfiás pontosságot a standard minta (40 ng Tinuvin 770 tartalmú oldat) ötször ismételt mérésével ellenőriztük egy napon belül végezve a méréseket (intra day measurement). A minták injektálását követően azonos retenciós időket (tR) mértünk (p ≤ 0,05).
5.3.4 Megbízhatóság Az extrakciós hatásfokot különböző koncentrációjú hatóanyaggal (Tinuvin 770) jelzett minták mérésével értékeltük. A visszanyert hatóanyag mennyiség 91.6 ± 1.8 % (mean ± SD). A regressziós egyenes meredeksége a kalibrációs görbéhez hasonló.
5.3.5 Kimutatási és a mennyiségi meghatározás határa Meghatároztuk a kimutatási határt (LOD) és a mennyiségi meghatározás határát (LOQ). A DL 1 ng/ml, a QL 10 ng/ml volt. A eredmények alapján a módszer kifejezetten érzékenynek tekinthető.
36
5.4 Az eredmények megbeszélése Kísérleteink során olyan kromatográfiás eljárást fejlesztettünk ki, mely alkalmas a Tinuvin 770 kimutatására vizes oldatokból [83]. A módszer szilárd fázisú extrakción, HPLC elválasztáson és tömegspektrográfiás detektáláson alapul. Eredményeink alapján összegezhető, hogy a módszer kellően specifikus, szenzitív, megbízható és pontos az általunk vizsgált műanyag adalékanyag a Tinuvin 770 vizes oldatokból történő kimutatására. Vizsgálatainkkal egyértelműen igazoltuk, hogy a Tinuvin 770 megtalálható a dialízis membránokban. Az egyes membránok között jelentős különbség van a kioldható Tinuvin 770 mennyiségét tekintve. Ennek oka nem kizárólag a műanyag tejes Tinuvin 770 tartalma lehet. A kioldódó mennyiséget jelentősen befolyásolhatja a polimerek és egyéb műanyag adalékanyagok kémiai tulajdonsága is. A módszert egyszerűsége és reprodukálhatósága alkalmassá teszi mind minőségi, mind mennyiségi toxikológiai és farmakológiai vizsgálatokban való felhasználásra. Általános toxikológiai kontroll megfontolandó lehet olyan műanyagoknál, melyeket az orvosi gyakorlatban vagy az élelmiszeriparban használnak. Ugyan vizsgálatainkban alkalmazott fiziológiás sóoldat bizonyos értelemben tekinthető plazmaszerű oldatnak, mely képes a Tinuvin 770-t a membránból kioldani, mégis szükséges további kísérletek elvégzése plazma oldási tulajdonságainak feltérképezése céljából. A folyamatban lévő vizsgálataink célja, hogy a kifejlesztett analitikai eljárás alkalmas legyen a Tinivin 770 bonyolult biológiai mátrixokból (vér, plazma, vizelet) történő kimutatására is. További kutatásunk célja kettős: igazolnunk kell, hogy a plazma a fiziológiás sóoldathoz hasonlóan képes Tinuvin 770-t kioldani a dialízis membránból, valamint dializált betegek véréből meg kell határoznunk a Tinuvin 770 terhelés mértékét. Csak ezen adatok pontos ismeretében vonhatunk egyértelmű párhuzamot a kialakuló dialízis szövődmények és a Tinuvin 770 ismert kórélettani hatásai között.
37
6. Tinuvin 770 hatása izolált szívizomsejt modellen in vitro 6.1 Bevezetés A szívizom-kutatás egyik jelentős módszertani eredménye, hogy a szívizomsejtek szinciciális kapcsolata enzimatikus úton szétválasztható. Az így elkülönült sejtek morfológiai, biokémiai és fiziológiai tulajdonságai az in vivo körülmények között megfigyeltektől lényegesen nem térnek el. A szívizomsejt-izolálás módszertanát, eredményét és tudományos jelentőségét kitűnő összefoglaló munkák ismertetik [18, 34, 36, 40, 44, 66, 86]. Az izolált szívizomsejteken kiválóan tanulmányozhatóak olyan alapvető kérdések, mint az ionösszetétel, a hőmérséklet, az oxigenizációs idő változásának szerepe a sejtkárosodásban [2, 60, 64] a szívizomsejt ionáramainak jellemzése [51, 52], az ioncsatornák elektrofiziológiai és farmakológiai tulajdonságai [93]. Az izolált szívizomsejt modell kedvező feltételeket biztosít többek között a gyógyszerek, kémiai anyagok közvetlen sejthatásának tanulmányozására, pontos behatárolt dózis és időértékek mellett. Az in vivo körülmények között, a közvetlen Tinuvin-770 hatással összefüggő kísérletes toxikológiai vizsgálatokat neurális és hormonális tényezők is befolyásolják. Az izolált szívizomsejtek ezektől a hatásoktól mentesek, a modellen a dózis és időfüggő hatások követése és a közvetlen sejteffektus elemzése pontosan behatárolt dózisértékek mellett történhet meg.
6.2 Módszerek 6.2.1 Általános beavatkozások A vizsgálatokat Sprague-Dawley típusú patkány (200-300 g) szívből izolált bal kamrai szívizomsejteken végeztük. A szívizomsejteket 19 állat felhasználásával nyertük. A kontroll csoportban négy, a kísérleti csoportba öt-öt állatot alkalmazva. Az állatokat éter narkózissal altattuk el, majd fiziológiás konyhasó-oldatban oldott 50 IU/testsúlygramm Heparint adtunk. A narkózis mélységét szükség esetén kisebb dózisok adásával tartottuk fenn. A mellkast a bal oldali. IV-V. bordaközben megnyitottuk.
38
A szívburkot a nervus phrenicus mentén hosszában felvágtuk, majd az érképleteket aláöltöttük, a szívet eltávolítottuk, és azonnal perfúziós rendszerre helyeztük (HögbergKristoferson, LKB, Bromma, Svédország), amelyen a hőmérséklet, az oldatáramlás sebessége a nyomásértékek szabályozhatók. A perfúzió 95 Hgmm víznyomásérték mellett Tyrode (pH = 7,4) oldattal történ, amelyet 95 % O2, 5 % CO2, gázkeverékkel folyamatosan buborékoltattunk át. A készítményt 10 perces perfúzió és stabilizálás után Rajs és munkatársai módszere [66] szerint (6/1. ábra) a fenti perfúziós nyomásérték összetétele: 10 mg/ml High purity collagenase (Type VII. Sigma), 21 mg/ml NaHCO3 (25 mM) pH 7,4 Tyrode oldatban – 30 percig 10 ml/min sebességgel áramoltattunk át.
6/1.
ábra:
A
patkányszív
perfúziós rendszerének sematikus ábrázolása (Rajs szerint).
A rendszerről levett szívet Tyrode (pH = 7,4) oldatba helyeztük, amely 2 % marhaszérumot, 5 mM piruvátot és 10 mM glukózt tartalmazott, folyamatos 95 % O2 és 5 % CO2 gázkeverék átáramoltatása mellett. A szívet sztereomikroszkóp alatt pitvari és kamrai falrészekre szétválasztottuk, majd kivettük a bal kamra elülső papilláris izmát és a kapcsolódó szubendokardiális területet.
39
6/2. ábra: Szívizom részlet, melyet emésztési
folyamatnak vetetünk alá. A sejtek a kezelés hatására elváltak egymástól, és így különálló miocitákból álló szuszpenzió jön létre.
A szívizomfal-részleteket (6/2. ábra) 350 mesh lyukátmérőjű hálón 95 % O2 5 % CO2 gázkeverékkel buborékoltatott Tyrode (pH = 7,4) oldatba szűrtük, amely 10,0 mM glukózt, illetve a plazmaszintnek megfelelő mennyiségben és összetételben 20 aminosavat tartalmazott (AB Leo Rhodia, Helsinborg, Svédország). A Tyrode oldat összetétele: 125,0 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 1,0 mM CaCl2, 25,0 mM HEPES: pH-ja 7,4. A sejtszuszpenziót Rajs szerint standardizáltuk [66], mely 45±3x106 szívizomsejtet tartalmazott (106 sejt/ml). Az inkubációs oldat 0,25 x 106/ml töménységű szívizomsejtet, 10 mM glukózt, plazmaszintnek megfelelő 20 aminosavat foglalt magában, Tyrode (pH = 7,4) oldatban, folyamatos 95 % O2 és 5 % CO2 gázkeverékkel történő perfúzió mellett. Az inkubációs oldat 5 nM/ml koncentrációban (≈ 2,4 µg / ml) Tinuvin-770 (CibaGeigy)-t tartalmazott. A 25 nM Tinuvin 770-t 5 ml 0.9 %-os nátrium-kloridban oldottuk. A kontroll csoportban 5 ml 0,9%-os nátrium-klorid oldatot alkalmaztunk Az inkubációs idő 0, 30, 60 és 120 perc szobahőmérsékleten. A Tinuvin 770 dózisát önkényesen a korábbi in vitro patch clamp kísérletekben leírt dózisok alapján állapítottuk meg. A Tinuvin 770 sejtkultúrán történt alkalmazására irodalmi utalást nem találtunk.
40
6.2.2 Morfológiai módszerek 6.2.2.1 Fénymikroszkópia Az izolált sejtek típusának és minőségének meghatározása Rajs módszerével (sejtszuszpenzió+tripán-kék 1:1 arányú oldata, 0,33 mg/ml tripán-kék oldása KrebsHenseleit, pH = 7,4 pufferben) történt. A sejtszám és típus vizsgálatát 0,1 ml sejtszuszpenzióból Bürker-kamrában, fáziskontraszt mikroszkóp alatt, 300 sejt leszámolásával végeztük. Az izolátumot formaldehid rögzítés (4 %-os formaldehid pH = 7,4, 0,1 M kakodilát pufferben) parafin beágyazás után, HE, PTAH és Azan festésekkel vizsgáltuk, illetve fáziskontraszt mikroszkóp alatt (JenaMed, Carl Zeiss, Jena, Németország) tanulmányoztuk.
6.2.2.2 Elektronmikroszkópia A szívizomsejteket 2,0 %-os glutáraldehidben (pH = 7,2; 0,1 M kakodilát pufferben) 5 percig 200 g-vel centrifugáltuk, majd a centrifugátumot 30 percig továbbrögzítettük. A 3 x 5 perces mosást pufferben, 200 g-vel további 4 perces centrifugálás és 1,0 %-os ozmium-tetroxidban (pH = 7,2; 0,1 M kakodilát pufferben) utánrögzítés követte. A sejtszuszpenziót felszálló alkohol sorban propilén-oxid intermédiumon keresztül Aralditba
(Durcupan
ACM.
Fluka)
ágyaztuk.
Az
ultravékony
metszetek
kontrasztozásához az uranil-acetát ólom citrát félvékony metszetek festéséhez, toluidinkék és metilénkék-Azur-A-II módszereket használtunk [66].
6.2.3 Biokémiai módszerek A sejt ATP és CP koncentrációját Bergmeyer szerint [5] határoztuk meg. A csoportonkénti 10 mérési eredményt Student-féle egy- és kétmintás t-teszt segítségével statisztikailag elemeztük. Az eredményeket a Wilcoxon próba segítségével ellenőriztük. A szórási értékeket a táblázatban nem tüntettük fel.
41
6.2.4 Citokémiai módszerek A kalcium kimutatása a Komnick által módosított [43] Carasso-Faward ammóniumoxalátos és ólomacetátos módszerét [12] alkalmaztuk. A metszeteket szemikvantitaív módon éretékeltük ki. Állatkísérletünk etikai engedélyének száma: Semmelweis Egyetem TUKEB: 59/2001.
6.3 Eredmények 6.3.1 Kontroll csoport Az I. csoport 0,9 %-os NaCl oldattal kezelt, kontroll sejteket tartalmazó szuszpenzió. A pálcika alakú és szívizomsejtek száma elérti a 98 %-ot, ritmusosan, percenként 40-50 kontrakciót végeznek, tripan-kéket nem vesznek fel. A sejtek zöme 100-150 µm hosszú, és 25-35 µm szélességű. A harántcsíkolat, a szarkolemmamembrán és az interkaláris diszkusz élesen kirajzolódik (6/3. ábra).
6/3. ábra: Kontroll szívizomsejt izolátum a: félvékony metszet (240x), b: elektromikroszkópos felvétel (7200x).
42
Az elektronmikroszkópos felvételeken a szarkomerek étmérője 1,5-2,5 µm között változik. A Z-, I-, M- és az A-csíkok, az aktin és miozin filamentumok jól kirajzolódnak, elkülöníthetők, elrendeződésük szabályos. A mitokondriumok külső és belső membránszerkezete megtartott. A szívizomsejt-izolátum magas energiatartalmú foszfát értékei: CP: 8,5±1,2 µmol/gww, ATP: 6,0±0,75 µmol/gww.
6.3.2 30 perces inkubáció A II. csoport, melyben 30 perces Tinuvin 770 inkubációt végeztünk. A sejtek pálcika alakúak, az izolátum 92 %-át ez a sejttípus alkotja. A sejtek kontraháltak, rövidebbek (90-120 µm) és az éphez viszonyítva szélesebbek (45-50 µm), az összehúzódásuk ritmusos, percenként 30-40. A fény- és elektronmikroszkópos elemzések alapján a sejtek szerkezetére jellemző, hogy a tubuláris rendszer tág, az izomrostok kontraháltak (6/4. ábra).
6/4. ábra: 30 perces inkubáció után a megtartott szerkezet mellett, kontrahált
miofilamentumok
(nyíl)
láthatóak,
a:
elektronmikroszkópos metszet (11500x).
43
félvékony
metszet
(420x),
b:
Az úgynevezett mikrohólyag (microbelb) kialakulása citoszkeleton diszrupciójára utal. Ez az elváltozás akkor jön létre, amikor a hiperkontrakció nyomán a sejt belső nyomása jelentősen megnő. Sejtek a tripán-kéket közel 50 %-ban veszik fel, mely a plazma membrán károsodásának jele. A CP és ATP koncentráció 5,2±0,50 és 4,5±0,32 µmol/gww, csökkenő tendenciát mutat, (p<0,002), mely összefüggést mutat a sejtkárosodás hatására létrejött citoszolikus enzim kiáramlással.
6.3.3 60 perces inkubáció A III. csoport, melyben 60 perces Tinuvin 770 inkubációt végeztünk. Az izolátum 90 %-át pálcika alakú sejttípus alkotja, melyek rövidebbek (85-100 µm ) és szélesebbek (80-90 µm), zömében kontraháltak. A hiperkontrakcióban lévő sejtek aránya eléri az 50%-nél magasabb.
6/5.
ábra:
60
perces
inkubáció
után
kontrahált
izomsejt,
szarkolemma
kitüremkedésekkel, melyek sejtalkotókat tartalmaznak (nyilak). elektronmikroszkópos felvétel (12000x).
44
A működő sejtekben a ritmusos sejtösszehúzódás percenként 30-40. A széli részeken fibrilláció is előfordul. A sejtek több, mint 60% a tripán-kéket felveszi. Az elektronmikroszkópos felvételeken kontrahált izomsejt-szerkezet látható (6/5. ábra). A miofibrillumok nem párhuzamosak, néhány területen a Z csík elmosódottabb. A mitokondriumok külső és belső membránszerkezete megtartott, denzitásuk fokozott. Az ID és a szarkolemma extracelluláris felszínén nagyobb átmérőjű mikrohólyagok jelennek meg, melyek sejtalkotó részeket, vagy azok maradványait tartalmazzák. A CP és ATP koncentráció jelentősen csökken, 1,8±0,08 µm/gww és 2,5±0,08 µm/gww protein, (p<0,002).
