A tüdırák progressziójában szerepet játszó tényezık Doktori értekezés Dr. Pápay Judit Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola
Témavezetı: Dr. Tímár József egyetemi tanár, az orvostudományok doktora
Hivatalos bírálók: Dr. Gálffy Gabriella egyetemi adjunktus, PhD Dr. Jäckel Márta osztályvezetı fıorvos, PhD Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Sréter Lídia egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Kerényi Tibor egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Dr. Szentirmay Zoltán osztályvezetı fıorvos, kandidátus
Budapest 2009
Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke.........................................................................................................5 1. Bevezetés......................................................................................................................6 2. Irodalmi áttekintés........................................................................................................7 2.1. A tüdırák kialakulásának tényezıi........................................................................7 2.2. A tüdırákok szövettani (WHO) és TNM osztályozása.........................................7 2.3. A tüdırákok áttétképzése....................................................................................10 2.4. A neuralis sejtadhéziós molekula (NCAM) és az NCAM-hoz kötött α-2,8 polisziálsav (polySia)......................................................................................................11 2.5. Genetikai eltérések és következményeik a különbözı szöveti típusú tüdırákokban.......................................................................................................13 2.6. A tüdırák kezelése, terápiás elvek......................................................................19 3. Célkitőzések.................................................................................................................22 4. Anyagok és módszerek................................................................................................23 4.1. Az NCAM–hoz kötött α-2,8-polisziálsav (polySia) expressziójának vizsgálata kissejtes tüdırákban SCLC).................................................................................23 4.1.1. Tumorszövetek..........................................................................................23 4.1.2. Sejttenyészeti sejtvonalak..........................................................................23 4.1.3. A polySia hatásának vizsgálata humán kissejtes tüdırákvonal (NCI-H69) polySia pozitív és polySia negatív szubklónjainak növekedésére in vitro és in vivo......................................................................................................................23 4.1.3.1. Sejtklónozás és sejtvonalak........................................................23 4.1.3.2. Reagensek és arany-jelölés........................................................ 24 4.1.3.3. Az endoN elıállítása..................................................................24 4.1.3.4. Citológiai minták készítése....................................................... 25 4.1.3.5. Immuncitokémia........................................................................ 25 4.1.3.6. Immunoblot................................................................................26 4.1.3.7. Sejtciklus szinkronizálás............................................................26 4.1.3.8. A DNS - metiláció gátlása 5- azacitidinnel...............................26 4.1.3.9. A sejfelszíni polySia eltávolítása endoN kezeléssel.................. 27
1
4.1.3.10. A sejtaggregáció kálcium függésének vizsgálata EDTA kezeléssel .................................................................................27 4.1.3.11. Kombinált endoN és EDTA kezelés.........................................27 4.1.3.12. Standard aggregációs assay.......................................................27 4.1.3.13. Standard diszaggregációs assay...............................................28 4.1.3.14. A sejt-szubsztrát adhézió vizsgálata........................................28 4. 1.3.15. Kolónia kialakító képesség vizsgálata...................................................29 4.1.3.16. Nude egér kisérletek ...............................................................29 4.2. Az NCAM-hoz kötött α-2,8-polisziálsav (polySia) szintézisének és sejtfelszíni re-expressziójának vizsgálata humán kissejtes tüdırákvonal (NCI-H69) sejtjeiben..............................................................................................................29 4.2.1. Reagensek..................................................................................................30 4.2.2. Sejtek.........................................................................................................30 4.2.3. Immunprecipitáció, SDS/PAGE................................................................30 4.2.4. Immuncitokémia........................................................................................31 4.2.5. EndoN kezelés a sejtfelszíni polySia eltávolítására...................................32 4.2.6. Hımérséklet indukálta transzport blokk.................................................. .32 4.2.7. Radioaktív polisziálsav-prekurzor beépülésének követése........................33 4.2.8. Kémiai (monenzin* indukálta) traszport blokk.........................................33 4.3. Nem-kisejtes tüdırákok progresszójában szerepet játszó fehérjék expressziójának vizsgálata szöveti multiblokk alkalmazásával.....................................................34 4.3.1.Betegek és metodikák.................................................................................34 4.3.2. A szöveti multiblokk (TMA) kialakítása...................................................35 4.3.3- Immunhisztokémia....................................................................................36 4.3.4. Értékelés, hierarchikus csoportosítás, statisztikai elemzés........................38 4.4. Platina-bázisú neoadjuváns kemoterápia hatása az apoptózis és a proliferáció markereire valamint az ERCC1 expressziójára nem-kissejtes tüdırákokban.....40 4.4.1. Betegek és metodikák................................................................................40 4.4.2. Immunhisztokémia.....................................................................................41 4.5. Az EGFR immunhisztokémiai kimutatásának értéke az EGFR-TKI célzott terápiára alkalmas tüdıadenocarcinomák kiválasztásában..................................43 4.5.1. Betegek és tumormintáik...........................................................................43
2
4.5.2. Immunhisztokémia (IHC) .......................................................................43 5. Eredmények ................................................................................................................45 5.1. Az NCAM–hoz kötött α-2,8-polisziálsav (polySia) hatásának vizsgálata humán kissejtes tüdırákvonal (NCI-H69) polySia pozitív és polySia negatív szubklónjainak övekedésére in vitro és in vivo....................................................45 5.1.1. A polySia expressziója primer humán SCLC tumorokban és áttéteikben 45 5.1.2. Klonális alvonalak kialakítása NCI - H69 kissejtes tüdırákból...............47 5.1.3. A különbözı arányú polySia expresszió alapja a H69 SCLC klónokban .48 5.1.4. A polisziálsav (polySia) és az NCAM jellemzése immunoblottal............48 5.1.5. A metiláció hatásának vizsgálata a polySia cellularis expressziójára.......49 5.1.6. A polySia expressziójának változása az idı függvényében......................49 5.1.7. A polySia hatása a sejt-sejt közötti interakcióra ......................................50 5.1.8. A polySia hatása sejt-szubsztrát adhézióra ..............................................51 5.1.9. A sejtklónok növekedése lágy agaron és nude egerekben ........................52 5.2. Az NCAM-hoz kötött α-2,8-polisziálsav (polySia) szintézisének és sejtfelszíni re- expressziójának vizsgálata humán kissejtes tüdırákvonal (NCIH69) sejtjeiben.....................................................................................................53 5.2.1. A transzportfolyamat követése immunelektronmikroszkópos és immunprecipitációs módszerrel.................................................................54 5.3.Nem-kissejtes tüdırákok progresszójában szerepet játszó fehérjék expressziójának vizsgálata szöveti multiblokk alkalmazásával...........................59 5.3.1 Fehérje expressziós profil eltérések a progresszió különbözı stádiumai között........................................................................................................60 5.3.2. Fehérje expressziós különbségek a hisztológiai típusok között.................63 5.3.3. Hierarchikus csoportosítás, klaszter analízis a fehérjék expressziója alapján ....................................................................................................64 5.3.4. A fehérjék expressziója és a betegek túlélési ideje közötti kapcsolat.......67 5.4. Platina-bázisú neoadjuváns kemoterápia hatása az apoptózis és a proliferáció markereire valamint az ERCC1 expressziójára nem-kissejtes tüdırákokban ....70 5.4.1. Apoptózis markerek a neoadjuváns terápia elıtti és utáni (pre- és posztkemoterápiás) tumorszövetekben .....................................................72
3
5.4.2. A Ki-67 expressziója a neoadjuváns kemoterápia elıtt és után a NSCLC szövetekben .............................................................................................74 5.4.3. Az ERCC1 expressziója a neoadjváns kemoterápia elıtt és után a NSCLC szövetekben ..............................................................................................74 5.4.4. Az egyes betegek túlélési adatai................................................................76 5.5. Az EGFR immunhisztokémiai kimutatásának értéke az EGFR-TKI célzott terápiára alkalmas tüdıadenocarcinomák kiválasztásában.................................78 5.5.1. Retrospektív vizsgálatok eredménye........................................................78 5.5.2. Prospektív vizsgálatok eredménye............................................................78 6. Megbeszélés.................................................................................................................81 6.1. NCAM- kötött α-2,8 polisziálsav hatása a kissejtes tüdırákok viselkedésére in vitro és in vivo .....................................................................................................81 6.2. Nem-kissejtes tüdırákok és agyi áttéteik fehérje expressziójának összehasonlító vizsgálata.............................................................................................................85 6.3. Neoadjuváns terápia hatása az apoptózis markerekre és a proliferációra ............91 6.4. Az EGFR immunhisztokémiai kimutatásának szerepe az EGFR-TKI terápia megtervezésében..................................................................................................95 7. Következtetések...........................................................................................................97 8. Összefoglalás..............................................................................................................99 9. Summary...................................................................................................................100 10. Irodalomjegyzék…………......................................................................................101 11. Saját publikációk jegyzéke…..................................................................................117 12. Köszönetnyilvánítás.................................................................................................120
4
Rövidítések jegyzéke
ADC
adenocarcinoma
BAC
bronchioloalveolaris carcinoma
CAS
cellular apoptosis susceptibility protein
EGFR
epidermal growth factor receptor
EGFR-TKI
EGFR -tirozin-kináz inhibitor
EndoN
endo - neuraminidáz enzim
ERCC1
excision repair cross-complementation group 1
HBME-1
mesothelsejt és epitheloid mesothelioma antitest
IHC
immunhisztokémia
NCAM
neural cell adhesion molecule
NSCLC
non-small cell lung carcinoma (nem-kissejtes tüdırák)
OKTPI
Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet
polySia
α-2,8,kötésben lévı polisziálsav az NCAM-on
PSA
polisialic acid (polisziálsav)
SCC
squamous cell carcinoma (laphámrák)
SCLC
small cell lung carcinoma (kissejtes tüdırák)
TMA
tissue microarray (szöveti multiblokk)
5
1. Bevezetés A tüdırák okozta halálozás az egész világon a daganatos halálozási statisztikák élén áll. Az utóbbi évek adatai arra utalnak, hogy az újonnan regisztrált megbetegedések száma évrıl évre emelkedik. A férfiak tüdırák halálozása tekintetében Magyarország világelsı. A világ fejlett országaiban és hazánkban is a férfiak tüdırák incidenciája az utóbbi években nem emelkedett, a nık esetében a növekedés üteme töretlen. A gyakori elıfordulás rossz gyógyeredményekkel társul [1]. A rohamosan fejlıdı diagnosztikai módszerek, a képalkotó vizsgálatok ellenére a tüdırákok jelentıs hányada már lokálisan elırehaladott stádiumban kerül felismerésre, s így a mőtéti radikalitás, az elsıdleges daganat eltávolításának lehetıségei rendkívül korlátozottak. A betegség prognózisa azokban az esetekben is kedvezıtlen, amikor a primer tüdırák mőtétileg eltávolítható, hiszen a statisztikai adatok szerint a prognosztikailag viszonylag jobb klinikai stádium esetében is alacsony a túlélési idı. Az I. stádiumú betegek közel 60-65%-a, míg a II. stádiumú betegek kb. 45-50% -a esetében haladja csak meg a túlélési idı az 5 évet az elsıdleges terápiát követıen. Az összes tüdırákos betegre vonatkoztatva a várható ötéves túlélés 10-15%-os. A tüdırák hazai epidemiológiai adatai Magyarországon az elmúlt két évtizedben robbanásszerően emelkedett az incidencia, az utóbbi néhány évben ugyan némi mérséklıdés tapasztalható, de jelenleg is évi mintegy 8-10 ezer az újonnan felfedezett beteg. A prevalencia, köszönhetıen az egyre hatékonyabb kezelési módoknak is, fokozatosan emelkedik, jelenleg közel tizenhétezer. A mortalitás nyolcezer, ami jelzi, hogy a betegség ma még a kevéssé gyógyítható daganatok közé tartozik. Az operabilitási ráta 22%, az ötéves túlélés azonban alacsonyabb a nemzetközi átlagnál, 8-10% [1]. Az újonnan diagnosztizált esetek számának emelkedése, a felismeréskor már gyakran elırehaladott stádium, a kedvezıtlen prognózis egyaránt indokolttá teszi a daganatos progressziót befolyásoló tényezık vizsgálatát.
6
2. Irodalmi áttekintés 2.1. A tüdırák kialakulásának tényezıi A tüdı elsıdleges rosszindulatú daganatainak többsége carcinoma. A nem hámeredető malignus tumorok aránya nem több mint 1% (WHO Classification of Tumours, Pathology & Genetics Tumours of the Lung, Pleura, Thymus and Heart, 2004) [2]. A tüdırákok kialakulásában elsıdleges szerepet tulajdonítanak a dohányzásnak. Ennek kezdeti felismerése a XX. század 20-as-30-as éveire tehetı, az elsı nagy epidemiológiai vizsgálatot az 50-es években Nagy-Britanniában majd az Egyesült Államokban végezték. Nagyszámú adatra alapozott statisztikai analízis igazolta, hogy összefüggés van a tüdırák kialakulása, valamint a dohányzás kezdete, idıtartama, intenzitása és egyéb jellemzıi - pl. a dohány minısége, a filteres cigaretták elterjedése, stb. - között. A dohányzók tüdırák okozta halálozási kockázata a naponta elszívott cigaretta mennyiségével párhuzamosan nı. Az epidemiológiai vizsgálatok eredményeit összegezve az Egyesült Államok tiszti fıorvosának 1989. évi jelentése megállapította, hogy a tüdırákot 80-90%-ban a dohányzás okozza, ugyanakkor a dohányzóknak viszonylag alacsony, csak 10-15%-ában várható a tüdırák kialakulása [3]. A tüdırákos betegek döntı hányada esetében tehát a dohányzás oki szerepe az epidemiológiai adatok alapján igazolható; ez az összefüggés a legszorosabb a laphámrákok esetében, majd ezt követi a kissejtes tüdırák és sorrendileg az adenocarcinoma.
2.2. A tüdırákok szövettani (WHO) és TNM osztályozása A szövettani klasszifikáció a tüdırákok esetében ma még kiemelt jelentıségő, hiszen ettıl függ a beteg kezelési protokollja. A kezelés szempontjából a sejtmorfológia alapján két alapvetı csoport különítendı el, amelyek szoros összefüggést mutatnak a daganat felismerésekor annak kiterjedésével és klinikai stádiumával.
7
A kissejtes tüdırák (SCLC) valószínőleg a neuroendokrin eredető Kultshiczky-sejtekbıl jön létre, amely a daganatos átalakulás után is megırzi neuroendokrin jellegét. Mások szerint az SCLC sejtes eredete biztonsággal nem igazolt, feltehetıen közös pluripotens bronchiális prekurzor sejt különbözı irányú differenciálódása felelıs a különbözı szövettani típusú daganatok kialakulásáért (WHO 2004.) A többi, hisztogenezisét tekintve egymástól eltérı tüdırák közös tulajdonsága a kissejtestıl való elkülönülés, mind morfológiai, mind prognosztikai és terápiás szempontból. Míg a kissejtes tüdırák a daganat felismerésekor már nagy valószínőséggel disszeminált formában létezik, a nem-kissejtes (NSCLC) csoportba tartozó, hisztológiailag heterogén kategória tagjai esetében gyakrabban számolhatunk a daganat lokális jellegével. A nem-kissejtes tüdırákok szöveti megjelenésük alapján az alábbi módon osztályozhatók tovább: laphámrák (25-35%, férfiakban 44%, nıkben 25%),
adenocarcinoma
(35-40%,
férfiakban
28%,
nıkben
42%),
nagysejtes
(anaplasztikus) carcinoma (5-10%), bronchioloalveolaris carcinoma (BAC) [2]. Utóbbi az adenocarcinomák egyik altípusa, azonban eltérı klinikai viselkedése, gyakran többgócú megjelenése, lassúbb progressziója, viszonylag kedvezıbb prognózisa miatt külön említést érdemel. A betegek döntı többsége nı, anamnézisükben dohányzás nem szerepel, s a betegség elıfordulása ázsiai emberekben gyakoribb. A hisztológiailag szigorú feltételekhez kötött BAC – alveoláris szeptumok mentén terjed, sztrómális, vaszkuláris és pleurális invázió nélkül – a tüdırákok 4%-a, a szövettanilag kevert formában megjelenı, BAC komponenst is hordozó adenocarcinoma azonban a NSCLC csoport közel 20%-a. Új BAC esetek megjelenése napjainkban emelkedı tendenciát mutat [4,5]. A szintén NSCLC osztályba tartozó adenosquamosus carcinoma gyakorisága változó (0,4 - 4%). Érdemes megemlíteni, hogy az egyes hisztológiai típusok aránya az idıben jól láthatóan változik. Az Egyesült Államokban a tüdı laphámrák maximális incidenciáját a férfi lakosságban 1981-ben érte el, az adenocarcinoma elıfordulása ugyanakkor 1987-ig folyamatos emelkedést mutatott. Ennek eredményeként jelenleg az adenocarcinoma a leggyakoribb tüdırák típus a férfiakban, ami az 1950-es évtizedben a legkissebb arányú tumor volt, közel 5%-kal. Ezzel szemben nıkben mindkét szövettani típus elıfordulása emelkedı tendenciát mutatott. A laphámrák incidenciája a 90-es évek környékén érte el maximumát. Hasonló irányú változás volt megfigyelhetı más országok eseteiben is -
8
Hollandia, Japán és az Egyesült Királyság -, de figyelembe kell venni azt is, hogy az adatokat befolyásolhatják az idıközben módosított klasszifikációk, a periférikus tumorok esetében alkalmazható fejlettebb diagnosztikai eszközök és egyéb paraméterek (WHO 2004.) Az Országos Korányi Tbc és Pulmonológiai Intézet (OKTPI) 2008-as évkönyv adatai azt mutatják, hogy Magyarországon is az új megbetegedéseken belül az adenocarcinoma áll az élen 30%-os aránnyal, melyet a laphámrák (29%), majd a kissejtes tüdırák (11%) követ. A további esetek megoszlása: nagysejtes carcinoma 2%, az egyéb és a nem klasszifkált kategória pedig együttesen 28%[6]. A nem-kissejtes tüdırákok stádiumbeosztását – ami a TNM klasszifikáción alapul – az 1. táblázat tartalmazza.
1. táblázat: A nem-kissejtes tüdırákok TNM osztályozása és stádiumtól függı kezelése Stádium okkult 0 IA IB IIA IIB
IIIA IIIB IV
TNM osztályozás TXN0M0 TisN0M0 T1N0M0 T2N0M0 T1N1M0 T2N1M0 T3N0M0 T1N2M0 T2N2M0 T3N1M0 T3N2M0 bármelyik T, N3M0 T4, bármelyik N, M0 bármelyik T és N, M1
Kezelés véletlenszerő felismerés, bronchoszkópia során a daganat mőtéti eltávolítása lehetséges
sebészi terápia és posztoperatív kemoterápia
kemo- és sugárterápia, sebészi kezelés kemoterápia vagy kemo- és sugárterápia palliatív kemoterápia
A kissejtes tüdırákok stádiumbeosztása az NSCLC csoporttól részben eltérı. Korábban a körülhatárolt (limited disease: LD) és a kiterjedt (extensive disease: ED) stádiumokat alkalmazták (2. táblázat), ma azonban (ismét) a nem-kissejtes carcinomáknál használt TNM klasszifikáció ajánlott, amelyben az LD az I-IIIB stádiumnak, míg az ED a TNM IV. stádiumának felel meg. A kissejtes tüdôrák sebészi kezelése elsôsorban az I-II stádiumokban lévı betegeknél lehetséges, a III/A stádiumú
9
betegek esetében ma még nagyon kérdéses. A hazai gyakorlatban a komplex neoadjuváns (kemo- és radioteápia) protokollt követik, amellyel 20-40% közötti 5 éves túlélés érhetô el [7].
2. táblázat: A kissejtes tüdırákok stádiumbeosztása
Stádium Kiterjedés körülhatárolt az egyik tüdı és környéki nyirokcsomó (LD) szervi és/vagy mellhártya áttétek kiterjedt (ED) kiújulás a tüdıben vagy egyéb szervben visszatérı
A kissejtes tüdırákok diagnózisának felállításakor azonban a betegek 80%-ában már szervi áttétek meglétével kell számolni, tehát az elsıdleges sebészi megoldás nem jön szóba.
2.3. A tüdırákok áttétképzése A tüdırákok agresszív klinikai viselkedése elsısorban abban nyilvánul meg, hogy a daganat felismerésekor a betegség gyakran már igen elırehaladott stádiumban van. Az áttétképzés sajátos lokalizációja, ezen belül is fıként az agyi metasztázisok kialakulása a sebészi és egyéb terápiás törekvések ellenére is korán megpecsételi a beteg sorsát [8]. Az ismeretlen lokalizációjú elsıdleges daganatok okozta agyi áttétek hátterében az elsı helyen az esetek 72%-ában a tüdırák áll, melyet az emlı-, majd a veserák okozta cerebrális metasztázisok gyakorisága követ. Magas betegszámmal végzett vizsgálatok eredményei arra utalnak, hogy az izolált agyi áttétek az esetek 29%ában a primer tumor felismerését követıen 2 éven belül jelentkeznek [9]. Hatvan évnél fiatalabb betegekben az agyi metasztázis kialakulása gyakoribb, s korábban következik be. Kissejtes tüdırákok idegrendszeri áttéteinek vizsgálata arra utal, hogy az esetek 15%-ában neurológiailag tünetmentes betegeknél is kimutatható az agyi áttét megfelelı képalkotó vizsgálatok alkalmazásával [10]. További, a nem-kissejtes és kissejtes
10
tüdırákokat összehasonlító tanulmány szerint a nem-kissejtes daganatcsoportban az agyi áttétképzés kisebb arányú, mint a kissejtesben [11]. Hosszú távú betegkövetési vizsgálatok arra utalnak, hogy az izolált, egygócú agyi metasztázist hordozó betegeknél akkor várható a legkedvezıbb prognózis, ha a primer tumor eltávolítása lobektómiával történt és az agyi áttét több mint egy évvel azt követıen alakult ki [12]. Ebben a betegcsoportban egyéb, az életkort, nemet, lokalizációt érintı faktorok statisztikailag nem befolyásolták a túlélési idıt. Más szerzık 200 kissejtes tüdırákos beteg adatainak összehasonlító elemzésével megállapították, hogy a férfiak kissejtes tüdırákja rosszabb prognózisú, mint a nıbetegeké. A daganat anatómiai lokalizációja és az agyi áttétek elıfordulása között azonban nem tapasztaltak összefüggést [13]. A különbözı szövettani típusú tüdırákok eseteiben a hematogén áttétképzés szervi megoszlása alapvetıen nem különbözik egymástól, de eltérés tapasztalható a metasztatizálás dinamikájában. A kissejtes tüdırákot és az adenocarcinomák egy részét korai és gyors metasztatizálás jellemzi, míg a laphámrákok esetében az áttétek késıbb és lassabban alakulnak ki. [14]. A kissejtes tüdırákok áttétképzésére vonatkozó tanulmányok a korábbi években gyakran vizsgálták a daganat sejtfelszíni jellemzıit, azok változását a metasztatizálás folyamatában.
2.4.
A neuralis sejtadhéziós molekula (NCAM) és az NCAM-hoz
kapcsolt α-2,8 polisziálsav (polySia) A daganatok jellemzése, az áttétképzıdés körülményeinek és feltételeinek vizsgálata hosszú évek óta azokra a sejtfelszíni struktúrákra, molekulákra irányult, amelyek szerepet játszanak a sejt és környezete kapcsolatában, a tumorsejt invazivitásban, érbetörésében és az áttétek szervi megoszlásában. A neurális sejtadhéziós molekula (neural cell adhesion molecule; NCAM) egyik célpontja az ilyen vizsgálatoknak. Az NCAM (CD56) homofil kötésben lévı glikoprotein, az ideg-, glia -, harántcsíkolt izom- és NK (natural killer) – sejtek felszínén expresszálódik, szerepet játszik a sejt-sejt közötti adhézióban, az idegszövetek
11
embrionális fejlıdésében és differenciálódásában, a tanulási és az emlékezési memóriában. [15,16]. CD56 ellenes antitesttel pozitív reakciót mutatnak a normál NK sejtek, az aktivált T sejtek, az agy és kisagy, valamint a neuroendokrin szövetek sejtjei. A daganatok között a myeloma, chronicus myeloid leukaemia, a neuroendokrin tumorok, a Wilms tumor, phaeochromocytoma és a kissejtes tüdırák (SCLC) sejtjei NCAM pozitívak. Az NCAM három fı izoformája a citoplazmatikus doménben különbözik egymástól [17]. Az NCAM poszttranszlációs modifikációja során az ötödik Ig doménhez polisziálsav (PSA) kötıdik, amely meghatározza az NCAM homofil kötıdési tulajdonságait és csökkentheti a sejtek migrációjában és inváziójában fontos szerepet játszó sejtadhéziót. A felszínén α-2,8-kötésben homopolimér formájában sziálsavat (polySia) hordozó NCAM a légzıhám egyedfejlıdése során jelenik meg átmenetileg. Érett respiratórikus hámsejtekben egészséges körülmények között nem mutatható ki, a kissejtes tüdırákokban (SCLC) azonban expresszálódik [18,19]. Tíz-tizenöt évvel ezelıtt kiemelt érdeklıdés fordult az NCAM felé, fıként a molekula daganatos terjedésben, áttétképzésben való szerepét illetıen. Az NCAM tumormarkerként való megjelenését is tanulmányozták kissejtes tüdırákos betegekben, de a korai és késıi stádiumú betegeket összehasonlítva nem találtak szignifikáns különbséget a szérumban mért NCAM koncentrációban [20]. A kissejtes és nemkissejtes tüdırákokat összehasonlítva is vizsgálták a polySia expressziójának tényét és differenciáldiagnosztikai szerepét arra a következtetésre jutva, hogy a polySia expresszió az NSCLC csoportban igen alacsony és fokális [19] Az NCAM prognosztikai szerepét egyéb markerekkel (p53 és ciklin D1) együttesen értékelve a betegek túlélési ideje és az NCAM expresszió, valamint az NCAM szializált izoformájának expressziója között nem találtak szignifikáns összefüggést [21].
12
2.5. Genetikai eltérések és következményeik a különbözı szöveti típusú tüdırákokban A tüdırákok kialakulásában komplex genetikai változások játszanak szerepet. Számos környezeti karcinogén, akár a dohányfüstben, akár az ipari eredető szennyezı anyagokban, a bronchialis vagy a bronchiolo-alveolaris hámsejtek irritációján keresztül fejti ki hatását. Ezek a karcinogén vegyületek általában az egész hörgırendszerre hatással vannak, így ugyanabban az expozíciónak kitett szervben egyidejúleg számos elsıdleges lézió jöhet létre. Ez a megfigyelés vezetett a mezı-karcinogenezis elmélet kialakulásához. Amennyiben dohányosokban a karcinogének aktiválásában fontos szerepet játszó CYP1A1 magas aktivitásához a lebontásban érintett GSTM’1 csökkent funkciója társul, a tüdırák kialakulásának kockázata nagymértékben megnı [22]. A tüdırákok kialakulásában és progressziójában szerepet játszó génhibák feltérképezése az évek során újabb és újabb információt szolgáltat. Tüdırák kialakulásáért specifikusan felelıs genetikai hiba még nem ismert, de a családban való tüdırák halmozódás esetenként kimutatható. Számos vizsgálat utal arra is, hogy a nık érzékenyebbek a dohányzással szervezetbe kerülı karcinogének iránt, mint a férfiak. A nem-dohányzó nıbetegek adenocarcinomája is azt látszik alátámasztani, hogy bizonyos hormonális háttér felelıssé tehetı a két nem közötti különbségért [23]. A tüdırákokban ismert gyakori génhibák csoportosíthatók lokalizációjuk (pl. kromoszómához kötött), gyakoriságuk (az egyes ráktípusokban százalékos arányuk), a károsodás következményei (pl. onkogének aktiválódása, tumorszuppresszor gének funkcionális változásai), a jelátviteli utakban való szerepük (pl. RAS - jelút) vagy receptorok módosulásai (pl. tirozin - kináz EGFR-receptor) alapján. Az egyes génhibák éles elkülönítése csak teoretikus lehet, hiszen a különbözı eltérések, folyamatok számos ponton kacsolódhatnak egymással. A tüdırákokban elıforduló gyakori génhibák - a teljesség igénye nélkül - az alábbiakban csoportosíthatók. A 3. kromoszóma eltérései A tüdırákokban elıforduló génhibák között különösen gyakori a 3. kromoszóma rövid karjának (3p) deléciója. Valószínő, hogy az ezen a területen lévı szuppresszorgének kiesésének fontos szerepe van a karcinogenezisben. A deléció
13
eredményeképpen a heterozigótaság elvesztése (LOH: „loss of heterozygosity”) következik be, ami a kissejtes tüdırákok 90%-ában, a nem-kissejtes tüdırákok több mint felében figyelhetı meg. Itt helyezkedik el a szuppresszor hatású FHIT gén is. Az általa kódolt Fhit-fehérje inaktivációja nem-kissejtes tüdırákokban igen gyakran elıfordul, dohányosoknál gyakrabban (75%), mint nem-dohányzóknál (39%). A 13q LOH (60%) felelıssé tehetı az adenocarcinomák, laphámrákok kialakulásáért. További gyakran elıforduló kromoszomális eltérések: 2q LOH (70%), 9p LOH (80%), 18q LOH (85%). A 9p kromoszómahelyen található a ciklinfüggı-kinázt gátlók közül a p15 és p16 gén [24].
