A növény inváziójában szerepet játszó bakteriális gének
merisztéma
korai szimbiotikus zóna
késői szimbiotikus zóna
öregedési zóna
gyökér keresztmetszet
NODULÁCIÓ
növényi jel
Rhizobium meliloti
rhizobium jel
INFEKCIÓ
? gének
lucerna
pH adaptáció - a pha régió története
A fix-2 mutáns K+ érzékeny
wt
fix-2
wt
fla-1
Motilitási táptalaj Mutáció térképezése: a kromoszómán Komplementáló géntár klónok izolálása
0,1 % yeast extract 10 mM K-foszfát puffer (pH: 7,0) MgSO4
fix-2
A fix-2 régió a K-transzportban és az invázióban is fontos
Tn5 Inf E E
K+
3 3 33 3 1 2 10 3 5 2 42 9
3 3 4 2 33 3 3 3 3 7 8 33 3 0 4 5 30 2 6 2 1
3 3 33 33 3 6 50 12 5 1 69 29 3 3 3 3 4 3 2 3 4 7 1 6
++ +++
+++ ++ + - -
- - - - -- ++ + +
E
E
E E
E
- -
A régió új neve: pha
- - - - --
a pH adaptáció után
E
E
1 kb
Szekvencia meghatározás E
B Sp
1
2
3
E
C
phaB
phaA
0
Sp Sa
4
5
F G
6
7 kb
A pha régió membránfehérjéket kódol 39 out PhaA
1
2
3
5
4
71
73 6
7
8
9
10
11
12
67 13
14
15
16
17
in
PhaB
80
2
out 1
2
3
4
out PhaC
5
in
1
2
PhaD
3
1
out PhaE in
1
2
out 3
1
2
3
5
4
6
7
in
in
PhaF in
46
out 1
2
3
6
13
out
PhaG in
1
2
3
8
9
10
11
12
13
A pha régió egy K/H antiportert kódol 800
K
cytosol
+
600
ADP
NADH ATP
NAD
+
Cell K or Na (nmol/mg protein)
A pha gének szükségesek a megfelelő K+-kiáramlás és a pH egyensúly biztosításához
400
H+
K+
K+ATPase
+
1o H+
200
0
Na
+
KHA H+
0
5
10
15
Time (min.)
20
25
medium
K+
A pha gének • S. melilotiban a pha1 géncsoport
K+/H+-antiportert
cytosol
kódol
ADP
NADH ATP
NAD
phaA1
C1
phaD1
E1
F1 G1
1o H+
H+
• B. subtilisben található Na+/H+-antiportert meghatározó géncsoport hasonló szerkezetű
K+ KHA
K +ATPase
K+
H+ medium
phaA2
phaB2
C2
phaD2
E2 F2 G2
• genomszekvenálások
Rhizobiumban és Agrobacteriumban, több más baktériumfajban is két pha géncsoport • Feltételezhető: a pha1 K+/H+-, a pha2 Na+/H+ -antiportert kódol
Feltételezhető, hogy a pha1 K+/H+-, a pha2 Na+/H+ -antiportert kódol.
Atu: Agrobacterium tumefaciens, Bfi: Bacillus firmus, Bha: B. halodurans, Bsu: B. subtilis, Bme: Brucella melitensis, Lin: Listeria innocua, Lmo: L. monocytogenes, Sau: Staphylococcus aureus, Sme: S. meliloti, Vch:Vibrio cholerae. Az ábra nem a baktériumok rokonsági fokát tükrözi, mert a pha gének horizontális géntranszferrel is bekerülhettek az egyes törzsekbe
Az Agrobacterium fertőzés chv--gének: kromoszomális virulencia gének ozmotikus adaptáció
sebzés
vir gének aktiválása
T-DNS átvitel
hormon bioszintézis
tumor és invázió
CÉLKITŰZÉSEK (1) Agrobacterium tumefaciens mutánsok létrehozása a pha1 és pha2 géncsoportokban (2) funkció vizsgálata:
iontranszport, virulencia ?