6.3.4 120 perces inkubáció A IV. csoportban 120 perces Tinuvin 770 inkubáció után markáns szerkezeti és működésbeli változások alakulnak ki. Az izolátum 80%-át hiperkontrahált, 60%-ban gömb-alakzathoz hasonlító szívizomsejt-típusok alkotják. A jellegzetes szarkomer formát erős denzitású, kötegszerű, vagy egyneműen homogenizált harántcsíkolat megjelenése váltja fel. A hiperkontrakciós csíkok mellett a filamentumok szétszakadása is bekövetkezik (6/6. ábra). A szarkolemma membránon hólyagszerű képletek, majd folytonossághiányok jelennek meg. A mikrohólyagok (10-30 µm átmérő) a szarkolemmamembrán kitüremléseinek felelnek meg, amelyben egyneműen festődő, finom denzitású anyag és különböző sejtalkotókat tartalmazhatnak, és a felszínről leválhatnak. A magas energiatartalmú foszfátok, CP: 0,7±0,1 µmol/gww, az ATP: 0,6±0,11 µmol/gww erőteljes csökkenést mutatnak, a kiindulási értékhez képes alig mérhetőek (p<0,002). A sejtek tripán-kék felvétele erőteljes.
45
6/6. ábra: Hiperkontrahált, szerkezetében felbomlott szívizomsejt, amelynek felületén
nagy számú hólyagszerű kitüremkedés, illetve annak letszakadt formája látható. A sejtalkotók a hólyagszerű képletekben, vagy az egyneműen homogenizálódott szívizomsejt környezetében láthatók (nyilak), a: félvékony metszet (180x), b: elektronmikroszkópos felvételek (8600x), c: elektronmikroszkópos felvételek (8600x), a citoplazmatikus hólyagok nyíllal jelölve. A citokémiai reakció 30 perces Tinuvin 770 inkubáció után a citoplazma Ca2+-tartalma a kontrollhoz viszonyítva csökken, majd 60 perces inkubáció már fokozott intracitoplazmatikus felhalmozódást mutat, ami 120 perces inkubációnál már jellegzetesnek mondható (6/7.-8. ábra).
46
6/7 ábra: Ca2+ a reakció kontroll szívizmon a szarkolemma membránon és a tubuláris
rendszerre lokalizálódik (nyilak). A mitokondriumokban és a miofilamentumokon finom eloszlású csapadék látható, a: fénymikroszkópos felvétel (190x), b: elektronmikroszkópos felvétel (11000x), ólomacetátos reakció.
6/8 ábra: 120 perces inkubáció után erőteljes Ca2+ felhalmozódás a károsodott
mitokondriumokban
és
a
homogenizált
miofilamentumokon
(nyilak),
a:
fénymikroszkópos felvétel (190x), b: elektronmikroszkóos felvétel (12800x), ólomacetátos reakció.
47
A sejtmembrán intergritását tripán-kék festéssel vizsgáltunk, ennek változásait a 6/9. ábra foglalja össze.
6/9. ábra: A tripán kék felvétel a: 30 perces inkubáció után nem figyelhető meg, b: 60
perces inkubációt követően intracellulárisan megjelenik (nyíl), c: 120 perces inkubációs időnél erőteljes felhalmozódás látható (nyilak) fáziskontraszt mikroszkópos felvételek (580x).
6.4 Az eredmények megbeszélése A Tinuvin 770 szerkezetében a piperidinyl és a kapcsolódó szebacainsav komponensnek van a kémiai hatásban meghatározó szerepe. A vegyület erősen lipidoldékony, bázikus (pH 9,2-9,6) kémhatású, alacsony molekulasúlyú ultraibolyafényt erősen abszorbeáló tulajdonságú. A műanyagiparban felhasználásra kerülő más vegyületek, elsősorban a ftalát észterei és származékai, a – di-2-ethyl-hexylphtalat (DEHP) és a di-n-butylphtalat (DBP) –, mint lágyító és stabilizáló, szívizomsejt kultúrához adva a szívizomsejtek nekrózisát hozza létre [92], feltételezésük szerint a kémiai anyag a sejtmembránon keresztül jutva mitokondrium membránkárosodást hoz létre [53]. Ennek okán indulna meg a szívizom anyagcsere állapotának felborulása, a sejtkárosodás folyamata. Összességében csekély számú irodalmi hivatkozás ismeretes, amely, más műanyaglágyítók, illetve a dializáló eszközökből
kioldódó ftalátok
szövetkárosító,
illetve
kardiotoxikus
hatásával
foglalkozik [4, 8, 30, 35, 70, 80, 82, 83, 84]. A ftalát-észter kalcium antagonista szerű farmakológiai tulajdonságát írták le [8]. A vizsgálataikban csatorna specificitását és szövetszelektivitást nem tudták meghatározni. Ismert, hogy a Tinuvin 770 L típusú Ca2+-csatorna blokkoló, és különböző affinitással kötődik a fenilalkilamin, benzotiazepin és dihidropiridin kötőhelyéhez [31]. A Tinuvin
48
770 további tulajdonságait vizsgálók munkahipotézisként vetették fel annak lehetőségét, hogy a kalciumcsatorna blokkoló az α1 alegység oldalán kapcsolódna a csatornához [31, 87]. Ez egyértelműen nem nyert bizonyítást. A kalcium antagonisták szelektíven gátolják a Ca2+ sejtekbe való beáramlását ezzel befolyásolva a sejtmembrán különböző típusú Ca2+ csatornáinak működését. Az elmúlt években jelentős előrelépés történt a kalciumcsatornák szerkezete és molekuláris biológiai tulajdonságainak megismerése terén [79]. A Ca2+ csatornák fehérje összetételük alapján egy heterogén rendszert alkotnak. A legfontosabb tulajdonságukat alapvetően az úgynevezett α1 alegység adja meg [38, 57]. A klinikai gyakorlatban alkalmazott Ca2+ csatorna blokkolók ehhez a fehérjéhez kapcsolódnak. A három legjelentősebb
Ca2+
antagonista
csoport
–
fenilakilaminok,
benzotiazepinek,
dihidropiridinek – kötőhelye egyaránt az α1 alegységen van, de vizsgálati adatok utalnak arra, hogy lehetséges a kötődés bizonyos csatornablokkolók esetében más alegységhez is [38, 96]. A dihidropiridin vegyületek között – Bay K 8644 – ismertek csatornaserkentő, majd gátló hatással egyaránt rendelkező vegyületek [24, 38]. Alapvető kérdés, hogy L-típusú Ca2+ csatornablokkoló Tinuvin 770 milyen mechanizmussal hoz létre sejtkárosodást. A folyamat magyarázata az ismereti eredmények alapján meghatározóan elméleti lehet, bár összehasonlítva azokat a Ca2+ túlterhelés vagy hiány következtében létrejövő elváltozásokkal, majd megalapozottnak látszó patomechanizmus kiválasztásával, a megoldás irányába mutató kutatások irányvonala megtervezhető. A morfológiai vizsgálatok a koncentráció függvényében mutatták az izolált szívizomsejtek elváltozásait, a kiindulási 0 perces inkubáció állapotához – kontroll – viszonyítva. A jellegzetesnek mondható elváltozások 60 és 120 perces Tinuvin 770 inkubáció után jelennek meg. A szívizomsejt CP és ATP készlete csökken, ezzel egyidejűleg kialakul a kontrahált, majd hiperkontrahált állapot. Az általános anyagcserezavarral tehát együtt jár a szívizomsejt morfológiai módszerekkel is követhető elváltozása. A tripán-kék felvétel, kontrollhoz viszonyított változása a sejtmembrán károsodásának jeleként is értékelhető. A citokémiai kalcium kimutatási módszer szelektivitását és specificitását kellő kritikával kell kezelni, de viszonyítva a kontroll képhez azt a következtetést engedi meg levonni, hogy 30 perces inkubálás után érdemlegesen csökken a szívizomsejt citokémiai módszerrel kimutatható Ca2+ mennyisége. Ez az eredmény megerősítette azokat a
49
fiziológiai vizsgálatokat, melyek egyértelművé tették, hogy a Timuvin 770 L-típusú Ca2+ csatorna gátló. A 30 perces Tinuvin 770 inkubációnál a citoplazma és az organellumok Ca2+-t a kontrollhoz viszonyítva alig tartalmaztak, azonban a 60, majd a 120 perces Tinuvin 770 inkubációt követően jelentős divalens kation felhalmozódás történt, ami megmagyarázhatja a sejt Ca2+ elárasztását, és a következményes hiperkontrakciós sejtelhalást is. A kialakuló morfológiai és biokémiai változásokat illetően, részben már érdemi magyarázatokba bocsátkozhatunk. A Tinuvin 770 L típusú Ca2+ csatorna blokkoló hatása mellett zsíroldékonyságának megfelelően a sejtmembrán lipidrétegébe juthat. A hosszabb inkubációs idő függvényében a receptor telítődik, de ezzel egyidejűleg a sejtmembránban felhalmozódik [24, 38]. A Ca2+ csatorna blokkolásának tényét követni lehet a citokémiai módszerrel, majd ez a hatás részben vagy teljesen megszűnik és a sejt Ca2+ elárasztása, illetve tripán-kék felvétele megkezdődik, majd kialakul a szívizomsejt ion-homeosztázisának zavara, adenozin-trifoszfát és kreatin-foszfát vesztése és a struktúra irreverzibilis károsodása. Ismeretesek
olyan
lipidoldékony
kémiai
és
gyógyszer-alapanyagok,
amelyek
sejtmembrán károsodást hoznak létre – puromycin, drotic acid, tetracyclin, acetominophen, széntetraklorid – oly módon, hogy kötődnek a membrán lipoprotein alkotóihoz, abban mintegy akkumulálódnak. A folyamat fontos szerepet játszik a sejtkárosodás további kialakulásában [17, 20, 25, 62, 63, 67, 99]. A Tinuvin 770 közvetlen sejtkárosító hatásáról nem rendelkezünk irodalmi adatokkal. Más irányú vizsgálatból ismert, in vitro körülmények között, hogy magasabb koncentráció mellett – 15-20 mM – szerepe lehet a lipid molekula lebontásában [85]. Valószínűleg ez a tulajdonság in vivo is érvényesül. A sejtmembrán Tinuvin 770 túltelítettsége olyan membrán-károsodáshoz vezet, ami már a csatornán kívül intracellularis Ca2+ beáramlást tesz lehetővé. A membrán károsodás tényét alátámasztja a fokozódó – 60 és 120 perc – tripán-kék felvétele is. Az elváltozások kialakulását illetően a felmerülő további lehetőségeket az alábbiakban részletezem.
A
kalciumcsatorna
gátlók
kliniko-farmakológiai
tulajdonságaiból
ismeretes, hogy a fenilalkilaminok (bepridil, verapamil) és a benzotiazepinek (diltiazem) hatással vannak a prosztaglandin szintézisre, illetve a Tinuvin származékok érinthetik a zsíranyagcserét [85]. A Tinuvin 770 in vivo körülmények között un. reflexes szimpatikus aktivitás fokozódáshoz és annak következményeihez vezetnek [84]. Az
50
izolált szívizomsejtek esetében az indirekt úton történő hatás lehetősége kizárt. Az elváltozások kialakulásáért az izolált szívizomsejt modell esetében a Tinuvin 770 közvetlen sejthatása tehető felelőssé. Az un. kalcium érzékenyítő vegyületek a szívizomzat által létrehozott erőt úgy növelik, hogy a mioplazmatikus Ca2+ koncentráció nem növekedik, de javítják az izom összehúzódás hatékonyságát. Ezek a vegyületek fokozzák a Tn-C Ca2+ iránti affinitását, növelik a kötött Ca2+ Tn-C kontraktilis rendszert aktiváló hatását, vagy megváltoztatják a keresztkötések kinetikáját. Striessnig és munkatársai [87] elméletileg vetették fel annak lehetőségét, hogy a Tinuvin 770-nek - kémiai szerkezetéből adódóan - a foszfódieszteráz gátló tulajdonsága a kontrakciós erő fokozásában játszhat szerepet. A Tinuvin 770 esetében ez a tulajdonság nagy valószínűséggel azért zárható ki, mert kémiai szerkezetéből adódóan nem tud Tn-C-hez kapcsolódni, annak kis (Kd-=0,1 µm) és nagy (Kd=10,0 µm) affinitású specifikus kötőhelyéhez. Természetesen különböző komplexitású biológiai modelleken végzett párhuzamos vizsgálatok nélkül, nem foglalhatunk ebben a kérdésben egyértelmű állást. A PDE rendszerre kifejtett hatás további gyakorlati in vitro és in vivo kísérletes vizsgálatokra szorul. A Ca2+ antagonista gyógyszerek egyes csoportjai között különbség mutatkozik a szöveti szelektivitásban, a receptorhoz történő kötődés minőségében és az ezekből adódó hemodinamikai hatásukban. A hosszú idejű farmakológiai hatás a szívizomsejt modellen – 120 perc – egyértelmű. Annak lehetősége tehát, hogy egy átmeneti kalciumcsatorna blokkolást, a szívizomsejt divalens kation elárasztása követné – mintegy a kalcium paradox jelenséghez hasonlóan – és az lenne felelős, az elváltozások kialakulásáért, gyakorlatilag kizárható. A Ca2+ antagonisták nem kívánt hatásai között ismeretes elsősorban túladagolás eseteiben a kontraktilitás csökkenése, mert intracellulárisan nem áll rendelkezésre az aktin-miozin kapcsolat szabályozásában megfelelő mennyiségű Ca2+, ezért gyengülhet a kontrakció ereje [96]. A morfológiai kép a szívizomsejtek különböző fokú kontrakciós állapotát és nem az intracelluláris kalcium hiányra jellemző ellazult formáját mutatja, sokkal inkább a az ATP hiányára jellemző relexációs zavart [24]. A Tinuvin vegyületek kutatásával kapcsolatos adatok klinikum szempontjából fontosak lehetnek, különös jelentőséggel bírva a hemodialízis során egyelőre pontosan nem értelmezhető kardiális szövődmények megértésében is. Kísérletes és klinikai adatok
51
támasztják alá, hogy az élet legkülönbözőbb területein felhasználásra kerülő műanyagok és azok alkotó anyagai stabil kötésükből kikerülve sejt és szövetkárosító tulajdonsággal rendelkezhetnek [1, 21, 91], annak lehetőségével tehát számolni kell. Az izolált szívizomsejt modellen végzett vizsgálatok alapján levonhattuk azt a megalapozott következtetést, hogy a tartós Tinuvin 770 hatás annak ellenére, hogy Ltípusú Ca2+ csatorna tulajdonsággal rendelkező vegyületről van szó, szívizomsejt károsodást hoz létre. A Tinuvin-770 hatására kialakult elváltozások indokolják a további vizsgálatok elvégzését, elsősorban a vegyületnek a sejtmembránra kifejtett közvetlen hatását illetően.
52
7.
Tinuvin 770 hemodinamikai hatásainak vizsgálata kutya modellen
7.1 Bevezetés Glossmann és kutatócsoportja által az orvosi műanyagokból kioldódó Tinuvin 770 Ltípusú Ca2+ csatorna blokkoló hatásával kapcsolatban tett megfigyelés összhangban áll az eddigi megfigyeléseinkkel. Sikeresen izoláltuk a Tinuvin 770-et orvosi gyakorlatban alkalmazott polimerekből (hemodializátor), valamit igazoltuk, hogy a Tinuvin 770 által kiváltott kalcium anyagcsere változás izolált szívizomsejten az inkubációs idővel arányos sejtkárosodást okoz. A szívizomsejt kultúrához adott 5 ml mennyiségű, 25 nm Tinuvin 770-t tartalmazó oldat 60 perc elteltével a sejtek több 50%-ának pusztulását, hiperkontrakciót, az ATP és CP szintjének jelentős csökkenését okozza. 120 perc után a sejtek jelentős része irreverzibilis károsodást szenved, melyet a az ATP és CP szint további drasztikus csökkenése, valamint az intracelluláris kalcium szint jelentős emelkedése követ. A Tinuvin 770 kórélettani hatásaival kapcsolatban csak in vitro irodalmi adat áll rendelkezésünkre. Utalva az irodalmi áttekintésben leírtakra kiemelendő, hogy a Tinuvin 770 L-típusú Ca2+ csatorna blokkoló hatása leginkább a benzotiazepin (Diltiazem) hatásához hasonlít, bár szerkezetét és hatásmechanizmusát tekintve eltérő a korábban ismert Ca2+ csatorna blokkolóktól. Az eddig ismert Ca2+ antagonisták szöveti szelektivitása igen különböző. A dihidropiridinek (pl.:Nifedipin) elsősorban a perifériás erek simaizom sejtjein hatnak, erőteljes arteriolo- és coronariatágulatot valamint afterload csökkenést okozva. Az AV átvezetést nem befolyásolják, a szív kontraktilitását nagy dózisban is csak enyhén csökkentik. Nagyfokú perifériás vazodilatáció
kialakulásánál
reflextahikardia
jelentkezhet.