Tumorszuppresszor gének és onkogének A daganat növekedésének ütemét a sejtproliferációt és sejthalált befolyásoló tényezık aránya határozza meg. Ezeknek a folyamatoknak a szabályozási zavaraiban fontos szerepet játszanak a tumorszuppresszor gének és az onkogének. Az elıbbiek közül a retinoblastoma gén (RB) az SCLC-k közel 90%-ában, míg az NSCLC-k csak 15-30%-ában inaktiválódik. A p53 (vad típus) tumorszuppresszor gén élettani körülmények közótt gén transzkripciós folyamatokban, a DNS szintézis és reparáció [25], valamint a programozott sejthalál eseményeiben játszik szerepet [26,27]. A p53 gén mutációi a humán malignus tumorok több mint 50%-ában kimutathatók, a tüdırákok esetében is hasonló arány tapasztalható, ezen belül a SCLC csoportban ez közel 80%-os A citotoxikumok közül a tüdırák kezelésében gyakran alkalmazott topoizomeráz-II gátlók többek között a p53-függı apoptózis utat aktiválva fejtik ki hatásukat. Érthetı tehát, hogy a p53 mutációja esetén ezeknek a szereknek a citotoxikus hatása kevéssé érvényesül.
A sejthalál szabályozása Apoptózis Az apoptózis zavara tüdırákokban is kimutatható. SCLC-ben igen gyakori a prokaszpáz-8 expressziójának csökkenése, ezzel a kaszpáz-kaszkád láncreakció egyik iniciatív lépése módosulhat. Az apoptózis szabályozásában résztvevı fehérjék közül a
14
Bcl-2 és a Bax ellentétes irányú hatása érvényesül. Az apoptózist stimuláló tényezık hatására a fıként citoplazmatikus lokalizációjú Bax fehérje a mitokondriumokhoz kapcsolódik és így fejti ki apoptózist aktiváló feladatát, ugyanakkor a Bcl-2 fokozott expressziója gátolja a proapoptótikus hatású Bax aktivitását [28]. A Bcl-2 a SCLC esetek 80%-ában, míg a nem-kissejtes tüdırákok 25-30%-ában mutat fokozott expressziót.
Jelátvivı utak A K-RAS út A RAS-családba tartozó K-RAS gén hibája (leggyakrabban a 12-es kodon mutációja) nem fordul elı SCLC-ben, míg NSCLC-ben gyakorisága kb. 30%-os [29]. A WNT- β-katenin út A WNT(wingless and a related gene termed int 1) - jelút fontos szabályozó tényezı mind az embrionális mind a felnıtt szövetek homeosztázisának fenntartásában, folyamatos aktiválása azonban daganatok kialakulását segítheti elı. A szignálút fokozott aktivitása vagy magának a β-katenin molekulának a mutációja a β-katenin magi felhalmozódásához vezet, ami transzkripciós faktorként különbözı gének expresszióját serkenti (pl. c-MYC, ciklin D1), amint ezt számos különbözı humán daganattípusban megfigyelték [30,31]. A sejtben a β-katenin több fehérjével állhat kapcsolatban: a sejtmembránhoz kapcsolódó kadherinnel, a magban transzkripciós faktorrokkal, egyéb fehérjével, így az APC-vel (adenomatosus polyposis coli) vagy a citplazmában axinnal, amely a WNT (wingless and a related gene termed int 1) - jelútrendszer egyik komponense. A β-catenin a WNT szignálút egyik fontos szereplıje [32]. A béta-katenin gén funkciónyerı mutációja különbözı szövettani típusú tüdırákokban is elıfordul. AKT Az újabb vizsgálatok gyakori targetje az AKT fehérje, egy szerin/treonin kináz enzim, a P13K szignálút egyik központi szereplıje, számos sejtfunkciót befolyásol. Fokozott aktivitása a sejtek túlélését segíti elı, sok daganat kialakulásában játszik szerepet, így a tüdırákban is. Irodalmi adatok arra utalnak, hogy míg az AKT szabályos vagy hiperpláziás hörgıhámsejtekben nincs jelen vagy csak minimális expressziót
15
mutat, addig a metapláziás és diszpláziás, daganat elıtti elváltozásokban aktivitása fokozott. A tüdırákok különbözı stádiumai (I/II és III/IV) között azonban már nem találtak értékelhetı különbséget, ami arra enged következtetni, hogy az AKT aktiváció korai esemény a tüdırákok kialakulásában [33]. Humán tüdıszöveti primer tenyészetekben a dohányfüstben jelenlévı komponensek aktiválni képesek az AKT-ot, ami alapján feltételezhetı a dohányzás - AKT aktivitás fokozódás - NSCLC kialakulása közötti kapcsolat [34].
Tirozin kináz receptorok EGFR tirozin kináz receptor Az EGFR volt az elsı sejtfelszíni receptor, amit közvetlenül kapcsolatba hoztak a rákok kialakulsával. Ahogy neve is utal rá, az EGF és EGFR-család elsısorban a hámsejtek, így a respiratórikus hám mőködését is szabályozza. A daganatok növekedését befolyásoló növekedési faktorok rendszerint specifikus receptoraikat aktiválva befolyásolhatják a sejt mőködését. A nem-kissejtes tüdırákok esetében fontos szabályozó az EGF (epidermális növekedési faktor; „epidermal growth factor”), illetve ennek tirozinkináz aktivitással rendelkezı transzmembrán receptora, az EGFR (epidermal growth factor receptor). Az EGFR-t a C-ERBB-1 gén kódolja és az EGF mellett a TGFα (transzformáló növekedési faktor α, „transforming growth factor α”) is aktiválhatja. Az aktivált EGFR részt vesz a sejtosztódás, az angiogenezis, a daganatsejt invázió és az áttétképzés fokozásában, valamint az apoptózis gátlásában és mindezek következményeképpen tüdırákban rossz prognosztikai faktornak bizonyult. Az EGFR expresszióját fokozhatja a gén amplifikáció, megnövekedett aktivitását pedig mutációi eredményezhetik. Az amplifikáció gyakorisága nem-kissejtes tüdırákokban 40-80%-os, az EGFR mutációja pedig (a 18., 19., 21. exonokon) az adenocarcinomák 10%-ában (ebbıl 26% BAC és 6% konvencionális ADC) mutatható ki [35].
A sejtciklus szabályozása Ciklinek, ciklin-dependens kinázok és gátlóik A sejtciklus egymást követı fázisai között protein komplexek - ciklinek és ciklin-dependens kinázok (cdk) - végzik az ellenırzést A ciklinek olyan periodikus fehérjéket testesítenek meg, amelyek a sejtciklus meghatározott pillanataiban
16
szintetizálódnak, majd gyorsan degradálódnak is. A ciklin dependens kinázok pedig azok a ciklusszabályozó fehérjék, amelyek ugyan folyamatosan expresszálódnak, de csak ciklinhez kapcsolt állapotban aktívak [36]. A ciklincsalád jelenleg 8 ismert nagy osztályból áll, melyeket A-tól H-ig betőkkel jelölnek. A C, D1, D2, D3 és az E-ciklinek a G1 fázisban érik el aktivitásuk maximumát. A ciklin-dependens kinázok közül - a teljesség igénye nélkül kiemelve néhány fı képviselıjüket - a cdk4 és a cdk6 a D1, D2 és a D ciklinnel alkot stabil komplexet, szintézisük és aktivitásuk a G1 fázisban éri el maximumát. A sejtciklus negatív szabályozói gátló hatással vannak a ciklin/cdk kompexekre (CKI). Gátló hatásukat a ciklin/cdk katalizáló egységeinek inaktiválásával fejtik ki. Az inhibitorokat két csoportba sorolják, az egyikbe a p21 és p27 tartozik, míg a másik csoportot a p15, p16 alkotja. A p21 gátló hatása olyan enzimek inaktiválásával érvényesül, amelyek a sejtek S fázisának beindításáért felelısek [37]. A p27 a G1 fázisban érintett [38]. A p15 ciklindependens kináz inhibitor a TGF-β közvetített sejtciklus blokkolásban játszik szerepet [39], míg a p16 a D ciklin dependens kinázok aktivitásának gátlásával a G1 fázisra gyakorol hatást [40]. A p16 eltérései gyakrabban láthatók NSCLC-ben, mint SCLC-ben. A sejtciklus szabályozásában érintett fehérjék szerepét a tüdırákok különbözı hisztológiai csoportjaiban tanulmányozták, különös tekintettel a prognosztikai tényezıkre és a betegek túlélési paramétereire. Caputi és munkacsoportja számos fehérje immunhisztokémiai analízisével azt találta, hogy csak a p16 expresszió mutatott pozitív összefüggést a betegek átlagos túlélésével [41]. Ha a tüdırákos eseteket a p16 és a p21 státusz alapján csoportosították, a szerzık azt tapasztalták, hogy a p16 és p21 együttes negativitása rövidebb átlagos túlélési idıvel volt szoros korrelációban. Korábbi vizsgálatok is arra mutattak rá, hogy a különbözı ciklin dependens kináz - inhibitor gének között „funkcionális kollaboráció” áll fenn [42], pl. a p16 - p21 - ciklinE - cdk2 folyamat egymásra épülı lépéseiben [43]. A két fı hisztológiai típusban – SCLC és NSCLC – elıforduló leggyakoribb génhibákat a 3. táblázat tartalmazza.
17
3. táblázat: A leggyakoribb génhibák a SCLC és a NSCLC csoporban Forrás: [28]
Génhibák
SCLC
3p-deléció (LOH)
NSCLC
90%
50-60%
80%
40%
3p12 3p 14.2 (FHIT) 3p21.3 (25 gén) 3p24 (RARb)
RB
80- 90%
15-30%
RAS
0%
20-30%
EGFR amplifikáció
0%
40-80%
0%
10 %
c-MYC
10-40 %
5-10%
p53
80%
50-60%
HER2/neu
?
25%
p16
7%
16%
BCL2-expresszió
75-95%
25-30%
Telomeráz
100%
80%
Prokaszpáz-8
80%
?
mutáció
(csökkenés)
A tumor progresszió még a különbözı NSCLC alcsoporton belül is igen változó, s a hagyományos szövettani osztályozás, mint önálló tényzı, nem elegendı az NSCLC biológiai viselkedésének megbecsülésére. Egyes NSCLC daganatok nagy gyakorisággal képeznek agyi áttétet, az áttétképzési tendencia azonban nem mutat egyértelmő összefüggést a daganat méretével, lokalizációjával és hisztológiai típusával [44], ugyanakkor ismert, hogy a laphámrákok az adenocarcinomáknál ritkábban képeznek áttétet és lokális recidivájuk is kevésbé gyakori. A korai recidíva és rákhalálozás
18
szempontjából
szignifikáns
elırejelzı
tényezık
között
találjuk
a
következı
paramétereket: a férfi nem; tünetek megléte; mellkasi fárdalom; a köhögés jellege; hemoptoe; 3 cm-nél nagyobb daganat átmérı (T2 stádium); az alacsony differenciáltsági fok; vaszkuláris invázió; erbB-2 expresszió; p53 expresszió; Ki 67 >5%. [45,46]. Bár az irodalmi adatok némileg ellentmondóak, ismertek olyan markerek is, amelyek alapján viszonylag kevésbé malignus biológiai viselkedés, jobb terápiás válasz kalkulálható. Így a Bcl-2 fehérje fokozott expressziója, a tumorsejtek euploiditása, a TTF-1 pozitivitás az adenocarcinomák csoportjában [47,48]. A K-RAS mutáció, a magas Ki67 index, a p53 mutáció, a
c-erbB2/Her2 [49],
az EGFR [50],
a
p21waf1/cip1 [41], az NCAM [51], a c-MET [52], a Cox-2 [53] vagy oestrogen receptor [54] fokozott expressziója azonban rossz prognózisra utalnak. Az egyes NSCLC csoportokon belül az mRNS microarray alapján további adenocarcinoma és laphámrák csoportokat különítettek el, melyek eltérı prognosztikai besorolásokat tettek lehetıvé [55,56].
2.6. A tüdırák kezelése, terápiás elvek A kissejtes és a nem-kissejtes tüdırákok terápiája a két daganattípus eltérı lokális és áttétképzı tulajdonságával összefüggésben különbözik egymástól. A stádiumfüggı kezelési elveket a NSCLC és az SCLC TNM és LD/ED klasszifikációjával kapcsolatban korábban részleteztük (lásd. 2.2. bekezdésben). A kissejtes és a nem-kissejtes tumoroknál egyaránt a platina bázisú citotoxikus kombinációk jelentik az elsıvonalbeli kezelés standardját: kissejtes tüdrákokban Cisplatin-Etoposid, nem-kissejtes cacinomákban Gemzar-Cisplatin vagy TaxolCarboplatin. A beteg állapotától, a daganat stádiumától függıen a kemoterápia lehet adjuváns vagy neoadjuváns, egyéb malignus daganatok kezeléséhez hasonlóan. Az NSCLC csoportban alkalmazható neoadjuváns (mőtét elıtti) kemoterápia a kezdeti, fıként bronchoszkópos minta diagnózisára alapozott. A neoadjuváns terápia célja a sebészi beavatkozás hatékonyságának fokozása - pl. a szerv megtartása. Az adjuváns (mőtét utáni) kemoterápia a primer tumor eltávolítását követi.
19
Napjainkban az új szerek alkalmazásával a kezelés hatékonysága megnövekedett, de a hatás továbbra is inkább csak az életminıség javulásában és a betegség kiújulásáig eltelt idıtartam meghosszabbodásában mutatkozik meg. Az EGFR fokozott expressziója a hám eredető malignus daganatok közel egyharmadában, a nem-kissejtes tüdırákok (NSCLC) 62%-ában (laphámrákok 80 %- a, adenocarcinomák 60 %-a, ezen belül a bronchioloalveolaris carcinomák 80 %-a) kimutatható. Ezért gondolták azt, hogy az EGFR kikapcsolása eszköz lehet - elsısorban a nem-kissejtes tüdırákok esetében - a daganatsejtek növekedésének gátlásában [57]. Az EGFR gátlására számos stratégia született, melyek közül az intracelluláris tirozinkináz (TK) aldoménnel szembeni kis molekulájú gátlók (TKI) és az extracelluláris domént támadó monoklonális antitestek váltak a legismertebbekké. Néhány éve tudott tény, hogy az EGFR gén kinázdoménjének bizonyos aktiváló mutációit hordozó nem-kissejtes tüdırákok egy része (az összes NSCLC 10-15 %-a) fokozott érzékenységet mutat az EGFR tirozinkináz gátló (EGFR-TKI) szerekkel szemben
[58].
Ilyen
mutációkat
gyakrabban
a
nemdohányzókban,
az
adenocarcinomában (különösen a bronchiolo-alveolas carcinomában) szenvedıkben, a nıkben, illetve a távol-keleti betegek tüdırákjaiban igazoltak. A klinikai használat szempontjából a legjelentısebb tirozin kináz inhibitor (TKI) a gefitinib (Iressa™, ZD1839) és az erlotinib (Tarceva™, OSI-774). Szerkezeti képletük az 1. ábrán látható. Mindkettı anilinoquinazolin vázzal rendelkezik, ez teszi lehetıvé, hogy bekötıdjenek a receptor ATP kötı helyére és ezzel kompetitíve akadályozzák a receptor foszforilációját. Az így létrejövı EGFR gátlás kiiktatja a receptorról induló mitogén és antiapoptotikus jeleket [59].
Gefitinib (Iressa™, ZD-1839)
Erlotinib (Tarceva™, OSI-774)
1. ábra (Forrás: [60].)
20
A DNS károsodásait helyreállító mechanizmusokban érintett fehérjék aktivitása is módosíthatja a terápiára adott választ, így az ERCC1 (excision repair crosscomplementation group 1), amely a platina-származékok indukálta DNS-adduktok kijavításában játszik szerepet. Több mint 700 nem-kissejtes tüdırákos beteg részesült ciszplatin bázisú adjuváns kemoterápiában. Az adjuváns terápia után az ERCC1 negatív tumorok eseteiben a betegek túlélési ideje szignifikánsan hosszabb volt, mint azoké, akiknek tumora ERCC1 pozitív volt. Ha azokat a betegeket hasonlították össze, akik adjuváns kezelést nem kaptak, hosszabb túlélési idıt az ERCC1 pozitív tumort hordozók esetében találtak, ami kevésbé agresszív biológiai viselkedésre uta. Az ERCC1 negativitás tehát agresszívabb tumorsejteket, de ugyanakkor a platina-bázisú terápia iránti fokozott érzékenységet is jelent [61]. Az ERCC1 fehérje vizsgálata tehát elısegítheti azoknak a betegeknek a kiválasztását, akik – korai stádiumban történt tüdımőtét után – nem szorulnak kiegészítı kemoterápiára, illetve azokét, akiknél a hagyományos platina-alapú kemoterápia valószínőleg nem lesz eredményes [62].
21
3. Célkitőzések
1. A sejtadhézióban szerepet játszó NCAM-hoz kapcsolódó α-2,8-polisziálsav (polySia) hatásának vizsgálata humán kissejtes tüdırákvonal (NCI-H69) szubklónjainak növekedésére in vitro és in vivo
2. Az
NCAM-hoz
kapcsolódó
polySia
szintézisének
és
sejtfelszíni
re-
expressziójának vizsgálata a H69 sejtekben
3. Nem-kissejtes
tüdırákok
progressziójában
szerepet
játszó
fehérjék
expressziójának vizsgálatával arra a kérdésre kerestünk választ, hogy az egyes progressziós stádiumokban (primer tüdırákok és agyi áttéteik) taláhatók-e olyan markerek, amelyeknek elırejelzı értékük van a metasztatizálás, eseteinkben az agyi áttétképzés illetve a betegek túlélési ideje szempontjából.
4. Platina-bázisú neoadjuváns terápia hatását vizsgáltuk az apoptózis és a proliferáció markereire valamint az ERCC1 (excision repair cross-complemetation group 1) expressziójára nem-kissejtes tüdırákokban. Azt tanulmányoztuk, hogy van-e szelekciós hatása a neoadjuváns terápiának valamely tumorsejt populációra és ez befolyásolhatja-e a daganat késıbbi kemoterápiás érzékenységét.
5. Az EGFR immunhisztokémiai kimutatásának értéke a célzott terápiára alkalmas tüdıadenocarcinomák kiválasztásában, amely részét képezi annak a komplex vizsgálatnak, amely az EGFR-TKI kezelésre érzékeny daganatok szelekcióját teszi lehetıvé.
22
4. Anyagok és módszerek 4.1.
Az
NCAM–hoz
kötött
α-2,8-polisziálsav
(polySia)
expressziójának vizsgálata kissejtes tüdırákban (SCLC)
4.1.1. Tumorszövetek Ötven sebészileg eltávolított humán primer kissejtes tüdırák (SCLC) archivált paraffinos blokkja. Primer tumorok és metasztázisaik (15 eset) formalin fixált és paraffinba ágyazott mintái.
Az immunhisztokémiai vizsgálat 5 µm vastagságú
metszeteken az alábbiakban leírt immunhisztokémiai protokoll szerint történt (lásd a 4.1.3.5. alfejezetben).
4.1.2. Sejttenyészeti sejtvonalak SCLC H69 sejtvonal fagyasztott mintája az ATCC [American Type Culture Collection (Rockville, Maryland)] sejtbankból származik. A SCLC eredető sejtek RPMI 1640 tápfolyadékban (10% FCS, 1mM benzyl penicillin és 0.01 % streptomycin sulfat, [Gibco BRL, Basel, Switzerland]) 37°C-on, 5% CO2 mellett, nedves inkubátorban, 75cm2-es mőanyag edényben (Falcon) nıttek.
4.1.3. A polySia hatásának vizsgálata humán kissejtes tüdırákvonal (NCI-H69) polySia pozitív és polySia negatív szubklónjainak növekedésére in vitro és in vivo
4.1.3.1. Sejtklónozás és sejtvonalak A NCI - H69 (humán SCLC) vonal sejtjei 0,5 mm-es hypodermiás tőn történı 10-szeres átnyomásával egysejtes szuszpenzió formájában és sorozatosan higítva kerültek a tápfolyadékba, 1 sejt/100µl arányban. Ötven mikroliter ebbıl a szuszpenzióból került késıbb a 96 lyukú szövettenyésztı edénybe. Minden egyes lyukhoz 50 µl RPMI 1640 tápfolyadékot adtunk. Az egysejtes növekedést inverz mikroszkóppal ellenıriztük, s több sejt jelenléte esetén a további lépéseket nem folytattuk.
23
Az ily módon kialakított 51 alvonal közül az E2 jelzéső nem tartalmazott polySia pozitív sejtet, míg az F3 jelzéső szubklónban a polySia pozitív sejtek aránya közel 95% volt. Az E2 és az F3 sejtvonalakat alkalmaztuk a további kísérletekben. Ezek a szubklónok 3 vagy több sejt alkotta aggregátumokból álló szuszpenzióban nıttek.
4.1.3.2. Reagensek és arany-jelölés A mAb 735 jelöléső egér monoklonális antitest [63,64], csak a hosszú láncot alkotó (>9 egységbıl álló, homopolimer) polySia formákat ismeri fel. A protein A tisztított mAb735 antitestet a 8nm-es arany partikulummal való jelölés után kolloid oldatban, 4°C-on tároltuk az aktuális felhasználásig [65]. Kecske – (anti-nyúl) IgG antitest (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pennsylvania), amely szintén arannyal jelölt. Nyúl – (anti-egér) NCAM antitest, C. Goridis (IN SERM, Marseille) ajándéka. Az α-2,8 kötésben lévı sziálsavat specifikusan hydrolizáló K1F bakteriofág eredető endoszialidáz N (endoN), amelynek izolálása Hallenbeck protokollja szerint történt [66]. A bakteriofág és az E.coli törzs (EV1) Dr. E. Vimr (University of Illinois, Urbana, USA) ajándéka.
4.1.3.3. Az endoN elıállítása Két liter E. coli EV 1 törzs LB (Bacto tryptophan, Bacto yeast kivonat, NaCl, víz, pH7.5) médiumba való beoltása után 3-4 órán át tartó rázással kialakított lizátum szaturálása 50%-ra ammónium szulfáttal történt. Ezt a lépést 4°C-on precipitáció (egy éjszakán át), majd 16 000 x g 20 perces centrifugálás követte. Az üledéket 10mM Trisben (pH 7.6) felvéve, ismételt centrifugálással (16000 x g, 10 perc) a törmelék eltávolítása, majd a felülúszó 150.000 x g 30 perces centrifugálásával a fágok eltávolítása történt. Az így nyert felülúszó vált alkalmassá a tiszta, szolubilis endoN preparálásához. A fágmentes felülúszó DEYE-Sephacel oszlopon való frakcionálása 10mM Tris-HCl pufferben (pH 7.6) történt. A frakciók összegyőjtése után azok endoN aktivitásának meghatározása annak alapján történt, hogy milyen mértékben képesek eltávolítani a polySia immnreaktivitást a polySia pozitív sejtek felszínérıl. A pozitív frakciók sőrítése ammónium szulfáttal precipitáció révén történt. Az üledéket foszfát pufferben újra szuszpendálva (pH6.8) dialízáltuk, amelyet hidroxiapatit extrakció után a
24
felülúszó dilalízise követett 10mM Tris-HCl (pH 7.6) oldattal szemben. Az enzim preparátumot -20°C-on 50% glicerinben tároltuk, használat elıtt a tisztított enzimet RPMI 1640 médium ellen dializáltuk. 4.1.3.4. Citológiai minták készítése A sejteket szérummentes RPMI 1640 tápfolyadékkal mostuk át, majd a centrifugálással nyert üledéket 20 µl médiumban újra szuszpendáltuk és poli-L-lizin fedett tárgylemezre cseppentettük. Öt perc múltán a felesleges médiumot eltávolítottuk és a lemezeket 37°C-on további 5 percig szárítottuk a 10 percig tartó fixálás elıtt, amely 0.1 % glutáraldehid és 3% formaldehid PBS-ben való keverékében történt. A szabad aldehid csoportok blokkolására a lemezeket 15 percig ammónium kloridban (50 mM/ PBS) (PBS: 0.01M Phosphate Buffered Saline with isotonic NaCl) tartottuk.
4.1.3.5. Immuncitokémia A citológiai mintákat és a metszeteket 5-10 percen át 2% zsírmentes tejport tartalmazó PBS-ben blokkoltuk. A keneteket ezután vagy NCAM antitesttel (1:400 higítás 1%
zsírmentes tejport tartalmazó PBS-ben) vagy arany-jelölt mAb735
antitesttel (antitest koncentráció kalibrálása fehérje meghatározás (Bradford) alapján: OD525 nm = 0.04) inkubáltuk, majd PBS-ben 2x5percig mostuk. Ha az NCAM volt az elsı antitest, 1 órás arany-jelölt kecske – (anti-nyúl) antitesttel való inkubáció volt a következı lépés. Valamennyi antitestet PBS-ben (1 % bovin szérum albumin [BSA] és 0.05 % Triton X-100 és 0.05 % Tween-20) higítottuk, az ettıl való eltérést jelöljük. Az immunjelölés után a metszeteket a fent leírtaknak megfelelıen mostuk, 1%-os glutáraldehiddel (PBS-ben) utófixálás történt (20 perc), majd desztillált vízzel mostuk. A jel erısségének növelésére ezüstacetát elıhívást alkalmaztunk: A mintát 2-5 percig redukáló pufferben, majd 18 percig szobahımérsékleten ezüst elıhívóban (ezüstacetát)) tartottuk, végül gyors desztillált vizes öblítés után Superfixben 2-5 percen át fixáltuk [67]. A magfestést a keneteken „nuclear fast red”-del végeztük. Az immuncitokémiai kontrollt a primer vagy szekunder illetve mindkét antitest kihagyása és az endoN-nel való inkubálás (1-18 óra, 37°C) biztosította. Az NCAM-ot és polySia-t hordozó patkány embriók szolgáltak pozitív kontrollként.
25
4.1.3.6. Immunoblot A sejteket (105-2x106) szérummentes tápfolyadékban mostuk (2x, 4°C-on), centrifugáltuk, majd az üledéket a sejtszámtól függıen 20-100µl PBS-ben reszuszpendáltuk (1% Triton 100 + 1mM phenylmethylsulfonyl fluorid + 1 % aprotinin). A fehérje izolálást követıen a mintákat SDS/PAGE -re használtuk fel. Az endoN elıkezelés 37°C-on 60 percig tartott, a 60°C-os denaturációt és az elektroforézist megelızıen. Mindegyik mintából 25 µg vagy 50 µg fehérjét futtattunk. Ezt követıen a fehérjéket nitrocellulózba vittük át, félszáraz transzfer apparátus alkalmazásával [68]. A blotokat vagy a/ arany-jelölt mAb 735 polySia ellenes antitesttel való kezelés után ezüstacetáttal hívtuk elı, vagy b/ az NCAM esetében alkalikus foszfatáz jelölt másodlagos antitestet használtunk, amit NBT/BCIP elıhívóval tettünk láthatóvá. Az elıblokkolást vagy FCS tartalmú PBS-sel vagy az NCAM reakció esetében 2%-os zsírmentes tejpor oldatával végeztük. Mind a blokkoló anyagok mind az antitestek higítása 0.1% Tween 20 tartalmú oldatban történt. A blotokhoz használt antitesteket elıblokkoló oldatban (polySia és NCAM antitestek), a szekunder alkalikus foszfatáz – jelölt antitest esetében 0.15 M NaCl és 1% zsírmentes tejport tartalmazó 0.1M Tris-HCl pufferben (pH 7.4) higítottuk.
4.1.3.7. Sejtciklus szinkronizálás A mitózis blokkolásához és a sejtek többségének a sejtciklus azonos pontjára való szinkronizáláshoz a H69 SCLC sejteket 18 órára friss RPMI 1640 médiumban szuszpendáltuk, majd vagy (a) 10% FCS 4° C (a mikrotubulusok depolimerizálására), vagy (b) 10% FCS + 5 µg/ml colcemide (Gibco BRL) 37° C vagy (c) 10% FCS 37° C körülmények között folytattuk a tenyésztést. A mitózis blokkolását a sejtek normál tápfolyadékban való 2x-es mosásával oldottuk fel. Ezt követıen 0-24 óráig adott idıközönként mintát vettünk a kiértékeléshez.
4.1.3.8. A DNS - metiláció gátlása 5- azacitidinnel A CpG szakasz metilációja és a DNS szekvencia transzkripciós aktivitása között fordított összefüggés van [69]. Számos permanens sejtvonalban a CpG szakasz metilációja felelıs a „loss of function” kialakulásért. Az 5-azacitidin a metiláció
26
inhibitora. Az E2 (polySia negatív) és F3 (polySia pozitív) szubklónokat 50µg/ml azacitidint tartalmazó RPMI 1640 médiumban kezeltük 5 napon át. A kezelés hatására a sejtek viabilitása nem változott (tripánkék teszt). A kezelés után a minták polySia pozitív sejtjeinek arányát immunhisztokémiai vizsgálattal határoztuk meg.
4.1.3.9. A sejfelszíni polySia eltávolítása endoN kezeléssel A fent leírtaknak megfelelıen elıállított endoN enzimet hozzáadtuk a szérumot tartalmazó RPMI 1640 tápfolyadékban növı sejtekhez, majd egy órán át inkubáltuk az enzimmel további felhasználásuk elıtt. Az endoN koncenrációt úgy állítottuk be, hogy a polySia
eltávolítása
teljes
mértékő
legyen.
Ez
utóbbit
a
sejtek
polySia
immunreaktivitásának meghatározásával ellenıriztük a kísérleti lépések végén.
4.1.3.10. A sejtaggregáció kálcium függésének vizsgálata EDTA kezeléssel A 3mM EDTA-t (Sigma Chemical Company) tartalmazó RPMI 1640 (10% FCS pH: 7.4) tápfolyadékot használtunk az alábbiakban leírt vizsgálathoz. Az EDTA a médium szabad kalciumionjait távolította el. Centrifugálás (800xg) után a sejteket a fenti folyadékban reszuszpendáltuk, a sejtek viabilitását tripánkékkel ellenıriztük. A kontroll csoporthoz a sejteket EDTA-mentes komplett RPMI 1640 tápfolyadékban vettük fel a centrifugálás után, amelynek szabad kalciumion koncentrációja 0.37mM volt.