phaA1 phaA2
C1
phaB2
C2
phaD1 phaD2
E1
F1 G1
E2 F2 G2
A pha szekvenciák izolálása
A. tumefaciens c58 törzsből PCR segítségével klónozás pBluescript vektorba ellenőrzés: restrikciós emésztés, szekvenálás
RANDOM MUTAGENEZIS in vitro, Eppendorf csőben tisztított plazmid DNS Entranceposon (KmR) Mu transzpozáz enzim
INSZERCIÓ HELYZETE meghatározás restrikciós emésztésekkel, szekvenálással
TRANSZFORMÁCIÓ DIREKT MUTAGENEZIS plazmid DNS miniprep
TOVÁBBI SZEKVENCIA meghatározás, ha kell
Mutáció elhelyezése a pha szekvenciákban
Mu entranszpozon mutagenezissel (B ábra) Inszerció helyzetének megállapítása (A ábra): PCR, BamHI emésztés Cél: mutáció a klónozott génszakasz közepén helyezkedjen el
A pha mutációk átklónozása konjugatív vektorba
pPAG160: konjugatív plazmid, nem képes replikálódni Agrobacterium törzsben ellenőrzés: EcoRI-KpnI kettős emésztés (A ábra)
Mutánsok előállítása homológ rekombinációval Egyszeres rekombináció: kointegrát képződik a mutációt hordozó szakasz és a plazmid is beépül
A vad típusú szekvencia megmarad
Mutánsok előállítása homológ rekombinációval Kétszeres rekombináció: csak a mutációt hordozó szakasz integrálódik a plazmid és a vad típusú szekvencia elvész mutáns baktérium keletkezik
Az A. tumefaciens pha1 mutánsok előállítása Kointegrát származékok keletkeztek, nem kaptunk valódi mutánsokat! Táptalaj
Telepek száma
K-érzékeny telep
StrR telep
LBTA (Km) + NaCl
54
0/20
20/20
LBTA (Km)
48
0/20
20/20
LBTA (Km) + KCl
62
0/20
20/20
Plazmid szekvencia jelenléte: streptomicin rezisztens telepek PCR reakcióval a vektor jelenléte szintén kimutatható
Újabb pha1 mutációk előállítása A mutáció letális Na+ ionok jelenlétében is,
• Új szekvenciák izolálása •
Mutáció elhelyezése: kanamicin rezisztenciagén irányított beépítése restrikciós hasítóhelyek segítségével
•
Átklónozás pPAG160 vektorba
•
Mutáció bejuttatása a vad típusú törzsbe
•
StrR telepek, PCR a vektor szekvencia jelen van, csak kointegrát származékok
A phaA2 mutánsok előállítása Mutáció bejuttatása a vad típusú törzsbe Táptalaj
Telepek száma
Na-érzékeny telep
StrR telep
LBTA (Km) +NaCl
0
0
0
LBTA (Km)
85
20/20
0/20
LBTA (Km) + KCl
93
20/20
0/20
streptomicin érzékeny telepek PCR: vektor jelenléte nem mutatható ki vektor nem épült be Kétszeres rekombináció játszódott le, valódi mutánsok keletkeztek. A mutánsok Na-érzékenyek!
A phaA2 mutáns jellemzése I. A Na+ gátolja a mutáns baktérium növekedését
Na-mentes, alacsony tápanyag koncentrációjú táptalaj
A phaA2 mutáns jellemzése II. A Na+ növekedést gátló hatása pH-függő.
1. pH sorozat : 5,6 – 8,8 Nincs különbség a vad típusú és a mutáns baktérium növekedésében. 2. pH sorozat + 10mM NaCl A mutáns savas és lúgos környezetben is érzékeny a Na+-ionok jelenlétére.
A phaA2 mutáns jellemzése I. A pha2 gének nem szükségesek a tumorképzéshez
fertőzetlen
Vad típusú baktériummal fertőzött
phaA2::KmR mutáns baktériummal fertőzött
A phaA2 mutáns jellemzése III. A pha2 gének nem szükségesek a tumorszövet inváziójához. Visszaizolálható a phaA2 mutáns a tumorból ? A.tumefaciens törzs
CFU/ml
Kanamicin
NaCl
Vad típus
3x105
0/20
20/20
phaA2::KmR mutáns
2x105
20/20
0/20
a vad típusú baktérium visszaizolálható a mutáns baktérium visszaizolálható (Na+-érzékeny, kanamicin-rezisztens)
A phaA2 mutáns S. meliloti 41 baktérium A pha2 gének Na+-transzportért felelősek, de nem szükségesek az invázióhoz.
Fix-
és Fix+ gümők
