A szívmőködés kémiai szabályozásának vizsgálata Straub szerint izolált békaszíven
A szívmőködés humorális szabályozásának vizsgálata békából készült izolált szívpreparátumon fog történni. Megvizsgáljuk a szívverés frekvenciájának és az általa létrehozott elmozdulásnak kémiai befolyásolhatóságát. a szívet fürdetı oldatok ionális és kémiai összetételének, a szív utóterhelésének (a kipumpált folyadék nyomásának) megváltozásával. Ennek a gyakorlatnak az a célja, hogy a Straub módszere szerint elkülönített, a szervezetbıl kivett békaszíven a hallgatók megfigyelhessék egyes ionoknak és transzmitter vegyületeknek a szívmőködésre gyakorolt hatásait. 1883/84-ben Sydney Ringer állapította meg, hogy a békaszív csak bizonyos ionokat bizonyos arányokban tartalmazó fiziológiás sóoldatokban mőködıképes: a rajta folyamatosan átáramló Ringer-oldat segítségével hosszabb ideig (megfelelı gyakorlattal akár 24 óráig is) mőködıképes állapotban tartható. Azóta a normális békaszív-mőködést a Ringer-féle fiziológiás sóoldatban vizsgálják. A gyakorlaton az egyes ionok mennyiségét megváltoztatjuk a Ringer-oldatéhoz képest, és azt elemezzük, hogyan hat ez a békaszív verési frekvenciájára, összehúzódásainak erejére. A Straub-féle izolált békaszív készítmény alkalmas különféle kémiai anyagok (ionok, gyógyszerek, ingerületátvivı vegyületek) egyedi tiszta hatásainak vizsgálatára, mert nem kell számolni a szervezetben a szívre ható sokféle (egyéb) hatással. Ez az egyszerősítés azonban ugyanakkor megnehezíti a szívnek a szervezet körülményei közötti mőködésének megismerését – éppen a szervezet további hatásainak kiiktatása miatt. A szívizomzat ingerlékeny membránú kontraktilis szövet. Ezért fontos, hogy megismerjük a sejtmembrán elektromos ingerületi folyamataiban (nyugalmi potenciáljában és akciós potenciálhullámaiban) szerepet játszó ionok koncentrációváltozásainak hatását a szív pumpáló funkciójára. A táplálkozással, továbbá a gyógyításban is alkalmazott különféle gyógyszerek (fıleg a szívre és a vizelettermelésre hatók) használatával a testfolyadékokban kissé eltolódhat a Na+, a K+, a Ca2+ koncentrációja (még annak ellenére is, hogy a szervezet számos mőködése szabályozza ezek szintjeit). Mivel a Na+ sói elég jó ozmotikumok, a Ringer-oldatban a Na+ mennyiségének növelése hiperozmotikumként hat; a hipertóniás oldatra a szívizom enyhe elerıtlenedéssel, kissé csökkenı inotrópiával válaszol. (A tartós hipernátrémia azonban növeli a sejtek Na+-
tartalmát, ami fıleg az érfalak simaizomsejtjeiben növeli a feszülést, ami magas vérnyomáshoz vezethet.) A K+ relatív vagy abszolút hiánya a Ringer-oldatban elvben hiperpolarizálná az izomsejteket, ami gyengítené az ingerületbe jutást és az aktív állapotot. Ám ebben a helyzetben a sejtekbıl az extracelluláris térbe jut a K+ (a viszonylag permeábilisabb K+-csatornákon át), ezért jelentısebb K+-hiányt az izomsejtek körül viszonylag nehéz elérni (többnyire csak hosszabb idı múltán lehetséges). A K+ fölöslege a Ringer-oldatban azonban a nyugalmi potenciál csökkenését okozza. Az izomsejtek membránjának hipopolarizációja egy kritikus értékig megkönnyíti az aktív állapot kialakulását: könnyebb kiváltani az akciós potenciálhullámot és az izomrostokon a vezetés sebessége is kissé módosul. Emiatt a szívverés frekvenciája valamelyest fokozódhat. A nagyobb fölösleg azonban már akkora hipopolarizációt idézhet elı, hogy az izomsejtek membránjában levı feszültséggel kapuzott ioncsatornák blokkolódnak, és ekkor a szívizomsejtek nem reagálnak többé az újabb impulzusokra (vagyis a szív diasztoléban megáll). A Ca2+ befolyásolja egyrészt az ioncsatornák nyílásának készségét (minél nagyobb a koncentrációja, annál nehezebben nyílnak a feszültségfüggı ioncsatornák, míg az alacsonnyá váló koncentrációja sokkal könnyebbé teszi ezen ioncsatornák kinyílását); ezzel a Ca2+-szint változása a szívverés frekvenciáját is befolyásolja. Másrészt erıteljes hatást gyakorol az összehúzódás erejére (az inotrópiára): a normálisnál alacsonyabb szintje gyengíti az összehúzódások erejét, míg a normálisnál magasabb koncentrációja fokozza a kontrakciók erejét és csökkentheti a relaxációt. Emiatt magas Ca2+-koncentráció esetében a szívizomzat átlagos kontraktilitása kissé fokozódik (a készítmény esetleges szélsıséges körülményei között a szív szisztoléban meg is állhat). Az ionok hatásai mellett elemezzük a véren, illetve az idegeken át a szívizomzathoz jutó ingerületátvivı anyagok és hormonok hatását is. A mellékvesevelıbıl felszabaduló és a véren át a szívbe jutó adrenalin β1 típusú és G-fehérjéhez kapcsolt adrenoceptorokhoz kötıdve növeli az adenilátcikláz aktivitást az izomsejtekben, és a növekvı cAMP-szint a sejtekben elısegíti a Ca2+-csatornákon át a Ca2+ bejutását az akciós potenciálhullám alatt, továbbá aktiválja a kontraktilis rendszert is; e hatások eredıjeképpen növekszik a kontrakciós inotrópiája. Lényegileg hasonló módon hat a szívgyorsító idegek végzıdésein felszabaduló noradrenalin is. A β-receptorokon érvényesülı hatás blokkolható propranolollal, ami így meggátolja az adrenalin (és noradrenalin) hatásának érvényesülését. A bolygóideg rostjai által közvetített paraszimpatikus hatást a posztganglionáris rostok végzıdésén felszabaduló acetil-kolin közvetíti. A szívben az acetil-kolin muszkarinikus