4.1.3.11. Kombinált endoN és EDTA kezelés A sejteket egy órás, 37°C-on történı endoN inkubációt követıen 2x EDTA-ban mostuk át (lásd fent).
4.1.3.12. Standard aggregációs assay Az
egysejtes
szuszpenzióban
lévı
sejtek
aggregációjának
mértéke
a
csoportokban (clump ≥ 3 sejt) lévı sejtek százalékos arányában fejezhetı ki. A sejtaggregációs vizsgálathoz mikroszkópos sejtkamrát használtunk. Egysejtes szuszpenzió elıállítása 0.5 mm-es hypodermiás tő segítségével (leírást lásd fentebb) történt, a viabilitást ismét tripánkékkel ellenıriztük. Az üveghez történı adhéziót szilikonizálással minimalizáltuk. A fedılemezen lévı sejteket a nedves kamrában invert
27
mikroszkóppal
200x
nagyítással
tudtuk
vizsgálni.
Kettı
100µl-es
aliquotot
cseppentettünk a fedılemez szomszédos területeire. A kezelt és a kontroll aliquotokat 20 perc elteltével értékeltük három, random módon kiválasztott szomszédos területen. Az aggregáció fokát a teljes sejtszám és a magányos sejtek arányával határoztuk meg. Magányos sejtnek azokat tekintettük, amelyek nem képeztek közös határt szomszédos sejttel. A kísérletek során 104/ml sejtkoncentrációt tartottunk fent.
4.1.3.13. Standard diszaggregációs assay A sejtek diszaggregálása 0.5mm-es hypodermiás tőn kétszeri átnyomással történt. A sejtcsoportokat alkotó sejtek százalékos arányát a disszociált sejtek és a teljes sejtszám hányada határozta meg. Mikroszkópos analízis alapján a sejtszuszpenziókban, amelyeket a teljes sejtszám kalkulálásához használtunk, az egyedülálló sejtek aránya 70-80%-os volt. A tripánkékkel meghatározott sejtviabilitás arra utalt, hogy a fent leírt metodika nem csökkentette szignifikánsan az élı sejtek számát.
4.1.3.14. A sejt-szubsztrát adhézió vizsgálata Kilencvenhat
lyukú
szövettenyésztı
edényt
(Falcon)
a
következı
szubsztrátokkal vontunk be: IV-es típusú kollagén, laminin, heparán szulfát és poli-Llizin. Minden egyes vizsgálathoz 700µl egysejtes szuszpenziót alkalmaztunk. Száz mikroliteres aliquotokat (104 sejt/aliquot) adtunk az egyes lyukakhoz, majd egy órán át hagytuk letapadni a sejteket a különbözı szubsztrátokhoz. A szövettenyésztı edény bevonása IV-es típusú kollagénnel Engelbreth-HolmSwarm egér sarcoma bazális membránjából izolált IV-es típusú kollagént (Sigma) (0.03 µg-12 µg/ 50µl 0.25%-os ecetsav) használtunk a fedéshez. Ezután a tenyésztıedényt 1x desztillált vízzel átmostuk. Nem találtunk összefüggést az alkalmazott kollagén koncentrációja és a letapadási ráta között. A kísérletekben 0.5µg IV-es típusú kollagént alkalmaztunk lyukanként. A szövettenyésztı edény bevonása lamininnel Engelbreth-HolmSwarm egér sarcoma bazális membránjából izolált laminint (Sigma) (0.25µg – 10µg/50µl steril víz) használtunk a bevonáshoz. Ezután a tenyésztıedényt 1x desztillált vízzel átmostuk. A laminin koncentráció és a letapadási ráta között egyenes összefüggést tapasztaltunk. Az alkalmazott laminin koncentráció 0.5µg/ lyuk volt.
28
A szövettenyésztı edény bevonása heparánszulfáttal. 0.5µg-50µg heparánszulfátot (Sigma) (50 µl desztillált vízben) használtunk a bevonáshoz. Ezután a tenyésztıedényt 1x desztillált vízzel átmostuk. A vizsgálatok során 10µg heparánszulfátot alkalmaztunk lyukanként. A szövettenyésztı edény bevonása poli–L –lizinnel 0.1mg/ml poli–L–lizint 50µl steril vízben használtunk a bevonáshoz, majd 5 perc múlva a folyadékot eltávolítottuk, s az edényt felszínét 2x steril vízzel átöblítettük.
4. 1.3.15. Kolónia kialakító képesség vizsgálata Az egysejtes sejttenyészetbıl származó sejteket 0.3%-os agar tartalmú tápfolyadékban szuszpendáltuk, majd a viabilitiást tripánkékkel ellenıriztük a sejtszám beállításához. Az egységnyi tenyésztı edény területre jutó sejteket fáziskontraszt mikroszkóp mellett leszámoltuk, majd a viabilis sejtek számának ismeretében állítottuk be a sejtszámot. Nyolc napig tartó, standard körülmények között történt tenyésztés után a ≥ 4 sejtbıl álló csoportokat (kolóniákat) a tenyésztıedényre kitett viabilis sejtek számához viszonyítva adtuk meg. A 0. napon nem láttunk ≥ 2 sejt alkotta csoportot.
4.1.3.16. Nude egér kisérletek Nude egerek (ICR nude/nude Zürich) (F3 és E2 szubklónok, 106 sejtszám /RPMI 1640 médiumban) szubkután oltása a nyaki régióba történt. Az állatokat az oltás után hét héttel leöltük, majd a tumorokból új sejtkultúrákat alakítottunk ki. Intrakután metasztázisnak azt tekintettük, ha legalább két olyan tumor nodulust láttunk, amelyeket kötıszöveti rostok teljes mértékben elkülönítettek egymástól. A tumorsejtek karyotipizálása az Unispital Zürich Genetikai Laboratóriumban történt.
Statisztikai analízis A statisztikai analízist komputer programm (StatView II, Abacus Concepts, Berkeley, California, version 1.03) segítségével végeztük el. A kontroll és a kísérleti csoportok összehasonlítása Student t-teszttel vagy Chi2 - teszttel történt. Szignifikánsnak a p≤0.05 értéket tekintettük Ha másként nem volt kifejezhetı, az átlagértéket adtuk meg átlag SD-vel.
29
4.2. Az NCAM-hoz kötött α-2,8-polisziálsav (polySia) szintézisének és sejtfelszíni re-expressziójának vizsgálata humán kissejtes tüdırákvonal (NCI-H69) sejtjeiben. 4.2.1. Reagensek Egér IgG2a monoklonális antitest (mAb 735) [63,65]. Az α-2,8 kötésben lévı polisziálsavat specifikusan hydrolizáló K1F bakteriofág eredető endoszialidáz N (endoN), amelynek izolálása Hallenbeck protokollja szerint történt (lásd az elızı fejezetben) [67]. A bakteriofág és az E. coli törzs (EV1) Dr. E. Vimr (University of Illinois, Urbana, USA) ajándéka. Vibrio Cholerae szialidáz (Sigma Chemical Co.). A nyúl–(antipatkány) NCAM IgG, amely valamennyi fı NCAM izotípust felismeri, E. Bock-tól származik (The Panum Institute, University of Copenhagen, Denmark). 10 nm-es arannyal jelölt nyúl-(anti-egér) IgG és kecske-(anti-nyúl) IgG (Jackson Immuno Research Laboratorium). A nyúl anti(egér IgG) immungyöngyök a Bio-Rad-tól, a Tritirachium album-ból kivont proteináz K a Boehringer Mannheim, az N-acetil-D-[6-3H(N)]-mannózamin (50 Ci/mmol, 0.9 mCi/ml) és a monenzin a Sigma, az N-acetil-D-[6-3H(N)]glukózamin (40 Ci/mmol, 0.8 mCi/ml) az Amersham, a 6-diazo-5-oxo-norleucin a Fluka cég terméke. Colominic sav (N-acetil neuraminsav polimer –NANA) Boehringer Mannheim.
4.2.2. Sejtek A kísérletekben az NCI-H69 F3 jelzéső, polySia és NCAM ≥95%-ban pozitív sejteket tartalmazó szubklónt alkalmaztuk. 4.2.3. Immunprecipitáció, SDS/PAGE PolySia pozitív (H69 F3 szubklón) sejtekbıl homogenizátumot állítottunk elı 1% Triton, (fenilmetilszulfonid fluorid) PMSF/DMSO, aprotonin lízis pufferben, 30 percig jégen (a sejtüledéket kb. 4-szeres lízispufferben szuszpendálva), majd 1000g-vel 5 percig centrifugálás következett. A fehérje koncentrációt Bradford szerint határoztuk meg Biorad kittel.
30
Immungyöngyök jelölése (nyúl-/anti-egér, RAM, Biorad): gyöngyök centrifugálása (1000g), majd 1%BSA, 0.05% Tween/PBS-ben szuszpendálás, inkubálás 1 órán át, 4°C-on. PolySia antitest (mAb735, arany-jelölt) elıkészítése 1%BSA, 0.05% Tween/PBS-ben, a végleges koncentráció 20µg polySia Ab/500µl puffer legyen. PolySia antitest és az immungyöngyök összekapcsolása: 10µl RAM immungyöngy 500µl 1%BSA és 0.05 % Tween/PBS-ben + 1.5µl PolySia antitest 500µl 1%BSA és 0.05%Tween/PBS-ben. Inkubálás 1 órán át, 37°C-on. Fehérje tartalom beállítása: 10µl gyöngy = 10µg/µl 20µg polySia antitesthez. A polySia antitest eltávolítása a sejtlizátumból: 50µl sejtlizátum (=450µg fehérje) + 450µl 1%BSA/PBS. 5µl GAM (kecske -/anti-egér, Biorad) immungyönggyel inkubáció 4°C-on 1 órán át. Centrifugálás (1000g), majd az üledékhez 500µl sejtlizátumot adunk. További inkubálás 4°C-on, éjszakán át (18 óra). Az inkubálás után 2-3 x óvatos mosás PBS-ben (pH7.4), 1ml térfogatban. PolySia elıkészítés Western blotra Inkubálás 1xSDS pufferben (40µl), BME [β-merkaptoetanol] nélkül: 30µl gyöngyöt tartalmazó PBS + 10µl 4 x SDS puffer BME nélkül. Melegítés 60°C-on 5 percen át, majd centrifuglás 1000g-n. BME hozzáadása, 5%-os végkoncentrációval. Hevítés 60°Con, 10 percig. Futtatás Western blotra. 4 x SDS puffer BME nélkül: 12% SDS 0.12g, 20% szukróz 0.27 (75%), 8mM EDTA 16µl 0.5M, 120mM Tris 8.6 60µl 2M. Az SDS/PAGE-hez 3-10% polyacrylamid gradiens gélt használtunk, az immunoblothoz arany - jelölt mAb 735 antitestet, a korábban leírtaknak megfelelıen. 4.2.4. Immuncitokémia A fénymikroszkópos vizsgálathoz a keneteket a 4.1.7. alatt leírt módon készítettük elı. Elektronmikroszkópos vizsgálathoz Griffiths [70] és Tokuyasu [71,72] módszerét követve készítettük el a fagyasztott metszeteket a tenyésztett sejtekbıl: a sejteket gyorsan 2 %-os meleg Bacto-agarban (PBS-ben) ülepítettük, majd azonnal jégre helyeztük és 2.3M, 20% poly-vinylpyrrolidont (25000 Da) tartalmazó szukrózzal infitráltuk. A mintákat folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, majd -120°C-on ultravékony metszeteket készítettünk Reichert Ultracut E ultramikrotómmal. A metszetek parlódiummal és szénnel fedett gridekre kerültek, melyeket 1%-os zselatinon,
31
4°C-on egy éjszakán át tároltunk. A polySia immunjelöléshez a grideken lévı metszeteket 5x10 percig PBS pufferen (+1 % BSA, 0.01 % Triton X100 és 0.05% Tween 20) kondícionáltuk, majd monoklonális mAb735 antitesttel 2 órán át, ezt követıen arannyal jelölt nyúl anti-(egér IgG, [OD525mn = 0.1]) antitesttel 1 órán át inkubáltuk. A metszetek 1%-os, PBS-ben higított glutáraldehidben, 20 percen át tartó utófixálását követıen 0.2% uranil acetátot tartalmazó 2% metil cellulózban kerületek beágyazásra [71].
4.2.5. EndoN kezelés a sejtfelszíni polySia eltávolítására A tenyésztett sejteket endo N enzimmel kezeltük 37°C-on 1 órán át, amely a sejtfelszíni polySia teljes mértékő eltávolítását eredményezte (elektronmikroszkópos vizsgálat igazolta a polySia hiányát). Az endoN enzim eltávolításához a sejteket colominic savval (1mg/ml RPMI 1640) inkubáltuk 10 percig 37°C-on, majd kétszer tápfolyadékban mostuk. Az endoN eltávolítása szükségszerő, hiszen az enzim bármilyen kismértékben visszamaradó mennyisége is meggátolhatja a polySia sejtfelszíni ismételt megjelenését. A 0. idıpontban a kultúrából sejt-aliquotokat készítettünk a további vizsgálatokhoz. Az egyes aliquotokat 37°C-on tovább inkubáltuk, majd az enzimkezeléseket követı kérdéses idıpontokban mintát vettünk a polySia re-expressziójának immunoblot és immuncitokémiai vizsgálatára.
4.2.6. Hımérséklet indukálta transzport blokk A hımérséklet indukálta transzport blokk az enzim kezelt sejtekben 20°C-os inkubálással történt, ezt követıen eltérı idıpontokban sejteket győjtöttünk ki immunjelölésre, immunoblotra és metabolikus jelölésre. A 20°C-os hımérséklet indukálta transzport blokkolás visszafordíthatóságának vizsgálatára a sejteket visszahelyeztük 37°C-ra, majd 15, 30 és 60 perc elteltével azonos sejtvolumeneket emeltünk ki a tenyészetbıl immunelektronmikroszkópos értékeléshez [73,74].
32
4.2.7. Radioaktív polisziálsav prekurzor beépülésének követése A polySia metabolikus jelöléséhez szérummentes HITES médiumot használtunk (N-acetil-D-[6-3H(N)]mannózamin (250µCi), N-acetyl-D-[6-3H(N)]-glukózamin (2Ci) és 150-400µg/ml 6-diazo-5-oxo-norleucin kiegészítéssel) és a sejteket 24 órán át inkubáltuk. A polisziálsavba (polySia) beépült radioaktivitás méréséhez a sejt homogenizátumot mAb735 antitesttel immunprecipitáltuk (leírást lásd fent). A kinyert immungyöngyöket endoN-nel kezeltük, a polySia asszociált radioaktivitást a felülúszóból határoztuk meg. A kontroll inkubációhoz endoN-mentes puffert használtunk és a felülúszóban megjelenı radioaktivitást mértük. A sziálsav prekurzor N-acetilglukózamin utilizációjának követésére a sejteket 24 órán át 37°C-on inkubáltuk, majd 3% paraformaldehid és 0,1 % glutáraldehid keverékében 20 percig fixáltuk, Vibrio cholerae szialidáz enzimmel (0,5U/ml 50mM acetátban, pH 5,5 és 9mM CaCl2 vagy csak inkubációs pufferben egy éjszakán át, 37°C-on), majd a kibocsátott radioaktivitást meghatároztuk.
4.2.8. Kémiai (monenzin* indukálta) traszport blokk A monenzin indukálta transzport blokkoláshoz az enzim kezelt sejteket 45 percig, 37°C-on, 2µM monenzin jelenlétében inkubáltuk, majd endoN kezelés (lásd fent) következett monenzin jelenlétében. Ezt követıen a sejteket tovább tenyésztettük 37°C-on, monenzin jelenlétében 24 órán át, majd immunjelölésre és immunoblotra készítettük elı.
* A Streptomyces cinnamonensis-bıl izolált monenzin a sejtekben a glikoproteinek szekrécióját blokkolja, de gátolja a sejten belüli fehérje transzportot is. Antibiotikus és malária ellenes aktivitással rendelkezik.
33
4.3. Nem-kisejtes tüdırákok progresszójában szerepet játszó fehérjék expressziójának vizsgálata szöveti multiblokk alkalmazásával 4.3.1.Betegek és metodikák
Ötvenkilenc nem-kissejtes tüdırákos beteg primer tumorának valamint közülük 26 beteg agyi áttétének szövetmintáját vizsgáltuk. A betegek közül senki sem részesült pre- vagy posztoperatív kemoterápiában vagy preoperatív besugárzásban. Az agyi áttéteket mőtétileg, metasztaszektómia során távolították el, amit irradiáció követett, 15G szereotaktikus és 30G teljes agyi irradiációval. Az N2 stádiumú betegek 50G posztoperatív mediasztinális besugárzásban részesültek, s csak egy, mellkasfali propagációt mutató beteg kapott adjuváns irradiációt a primer tumor lokalizációjának megfelelıen. A betegek adatait a 4. táblázat tartalmazza.
34
4. táblázat: A betegek részletes adatai primer tüdırák távoli áttét nélkül
primer tüdırák és agyi áttéte
33
26
átlag életkor nem (férfi/nı)
56 .1 24/9
stádium
IA: 6 IB: 16, IIA: 2, IIB: 6, IIIA: 3
56.8 17/9 IA:1, IB: 7, IIA: 1, IIB: 6, IIIA: 3, IIIB: 2, IV:6
esetszám
szövettani típus laphámrák
18
14
adenocarcinoma adenosqamosus carcinoma nagysejtes anaplasticus
20
9
0
1
1 betegkövetési adatok
2
91 82,6
23 30,7
20
3
2
1
median túlélési idı átlag túlélés vizsgálatkor élı betegek száma nincs elérhetı adat
4.3.2. A szöveti multiblokk (TMA) kialakítása A szöveti multiblokk (TMA) kialakítása manuális technikával történt, a Histopathologia Kft, Pécs (LabVision/Neomarkers, Fremont CA, USA), által létrehozott eszköz felhasználásával. A paraffinba ágyazott multiblokkok egyenként 2mm átmérıjő, összesen 24 mintát tartalmaztak, 4x6-os elosztásban. Az egyes szövetrészletek kiválasztása a reprezentatív mőtéti blokkból készült HE festett metszetek alapján történt, törekedve arra, hogy a legjellegzetesebb szövetrészlet képviselje a blokkban a vizsgálandó daganatszövetet.
35
Heterogén szövetekbıl több területrıl is történt beágyazás. Az orientációt biztosítandó tonsilla részletet vagy „üres” paraffint helyeztünk az 1-es pozícióba. Így összesen 116 szövetminta került 5 mutiblokkba. Az így elkészült blokkokat 56°C-on 5-8 percig inkubáltuk,
hogy
az
eredetileg
különbözı
paraffinos
blokkokból
származó
szövetrészletek kellıen rögzüljenek a „befogadó” blokkban (2. ábra).
2.ábra
4.3.3 Immunhisztokémia A multiblokkokból 5µm vastagságú sorozatmetszetek készültek adhezív SuperFrost Ultra Plus tárgylemezre (Menzel GmbH & Co KG, Braunschweig, Germany), amelyeket 60°C-on 2 óráig elıkezeltünk az adhézió fokozásához. Az endogén peroxidáz blokkolásához a deparaffinált metszeteket 30 percig 1%-os hidrogén peroxidot tartalmazó metanolban elıkezeltük A hıindukált epitóp feltárás vagy 0.1M Tris és 0.01M EDTA (pH 9.0; T/E) keverékben, pH 6.1 kereskedelmi feltáró oldatban (TRS, Dako, Glostrup, Denmark) vagy 0.01M citrát pufferben (pH 6.0) történt öt literes rozsdamentes kuktában (Tefal Clipso), közel 120°C-on, 2 percen át. A leghatékonyabb feltárás az antigének többségénél a Tris-EDTA (pH 9.0) esetében volt tapasztalható. A további antigének esetében a hagyományos citrát puffert (pH 6.0)
36
használtuk. A kiválasztott antitestek a sejtciklus szabályozásában, a sejtadhézió, a DNS replikáció és helyreállítás folyamataiban valamint az apoptózis regulációjában szerepet játszó fehérjék jellemzését célozta. Az egyes antitestek alkalmazásának körülményeit az 5. táblázat tartalmazza. A 180 kDa Bullosus Pemphigoid antigént felismerı 1D6 és 9G2 antitest klónokat (BP 180 és BPA G2, a XVII kollagén molekula), szintén vizsgáltuk. A XVII kollagén molekula korábbi vizsgálatok szerint laphámrákokban „upregulált” formában van jelen [75]. Az
elıkezelt
metszeteket
90
percig
inkubáltuk
a
polimer-HRP
konjugált
EnVision+detektáló rendszerrel (Dako) szobahımérsékleten vagy 40 percig a Ventana ES (Tuscon AR, USA) immuno-automata készülékkel, 41°C-on. A peroxidáz aktivitást DAB (3-3`diaminobenzidine-terahydrochloride) hidrogén peroxid kromogén szubsztrát kit-tel (Dako vagy Ventana) mutattuk ki. Haematoxylin festést követıen a metszeteket glicerin-zselatinnal fedtük. 5. táblázat: Az egyes antitestek jellemzıi Marker
Klón
Gyártó
Elıkezelés
Higítás
1
Pan-Citokeratin
Mouse/AE1-AE3
DakoCytomation
T/E
kit 2x
2
CK7
Mouse/OV-TL12/30 DakoCytomation
T/E
kit 2x
3
Kollagen XVII *
Mouse/6D1
Bay Z. Alapítvány, Szeged
T/E
1:100
4
Kollagen XVII *
Mouse/9G2
Bay Z. Alapítvány, Szeged
T/E
1:30
5
CD44v6
Mouse/VFF-7
NovoCastra
T/E
1:50
6
β-katenin
Mouse/17C2
NeoMarkers
T/E
1:30
7
E-kadherin
Mouse/36B5
Novocastra
Citrate
1:20
8
EGFR
Mouse/EGFR.25
Novocastra
T/E
1:100
9
p16
Mouse/6H12
Novocastra
T/E
1:30
10
p27 kip1
Mouse/SX53G8
DakoCytomation
T/E
1:50
11
p53
Mouse/PAb240
DakoCytomation
T/E
1:50
12
p53
Mouse/DO-7
DakoCytomation
T/E
kit 2x
13
p63
Mouse/4A4
NeoMarkers
T/E
1:50
14
Ciclin D1
Rabbit/ SP4
NeoMarkers
T/E
1:100
15
Ciclin D3
Mouse/DCS-22
DakoCytomation
T/E
1:30
16
Ki 67
Mouse/MIB-1
DakoCytomation
T/E
kit 2x
17
Topoizomeráz II-α Mouse/3F6
Novocastra
T/E
1:20
37
18
Kaszpáz 3
Mouse/3CSP03
NeoMarkers
T/E
1:300
19
Kaszpáz 8
Rabbit/polyclonal
NeoMarkers
T/E
1:200
20
Kaspáz 9
Rabbit/polyclonal
NeoMarkers
T/E
1:200
21
CAS
Mouse/30F12
Novocastra
T/E
1:50
22
Bax
Rabbit/polyclonal
Santa Cruz Biothechnology
T/E
1:2000
23
nm23
Rabbit/polyclonal
DakoCytomation
Citrate
1:100
24
Bcl-2
Mouse/124
DakoCytomation
T/E
kit 2x
25
FAS310
Mouse/GM30
Novocastra
T/E
1:200
26
TTF-1
Mouse/SPT24
Novocastra
TRS
1:50
27
Chromogranin A
Rabbit/polyclonal
DakoCytomation
T/E
1:3000
28
HBME-1
Mouse/HBME-1
DakoCytomation
T/E
1:100
29
CD138
Mouse/MI15
DakoCytomation
Citrate
1:50
HIER: Heat-induced epitope retrieval (hı-indukált epitóp feltárás) T/E = 0.1 M Tris-HCl : 0.01 M EDTA, pH 9.0 Citrát = 0.1 M Citromsav-natrium citrát puffer, pH 6.0 TRS = Módosított citrát puffer pH 6.1 (Dako) * BP 180 és BPA G2
4.3.4 Értékelés, hierarchikus csoportosítás, statisztikai elemzés Az immunhisztokémiai reakciókat két patológus egymástól függetlenül értékelte négyes empírikus skála alapján. Az értékelésénél az egyes markerekre vonatkozó standard kritériumokat követtük (citpolazmatikus, magi vagy membránhoz kötött lokalizáció).
Megadtuk a reakciók intenzitását (0═negatív, 1═gyenge, 2═mérsékelt,
3=erıs) valamint a pozitív reakciót adó tumorsejtek százalékos arányát. Kettıs mintavétel esetében a magasabb pontértéket használtuk fel a késıbbi analízishez (6. táblázat).
38
6.táblázat: Az értékelési csoportok kialakításának feltételei az NSCLC esetekben a TMA szövetminták alapján (empírikus skála)
Értékelési
A reakció erıssége
Pozitív sejtek aránya
csoport
0
1
2
3
negatív
gyenge
mérsékelt
erıs
1
< 2%
2-10%
10-40%
2
< 5%
5-20%
20-50%
3
< 10%
10-30%
30-60%
> 40%
> 50%
> 60%
Az egyes értékelési csoportokba tartozó biomarkerek 1 csoport: p53 (N), p63 (N) 2 csoport: CK7 (C), kollagén XVII (C, M), EGFR (M), p16 (N), ciklin D1 (N), ciklin D3 (N), topoIIα (N), kaszpáz 3 (C), kaszpáz 8 (C, pN), kaszpáz 9 (C,N), Bax (C, N), Bcl-2 (C), FAS310 (C, M), TTF-1 (N), chromogranin A (C), HBME-1 (M,C), CD138 (M, C) 3 csoport: pan-citokeratin (C), CD44v6 (M, C), β-katenin (M), E-kadherin (M), p27kip1 (N), Ki-67 (N), CAS (C, N), nm23 (C, N) Immunreakció jellege: M - sejtmembrán, C - citoplazma, N - nukleáris, pN -perinukleáris
Az immunreakciók pontértékeit Microsoft Excel táblázatban archiváltuk, majd az adatokat dekonvoluter software program alkalmazásával analizáltuk [76]. Az értékelési skála adatait binarizálva a negatív és pozitív immunreakciókat hasonlítottuk össze (0 versus 1-3, vagy 0-1 versus 2-3). Az egyes fehérjék expresszióját a három tumor progressziós csoport valamennyi tagjával összehasonlítva vizsgáltuk, minden lehetséges
39
kombinációban. A statisztikai analízis Chi
2
és Fischer exakt teszt alapján történt. A
szignifikancia szint: p < 0.05. A fehérjék expressziója és a betegek túlélési paraméterei közötti összefüggéseket Kaplan-Meier értékeléssel és a long-rank teszt segítségével elemeztük. A Cluster software program az ún. „unsupervised hierarchal clustering analysis” (a feltételek nélküli csoport/klaszter képzési analízis) a vizsgált eseteket a tumor szövetek fehérjeexpressziója közötti hasonlóság alapján rendezte csoportokba [77], melyet a Treeview software alkalmazásával készült dendogram jelenített meg. A dendrogramon az egyes esetek és a horizontális ágak hossza közötti távolság fordított arányban van a vizsgált esetek közötti rokonsági fokkal.
4.4. Platina-bázisú neoadjuváns kemoterápia hatása az apoptózis és a proliferáció markereire valamint az ERCC1 expressziójára nemkissejtes tüdırákokban
4.4.1. Betegek és metodikák Tizenhét lokálisan elırahaladott nem-kissejtes tüdırákos beteg anyagát vizsgáltuk, akik a diagnosztikus bronchoszkópos mintavétel után neoadjuváns kemoterápiában részesültek, majd a kemoterápiát követıen tüdıdaganatuk eltávolításra került. A bronchoszkópos, neoadjuváns kezelést megelızı és a hozzá tartozó sebészi biopsziás anyagokat együtt értékeltük ki. Egy beteg kivételével a neoadjuváns terápiára adott válasz megfelelı volt, ami lehetıvé tette a sebészi rezekciót. A fent említett beteg adenocarcinomája inoperábilisnak bizonyult, a kemoterápia után az endobronchiális tumor
progrediált,
ezért
a
daganatszövetet
merev
bronchoszkópia
kapcsán
mechanikusan távolították el. Az így nyert mintát a poszt-kemoterapiás (posztoperatív) tumor csoportba soroltuk és a továbbiakban így is értékeltük. A betegek klinikai és patológiai jellemzıit a 7. táblázat tartalmazza.
40
7.táblázat: A betegek adatainak összefoglalása A betegek száma
17
Életkor (év) Átlag
51
Intervallum
40 - 65 Nem
Férfi
11
Nı
6 Stádium (a sebészi minták alapján) I/A
2
I/B
4
II / A
2
II / B
3
III / A
4
III / B
1
IV
1 Szövettan
ADC (BAC)
9 (1)
Laphámrák
8
Neoadjuváns kezelés (≥ ≥ 2 ciklus)
17
Cisplatin-gemcitabine
14
Cisplatin-etoposide
3
Betegkövetési adatok*
12/17
* elérhetı adatok 17 beteg közül 12 esetében A hisztológiai csoportosítás a WHO 2004. osztályozást követte.
4.4.2. Immunhisztokémia Az immunhisztokémiai vizsgálatokat formalinban fixált, paraffinba ágyazott szöveteken végeztük, a Ki-67, p53, Bcl-2, Bax, FAS-ligand és ERCC1 (excision repair cross-complementation group 1) fehérjék kimutatására. Négy µm vastag metszeteken
41
deparaffinálás majd rehidrálás után standard avidin-biotin-peroxidáz komplex metodikával történt az immnhisztokémiai reakció.
Az antitestek jellemzıit és
alkalmazási feltételeiket a 8. táblázatban foglaltuk össze.