A
fenilalkilaminok
(pl.:Verapamil) hatása dominánsan a szívizmon fejlődik ki. Értágító hatása másodlagos. Az AV átvezetés idejét jelentősen megnöveli, a szív kontraktilitásának csökkenése mellett. A benzotiazepinek szelektivitása az előzőekben ismertetett két csoport között helyezkedik el. Az értágító hatása gyengébb, és a kontraktilitást kisebb mértékben csökkenti. A Tinuvin 770 szöveti szelektivitását és hatáserősségét a rendelkezésre álló adatok alapján csak becsülni tudjuk, ezért szükségessé vált egy olyan állatkísérletes modell
53
felépítése, melyben tanulmányozható a vegyület hatásmechanizmusa, valamint meghatározható a dózis-hatás összefüggés. Céljaink megvalósításához olyan nagytestű állatot választottunk, mely alkalmas pontos hemodinamikai és elektrofiziológiai monitorizálására. Vizsgálataink eredményeit az in vitro tanulmányok megállapításaival vetettük össze. Előzetes kísérletet végeztünk a hatékony dózistartomány behatárolása céljából. Széles intervallumot határoztunk meg, melyben a legalacsonyabb és a legmagasabb dózis között hat nagyságrend különbség volt (1 µg – 100 mg). Az előkísérletben két kutyán végeztük a vizsgálatokat. Mindkét állatnak a logaritmikus skálának megfelelően hat dózist (1 µg, 10 µg, 100 µg, 1 mg, 10 mg, 100 mg) és a kontrollt adtuk be. A kísérleti protokoll megegyezett a későbbiekben vizsgálatokban alkalmazottakkal. Lásd 7.2.2. fejezet. Az eredmények értékelése azt mutatta, hogy 1 mg alatt módszereinkkel hemodinamikai, és elektrofiziológiai hatás nem mérhető, míg 100 mg beadását az állatok nem élték túl. A fennmaradó 1 – 100 mg-os dózistartományt a finomabb hatáselemzés céljából tovább osztottuk harmados skálán (1-3,3-6,6-10-33,3-66,6-100 mg).
7.2 Módszerek 7.2.1 Általános beavatkozások Akut hemodinamikai vizsgálatot végeztünk 12 keverék kutya (súly: 24±2,7 kg; nem: 7 hím, 5 nőstény) felhasználásával. Az állatok tartása és a kísérlet a. Semmelweis Egyetem állatkísérletekre vonatkozó szabályai, valamint „Laboratoriumi állatok tartásával és használatával kapcsolatos útmutató” (National Institute of Health, NIH Publication No. 85-23, revised 1985) szerint történt. Az állatkísérletet a Semmelweis Egyetem Regionális Kutatás Etikai Bizottsága 42/1999 számú határozatával engedélyezte. Az állatoknál az anesztézia bevezetéseként intravénásan fenobarbitált (Nembutal, CEVA, 30 mg/kg) alkalmaztunk, majd szükség szerint ismételtük a dózist a megfelelő mélységű narkózis fenntartása céljából. Az intratraheális intubációt követően a kutyákat normál légköri levegővel lélegeztettük Cape CV2424 lélegeztetőgép felhasználásával (Cape Engineering Co. Ltd.). A jobb véna femorálist kipreparáltuk a Tinuvin 770 intravénás adagolásához. A jobb artéria femorálist kanüláltuk a folyamatos artériás
54
nyomás monitorizálása céljából (Experimetria HG 01 modem, Statham P23Db), a jobb arteria carotis communist kipreparáltuk, majd pigtail katétert vezettünk be a bal kamrai nyomás és a kamra kontraktilitás (dp/dt) méréséhez (Pigtail Catheter 4F, Cordis and Experimetria HG 01 modem, Statham P23Db). A bal véna jugularis internán vezettük be a CO méréséhez szükséges katétert, melyen keresztül mérésenként 10 ml 10 – 16 °Cos fiziológiás sóoldatot injektáltunk. A bal artéria femoralison juttatuk fel az aortába a CO méréshez szükséges termisztor katétert. A CO-t a termodulóció elve alapján számítottuk ki A méréseket és a számításokat Experimetria CO-100, Cardiostar készülékkel végeztük. Standard végtagi feszíni elvezetéseket alkalmaztunk az EKG felvételéhez (Madaus Schwarzer CU12), melynek alapján a szívfrekvenciát számoltuk, a PQ távolságot mértünk. A kísérletet a 7/1 ábra szemlélteti. 7/1
ábra:
A
kutya
előkészítése
méréshez, A: bal kamrai katéter az EDP és dp/dt méréséhez a jobb oldali arteria carotis communison bevezetve, B: a CO méréséhez vénás katéter a bal
véna jugularis interában, C: artériás kanül a bal arteria femorálisban a CO méréséhez, D: vénás katéter a bal véna femoralisban a dózis beadásához, E: artériás
katéter
a
jobb
artéria
femorálisban a vérnyomás méréshez és vérvételhez,
F:
végtagi
EKG
elektródok,
G:
tubus
gépi
lélegeztetéshez.
55
7.2.2. Kísérleti protokoll
Az aneszteziológiai és a sebészeti előkészítés után 20 perces ekvilibrációs időszakot tartottunk, mely alatt az kutyák egyensúlyi állapotba kerültek. Ezt követően a kísérleti állatok alap hemodinamikai paramétereit és EKG-ját 20 percig folyamatosan rögzítettük. A minták adagolását csak a kívánt stabil hemodinamikai értékek mellett kezdtük el. A kísérlet első szakaszában a kontrollként a vivőanyagból (etanol és 0,9%-os nátriumklorid 1:1 arányú keveréke) 5 ml-t adtunk be intravénásan. Ezt követően 1; 3,3; 6,6; 10; 33,3; 66,6 és 100 mg Tinuvin 770-t oldottunk 5 ml vivőanyagban. A dózisokat T1-T7 jelöltük a hatóanyag mennyiségének emelkedésével párhuzamosan. A egyes dózisokat 3 perc alatt bólusban adtuk be, majd 12 percig inkubáltuk. A dózis beadásának kezdetét 0 időpillanatnak vettük, a beadás végét 3 percnek. A hemodinamikai méréseket és EKG monitorizálást a 0 időpontban majd a 0 időpillanathoz viszonyítva 3., 6., 9., 12., 15. percben végeztünk. A kísérleti csoportban szereplő a 12 kutya minden dózist megkapta. Az egyes állatok a dózisokat egymás után emelkedő sorrendben kapták meg. Későbbi vizsgálatok céljából a 0, 3 és 9 perckor artériás vérmintát (2ml, EDTA-s kémcsőben), a kísérlet végén szöveti mintákat (szív, tüdő, máj, vese, izom, zsír) és hólyag punkcióval vizeletet vettünk. Az anyagokat - 20°C-ra lehűtve tároltuk.
7.2.1 Statisztikai analízis Az adatokat középérték ± standard deviáció formájában (S.D.) adtuk meg. Az adatok összehasonlításához kétmintás T próbát alkalmaztunk. Az értékeket p<0,05 feltétel teljesülése esetén tartottuk szignifikánsnak. Az adott dózis 0 időpillanatában mért értéket tekintettük a kiindulásnak, és ehhez hasonlítottuk a többi mérési pontot.
7.3 Eredmények A Tinuvin 770 T1 – T6 dózisainak alkalmazása során statisztikailag értékelhető eredményeteket kaptunk minden mért paraméter tekintetében. A T7 dózisban a letalitás 75%-ra emelkedett. A 12 kísérleti állatból egyet vesztettünk a T6 dózis beadását követően 12 perccel bekövetkező irreverzibilis keringés összeomlás következtében. A T7 dózis beadása közben 2, a 9 perces mérésig újabb 4, a 15 perces mérésig további 2
56
állat exitált. A T7-es dózis által kiváltott keringés depresszió kompenzálására csak 3 állat volt képes.
7.3.1 A vérnyomás változása 7.3.1.1 Szisztolés artériás vérnyomás értékek A kontroll csoportban és a T1 dózisban szignifikáns szisztolés vérnyomásváltozást nem észleltünk. A T2 dózisnál a hatás 6 perc elteltével jelentkezik (T2: ∆%≈ -0,058) és 9 perces mérésnél megszűnik. A T3 és T4 dózisoknál a hatás már 3 perc elteltével kialakul, és a 6 perces értéknél éri el a maximumát (T3: ∆%≈ -0,064, T4: ∆%≈ 0,108)), majd 9 perces méréskor már nem észlelhető. A T5 és T6 dózisoknál a hatás a 3 perces értéktől kezdve kialakul, 6 percnél éri el a maximumát (T5: ∆%≈ 0,302, T6: ∆%≈ 0,460) és mindvégig megmarad. A 15 perces érték csak megközelíti a kiindulási értéket, de nem éri el (T5: ∆%≈ 0,143 T6: ∆%≈ 0,265). Eredményeinket a 7/2 ábra szemlélteti.
7.3.1.2 Diasztolés vérnyomás értékek A kontroll csoportban és a T1 dózisban szignifikáns diasztolés vérnyomásváltozást nem észleltünk. A T2, T3 dózisoknál a hatás 6 perc elteltével jelentkezik (T2: ∆%≈ 0,067, T3: ∆%≈ 0,052) és a 9 percnél megszűnik. A T4 dózisnál a hatás 3 percnél kezdődik, 6 percnél éri el a maximumát (T4: ∆%≈ 0,118) és 9 percnél megszűnik. A T5 és T6 dózisoknál a hatás a 3 perces értéktől kezdve kialakul, 6 percnél éri el a maximumát (T5: ∆%≈ 0,319, T6: ∆%≈ 0,463) és mindvégig megmarad. A 15 perces érték csak megközelíti a kiindulási értéket (T5: ∆%≈ 0,163, T6: ∆%≈ 0,272), de nem éri el. Eredményeinket a 7/3 ábra szemlélteti.
57
58
59
7.3.1.3 Közép vérnyomás értékek A kontroll csoportban és a T1 dózisban szignifikáns diasztolés vérnyomásváltozást nem észleltünk. A T2 dózisnál a hatás 6 perc elteltével jelentkezik (T2: ∆%≈ 0,0601) és a 9 percnél megszűnik. A T3 és T4 (T3: ∆%≈ 0,071, T4: ∆%≈ 0,111) dózisoknál a hatás már 3 perc elteltével kialakul, a 6 perces érték még kifejezettebb, majd 9 perces méréskor már nem észlelhető. A T5 és T6 dózisoknál a hatás a 3 perces értéktől kezdve kialakul, 6 percnél éri el a maximumát (T5: ∆%≈ 0,298, T6: ∆%≈ 0,467)és mindvégig megmarad.
7.3.2 A szív kontraktilitásának változásai 7.3.2.1 Pozitív dp/dt értékek A kontroll csoportban és a T1 dózisban szignifikáns hatást nem észleltünk. A T2 dózisnál a hatás 3 percnél éri el a maximumát (T2: ∆%≈ 0,094), a 6 perces érték is szignifikáns, és 9. percre megszűnik. A T3 dózisban a maximális hatás 3 percnél alakul ki (T3: ∆%≈ 0,101), majd csökkenő tendenciát mutatva 12 percnél szűnik meg. A T4, T5 és T6 dózisoknál a hatás a 3 perces értéktől kezdve kialakul, 6 percnél éri el a maximumát (T4: ∆%≈ 0,123, T5: ∆%≈ 0,238, T6: ∆%≈ 0,486) és mindvégig megmarad. A 15 perces érték csak megközelíti a kiindulási értéket, de nem éri el (T4: ∆%≈ 0,066, T5: ∆%≈ 0,155, T6: ∆%≈ 0,263). Eredményeinket a 7/4 ábra személteti.
7.3.2.2 Negatív dp/dt értékek A kontroll csoportban és a T1 dózisban szignifikáns eltérést nem észleltünk. A T2 dózisban a hatás 6 percnél alakult ki (T2: ∆%≈ 0,082), és 9 percnél megszűnik. A T3 dózisban a hatás maximum már 3 percnél jelentkezik (T3: ∆%≈ 0,093), és 9 perckor megszűnik. A T4, T5 és T6 dózisoknál a hatás a 3 perces értéktől kezdve kialakul, 6 percnél éri el a maximumát (T4: ∆%≈ 0,088, T5: ∆%≈ 0,117, T6: ∆%≈ 0,475) és mindvégig megmarad. A 15 perces érték csak megközelíti a kiindulási értéket, de nem éri el (T4: ∆%≈ 0,060, T5: ∆%≈ 0,113, T6: ∆%≈ 0,309). Tekintettel arra, hogy a negatív dp/dt aránya megegyezik a pozitív dp/dt arányával, csak a pozitív szárat személtetjük ábraával.
60
61
7.3.3 A szívfrekvencia változása A kontroll és a T1-T4 csoportokban szignifikáns szívfrekvenciát befolyásoló hatást nem észleltünk. A T5 dózisban a hatás 12 percnél kezdődik és a 15 perces mérésnél nem tér vissza az eredeti értékre (T5: ∆%≈ 0,039),. A T6 dózisnál a frekvencia csökkenés a 9 perces értéknél válik szignifikánssá, és idővel fokozatosan romlik (T6: ∆%≈ 0,108),. Eredményeinket a 7/I Táblázat szemlélteti.
Kontroll
T1 dózis
T2 dózis
T3 dózis
T4 dózis
T5 dózis
T6 dózis
0 perc
160,6 ±6,5 155,9 ±5,8 162,8 ±4,6 162,8 ±4,9 156,3 ±6,3 153,7 ±5,6 147 ±6,5
3 perc
158 ±5,3
6 perc
158,4 ±5,8 154,1 ±5,4 163,1 ±4,3 165,3 ±5,1 156,5 ±6,3 156,4 ±8,2 142,9 ±8,8
9 perc
158,1 ±6,3 156,4 ±5,6 163,7 ±4,8 164,2 ±5,0 154,5 ±6,1 151,4 ±7,5 136 ±7,9*
12 perc
157,5 ±6,3 156,9 ±5,7 163,3 ±4,6 163,5 ±5,7 152,9 ±6,2 148 ±6,7* 135 ±8,4*
15 perc
156,7 ±6,0 156,5 ±5,4 163,6 ±4,8 162,7 ±6,1 151,2 ±6,3 147 ±6,6* 131 ±9,6*
155,2 ±5,3 163,2 ±4,4 165,7 ±4,9 157,5 ±6,7 159 ±8,0
148 ±8,8
7/I Táblázat: A szívfrekvencia (perc-1) változása az egyes dózisokban az idő
függvényében. A szignifikáns változást (p<0,05) kiemelt számokkal és *-gal jelöltük.
