Doktori (Ph.D.) Értekezés Tézisei
A Tinuvin 770 kardiovaszkuláris hatásainak állatkísérletes vizsgálata
Dr.Sótonyi Péter Semmelweis Egyetem, Transzplantációs és Sebészeti Klinika
Program- és témavezeto: Prof. Dr. Kádár Anna
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola 8/2 Program Budapest 2003
„Minden ismereted csupán arra jó, hogy a változók közt eligazítson, de a változatlanról nem nyújt semmi bizonyosságot.” Weöres Sándor : A Teljesség
1.
Bevezetés:
A fénystabilizátorok megakadályozzák a muanyagok fény által okozott fotodegradációját. A sztérikusan gátolt aminok (Hindered Amines Light Stabilizer – HALS) az egyik legfontosabb csoportját alkotják a muanyag adalék anyagok családjának. A Tinuvin 770-et /bis(2,2,6,6tetramethyl-4-piperidiny)szebacainsav/ - mely a HALS vegyületcsoport tagja - világszerte alkalmazzák polietilén, polipropilén, polikarbonát, poliuretán, polisztirén, poliamid, poliacetil és akrilonitril polimerek fénystabilizátoraként.
A
felsorolt
polimerek
összetevoi
az
orvostudományban és az élelmiszeriparban alkalmazott különféle muanyagoknak. Az adott termék felhasználásától függoen a polimerek érintkezésbe kerülhetnek az emberi szervezettel. Ez a kölcsönhatás létrejöhet a gasztrointesztinális rendszer, a bor és a keringés közvetítésével. In vitro kísérletek igazolták, hogy a Tinuvin 770 kifejezetten hatékony benzotiazepin/+/-cis szeru L-típusú Ca 2+ csatorna blokkoló (IC50 érték = 10 nM). Ezt a hatását az L típusú Ca 2+ csatorna a 1 alegységéhez kötodve a fenilalkilamin és a benzotiazepin szelektív doménján fejti ki. A vegyület ezen kívül kisebb intenzitással a 1,4dihidropiridin kötohelyéhez is képes kapcsolódni. A Tinuvin 770 szerkezetében és pontos hatásmechanizmusában is eltér az eddig ismert Ca2+ csatorna blokkolóktól. A fent említett hatásán kívül megemlítendo, hogy a neuronális acetil-kolin receptorokat is gátolja in vitro kísérleti eredmények alapján (IC50 érték ˜ 200nM). Fennáll a lehetoség arra, hogy muanyagokból a Tinuvin 770 a közvetlen kapcsolat révén a keringésbe kerüljön (hemodialízis kezelés, infúzió,
transzfúzió, szív-tüdo gép). Az állandó, ismétlodo kölcsönhatás a muanyagok és az emberi szervezet között esetlegesen összefüggésbe hozhatóak olyan klinikai tünetekkel, mint a hemodialízis alatt kialakuló hipotenzió, hányinger, hányás, eszméletvesztés, stb.
2.
Célkituzések:
Az értekezésben egy széles körben alkalmazott, a felhasználási területén kiváló tulajdonságokkal rendelkezo, Ca 2+ csatorna és acetilkolin receptor blokkoló hatású muanyag adalékanyag, a Tinuvin 770 analitikai, in vitro és in vivo morfológiai, valamint hemodinamikai vizsgálatával foglalkozunk.
1.
A muanyag – szervezet kölcsönhatás alapmodelljéül a magas kontaminációs
lehetoség
(nagy
felület,
hosszú
kezelési
idotartam), és bizonyos klinikai tünetek (hipotenzió, izomgörcs, anafilaktoid
reakció)
jelenléte
miatt
a
muvese
kezelést
választottuk. Célunk egy olyan korszeru, nagy érzékenységu analitikai módszer kidolgozása volt, mely képes a dializátor membrán esetleges Tinuvin 770 tartalmának kimutatására. Az eljárással szemben támasztott követelményeink közé tartozott a kvalitatív meghatározás mellett a kvantitatív analitikai eljárás kifejlesztése. 2.
Az irodalmi adatok alapján a Tiuvin 770 in vitro kifejezett Ca2+csatorna
és
acetil-kolin
receptor
blokkoló
hatással
rendelkezik. Ennek ismeretében terveztük a Tinuvin 770
patomorfológiai
vizsgálatihoz
kísérleti
modell
felépítését.
Célunk a Tinuvin 770 direkt kardiopatogén hatásának vizsgálata izolált szívizomsejteken, melyben a szívizomsejtekre kifejtett hatás szelektíven tanulmányozható a humorális és egyéb szisztémás
(neuronális
szabályozás
–
acetil-kolin
neurotranszmisszió) hatás kiiktatása mellett. 3.