8. táblázat: Az antitestek jellemzıi és alkalmazási feltételei
Biomarker p53
Klón
Gyártó
Mouse/DODakoCytomation 7
Bcl-2
Mouse/124
Bax
Polyclonalis DakoCytomation
FASligand
DakoCytomation
Sejten belüli megjelenés
Higítás
Elıkezelés
mag (N)
1: 50
Citrát
citoplazma (C)
1: 20
Citrát
C, N
1: 100
Citrát
1: 50
Citrát
N
1: 100
Citrát
N
1: 50
Citrát
APO-1/FAS C DakoCytomation DX2 sejtmembrán
Ki-67
MIB-1
ERCC1
Mouse(8F1)
DakoCytomation IOZOL
Citrát = 0.1 M Citromsav-natrium citrát puffer, pH 6.0 Az immunreakciókat két patológus értékelte emprírikus skála alkalmazásával. A reakciót akkor értékeltük pozitívnak, ha a pozitív sejtek aránya legalább 5%-os volt. Az alacsony esetszám a statisztikai analízist nem tette lehetıvé, a kiértékeléskor az egyes eseteket hasonlítottuk össze. A neoadjuváns terápia elıtti és az azt követı mintákban kiértékeltük az apoptótikus sejtek valamint a tumor parenchyma és tumor stroma arányát. Apoptózis index mehatározása HE festett metszeteken morfológiailag az apoptózisra jellemzı elváltozásokat mutató tumorsejtek száma / 100 tumorsejt
42
4.5. Az EGFR immunhisztokémiai kimutatásának értéke az EGFR-TKI célzott terápiára alkalmas tüdıadenocarcinomák kiválasztásában A tüdıadenocarcinomák kezelésében a gefitinib (Iressa) és az erlotinib (Tarceva) EGFR gátló hatású vegyületeket alkalmazzák. A gefitinib 50-szer hatékonyabban gátolja az EGFR-t, mint más tirozin kinázt. Az EGFR gátlók hatékonyságát nagylétszámú klinikai vizsgálati csoportokban tanulmányozták: az ISEL (Iressa Survival Evaluation in Lung Cancer) vizsgálatban a gefitinibet monoterápiában használták, másod- illetve harmadvonalban, a kezelés azonban nem eredményezett hosszabb túlélést [78]. Az erlotinib a TRIBUTE (Tarceva responses in conjunction with paclitaxel and carboplatin) és a TALENT fázis III vizsgálatokban, kemoterápiával kombinálva, elsı vonalban nem eredményezett hosszabb túlélést; a BR.21 fázis III vizsgálatban, monoterápiaként, másod- és harmadvonalban azonban szignifikánsan meghosszabbította a túlélési idıt [79].
4.5.1. Betegek és tumormintái A tüdı adenocarcinomák EGFR immunhisztokémiai vizsgálatát 9 esetben retrospektív (EGFR tirozin kináz inhibitor [TKI] - 1 eset gefitinib és 8 eset erlotinib kezelésben már részesült, arra reagáló) és 127 esetben prospektív, azaz EGFR TKI kezelésre kiválasztandó beteg tumormintáin végeztük el. A minták az ország 21 patológiai osztályáról érkeztek. A hét bronhoszkópos primer tumor és kettı agyi metasztázis kivételével a többi sebészi tüdırezekátum illetve az abból származó reprezentatív paraffinos blokk volt. A paraffinos mintákból 4µm vastag metszetek készültek.
4.5.2. Immunhisztokémia (IHC) Reagens: EGFR (PharmDx kit, Dako): egér monoklonális anti-humán EGFR (clone 2-18C9), kecske anti-egér IgG és HRP - konjugált dextrán polimér, majd DAB szubsztrát kromogén. A pozitív kontroll a gyártó által biztosított, H29 humán
43
colorectalis carcinoma sejtvonal formalinban fixált és paraffinba ágyazott sejtüledéke volt, amelyben a tumorsejtek membránpozitivitása 2+ erısségő viszonyítási alapot jelentett. A mintát IHC pozitívnak minısítettük, ha a daganatos sejtek több mint 10%-a mutatott membránfestıdést. A standard körülményeket a BR.21 és az ISEL klinikai kísérletek alapján alakítottuk ki: sikeres immunhisztokémiai vizsgátok során ugyanezt a kitet és elbírálást használták [79]. A pontosabb EGFR státusz megállapítást lehetıvé tévı, félkvantitatív IHC pontszámot is meghatároztuk, a Capuzzo és munkatársai által leírtakhoz hasonlóan: meghatároztuk a membránfestıdés intenzitását (0, 1+, 2+ = a kit kontroll metszetének festıdési intenzitásával megegyezı, 3+) és a festıdés százalékos gyakoriságát (0%-100%). A két érték szorzata adta az IHC pontszámot, melynek nagysága alapján a mintákat 3 kategóriába soroltuk (0-99, 100-199, 200-300) [80,81] .
44
5. Eredmények
Az egyes vizsgálatok eredményeit a Célkitőzésekben és az Anyagok és módszerek fejezetekben leírtaknak megfelelı sorrendben tárgyaljuk.
5.1. Az NCAM–hoz kötött α-2,8-polisziálsav (polySia) hatásának vizsgálata humán kissejtes tüdırákvonal (NCI-H69) polySia pozitív és polySia negatív szubklónjainak növekedésére in vitro és in vivo
Az egyes kísérletekben a polisziálsav szerepét tanulmányoztuk a sejt-sejt, sejt és szubsztrát közötti kapcsolatokban in vitro és nude egerekben in vivo a polySia pozitív és negatív szubklónok összehasonlításával.
5.1.1. A polySia expressziója primer humán SCLC tumorokban és áttéteikben Ötven kissejtes tüdırákos beteg primer daganatát és közülük 15 beteg áttétét vizsgáltuk és hasonlítottuk össze. Két alapvetıen eltérı polySia festıdést tapasztaltunk: az esetek 54%-ában a primer tumor diffúz polySia pozitiv reakciót mutatott (3. ábra), míg 46%-ukban a polySia expressziója heterogén jellegő volt (4. ábra), változó arányban hordozott pozitív és negatív sejteket. Hasonló arculat a metasztázisokban is megfigyelhetı volt. A primer tumorok és metasztázisaik azonos mintázatot mutattak.
45
3. ábra Humán SCLC, paraffin metszetek, polySia immunreakció (direkt arany-jelölt mAb735 antitest és ezüst intenzifikáció). A primer tumorban (a) és nyirokcsomó áttétében (b) diffúz és azonos intenzitású.
4. ábra: PolySia immunreakció egy másik humán SCLC primer tumorában (a) és nyirokcsomó áttétében (b). A primer tumor polySia pozitív és negatív területeket egyaránt tartalmaz (nyílhegyek) és a polySia reakció intenzitása is változó. Azonos jelleg figyelhetı meg a nyirokcsomó metasztázisban is.
46
5.1.2. Klonális alvonalak kialakítása NCI - H69 kissejtes tüdırákból A klonális alvonalak kialakításakor a limitált higítások után a tenyésztés annyi ideig tartott, amíg az egy-egy klónban a sejtszám a 103-104 értéket el nem érte. A polySia immunreaktív sejtek aránya az egyes alvonalakat összehasonlítva 0 és 95% között mozgott. Az 51 sikresen kialakított klónból 12 reprezentatív klonális alvonalat választottunk ki a további több hónapos tenyésztésekre. Valemennyi vizsgált klón sejtjei magas
százalékban
mutattak
(>95%)
NCAM(●)
expressziót,
a
polySia
immunreaktivitás azonban az egyes klónok között és az egyes klónokon belül is különbözı volt az egyes idıpontokban, 1 (▪) és 2 (○) hónap elteltével (5. ábra). A további vizsgálatokhoz két klonális sejtvonalat választottunk ki, amelyekben a polySia pozitív sejtek aránya az idıben viszonylag kisfokú változást mutatott: a polySia negatív (E2) és a polySia ≥95% pozitív (F3).
5. ábra Az ábrán az 51 sikeresen kialakított H69 szubklón látható, melyek közül 12 alvonalat vizsgáltunk tovább. Ezekben az NCAM (●) expresszió állandó, > 95%-os volt. A polySia azonban idıben változott: 1 hónap (▪) és 2 hónap (○) meghatározott értékeit az egyes klónok fölött lévı szimbólumok jelzik. Az E2 (polySia negatív) és az F3 (polySia pozitív) alvonalak mutattak idıben legstabilabb polySia expressziót.
47
5.1.3. A különbözı arányú polySia expresszió alapja a H69 SCLC klónokban A H69-SCLC tenyészetekben, a szubklónok kialakítása elıtti, parentalis sejtvonalban, a sejtek közel 40%-a volt polySia pozitív a sejtciklust szinkonizáló kezelések elıtt és után. A colcemide (5µg/ml) hatása, a szérum (10% FCS) megvonása majd visszajuttatása vagy a mikrotubulusok depolimerizálódását kiváltó 4°C-os (éjszakán át tartó) hőtés nem befolyásolta a polySia pozitív sejtek arányát. A polySia expresszió tehát sejtciklustól független esemény kell, hogy legyen (az adatokat nem ábrázoljuk).
5.1.4. A polisziálsav (polySia) és az NCAM jellemzése immunoblottal E2 (polySia negatív) és F3 (polySia pozitív) klónozott alvonalakban immunoblottal igazoltuk a polySia relatív expresszóját. Az E2 - NCAM a 140 kd-nál adott immunreaktív szignált. Az E2 sejtek futtatás elıtti endoN kezelése nem mutatott értékelhetı különbséget a polySia immunfestıdésben a kezeletlen sejtekkel összehasonlítva - az ábrán nem látható (6. ábra).
6. ábra: Western blot analízis: F3 és E2 szubklónok polySia és NCAM expressziója
48
5.1.5. A metiláció hatásának vizsgálata a polySia cellularis expressziójára Egy adott DNS szekvencia transzkripciós aktivitása és a CpG régió metilációja között inverz kapcsolat áll fenn. Számos permanens sejtvonalban a CpG régiók metilálódása következtében funkcióvesztés („loss-of-fuction”) alakulhat ki. A metilációt gátló 5-azacitidinnel történı kezelés alkalmazható a CpG régiók metilálódásának és így a funkcióvesztésnek a visszafordítására [82]. A metiláció gátló 5-azacitidinnel történt kezelést követıen a kissejtes tüdırák klónozott vonalaiban nem volt szignifikáns változás a polySia pozitiv sejtek arányát illetıen. Az E2 vonal polySia negatív sejtjei immuncitokémialilag továbbra is polySia negatívak maradtak (az adatokat külön nem mutatjuk).
5.1.6. A polySia expressziójának változása az idı függvényében A sorozatos tenyészetekben 18 hónapon át fenntartott E2 és az F3 sejtvonalakban ez idı alatt csak igen kis arányban változott meg a polySia pozitív sejtek aránya. Az 1,2,12 és 18 hónap múlva a polySia immunreaktív sejtek aránya a szubklónokban konzisztens volt, s nem tért vissza az eredeti H69 sejtekre jellemzı megoszláshoz (9. táblázat).
Szubklónok kialakítása óta eltelt idı
PolySia immunreakció
H69 – E2 H69 – F3 1 hónap
0%
94.8%
2 hónap
0%
95.5%
12 hónap
0%
88.9%
9. táblázat: a polySia reakció %-os megjelenése 1,2,12 hónap után az egyes szubklónokban
49
5.1.7. A polySia hatása a sejt-sejt közötti interakcióra Az NCI-H69 SCLC tenyészetei szuszpenzió formájában növekednek, 3 vagy több sejt által alkotott csoportokban. A sejtcsoportok 0.5 mm-es hypodermiás tőn történı átnyomását követıen a szuszpenzió 75-80%-ban önálló sejtekbıl áll, majd standard körülmények között a sejtek rapid módon újra aggregátumokat képeznek. Húsz perc elteltével az aggregáció további szignifikáns növekedést nem mutatott. A különbözı fokban polySia pozitív sejttenyészeteket összehasonlítva azt láttuk, hogy a sejtfelszíni polySia pozitiv (F3) sejtek szignifikánsan kevesebb aggregátumot képeznek, mint a polySia negatív (E2) sejtek (10. táblázat). A sejtfelszíni polySia endoN-nel való enzimatikus eltávolítása után a sejtek szignifikánsan több csoportot formáltak a kontrollhoz viszonyítva (10. táblázat). A polySia negatív sejtek esetében nem nıtt szignifikánsan az endoN kezelést követı aggregáció (10. táblázat). A sejtadhéziós molekulák osztályozásának egyik megközeítése a mőködésükhöz szükséges kalciumfüggıségük vagy annak hiánya. Az NCAM nem Ca-függı [83]. Az EDTA sejtaggregációra gyakorolt hatását olyan EDTA koncentráció mellett vizsgáltuk, amely az extracellularis Ca koncentrációt a mérhetı szint alá csökkentette. A polySia pozitív sejtek esetében az aggregáció nem változott, míg a polySia negatív sejteknél az aggregáció szignifikánsan csökkent (10. táblázat). A polySia pozitív sejteknél csak akkor láttunk hasonlóan szignifikáns csökkenést az aggregációban, ha a polisziálsavat elızetesen endoN-nel eltávolítottuk a sejtek felszínérıl (ua. táblázat). Ez arra utal, hogy a polySia hatással van a sejtek kalciumfüggı aggregációjára, s hogy ez a hatás az NCAM-tól eltérı sejtfelszíni molekulákra irányul [84]. A sejtaggregátumok kialakulását elindító kapcsolatok eltérıek azoktól, amelyek a már kialakult aggregátumok fenntartását szolgálják. Ez utóbbi folyamatok jellemzésére végeztük el a diszaggregációs vizsgálatokat. A kezeletlen polySia pozitív és negatív sejtek között nem láttunk szignifikáns különbséget a diszaggregációs viselkedésükben (10. táblázat). Az aggregációs teszt eredményeivel ellentétben, az EDTA kezelés ebben az esetben nem befolyásolta azt a diszaggregációs ellenállást, amit az endoN kezelés okozott a sejtfelszíni polySia eltávolításával. Mindez arra enged következtetni, hogy a sejtek közötti kapcsolatokban szerepet játszó, NCAM által mediált, Ca-független mechanizmust a polySia gátolni képes.
50
5.1.8. A polySia hatása sejt-szubsztrát adhézióra Az áttétképzésben az egyik legfontosabb tényezı a tumorsejt és extracellularis matrix (EM) közötti kapcsolat és az EM inváziója. Vizsgálataink során különbözı szubsztrátok (heparánszulfát, laminin, IV-es típusú kollagén és poli-L-lizin) és a tumrosejtek közötti adhéziót vizsgáltuk a sejt-szubsztrát assay-ben. Az adott szubsztráthoz letapadó sejteket standard mosásos procedurát követıen formazán festék alapú teszttel határoztuk meg. A polySia pozitív és negatív sejtvonalak, valamint az endoN-kezelt polySia pozitív sejtek között nem találtunk mérhetı különbséget a szubsztrátokhoz való kötıdésükben (10. táblázat).
10. táblázat: A sejt aggregációs, a sejt diszaggregációs és a sejt-szubsztrát adherencia assay-k eredményei polySia pozitív (F3) és polySia negatív (E2) alvonalakon F3
E2 a
Aggregációs assay Nincs kezelés
70 ± 9.5%
83 ± 7.5%
Endo N-
73 ± 6%
82 ± 7%
EndoN +
82 ± 7.5%
81 ± 6%
EDTA-
75 ± 6.5%
85 ± 6%
EDTA+
72 ± 6%
67 ± 5%
Endo N -, EDTA-
73 ± 11%
NDb
Endo N +, EDTA -
82 ± 11%
ND
Endo N -, EDTA +
83 ± 8%
ND
Endo N +, EDTA +
61 ± l1%
ND
Diszaggregációs-assayc Nincs kezelés
49 ± 12%
45 ± 6%
EndoN -
49 ± 11%
ND
EndoN +
64 ±6%
ND
Endo N -, EDTA -
49 ± 10%
ND
Endo N -, EDTA +
56 ± 8%
ND
Endo N +, EDTA +
69 ± 10%
NO
51
Sejt-szubsztrát adherencia assayd IV-es típ.kollagén (0.5µg/ lyuk)
26 ± 0.7%·
24 ± 4%·
Laminin (0.5µg/lyuk) EndoN -
32 ± 5%M
38 ± 12%
EndoN +
35.5 ± 4%
ND
61 ± 10%
64 ± 9%
Poli-L-lizin (0.1 mg/ml)
72 ± 6%
67 ± 5%
Plasztik
25 ± 3%
26 ± 1%
Heparanszulfát (10 µg/ lyuk)
a. Az eredmények az aggregátumokat képezı sejtek számát jelentik, 20 perccel a reaggregáció után, standard tenyésztési körümények között, a teljes sejtszám százalékában. b. ND: nem vizsgáltuk c. Az eredmények az aggregátumokat alkotó sejtek százalékos arányát jelentik 2x 0.5mm-es hypodermiás tőn való átnyomás után a teljes sejtszámhoz viszonyítva. d. Az eredmények az egyes szubsztrátokkal adhéziót mutató sejtek százalékos arányát jelentik, amit formazán festék alapú teszttel határoztunk meg.
5.1.9. A sejtklónok növekedése lágy agaron és nude egerekben Az F3 (polySia pozitív) és E2 (polySia negatív) alvonalak egyaránt kialakítanak kolóniákat 0.3%-os agaron. A kolóniák és az agarra kihelyezett viabilis sejtek számarányának meghatározásával azt láttuk, hogy az F3 sejtek több telepet hoztak létre, mint az E2 (polySia negatív) sejtek (11. táblázat). A metilcellulózon (1.5%) vizsgált növekedés hasonló eredményt adott. A sejtek in vivo növekedésének és áttétképzésének vizsgálatához nude egereket szubkután oltottunk mindkét tumorsejtvonal sejtjeivel, standard sejtszám mellett. Bár mindkét vonal (E2 és F3) esetében kialakult szolid tumor, a polySia pozitív sejtek szignifikánsan több esetben képeztek szubkután áttétet (11. táblázat). Az eltávolított tumorból ismét in vitro sejtvonalat kialakítva annak polySia expressziója nem mutatott eltérést a szülıvonaltól, s a citogenetikai vizsgálat is humán karyotípust igazolt.
52
11. táblázat: Klonogén növekedés in vitro és nude egerekben PolySia pozitív F3
PolySia negatív E2
vonal
vonal
0.11±0.13
0.04±0.095
0.37±0.16
0.03±0.045
Klonogén növekedés lágy agarona Klonogén növekedés metilcellulózona Tumor növekedés nude egerekben Sikeres tumor oltás Intrakután metastasisb
7/8 (87,5%)
6/9 (66%)
5/7 (71%)
1/6 (16%)
a. Kolóniaszám átlaga / a kihelyezett viabilis sejtek száma b. A tumornodulusok kötıszöveti rostokkal teljesen elhatárolódnak egymástól. Az egyes állatokban legfeljebb 1-1 ilyen metasztázis alakult ki.
5.2. Az NCAM-hoz kötött α-2,8-polisziálsav (polySia) szintézisének és sejtfelszíni re-expressziójának vizsgálata humán kissejtes tüdırákvonal (NCI-H69) sejtjeiben A polySia szintézisének és sejtfelszíni re-expressziójának vizsgálatához az F3 (polySia pozitív) sejteket használtuk. A polySia re-expresszióját immuncitokémiai és immunelektronmikroszkópos módszerekkel követtük. Az intracellularis transzport vizsgálatához hımérséklet (20°C) vagy kémiai (monenzin) blokkot alkalmaztunk. Az egyes lépéseknél a polySia és NCAM expressziót immunelektronmikroszkópiával és immunprecipitációt követı Western blot analízissel azonosítottuk.
53
5.2.1. A transzportfolyamat követése immunelektronmikroszkópos és immunprecipitációs módszerrel A kissejtes tüdırák (SCLC) F3 polySia pozitív klonális alvonala csak a sejtfelszínen mutatott polySia immunogold jelölıdést, de sejten belüli reakció nem volt azonosítható (7.a-b ábra). Western blot analízissel M>200kDa mérető, a polySiahordozó fehérjékre jellegzetes széles csík vált láthatóvá. (8. és 10. ábra). Az F3 sejtek endoN kezelése egyrészt a sejtfelszíni polySia hiányát (7.c ábra), másrészt a Western bloton az egyik immunreaktív csík eltünését eredményezte (8. és 10. ábra). A polySia az endoN kezelt sejtek 37°C-on, 1 órán át tartó tenyésztése után halvány csíkként vált láthatóvá (MS>200kD), majd ennek intenzitása az idıvel erısödött (8.ábra). Az ötödik napon, 37°C-on történı tenyésztés után a Western blot szignál csaknem elérte a kontroll sejtek intenzitását. Ezzel párhuzamosan, amint arra a sejtfelszíni immunogold - ezüst jelölés is utal, a polySia pozitív sejtek száma és a polySia immunfestıdés intenzitása idıvel arányosan fokozódott (9. ábra). A 4 órás illetve a 2 napos tenyésztés után a sejtek 8% majd 35 % -án lehetett gyenge, fokális sejtfelszíni immunjelölıdést megfigyelni. Három nap elteltével a sejtek közel 100%-a mutatott polySia pozitivitást, de a reakció intenzitása még elmaradt az 5 napig tenyésztett sejtekétıl. A proteináz K enzim kezelés eredményeként a sejtfelszíni polySia és NCAM pozitivitás egyaránt eltünt. A polySia és az NCAM sejtfelszíni re-expressziójának idıbeni jellege hasonló volt, mint a polySia esetében, az endoN kezelés után (az adatokat nem mutatjuk). Az endoN kezelt, majd 15 iletve 24 óráig 20°C-on (7.c ábra) vagy 37°C-on, de monenzin jelenlétében növekedı sejtek felszínén nem volt kimutatható polySia immunogold jelölıdés. A hımérséklet és a monenzin indukálta transzport blokk egyaránt a Golgi apparátus ciszternális struktúrájának eltőnését és annak számos, különbözı mérető vakuolummá való átalakulását eredményezte egyéb sejttípusokban [85,86,87 ] . A Golgi ilyen átalakulását mi is tapasztaltuk sejtjeinkben. A polySia immunreaktivitást jelölı arany partikulumok az F3 sejtekben a kialakult vakuolumok mentén voltak kimutathatók (7.d-f ábra). Ha a transzport-blokkolt (hıindukált, 20°C-os és/vagy monenzin indukált, kémiai blokk) sejtekbıl a blokk feloldása után 15 óra múlva egységnyi sejtet vettünk ki, Western bloton egy-egy gyenge polySia pozitív csík megjelenését láttuk (10. ábra), melynek intenzitása a 37°C-on, monenzin mellett
54
növekvı sejtekben erısebb volt, mint a 20°C-on blokkolt sejtek esetében. A hagyományos Western analízisnél érzékenyebb immunprecipitáció erısebb szignált eredményezett a 20°C-on blokkolt sejtekben, 15 óra után (10. ábra). Az immunelektronmikroszkópos vizsgálattal azt láttuk, hogy ha a 20°C-on kiváltott transzport blokkot a sejtek 15 perces 37°C-os inkubálásával leállítottuk, a polySia jelölıdés a vakuolumokhoz kapcsolódott, ugyanakkor szabályos Golgi ciszternák a sejtben nem voltak azonosíthatók, míg 30 perc elteltével a polySia immunreaktivitás mind a vakuolumokban mind a sejtfelszínen megfigyelhetı volt (ezt a stádiumot az ábrák nem demonstrálják). Mire a Golgi apparátus morfológiája egy órás, 37°C-os tenyésztést követıen visszanyerte eredeti állapotát, a polySia-t jelölı arany partikulumok már csak a sejtfelszínen voltak kimutathatók (az ábrán nem látható). A polySia de novo szintézisének demonstrálására az endoN kezelt sejteket 20°Con 24 órán át tenyésztettük triciált N-acetilmannózamin vagy N-acetilglukózamin és 6diazo-5-oxo-norleucin
jelenlétében.
A
polySia-ba
beépült
radioaktivitás
meghatározásához a sejthomogenizátumot mAb 735-tel immunprecipitáltuk, az Anyag és módszer fejezetben leírtaknak megfelelıen. Az így nyert immungyöngyök endoN kezelése után a polySia asszociált radioaktivitást a felülúszóból határoztuk meg. Kontroll inkubációnál endoN-mentes puffert használtunk (12. táblázat). Az Nacetilglukósamin az N-acetilmannózarninnal összehasonlítva nem fokozta a polySia-ba való beépülés ütemét (táblázatban errıl nincs adat). Az F3 sejtek mindkét vegyületet képesek voltak hasznosítani az általunk felállított kísérleti körülmények között. A sejtfelszíni sziálsav - asszociált radioaktivitás, ami a V. cholerae szialidáz hatására szabadult fel, megközelítıleg tízszerese volt a polySia-ban lévınek (a táblázatban nem látható). Ismert, hogy ez az exoszialidáz enzim az endoN-nel szemben a polySia rövidebb láncait is hidrolizálja és az egyedülálló, különbözı kötésekben lévı terminális sziálsav reziduumokat is hasítja.
55
56
57
12. táblázat: PolySia radioaktivitás az F3 sejtekben. A vizsgált minta
Radioaktivitás (cpm)
Endo-N-felszabadított polySia
127 ± 8
Immunprecipitáció-után felszabadult polySia
221 ± 9
Kontroll
60.5 ± 11
250 µCi N-acetil-n-[6-3H(N)]mannózamin bejuttatása a sejtekbe 24 órán át, 37°C-on, endoN kezelést követıen. (Student t-teszt P < 0.01)
58
5.3. Nem-kissejtes tüdırákok progresszójában szerepet játszó fehérjék
expressziójának
vizsgálata
szöveti
multiblokk
alkalmazásával Vizsgálatainkban három különbözı tumor progressziós stádiumot hasonlítottunk össze, 29 marker alkalmazásával. A három stádium az 1. primer, nem metasztatizáló, a 2. primer, agyi metasztázist adó, valamint a 3. az agyi áttétek csoportja volt (11. ábra). A szöveti multiblokk (TMA) kialakításával mód van a különbözı immunhisztokémiai reakciók standard körülmények közötti kivitelezésére, s az egyes biomarkerek összehasonlító vizsgálatára az eltérı szövetmintákon [88,89]. Az immunreakciók értékelésével olyan immunprofilt kerestünk, amelynek alapján a nem-kissejtes tüdırákokon belül a klinikai viselkedésnek megfelelı csoportok különíthetık el. Ötvenkilenc nem-kissejtes tüdırákos esetet vizsgáltunk, ezen belül 26 primer tüdırákot és annak agyi áttétét, valamint 33 olyan elsıdleges tüdıdaganatot, amelyekben a betegeknél nem alakult ki távoli metasztázis. A biomarker expresszió és a tumor
progresszió
közötti
kapcsolatot
az
immunfestıdési
jellegzetességek
összehasonlításával vizsgáltuk. Chi-square teszt és Fischer exakt teszt analízis eredményeként (p< 0,05) bizonyos markerek szignifikánsan eltérı expresszióját láttuk a nem-metasztatizáló és az áttétképzı primer tumorok összehasonlításával (13. táblázat).
59
11. ábra: Progressziós csoportok p: primer tüdırák, p+m: primer metasztatizáló tüdırák, m: agyi metasztázis
5.3.1 Fehérje expressziós profil eltérések a progresszió különbözı stádiumai között A nem metasztatizáló és a már agyi áttétet adott primer tüdırákok eseteiben megjelenı fehérjéket összehasonlítva azt láttuk, hogy a kollagén XVII, a CD 44v6 és a kaszpáz 9 szignifikánsan magasabb expressziót mutatott, míg a β-katenin és a CAS (cellular apoptosis susceptibility protein) expressziója alacsonyabb szintő volt a metasztatizáló csoportban. A ciklin D1, D3 és a citokeratin 7 megjelenése csaknem szignifikánsan magasabb volt ugyanebben a tumor progressziós daganat csoportban. A Ki67 proliferációs index csaknem valamennyi minta esetében magas volt. Az EGFR az egyes progressziós csoportokban egyaránt közel 70%-os volt. Az áttétet nem adó tüdıdaganatok és az agyi áttétek fehérje arculatának összehasonlításából a kollagén XVII, CD 44v6, p16, p53 (DO7), ciklin D3, kaszpáz 3 és 9 és a CD 138 jelent meg szignifikánsan gyakrabban az agyi áttétekben, mint a nem
60
metasztatizáló primer tumorban, míg a β-catenin elıfordulása jelentısen magasabb volt az utóbbi NSCLC csoportban. A ciklin D1, p63, kaszpáz 8 és chromogranin A emelkedett expressziója az agyi áttétek eseteiben szintén megközelíti a szignifikancia határát. Az egyes progressziós csoportokban megjelenı eltérı fehérje expresszió (βkatenin, ciklin D1, ciklin D3, kollagén XVII és CD44v6) néhány példáját a 12. ábra szemlélteti. A metasztatizáló primer tumorok és agyi áttéteik összehasonlításával néhány biomarker esetében szintén megfigyelhettünk eltérı expressziót. Lényeges emelkedés volt megfigyelhetı a p16, topoizomeráz II-α és a CD 138 fehérjék esetében az agyi áttétekben, a p53 (DO7) és a kaszpáz 3 fokozott expressziója közel szignifikáns mértéket ért el az áttétképzés folyamata során.
13. táblázat: Fehérje expresszió az egyes progressziós stádiumokban
Eset Marker
Nincs
Metaszt.