7.3.4 Pitvar-kamrai átvezetés változása A pitvar-kamrai átvezetést a PQ távolsággal jellemeztük. A kontroll és T1-T3 csoportokban szignifikáns PQ távolság változást nem észleltünk. A T4 dózisnál 12 percnél PQ távolság szignifikánsan megnyúlik (T4: ∆%≈ 1,025). A T5 és T6 dózisoknál a hatás a 3 perces értéktől kezdve kialakul, a T5 dózisnál 12 percnél (T5: ∆%≈ 1,084), a T6 dózisnál 9 percnél (T6: ∆%≈ 1,096) éri el a maximumát és mindvégig megmarad. A 15 perces érték csak megközelíti a kiindulási értéket, de nem éri el (T5: ∆%≈ 1,059, T6: ∆%≈ 1,088). Eredményeinket a 7/II Táblázat szemlélteti.
62
Kontroll
T1 dózis
T2 dózis
T3 dózis
T4 dózis
T5 dózis
T6 dózis
0 perc
0,114±,003 0,118±,003 0,114±,003 0,117±,004 0,120±,003 0,118±,004 0,124±,004
3 perc
0,113±,003 0,120±,004 0,117±,004 0,119±,005 0,120±,004 0,125±,004 0,129±,006
6 perc
0,114±,003 0,123±,003 0,119±,003 0,120±,004 0,122±,004 0,125±,004 0,135±,006
9 perc
0,114±,003 0,122±,004 0,120±,004 0,119±,004 0,122±,004 0,126±,005 0,136±,007
12 perc
0,114±,003 0,119±,003 0,119±,004 0,119±,004 0,123±,004 0,128±,004 0,135±,007
15 perc
0,114±,003 0,118±,003 0,117±,004 0,117±,004 0,122±,004 0,125±,004 0,135±,008
7/II Táblázat: A pitvar-kamrai ingerületátvezetés, a PQ szakasz (sec) megnyúlása az
egyes dózisokban az idő függvényében. A szignifikáns változásokat kiemelt számokkal jelöltük.
7.3.5 A végdiasztolés balkamrai nyomás változása A végdiasztolés bal kamrai nyomás (EDP) értékei nagy szórást mutattak. A kontroll, T1 és T2 csoportokban nem mértünk szignifikáns változást. Az átlag nyomásérték 7 Hgmm körül mozog. A T3 és T4 dózisokat követően az EDP értéke megemelkedik 10 Hgmm fölé (T3: ∆%≈ 1,264, T4: ∆%≈ 1,385). A T5 és T6 dózisban további szignifikáns emelkedés nem következik be. A T7 dózisban statisztikailag nem értékelhető.
7.3.6 A perctérfogat változása A T6 dózisig a cardiac output (CO) a szignifikánsan nem változik. A T6 dózisban mérhető nem szignifikáns CO csökkenés. A T7 dózisban, ahol az állatok jelentős része elpusztult beadását követően alakul ki szignifikáns CO esés. A 3 perces értéket (T7: ∆%≈ 0,244) csak 9 állatra tudjuk megadni, mert korábban három exitált. A következő mérésnél már nem elegendő az esetszám a statisztikai analízis elvégzéséhez további 6 állat pusztulása miatt. A T6 dózisban egy és a T7 dózisban nyolc elpusztult állatnál azt tapasztaltuk, hogy a keringés összeomlás előtt az EKG-n iszkémiás jelek (negatív T hullám, ST szakasz depresszió, vagy eleváció), kamrai extra szisztolék majd kamraremegés alakult ki. A
63
túlélő állatok keringése 1 órás megfigyelési időt követően sem tért vissza a T7 dózis 0 időpontjában mért értékhez.
7.4 Az eredmények megbeszélése Az előzetes kísérletek alapján meghatározott dózistaromány alkalmasnak bizonyult a Tinuvin 770 hemodinamikai hatásainak felmérésére és dózis-hatás összefüggések leírására. A legalacsonyabb dózisnál (1 mg) nem tudtunk kimutatni sem szignifikáns hemodinamikai, sem elektrofiziológiai hatást. Ezzel szemben a legmagasabb vizsgált dózisban (100 mg) az állatok 75%-a visszafordíthatalan keringési elégtelenségben elpusztult. A szélső értékek között vizsgált dózisokról elmondható, hogy a beadott mennyiség emelésével arányosan nő a kiváltott hatás. A Tinuvin 770 a Ca2+ antagonista vegyületre jellemző változásokat hoz létre, de azok nem írhatóak le maradéktalanul az eddig ismert egyetlen Ca2+csatorna blokkoló vegyület hatásmehanizmusával sem. A dihidropiridinek (pl.: Nifedipin) ér-szelektivitásuk révén kifejezetten a vazodilatáció felé hatnak, a szívhatásuk lényegesen gyengébb. A fenilalkilaminok (pl.: Verapamil) kardioszelektívek, hatásukra a PQ megnyúlás, a csökkenő szívfrekvencia, később negatív kronotróp hatás jellemző. A benzotiazepinek (pl.: Dilzem) hatása is döntően kardiális, de szelektivitásuk fenilalkilaminokénál gyengébb. Perctérfogat: A Tinuvin 770 a T1-T5 (1-33,3 mg) dózistartományban nem befolyásolja
a perctérfogatot. A CO egyértelmű, de nem szignifikáns csökkenését a T6 dózisban (66,6 mg) mértünk először. A T7 dózisban (100 mg) a keringés összeomlása jelentkezik, ekkor a CO hirtelen kialakuló, nagyfokú esését tapasztaltuk. Három kutya képes volt kompenzálni ezt a változást, azonban keringési paramétereik csak hosszú időtartam után tértek vissza a kiindulási értékekhez, és az EKG-n iszkémiás jelek mutatkoztak. Vérnyomás: A kontroll csoportban és a T1 dózisban mérhető hatást még nem
regisztráltunk. A T2 dózistól (3,3 mg) emelkedő tendenciát mutató szignifikáns vérnyomásesés jelentkezett mind a szisztolés, mind a diasztolés vérnyomás értékekben. A alacsonyabb T2, T3 dózisnál (3,3; 6,6 mg) a vérnyomásesés csak kis mértékű, 5-7 %al csökken A T4 dózisnál (10 mg) észlelhető egy hatásváltozás, a csökkenés meghaladja a 10%-ot, és a hatástartama is megnövekszik. A T5 dózistól(33,3 mg) a vérnyomásesés
64
üteme hirtelen felerősödik. A T5 dózisban (33,3 mg) 30 %-ra, majd a T6 dózisban (66,6 mg) 46%-ra emelkedik. A T7 dózisban (100 mg) a többi keringési paraméterrel együtt a vérnyomás is mérhetetlenné válik. A szisztolés vérnyomás csökkenés üteme a teljes dozistartományban kis mértékben a diasztolés vérnyomásesés mértéke alatt marad. Szívizom kontraktilitása: A szívizom kontraktilitása a vérnyomás értékekhez
hasonlóan változik. Az alacsonyabb dózisoknál fokozatosan, kis mértékben csökken. A T5 dózisnál (33,3 mg) tapasztalható egy egyértelmű hatás erősödés, de a hirtelen nagy 40 %-ot meghaladó kontraktilitás esés a T6 dózisban (66,6 mg) következik be. A negatív és pozitív dp/dt is csökken. A pozitív dp/dt csökkenése a T5 dózisig (33,3 mg) meghaladja a negatív dp/dt értékek csökkenését. Ez a különbség a T5 dózisban (33,3 mg) a legkifejezettebb, ahol a pozitív dp/dt közel kétszer akkora esést mutat mint a negatív szár. A T6 dózisban (66,6 mg) a csökkenés mindékét paramétert illetően közel azonos. A T7 dózisnál (100mg) a kontraktilitás mérhetetlenné válik. Végdiasztolés bal kamrai nyomás: A T1 és T2 dózisokban (1; 3,3 mg) nem mutat
szignifikáns változást. A T3 és T4 dózisokban (6,6; 10 mg) lépcsőszerűen egy magasabb 10 Hgmm-t meghaladó nyomásállapot alakul ki a bal kamrában, mely a dózis emelésével a T5 és T6 dózisokban nem emelkedik tovább. Szívfrekvencia: Szignifikáns szívfrekvencia csökkenést csak a T5 és T6 dózisokban
(33,3; 66,6 mg) tapasztalunk. A csökkenés mértéke csak a T6 dózisban éri el a 10 %-ot. Pitvar-kamrai átvezetés: A PQ-ban a T5 és T6 dózisoknál (33,3; 66,6 mg) találtunk 10
%-ot nem meghaladó szignifikáns csökkenést. Kísérleti adataink alátámasztják azt az in vitro megfigyelést, mely szerint a Tinuvin 770 hatékony L-típusú Ca2+ csatorna blokkoló. Eredményeinket összegezve elmondható, hogy a Tinuvin 770 in vivo körülmények között is kifejezett Ca2+ antagonista hatással rendelkezik. A hatásmechanizmusa az in vitro adatok alapján a benzothiazepinhez (pl.: Dilzem) van a legközelebb, de kötődését mind a fenilalkilaminok (pl.:Verapamil), mind a dihidropiridinek (pl.: Nifedipin) kötőhelyéhez leírták. A Tinuvin 770 az általa létrehozott keringési változások alapján nem sorolható egyik klinikai gyakorlatban alkalmazott L típusú Ca2+ csatorna blokkoló csoporthoz sem. Feltételezésünk szerint a Tinuvin 770 alacsonyabb dózisban (3,3 – 10 mg) adva elsősorban kardiális hatású, kamra kontraktilitását csökkentve eredményez kis mértékű vérnyomás esését. Ekkor perifériás hatása még elhanyagolható. A magasabb dózisoknál perifériás hatásai
65
kialakulnak. A kisfokú vazodilatáció segíti a szív pumpa funkcióját, az after-load csökkentésével gyorsítja a bal kamra ürülését, csökkenti a kamrafal izomzatának feszülését, javíthatja a koronária keringést. Ezt támasztja alá, hogy a kezdetben megemelkedő EDP a dózist emelve nem nő tovább. A perifériás értágulat további emelkedése párhuzamosan a kamra kontraktilitásának fokozatos csökkenésével keringési elégtelenséghez vezet. Ez az állapot 66,6 – 100 mg Tinuvin 770 beadását követően alakul ki. A pitvar kamrai átvezetést csak a magasabb dózisokban befolyásolja szignifikánsan, de jelentős szívfrekvencia változást nem okoz. A negatív inotróp és a perifériás vazodilatációt okozó hatásához, magasabb (szubtoxikus) dózisban kialakuló pitvar-kamrai átvezetés idejének megnyúlása kapcsán kialakuló negatív kronotróp is hozzáadódik. Az l mg –os dózis 25 kg súlyú kutyán hatást nem okoz, viszont a 100 mg letális az állatok 75%-ban. A vizsgált dózistartomány alapján mind az EC50 (EC50 ≤ 0,137 mg/ttskg) mind az LD50 (LD50 ≤ 4 mg/ttskg) érték meghatározható. További állatkísérletes vizsgálatok szükségesek a Tinuvin 770 hatásmechanizmusának pontos feltérképezéséhez.
66
8. Tinuvin 770 kardiotoxikus hatásainak vizsgálata patkány modellen in vivo 8.1 Bevezetés A kutya modellen végzett vizsgálatainkkal a Tinuvin 770 in vivo heveny hatásairól kaptunk
képet
[80].
Kísérletünk
igazolta,
hogy a
Tinuvin
770
kifejezett
kardiovaszkuláris hatásokkal rendelkező vegyület (EC50 ≤ 0,137 mg/ttskg). Az alacsonyabb dózistartományban (1 – 10 mg) kamra kontraktilitást csökkentő, míg a dózist emelve (30 – 100 mg) fokozatosan vazodiliatatív, majd kardiotoxikus hatásai kerülnek előtérbe. A mérsékelt vérnyomáscsökkenést követően, a szív további kontraktilitás romlása és a pitvar-kamrai ingerület átvezetési idő megnyúlása következik be. A kompenzációs mechanizmusok 30 – 60 mg dózistartományig képesek a perctérfogatot fenntartani, majd a 100 mg-os dózis beadását követően kialakuló keringésdepressziót csak a kísérleti állatok 25 %-a volt képes túlélni (LD50 ≤ 4 mg/ttskg). A korábbi in vitro eredményeket feldolgozó irodalmi adatok [31, 55, 56, 82] és a kutya modell dózis-hatás összefüggései alapján egy olyan modellt alakítottunk ki, melyben vizsgálható a Tinuvin 770 szubkrónikus kardiotoxikus hatása. Széles dózistartományt (1 µg – 1 mg) határoztunk meg, melynek felső értékei már heveny hatással is rendelkezhetnek. Kísérletünkben krónikus hemodinamikai monitorizálásra nem volt mód. A kiértékelésnél a Tinuvin 770 által okozott morfológiai elváltozásokat vetettük össze az izolált szívizomsejteken kialakult képpel és a hemodinamikai vizsgálat funkcionális eredményeivel.
8.2 Módszerek 8.2.1 Általános beavatkozások Vizsgálatainkat 50 darab 250-300 grammos Wistar típusú patkányon végeztük normál tartási körülmények és ad libitum hozzáférhető étrend mellett. A kísérlet a Semmelweis Egyetem állatkísérletekre vonatkozó szabályai, valamint a Laboratóriumi állatok tartásával és használatával kapcsolatos útmutató” (National Institute of Health, NIH Publication No. 85-23, revised 1985) szerint történt. Az állatkísérletet a Semmelweis
67
Egyetem Regionális Kutatás Etikai Bizottsága 59/2001. számú határozatával engedélyezte. A nemi megoszlás 25 hím és 25 nőstény volt. Az állatokat súly szerint randomizáltan öt csoportba osztottuk úgy, hogy csoportonként a nemek aránya egyenlő legyen. Az I. csoport képezte a kontrollt, ahol az állatok fiziológiás sóoldat (Salsol infúziós oldat, Gödöllő, Magyarország) és 96 %-os etanol (Riedel de Haen, Seelze, Germany) 1:1 arányú keverékét kapták intraperitonealisan (i.p.) 15 alkalommal öt hetes periódus alatt (hétfő – szerda - péntek). A II-V. csoportban a Tinuvin 770 [bis(2,2,6,6-teramethyl-4piperidinyl)szebacainsav, Ciba Geigy Co., Basle, Svájc] különböző dózisait adtuk fiziológiás sóoldat és 96 %-os 1:1 arányú keverékében oldva. A II. csoportban 1 µg/ml, a III. csoportban 10 µg/ml, a IV. csoportban 100 µg/ml, az V. csoportban 1 mg/ml Tinuvin 770-t tartalmazó oldatokat alkalmaztunk. A kísérleti csoportokban is a dózisból öt héten keresztül, hetente háromszor (hétfő – szerda – péntek), alkalmanként 1-1 ml oldatot fecskendeztünk be az állatoknak intraperitonelaisan. Az állatokat rövid éter narkózisban dekapitációval öltük le. A morfológiai vizsgálatokhoz a mintákat a szívizom balkamrai, szeptális és papilláris izmok területéről vettük.
8.2.2 Morfológiai módszerek 8.2.2.1 Fénymikroszkópia A szívizom mintákat 4 %-os, foszfáttal pufferelt (pH: 7.2) formalinban fixáltuk. Hematoxylin-Eosin (H&E), Azan, Phosphotungstic acid-Hematoxylin (PTAH), Van Gieson, PAS festéseket végeztünk. A metszetvastagság a 2-3 µm volt.
8.2.2.2 Elektronmikroszkópia Az elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz a mintákat 0,1 M-os Na-kakodilát-al pufferelt 3 %-os glutáraldehidben fixáltuk, majd 1 %-os Ozmium teroxiddal posztfixáltuk és aralditba ágyaztuk. Toluidin-kékkel festett félvékony metszeteket használtunk az ultrastrukturális vizsgálati terület kiválasztásához. Az araldítból való kioldást követően a további félvékony metszeteket PTAH-al festettük. Az ultravékony metszeteket uranilacetáttal és ólom-citráttal kontrasztoztuk, szénréteggel fedtük. Az elektronmikroszkópos
68
vizsgálatokat JEOL 100B elektronmikroszkópot használtunk 60 kV gyorsító feszültségen.