Az in vitro eros Ca 2+csatorna blokkoló képessége alapján feltételezheto
volt,
kardiovaszkuláris
hogy
hatással.
Tinuvin Célunk
770 egy
rendelkezhet
olyan
in
vivo
állatkísérletes modell felépítése volt, mely alkalmas a Tinuvin 770 heveny hemodinamikai hatásainak leírására. 4.
A hemodinamikai vizsgálatok igazolták, hogy a Tinuvin 770 in vivo is kifejezetten hatékony Ca 2+csatorna blokkoló (eros vazodilatátor, és negatív kronotróp hatású). Célunk egy olyan állatkísérletes
modell
kialakítása
volt,
melyben
in vivo
tanulmányozhatóak a Tinuvin 770 krónikus kardiotoxikus hatásai.
3. 1.
Anyag és Módszer: Kísérleteinkben négy, kereskedelmi forgalomban elérheto haemodialízis membránt vizsgáltunk: polisulfont, kuprofánt, és kétféle hemofánt. Mindegyik vizsgált membránból 4 grammot áztattunk 72 órán keresztül 100 ml 0,9%-os nátrium-klorid oldatban. Ezt követoen szilárd fázisú extrakciót alkalmaztunk a Tinuvin 770 izolálásához. A detektáláshoz LC-MS rendszert
pozitív inonizációs módban használtuk és figyeltük a protonált molekuláris iont (m/ z 481). 2.
Az
izolált
szívizom
sejteket
Sprague-Dawely
fajtájú
patkányokból nyertük Rajs módszere szerint. A kontroll csoportban a sejteket 0,9% -os NaCl-al inkubáltuk. A kísérleti csoportokban az izolált miocitákat 25 nM Tinuvin 770 tartalmú oldattal kezeltük. Az expozíciós ido szerint hoztuk létre a csoportokat (30, 60, 120 perc). Fény- és elektronmikroszkópos vizsgálatokat
végeztünk.
A
kreatin-foszfát
és
adenozin
trifoszfát meghatározást standard enzimatikus UV módszerrel végeztük. Az intracelluláris Ca 2+-ot ólom-acetátos módszerrel mutattuk ki. 3.
Az akut hemodinaikai vizsgálatokat 12 keverék kutyán végeztük (súly 24±1 kg). Az intravénás fenobarbitál anesztéziát követoen az állatokat intubáltuk és géppel lélegeztettük. Mértük az artériás vérnyomást (szisztólés, diasztólés, és közép nyomásokat),
bal
kamrai
nyomást
(EDP),
bal
kamrai
kontraktilitást (dp/dt), és a perctérfogatot. A standard EKG elvezetéseket
alkalmaztunk.
Ennek
alapján
számoltuk
a
szívfrekvenciát és PQ távolságot. A kontroll csoportban az oldószert
adagoltuk
(etanol:0,9%-os
NaCl
1:1
arányú
keveréke). A kísérleti csoportokban 1, 3.3, 6.6, 10, 33.3, 66.6, 100 mg Tinuvin 770 volt inkubálva, minden dózisnál 15 percig. A kísérleti csoportban szereplo a 12 kutya minden dózist megkapta, idorendben egymás után, növekvo sorrendben. A
hatékony dózistartományt elo-kísérletekkel határoztuk meg (1 – 100 mg). 4.
Ötven 250-300 grammos Wistar patkányt öt csoportba soroltunk (I-V.). Minden csoportba a súly tekintetében randomizáltan 10 patkányt osztottunk. A hemodinamikai kísérlet dózistartományi alapján határoztuk meg az alkalmazott adagokat. A Tinuvin 770-et tartalmazó oldatot 15 alkalommal intraperitoneálisan adtuk be (5 héten keresztül, hetente háromszor). A következo dózisokkal kezeltük az állatokat: I csoport: kontroll (etanol és 0,9%-os NaCl 1:1 arányú keveréke), II. csoport: 1µg, III. csoport: 10µg, IV csoport: 100µg, V. csoport: 1 mg. Fény és elektronmikroszkópos vizsgálatokat végeztünk. adrenerg
Az
intracelluláris
innerváció
Ca 2+-ot
változását
ólom-acetátos,
glioxálsavas
az
citokémiai
módszerrel mutattuk ki.
4.
Eredmények, Megbeszélés:
A következo megállapításokra jutottunk az analitikai hemodinamikai és toxikológiai vizsgálataink kiértékelését követoen: ?
A Tinuvin 770 analitikai vizsgálatára a kidolgozott SPE eljárás ás a HPLC elválasztással kombinált MS detektálási módszer alkalmas.