N met./Agyi m Agyi met. Met./Agyi met
p
p*
c/to
p
1.000
1.000
0.061
0.120
metasztázis c/to
1
N. met./Met.
%
Pan-Cytokeratin 33/33 100
%
p*
c/to
%
p
p*
26/26 100 1.000
1.000
25/25 100 1.000
1.000
24/25 96
0.531
0.738
22/26 87
0.187
0.351
(AE1-AE3) 2
CK7
25/32 78
0.021* 0.035* 3
BP180 (6D1)
15/33 46
0.033
0.039
19/26 73
0.043
0.062
18/25 72
0.931
1.000
14/33 42
0.080
0.116
17/26 65
0.103
0.120
16/25 64
0.918
1.000
19/32 60
0.026
0.036
20/23 87
0.041
0.066
18/21 86
0.905
1.000
13/25 52
0.208
0.258
Kollagén XVII 4
BP180 (9G2) Kollagén XVII
5
CD 44v6
0.049* 0.089* 6
β-katenin
30/33 91
0.034
0.046
18/26 69
0.001
0.002
0.002* 0.003* 7
E-kadherin
24/32 75
0.865
1.000
20/26 77
0.163
0.260
15/26 58
0.139
0.237
8
EGFR
23/32 72
0.919
1.000
19/26 73
0.826
1.000
18/26 69
0.760
1.000
9
p16
15/32 47
0.536
0.599
15/25 60
0.004
0.007
21/26 81
0.029
0.040
0.007* 0.009*
0.035* 0.048*
10
p27 kip1
24/31 77
0.182
0.270
14/26 54
0.810
1.000
18/25 72
0.301
0.393
11
p53 (DO7)
16/29 55
0.780
1.000
13/22 59
0.029
0.040
21/24 88
0.068
0.103
61
12
p53 (Pab240)
14/28 50
0.460
0.551
7/19
37
0.732
0.777
9/20
45
0.703
0.752
13
p63(4A4)
14/32 44
0.643
0.788
12/24 50
0.185
0.272
7/26
27
0.093
0.145
22/26 85
0.685
1.000
0.048* 0.090* 14
Ciklin D1
22/33 67
0.051
0.068
23/26 89
0.116
0.101
0.040* 0.065* 15
Ciklin D3
23/33 70
0.084
0.117
23/26 89
0.010
0.016
25/26 96
0.298
0.610
16
Ki 67
32/33 97
0.380
1.000
25/25 100 0.371
1.000
26/26 100 1.000
1.000
17
Topoizomeráz
23/33 70
0.725
0.784
17/26 65
0.381
21/26 81
0.349
0.332
0.012* 0.025*
II-α 18
Kaszpáz 3
0.211
7/33
21
0.146
0.162
10/26 39
0.001
0.001
17/26 65
0.052
0.095
20/25 80
0.666
0.726
22/26 85
0.385
0.668
0.005* 0.007* 19
Kaszpáz 8
23/32 72
0.247
0.346
22/26 85
0.479
0.548
0.045* 0.058* 20
Kaszpáz 9
21/33 64
0.018
24/26 92
0.026
0.004* 0.008* 21
CAS
27/33 82
0.009
0.142
0.004* 0.008* 13/26 50
0.013
0.116
0.259
0.358
18/26 69
0.158
0.258
26/26 100 0.263
0.448
25/26 96
0.313
1.000
0.031* 0.038* 22
Bax
32/32 100
1.000
1.000
0.045* 0.080* 23
nm23
31/33 94
0.202
0.499
26/26 100 0.202
0.499
26/26 100 1.000
1.000
24
Bcl-2
13/31 42
0.445
0.580
8/25
32
0.132
0.165
6/26
23
0.475
0.541
25
FAS310
6/16
38
0.548
0.734
8/26
31
0.148
0.272
5/26
19
0.337
0.523
26
TTF1
18/33 55
0.589
0.608
19/26 73
0.847
1.000
18/26 69
0.492
0.577
27
ChromograninA 0/33
0.256
0.441
1/26
0.045
0.080
3/26
12
0.298
0.610
28
HBME-1
19/32 59
0.798
1.000
14/25 56
0.189
0.280
10/24 42
0.316
0.396
29
CD138
20/32 63
0.940
1.000
16/26 62
0.003
0.003
24/25 96
0.003
0.005
0
4
N. metasztázis = primer NSCLC metasztázis nem ismert; Metaszt.= primer NSCLC ismert agyi metasztázissal; Agyi met. = Agyi metasztázisok a NSCLC metasztatikus csoportban. c/to = positív esetek/teljes esetszám a saját csoporton belül az ua. csoporton belüli megfelelı %-os aránnyal (%). A Chi-square teszt (p) és a Fischer exakt teszt (p* értékek) korrelációk külön oszlopokban. Szignifikáns eltérések vastagon kiemelve* a p értékek után a táblázatban, ha a 0-1 értékeket 2-3 értékekkel hasonlítottuk.
62
12. ábra: A: Metasztatizáló nagysejtes carcinoma, részleges β-katenin expresszió B: βkatenin reakció teljes hiánya és C: ciklin D1 erıs expressziója adenocarcinoma eset agyi áttétjében. D: Ciklin D3 E: kollagén XVII és F: CD44v6 fokozott expressziója agyi áttétet okozó elsıdleges laphámrákban. Digitális metszetek, Mirax Scan (Gottingen, Germany)
5.3.2. Fehérje expressziós különbségek a hisztológiai típusok között Néhány fehérje jelentısen eltérı expressziót mutatott az egyes NSCLC szöveti típusokat összehasonlítva. A TTF-1(74% ADC és 43% SCC), a citokeratin 7 (100% ADC és 75% SCC), a ciklin D1 (87% ADC és 71% SCC), a HBME-1 (66% ADC és 48% SCC) és a kaszpáz 8 (48% ADC és 33% SCC) szignifikánsan nagyobb gyakorisággal jelent meg az adenocarcinomákban (ADC), mint a laphámrákokban (SCC). Ugyanakkor a p16 (62% SCC és 48% ADC), a kollagén XVII (72% SCC és 48% ADC) valamint a topoizomeráz II-β (78% SCC és 58% ADC) expressziója jelentısen gyakoribb volt a laphámrákok, mint az adenocarcinomák eseteiben. Ebben az összehasonlításban csak a szövettani típusra voltunk tekintettel, nem vettük figyelembe, hogy a daganatok melyik progressziós csoportba tartoznak (14. táblázat).
63
14. táblázat: Fehérje expressziós eltérések az egyes szöveti típusok között
Gén expressziós profil az egyes antitestek alapájn (%) Hiszt
topoII-
TTF-1
CK7
ciklinD1
HBME-1
kaszp8
p16
kollVII
ADC
74
100
87
66
48
48
48
58
SCC
43
75
71
48
33
62
72
78
α
5.3.3. Hierarchikus csoportosítás, klaszter analízis a fehérjék expressziója alapján Irányítottan
kialakított
csoportokba
soroltuk
az
egyes,
funkcionálisan
összetartozó markereket, így a sejtciklus, az apoptózis regulációs fehérjéit és az adhéziós proteineket. Ezek között azonban nem találtunk olyan elkülöníthetı klasztereket, amelyek kapcsolatba hozhatók lennének valamelyik progressziós csoporttal. Nem tudtunk azonosítani egyetlen olyan markert sem, amelynek alapján a hierarchikus csoportosítás az eseteket egy közös progressziós vagy hisztológiai csoportba sorolta volna. A feltételhez nem kötött, nem irányított hierarchikus klaszterképzéssel a 85 nem-kissejtes tüdırákból származó szövetmintán (33 primer, nem metasztatizáló tüdırák, 26 primer metasztatizáló tüdırák és az utóbbiak agyi áttétei) elvégzett 29 immunhisztokémiai reakció eredménye alapján 35 eset rendezıdött egy olyan közepes mérető csoportba, amelyre mérsékelt fokú korreláció (0.63) volt jellemzı (Treeview kép, 13. ábra). Ebbe a csoportba 16 agyi áttét (16/26), 12 metasztatizáló primer tüdırák (10/26) és 7 áttétet nem adó tüdı tumor (7/33) tartozott.
64
13. ábra: Feltétel nélküli csoportanalízissel, valamennyi (29) antitestet figyelembe véve, a 85 NSCLC szövetminta közül 35 alkotott egy csoportot, amelybe 16 agyi áttét (16/26) 12 metasztatizáló primer tüdırák (10/26) és 7 nem-metasztatizáló tüdırák (7/33) tartozott. Korreláció: 0. 63
Ha a csoportosítás az eltérı módon expresszálódott markerek (13. táblázat) alapján történt, magasabb korrelációt mutató klasztereket kaptunk. A ciklin D1, -D3, p16, p53 (DO7 klón), p63, kaszpáz-3, -8, -9, CD44v6, β-katenin, CD 138 és a XVII kollagén fehérjék együttes kombinációja már csak kisebb, 20 esetet tartalmazó csoportot eredményezett, de a korábban 29 marker alapján szelektált 16 agyi áttét ismét együtt került csoportosításra, magasabb (0.74) korrelációval (14. ábra).
65
14. ábra: A 12 fehérje alapján történı klaszter analízis 20 esetet rendezett egy csoportba, amely tartalmazta ugyanazt a 16 agyi metasztázist, amelyet a korábban 29 antitestre alapozott csoportosítás is szelektált. Korreláció: 0.74
Az agyi áttétek a lehetı legerısebb pozitív korrelációt (0.93) a ciklin D1, -D3, p16, Ki-67 és XVII kollagén fehérje együttes értékelésével adták. A csoport analízis így 24 esetet rendezett egy csoportba, amelyet 16 agyi áttét, 7 metasztatizáló és 1 nemmetasztatizáló primer tüdırák alkotott (15. ábra).
66
15. ábra: Klaszter analízis, 5 fehérje (ciklin D1, -D3, p16, Ki-67 és XVII kollagén) alapján, 24 esetet rendezett egy csoportba: 16 agyi áttétet, 7 metasztatizáló és 1 nemmetasztatizáló tüdırákot. Korreláció: 0.93
5.3.4. A fehérjék expressziója és a betegek túlélési ideje közötti kapcsolat A betegek túlélésének egyváltozós analízise és a Kaplan-Meier túlélési görbék egyértelmően szignifikánsan rövidebb (p<0.001) idıtartamot igazoltak a metasztatikus nem-kissejtes tüdırákos esetekben a nem-metasztatizáló progressziós csoporttal összehasonlítva (16.ábra). A magas korrelációt mutató hierarchikusan rendezıdı esetek (14. ábra) alkotta csoport tagjai szignifikánsan rosszabb prognózissal bírtak, mint a csoporton kívül esı betegek (17. ábra). Az egyes fehérjék prognosztikai jelentıségét egyváltozós analízissel értékeltük, a szövettani altípusoktól függetlenül. A β-katenin szignifikánsan (P=0.03) fokozatosan csökkenı expressziót mutatott az agyi áttétek (91%), a metasztatizáló primer tumorok (69%) és áttétet nem képzı tüdırákok (52%) összehasonlításában. A β-katenin pozitív
67
esetekben átlagosan 91 hónap, míg a negatívakban 36 hónap túlélési idıt láttunk (18. ábra). Egyéb fehérjék prognosztikai szerepe, vizsgálataink eredménye alapján, nem volt igazolható a nem-kissejtes tüdırákos esetekben.
Százalékos túlélés
100
NSCLC no meta nemdist. áttétképzı NSCLC, agyi brain metast áttét
50
0 0
25
50
75
100
125
Túlélési idı az 1.diagnózis után (hó)
16. ábra: Kaplan-Meier túlélési görbe a nem- metasztatizáló és a metasztatizáló daganatok eseteiben
68
100
klaszteren belül
Százalékos túlélés
klaszteren kívül
50
0 0
25
50
75
100
125
Túlélési idı az 1.diagnózis után (hó)
17. ábra: A magas korrelációval csoportosított esetek (13. ábra) prognózisa szignifikánsan rosszabb, mint a csoporton kívül esı betegeké (P<0.0001) - KaplanMeier
69
Százalékos túlélés
100
β β – katenin + β β – katenin -
50
0 0
25 50 75 100 125 Túlélési idı az 1.diagnózis után (hó) (months) Survival after 1st diagnosis
18. ábra: A β-katenin pozitív és negatív daganatos betegek túlélési görbéi. Az átlag túlélési idı 91 hónap a β-katenin + és 36 hónap a β-katenin – esetekben - Kaplan-Meier
5.4. Platina-bázisú neoadjuváns kemoterápia hatása az apoptózis és a proliferáció markereire valamint az ERCC1 expressziójára nemkissejtes tüdırákokban A vizsgálatokban 17 nem-kissejtes tüdırákos beteg neoadjuváns terápiát megelızı (bronchoszkópos) és a terápiát követı (sebészi) daganatmintáin vizsgáltuk az apoptózis és a proliferáció markerei valamint az ERCC1 fehérje expresszióját. Az eredmények összehasonlításával a neoadjuváns terápia fent leírt markerekre gyakorolt hatására szándékoztunk következtetni.
70
Az apoptózis index és a tumorsejt/tumor stroma arány jellemzıit az egyes esetekben a 15. táblázat tartalmazza.
15. táblázat: A bronchoszkópos és a sebészi minták összehasonlítása pre: neoadjuváns terápia elıtt poszt: neoadjuváns terápia után
Apoptózis index Eset
Hiszt
Tumor sejt / Tumor stroma arány
% pre
poszt
pre
poszt
1
SCC
1
0
90
60
2
SCC
1
4
90
70
3
SCC
0
1
90
75
4
SCC
1
0
80
70
5
SCC
1
1
70
85
6
SCC
0
1
90
80
7
SCC
1
2
90
70
8
SCC
0
1
70
60
9
ADC
0
1
80
70
10
ADC
1
1
70
80
11
ADC
1
2
90
95
12
ADC
1
0
40
10
13
ADC
0
0
80
85
14
ACC
1
2
50
80
15
ADC
0
1
60
50
16
ADC
0
3
70
90
17
BAC
0
1
80
80
71
5.4.1. Apoptózis markerek a neoadjuváns terápia elıtti és utáni (pre- és posztkemoterápiás) tumorszövetekben A p53 marker expressziója a neoadjváns kemoterápia elıtt és után a NSCLC szövetekben A neoadjuváns kemoterépia elıtt meghatározott p53 marker 7/17 esetben mutatott magi pozitivitást (41%) és 10/17 (59%) esetben negatív volt a nem-kissejtes tüdırákokban. Egy esetben a p53 expresszió elveszett (1/7), míg 4/10 esetben negatív vált pozitívvá a terápia után, míg a további 12 esetben nem történt változás a p53 expressziójában a neoadjuváns terápiát követıen. A FAS-ligand expressziója a neoadjváns kemoterápia elıtt és után a NSCLC szövetekben A FAS-ligand 5/17 kemoterápiát megelızı esetben nem volt kimutatható, míg 12/17 beteg anyagában pozitív volt. Az eredetileg 5 negatív esetbıl három (3/5) a poszkemoterápiás mintákban pozitív volt, ugyanakkor 3 eset (3/12) elvesztette Fasligand pozitivitását a neoadjuváns kezelést követıen. Bcl-2 expresszió a neoadjváns kemoterápia elıtt és után a NSCLC szövetekben A 17 neoadjuváns kemoterápiát megelızı eset közül 15 (15/17) mintában nem láttunk Bcl-2 expressziót és csak 2/17 eset volt pozitív. Az utóbbi 2 Bcl-2 pozitív tumor közül az egyik esetében a neoadjuváns kezelés után nem találtunk Bcl-2 pozitivitást, míg a 15 negatív közül 3/15 (20%) a kezelést követıen Bcl-2 expressziót mutatott. A Bax marker expressziója a neoadjváns kemoterápia elıtt és után a NSCLC szövetekben A terápiát megelızıen csak egy esetben nem volt detektálható a Bax expresszió, (16/17 pozitív), a posztkemoterápiás anyagok közül azonban valamennyi pozitív volt 17/17. Az apoptózis markereinek adatait a 16. táblázat tartalmazza, az egyes fehérjék expresszióját az egyik adenocarcinoma esetben (16. eset) a 19. ábra szemlélteti.
72
16. táblázat: Az apoptózis markerek összehasonlítása a neoadjuváns terápia elıtti és terápia utáni (pre és poszt) mintákban
Eset
Hiszt
p53 pre poszt
FAS pre poszt
Bcl 2 pre poszt
Bax pre poszt
SCC
poz
poz
poz
neg
neg
neg
poz
poz
SCC
poz
poz
poz
poz
neg
poz
poz
poz
SCC
neg
poz
poz
poz
neg
neg
poz
poz
SCC
neg
neg
neg
poz
neg
neg
poz
poz
SCC
poz
poz
poz
poz
neg
neg
poz
poz
SCC
neg
neg
poz
neg
neg
neg
poz
poz
SCC
neg
neg
poz
poz
neg
neg
poz
poz
SCC
neg
neg
poz
neg
poz
poz
poz
poz
ADC
neg
neg
neg
poz
neg
neg
poz
poz
ADC
neg
neg
neg
neg
neg
neg
poz
poz
12
ADC ADC
poz poz
neg poz
poz poz
poz poz
neg neg
neg neg
poz neg
poz poz
13
ADC
neg
poz
poz
poz
neg
poz
poz
poz
14
ADC
poz
poz
neg
poz
neg
neg
poz
poz
15
ADC
neg
poz
poz
poz
neg
poz
poz
16
ADC
poz
poz
poz
poz
neg
neg
poz
poz poz
17
BAC
neg
poz
neg
neg
poz
neg
poz
poz
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
73
19.ábra: p53, FAS, Bcl2 és Bax protein expressziója a neoadjuváns terápia után a sebészi mintában (16. táblázat 16. ADC eset) p53, FAS és Bax pozitív, Bcl 2 negatív (belsı kontroll: lymphocyták)
5.4.2. A Ki-67 expressziója a neoadjváns kemoterápia elıtt és után a NSCLC szövetekben A 17 eset közül a neoadjuváns terápiát megelızı állapothoz képest 7 esetben (7/17) a Ki-67 expressziója nıtt a terápiát követıen, 3/17 esetben azonban csökkent. A további hét esetben nem változott a proliferációs aktivitás (17. táblázat).
5.4.3. Az ERCC1 expressziója a neoadjváns kemoterápia elıtt és után a NSCLC szövetekben A neoadjuváns kemoterápia elıtti szövetminták közül 8 esetben (8/17, 47%) az ERCC1 reakció pozitív volt, ezek szövettani megoszlása: 6/8 laphámrák (SCC), 2/9 adenocarcinoma (ADC) (20. ábra). Egyetlen adenocarcinoma eset kivételével a
74
korábban ERCC1 pozitív prekemoterápiás minták a neoadjuváns kezelés után elvesztették expressziójukat (7/8) a sebészi rezekátumokban. A sebészi minták között tehát nem találtunk olyan esetet, amelyben az ERCC1 a terápiát követıen jelent volna meg.
20. ábra: ERCC1 magi expressziója a terápia elıttti adenocarcinoma és laphámrák esetekben
A Ki-67 és az ERCC1 markerek változásait a pre- és posztkemoterápiás mintákban a 17. táblázat foglalja össze. A laphámrákok közül (SCC) egyetlen neoadjuváns terápiát követı sebészi mintákban sem volt azonosítható ERCC1 expresszió.
75
17. táblázat: A Ki-67 és az ERCC1 változásait foglalja össze.
ERCC1 Eset
Hiszt
Ki-67 %
neoadjuváns terápia
neoadjuváns terápia
elıtt
után
elıtt
után
SCC
poz
neg
25
70
SCC
poz
neg
30
50
SCC
neg
neg
70
40
SCC
poz
neg
40
5
SCC
neg
neg
60
80
SCC
poz
neg
10
10
SCC
poz
neg
50
90
SCC
poz
neg
10
20
ADC
neg
neg
5
20
ADC
neg
neg
50
40
ADC
poz
neg
30
30
ADC
neg
neg
5
30
ADC
poz
poz
50
60
ACC
neg
neg
50
90
ADC
neg
neg
<5
5
ADC
neg
neg
60
40
BAC
neg
neg
10
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
5.4.4. Az egyes betegek túlélési adatai Az alacsony esetszám és a nem minden beteg esetében elérhetı betegkövetési adatok miatt a vizsgált markerek változása és a betegek túlélési ideje közötti esetleges kapcsolat értékelése statisztikai módszerekkel nem lehetséges. A 18. táblázatban összefoglaltuk az elérhetı paramétereket.
76
18.táblázat: Betegkövetési adatok
Bronchoszkópia Hisztológia és mőtét között eltelt idı (hó)
Túlélési idı (hó)
Él: 0 Elhunyt:1
Eset
Nem
1
F
ADC
3.5
28
1
2
N
ADC
4.5
NA
NA
3
N
ADC
10
NA
NA
4
F
ADC
6
25
1
5
F
ADC
2.5
NA
1
6
N
ADC
7
NA
NA
7
F
ADC
13
33
1
8
N
BAC
>48
0
9
F
ADC
3.5
NA
1
10
N
ADC
3.5
>38
0
11
F
SCC
2.5
NA
NA
12
F
SCC
3
55
1
13
F
SCC
2.5
11
1
14
F
SCC
6.5
25
1
15
F
SCC
11
NA
NA
16
N
SCC
48
>76
0
17
F
SCC
3.5
NA
1
F: férfi N: nı ADC: adenocarcinoma SCC: laphámrák NA: adat nem elérhetı A követés 2007. decemberében ért véget.
77
5.5. Az EGFR immunhisztokémiai kimutatásának értéke az EGFRTKI
célzott
terápiára
alkalmas
tüdıadenocarcinomák
kiválasztásában
5.5.1. Retrospektív vizsgálatok eredménye Az immunhisztokémiai vizsgálat csak 5 minta (56%) esetében mutatott EGFR pozitivitást, azaz 10% feletti gyakorisággal membránfestıdést. A 4 IHC negatív minta közül 2 (2/4) nem tartalmazott EGFR pozitív sejtet, a további 2 esetben pedig a pozitív festıdés <10%-os volt. 5.5.2. Prospektív vizsgálatok eredménye Immunhisztokémia (IHC) Az EGFR fehérje expresszióját 117 betegmintán vizsgáltuk, 116 esetben (99%) sikeresen, 1 esetben a minta nem volt alkalmas a feldolgozásra. Hatvannyolc tumorszövetben (59%) IHC pozitivitást tudtunk igazolni. A 48 IHC negatív minta, valamint 26 IHC pozitív minta (összesen 74 minta - az összes sikeresen vizsgált anyag 63.8 %-a) kapott 0-99 IHC pontszámot. Huszonöt tumorszövet (21.6%) 100-199 és 17 minta (14.7%) pontszáma 200-300 volt. Az IHC pozitivitás gyakorisága és a klinikai jellemzık (dohányzás, nem és kor) között nem találtunk szignifikáns összefüggést. Az EGFR génkópiaszám és mutáció vizsgálatának metodikai összefoglalóját és eredményét a Dr. Pintér Ferenc és mtsai által publikált közlemény tartalmazza [90]; az adatok egyben Dr. Pintér Ferenc PhD értekezésének részét képezik. Fluoreszcens in situ hibridizációval (FISH) EGFR génamplifikáció vagy az EGFR gént tartalmazó 7-es kromoszóma poliszómiája észleltı. Amplifikáció esetén az EGFR gén / 7-es kromoszóma számaránya ≥2, míg a poliszómia esetén általában az EGFR gén és a 7-es kromoszóma száma együtt nı, azaz arányuk általában 1 körüli. A BR.21 vizsgálatban az erlotinib csak a FISH pozitívak esetében mutatott túlélési elınyt, a FISH negatívak esetében nem. Az EGFR génkópiaszámot kvantitatív PCR-rel (qPCR) vizsgálva, csak a válaszarányban volt szignifikáns különbség, a túlélés hosszában már nem [80]. Az erlotinib fázis III (BR. 21) valamint a gefitinib fázis III (ISEL) vizsgálatainak kritériumrendszerét alkalmazva, az EGFR IHC poztív esetekben nagyobb volt a
78
mutációk gyakorisága (16%, 11/67 eset), mint az IHC negatívakban (8%, 4/48 eset), de a különbség nem volt szignifikáns. A Capuzzo és munkatársai által leírtakhoz hasonló fél-kvantitatív értékelést alkalmazva, az EGFR IHC pontszám már szignifikáns korrelációt mutatott (P = 0,025) a mutáció gyakoriságával: 0-99 közötti IHC pontszám esetén 8,1% (6/74 eset), 100-199 között 16% (4/25 eset), 200-300 között pedig 31% (5/16 eset) volt a mutációs ráta. Az EGFR fehérje expressziónak az EGFR genotípusváltozástól való függetlenségét próbáltuk érzékeltetni a 21. ábrán. FISH-
FISH+
Amplifikált
IHCPozitív kontroll:
Vad típusú
-
Mutáns
-
IHC+ Negatív kontroll:
Vad típusú
Mutáns
21.ábra: Az EGFR fehérje expressziója a különbözı genotípusok esetében. vad típus: mutáció nem mutatható ki (18.19.21.exon) FISH pozitívnak nyilvánítottuk a mintát, ha az magas poliszómás (tumorsejtek ≥ 40%-a tartalmazott ≥ 4 génkópiát) vagy génamplifikált volt. IHC pozitív kontroll: 2 + erısségő EGFR membrán festıdés (FISH+: magas poliszómia, de nem amplifikált)
79
Mindhárom módszerrel vizsgált minták 90 mintán sikerült mindhárom EGFR-státuszvizsgálatot elvégezni. A mutáció +/-, FISH +/- és IHC+/- csoportok közül egyik sem fedte teljesen a másikat, így mind a 8 lehetséges státusz-variáció elıfordult. Az alcsoportok egymáshoz való viszonyát a 22. ábrán látható Venn-diagramm mutatja be.
22. ábra: A különbözı EGFR-státuszvizsgálatokkal meghatározott tüdıadenocarcinoma-alcsoportok egymáshoz való viszonya.
80
6. Megbeszélés A tüdırák világviszonylatban és Magyarországon is a vezetı daganatos halálok. A világon évente több mint 1,2 millió új tüdırákos esetet regisztrálnak, és ez a betegség felelıs a daganatos halálozás kb. 20 %-áért, ami Magyarországon évente kb. 8000 tüdırákos beteg halálát jelenti. A modern képalkotó eljárások és egyéb diagnosztikus módszerek gyors fejlıdése, továbbá a kombinált daganatellenes kezelések alkalmazása ellenére a betegség ötéves túlélése napjainkban még mindig 15 % alatt van. Eltekintve a tüdırák igen korai stádiumában elvégzett radikális sebészi rezekciótól, a betegség kezelésében a multimodalitás játszik döntı szerepet, tehát a sebészi és/vagy a sugárterápiás és/vagy a kemoterápiás módszerek összehangolt alkalmazása. A tüdırákok progressziójáért felelıs tényezık megismerése részben közelebb vihet a daganat kialakulásának körülményeihez, részben az egyes progressziós stádiumok közötti eltérések és azonosságok megtalálásához. Prognosztikai és prediktív faktorok megismerése nemcsak a folyamatok megértését szolgálja, hanem terápiás szempontból is jelentıséggel bír.
6.1.
NCAM-hoz kötött α-2,8 polisziálsav hatása a kissejtes tüdırákok viselkedésére in vitro és in vivo
A magas malignitású kissejtes tüdırák (SCLC) sejtjei NCAM-ot és polisziálsavat (polySia) expresszálnak. Vizsgálatainkkal azt szándékoztunk igazolni, hogy különbözı SCLC esetekben és az ezekbıl a tumorokból elıállított sejtvonalakban a polySia expressziója heterogén. Az NCAM olyan membrán glikoprotein, amely homofil kötıdési mechanizmussal képes elısegíteni a sejt-sejt adhéziót. Az adhézió erıssége fordított összefüggést mutat az NCAM glikolizációjának mértékével és specifikusan az α-2,8-sziálsav reziduumok homopolimérjeinek (polisziálsav) mennyiségével [91]. In vitro vizsgálatok korábban demonstrálták, hogy a polySia nemcsak az NCAM funkcióját képes befolyásolni, hanem más molekulákét is. A poliszialált NCAM volt az elsı adhéziós molekula, melyrıl igazolódott, hogy tumor- és szövetfejlıdési antigén
81
[92] és feltételezhetıen kapcsolatot mutat a daganatsejtek invazivitásával és áttétképzésével [93,94,95].