8.2.3 Citokémiai módszerek A kalcium citokémiai kimutatásához ólom-acetát módszert alkalmaztuk [12, 43]. Az adrenerg innerváció változásait a gliokxálsavas módszerrel követtük [77, 97]. A kiértékelés Jenalumar fluorescens mikroszkóppal történt (VEB Carl Zeiss Jena) a következő paraméterek mellett: VG1/3.5+BG52/2 gerjesztőszűrő és GG9+OG4 zárószűrő. . További laboratóriumi vizsgálatok céljára 50-50 ml vért –20 °C-ra lefagyasztva tároltuk. Az összehasonlító vizsgálatokra agy, máj tüdő, vese, lép, mellékvese és csontvelő mintákat biztosítottunk.
8.3 Eredmények Az I.-III. csoportnál az állatok magatartásában és étkezési szokásaiban jelentős változást nem tapasztaltunk. A IV.-V. csoportban az állatok a harmadik héttől kezdve fokozatosan elveszítették aktivitásukat, indítékszegénnyé váltak, táplálékfogyasztásuk lecsökkent, jelentős testsúlycsökkenés következett be. Az állatok egymáshoz bújtak, a külső ingerekre gyengén reagáltak. A kísérletek alatt a IV. csoportban egy, az V. csoportban három állatot veszítettünk a negyedik héten. Az állatok számának és testsúlyának változását a 8/I Táblázat mutatja be.
69
Csoport\testsúly (g)
0. nap
7. nap
14. nap
21. nap
28. nap
35. nap
I. csoport
273 ± 9
266 ± 5
283 ± 5
281 ± 7
292 ± 5
296 ± 3
n = 10
n = 10
n = 10
n = 10
n = 10
n = 10
II. csoport
291 ± 3
293 ± 7
305 ± 2
300 ± 5
307 ± 3
305 ± 5
n = 10
n = 10
n = 10
n = 10
n = 10
n = 10
III. csoport
271 ± 8
285 ± 2
287 ± 10
276 ± 5
275 ± 5
270 ± 6
n = 10
n = 10
n = 10
n = 10
n = 10
n = 10
IV. csoport
279 ± 8
278 ± 5
279 ± 4
265 ± 8
257 ± 6
250 ± 5
n = 10
n = 10
n = 10
n = 10
n=9
n=9
V. csoport
266 ± 11
270 ± 6
255 ± 4
252 ± 5
239 ± 2
227 ± 3
n = 10
n = 10
n = 10
n = 10
n=7
n=7
8/I Táblázat: Az állatok súlyának és a számának változását az idő függvényében
szemléltetjük. A kiemelt értékek a 10%-nál nagyobb súly és a csoportban található állatok számának csökkenését mutatják
8.3.1 I. kontroll csoport Az I. úgynevezett kontroll csoportban a fény és elektronmikroszkópos vizsgálatok az ép viszonyoknak megfelelő képet mutatták. A szívizom struktúrája megtartott, nekrózis, fokális elváltozás nem volt látható. Enyhe kalcium reakció volt megfigyelhető a a bal kamrai
izomzat
mikoradiumának
szarkoplazmás
retikulumában
és
a
mitokondriumokban (8/4. A ábra). A gliokszálsavas reakció szabályos, longitudinális elrendeződést mutatott a miofilamentumok mentén (8/5. A ábra).
8.3.1 II. és III. csoport A II.-III. kísérleti csoportokban a morfológiai vizsgálat érdemi változást nem mutatott. A makroszkópos vizsgálattal a III. csoportban három esetben a szeptum felső harmadában disszeminált formában bevérzést találtunk. Szövettani vizsgálattal enyhe, kis területet érintő, fokális hiperkontrakció (8/2. A ábra), intersticiális ödéma és miocitolízis volt igazolható. Az II.-III. csoportban az adrenerg innerváció a kontroll csoporthoz viszonyítva nem mutatta a katekolaminok fokozott felszabadulását az idegvégződéseken.
70
8.3.3. IV. csoport A IV. csoportban a makroszkópos elemzésnél feltűnő volt a tág, vérrel telt balkamra. A szubendokardiális területen a sövénynek megfelelő nagyobb terjedelmű, lapszerinti bevérzéseket figyeltünk meg. Ezen elváltozásoknak megfelelően a kórszövettani vizsgálattal az arteriolák és kapillárisok körüli vérzések (8/1. A ábra) voltak kimutathatóak. Az ödémássá vált (8/2. B ábra) szarkoplazmában a fibrillumok kisebb nagyobb aggregátumok formájában összecsapzódtak. A miofibrillumok pusztulása miatt a szarkoplazmában különböző nagyságú vakólumok jelentek meg, melyek helyenként összeolvadva nagyobb üregeket hoznak létre. A maradék szakroplazma így gyűrűszerűen bélelheti a szarkolemmát. A szövettani kép fibrinolízisnek felel meg. Két másik jellegzetes elváltozást tudtunk még azonosítani: a miofilamentumok teljes lízisét, melynél üres szarkoplazma csövek láthatóak, jelezve a létrejövő miocitolízist és néhány látótérben megjelenő erőteljesen festődő kötegeket mutató, hiperkontrakciós csíkokkal járó sejtkárosodást. Az elektronmikroszkópos vizsgálat a Z és I csíkok területén kialakult filamentum károsodást igazolt. Az aktin és miozin filamentumok elveszítik folytonosságukat, részleges vagy teljes lízis alakul ki (8/1. C, és 8/3. A ábra). A sérült filamentumok szomszédságában az ép felé eső széli zónában a Z csík elektronszóró anyaga csökkent. Az I csík megmaradt filamentumai kötegszerűen összecsapzódnak, és a kereszthidak elszakadnak. A sérült aktin és miozin filamentumok környezetében a citokémiai vizsgálat alapján kifejezett intracelluláris Ca2+ felhalmozódás figyelhető meg. A fluoreszcens mikroszkópos vizsgálaton a kontrollhoz viszonyítva fokozott katekolamin felszaporodás figyelhető meg a szívizom szubendokardiális területein, jellegzetesen a szeptumnak megfelelő területek idegvégződéseiben.
8.3.4. V. csoport A makroszkópos kép mindkét kamrafal belhártyája alatt nagykiterjedésű vérzéseket mutatott, melyek több sejtsor mélységben a szívizomba terjedtek. A megduzzadt, hosszanti irányban metszett szívizomrostok szegmentumaiban homogén, fokozott festékkötő szakaszok formájában kontrakciós kötegek figyelhetőek meg. A rostszakadás következményeként a harántkötegek egymástól eltávolodtak. A hiperkontrahált rostkötegektől távolabb a túlnyujtott szarkomerek mindig megtalálhatóak (8/2. B ábra). A kórszövettani elváltozás hiperkontrakciós nekrózisnak (8/1. D, és 8/3. B ábra) felel
71
meg. Az elektronmikroszkópos kép a több szarkomért érintő hiperkontrakciós csíkok mellett a túlnyujtott rostok folytonosságának megszakadását mutatja, az aktin és miozin filamentumok egymáshoz viszonyítva térben eltolódnak. A hiperkontrakciós csík felé haladva fokozatosan egyneművé váltak. A mitokondriumok belső membránjának károsodása, a glikoproteinszemcsék megfogyatkozása alakult ki. A szívizomsejt Ca2+ felvétele kifejezetten megnőtt. A mitokondriumokban Ca2+ szemcsék halmozódtak fel. (8/4. B ábra). A fluoreszcens mikroszkópos vizsgálat erőteljes katekolamin felszabadulást mutat, a szubendokardiális területek idegvégződésein (8/5. B ábra). A szövettani eredmény szemikvantitaív kiértékelését a 8/II Táblázat mutatja. A kísérlet alatt elpusztult állatok boncolásakor és szövettani vizsgálatakor az V. csoportban leírt elváltozásokat találtuk. A szíven kívül vizsgáltuk a vesét, tüdőt, agyat, lépet, ereket. A felsorolt szervekben szignifikáns kórszövettani elváltozást nem találtunk. A IV. és V. csoportokban a májban nem specifikus, enyhe fokú intracelluláris vakualizációval járó degenerációt láttunk.
72
8/1. ábra: Fénymikroszkópos vizsgálat, bal kamra izomzat A: perikapilláris bevérzés, IV csoport (HE, 200X), B: intersticiális ödéma, IV
csoport (HE, 200X), C: miocitolízis, IV. csoport (PTAH, 200X), D: hiperkontrakciós nekrózis, V. csoport (PTAH, 100X).
73
8/2 ábra: Félvékony metszetek a balkamrai szívizomzatból, a: közepes fokú
hiperkontrakciós csíkok láthatóak a III. csoportban (Movat, 400X), b: miocitolízis és hipekontrakciós nekrózis az V. csoportban (PTAH, 400X). Az elváltozásokat nyílheggyel jelöltük.
8/3 ábra: Transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálat a balkamra szívizomzatából.
Az elváltozásokat nyílheggyel jelültük. Az arányokat az ábrára helyezett egyenessel tüntetjük fel, melynek hossza egy mikron. a: miocitolízis és a miofilamentumok fokális károsodása a IV. csoportban. b: hiperkontrakciós nekrózis szétesett szarkomérekkel az V. csoportban.
74
8/4 ábra: A Ca2+ citokémiai kimutatása a bal kamrai szívizomzatból (ólom-acetát). a: a
kontroll reakció enyhe Ca2+ lerakódást mutat a szarkoplazmás retikulumokban és a mitokondriumokban, b: Az V. csoportban nagy mennyiségű Ca2+ felszaporodás látható a mitokondriumokban és intracellularisan.
8/5 ábra: A katekolaminok hisztokémiai kimutatása a bal kamrai szívizomzatban
(glioxálsavas reakció), A: a kontroll csoportban szabályos a miofilamentumoknak megfelelő elrendeződés látható, B: intenzív, szabálytalan reakció látható az V. csoportban.
75
8/II táblázat: A szövettani elváltozások szemikvantitaív értékelésének összefoglaló táblázata.
Erősségi skála: - nincs változás, + enyhe, ++ közepes, +++ kifejezett változás. Módszer
Elváltozások
I. csoport
II. csoport
III. csoport
IV. csoport
V. csoport
Szubendokardiális bevérzés
-
-
+
++
+++
Perikapilláris bevérzés
-
-
+
++
+++
Interfibrilláris ödéma
-
-
+
++
++
Miocitolízis
-
-
+
+
++
Hiperkontrakciós nekrózis
-
-
+
+
+++
Miokardiális sejtek vakuolizációja
-
-
-
++
+++
Miofilamentumok lízise
-
-
-
++
+++
I & Z band alterations
-
-
-
++
+++
Mitokondriális membrán károsodás
-
-
-
-
++
Glikoprotein granulumok vesztése
-
-
-
-
++
Hiperkontrakciós gyűrűk
-
-
-
++
+++
Kémiai analízis
Intracelluláris Ca2+ intenzitása
-
-
-
+
+++
Immunfluoreszcens vizsgálat
Katekolamin mennyisége
-
-
-
+
+++
Fénymikroszkópia
Elektronmikroszkópia
76
8.4 Az eredmények megbeszélése A Ca2+ antagonisták napjainkban a kardiovaszkuláris betegségekben általánosan alkalmazott gyógyszerek közé tartoznak. Közös mechanizmusuk, hogy a sejtmembrán feszültségfüggő Ca2+ csatornáiban szelektíven gátolják a Ca2+ ionok sejtbe történő beáramlását. Valamennyi, a klinikai gyakorlatban alkalmazott Ca2+-csatorna blokkoló (fenilakliaminok, dihidropiridinek, benzothiazepinek) az L típusú Ca2+-csatorna α1 alegységén fejti ki a hatását [26]. Az L típusú Ca2+-csatornák megtalálhatóak a szívizomzatban, érfali simaizomzatban, kisebb számban a vázizomzatban és a gastrointesztinális rendszerben is [50]. Ezen csatornák blokkolása a miokardiumban negatív ino-, krono-, és dromotróp hatású. Az érfali csatornák gátlása vazodilatációt okoz. A Ca2+ antagonista szerek szív és érrendszeri szöveti szelektivitásuk alapján heterogén csoportot jelentenek [59]. Klinikai felhasználásuk különböző, mivel hemodinamikai hatásaikban jelentősen eltérnek egymástól. A szelektivitásukat az érfal/miokardium indexel jellemezhető. Ennek alapján a fenilalkilaminok szelektíven hatnak a miokardiumra, a dihiropiridinek az érfalra [32, 61]. A benzothiazepinek inkább kardioszelektivek, de hatásuk nem elhanyagolható az érfalon. Elsősorban a Ca2+ antagonisták első generációja - különösen a dihidropiridinek - erőteljes vazodilatációs hatásuk kapcsán- a hipotenzió ellenregulációját váltják ki, ami szimpatikus idegrendszer aktivitásfokozódásával jár [24]. Ilyenkor reflex tahikardia és a renin-angiotensin rendszer aktivációja jön létre. A tahikardiát a fenilakliaminok és a benzothiazepinek esetében a negatív kronotróp hatás bizonyos mértékben ellensúlyozza. A Tinuvin 770 az in vitro kísérleti eredmények alapján nem sorolható egyértelműen egyik, eddig ismert Ca2+-csatorna blokkoló csoportba sem. Kémiai szerkezetét tekintve teljesen elétérő az eddig tárgyalt vegyületektől. Amellett, hogy nagy affinitással kötődik a Ca2+-csatorna fenilalkilamin és benzothiazepin kötőhelyéhez, a Tinuvin 770 dihidropiridin alegységén keresztül is gátolja a Ca2+ áramot [31]. A kombinált hatásmechanizmus miatt működésének egyértelmű magyarázata összetett feladat. A képet színezi, hogy in vitro kísérleti eredmények a Tinuvin 770 centrális nikotinerg típusú acetil-kolin receptor blokkoló hatását írták le [55, 56]. A ganglionbénítókra jellemző vazodilatációs hatás további vérnyomásesést eredményezhet. A klinikai gyakorlatban intravénásan alkalmazott ganglionbénítókra jellemző, hogy a hatás gyorsan kialakul, kifejezett, de rövid ideig tart [28].
77
A fentiek ismeretében látszólag ellentmondásos az a megfigyelésünk, hogy a Ca2+antagonista tulajdonsággal bíró Tinuvin 770 adagolása során a dózis emelésével párhuzamosan jellegzetesnek mondható miocitolízis és hiperkontrakciós nekrózis formájában megjelenő szívizom elváltozás alakul ki. A dihidropiridinekhez hasonlóan a Tinuvin
770
alkalmazásakor
létrejöhet
hipotenzió
és
reflexes
szimpatikus
tónusfokozódás, mely az szívizom oxigén egyensúlyának romlásához, a miokardium iszkémiájához, és a kontraktilitás romlásához vezethet. Természetesen csupán morfológiai vizsgálatokkal a tényleges patomechanizmusra csak munka hipotézist állíthatunk fel. A szívizomsejtek fibrillo-miocitolízisét, illetve hiperkontrakciós nekrózisát számos tényező következményeként írták le. Ezek közé tartozik a hipoxia, direkt toxikus károsodás, intrakardiális nyomásfokozódás. Ezen morfológiai kép jellemző a katekolaminok indukálta szívelváltozásra [7]. A katekolaminok hirtelen felszaporodásakor
az
anyagcsere
felgyorsul,
hipermetabolizmus
lép
fel.