receptorokhoz kötıdik, és ez a kötıdés G-fehérjén keresztül M típusú K+-csatornát nyit az izomsejtek membránjában. Ennek eredménye lesz a nodális (ritmuskeltı) izomsejtekben a depolarizáció lassulása, ami a szívverés frekvenciájának csökkenésére vezet (nagy acetil-kolin adagtól a szív diasztoléban idılegesen meg is állhat). A muszkarinikus acetilkolin-receptor atropinnal blokkolható, és ezért az atropin adagolása az acetil-kolin szívlassító hatását felfüggeszti.
A felhasznált anyagok, eszközök és programok a következık: Dekapitált és gerincvelıroncsolt
kecskebéka
egyedek,
békapad,
kézimőszer-készlet,
fonal,
szerafin,
elmozdulásérzékelı (transzducer), erısítı, számítógép monitorral, Analyze program; Pasteurpipetta, Ringer-oldat, Ringer-oldatban acetil-kolin, Ringer-oldatban adrenalin, illetve a gátló szereik (atropin és propranolol), módosított Ringer-oldatok (ionok hiányával és fölöslegével).
A preparátum elıkészítése A dekapitált és gerincvelı-roncsolt békát a bonctálban a hátára fektetjük és a végtagjait leszúrjuk. A bır és az izomzat felnyitása után a sternumot a kulcscsontok átvágása után eltávolítjuk. A szívburkot felnyitjuk. Fonalat vezetünk a truncusok és a sinus venosus alá. A béka jobb oldali truncusát lekötjük és ugyancsak lekötjük a vénás rendszert a sinus venosustól disztálisan (vigyázzunk, hogy a preparátumról nehogy lekössük a sinus venosust!). A bal oldali truncus arteriosus alatti proximális fonalra laza elıcsomót kötünk; ez fogja majd a kanült rögzíteni. A bal oldali truncus alatti disztális fonallal a truncust disztálisan lekötjük; ennél fogva lehet a truncust felemelni és mozgatni. A disztális és a proximális fonal közötti truncus szakaszon fogjuk behelyezni a kanült; ezért a két fonal között hagyjunk elég nagy távolságot. A Straub-kanült töltsük fel Ringer-oldattal, majd dugóval zárjuk le. A bal oldali truncus arteriosuson a két fonal között ejtsünk a kisollóval piciny bemetszést (ne vágjuk át!), és a szemészeti csipesz szárát dugjuk be a nyílásba ellenırzendı, hogy valóban bejutunk-e az érbe (vagy a metszés csak a truncus kötıszövetes burkába enged bejutni). Ha a csipesz valóban bejut a truncus üregébe, akkor a csipesz szára helyett a Ringer-oldattal buborékmentesen feltöltött Straub-kanült toljuk a truncusba, majd óvatosan mozgatva a bulbus cordis spirális billentyőin át a szívkamra aljáig vezetjük. Vigyázzunk, nehogy egy türelmetlen erıs mozdulattal kiszúrjuk a kamrát! Amikor a kanül vége már a kamrában van, a truncus pedig rásimul a kanül vékonyodó részére, meghúzzuk a kanül körül a csomót úgy, hogy rákösse a fonalat a kanülön levı truncusra. A fonalat a kettıs csomón kívül még a kanülön levı üvegkampóhoz is hozzáerısítjük (meggátolva ezzel a szív lecsúszását a
kanülrıl). A truncusokat a lekötésektıl disztálisan elvágjuk, majd a szívet a kanüllel együtt megemeljük. A sinus venosus mögötti lekötésen túl a vénás rendszert is elvágjuk, és ezzel a szívet a testbıl kiemelhetjük. A kanülbıl a dugót eltávolítva a kanült a szívvel lefelé fordítjuk, így a kanülben levı folyadék a szívkamrák falára nehezedik (ha csak a pitvarok tágulnak ki, akkor a kanül vége nincs a kamrában). A kanült az állványon levı befogóba helyezzük, majd a szívet Ringer-oldattal többször átmossuk, hogy az esetleges véralvadékot eltávolítsuk. (A kanül bekötésével és a szív kimosásával igyekezni kell, nehogy a vér a kanülbe alvadjon.) Gondosan ügyeljünk arra, hogy a kanülbıl soha nem fogyjon ki a Ringer-oldat, és a folyadékoszlop magassága is állandó legyen (a szív kontraktilitása függ az izomsejtek feszítettségétıl, lásd Starling-effektus). A szívkamra csúcsára rácsíptetjük a szerafint, annak fonalát (vagy a dróthuzalt) pedig lefelé, kissé ferdén az elmozdulásérzékelı nyelvéhez csatlakoztatjuk úgy, hogy a fonalon vagy a huzalon lecsurgó Ringer-oldat a szívbıl ne kerülhessen a transzducerbe. (Ezt elısegíthetjük azzal is, hogy a szerafintól egy másik fonalat a szenzortól távolabb a bonctálba vezetünk.) Ezt követıen kezdhetjük meg a regisztrálást.