Számos neuroendokrin daganat sejtjeinek felszínén
azonosítható poliszialált NCAM, melyek közül a kissejtes carcinoma azért is bír különös jelentıséggel, mert a tüdı carcinoid tumorával összehasonlítva éppen a polySia jelenléte képez fontos differenciáldiagnosztikai markert: a carcinoid tumor sejtjenek felszínén nem - poliszialált NCAM található. Ez a különbség a polySia bizonyos biológiai szerepére is utalhat [18]. A vizsgálatok során humán kissejtes tüdırák (SCLC) sejtvonal (NCI-H69) olyan különbözı szubklónjait alakítottuk ki és jellemeztük, amelyek eltérı arányban tartalmaztak polisziálsavat expresszáló sejteket (0%-95%), de valamennyi sejt NCAMpozitiv volt. A további modellben polySia pozitív sejtekrıl endoN kezeléssel távolítottuk el a polisziálsavat, hogy vizsgálni tudjuk a polySia szerepét az azonos eredető sejtek viselkedésének összehasonlításával. A
primer
és
áttéti
SCLC
tumorok
hullámzó
sejtfelszíni
polySia
immunreaktivitása azzal magyarázható, hogy a polySia az α-2,8 kötésben lévı Nacetilneuraminsav reziduumok homopolimérjeibıl áll, melyben a polimerizáció foka igen változó. Az a tény, hogy a H69 szubklónok folyamatosan magas vagy alacsony arányban hordoztak polySia pozitív sejteket arra utalt, hogy a sejteknek ez a tulajdonsága az alkalmazott tenyésztési körülmények között stabil. A polySia expresszióját az idı függvényben vizsgálva azt láttuk, hogy az E2 (polySia negatív) és az F3 (polySia pozitív) alvonalak esetében az expresszió stabil és nem tért vissza az eredeti H69 vonalra jellemzı értékre. Az NCAM expresszió valamennyi szubklón esetében állandó és egyenletesen magas. A sejtadhéziós molekulák osztályozásának egyik alapja, hogy aktivitásukhoz igénylik-e kalcium jelenlétét. Az NCAM mőködése a kálciumtól független [96]. Esetünkben
a
sejt-sejt
közötti
kapcsolatokat
vizsgálva
az
aggregációs
és
diszaggregációs assay-k eredménye arra enged következtetni, hogy egy valószínőleg NCAM által közvetített, kálcium-független mechanizmus érintett a sejtaggregátumokon belüli, sejtek közötti kapcsolatban, amelyet a polySia jelenléte gátolni képes. Egér tumorsejt vonalak esetében leírták, hogy sejtfelszíni sziálsav reziduumok csökkentik a tumorsejtek IV-es típusú kollagénhez és fibronektinhez való adhézióját
82
[97], mi azonban nem találtunk mérhetı különbséget a szubsztrát kötıdésben sem a polySia pozitív (F3) és -negatív (E2) sejtek esetében, sem akkor, ha endoN kezelt polySia pozitív (F3) sejteket vizsgáltunk. A kolóniaképzıdést összehasonlítva azt láttuk, hogy a polySia pozitív F3 sejtek több telepet képeztek, mint az E2 sejtek, nude egereken végzett kísérletek eredményei pedig arra utaltak, hogy a polySia fokozott expressziója korrelációt mutat az intrakután metasztázisok kialakulásával. A polySia NCAM tulajdonságait módosító hatása részben annak homofil és heterofil kötıhelyeit befolyásoló, maszkoló effektusával lehet összefüggésben, hasonlóan más sejtadhéziós molekulákhoz [98]. Ez a maszkoló hatás vélhetıen fizikaikémiai tulajdonságokkal van összefüggésben, ami magyarázhatja a polySia pozitív sejtek könnyebb leválását a primer tumorról, ezzel elindítva a metasztatizálás kaszkád mechanizmusát. A polySia sejten belüli szintézisével és sejtfelszíni expressziójával kapcsolatos immunhisztokémiai és Western blot vizsgálatokban azt láttuk, hogy az NCAM és a polySia F3 sejtekrıl történı enzimatikus eltávolítása után a kezelt sejtek 37°C-os tenyészetben csak 5 nap múlva érik el a kezeletlen kontroll sejtekben kimutatott sejtfelszíni markerek szintjét. A polySia komplett expressziója tehát lassú folyamat, annak ellenére, hogy az F3 sejtek kettızıdési ideje 2.5 nap. A sejtfelszíni polySia lassú megjelenésével párhuzamosan re-expresszálódott az NCAM is a sejtfelszínen, amit azzal is magyarázhatunk, hogy a polySia-at hordozó NCAM-nak csak kis hányada szintetizálódik az adott idıtartam alatt. A triciált N-acetilmannózamin és Nacetilglukózamin alkalmazásával kimutatható volt, hogy a sejtek ezeket a prekurzorokat olyan, a plazmamembrán fehérjéken lévı sziálsav de novo szintéziséhez használták fel, amelyet a V.cholerae - szialiláz (II. típus) hasít. Látható volt az is, hogy 24 óra alatt a rendelkezésre álló anyagoknak csak közel 1%-a épült be. Ehhez hasonlóan, az endoN emésztésre érzékeny polySia-ba is csak kis mennyiségő prekurzor épült be. AtT-20 (hypophysis adenoma sejtvonal) sejteken korábban végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy az újonnan szintetizálódott NCAM gyorsan poliszialilálódik és jut is a sejtfelszínre [99]. Az F3 sejtekben a polySia intracellularisan nem detektálható [100,101]. A folyamat lépéseinek megismerésére a Golgi apparátus és a sejtfelszín között kísérleti körülmények között transzport blokkot alakítottunk ki. Korábbi vizsgálatokból
83
ismert, hogy a 20°C-os hımérséklet indukálta vagy a 37°C-on monenzin kiváltotta transzport blokk hatására a Golgi apparátus vakuolumaiban reverzibilis módon halmozódnak fel a cellularis és a viralis glikoproteinek anélkül, hogy terminális glikolizációjukat ez befolyásolná [102]. Az így transzport blokkolt endoN kezelt F3 sejtekben mi azt láttuk, hogy a polySia sejtfelszíni ismételt feltőnése gátolt, ugyanakkor, a kontroll sejtekkel szemben, ultravékony fagyasztott metszeteken intracellularisan kimutatható. Arany jelöléssel a módosult, vakuolizált Golgi ciszternák területén volt lokalizálható a polySia, míg a citoszolban nem volt kimutatható. A Western blottal is azonosított polySia a radioaktív izotóppal végzett inkorporációs kísérletek alapján igazolhatóan de novo szintézis eredményeként jön létre. Egyes vizsgálatok azt mutatták ki, hogy a glikoproteinek galaktozilációja és szialilációja a transz-Golgi apparátusban történik [103]. Mi arra következtettünk, hogy az F3 sejtekben a polySia intracellularisan egy olyan, membránhoz kötött egységben szintetizálódik, ami legnagyobb valószínőséggel a Golgi rendszerhez tartozik. Elméletileg az is feltételezhetı, hogy a polySia szintéziséhez szükséges összes enzim a Golgi apparátusban akkumulálódik, s nem valahol máshol, olyan területen, amit a transzport blokk nem befolyásol. Ha figyelembe vesszük a transzport blokk sejtbiológiai sajátosságait, valamint az N-glikoziláció topográfiai jellegzetességeit és azt, hogy a polySia egy aszparaginhoz kötött oligoszaccharid oldallánc részét képezi, adataink is arra utalnak, hogy a polySia nem a sejtfelszínen szintetizálódik [100]. Korábbi
tanulmányok
alapján
ismert,
hogy
az
exogén
NCAM
poliszialilálódásához a Golgi membrán-asszociált szialiltranszferáz aktivitás jelenléte szüksges [104]. Tekintettel arra, hogy a mAb735 antitest kizárólagosan az α-2,8-ketozid kötésben lévı, több, mint 9 homopolimért tartalmazó polisziálsavat ismeri fel, immunelektronmikroszkópos vizsgálataink eredménye azt igazolja, hogy ez a polySia már az F3 sejtek Golgi apparátusában szintetizálódik, majd transzport folyamat révén a már „elkészült” molekula jut a sejtfelszínre. Az NCAM szialilálódása tehát komplex folyamat, amely egyéb glikoproteinekhez hasonalóan, számos, Golgi apparátushoz kapcsolódó enzim aktiválódását igényli. Bár az NCAM - α-2,8 polisziálsav (> 9 homopolimer) jelenlétét korábbi években a kissejtes tüdırákok jellegzetességének tartották, késıbb érdeklıdés fordult a nem-
84
kissejtes tüdırákok sejtfelszíni polySia jelenléte felé is. Japán munkacsoport 2000-ben arról számolt be, hogy nem-kissejtes tüdırákban szenvedı betegek közül a p (patológiai) I stádiumban lévıknek csak 20.8%-ában (5/24), míg pIV stádiumban már 76.8%-ában (11/14) azonosítható polySia expresszió a daganatokban. A polySia korrelációt mutatott a nyirokcsomó és a távoli metasztázisokkal, a primer tumor lokális kiterjedésével azonban nem [105]. Ugyanez a munkacsoport késıbb nagyobb betegszámra (44 polySia pozitív eset/ 236 NSCLC) alapozott vizsgálatát összegezve arra a következtetésre jutott, hogy a polySia rosszabb prognózisra utal a rezekált nem-kissejtes tüdırákokban, továbbá, hogy a polySia fontos klinikai marker lehet a preoperatív indukciós (neoadjváns) és/vagy a posztoperatív adjuváns terápia megválasztásában, még a relatíve jobb p-stádiumú betegek esetében is [106]. Az utóbbi értékelés azonban arra is rámutat, hogy a polySia expresszió az NSCLC csoporton belül az esetek jóval kisebb százalékában expresszálódik, mint az SCLC típusú tüdırákokban. Az NCAM és a polySia a 44 polySia pozitív eset közül csak 17/44-ben expresszálódott együttesen. A további 27 polySia pozitív tumor NCAM immunreakciót nem mutatott, tehát a polisziásav vélhetıen nem az NCAM-hoz, hanem más molekulához kapcsolódott [19].
6.2.
Nem-kissejtes
tüdırákok
és
agyi
áttéteik
fehérje
expressziójának
összehasonlító vizsgálata
A nem-kissejtes tüdırákok heterogén csoportjait eltérı morfológia, klinikai viselkedés és terápiás érzékenység jellemzi. Mindezen tulajdonságok különösen alátámasztják a molekuláris vizsgálatok szükségességét, hogy megismerhetıek legyenek azok a biomarkerek, amelyek a daganat progressziójával, a betegek prognózisával összefüggésbe hozhatók. A fehérje expressziós profil alapján remélhetıleg a nemkissejtes tüdırákokon belül további hasonlóan viselkedı daganatok csoportjai lesznek felismerhetık. A nem-kissejtes tüdırákok molekuláris vizsgálatainak további célja olyan biomarkerek megtalálása, amelyek az áttétképzı potenciált elırejelzik és alkalmasak lehetnek az adjuváns kemoterápiát igénylı betegek kiválasztására [107,108,109].
85
A szöveti multiblokk technika alkalmas nagyszámú tumorminta gyors és standardizált jellemzésére, ami számos új információt adhat a malignus fenotípussal és a terápia érzékenységgel kapcsolatban. Vizsgálatainkban nem-kissejtes tüdırákok reprezentatív területeit tartalmazó multiblokkokat alakítottunk ki. A tumorok a különbözı progressziós csoportokat (1. primer, 2. metasztatizáló primer és 3. agyi áttét) és a szöveti típusokat reprezentálták. Az emelkedett XVII kollagén (bullosus pemphigoid antigén, BP 180/BP AG2), CD44v6 és kaszpáz -9 expresszió, csökkent β-katenin és CAS protein expresszió szignifikáns összefüggést mutattak a nem-kissejtes carcinoma áttétképzı képességével. A sejtproliferációt elısegítı fehérjék (ciklin D1 és D3) nagyobb gyakorisággal jelentek meg a metasztatizáló primer tumorokban. A nem-kissejtes tüdırákok agyi áttétképzését a p16, a syndecan -1 (CD138), a p53 (DO7) és a kaszpáz-3 magasabb expressziója kísérte. Ez utóbbi fehérjék együttes jelenlétére alapozott hierarchikus csoportképzéssel az agyi metasztázisok kétharmada került néhány metasztatizáló primer tüdırákkal egy csoportba, amire rossz prognózis volt jellemzı. Ugyanakkor az agyi áttétek egyharmada kívül rekedt ezen a csoporton. A 29 vizsgált fehérje közül a sejtmembránhoz kötıdı β-katenin eltőnése vagy lokalizációjának sejten belüli változása volt a betegek kedvezıtlen túlélésének egyetlen független szignifikáns elırejelzıje. A sejtadhéziót befolyásoló molekulák eltérı expressziója valószínőleg szerepet játszik a metasztatizálás folyamataiban [110]. A metasztatizáló és a nem-metasztatizáló csoportokat összehasonlítva, a β-katenin szignifikáns delokalizációját (membránról - citoplazmába) láttuk, ami késıbb az agyi áttétekben is megfigyelhetı volt, s szignifikáns összefüggést mutatott a rövidebb túléléssel. A sejtmembránhoz kötıdı β-katenin expressziójának fokozatos eltünése a hörgıhámban kialakuló karcinogenezis egyes lépéseiben arra utal, hogy a β-katenin döntı szerepet játszhat ezekben az egymásra épülı folyamatokban. Az expresszió eltünése a diszplázia és a bronchiális laphámmetaplázia atípusos formáiban kezdıdik. [111]. A β-katenin csökkenését
és
delokalizációját
bronchioloalveolaris
carcinomában
(BAC)
is
kimutatták, szemben az atípusos adenomatosus hiperpláziával, amelyet a BAC megelızı állapotának tartanak [112].
86
A mi eredményeink is arra utalnak, hogy a nem-kissejtes carcinomákban a csökkent βkatenin expresszió kapcsolatban lehet a metasztatizálással és a rövid túlélési idıvel [113]. A közelmúltban vált ismertté, hogy a kóros β-katenin expresszió hátterében inkább az axin expressziójának csökkenése, mint a 3. exon mutációja állhat a nemkissejtes tüdırákokban [114]. A β-katenin eltünése és lokalizációjának változása eredményezheti a megzavart sejtadhéziót és a Wnt célgének fokozott tanszkripcióját, amelyek pozitiv irányban befolyásolják a sejtproliferációt [115]. Ugyanakkor a βkatenin magi transzlokációja, ami az emelkedett Wnt szignált jelzi, ezekben a vizsgálatokban nem volt látható. Ugyanezen esetek többségében az E-kadherin, a βkatenin funkcionális partnere a normális hámsejtekben, szintén csökkent expressziót mutatott a nem-kissejtes tüdırákok kialakulása során [111], ami néhány esetben összefüggött a betegek rossz prognózisával [116]. Saját vizsgálataink során mi is az Ekadherin expressziójának csökkenését észleltük az NSCLC progressziója során, de ez a különbség nem volt szignifikáns. A humán CD44 gén a sejt-sejt és sejt-matrix közötti interakciókban részt vevı I. típusú transzmembrán glikoproteineket kódolja. Bizonyos CD44 variáns izotípusok, így a CD44v6 is szerepet játszik a tumorok kialakulásában, a tumorsejtek inváziójában és a metasztázis képzésben [117]. Szabályos hörgıhámban és a nem daganatos léziókban a CD44 családba tartozó fehérjék expressziója a bazális membránhoz és a szomszédos alsó hámrétegekhez kötött, míg a CD44v6 csak a bazális membránban mutatható ki. Daganat elıtti állapotokban azonban a CD44 fehérjék és a CD44v6 immunreaktivitása a hám valamennyi rétegére kiterjed. A CD44v6 elsısorban a laphámrákokban és a bronchioloalveolaris carcinomában mutatható ki, ami alapján feltételezhetı, hogy a CD44 család szerepet játszik a tüdırákok differenciálódásában [118]. Egyes tanulmányok tüdıadenocarcinomák kialakulása során és azok recidiváló eseteiben a CD44v6 expressziójának csökkenését igazolták [119]. Saját vizsgálataink során egyrészt nem találtunk értékelhetı különbséget a laphámrákok és az adenocarcinomák CD44v6 expressziója között, másrészt az agyi áttétet adó tüdırákokban szignifikánsan emelkedett CD44v6 expressziót láttunk a nem-metasztatizáló tumorokhoz képest. A többfunkciós transzmembrán heparánszulfát proteoglikán, a syndecan-1 (CD 138) a nem-kissejtes tüdırákok közel 90%-ában jelen van [120] és expressziója már a lokalizált, korai stádiumú tüdırák eseteiben is megfigyehetı [121]. A syndecan-1
87
prognosztikai szerepe a nem-kissejtes tüdırákokban ellentmondásos. Toyoshima és mtsai vizsglatai szerint nincs hatással a prognózisra [120], míg mások elınyösebb kimenetelrıl, hosszabb túlélési idıtartamról számoltak be [122]. További vizsgálatok ugyanakkor a szérum syndecan-1 szintjének emelkedését a platina- ázisú kemoterápia esetén értékelik negatív prediktív jelként [123]. A mi vizsgálatainkban a syndecan-1 expressziója gyakoribb volt az agyi áttétek csoportjában bármelyik primer daganatcsoporttal összehasonlítva, ami azt jelzi, hogy a syndecan-1 szerepet játszhat az áttétképzés folyamatában. A legtöbb daganathoz hasonlóan az emelkedett proliferációs aktivitás rossz prognosztikai jelként értékelhetı a nem-kissejtes tüdırákok esetében is, különösen azok korai stádiumaiban [124]. Mi mindhárom prognosztikai csoportban magas (97-100100%) Ki-67 aktivitást észleltünk, a betegség proressziójára és a beteg prognózisára utaló szignifikáns különbséget az egyes csoportok között azonban nem láttunk. A sejtciklus szabályozói, a ciklinek, a ciklin-függı kinázok és a kináz-gátlók szintén érintettek az NSCLC prognózisában. Irodalmi adatok szerint a ciklin E és a ciklin B1 fokozott expressziója mutatott kapcsolatot a rossz prognózissal, utóbbi a tumorszövet differenciáltsági fokával is, míg a p21, p27 és p16 expresszió jobb kimenetelre utalt [125]. A ciklin D1 prognosztikai értéke a nem-kissejtes tüdırákokban ellentmondásos. Az egyik publikáció szerint a ciklin D1 fokozott expressziója alacsonyabb túlélési idıre utal [126], míg mások ezt nem tudták megerısíteni [127]. Saját vizsgálatainkban a ciklin D1 a metasztatizáló primer tüdırákokban gyakrabban volt kimutatható (89%), mint a nem metasztatizáló esetek között (67%). A ciklin D3 pedig az egyes progressziós csoportok között mutatott fokozatos növekedést a pozitív sejtek százalékos arányában (70-89-96%). Az eredmények arra utalnak, hogy a ciklin D1 és D3 a tumor progresszióban funkcionális szerepet tölt be, de direkt prognosztikai hatása nem mutatható ki. A mi megfigyelésünkhöz hasonlóan kutatók 284 NSCLC tumorminta és 18 fehérje vizsgálatával, szöveti multiblokk alkalmazásával nem találtak olyan markert, amely a nem-kissejtes tüdırákok egész csoportját tekintve prognosztikai elırejelzı értékkel rendelkezne. A ciklin D1 az adenocarcinomákat tekintve azonban szignifikáns prognosztikai markernek bizonyult (128).
88
A p16 cdk-inhibitor a ciklin D dependens kinázok aktivitásának gátlásával a G1 fázisra hat. Egyes vizsgálatok szerint a p16 fehérje hiánya önmagában vagy a Rb fehérje eltünésével együttesen nem bír prediktív értékkel a rezekált NSCLC tumoros betegek klinikai kimenetelével kapcsolatban [129], ugyanakkor a közelmúltban újabb tanulmányok azt mutatták be, hogy laphámrákokban a p16 eltünése (75%) és a pRb fokozott retenciója (86%) gyakoribb, mint adenocarcinomákban [130], valamint, hogy a p16 expressziójának hiánya a kedvezıtlen prognózis önálló faktora [131]. További eredmények a szimultán p16-pozitív és cyclin D1-negatív esetekben igazoltak egyszer rosszabb [128], más esetekben azonban jobb túlélési esélyt [132]. Vizsgálataink során fokozódó citoplazmatikus és magi p16 expressziót láttunk a tumor progresszió folyamán, amely végül az agyi metasztázisokban érte el csúcspontját. A p53 szerepét vizsgáló tanulmányok jelentıs része a nem-kissejtes tüdırákokban kóros p53 státuszt igazolt, ami a TP53 mutációjának következtében immunhisztokémiailag detektálhatóvá váló magi fehérje expressziójában nyilvánul meg [133], s rövid túlélési idıre utal, amint azt a p53 adatok meta-analízisével foglalkozó cikk összegzi [12]. Bár mi nem találtuk szignifikánsnak a p53 prognosztikai szerepét a nem-kissejtes tüdırákokban, de az agyi metasztázisokban a magi p53 fehérje pozitivitás jelentısen megemelkedett más csoportokhoz viszonyítva. A p53 csoport másik tagját, a p63 proteint sem láttuk prognosztikailag szignifikánsnak. Az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) fehérje a laphámrákok döntı többségében (70-80%) jelen van, ami közel kétszerese az adenocarcinomákban leírtaknak [100]. Bár néhány vizsgálat összefüggést mutatott ki az EGFR expressziója és a kedvezıtlen kimenetel között [49], a legtöbb esetben a génkópia szám volt az egyetlen statisztikailag szignifikáns prognosztikai faktor a nem-kissejtes tüdırákokban [134,135]. Vizsgálataink az NSCLC esetek közel 70%-ában igazoltak sejtmembrán asszociált EGFR pozitivitást a tumorsejtek legalább 5%-ában, az egyes progressziós csoportok között azonban nem találtunk szignifikáns különbséget a marker expressziójában. A nem-kissejtes rákok eseteiben csak kevés adat áll rendelkezésre az apoptózis markerek prognosztikus szerepével kapcsolatban [29,136]. Abban általános az egyetértés, hogy az apoptózis faktorok hiánya a tumor agresszív viselkedésére és a betegség rossz prognózisára jellemzı. Különbözı munkák eltérı eredményeket közöltek
89
a FAS, a FAS-ligand vagy a kaszpáz-3 hiányának a betegek túlélésére gyakorolt hatásával kapcsolatban [137], valamint a pro-apoptótikus Bax expressziójának prognosztikai szerepérıl [130]. Egyéb tanulmányok az emelkedett anti-apoptótikus Bcl2 és a kedvezıbb túlélés közötti kapcsolatot [48, 136] vagy az emelkedett kaszpáz-3 fehérje és a kedvezıtlen kimenetel összefüggését mutatták ki [137]. Vizsgálataink arra utaltak, hogy a CAS fehérje szignifikánsan lecsökkent a primer, áttétet adó tumorokban a nem-metasztatizálóhoz képest, míg a Bcl-2, Bax és FAS szintek között nem volt alapvetı különbség az egyes csoportokat összehasonlítva. A kaszpáz-3 és kaszpáz-9 egyaránt fokozott expressziót mutatott az egyes progressziós csoportokat összehasonlítva, ugyanakkor a kaszpáz-9 a nem-metasztatizáló (64%) és az áttétet adó (92%) primer tumorok között mutatott szignifikáns emelkedést. Ez szintén meglepı volt, de nem tudhatjuk, hogy a funkcionálisan inaktív vagy aktív kaszpázokat azonosítottuk-e. Ugyanakkor a fentiek közül egyik marker esetében sem láttunk szignifikáns prognosztikai összefüggést. A további értékelésekben feltétel nélküli csoport/klaszter képzési analízist alkalmaztunk annak vizsgálatára, hogy az egyes progressziós stádiumokban megjelenı fehérjék alapján szelektálhatók-e olyan markerek, amelyeknek önálló vagy együttes szerepük lehet az NSCLC csoportok biológiai viselkedésében, elsısorban agyi áttétképzésében.
Az agyi áttétek 2/3-ának immunhisztokémiai arculata nagy
hasonlatosságot mutatott (szoros korreláció: 0,74), a különbözı progressziós markerek (ciklinD1, -D3, p16, p53, kaszpáz-3, -8, -9, CD44v6, β-katenin, CD138 és a XVII kollagén) expressziója alapján. Ez arra utalhat, hogy ezekben a tumorokban hasonló szabályozó folyamatok aktiválódtak. A legszorosabb korreláció (0.93) a csoportosított eseteken belül a sejtciklus szabályozóinak, így a ciklin D1, ciklin D3, p16, Ki67 és a XVII kollagén molekula fokozott expressziójával volt kimutatható. A vizsgált eseteknek ebben a csoportjában a prognózis is szignifkánsan rosszabb (p<0.0001) volt, mint az ezen a csoporton kívül esı nem-kissejtes tüdırákos betegek csoportjában. Az egyes progressziós lépések közötti összefüggések további megismeréséhez további vizsgálatokra van szükség, amelyekben sok segítséget nyújthatnak az újabb antitestek. Vizsgálatainkat az alábbi eredményekben foglalhatjuk össze:
90
•
A XVII kollagén, a CD44v6, a kaszpáz-9, valamint a ciklin D1 és ciklin D3 expressziója fokozott, míg a β-katenin és a CAS csökkent expressziója a rosszabb prognózisú daganatokra jellemzı.
•
A vizsgált markerek közül csak a β-katenin esetében találtunk olyan expressziós változást - a sejtmembránról citoplazmába irányuló lokalizációs változás és/vagy az expresszió eltünése - amely önálló elırejelzıje a kedvezıtlen prognózisnak. Magi expressziót eseteinben nem láttunk. A βkatenin volt azonban az egyetlen marker, amelynek expressziója összefüggést mutatott a betegek szignifikánsan hosszabb túlélési idejével.
Az eredmények összegzéseként arra következtethetünk, hogy a daganatos progresszióval összefüggést mutató markerek és a hierarchikus csoportképzés módszerének alkalmazásával meghatározható azoknak a nem-kissejtes tüdırákos betegeknek a csoportja, akiknek tumora magasabb agresszivitású és fokozott áttétképzési kockázattal bír, s így a betegek túlélési esélyei is rosszabbak. A kockázati tényezık ismeretében a betegek kezelési stratégiája több elızetes adat alapján tervezhetı.
6.3.
Neoadjuváns
terápia
hatása
az
apoptózis
markerekre
és
a
proliferációra
A malignus daganatok kezelésében, így a tüdırákok eseteiben is a kemoterápia a mőtéti beavatozás idıpontjához viszonyítottan adjuváns és neoadjuváns lehet. Az I-es és II-es stádiumban neoadjuváns kemoterápia adása a klinikai gyakorlatban nem indokolt. A III/A (N2) stádiumban alkalmazott két-három ciklus kemoterápia után 50 % feletti remissziót lehet elérni, javul a rezekciós ráta és növekszik az átlagos túlélési idı, így ebben a stádiumban két-három ciklus neoadjuváns kemoterápia alkalmazható [1]. A daganatok fehérje expressziós változásai és biológiai viselkedésük közötti összefüggések,
progressziós
dinamikájuk
számos
tanulmány
tárgya.
Korábbi
vizsgálatainkban mi is az egyes progressziós stádiumok közötti, fehérje expresszióban megnyivánuló eltéréseket és azonosságokat próbáltuk jellemezni.
91
Részben fordított irányú a megközelítés, ha azt vizsgáljuk, a neoadjuváns kezelés hatására milyen molekuláris szintő változások jönnek létre a tumorszövetekben, a citotoxius terápia hatására mennyiben változik a tumorsejtek fehérje expressziós arculata. A platina-bázisú kemoterápia a nem-kissejtes tüdırák kezelésének alapvetı eleme, melynek egyik képviselıje a leggyakrabban alkalmazott ilyen szer a ciszplatin. Utóbbi esetében a citotoxikus hatás alapja a ciszplatin és DNS közötti kovalens keresztkötés kialakulása, a DNS-sel való addukt képzés. A DNS károsítás a túlélı tumorsejtekben is különbözı változásokat okoz. Vizsgálatainkban a ciszplatin tartalmú kemoterápia hatását a pre- és posztkemoterápiás (bronchoszkópos és sebészi) szövetmintákban hasonlítottuk össze, különös tekintettel az apoptózis ás a proliferációs aktivitás markereire valamint az ERCC1 expressziójára. A daganatsejtek terápiás érzékenységének jellemzésére a Ki-67 proliferációs index az egyik leggyakrabban vizsgált marker [138, 139, 140]. Az általunk vizsgált tizenhét, platina-alapú neoadjuváns terápiában részesült, nem-kissejtes tüdırákos beteg tumormintáinak több mint 40%-ában (7/17) a Ki67 proliferációs index növekedését, közel 18%-ában (3/17) csökkenését tapasztaltuk. Bár statisztikai értékelésre az alacsony esetszám nem adott lehetıséget, az megállapítható, hogy a neoadjuváns terápia összességében nem csökkentette a tumorszövetekben a proliferációs aktivitást, ami a daganatos progresszió egyik kulcstényezıje. Ez ellent mond Lang és mtsai megfigyelésének, akik terápia indukált hatásként a Ki-67 csökkenését mutatták ki, s ezt adenocarcinomákban kifejezettebbnek találták, mint a laphámrákokban [141]. További tanulmányok a IIIA és IIIB stádiumban lévı betegek mediasztinális nyirokcsomó mintáiban többek között a Ki-67 index értékelésével azt tapasztalták, hogy a progresszióhoz szükséges idı (TTP = time to progression) korrelációt mutat a kemoterápia utáni p (patológiai) N2 státusszal és a magas Ki-67 expresszióval, így rosszabb prognózisra utal azokban a betegekben, akik platina-alapú neoadjuváns kemoterápiában részesültek [142]. Az apoptózist szabályozó markerek között gyakran vizsgált Bcl-2 család proés anti-apoptotikus proteineket egyaránt tartalmaz. A Bcl-2 az apoptózis gátlásával, míg a Bax az apoptózis elısegítésével fejti ki hatását [143].