A
szívizomrostok ilyenkor nagyobb erővel húzódnak össze, nő a szív teljesítőképessége, de egyben az oxigénigénye is. Az oxigénfogyasztás növekedése olyan méreteket ölthet tartós katekolamin hatásra, hogy a szívizomban oxigéndeficit, hipoxia léphet fel [9]. Ezen állapotot ronthatja a Ca2+-csatorna blokkolóknál leírt „coronarian-steel” jelenség is. A katekolaminok élettani mennyiségben növelik a szívizom kontrakciós erejét, mivel fokozzák a nagyenergiájú foszfátészterek felhasználását. A fiziológiásnál nagyobb koncentrációban azonban már olyan mértékben fokozzák a Ca2+ beáramlást is, hogy a sejtek ion- és energiaháztartása felborul, majd funkcionális és szerkezeti károsodások következnek be [7, 46, 76, 98]. A katekolaminok indukálta szívizomsejt károsodás alapvetően metabolikus esemény. A metabolizmus fokozatosan eltolódik az aerób oxidáció felől az anaerób oxidáció és zsírsav oxidáció irányába. Az anaerob glikolízis ATP termelése elégtelen, mert a szívizomsejtek képtelenek az iongrádiens fenntartására és az intracelluláris Ca2+ szabályozására elegendő mennyiségű ATP-t termelni. A kialakult intracellularis acidózis a képződő oxigén szabadgyökök együttesen vezetnek a membránkárosodáshoz, nagy mennyiségű intracellularis Ca2+ felszaporodásához és végül a sejt pusztulásához. A katekolaminok hatására megnőtt intracellularis cAMP szint aktiválja a cAMP dependens protein kinázt, majd megindul a szarkoplazmás retikulumok foszforliációja. Ennek következtében megnövekszik a Ca2+ felvétel a raktározási helyekre és csökken a diasztólés kiáramlás. Az intracellularis Ca2+
78
felhalmozódás a mitokondriumokban is megjelenik károsítva annak szerkezetét és működését [19]. A Tinuvin 770 kisebb dózisaiban (II.,III. csoport) – 1 µg, 10µg – nem hoz létre jelentős szívizom elváltozásokat. A Tinuvin 770 magas dózisban (IV.,V. csoport) – 100 µg, 1 mg – úgynevezett fordított hatás következik be. Az L típusú Ca2+ csatorna blokkolást ellensúlyozza, illetve felfüggeszti a reflektórikus szimpatkius adrenerg aktiváció. Ezt támasztja alá, hogy a miocitolízist és hiperkontrakciós nekrózist mutató miokardiumban fluoreszcens mikroszkópos vizsgálattal fokozott katekolamin aktivitás volt kimutatható, az intracellularis Ca2+ jelentős felszaporodása mellett. A kialakuló jelenséget a morfológiai módszerek eredményei határozottan alátámasztják, kiegészítve a korábbi szívizomsejt kultúrán végzett vizsgálataink megállapításait. A kísérletek egyértelműen kimutatták, hogy a folyamat dózisfüggő. A morfológiai vizsgálataink eredményét összegezve megállapíthatjuk, hogy a Tinuvin 770 100µg, vagy ennél magasabb dózisának tartós alkalmazásakor - az egyébként Ca2+ blokkoló vegyület – toxikus hatásai kerülnek előtérbe. Hipotézisünk szerint a kifejezett hipotonia
kompenzációjaként
felszabadulással
jár.
A
reflexes
folyamat
szimpatikotónus
következményeként
fokozott romlik
a
katekolamin miokardium
kontraktilitása, az oxigén egyensúly felborul és a szívizom metabolikus zavara alakul ki. A leírt jelenség azért érdemel különös figyelmet, mert a Tinuvin 770 jó UV stabilizáló tulajdonságai és kedvező költségvonzata miatt a műanyagok elterjedt adalékanyaga. A haemodialysis kezelés különösen nagy kontaminációs lehetőséget teremt, tekintettel arra, hogy a szervezet és a műanyag hosszan tartó, krónikus direkt kölcsönhatásban van egymással. Felmerül, hogy a hemodialízis egyes multifactorialis szövödményében (pl.: hypotensio) szerepe lehet. Hasonló problémát rejthet magában bármely más extracorporalis keringéssel járó kezelés (szív-tüdő gép), vagy akár egy egyszerű intravénás infúziós kezelés, ha Tinuvin 770-t tartalmazó palackkal és szerelékkel végzik. Természetesen az irodalomban a Tinuvin 770 farmakológiai sajátosságaival, farmakokinetikájával kapcsolatos adatok hiányosak, további kiterjedt kutatás tárgyát képezik. Kísérleti eredményeink azonban azért arra hívják fel a figyelmet, hogy minden olyan műanyag eszköz, mely Tinuvin 770-t tartalmaz és valamilyen módon az emberi szervezettel szorosabb kapcsolatba kerülhet potenciálisan magában rejti a kontamináció lehetőségét. A műanyagok esetleges gyártási hibája, vagy nem rendeltetésszerű
79
használata lehetőséget teremthet olyan Tinuvin 770 koncentráció elérésére, mely kardiotoxikus hatás veszélyét hordozza magában. Fel szeretnénk hívni a figyelmet a Tinuvin 770 problematikája interdisziplináris megoldást kíván. Elsősorban a rendszeres toxicológiai ellenőrzés kidolgozása lehet szükségszerű.
80
9. Eredményeink, összefoglalás A következő megállapításokra jutottunk az analitikai hemodinamikai és toxikológiai vizsgálataink kiértékelését követően: •
A Tinuvin 770 analitikai vizsgálatára a kidolgozott SPE eljárás ás a HPLC elválasztással kombinált MS detektálási módszer alkalmas.
•
A kifejlesztett eljárás nagy érzékenységű (LOD=1 ng, LOQ=10 ng), alkalmas kis mennyiségű, akár nyomokban jelenlévő Tinuvin 770 kimutatására.
•
A
Tinuvin
770
jelenléte
egyértelműen
igazolható
hemodializátor
membránokban. •
A Tinuvin 770 vizes oldatokkal (0.9%-os nátrium-klorid) a membránokból kioldható.
•
Az izolált szívizomsejt kultúra alkalmas a sejtek szelektív vizsgálatára, külső hatások kiiktatásával.
•
A Tinuvin 770 igen kis mennyiségben (25 nM) irreverzibilis sejtkárosodást okoz izolált szívizomsejteken. A hatás az eltelt idő függvényében erősödik, majd 120 perc elteltével válik irreverzibilissé.
•
A toxikus hatás kialakulásában a kalcium anyagcserezavarok mellett a Tinuvin 770 membránkárosító hatása is felvetődik kóroki tényezőként.
•
A megfigyelt erőteljes ATP szint csökkenés a sejt relaxációs zavarához vezet, ennek jeleként hiperkontrakciós nekrózis alakul ki.
•
A kutya modellben a Tinuvin 770 kifejezett heveny hemodinamikai hatását igazoltuk
•
A Tinuvin 770 alacsonyabb dózisban (1-10 mg) a szívizom kontraktilitását csökkenti, mely a vérnyomás enyhe csökkenéséhez vezet.
•
A Tinuvin 770 magasabb dózisban (10-60 mg) a kamra kontraktilitásának csökkenése mellett fokozott vazodilatációt hoz létre, mely a vérnyomás erőteljes csökkenését okozza. A 66,6 mg beadását követően a PQ távolság megnyúlása észlelhető, a szívfrekvencia csökkenése mellett. A perctérfogat relatíve állandó szinten marad, egészen a letális dózisig.
81
•
100 mg-os dózis a keringés összeomlásához vezet, az állatok 75 %-a elpusztul.
•
A krónikus patkánymodellben igazoltuk, hogy a Tinuvin 770 szubakut dózisban is toxikus elváltozásokat hoz létre.
•
Az állatokban dózisfüggő myocardialis elváltozások jönnek létre. A 100 ug és 1 mg dózissal kezelt állatokban hiperkontrakciós nekrózis és miocitolízis uralja a képet.
•
A citokémiai reakció igazolta, hogy a sejtek kalcium tartalma jelentősen megnő. Ezzel
párhuzamosan
az
idegvégződéseken
a
katekolamin
mennyisége
kimutathatóan megnő. A szabályos véglemez szerkezet megváltozik. •
A 1 mg-os dózisnál az állatok közel egyharmada elpusztul, igazolva a Tinuvin 770 magas dózisának krónikus toxikus hatását.
Eredményeink alátámasztják a Tinuvin 770-el kapcsolatos toxikológiai és klinikai vizsgálatok fontosságát. Az eddig ismert kalcium csatorna blokkoló vegyületekhez való funkcionális hasonlósága megteremtheti a lehetőségét annak, hogy a dialízis kezelés alatt a keringésbe kerülve keringési változásokat okozzon. A kalcium csatorna blokkoló hatású Tinuvin 770 így elméletileg hozzájárulhat a több tényező által kialakított dialízishez kapcsolódó kardio-vaszkuláris szövődményekhez. A Tinuvin 770 molekulán kívül számtalan olyan műanyagipari alkalmazásban szereplő vegyület ismert, mely az emberi szervezettel tartósan közvetlen kapcsolatba kerül. Szükséges lehet a molekulák átfogóbb toxikológiai vizsgálata az ipai alkalmazás engedélyezése előtt, valamint a már használatban lévő anyagok szorosabb norma ellenőrzése.
82
10. Összefüggések humán kísérletes eredményeinkkel A kísérleteink végső célja, hogy a Tinuvin 770 kísérletesen igazolt kardiovaszkuláris hatásait összefüggésbe hozzuk, vagy a kapcsolatot kizárjuk a dialízis kezelés alatt tapasztalható keringési szövődményekkel. Egyértelműen sikerült igazolnunk, hogy a membrán anyagát képező polimerekben megtalálható, és vizes oldószerekkel kioldható a Tinuvin 770. Az elméleti valószínűsége nagy annak, hogy a fizilogiás sóoldathoz hasonlóan a plazma is képes a Tinuvin 770 –t mérhető mennyisében oldani. Az előzetes, de nem validált vizsgálataink kísérletes körülmények között ezt alátámasztják. A méréseket jelentősen nehezíti, hogy ellentétben a fiziológiás sóoldattal a plazma egy komplex biológiai mátrixnak tekinthető. Az extrakciót a plazmában található oldott anyagok, fehérjék, zsírok nehezítik. Az extrakció módszerének fejlesztése a mérés sikerének alapfeltétele. A Semmelweis Egyetem Regionális Kutatásetikai Bizottsága 108/2000 határozatával engedélyezte dializált betegektől a dialízis kezelés előtt, alatt és után történő vérvételt további kémiai analízis céljából. Az előzetes, de még nem publikált eredményeink felvetik, hogy a Tinuvin 770 ng/ml-es nagyságrendben a keringésbe kerül. Az eredményeket a kis esetszám és a további módszerfejlesztés szükségessége miatt jelenleg csak tájékoztató jellegűnek tartjuk, de úgy gondoljuk, hogy megalapozhatják a Tinuvin 770 további kutatási irányvonalát. Távlati céljaink: •
A plazmába bekerülő Tinuvin 770 mennyiségének pontos meghatározása. Amennyiben a kvantitatív elemzés sikerrel jár, lehetőségünk nyílhat a kísérletes modellekben meghatározott hatékony dózistartomány és a beteg plazmájába bekerülő mennyiség összevetésére.
•
A Tinuvin 770 farmakokinetikájának részletes leírása, különös tekintettel a vegyület metabolizmusára.
•
A
Tinuvin
770
acetil-kolin
receptorokon
kifejtett
hatásának
további
tanulmányozása. Az acetil-kolin blokkoló hatás kórélettani vonatkozásainak vizsgálata.
83
11. Irodalmi háttér 1. Amdur, M.O., Doull, I., Klaassen, C.C. (1998). Toxicology. McGraw-Hill. Inc. London-New York. 2. Armstrong, S.G., Ganote, C.E. (1991). Effects of 2,3 – Butanedione Monoxine (BDM) on contracutre and injury of isolated rat myocytes following metabolic inhibition and ischemia. J. Mol. Cell. Cardiol. 23. 1001-1014. 3. Arnow, P.M., Bland, L.A., Garcia-Houchins, S., Fridkin, S., Fellner, S.K. (1994). An outbreak of fatal fluoride intoxication in a long-term hemodialysis unit. Ann. Intern. Med. 121, 339-344. 4. Balázs, T., Ferrans, V.J. (1978). Cardiac lesion induced by chemicals. Environ. Health Perspect. London-New York.Bergmeyer,H.,U. (1974) Methods of Enzymatic Analysis. Academic Press. New York. 5. Bergmeyer, H.U. (1974). Methods of Enzymatic Analysis. Academic Press. New York 6. Bommer, J., Ritz, E. (1987). Ethylen oxide (ETO) as a major cause of anaphylactoid reactions in dialysis (a review). Artif. Organs 11, 111-117. 7. Bristow, M.R. (1995). Spontaneous reversibility of catecholamine-induced cardiotoxicity in rats. Am. J. Cardiovasc. Pathol. 5 (1), 79-88. 8. Brody, T.M., Chubb, J.M. (1991). Biochemical and ionic mechanismus of cardiotoxic agents. In: BalazsT. Cardiac Toxicology. Vol I. CRC Press. New York. pp. 1-12. 9. Burniston, T.I., Clark, C.W., Yeelan, N.G. (2003). Characterisation of adenoceptor involvement in skeletal and cardiac myotoxicity induced by sympathomimetic agents: toward a new bioassay for beta-blockers. J. Cardiovasc. Pharmacol. 41 (4), 518-525. 10. Caceres, A., Ysambertt, F., Lopez, J., Marquez, N. (1996). Analysis of photostabilizer in high density polyethylen by reverse- and normal-phase HPLC. Separation Science and Technology 31 (16): 2287-2298. 11. Canaud, B. (2002). Performance liquid test as a cause for sudden deaths of dialysis patients: perfluorohydrocarbon, a previously unrecognized hazard for dialysis patients. Nephrol. Dial. Transplant. 17 (4), 545-548.
84
12. Carasso, N., Favard, P. (1966). Mise en évidence du calcium dans les myonénes pédunoclaries de ciliés péritriches. J. Microsc. 5, 759-770. 13. Czvikovszky, T., Nagy, P. (2003). Polimerek az orvostechnikában. Egyetemi Tankönyv, Műegyetemi Kiadó, Budapest. 14. Damiani, E., Castagna, R., Greci, L. (2002). The effects of derivates of the nitroxide tempolon UVA-mediated in vitro lipid and protein oxidation. Free. Radic. Biol. Med. 33 (1). 128-136. 15. Damiani, E., Kalinska, B., Canapa, A., Canestrari, S., Wozniak, M., Olmo, M., Gerci, L. (2000). The effects of nitroxide radicals on oxidative DNA damage. Free. Radic. Biol. Med. 28 (8). 1257-1265. 16. Daugirdas, J.T. (1991). Dialysis hypotension: A hemodynamic analysis. Kidney Int. 16, 233-246.
17. Debayser, D., Goethals, F., Klack, G., Roberfroid, M. (1989). Investigation into the mechanism of tetracycline induced steatosis: study in isolated hepatocytes. Toxicol. Appl. Pharmacol. 97. 173-179. 18. Decker, M.L, Barclay, M.B., Cook, M.G., John,J., LaPres, J.J.,Clark, W.A., Decker, R.S. (1991). Cell shape and organization of the contractile apparatus in cultured adult cardiac myocytes. J. Moll. Cell. Cardiol. 23. 817-832. 19. Dhalla, N.S. (2001). Role of oxidative stress in catecholamine-induced cardiac sarcolemmal Ca2+ transport. Arch. Biochem. Biophys. 387 (1), 85-92. 20. Dianzani, F. (1976). Toxic liver injury by lipoprotein synthesis inhibitor. In: Popper, H., Schaffner, F. (eds) Progress in Liver Diseases. Vol. 5. Grune and Stratton, New York , USA. 21. Dukes, M.N.G. (1985). Side effects of Drugs. Anual. 9. Liwingston Inc. London 22. Dunn, A., Fogg, I. (1959). New low molecular light stabilizer J.Appl. Polymer. Sci. 2. 367-371.
23. Edenbaum J. (1992). Plastics additives and modifiers handbook. Van Nostrand Reinhold, New York. 24. Édes, I. (2000). A szívizom és simaizom Ca2+ anyagcseréje: elmélet, klinikum. Golden Book Kiadó. Budapest.