A gyakorlat kivitelezése Bekapcsoljuk az erısítıt és a számítógépet, majd bekapcsoljuk az Analyze programot. A „Measure” menüpontot aktiválva fogjuk a regisztrátumot beállítani. Az eljárás megegyezik az in situ békaszív mőködés vizsgálatánál leírtakkal. Minden egyes regisztrátum most is három szakaszból áll: a kontroll, a beavatkozási és a lecsengési szakaszból, a beavatkozás elején „Marker on”, a végén „Marker off” lenyomásával. A regisztrátumokon fel kell tüntetni a szisztole és a diasztole irányát (mivel a szív akármelyikben megállhat). Az összes vizsgálat elvégzése után ugyanezen beállítások mellett a súlykalibráció is felveendı és a kiértékelés során az önkényes feszültségegységek a kalibrált súlyerıvel helyettesítendık.
Regisztrálandó feladatok: A kísérleti beavatkozások a következık: 1. K+-mentes Ringer-oldat (a K+-ot Na+ helyettesíti) (az eredeti Ringer-oldat erre cserélendı. 2. A Ringer-oldatba 5 %-os KCl-oldatot csöpögtetünk. 3. Ca2+-mentes Ringer-oldat (a Ca2+-ot Na+ helyettesíti) (az eredeti Ringer-oldatot itt is erre kell kicserélni).
4. A Ringer-oldatba 5 %-os CaCl2-oldatot csöpögtetünk. 5. 0,9 %-os (a Ringer-oldathoz képest hiperozmotikus) oldat. 6. 10-4 g/ml adrenalin Ringer-oldatban. 7. Adrenalin oldat + 10-5 g/ml propranolol. 8. Propranolol + adrenalin. 9. 10-4 g/ml acetil-kolin Ringer-oldatban. 10. Acetil-kolin + 10-4 g/ml atropin. 11. Atropin + acetil-kolin Ringer-oldatban. Lehetséges, hogy a megadottól töményebb vagy hígabb oldat hatásos. Ne felejtsük el a súlyelmozdulás összefüggést is felvenni a regisztrálás körülményei között (kalibrálás). Mindegyik váltás után a kanült alaposan mossuk át Ringer-oldattal. Mindegyik beavatkozás külön regisztrált file-ban legyen (elıtte természetesen a kontroll, utána a lecsengés vagy kimosás szakasza). Elıfordulhat, hogy a beavatkozáskor a hatás csak hosszabb idı múlva jelentkezik; ezért kezdetben a „file length” 300 s legyen.
A kísérleti beavatkozások kiértékelése A munkamenet azonos az „in situ” békaszív mőködés vizsgálatnál leírtakkal. Elemezzük minden egyes beavatkozás esetében a szívverés frekvenciájára és az összehúzódások amplitúdójára gyakorolt hatásokat. A „tone” az egyes amplitúdók felének abszolút egységekben mért értékére utal; a kontroll alapvonal abszolút értékéhez képest a tone elmozdulása a szisztole felé a kontrakciók fokozódását, a diasztole felé pedig a szív gyengülését jelzi. Meghatározandó az is, hogy a szív esetleges megállása a mechanikai szívciklus melyik fázisában történt, illetve a hatás a szívkontrakciók erısödését vagy gyengülését váltotta-e ki.
A jegyzıkönyvbe kerüljön bele mind a 11 teljes regisztrátum a maga három szakaszával, a szakaszok alatt a saját átlagaik és szórásaik. Hasonlítsuk össze a kontroll és a beavatkozási szakaszok adatait; próbáljuk megállapítani, hogy a változás szignifikáns-e. Az Eredményekben értelmezzük a megfigyelt hatásokat. A Megbeszélés részben vessük össze az észlelteket a várt (tanult, olvasott) hatásokkal. Ne felejtsük el a kalibráció nyomán az ordinátákat súlyerıre átskálázni. Tüntessük fel a tanult vagy olvasott hatások forrását is.