92
Az általunk is alkalmazott vizsgálati körülményekkel csaknem azonos feltételek mellett tanulmányozták a p21 és a Bcl-2 fehérje expressziójának változását neoadjuváns terápiát megelızı és követı szövetmintákban. A szerzık a Bcl-2 protein csökkent aktivitását és a p21 fehérje expressziójának fokozódását tapasztalták az induktív (neoadjuváns) kemoterápiát követıen a sebészileg eltávolított tumormintákban [144]. Saját vizsgálatainkban a Bcl-2 protein a bronchoszkópos esetek 80%-ában (15/17) nem volt kimutatható. A kemoterápia után a korábban Bcl-2 negatív esetek 20%-ában (3/15) Bcl-2 expressziót tapasztaltunk, azaz a kis esetszámú mintánkban anti-apoptótikus irányú változást tudtunk megfigyelni. Egyes szerzık vizsgálatai szerint a Bax protein alacsony expressziója kedvezıtlen prognózisra utal a nem-laphám szövettani típusú rezekált NSCLC tüdırákos esetekben [145]. Az általunk vizsgált mintákban az apoptózist elısegítı aktivitással bíró FASligand a terápiát megelızıen az esetek 70%-ában, míg a Bax fehérje valamennyi esetben megfigyelhetı volt. A neoadjuváns terápia nem módosította érdemben a két fehérje expresszióját. A p53 protein expressziója 7 esetben pozitív és 10 esetben negatív volt a nemkissejtes tüdırákokban a kemoterápia elıtt vett mintákban. Egy esetben a pozitív p53 reakció negatívvá vált, míg 4 negatív eset a kezelést követıen pozitívitást mutatott. A további 12 esetben nem történt változás a p53 expressziójában a neoadjuváns terápiát követıen. Ikuta és mtsai heterogén apoptózis-érzékeny nem-kissejtes tumorsejtvonalakat alkalmaztak annak vizsgálatára, hogy a ciszplatin különbözı apoptózis utakra történı hatását összehasonlíthassák. Arra a következtetésre jutottak, hogy az anti-apoptotikus hatású Bcl-xL és a pro-apoptótikus p53 szükséges, de nem elegendı a ciszplatinindukálta
apoptózissal
kapcsolatos
rezisztencia
kialakulásához
nem-kissejtes
tüdırákokban [146]. Az ERCC1 (excision repair cross-complementation group 1) a platina-DNS repair mechanizmus kulcsfigurája, döntı szerepet játszik a platina-származékok indukálta DNS károsodás kijavításában [147]. Vizsgálatainkban nyolc daganat (8/17) a neoadjuváns terápia elıtt az ERCC1 pozitívitást mutatott, melyek közül 6 laphámrák, 2 adenocarcinoma volt hisztológiailag. Egyetlen adenocarcinoma eset kivételével a terápia elıtt ERCC1 pozitív minták a
93
neoadjuváns kezelés után nem mutattak pozitív reakciót a sebészi rezekátumokban. A sebészi minták között tehát nem találtunk olyan esetet, amelyben az ERCC1 a terápia hatására manifesztálódott volna. Az általunk alkalmazott metodikához hasonlóan, immunhisztokémiai reakció alapján ERCC1 negatív esetekben a betegeknél hosszabb túlélési idıt találtak a ciszplatinbázisú adjuváns kemoterápia alkalmazásával [61]. Eredményeink arra utalnak, hogy különbség van az adenocarcinomák és a laphámrákok között bizonyos markerek tekintetében. Laphámrákok között több esetben észleltük, hogy a prekemoterápiás ERCC1 expresszió a posztkemoterápiás, sebészi mintában már nem azonosítható immunhisztokémiailag. Az adenocarcinomák esetében nem tudunk tendenciózus következtetést levonni a már említett igen alacsony esetszám miatt. Látszólag ellentmondásosnak tőnik, hogy a kemoterápiát éppen azok a tumorsejtek nem „élik túl”, amelyek ERCC1 pozitívak, tehát a platinahatás ellen védekezni tudnak. Megfigyeléseink ugyanakkor arra is engednek következtetni, hogy a daganat rezekabilitását lehetıvé tévı kemoterápia hosszú távon tumorszelekciós hatást is kifejt. Az eredményeket összefoglalva tehát megállapíthatjuk, hogy a tüdırákokban eredendıen is alacsony apoptótikus aktivitás a neoadjuváns kezelést követıen nem mutatott érdemi változást az esetek többségében. A pro- és antiapoptotikus markerek kisfokú változásainak irányában még az egyes esetek értékelésével sem láttunk tendenciózus jelleget. A Ki-67 index emelkedése az esetek 40 százalékában a terápiát követı emelkedett proliferációs aktivitásra utal. Az alacsony betegszám ellenére talán megengedhetı az az óvatos következtetés, hogy az ERCC1 viszonylag gyakrabban expresszálódik IHC segítségével is kimutatható szinten laphámrákokban, mint adenocarcinomákban, ugyanakkor a terápiát követıen a rezekált tumormintákban elvész. Ez az információ nem csak az elsıdleges terápia szempontjából fontos, hanem felhívhatja a figyelmet a daganatsejtek késıbbi terápiás protokollal szemben megváltozott érzékenységére is.
94
6.4. Az EGFR immunhisztokémiai kimutatásának szerepe az EGFR-TKI terápia megtervezésében
2004-ben derült fény arra, hogy az EGFR TKI (epidermal growth factor receptor-tirosin kinase inhibitor) kezelésre jól reagáló nem-kissejtes tüdırákos betegek többségénél szekvenálással az EGFR mutációja kimutatható, míg a kezelésre nem reagáló betegeknél nem találtak ilyen mutációt [58]. További vizsgálatok igazolták, hogy a 18. 19. és a 21. exonra esik az összes mutáció 95%-a [148,149,150]. Az EGFR TK mutációk onkogén hatásúak és a tüdırák kialakulásának folyamatában igen korán jelentkeznek. Míg a gefitinib a vad típusú EGFR-t tartalmazó tüdırák sejtvonalakban G1 sejtciklus-blokkot okoz, addig a 19. és a 21. exon mutációját tartalmazó sejtvonalakban apoptózist. Az EGFR TK mutáció megléte esetén a tumor mintegy függ az EGFR jelúttól (onkogénfüggı) - így érzékeny az EGFR TKI-okra, míg a hagyományos kemoterápiával szemben rezisztenciát mutat [151,152]. A BR.21 és az ISEL klinikai kísérletek betegmintáit vizsgálva az erlotinib illetve a gefitinib csak az immunhisztokémiával kimutatható EGFR (IHC) alapján pozitívak esetében mutatott túlélési elınyt, az IHC negatívaknál nem. Az utóbbi két vizsgálatban egyaránt a Dako EGFR PharmDx kitet használták, a tumorsejtek 10%-os festıdése esetén minısítve a mintát IHC pozitívnak. A leírt eredményeink bizonyítják, hogy a gén amplifikációt mutató, mutáns gént hordozó és immunhisztokémiával EGFR expressziót mutató tumorok csak részben fedik egymást. Az egyik legfigyelemreméltóbb jelenség, hogy az EGFR fehérjét fokozottan nem expresszáló, azaz az immunhiszokémiai reakcióval negatívnak bizonyult daganatok is tartalmazhatják az EGFR TK aktiváló mutációját, az EGFR TKI - köztük az erlotinib -kezelésre pedig nagy érzékenységgel reagálnak. Az EGFR IHC leggyakrabban jár pozitív eredménnyel (vizsgálatunkban 59%-ban), így ez a vizsgálat zárja ki a legkevesebb beteget. A retrospektív EGFR vizsgálatok között hét, az EGFR TK mutációt hordozó és a TKI kezelésre választ adó beteg mintája IHC negatív volt. Öt közülük semmilyen festıdést nem mutatott, kettı pedig nem érte el a 10%-os határt. Bár a standard IHC protokoll megváltoztatásával növelhetı az IHC+ minták aránya, de ez már most is 59%
95
és az érzékenység további növelésével csökken az EGFR expresszió kvantitatív információ tartalma. Az EGFR státusz prediktív jelentısége tehát nem a receptor megjelenésével és kimutathatóságával van összefüggésben, hanem az EGFR gén mutációival [135] és az EGFR dinamikus változásaival az áttétképzés lépéseiben [153]. Az EGFR-TKI kezelésre érzékeny tüdıadenocarcinomák kiválasztásában az IHC önállóan nem alkalmas.
96
7. Következtetések
1. NCAM-hoz α-2,8 kötésben kapcsolódó polisziálsav a sejtadhézióban kulcsszerepet játszó NCAM tulajdonságát módosítani, az NCAM-ot expresszáló sejtek adhezív tulajdonságát csökkenteni képes. Az NCI-H69 humán SCLC sejtvonalból kialakított polySia pozitív és negatív szubklónok vizsgálata alapján megállapítható, hogy a magas polySia expresszió összefüggést mutat a sejtek közötti adhézió csökkenésével, de nem befolyásolja a sejt-szubsztrát adherenciát. A primer és az áttéti tumorok között nem tapasztalható értékelhetı különbség a polisziálsav expressziójában, de in vivo nude egerekben a polySia pozitív sejtek szubkután oltását követıen a metasztatizálási képesség a polySia negatív tumorokhoz képest emelkedett volt.
2. Az endoN emésztéssel eltávolított sejtfelszíni polySia re-expressziójának követésével - Western blot és immunelektronmikroszkópos módszerek segítségével megállapíthattuk, hogy a polySia szintézise lassú folyamat és valamennyi, az NCAM szialilálódásához szükséges enzim a Golgi apparátushoz kapcsolódik.
3. A nem-kissejtes tüdırákok három, egymásra épülı progressziós csoportjának -1. primer, nem metasztatizáló, 2. primer metasztatizáló és 3. agyi áttétösszehasonlításával megállapíthattuk, hogy az egyes csoportokhoz tartozó fehérje expressziós profilok között nem mutatható ki olyan önálló marker vagy a sejtfunkció szempontjából összetartozó markercsoport, amelybıl prognosztikai összefüggésre következtethettünk volna. Az agyi áttétképzés során az általunk vizsgált proteinek közül csak a β-katenin esetében tapasztaltunk a betegek túlélési idejével összefüggést mutató prognosztikus értéket: a β-katenin sejtmembrán és citoplazma közötti lokalizációs változása illetve expressziójának eltőnése a kedvezıtlen prognózis önálló elırejelzıje.
4. A platina bázisú neoadjuváns kemoterápia apoptózis markerekre gyakorolt hatásának vizsgálatával nem találtunk az alapvetıen alacsony apoptótikus aktivitású, nem-kissejtes tüdıcarcinomák sejtjeiben értékelhetı változást. Az alacsony esetszám miatt statisztikai analízist nem végeztünk, de az eredmények alapján megfigyelhetı volt
97
egy olyan tendencia, hogy a platina-alapú terápia során magas proliferációs aktivitást mutató
sejtek
szelektálódnak.
A
neoadjuváns
terápiát
megelızı
mintákban
immunhisztokémiai vizsgálattal kimutatható ERCC1 a terápiát követıen a rezekált daganatokban már nem azonosítható, ami az ERCC1-negatív, biológiailag agresszívabb viselkedéső tumorsejt populáció kiválogatódására utal. Megfigyeléseinket nagyobb esetszám és kiterjesztett betegkövetési adatok mellett szándékozunk folytatni.
5. Az EGFR (epidermális növekedési faktor receptor) tirozinkináz inhibitor (TKI)
alapú
célzott
molekuláris
terápiára
érzékeny
tüdıadenocarcinomák
kiválasztásában az EGFR immunhisztokémiai (IHC) kimutatása önmagában nem alkalmas. Számos beteg daganatmintájának IHC, FISH és mutáció analízis módszerekre alapozott prediktív vizsgálatainak összevetése azt igazolta, hogy az eseteknek csak kis százalékában van átfedés a különbözı metodikákkal kiválasztott érzékeny csoportok között. A csak IHC-ra alapozott szelekció során elveszíthetünk EGFR-TKI kezelésre alkalmas betegeket.
98
8. Összefoglalás A tüdırák okozta halálozás világszerte a haláloki statisztikák élén áll. A daganat felismerésekor az esetek döntı többsége elırehaladott stádiumban van, a prognózis kedvezıtlen. Az idıben és módszerekben egymástól távol álló vizsgálatok a tüdırákok olyan tulajdonságait célozták, amelyek szerepet játszanak a tumorsejt és környezete kapcsolatában és az áttét képzésben és amelyeknek prediktív szerepe lehet a kemoterápiás próbálkozások tervezésében. A humán kissejtes tüdırák sejtvonal (H69 SCLC) és szubklómjainak in vivo és in vitro vizsgálati eredményei azt mutatják, hogy a tumorsejtek felszínén lévı NCAM asszociált (α-2,8 kötésben lévı) polisziálsav csökkenti a tumorsejtek közötti adhéziót és fokozza az áttétképzést. A polisziálsav szintézise és transzportja a Golgi - apparátushoz kötött, de novo folyamat a SCLC sejtekben. A nem-kissejtes tüdırákok és agyi áttétteik fehérje expressziós profiljának vizsgálata eredményeként az általunk vizsgált proteinek közül csak a β-katenin mutatott összefüggést a betegek túlélési idejével. A platina-alapú neoadjuváns terápia apoptózisra, proliferációra és DNS helyreállító mechanizmusra gyakorolt hatását csak alacsony betegszám mellett tudtuk vizsgálni. Az eredmények alapján arra következtethetünk, hogy a kezelés nem befolyásolja az alacsony aktivitású apoptózist, a kemoterápia során viszont fokozott proliferációs aktivitású tumorsejtek szelektálódhatnak. A DNS helyreállításában szerepet
játszó
ERCC1
(excision
repair
cross-complementation
group
1)
expressziójának terápiát követıen észlelt változása - eseteinkben eltőnése - pedig összefüggést mutathat a terápiás válaszkészség megváltozásával a kezelés során. Az EGFR expresszióját különbözı szinten vizsgáló metodikák összehasonlítása alapján látható, hogy a különbözı módszerek alapján EGFR pozitív tumorszövetek között csak részben van átfedés. A legfontosabb következetetés, hogy az EGFR-t nem fokozottan
expresszáló,
így
az
EGFR
immunhisztokémiával
negatív
tüdıadenocarcinomák aktiváló mutációkat hordozhatnak és a betegek jó terápiás válasszal reagálhatnak az EGFR-TKI kezelésre.
99
9. Summary Lung cancer is the leading cause of tumor mortality worldwide. Most of the cases are in advanced stage at the time of diagnosis. The prognosis of patients is poor. Investigations which are far from each other in time and research methods, focused on the characteristic features of lung cancers, that may have a role in the connections between tumor cells and their environment,tumor cells and their metastatic potential and profiles with predictive value in the chemotherapeutic plan. In vitro and in vivo investigations of the human small cell lung cancer (SCLCH69) cell line and its subclones demonstrated that the NCAM–α-2,8 linked polysialic acid reduces the cell to cell adhesion and increases the metastatic ability. The synthesis and intracellular transport of polysialic acid are associated with the Golgi complex: it is a de novo process in SCLC cells. The results of the investigations of protein expression profile of primary and brain metastatic non-small cell lung cancer groups concluded that the β-catenin is the only marker which has correlation with the patients’ survival. The effect of platinum-based neoadjuvant chemotherapies on certain biomarkers, including apoptosis, cell proliferation, and DNA repair mechanisms, was also investigated. The low patients’ number could not allow us to compile statistics, but the results suggest that platinum-based chemotherapy has no influence on low activity level apoptosis, and it induces a selection of tumor cells with increased proliferating activity. Therapy-induced change in the expression – in our cases the loss of expression - of tissue marker ERCC1 (excision repair cross-complementation group 1), which plays a role in DNA repair, may have a predictive value in therapeutic response. The study comparing methods to detect different levels of EGFR expression provides evidence that tumor tissue groups positive to different EGFR diagnostics only partly overlap. Most importantly, lung cancers which do not overexpress EGFR protein, therefore present negative EGFR immunohistochemical reaction, can carry activating mutations and the patients can have excellent response to EGFR TKI therapy.
100
10. Irodalomjegyzék 1. Az Egészségügyi Minisztérium szakmai protokollja a tüdı rosszindulatú daganatairól. A szakmai protokoll érvényessége: 2009. december 31. 2. World Health Organization Classification of Tumours, Pathology & Genetics Tumours of the Lung, Pleura, Thymus and Heart. Edited by William D. Travis, Elizabeth Brambilla, H. Konrad Müller-Hermelink and Curtis C. Harris. IARCPress Lyon, 2004 Organization 3. Kopper L, Tímár J. Genomics of lung cancer may change diagnosis, prognosis and therapy. Pathol Oncol Res. 2005;11(1):5-10. Epub 2005 Mar 31. Review. 4. Raz DJ, He B, Rosell R, Jablons DM. Bronchioloalveolar carcinoma: a review. Clin Lung Cancer. 2006 Mar;7(5):313-22. Review. 5. Arenberg D; American College of Chest Physicians. Bronchioloalveolar lung cancer: ACCP evidence-based clinical practice guidelines (2nd edition).Chest. 2007 Sep;132(3 Suppl):306S-13S. 6. OKTPI Évkönyv 2008. www.korányi.hu 7. Csekeo A. [The possibility of surgery for small cell lung cancer (state of art)]. Magy Onkol. 2006;50(3):223-7. Epub 2006 Nov 12. Review. Hungarian. PubMed PMID: 17099781. 8. Delattre JY, Krol G, Thaler HT, Posner JB. Distribution of brain metastases.Arch Neurol. 1988 Jul;45(7):741-4. 9. Ceresoli GL, Reni M, Chiesa G, Carretta A, Schipani S, Passoni P, Bolognesi A, Zannini P, Villa E.
Brain metastases in locally advanced nonsmall cell lung
carcinoma after multimodality treatment: risk factors analysis. Cancer. 2002 Aug 1;95(3):605-12. 10. Hochstenbag MM, Twijnstra A, Wilmink JT, Wouters EF, ten Velde GP. Asymptomatic brain metastases (BM) in small cell lung cancer (SCLC): MRimaging is useful at initial diagnosis. J Neurooncol. 2000 Jul;48(3):243-8. 11. Schouten LJ, Rutten J, Huveneers HA, Twijnstra A. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 2002 May 15;94(10):2698-705.
101
12. Saitoh Y, Fujisawa T, Shiba M, Yoshida S, Sekine Y, Baba M, Iizasa T, Kubota M. Prognostic factors in surgical treatment of solitary brain metastasis after resection of non-small-cell lung cancer. Lung Cancer. 1999 May;24(2):99-106. 13. Sahmoun AE, Case LD, Santoro TJ, Schwartz GG. Anatomical distribution of small cell lung cancer: effects of lobe and gender on brain metastasis and survival.Anticancer Res. 2005 Mar-Apr;25(2A):1101-8. 14. Ihde DC, Minna JD. Non-small cell lung cancer. Part I: Biology, diagnosis, andstaging. Curr Probl Cancer. 1991 Mar-Apr;15(2):61-104. Review. PubMed PMID: 1649734. 15. Conboy L, Bisaz R, Markram K, Sandi C. Role of NCAM in Emotion and Learning. Neurochem Res. 2008 Feb 29. 16. Rutishauser U. Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system. Nat Rev Neurosci. 2008 Jan;9(1):26-35. Review. 17. Reyes AA, Small SJ, Akeson R. (1991). "At least 27 alternatively spliced forms of the neural cell adhesion molecule mRNA are expressed during rat heart development". Mol Cell Biol. 11 (3): 1654–61 18. Komminoth P, Roth J, Lackie PM, Bitter-Suermann D, Heitz PU. Polysialic acid of the neural cell adhesion molecule distinguishes small cell lung carcinoma from carcinoids. Am J Pathol. 1991 Aug;139(2):297-304. 19. Kibbelaar RE, Moolenaar CE, Michalides RJ, Bitter-Suermann D, Addis BJ, Mooi WJ. Expression of the embryonal neural cell adhesion molecule N-CAM in lung carcinoma. Diagnostic usefulness of monoclonal antibody 735 for the distinction between small cell lung cancer and non-small cell lung cancer. J Pathol. 1989 Sep;159(1):23-8. 20. Vangsted A, Drivsholm L, Andersen E, Bock E. New serum markers for small-cell lung cancer. II. The neural cell adhesion molecule, NCAM. Cancer Detect Prev. 1994;18(4):291-8. 21. Kwa HB, Michalides RJ, Dijkman JH, Mooi WJ. The prognostic value of NCAM, p53 and cyclin D1 in resected non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 1996 Jun;14(2-3):207-17. 22. Schwartz AG: Genetic predisposition to lung cancer. Chest 125: 86S-89S, 2004
102
23. Olak J, Colson Y: Gender differences in lung cancer: Have we really come a long way, baby? J Thorac Cardiovasc Surg 128: 346-351, 2004 24. Yokota J, Kohno T: Molecular footprints of human lung cancer progression. Cancer Sci 95: 197-204, 2004 25. Fornace AJ Jr, Nebert DW, Hollander MC, Luethy JD, Papathanasiou M, Fargnoli J, Holbrook NJ. Mammalian genes coordinately regulated by growth arrest signalsand DNA-damaging agents. Mol Cell Biol. 1989 Oct;9(10):4196-203. PubMed PMID:2573827; PubMed Central PMCID: PMC362498. 26. Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B, Harris CC. p53 mutations in humancancers. Science. 1991 Jul 5;253(5015):49-53. Review. PubMed PMID: 1905840. 27. Montenarh M. Biochemical properties of the growth suppressor/oncoprotein p53. Oncogene. 1992 Sep;7(9):1673-80. Review. PubMed PMID: 1501881. 28. Singhal S, Vachani A, Antin-Ozerkis D, Kaiser LR, Albelda SM.
Prognostic
implications of cell cycle, apoptosis, and angiogenesis biomarkers in non-small cell lung cancer: a review. Clin Cancer Res. 2005 Jun 1;11(11):3974-86. Review. 29. Kopper L, Jeney A. (szerk.) Onkológia - a géntıl a betegágyig Budapest: Medicina, 2002 30. Wang X, Goode EL, Fredericksen ZS, Vierkant RA, Pankratz VS, Liu-Mares W,Rider DN, Vachon CM, Cerhan JR, Olson JE, Couch FJ. Association of geneticvariation in genes implicated in the beta-catenin destruction complex with riskof breast cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008 Aug;17(8):2101-8. PubMedPMID: 18708403. 31. Kikuchi A. Tumor formation by genetic mutations in the components of the Wnt signaling pathway. Cancer Sci. 2003 Mar;94(3):225-9. Review. PubMed PMID:12824913 32. J. Lilien and J. Balsamo "The regulation of cadherin-mediated adhesion by tyrosine phosphorylation/dephosphorylation of beta-catenin" in Current opinion in cell biology (2005) Volume 17, pages 459- 465 33. Balsara BR, Pei J, Mitsuuchi Y, Page R, Klein-Szanto A, Wang H, Unger M, Testa JR. Frequent activation of AKT in non-small cell lung carcinomas and preneoplastic bronchial lesions. Carcinogenesis. 2004 Nov;25(11):2053-9. Epub 2004 Jul 7.
103
34. West KA, Linnoila IR, Brognard J, et al: Tobacco carcinogeninduced cellular transformation increases Akt activation in vitro and in vivo. Chest 125: 101S-102S, 2004 35. Marchetti A, Martella C, Felicioni L, et al:EGFR mutations in non-small-cell lung cancer: analysis of a large series of cases and development of a rapid and sensitive method for diagnostic screening with potential implications on pharmacologic treatment. J Clin Oncol 23: 857-865, 2005 36. Esposito V, Baldi A, Tonini G, Vincenzi B, Santini M, Ambrogi V, Mineo TC,Persichetti P, Liuzzi G, Montesarchio V, Wolner E, Baldi F, Groeger AM. Analysis of cell cycle regulator proteins in non-small cell lung cancer. J Clin Pathol.2004 Jan;57(1):58-63. PubMed PMID: 14693837; PubMed Central PMCID: PMC1770176. 37. Zhang H, Xiong Y, Beach D. Proliferating cell nuclear antigen and p21 arecomponents of multiple cell cycle kinase complexes. Mol Biol Cell. 1993 Sep;4(9):897-906.
PubMed
PMID:
7903056;
PubMed
Central
PMCID:
PMC275720. 38. Esposito V, Baldi A, De Luca A, Micheli P, Mazzarella G, Baldi F, Caputi M,Giordano A. Prognostic value of p53 in non-small cell lung cancer: relationshipwith proliferating cell nuclear antigen and cigarette smoking. Hum Pathol. 1997Feb;28(2):233-7. PubMed PMID: 9023408. 39. Dosaka-Akita H, Shindoh M, Fujino M, Kinoshita I, Akie K, Katoh M, Kawakami Y.Abnormal p53 expression in human lung cancer is associated with histologicsubtypes and patient smoking history. Am J Clin Pathol. 1994 Nov;102(5):660-4.PubMed PMID: 7942633. 40. Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature. 1993 Dec 16;366(6456):7047. PubMed PMID: 8259215. 41. Caputi M, Esposito V, Baldi A, De Luca A, Dean C, Signoriello G, Baldi F,Giordano A. p21waf1/cip1mda-6 expression in non-small-cell lung cancer: relationship to survival.Am J Respir Cell Mol Biol. 1998 Feb;18(2):213-7. 42. Franklin DS, Godfrey VL, O'Brien DA, Deng C, Xiong Y. Functional collaboration between different cyclin-dependent kinase inhibitors suppresses tumor growth with
104
distinct tissue specificity. Mol Cell Biol. 2000 Aug;20(16):6147-58. PubMed PMID: 10913196; PubMed Central PMCID: PMC86090. 43. Mitra J, Dai CY, Somasundaram K, El-Deiry WS, Satyamoorthy K, Herlyn M, Enders GH. Induction of p21(WAF1/CIP1) and inhibition of Cdk2 mediated by the tumor suppressor p16(INK4a). Mol Cell Biol. 1999 May;19(5):3916-28. PubMed PMID: 10207115; PubMed Central PMCID: PMC84249. 44. Stang A, Pohlabeln H, Müller KM, Jahn I, Giersiepen K, Jöckel KH. Diagnostic agreement in the histopathological evaluation of lung cancer tissue in a populationbased case-control study.Lung Cancer. 2006 Apr;52(1):29-36. 45. Nonomura A, Mizukami Y, Shimizu J, Oda M, Murakami S, Watanabe Y, Kobayashi T, Kamimura R, Takashima T, Kitagawa M. Clinicopathological study of primary malignant tumors of the lung: an analysis of 993 tumors resected at the Kanazawa University Hospital between 1979-1993. J Surg Oncol. 1995 Jan;58(1):511. 46. Harpole DH Jr, Herndon JE 2nd, Wolfe WG, Iglehart JD, Marks JR.A prognostic model of recurrence and death in stage I non-small cell lung cancer utilizing presentation, histopathology, and oncoprotein expression. Cancer Res. 1995 Jan 1;55(1):51-6. 47. Casson AG, McCuaig S, Craig I, Ayed A, Inculet R, Kerkvliet N, O'Malley F. Prognostic value and clinicopathologic correlation of p53 gene mutations and nuclear DNA content in human lung cancer: a prospective study. J Surg Oncol. 1994 May;56(1):13-20. 48. Ishida H, Irie K, Itoh T, Furukawa T, Tokunaga O. The prognostic significance of p53 and bcl-2 expression in lung adenocarcinoma and its correlation with Ki-67 growth fraction. Cancer 1997 Sep 15;80(6):1034-45. 49. Kern JA, Slebos RJ, Top B, Rodenhuis S, Lager D, Robinson RA, Weiner D,Schwartz DA. C-erbB-2 expression and codon 12 K-ras mutations both predict shortened survival for patients with pulmonary adenocarcinomas.J Clin Invest. 1994 Feb;93(2):516-20. 50. Selvaggi G, Novello S, Torri V, Leonardo E, De Giuli P, Borasio P, Mossetti C, Ardissone F, Lausi P, Scagliotti GV. Epidermal growth factor receptor
105
overexpression correlates with a poor prognosis in completely resected non-smallcell lung cancer.Ann Oncol. 2004 Jan;15(1):28-32. 51. Kanters SD, Lammers JW, Voest EE. Molecular and biological factors in the prognosis of non-small cell lung cancer.Eur Respir J. 1995 Aug;8(8):1389-97. Review. 52. Masuya D, Huang C, Liu D, Nakashima T, Kameyama K, Haba R, Ueno M, Yokomise H. The tumour-stromal interaction between intratumoral c-Met and stromal hepatocyte growth factor associated with tumour growth and rognosis in non-small-cell lung cancer patients.Br J Cancer. 2004 Apr 19;90(8):1555-62. 53. Laga AC, Zander DS, Cagle PT.Prognostic significance of cyclooxygenase 2 expression in 259 cases of non-small cell lung cancer.Arch Pathol Lab Med. 2005 Sep;129(9):1113-7. 54. Vargas SO, Leslie KO, Vacek PM, Socinski MA, Weaver DL. Estrogen-eceptorrelated protein p29 in primary nonsmall cell lung carcinoma:pathologic and prognostic correlations.Cancer. 1998 Apr 15;82(8):1495-500. 55. Bhattacharjee A, Richards WG, Staunton J, Li C, Monti S, Vasa P, Ladd C, Beheshti J, Bueno R, Gillette M, Loda M, Weber G, Mark EJ, Lander ES, Wong W, Johnson BE, Golub TR, Sugarbaker DJ, Meyerson M. Classification of human lung carcinomas by mRNA expression profiling reveals distinct adenocarcinoma subclasses. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Nov 20;98(24):13790-5. Epub 2001 Nov 13. 56. Sun Z, Yang P, Aubry MC, Kosari F, Endo C, Molina J, Vasmatzis G. Can gene expression profiling predict survival for patients with squamous cell carcinoma of the lung? Mol Cancer. 2004 Dec 3;3(1):35. 57. Kopper L, Tímár J. A sejtek mőködésének szabályozása. In: Kopper L, Tímár J. Molekuláris onkológia. Semmelweis Kiadó, Budapest 2007: 1-90 58. Lynch TJ, Bell DW, Sordella R et al. Activating Mutations in the Epidermal Growth Factor Receptor Underlying Responsiveness of Non-Small-Cell Lung Cancer to Gefitinib. N Engl J Med. 350:2129-2139, 2004 59. Chan SK, Gullick WJ, Hill ME. Mutations of the epidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer -- search and destroy. Eur J Cancer. 2006 Jan;42(1):17-23. Review
106
60. Fry DW. Mechanism of action of erbB tyrosine kinase inhibitors. Exp Cell Res. 2003 Mar 10;284(1):131-139. 61. Olaussen KA, Dunant A, Fouret P, Brambilla E, André F, Haddad V, Taranchon E, Filipits M, Pirker R, Popper HH, Stahel R, Sabatier L, Pignon JP, Tursz T, Le Chevalier T, Soria JC; IALT Bio Investigators. DNA repair by ERCC1 in nonsmall-cell lung cancer and cisplatin-based adjuvant chemotherapy. N Engl J Med. 2006 Sep 7;355(10):983-91. 62. Gazdar AF. Kommentár a „DNA synthesis and repair genes RRM1 and ERCC1 in lung cancer” c. cikkhez. N Engl J Med 2007;356:771-3. 63. Hiiyrinen J, Bitter-Suermann D, Finne J. Interaction of meningococcal group-B monoclonal antibody and its FAB fragment with alpha-2-8-linked sialic acid polymers - requirement of a long oligosaccharide segment for binding. Molec Immunol 1989;26: 523-9. 64. Husmann M, Roth J, Kabat EA, Weisgerber C, Frosch M, BitterSuermann D. Immunohistochemicallocalization of polysialic acid in tissue sections - differential binding to polynucleotides and DNA of a murine IgG and a human IgM monoclonal antibody. J Histochem Cytochem 1990;38:209-15. 65. Slot JW, Geuze HJ. A new method of preparing gold probes for multiple labeling cytochemistry. Eur J Cell Biol 1985;38:87-93. 66. Hallenbeck PC, Vimr ER, Yu F, Bassler B, Troy FA. Purification and properties of a bacteriophage-induced endo-N-acetylneuraminidase specific for poly-alpha-2,8sialosyl carbohydrate units. J Biol Chem. 1987 Mar 15;262(8):3553-61. PubMed PMID: 3546309. 67. Roth J. Postembedding labeling on Lowicryl K4M tissue sections: detection and modification of cellular components. Methods Cell Biol. 1989;31:513-51. PubMed PMID: 2674631. 68. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic tranl!fer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc NatI Acad Sci USA 1979;76: 4350-4. 69. Antequera F, Boyes J, Bird A. High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines. Cell 1990;62:503-14. Cedar H,
107
Razin A. DNA methylation and development. Biochim Biophys Acta 1990;1049:18. 70. Griffiths, G., Simons, K., Warren, G. &Tokuyasu, K. T. (1983) Immunoe1ectron microscopy using thin, frozen sections: application to studies of the intracellular transport of Semliki Forest virus spike glycoproteins, Methods Enzymol. 26,446485. 71. Tokuyasu,
K.