85
25. Endoh, M. (1998). Changes in intracellular mobilization as mechanism of action of physiological interventions and inotropic agents in intact myocardial cells. Ipn. Heart J. 39, 1-44. 26. Epstein, M. (ed). (1998). Calcium antagonist in clinical medicine. Hanley & Belfus Inc. Medical Publisher, Philadelphia, USA. 27. Fairgrieve, S.P., MacCallum, J.R. (1984). Hindered amine light stabilizer: A purposed photostabilization mechanism. Polym. Degrad. Satb. 8, 107-121. 28. Flores, C.M., Rogers, S.W., Pabreza, L.A., Wolfe, B.B., Kellar K. (1992). A subtype of nicotinic cholinergic receptor in rat brain is composed of α4 and β2 subunits and is up-regulated by chronic nicotine treatment. Mol. Pharmacol. 41, 3137. 29. Gächter, R, Müller, H., Klemchuk, P.P.(1990) Plastic Additives Handbook, 3rd ed., pp. 129-270. Hanser Publisher, Munich Vienna New York. 30. Gál, Gy. (1988). Mérgezések kezelése művi méregtelenítéssel. Gyakorlati Toxikológia, 31. Glossmann, H., Hering, S., Savchenko, A., Berger, W., Friedrich, K., Garcia, M. L., Goetz, M. A., Liesch, J. M., Zink, D. L., Kaczorowski, G. J. (1993). A light stabilizer (Tinuvin 770) that elutes from polypropylene plastic tubes is a potent Ltype Ca2+ -channel blocker. Proc.Natl.Acad.Sci. 90, 9523-9527. 32. Gong, L., Zhang, W., Zhu, Y., Zhu, J., Kong, D., Page, V., Ghadirian, P., LeLorier J., Hamet, P. (1996). Shanghai trial of nifedipine in elderly (STONE). J. Hypertens. 14, 1237-1245.
33. Gray, R.J., Sands, J.J. (2002). Dialysis Access: Multidisciplinary Approach. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, USA. 34. Hahn, R.G., Olsson, J., Sótonyi, P., Rajs,I. (2000). Rupture of myocardial histoskeleton and its relation to sudden death after infusion of glycine 1.5 % in the mouse. APMIS 108, 487-495. 35. Hang, J.P., Herman, E.H. (1998). Toxic response of the heart and vascular system. In: BalazsT. Cardiac Toxicology. Vol I. CRC Press. New York. pp 1-12. In: Casarett and Doubll’s Toxicology. Edit. Amdur, M.O., Doull, J., Klaassen, C.D., McGraw-hill. Inc. London.
86
36. Jacobson, S.L., Piper, H. (1986). Cell cultures of adult cardiomyocytes as model of the myocardium. J. Mol. Cell. Cardiol. 18, 661-678. 37. Karátson, A., Kakuk, Gy., Makó, J. (2000). Hemodialízis, „A vesebetegek ellátásának fejlesztéséért” Alapítvány, Pécs. 38. Kecskeméti, V. (1997). Kaciumantagonisták. Humán Farmakológia. Szerk. Vizi E. Szilveszter. Medicina. 654-664. 39. Kessler, M., Cao Huu, T., Mariot, A., Chanliau, J. (1988). Oxide and formaldehyde. Contrib. Nephrol. 62, 13-23. 40. Kim, D.H., Akera, T. (1984). Effect of myocardial hypoxia on digitalis induced toxicity in the isolated heart on guinea pigs and cats, Eur. Pharmacol. 104, 303-312. 41. Klee, D., Höcker, H. (1998). Polymers for Biomedical Application. Springer, Berlin. 42. Klemchuk P.P., Gande, M.E. (1988). Stabilization mechanisms of hindered amines. Polym.Degrad.Stab. 22, 241-274. 43. Komnick, H. (1969). Histochemische Calcium Lokalistion in der Skelettmuskulatur des Frosches. Histochemie. 18, 24-29. 44. Kumar, D., Kirshenbaum, L., Li, T., Danielsen, I., Singal, P. (1999). Apoptosis in isolated adult cardiomyocytes exposed by Adriamycin. Ann. NY. Acad. Sci. 142, 159-168. 45. Kuwahara, T., Market, M., Wauters, P.J. (1989). Proteins adsorbed on haemodialysis membranes modulate neutrophil activation. Artif. Organs. 5, 427431. 46. Lehr, D. (1981). Studies on the cardiotoxicity of alpha and beta adrenergic amines. In: Balazs, T. (ed.) Cardiac Toxicology, vol.II., pp. 75-108. CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida, USA. 47. Marque, D., Feigenbaum, A., Riquet, A.M. (1996). Repercussion of plastic packing on the compatibility with packaged foodstuff. J. Chem. Phys. et Physico-Chem. Biol. 93 (1), 165-168. 48. Material Safety Data Sheet Directive /MSDSD/ (1998). Ciba Speciality Chemicals, Additives Division. Toxicological Information. Basle, Switzerland. 49. Maue, M., Ike, T., Kasagi, M., Takahashi, H. (1998). Manufacture of bis(2,2,6,6tetra-methyl-4-piperidinyl)sebacate, Japan Kokai Tokkyo Koho, Japanese Patent,
87
63,198,662 A2 August 17, 1998 (to Yoshitomi Pharmaceutical Industries Ltd.).CA110(14):116041h. 50. McDonald, T.F., Pelzer, S., Trautwein, W., Pelzer, D. (1994). Regulation and modulation of calcium channels in cardiac, skeletal, and smooth muscle cells. Physiol. Rev. 74, 365-507. 51. Mitchell, M.R., Powell, T., Sturridge, M.F., Terra, D.A., Twist, V.W. (1986). Electrical properties and response to noradrenaline of individual heart cells isolated from human ventricular tissue. Cardiovasc. Res. 20, 829-876. 52. Nánási, P.,Varró, A., Lathrop, D.A. (1991). Ionic currents in isolated cardiomyocites. Cell Motility. 8, 431-440. 53. Niesink, R., de Vries, I., Hollinger, M.A. (eds) (1996). Toxicology Principles and Application. New York. London. Tokyo. 54. Nissenson, A.L.R., Fine R.F. (2002). Dialysis Threapy, 3th edition, Honely Beifus, Philadelphia, USA. 55. Papke, R.L., Grey Craig, A., Heinemann, S.F. (1994). Inhibition of nicotinic acetylcholine receptors by bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinyl)sebacate (Tinuvin 770), an additive to Medical Plastics. J. Pharm. and Exp. Therap. 268,:718-726. 56. Papke, R.L., Thinschmidt, J.S., Moulton, B.A., Meyer, E.M., Poirier, A. (1997). Activation and inhibition af rat neuromal nicotinic receptors by ABT-418. J. Pharmacol. 120 (3), 429-438. 57. Papp, Z., Czuriga, I. (2000). Ca2+ csatorna. Szerk. Édes,I. A szív és simaizom Ca2+ anyagcseréje: elmélet, klinikum. Golden Book Kiadó. Budapest. pp. 143-224. 58. Pegues, D.A., Beck-Sague, C.M., Wollen, S.V. (1992). Anaphylactoid reactions associated with reuse of hollow-fiber haemodialyser and ACE inhibiors. Kidney Int. 42, 1232-1237.
59. Pelzer, D., Pelzer, S., McDonald, T.F. (1992). Calcium channels in heart. In: Fozzard, H.A. (ed.) The heart and cardiovascular system., pp. 1049-1089. Raven Press Ltd., New York, USA. 60. Piper, H.M., Spahr, R., Spieckermann, P.G. (1985). Anoxic injury of adult cardiac myocytes. Basic. Res. Cardiol. 80, 159-163. 61. Pitt, B. (1997). Diversity of calcium antagonists. Clin. Ther. 19 (suppl.A), 3-7.
88
62. Placke, M.E., Ginsberg, G.L., Wyand, D.S., Cohen, S.D. (1987). Ultrastructural changes during acute acetaminophen-induced hepatotoxicity in the mouse: a time and dose study. Toxicol. Pharmacol. 15, 431-438. 63. Popper, M., Schaffner, F. (1982). Drug induced hepatic injury. Ann. Intern. Med. 51, 1230-1252. 64. Powell, T. (1984). Methods for presentation and characterisation of cardiac myocytes. In: Singal, K., Dhalla, N.S. (eds.) Heart membrane Structure and Morphology CPC Press Inc.Boca Paton, Florida, USA. 65. Rabek, J.F. (1990). Photostabilization of polymers. Principles and Applications. Elsevier Applied Science, London and New York. 66. Rajs, J., Sundberg, M., Danell, N., Tornling, G., Biberfeld, P., Jacobsson, W.S. (1978). A rapid method for the isolation of viable cardiac myocytes from adult rat. Exp. Cell. Res. 115, 183-189. 67. Recknagel, R.O. (1967). Carbon tetrachloride hepatotoxicity. Pharmacol. Rev. 19, 145-208. 68. Roth, V.R., Jarvis, W.R. (2000). Outbreaks of infection and/or pyrogenic reactions in dialysis patients. Semin. Dial. 13, 92-96. 69. Rozeman, C.A., Jonkman, E.J., Poortvliet, D.C., Emmen, H.H., de Weerd, A.W., van der Maas, A.P., Tjandra, Y.I., Beermann, E.M. (1992). Encephalopathy in patients on continuous ambulatory peritoneal dialysis and patients on chronic haemodialysis. Nephrology Dialysis Transplnatation. 7 (12), 1213-1218. 70. Rubin, R.J., Jaeger, R.J. (1973). Some pharmacologic and toxicologic effects of di2-ethylhexyl phtalate (DEHP) and other plasticizers. Environ. Health Perspect. 3, 53-59. 71. Sass, D.J., Van Dyke, R.A., Wood, E.H., Johnson, S.A., Didisheim, P. (1976). Gas embolism due to intravenous FC 80 liquid fluorocarbon. J. Appl. Physiol. 40, 745751. 72. Sato, M., Horigome, I., Chiba, S., Furuta, T., Miyazaki, M., Hotta, O., Suzuki, K., Noshiro, H., Taguma, Y. (2001). Autonomic insufficiency as a factor contributing to dialysis-induced hypotension. Nephrol. Dial. Transplan. 16 (8), 1657-1662. 73. Seifert, S.A. (1998). The rates and severity of complications of haemodialysis in toxicology settings. J. Toxicol. Clin .Toxicol. 36, 214-219.
89
74. Sevini F., Marcato, B. (1983). Chromatographic determination of some hindered amine light stabilizer in polyolefins. Journal of Chromatography, 260, 507-512. 75. Shalaby, S.W. (1994). Biomedical Polymers. Hanser-Gardner, Munich, Cincinnati, USA. 76. Shinay, I., Shinichi, M., Mitsuhiro, Y., Shoei, K., Sakan, M. (2000). Isoproterenolinduced myocardial injury resulting in alerted S100A4 and S100A11 protein expression in the rat. Pathol. Int. 50 (6), 480-485. 77. Shwalev, W.N., Zhuchkova, N.I. (1979). A simple method for revealing adrenergic nerve structure in human and animal tissues using glyoxylic acid solution. Arch. Anat. Histol. Embryol. 6, 114-116. 78. Silver, F.H., Doillon, C. (1989). Biocompatibility – Interactions of Biological and Implantable Materials. VCH Publisher, New York. 79. Solaro, R.J. (1996). Calcium sensitizers and molecular mechanisms of altered esponse of cardiac myofilaments to calcium. In: Andoh, M., Morad, H., Lijima, T. (eds.) Molecular mechanism of cardiovascular regulation. Springer. Tokyo. Japan. pp. 363-372. 80. Sótonyi, P., Hubay, M., Szentmáriay, I. A light stabilizer Tinuvin 770 induced toxic injury of ventricular myocardium. Archives of Legal Medicine. In press, Accepted 24. September 2003. 81. Sótonyi, P., Járay, J., Pádár, Z., Woller, J., Füredi, S., and Gál, T. (1996). Comparative study on reused haemodialysis membranes. Int.J.Artif.Org. 19 (7), 387-392. 82. Sótonyi, P., Keller, É., Járay, J., Nemes, B., Benkő, T., Kovács, A., Tolokán, A., Rajs, I. (2001). A light stabilizer Tinuvin 770-induced toxic injury of adult rat cardiac myocytes. Forensic Sci. Int. 119, 322-327. 83. Sótonyi, P., Kovács, A., Volk, G., Járay, J., Benkő, A. Detection of Tinuvin 770 a light stabilizer of plastic materials from dialysis membranes by high performance liquid chromatographic analysis. J. Chrom. Sci. In press Accepted 25. August 2003. 84. Sótonyi, P., Merkely, B., Hubay, M., Járay, J., Zima, E., Soós, P., Kovács, A., Szentmáriay, I. (2003). Comparative study on cardiotoxic effect of Tinuvin 770; a light stabiliser of medical plastics in rat model. Toxicological Science, In press, Accepted 29. October 2003.
90
85. Spyropoulos, D.V. (1998). Stability testing of the plastic additives. Food. Addit. Contam. 15 (3), 362-369. 86. Stegemann,R.,Meyer,R.,Haas,H.G.,Nicoud,R.M. (1990) The cell surface of isolated cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 22, 878-803. 87. Striessnig, J., Strubing, C., Lakitsch, M., Hering, S., Glossmann, H. (1992). Tinuvin-770 is a L-type Ca2+ chanel blocker. Nauny-Schmiedebergers Arch. Pharmacol. 356. R8 abstract. 88. Tielemans, C., Gastaldello, K., Goldmann, M., Vanherweghem, J. L. (1996). Acute haemodialysis membrane-associated reactions. Nephrol. Dial. Transplant. 11 (suppl.), 112-115.
89. Tielemans, C., Madhoun, P., Lenaers, M., Schandene, L., Goldmann, M., Wanherweghem, J.L. (2000). Anaphylactoid reactions during hemodialysis on AN69 membranes in patients receiving ACE inhibitors. Kidney Int. 38, 992-998. 90. Tipple, M.A., Shusterman, N., Bland, L.A. McCarthy, M.A., Favero, M.S., Arduino, M.J., Reid, M.H., Jarvis W.R. (1991). Illness in hemodialysis patients after exposure to chloramine contaminated dialysate. ASAIO Trans. 37, 588-591. 91. Ungváry, Gy. (2000). Munkaegészségtan. Medicina Könyvkiadó Rt. Budapest 92. Van Stee, W. (1982). Cardiovascular Toxicology in Target Organ Toxicilogy Series. Dixon, R.L. (eds) Ravena Press. New York, USA. 93. Varró, A., Nánási, P., Lathrop, D.A. (1991). Voltage clamp characterization of ventricular myocytes in rabbit. Cardioscience. 2, 328-342. 94. Wiles D.M., Tovborg Jensen, J.P., Carlsson, D.J. (1983). Polymer stabilization by hindered amines. Pure Appl. Chem 55, 1651-1659. 95. William, W.D., Henrich, L. (2002). Principles and practice of dialysis. Lippcott Williams and Wilkins, Philadelphia, USA. 96. Wray, W.D., Norman, P.I., Hess,P. (1989). Calcium chanels: Structure and function. Ann. New York Acad. Sci. 560.59. New York. 97. Zhuchkova, N.I., Shwalev, W.N., Stropus, R.A. (1984). Qualitative analysis of the density of adrenergic nervous plexuses of the heart in sudden cardiac death. In: Szekeres, L., Papp, Gy., Takáts, L. (eds.) Pathomechanism and Prevention of Sudden Cardiac Death due to Coronary Insufficiency, pp.269-274. Akademia Press, Budapest, Hungray.
91
98. Zimmer, H.G. (1997). Catecholamine-induced cardiac hypertrophy: significance of protooncogenie expression. J. Mol. Med. 57 (11-12), 849-859. 99. Zimmermann, M.J. (1978). Hepatotoxicity. Appleton-Century Crofts. New York. USA. 100.