?
A kifejlesztett eljárás nagy érzékenységu (LOD=1 ng, LOQ=10 ng), alkalmas kis mennyiségu, akár nyomokban jelenlévo Tinuvin 770 kimutatására.
?
A Tinuvin 770 jelenléte egyértelmuen igazolható hemodializátor membránokban
?
A Tinuvin 770 vizes oldatokkal (0.9% -os nátrium-klorid) a membránokból kioldható.
?
Az izolált szívizomsejt kultúra alkalmas a sejtek szelektív vizsgálatára, külso hatások kiiktatásával.
?
A Tinuvin 770 igen kis mennyiségben (25 nM) irreverzibilis sejtkárosodást okoz izolált szívizomsejteken. A hatás az eltelt ido függvényében
erosödik,
majd
120
perc
elteltével
válik
irreverzibilissé. ?
A toxikus hatás kialakulásában a kalcium anyagcserezavarok mellett a Tinuvin 770 membránkárosító hatása is felvetodik kóroki tényezoként.
?
A megfigyelt eroteljes ATP szint csökkenés a sejt relaxációs zavarához vezet, ennek jeleként hiperkontrakciós nekrózis alakul ki.
?
A
kutya
modellben
a
Tinuvin
770
kifejezett
heveny
hemodinamikai hatását igazoltuk ?
A Tinuvin 770 alacsonyabb dózisban (1-10 mg) a szívizom kontraktilitását
csökkenti,
csökkenéséhez vezet.
mely
a
vérnyomás
enyhe
?
A Tinuvin 770 magasabb dózisban (10-60 mg) a kamra kontraktilitásának csökkenése mellett fokozott vazodilatációt hoz létre, mely a vérnyomás eroteljes csökkenését okozza. A 66,6 mg beadását követoen a PQ távolság megnyúlása észlelheto, a szívfrekvencia csökkenése mellett. A perctérfogat relatíve állandó szinten marad, egészen a letális dózisig.
?
100 mg-os dózis a keringés összeomlásához vezet, az állatok 75 %-a elpusztul. A Tinuvin 770 EC50 értéke = 0,137 mg/ttsKg, LD50 értéke = 4 mg / ttskg.
?
A krónikus patkánymodellben igazoltuk, hogy a Tinuvin 770 szubakut dózisban is toxikus elváltozásokat hoz létre.
?
Az állatokban dózisfüggo miokardiális elváltozások jönnek létre. A 100 ug és 1 mg dózissal kezelt állatokban hiperkontrakciós nekrózis és miocitolízis uralja a képet.
?
A citokémiai reakció igazolta, hogy a sejtek kalcium tartalma jelentosen megno. Ezzel párhuzamosan az idegvégzodéseken a katekolamin mennyisége kimutathatóan megno. A szabályos véglemez szerkezet megváltozik.
?
A 1 mg -os dózisnál az állatok közel egyharmada elpusztul, igazolva a Tinuvin 770 magas dózisának krónikus toxikus hatását.
Eredményeink
alátámasztják
a
Tinuvin
770-el
kapcsolatos
toxikológiai és klinikai vizsgálatok fontosságát. Az eddig ismert kalcium
csatorna
blokkoló
vegyületekhez
való
funkcionális
hasonlósága megteremtheti a lehetoségét annak, hogy a dialízis kezelés alatt a keringésbe kerülve keringési változásokat okozzon. A kalcium csatorna blokkoló hatású Tinuvin 770 így elméletileg hozzájárulhat a több tényezo által kialakított dialízishez kapcsolódó kardio -vaszkuláris szövodményekhez. A Tinuvin 770 molekulán kívül
számtalan
olyan
muanyagipari
alkalmazásban szereplo
vegyület ismert, mely az emberi szervezettel tartósan közvetlen kapcsolatba
kerül.
Szükséges
lehet
a
molekulák
átfogóbb
toxikológiai vizsgálata az ipai alkalmazás engedélyezése elott, valamint a már használatban lévo anyagok szorosabb norma ellenorzése
5.
Az értekezés témájában megjelent közlemények:
P. Sótonyi, J. Járay, Z. Pádár, J. Woller, S. Füredi, T. Gál. Comparative study on reused haemodialysis
membranes, The
International Journal of Artificial Organs. 1996, Vol. 19 no. 7., pp. 001-006.
P. Sótonyi, E. Keller, J. Járay, B. Nemes, T. Benko, A. Kovàcs, A. Tolokàn, J. Rajs, A light stabilizer Tinuvin 770 induced injury of adult cardiac myocytes. Forensic Science International. 2001, 119, 322-327.