T.
(1986)
Application
of
cryoultramicrotomy
to
immunocytochemistry, J. Microscopy 143, 139-149. 72. Tokuyasu KT. Use of poly(vinylpyrrolidone) and poly(vinyl alcohol) for cryoultramicrotomy. Histochem J. 1989 Mar;21(3):163-71. PubMed PMID: 2722561. 73. Tartakoff, A. M. & Vassalli, P. (1978) Comparative studies of intracellular transport of secretory proteins, J. Cell Biol. 79, 694-707. 74. Tartakoff, A. M. (1983) Perturbation of vesicular traffic with the carboxylic ionophore monensin, Cell 32, 1026-1028. 75. Marczinovits I, Krenacs T, Stelkovics E et al. Development of monoclonal antibodies for detecting hemidesmosomal proteins, Bullous Pemphigoid antigen 22 (BPAG2) and alpha-6integrin: Expression of BPAG2 in epidermal malignancies. Cancer Detect Prev 2004; Suppl 1:S-61 76. Liu CL, Prapong W, Natkunam Y, Alizadeh A, Montgomery K, Gilks CB, van de Rijn M. Software tools for high-throughput analysis and archiving of immunohistochemistry staining data obtained with tissue microarrays.Am J Pathol. 2002 Nov;161(5):1557-65. 77. Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Dec 8;95(25):14863-8. 78. Thatcher N, Chang A, Parikh P, Rodrigues Pereira J, Ciuleanu T, von Pawel J, Thongprasert S, Tan EH, Pemberton K, Archer V, Carroll K. Gefitinib plus best supportive care in previously treated patients with refractory advanced non-smallcell lung cancer: results from a randomised, placebo-controlled, multicentre study (Iressa Survival Evaluation in Lung Cancer). Lancet. 2005 Oct 29-Nov 4;366(9496):1527-37.
108
79. Gatzemeier U, Pluzanska A, Szczesna A, Kaukel E, Roubec J, De Rosa F, Milanowski J, Karnicka-Mlodkowski H, Pesek M, Serwatowski P, Ramlau R, Janaskova T, Vansteenkiste J, Strausz J, Manikhas GM, Von Pawel J. Phase III study of erlotinib in combination with cisplatin and gemcitabine in advanced nonsmall-cell lung cancer: the Tarceva Lung Cancer Investigation Trial. J Clin Oncol. 2007 Apr 20;25(12):1545-52. 80. Cappuzzo F, Hirsch FR, Rossi E, Bartolini S, Ceresoli GL, Bemis L, Haney J, Witta S, Danenberg K, Domenichini I, Ludovini V, Magrini E, Gregorc V, Doglioni C, Sidoni A, Tonato M, Franklin WA, Crino L, Bunn PA Jr, Varella-Garcia M. Epidermal growth factor receptor gene and protein and gefitinib sensitivity in nonsmall-cell lung cancer. J Natl Cancer Inst. 2005 May 4;97(9):643-55. 81. Tsao MS, Sakurada A, Cutz JC, Zhu CQ, Kamel-Reid S, Squire J, Lorimer I, Zhang T, Liu N, Daneshmand M, Marrano P, da Cunha Santos G, Lagarde A, Richardson F, Seymour L, Whitehead M, Ding K, Pater J, Shepherd FA. Erlotinib in lung cancer - molecular and clinical predictors of outcome. N Engl J Med. 2005 Jul 14;353(2):133-44. 82. Jones PA, Taylor SM. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell 1980;20:85-93. 83. Rutishauser U, Jessell TM. Cell adhesion molecules in vertebrate neural development. Physiol Rev 1988;68:819-57. 84. Rutishauser U, Acheson A, Hall AK, Mann DM, Sunshine J. The neural cell adhesion molecule (N-CAM) as regulator of cell-cell interactions. Science (Washington) 1988;240:53-7. 85. Gazdar AF, Camey DN, Russel EK. Establishment of continuous, clonable cultures of small-cell carcinoma of the lung which have amine precursor uptake and decarboxylation cell properties. Cancer Res 1980;40:3502-7. 86. Aletsee-Ufrecht M, Langley K, Rotsch M, Havemann K, Gratzl M. NCAM: a surface marker for human small cell lung cancer cells. FEBS Lett 1990;267:295300. 87. Carbone DP, Koros AMC, Linnoila RI, Jewett P, Gazdar AF. Neural cell adhesion molecule expression and messenger RNA splicing pattems in lung cancer cell lines
109
are correlated with neuroendocrine phenotype and growth morphology. Cancer Res 1991;51:6142-9. 88. Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, Bärlund M, Schraml P, Leighton S, Torhorst J, Mihatsch MJ, Sauter G, Kallioniemi OP. Tissue microarrays for highthroughput molecular profiling of tumor specimens.Nat Med. 1998 Jul;4(7):844-7. 89. Kallioniemi OP, Wagner U, Kononen J, Sauter G. Tissue microarray technology for high-throughput
molecular
profiling
of
cancer.Hum
Mol
Genet.
2001
Apr;10(7):657-62. Review. 90. Pinter F, Papay J, Almasi A, Sapi Z, Szabo E, Kanya M, Tamasi A, Jori B, Varkondi E, Moldvay J, Szondy K, Keri G, Dominici M, Conte P, Eckhardt S, Kopper L, Schwab R, Petak I. Epidermal growth factor receptor (EGFR) high gene copy number and activating mutations in lung adenocarcinomas are not consistently accompanied by positivity for EGFR protein by standard immunohistochemistry. J Mol Diagn. 2008 Mar;10(2):160-8. 91. Rutishauser U, Watanabe M, Silver J, Troy FA, Vimr ER. Specific alteration of NCAM-mediated
cell
adhesion
by
an
endoneuraminidase.
J
Cell
Biol
1985;101:1842-9. 92. Roth J, Zuber C, Wagner P, Blaha I, Bitter-Suermann D, Heitz PU. Presence of the long chain form of polysialic acid of the neural cell adhesion molecule in Wilms' tumor. Identification of a cell adhesion molecule as an oncodevelopmental antigen and implications for tumor histogenesis. Am J Pathol. 1988 Nov;133(2):227-40. PubMed PMID: 2461089; PubMed Central PMCID: PMC1880794. 93. Roth J, Zuber C, Wagner P, Taatjes DJ, Weisgerber C, Heitz PhU and Goridis C. Bitter-Suermann D. Reexpression of (poly)sialic acid units of the neural cell adhesion molecule in Wilm's tumor. Proc Nati Acad Sci USA 1988;85:2999-3003. 94. Livingston BD, Jacobs JL, Glick MC, Troy FA. Extended polysialic acid chains (n greater than 55) in glycoproteins from human neuroblastoma cells. J Biol Chem.1988 Jul 5;263(19):9443-8. PubMed PMID: 3288635. 95. Roth J, Zuber C. Immunoelectron microscopic investigation of surface coat of Wilms tumor cells. Dense lamina is composed of highly sialylated neural cell adhesion molecule. Lab Invest. 1990 Jan;62(1):55-60. PubMed PMID: 2153260.
110
96. Rutishauser U, Jessell TM. Cell adhesion molecules in vertebrate neural development. Physiol Rev 1988;68:819-57. 97. Dennis J, Waller C, Timpl R, Schirrmacher V. Surface sialic acid reduces attachment of metastatic tumour cells to collagen type IV and fibronectin. Nature (London) 1982;300:274-6. 98. Husmann M, Roth J, Kabat EA, Weisgerber C, Frosch M, Bitter-Suermann D. Immunohistochemical localization of polysialic acid in tissue sections: differential binding to polynucleotides and DNA of a murine IgG and a human IgM monoclonal antibody. J Histochem Cytochem. 1990 Feb;38(2):209-15. 99. Alcaraz, G. & Goridis, C. (1991) Biosynthesis and processing of polysialylated NCAM by AtT-20 cells, Eur. J. Cell Biol. 55,165-173. 100.
Zuber, Ch. & Roth, J. (1990) The relationship of polysialic acid and the neural
cell adhesion molecule N-CAM in Wilrns tumor and their subcellular distributions, Eur. J. Cell Biol. 51, 313-321. 101.
Lackie, P. M., Zuber, C. & Roth, J. (1991) Polysialic acid and N-CAM in
embryonic rat kidney: mesenchymal and epithelial elements show different patterns of expression, Development 110, 933-947. 102.
Tartakoff A, Vassalli P, Détraz M. Comparative studies of intracellular transport
of secretory proteins. J Cell Biol. 1978 Dec;79(3):694-707. PubMed PMID: 103883; PubMed Central PMCID: PMC2110276. 103.
Roth, J. (1987) Subcellular topology of glycosylation in mammalian cells,
Biochim. Biophys. Acta 906,405-436 104.
Regan, C. M. (1991) Regulation of neural cell adhesion molecule sialylation
state, Int. J. Bioehem. 23, 513-523. 105.
Tanaka F, Otake Y, Nakagawa T, Kawano Y, Miyahara R, Li M, Yanagihara K,
Nakayama J, Fujimoto I, Ikenaka K, Wada H. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in nonsmall cell lung cancer.Cancer Res. 2000 Jun 1;60(11):3072-80. 106.
Tanaka F, Otake Y, Nakagawa T, Kawano Y, Miyahara R, Li M, Yanagihara K,
Inui K, Oyanagi H, Yamada T, Nakayama J, Fujimoto I, Ikenaka K, Wada H. Prognostic significance of polysialic acid expression in resected non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2001 Feb 15;61(4):1666-70.
111
107.
Sugita M, Geraci M, Gao B, Powell RL, Hirsch FR, Johnson G, Lapadat R,
Gabrielson E, Bremnes R, Bunn PA, Franklin WA. Combined use of oligonucleotide and tissue microarrays identifies cancer/testis antigens as biomarkers in lung carcinoma.Cancer Res. 2002 Jul 15;62(14):3971-9. 108.
Freier K, Joos S, Flechtenmacher C, Devens F, Benner A, Bosch FX, Lichter
P,Hofele C. Tissue microarray analysis reveals site-specific prevalence of oncogene amplifications in head and neck squamous cell carcinoma.Cancer Res. 2003 Mar 15;63(6):1179-82. 109.
Ullmann R, Morbini P, Halbwedl I, Bongiovanni M, Gogg-Kammerer M,
Papotti M,Gabor S, Renner H, Popper HH. Protein expression profiles in adenocarcinomas and squamous cell carcinomas of the lung generated using tissue microarrays.J Pathol. 2004 Jul;203(3):798-807. 110.
Kopfstein L, Christofori G. Metastasis: cell-autonomous mechanisms versus
contributions by the tumor microenvironment.Cell Mol Life Sci. 2006 Feb; 63(4):449-68. Review. 111.
Kato Y, Hirano T, Yoshida K, Yashima K, Akimoto S, Tsuji K, Ohira T, Tsuboi
M, Ikeda N, Ebihara Y, Kato H. Frequent loss of E-cadherin and/or catenins in intrabronchial lesions during carcinogenesis of the bronchial epithelium. Lung Cancer. 2005 Jun;48(3):323-30. 112.
Awaya H, Takeshima Y, Amatya VJ, Ishida H, Yamasaki M, Kohno N, Inai K.
Loss of expression of E-cadherin and beta-catenin is associated with progression of pulmonary adenocarcinoma. Pathol Int. 2005 Jan;55(1):14-8. 113.
Bremnes RM, Veve R, Hirsch FR, Franklin WA. The E-cadherin cell-cell
adhesion complex and lung cancer invasion, metastasis,and prognosis.Lung Cancer. 2002 May;36(2):115-24. Review 114.
Xu HT, Wang L, Lin D, Liu Y, Liu N, Yuan XM, Wang EH. Abnormal beta-
catenin and reduced axin expression are associated with poor differentiation and progression in non-small cell lung cancer. Am J Clin Pathol. 2006 Apr;125(4):53441. 115.
Brembeck FH, Rosário M, Birchmeier W. Balancing cell adhesion and Wnt
signaling, the key role of beta-catenin.Curr Opin Genet Dev. 2006 Feb;16(1):51-9.
112
116.
Tamura M, Ohta Y, Tsunezuka Y, Matsumoto I, Kawakami K, Oda M,
Watanabe G. Prognostic significance of dysadherin expression in patients with nonsmall cell lung cancer.J Thorac Cardiovasc Surg. 2005 Sep;130(3):740-5. 117.
Heider KH, Kuthan H, Stehle G, Munzert G. CD44v6: a target for antibody-
based cancer therapy. Cancer Immunol Immunother. 2004 Jul;53(7):567-79. 118.
Wimmel A, Kogan E, Ramaswamy A, Schuermann M. Variant expression of
CD44 in preneoplastic lesions of the lung.Cancer. 2001 Sep 1;92(5):1231-6. 119.
Lee LN, Kuo SH, Lee YC, Chang YL, Chang HC, Jan IS, Yang PC. CD44
Splicing
pattern
is
associated
with
disease
progression
in
pulmonary
adenocarcinoma.J Formos Med Assoc. 2005 Aug;104(8):541-8. 120.
Toyoshima E, Ohsaki Y, Nishigaki Y, Fujimoto Y, Kohgo Y, Kikuchi K.
Expression of syndecan-1 is common in human lung cancers independent of expression of epidermal growth factor receptor.Lung Cancer. 2001 Feb-Mar;31(23):193-202. 121.
Linnerth NM, Sirbovan K, Moorehead RA. Use of a transgenic mouse model to
identify markers of human lung tumors.Int J Cancer. 2005 May 10;114(6):977-82. 122.
Shah L, Walter KL, Borczuk AC, Kawut SM, Sonett JR, Gorenstein LA,
GinsburgME, Steinglass KM, Powell CA. Expression of syndecan-1 and expression of epidermal growth factor receptor are associated with survival in patients with nonsmall cell lung carcinoma.Cancer. 2004 Oct 1;101(7):1632-8. 123.
Anttonen A, Leppä S, Ruotsalainen T, Alfthan H, Mattson K, Joensuu H.
Pretreatment serum syndecan-1 levels and outcome in small cell lung cancer patients
treated
with
platinum-based
chemotherapy.
Lung
Cancer.
2003
Aug;41(2):171-7. 124.
Junker K. Prognostic factors in stage I/II non-small cell lung cancer. Lung
Cancer. 2001 Sep;33 Suppl 1:S17-24. Review. 125.
Singhal S, Vachani A, Antin-Ozerkis D, Kaiser LR, Albelda SM. Prognostic
implications of cell cycle, apoptosis, and angiogenesis biomarkers in non-small cell lung cancer: a review. Clin Cancer Res. 2005 Jun 1;11(11):3974-86. Review. 126.
Keum JS, Kong G, Yang SC, Shin DH, Park SS, Lee JH, Lee JD. Cyclin D1
overexpression is an indicator of poor prognosis in resectable non-small cell lung cancer.Br J Cancer. 1999 Sep;81(1):127-32.
113
127.
Brambilla E, Moro D, Gazzeri S, Brambilla C. Alterations of expression of Rb,
p16(INK4A) and cyclin D1 in non-small cell lung carcinoma and their clinical significance. J Pathol. 1999 Aug;188(4):351-60. 128.
Au NH, Cheang M, Huntsman DG, Yorida E, Coldman A, Elliott WM, Bebb G,
Flint J, English J, Gilks CB, Grimes HL. Evaluation of immunohistochemical markers in non-small cell lung cancer by unsupervised hierarchical clustering analysis: a tissue microarray study of 284 cases and 18 markers. J Pathol. 2004 Sep;204(1):101-9. 129.
Hommura F, Dosaka-Akita H, Kinoshita I, Mishina T, Hiroumi H, Ogura S,
Katoh H, Kawakami Y. Predictive value of expression of p16INK4A, retinoblastoma and p53 proteins for the prognosis of non-small-cell lung cancers.Br J Cancer. 1999 Oct;81(4):696-701. 130.
Leversha MA, Fielding P, Watson S, Gosney JR, Field JK. Expression of p53,
pRB, and p16 in lung tumours: a validation study on tissue microarrays.J Pathol. 2003 Aug;200(5):610-9. 131.
Gessner C, Liebers U, Kuhn H, Stiehl P, Witt C, Schauer J, Wolff G. BAX and
p16INK4A are independent positive prognostic markers for advanced tumour stage of nonsmall cell lung cancer.Eur Respir J. 2002 Jan;19(1):134-40. 132.
Jin M, Inoue S, Umemura T et al. Cyclin D1, p16 and retinoblastoma gene
product expression as a predictor for prognosis in non-small cell lung cancer at stages I and II. Lung Cancer 2001; 34:207-218. 133.
Minna JD, Fong K, Zöchbauer-Müller S, Gazdar AF. Molecular pathogenesis of
lung cancer and potential translational applications.Cancer J. 2002 May-Jun;8 Suppl 1:S41-6. Review. 134.
Hirsch FR, Scagliotti GV, Langer CJ, Varella-Garcia M, Franklin WA.
Epidermal growth factor family of receptors in preneoplasia and lung cancer:perspectives for targeted therapies.Lung Cancer. 2003 Aug;41 Suppl 1:S2942. Review. 135.
Cappuzzo F, Hirsch FR, Rossi E, Bartolini S, Ceresoli GL, Bemis L, Haney
J,Witta S, Danenberg K, Domenichini I, Ludovini V, Magrini E, Gregorc V, Doglioni C, Sidoni A, Tonato M, Franklin WA, Crino L, Bunn PA Jr, Varella-
114
Garcia M. Epidermal growth factor receptor gene and protein and gefitinib sensitivity in non-small-cell lung cancer. 136.
Shivapurkar N, Reddy J, Chaudhary PM, Gazdar AF. Apoptosis and lung
cancer: a review. J Cell Biochem. 2003 Apr 1;88(5):885-98. Review. 137.
Takata T, Tanaka F, Yamada T, Yanagihara K, Otake Y, Kawano Y, Nakagawa
T,Miyahara R, Oyanagi H, Inui K, Wada H. Clinical significance of caspase-3 expression in pathologic-stage I,nonsmall-cell lung cancer.Int J Cancer. 2001;96 Suppl:54-60. 138.
Meert AP, Martin B, Verdebout JM, Paesmans M, Berghmans T, Ninane V,
Sculier JP. Correlation of different markers (p53, EGF-R, c-erbB-2, Ki-67) expression in the diagnostic biopsies and the corresponding resected tumors in nonsmall cell lung cancer.Lung Cancer. 2004 Jun;44(3):295-301. 139.
Nguyen VN, Mirejovský P, Mirejovský T, Melínová L, Mandys V. Expression
of cyclin D1, Ki-67 and PCNA in non-small cell lung cancer: prognostic significance and comparison with p53 and bcl-2. Acta Histochem. 2000 Aug;102(3):323-38. 140.
Bubb RS, Komaki R, Hachiya T, Milas I, Ro JY, Langford L, Sawaya R,
Putnam JB, Allen P, Cox JD, McDonnell TJ, Brock W, Hong WK, Roth JA, Milas L. Association of Ki-67, p53, and bcl-2 expression of the primary non-small-cell lung cancer lesion with brain metastatic lesion. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2002 Aug 1;53(5):1216-24. 141.
Lung Cancer. 2009 Mar 20. [Epub ahead of print]Impact and interactions
between smoking and traditional prognostic factors in lung cancer progression. 142.
Morero JL, Poleri C, Martín C, Van Kooten M, Chacón R, Rosenberg M.
Influence of apoptosis and cell cycle regulator proteins on chemotherapy response and survival in stage IIIA/IIIB NSCLC patients. J Thorac Oncol. 2007 Apr;2(4):293-8. 143.
Korsmeyer SJ.
BCL-2 gene family and the regulation of programmed cell
death.Cancer Res. 1999 Apr 1;59(7 Suppl):1693s-1700s. 144.
Mańdziuk S, Dudzisz-Sledź M, Korszeń-Pilecka I, Milanowski J, Wojcierowski
J,Korobowicz E. Expression of p21 and bcl-2 proteins in paraffin-embedded preparations of non-small cell lung cancer in stage IIIA after Etoposide and
115
Cisplatin induced chemotherapy.Ann Univ Mariae Curie Sklodowska [Med]. 2003;58(1):149-53. 145.
Sánchez-Mora N, Presmanes MC, Monroy V, Moreno N, Lara-Martínez JM,
Aladro H,Alvarez-Fernández E. Micropapillary lung adenocarcinoma: a distinctive histologic subtype with prognostic significance. Case series. Hum Pathol. 2008 Mar;39(3):324-30. 146.
Ikuta K, Takemura K, Kihara M, Naito S, Lee E, Shimizu E, Yamauchi A.
Defects in apoptotic signal transduction in cisplatin-resistant non-small cell lung cancer cells. Oncol Rep. 2005 Jun;13(6):1229-34. 147.
Reed E. Platinum-DNA adduct, nucleotide excision repair and platinum based
anti-cancer chemotherapy. Cancer Treat Rev 1998;24:331-44 148.
Sharma SV, Bell DW, Settleman J, Haber DA. Epidermal growth factor receptor
mutations in lung cancer. Nat Rev Cancer. 2007 Mar;7(3):169-81. 149.
Irmer D, Funk JO, Blaukat A. EGFR kinase domain mutations - functional
impact and relevance for lung cancer therapy. Oncogene. 2007 Aug 23;26(39):5693701. 150.
Sequist LV, Bell DW, Lynch TJ, Haber DA. Molecular predictors of r esponse
to epidermal growth factor receptor antagonists in non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2007 Feb 10;25(5):587-95. 151.
Sordella R, Bell DW, Haber DA, Settleman J. Gefitinib-sensitizing EGFR
mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways. Science. 2004 Aug 20;305(5687):1163-7. Epub 2004 Jul 29. 152.
Tracy S, Mukohara T, Hansen M, Meyerson M, Johnson BE, Jänne PA.
Gefitinib induces apoptosis in the EGFRL858R non-small-cell lung cancer cell line H3255.Cancer Res. 2004 Oct 15;64(20):7241-4. 153.
A, Vandenbos FB, Otto J, Mouroux J, Fontaine D, Marcy PY, Cardot N, Thyss
A, Pedeutour F. Comparison of the epidermal growth factor receptor gene and protein in primary non-small-cell-lung cancer and metastatic sites: implications for treatment with EGFR-inhibitors.Ann Oncol. 2006 Jun;17(6):981-5. Epub 2006 Mar 8.
116
11. Saját publikációk jegyzéke A disszertációhoz kapcsolódó közlemények: 1. Pápay J, Sápi Z, Egri G, Gyulai M, Szende B, Losonczy G, Tímár J, Moldvay J. Platinum-Based Chemotherapy in Lung Cancer Affects the Expression of Certain Biomarkers Including ERCC1. Pathol Oncol Res. 2009 Mar 2. [Epub ahead of print] IF: 1.272 2. Pinter F, Papay J, Almasi A, Sapi Z, Szabo E, Kanya M, Tamasi A, Jori B,Varkondi E, Moldvay J, Szondy K, Keri G, Dominici M, Conte P, Eckhardt S, Kopper L, Schwab R, Petak I.Epidermal growth factor receptor (EGFR) high gene copy number and activating mutations in lung adenocarcinomas are not consistently accompanied by positivity for EGFR protein by standard immunohistochemistry. J Mol Diagn. 2008 Mar;10(2):160-8. Epub 2008 Feb 7. IF: 3.478 3. Papay J, Krenacs T, Moldvay J, Stelkovics E, Furak J, Molnar B, Kopper L. Immunophenotypic profiling of nonsmall cell lung cancer progression using the tissue microarray approach. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2007 Mar;15(1):19-30. IF: 1.474 4. Scheidegger EP, Lackie PM, Papay J, Roth J. In vitro and in vivo growth of clonal sublines of human small cell lung carcinoma is modulated by polysialic acid of the neural cell adhesion molecule.Lab Invest.1994 Jan;70(1):95-106. IF: 5.188 5. Scheidegger P, Papay J, Zuber C, Lackie PM, Roth J. Cellular site of synthesis and dynamics of cell surface re-expression of polysialic acid of the neural cell adhesion molecule. Eur J Biochem. 1994 Nov 1;225(3):1097-103. IF: 3.578
117
Egyéb közlemények 1. Juhasz M.; Csaplár M.; Berczi L.; Zalatnai A.; Papay J.; Pregun I.; Herszenyi L.; Zagoni T.; Nemeth A.; Miheller P.; Tulassay Z. High Pre-Test Probability for Coeliac Disease with thorough Pre-Endoscopy Evaluation Renders Routine Duodenal Biopsy Unnecessary Zeitschrift für Gastroenterologie 2009, vol. 47, no3, pp. 309-309 IF:-
2. Pápay J., Moldvay J Üregárnyék a tüdıben LAM 2007;17(8-9):597. IF:3. Csaplar M, Juhasz M, Muzes G, Jakab C, Aranyi Z, Rozsa C, Molnar B, Komoly S, Papay J, Zagoni T, Herszenyi L, Tulassay Z. Coeliakia és myasthenia gravis együttes elıfordulása [Association of coeliac disease and myasthenia gravis] Orv Hetil. 2006 May 7;147(18):841-4. Hungarian IF:4. Schwab R, Peták I, Pintér F, Szabó E, Kánya M, Tamási A, Várkondi E, Almási A,Szokolóczi O, Pápay J, Moldvay J, Kéri G, Kopper L. Epidermális növekedési faktor receptor (EGFR): célpont a tüdı adenocarcinomájának kezelésében [Epidermal growth factor receptor (EGFR): therapeutic target in the treatment of lung adenocarcinoma] Orv Hetil. 2005 Nov 13;146(46):2335-42. Review. Hungarian. IF:5. Schwab R, Pinter F, Moldavy J, Papay J, Strausz J, Kopper L, Keri G, Pap A, Petak I, Oreskovich K, Mangel L. Modern treatment of lung cancer: case 1. Amplification and mutation of the epidermal growth factor receptor in metastatic lung cancer with remission from gefitinib. J Clin Oncol. 2005 Oct 20;23(30):7736-8. IF:11,810 6. Belics Z, Csapo Z, Szabo I, Papay J, Szabo J, Papp Z. Large gastrointestinal stromal tumor presenting as an ovarian tumor. A case report. J Reprod Med.
118
2003 Aug;48(8):655-8. IF:0.888 7. Szeberin Z, Papay J, Biro G, Nemes A. Alsó végtagi vénás kompressziós tüneteket okozó éreredető leiomyosarcoma az inguinális régióban [Primary leiomyosarcoma of vascular origin in the groin causing lower extremity venous compression] Magy Seb. 2000 Feb;53(1):21-3.Hungarian. IF:8. Sólyom J., Sallai Á., Kontor E., Schäfer J., Pápay J., Almássy Zs., Gyırvári B., Dobos M, Fekete Gy. Részleges gonad dysgenesis: új betegek ismertetése és a korábbi esetek áttekintése Gyermekgyógyászat, 1997.4. 1997.4. 365-372. IF:9. Kopper L, Renyi I, Papay J, Kardos G, Bankfalvi A, Bartok M, Rakoczy G. Ki-1 positive (anaplastic, large cell) lymphoma (case reports and review). ActaPaediatrHung.1992;32(3):257-67.Review. IF:10. Lapis K, Papay J, Paku S. Effectiveness of tiazofurin (NSC 286193) in treating disseminated tumor cells and micrometastases in mice. Oncology. 1990;47(4):359-64. IF:11. Lapis K, Timar J, Papay J, Paku S, Szende B, Ladanyi A. Experimental metastasis inhibition by pretreatment of the host. Arch Geschwulstforsch. 1990;60(2):97-102. IF:12. Janoskuti L, Szilvasi I, Papay J, Rona E, Papp G, Benedek S, Fekete S. Csontvelı- és csontszcintigráfia a malignus lymphomás betegek vizsgálatában [Bone marrow and bone scintigraphy in the examination of patients with malignant lymphoma] Orv Hetil. 1988 Oct 16;129(42):2247-50. Hungarian. IF: -
119
12. Köszönetnyilvánítás
Ezúton szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik munkámban támogattak és segítséget nyújtottak.
Az I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet igazgatóinak: Dr. Lapis Károlynak, Dr. Szende Bélának, Dr. Kopper Lászlónak és Dr. Matolcsy Andrásnak Témavezetımnek: Dr. Tímár Józsefnek
és Dr. Nagy Péternek, Dr. Sápi Zoltánnak, Dr. Moldvay Juditnak, Dr. Peták Istvánnak, Dr. Pintér Ferencnek, Dr. Krenács Tibornak, Dr. Paku Sándornak Tamási Annának,Laczik Cecíliának, Szabó Szilviának, Cserneky Máriának
Az I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet fent nem említett munkatársainak
Dr. Jürgen Rothnak és Dr. Paul Scheideggernek, valamint az Abteilung für Zell- und Molekularpathologie, Universitätsspital Zürich összes dolgozójának (199294)
Szüleimnek
120