Tinuvin 770 toxicity. National Technical Information Service. (Springfield, VA
22161)
Formerly U.S. Clearinghouse for Scientific & Technical Information.
NTIS** OTS0544570-1. 101.
Support: Supplementary report on the 28-day toxicity to oral administration of
Tinuvin 770 in rat with cover letter dated 111693 (:EPA/OTS; Doc#89-940000035). 102.
Initial submission: Human repeated insult patch with three batches of Tinuvin
770 with cover letter dated 071592 and attachments (:EPA/OTS; Doc#88920004433). 103.
Support: effects of Chimmadsorb 119 & 944 and Tinuvin 622 & 770 on
macrophage
recruitment
/activation/
function
following
intraperitoneal
administration to mice with cover letter dated 110293 (: EPA/OTS; Doc#89941000010).
92
12. Köszönetnyilvánítás A Ph.D munkámat a Semmelweis Egyetem II.sz. Patológiai Intézetében végeztem 1996 és 2003 között Prof.Dr. Kádár Anna irányításával. 1996 – 2001-ig a Semmelweis Egyetem Doktori Iskola levelező tagozatos hallgatója voltam. A téma jellegéből adódóan több külső intézettel is állandó munkakapcsolatban álltam a kísérleteim során. Őszinte hálámat szeretném kifejezni Prof. Dr. Kádár Annának program- és témavezetőmnek, aki már munkám legelején elhitte nekem, hogy ez a téma fontos és valóban kapcsolódhat mind a patológia, mind a klinikum tárgyköréhez. Külön köszönöm neki, a tanácsait, kritikai megjegyzéseit és azt, hogy klinikai munkámat és ezzel járó zavaros időbeosztásomat mindig elfogadta. Hálás köszönettel tartozom Prof. Dr. Perner Ferencnek és Prof.Dr. Járay Jenőnek akik 1993-ban az akkor még transzplantációs osztály TDK-s hallgatói közé felvettek, meghatározva ezzel a későbbi sebészeti és a tudományos munkát. Köszönöm a bíztatásukat a doktori értekezésem elkészítésére. Nagyon köszönöm minden közvetlen kollégáimnak, hogy lehetővé tették számomra, hogy klinikai munkám mellett kísérleteimet elvégezzem. Köszönöm Dr. Remport Ádámak, Dr. Jansen Juditnak, Dr. Lázár Norbertnek, Dr. Doros Attilának, Dr. Hidvégi Mártának, dr. Máthé Zsoltnak, hogy klinikai és patológiai problémáimmal mindig megkereshettem őket. Feszt Tímeának nagyon nagy hálával tartozom a számítógépes szerkesztésekért. Köszönöm az Országos Igazságügyi Toxikológiai Intézetből Dr. Kovács Anikó laborvezetőnek, és Dr. Benkő András igazgató úrnak azt a kitartó munkát, melyet az analitika tárgykörében együtt végeztünk. Hálás vagyok azért, mert a kémiához keveset értőként is foglalkoztak velem. Köszönöm Prof. Dr. Jovan Rajsnak és munkacsoportjának, hogy az általuk kidolgozott az izolált szívizom modellt rendelkezésemre bocsátották. Köszönöm, Prof. Dr. Acsády Györgynek, Prof. Dr. Juhász-Nagy Sándornak Prof Dr. Nemes Attilanak, Prof. Dr. Horkay Ferencnek, Dr. Kékesi Violettának, Dr. Merkely Bélának, akik lehetővé tették számomra, hogy az Ér-és Szívsebészeti Klinika Kutató Laboratóriumában dolgozzak. Nagyon hálás vagyok Dr. Zima Endrének és Dr. Soós Pálnak a barátságukért és azért a sok gyakorlati és elméleti segítségért, amit tőlük kaptam.
93
Ezúton köszönöm meg az Igazságügyi Orvostani Intézetből dr. Hubay Márta, Prof..Dr. Keller Éva és Dr. Szentmáriay István munkáját, melyet közös kutatásainkban együtt végezhettünk. Nagyon köszönöm az elő-opponenseimnek Prof.Dr. Kerényi Tibornak és dr. Toronyi Évának az értekezésemmel kapcsolatban adott kritikai és elismerő megjegyzéseiket. Ezzel hozzásegítettek ahhoz, hogy dolgozatomat kellőképpen átdolgozhassam. Köszönöm továbbá Csongorné Rajczi Mártának, Lantos Mónikának, Szendrei Eszternek, Skrivanek Györgynek, Keresztes Istvánné Juditnak, Seffer Ilonának, Bognár Gyulának, dr. Szuhovszky Gyulának a toxikológiai-, patológiai- és igazságügyi orvostani intézet asszisztenseinek segítségét. Szeretném külön kifejezni hálámat és nagyrabecsülésemet Werglesz Albertnek (Berci bácsinak), aki nyolc éves koromban mutatta meg először az „öreg hitachi-t”, a legöregebb elektronmikroszkópot és azóta mindig segít ha kérem. Köszönöm barátaimnak azt a sok kedvességet, szeretetet és azt a környezetet ami mindig lehetőséget teremtett a munkából való kikapcsolódásra. Ki kell emelnem dr. Lovas Gábort és feleségét Ross Viktóriát, akik minden időben segítségemre siettek legyen az tudományos, vagy bármilyen más probléma. Legfőképpen pedig feleségemnek Lulunak, aki mindig mindenben társam, köszönöm a töretlen hitét, a nem szűnő szeretetét, amivel munkámhoz biztosította a feltételeket. Gyermekeimnek Botondnak és Borókának köszönöm, hogy jól viselkedtek, amikor nem voltam otthon. Édesapának és édesanyának mindenért köszönet. Köszönöm mindazon itt fel nem sorolt kollégáim és családtagjaim segítségét, akik bármilyen formában hozzájárultak Ph.D. hallgatóként végzett tudományos munkám elvégzéséhez.
94
13. Saját közlemények Az értekezés tárgyában megjelent közlemények
Sótonyi, P., Járay, J., Pádár, ZS., Woller, J., Füredi, S., Gál, T. (1996) Comparative study on reused haemodialysis membranes, The International Journal of Artificial Organs. 19 (7), 001-006. IF: 0,694 Sótonyi, P., Keller, E., Járay, J., Nemes, B., Benkő, T., Kovàcs, A., Tolokàn, A., Rajs, J. (2001) A light stabilizer Tinuvin 770 induced injury of adult cardiac monocytes. Forensic Science International. 119, 322-327. IF: 1,052 Sótonyi, P., Kovács, A., Volk, G., Járay, J., Benkő, A. Detection of Tinuvin 770 a light stabilizer of plastic materials from dialysis membranes by high performanced liquid chromatographic analysis. Journal of Chromatographic Science. In press, Közlésre elfogadva 2003. 08.25. IF: 1,241 Sótonyi, P., Hubay, M., Szentmáriay, I. A light stabilizer Tinuvin 770 induced toxic injury of ventricular myocardium. Archives of Legal Medicine. In press, Közlésre elfogadva 2003. 09. 24. IF: Sótonyi, P., Merkely, B., Hubay, M.,. Járay, J., Zima, E., Soós, P., Kovács, A., Szentmáriay, I. Comparative study on cardiotoxic effect of Tinuvin 770; a light stabiliser of medical plastics in rat model. Toxicological Science. Közlésre elfogadva 2003.10.29. IF: 3,367
Az értekezés tárgyában megjelent idézhető absztraktok
P. Sótonyi. The legal and ethical response to platics in medical practice. World Congress of Medical Law. Siófok. 1998. 08. 02-06.
95
P. Sótonyi, J. Járay, B. Nemes, É. Keller, I. Rajs. Ethical issues in the use of biological materials. World Congress of Medical Law. 2000. 08. 06-10. P. Sótonyi, J. Járay, B. Nemes, E. Szakonyi, I. Rajs. A light stabilizer Tinuvin 770induced toxic injury of adult cardiac myocytes. Congress of IALM, Spain, Santiago 2000. 09. 06-09. Pp. 56 Sótonyi P., Nemes B., Benkő T. A Tinuvin 770 toxikus hatásainak vizsgálata izolált patkány szívizomsejten. Ph.D. Tudományos Napok 2001, Budapest 2001. Február 2122.
Az értekezés tárgyán kívül megjelent közlemények
N. Lázár, G. Dallos, B. Nemes, T. Németh, P. Sótonyi, L. Kóbori, Experimental investigation of preservation injury in animal kidneys after reperfusion with EuroCollins. Acta-Chirurg-Hung. 1997, 36 (1-4), 192-4. Tóth A., Görög D., Podder H., Dallos G., Sasvári I., Borka P., Réti V., Sótonyi P.. Malignus daganatok vesetranszplantáció után. Magyar Sebészet. 50., 309-312. 1997. B. Nemes, H. Podder, J. Járay, G. Dabasi, L. Lázár, Zs. Schaff, P. Sótonyi, F. Perner. Primary Hepatic Carcinoid in a Renal Transplant Patient. Pathology Oncology Research. Vol 5, No 1, 1999. B. Nemes, A. Zalatnai, H. Podder, J. Járay, P. Sótonyi, Zs. Schaff, K. Földes, F. Perner. Papillary Microcarcinoma of the Thyroid Gland in Renal Transplant Patients. Pathology Oncology Research. Vol. No 1. 2000. Patonai A., Nemes B., Görög D., Kóbori L., Sótonyi P., Fehérvári I., Weszelits V., Doros A., Dallos G., Schaff Zs., Perner F., A hazai májtranszplantációk értékelése patologiai szempontból. Orvosi Hetilap 2001, 142 ( 9 ), 435 – 441.
96
G. Lotz, S. Simon, A. Patonai, P. Sótonyi, B. Nemes, C. Sergi, T. Glasz, T. Füle, B. Nashan, S. Schaff. Decetion of chlamydia pneumoniae in liver transplant patients with chronic allograft rejection. Transplantation, 2003 10. Accepted. A. Heratizadeh, M. Koch, M. Mengel, C. Doege, P. Sótonyi, J Strehlau, B Nashan. Anti-MHC Ib antibodies can induce chronic renal allograft nephropathy in a nude rat model. Transplnatation, 2003 10. Közlésre elküldve.
Az értekezés tárgyán kívül megjelent idézhető absztraktok
J. Járay, P. Sótonyi, H. Podder, A. Daboczi, F. Perner. Ethical problem of donor issues reflected in public opinion polls. Am. J. Kidney Diseases. 1997, Vol. 29, NO. 4., A8. H. Podder, J. Járay, P. Sótonyi, F. Perner. Transitional cell carcinoma developed in renal allograft. Am J. Kidney Diseases. 1997, Vol. 29. NO. 4., A13. H. Podder, J. Járay, P. Sótonyi, F. Perner. When should we regraft a patient who had a malignant disease. Am. J. Kidney Diseases. 1997, Vol. 29., NO. 4., A13. P. Sótonyi, G. Demirci, N. Nashan. Apoptosis in chronic rejection of human liver allograft. The British Journal of Surgery. 1998, Vol. 85., Supplement 2., 85. P. Sótonyi, G. Demirci, B. Nashan. Role of apoptosis in chronic human allograft rejection. Immunbiology, Vol.200, Number 3-5,pp. 500. September 1999. C. Doege, A. Heratizahed, P. Sótonyi, G. Demirci, B. Nashan. Humoral versus cellmediated
morphological
changes
in
chronic
renal
transplant
Immunbiology, Vol. 200, Number 3-5, pp. 500., September 1999.
97
dysfunction.
P. Sótonyi, N. Lázár, A. Doros, J. Pápay, B. Nemes, A. Tóth, F. Perner. Xanthogranulomatous pyelonephritis can mimic malignant renal tumor. Report of two cases. Magyar Nephrológiai Társaság 2000. évi Nagygyűlése. Budapest, 2000. október 5-7. ( Absztrakt : Nephrol. Dial. Transplant. ) Schaff Z., Lotz G., Simon S., Patonai A., Sótonyi P., Nemes B., Georgopoulos A., Graninger W. . Decetion of chlamydia pneumoniae in liver transplant patients with chronic allograft rejection. Journal of Hepathology. 34 : 43-43, Suppl. 1 Apr 2001. M. Koch, C. Doege, A Heratizahed, P. Sótonyi, M. Mengel. J. Strehlau. T-Cell Dependent and T-Cell independent Immune Mechanisms of Chronic Allograft Nephropathy in a Nude Rat Model. The 7th Basic Sciences Symposium of the Transplantation Society. Thun / Bern Switzerland. August 22-26. 2001. Végső
Gy.,
Péter
A.,
Sótonyi
P.,
Alföldy
F.,
Perner
F.,
Rosszindulatú
pajzsmirígydaganat miatt végzett operációink és reoperációink. Magyar Sebészet, Előadáskivonatok, 2002 Június, Volume 55. 155. Sótonyi P., Toronyi É., Remport Á., Péter A., Tóth A., Végső Gy., Fehérvári I., Doros A., Weszelits V., Járay J. Vesetranszplnatáció aorto-iliacalis keringészavar esetén. Hypertonia és Nephrologia, 2003, 7, (S3), 72.
Az értekezés tárgykörén kívüli egyéb előadások, poszterek
Sótonyi
P.
A
haemodialysis
kapillárisok
regenerációjának
összehasonlító
patomorfológiája. Országos Tudományos Diákköri Konferencia. Debrecen. 1995. április 6-9. A. Szabó, P. Sótonyi, P. Berek, Zs. Járányi, V. Bérczi, Á. Petrohai. Aorto-iliac reconstruction in the presence of renal artery abnormalities. Semmelweis Egyetem,
98
ÁOK, Ér- és Szívsebészeti Klinika. Fiatal Sebészek Angol Nyelvű Kazuisztikai Fóruma. 2000 április 7. Budapest. M. Koch, C. Doege, A. Heratizahed, P. Sótonyi, M. Mengel, B. Nashan, J. Strehlau. TZell-abhängige und T-Zell unabhängige Immunmechanismen der chronischen Allograft-Nephropathie (CAN) im Nackrattenmodell. 31. Wissenschaftliche Tagung der Arbeitsgemenischaft für Pädiatrische Nephrologie. 30. März 2001. P. Sótonyi. Comperative study of the regeneration of haemodialysis capillaries. III. Semmelweis Science Fair Budapest, Semmelweis University of Medicine, 28. april 1994. P. Sótonyi. J. Járay. Result of immunosuppressive treatment following second kidney transplantation. IV. Semmelweis Science Fair. Budapest, Semmelweis University of Medicine, 27. april 1995. P. Sótonyi, G. Demircin, B. Nashan. Role of Apoptosis in Chronic Human Liver Allograft Rejection. Oslo. X. ESOT Congress. 19-22.06. 1999. Lászik A., Soos M., Hubay M., Sótonyi P. Verblutung infolge mangelnder Sorgfalt bei einem neurochirurgischen Eingriff. 79. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Rechtsmedizin. Essen. 2000. 09.27-30. Sz. Várbíró, P. Sótonyi, N. Lázár, B. Székács. No morphological or ultrastructural alterations in kidneys in the animal model of menopause and HRT. Magyar ephrológiai Társaság 2000. évi Nagygyűlése. Budapest. 2000. október 5-7. ( Absztrakt : Nephrol. Dial. Transplant. ). Schaff Z., Lotz G., Simon S., Patonai A., Sótonyi P., Nemes B., Georgopoulos A., Graninger W. . Detection of chlamydia pneumoniae in liver transplant patients with chronic allograft rejection. Magyar Gasztroenterologiai Társaság 43. Nagygyűlése. Balatonaliga, 2001. Június 05 – 09
99
Patonai A., Nemes B., Görög D., Kóbori L., Sótonyi P., Fehérvári I., Weszelits V., Doros A., Dallos G., Schaff Zs., Perner F . .Pathologycal evaluation of different complication of liver transplantation in Hungary – 5 years experience. Magyar Gasztroenterologiai Társaság 43. Nagygyűlése. Balatonaliga, 2001. Június 05 – 09.
100