P. Sótonyi, A. Kovács, G. Volk, J. Járay, A. Benko. Detection of Tinuvin 770 a light stabilizer of plastic materials from dialysis membranes by high performance liquid chromatographic analysis. Journal of Chromatographic Science. In press, Közlésre elfogadva 2003. 08.25.
P. Sótonyi, M. Hubay, I. Szentmáriay. A light stabilizer Tinuvin 770 induced toxic injury of ventricular myocardium. Archives of Legal Medicine. In press, Közlésre elfogadva 2003. 09.
P. Sótonyi, B. Merkely, M. Hubay, J. Járay, E. Zima, P. Soós, A. Kovács, I. Szentmáriay. Comparative study on cardiotoxic effect of Tinuvin 770; a light stabiliser of medical plastics in rat model. Toxicological Science. Közlésre elfogadva 2003.10.29.
6.
Köszönetnyilvánítás:
Oszinte hálámat szeretném kifejezni Prof. Dr. Kádár Annának program- és témavezetomnek, aki már munkám legelején elhitte nekem, hogy ez a téma fontos és valóban kapcsolódhat mind a patológia, mind a klinikum tárgyköréhez. Külön köszönöm neki, a tanácsait, kritikai megjegyzéseit és azt, hogy klinikai munkámat és ezzel járó zavaros idobeosztásomat mindig elfogadta. Hálás köszönettel tartozom Prof. Dr. Perner Ferencnek és Prof. Dr. Járay Jenonek akik 1993 óta lehetové tették, hogy bekapcsolódjam a klinikánk tudományos életébe. Nagyon köszönöm a közvetlen kollégáimnak a Transzplantációs és Sebészeti Klinikán, hogy lehetové tették számomra, hogy klinikai munkám mellett kísérleteimet elvégezzem. Köszönöm az Országos Igazságügyi Toxikológiai Intézetbol Dr. Kovács Anikónak, és Dr. Benko András igazgató úrnak azt a kitartó munkát, melyet az analitika tárgykörében együtt végeztünk. Hálás vagyok azért, mert a kémiához keveset értoként is foglalkoztak velem. Köszönöm, Prof. Dr. Acsády Györgynek, Prof. Dr. Juhász-Nagy Sándornak Prof Dr. Nemes Attilanak, Prof. Dr. Horkay Ferencnek, Dr. Kékesi Violettanak, Dr. Merkely Bélának, akik lehetové tették számomra,
hogy
az
Ér-és
Szívsebészeti
Klinika
Kutató
Laboratóriumában dolgozzak. Nagyon hálás vagyok Dr. Zima Endrének és Dr. Soós Pálnak a barátságukért és azért a sok gyakorlati és elméleti segítségért, amit toluk kaptam.
Ezúton köszönöm meg az Igazságügyi Orvostani Intézetbol dr. Hubay Márta, Prof..Dr. Keller Éva és Dr. Szentmáriay István munkáját, melyet közös kutatásainkban együtt végezhettünk. Nagyon
köszönöm
az
elo-opponenseimnak
Prof.Dr.
Kerényi
Tibornak és dr. Toronyi Évának az értekezésemmel kapcsolatban adott kritikai és elismero megjegyzéseiket. Köszönöm továbbá a II.sz. Patológiai Intézet, az Igazságügyi Orvostani Intézet, az Ér és Szívsebészeti
Klinika,
és
az
Országos
Toxikológiai
Intézet
asszisztenseinek segítségét. Szeretném külön kifejezni hálámat és nagyrabecsülésemet Werglesz Albertnek (Berci bácsinak), aki nyolc éves koromban mutatta meg eloször az „öreg hitachi”, az elso elektronmikroszkópot és azóta mindig segít ha kérem. Köszönöm barátaimnak azt a sok kedvességet, szeretetet és azt a környezetet ami mindig lehetoséget teremtett a munkából való kikapcsolódásra. Ki kell emelnem dr. Lovas Gábort és feleségét Ross Viktóriát, akik minden idoben segítségemre siettek legyen az tudományos, vagy bármilyen más probléma. Legfoképpen pedig feleségemnek Lulunak, aki mindig mindenben társam, köszönöm a töretlen hitét, a nem szuno szeretetét, amivel munkámhoz biztosította a feltételeket. Gyermekeimnek Botondnak és Borókának köszönöm, hogy jól viselkedtek, amikor nem voltam otthon. Édesapának és édesanyának mindenért köszönet. Köszönöm mindazon itt fel nem sorolt kollégáim és családtagjaim segítségét,
akik
bármilyen
formában
hozzájárultak
ösztöndíjasként végzett tudományos munkám elvégzéséhez.
Ph.D.
